WO2013071702A1 - 以adipsin为检测指标的子痫前期检测试剂盒及制备方法 - Google Patents

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胡怀忠
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ORIGISSAY BIOLOGICS TECHNOLOGY Co Ltd
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    • G—PHYSICS
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
    • G01N2800/368—Pregnancy complicated by disease or abnormalities of pregnancy, e.g. preeclampsia, preterm labour

Definitions

  • the invention belongs to the field of medical kits, and particularly relates to a kit for detecting preeclampsia (PE) of a pregnant woman and a preparation method thereof.
  • PE preeclampsia
  • PE Preeclampsia
  • PE is an obstetric complication that occurs after 20 weeks of gestation and is one of the leading causes of death in pregnant women and perinatal children.
  • the prevalence of preeclampsia in pregnant women worldwide is 2-8%, and the incidence rate in pregnant women in China is 10%.
  • Severe preeclampsia patients may have severe clinical manifestations such as hypertension, edema and severe proteinuria. They are also prone to complicated pulmonary edema, renal failure, HELLP syndrome, etc., long-term cardiovascular disease, kidney disease and metabolism. The risk of disease is also significantly increased.
  • the gestational age the lower the survival rate, the premature infants before 32 weeks of pregnancy, the mortality rate is as high as 50%, and the chance of serious complications such as asphyxia, intracranial hemorrhage and infection in neonates is 5-10%.
  • the incidence of metabolic diseases and cardiovascular diseases in the long-term is also increasing, which seriously affects the health of the offspring, and brings a heavy psychological and health economic burden to the family and society.
  • the prior art clinical diagnosis of pre-eclampsia needs to meet the following three criteria: (1) maternal private complaints have clinical symptoms such as headache and dizziness; (2) The blood pressure of pregnant women meets the diagnostic criteria of hypertension, contraction by clinician Pressure/diastolic blood pressure ⁇ 140/90 mmHg; (3) 24-hour urinary albumin quantitative test results were 24-hour proteinuria ⁇ 0.3 g/day.
  • the 24-hour urinary albumin quantitative test requires the collection of urine samples for 24 hours. This method of collecting samples is cumbersome and time consuming.
  • Adipsin also known as factor D, or complement factor D, Chinese name “complement factor D”
  • factor D or complement factor D
  • complement factor D Chinese name “complement factor D”
  • Adipsin levels in circulating blood were stable in healthy pregnant women and pregnant women with preeclampsia, and there was no significant difference between the two groups.
  • Adipsin can be used as a diagnostic and predictive indicator for pre-eclampsia based on this research basis.
  • the Adipsin content in urine samples has not been reported as a test indicator for preeclampsia, and the pre-eclampsia test kit using the Adipsin content in urine samples as a detection index and its preparation method have not been reported. Summary of the invention
  • the object of the present invention is to provide a novel pre-eclampsia detection kit using the Adipsin contained in a urine sample as a detection index and a preparation method thereof, and to reduce the detection cost and reduce the pain of the patient by using the pre-eclampsia detection procedure. .
  • Adipsin is stable in circulating blood of healthy pregnant women and pregnant women with preeclampsia, and the content of Adipsin in the blood of preeclampsia group is 2929.37 ⁇ 814.08 ng/mL, healthy pregnancy group
  • the content of Adipsin in the blood was 2359.76 ⁇ 667.63 ng/mL, and there was no significant difference between the two groups.
  • due to vascular endothelial injury in pregnant women with preeclampsia renal vascular endothelial cell damage causes impaired renal permeability and recovery, resulting in high concentrations of Adipsin in urine samples from pregnant women with preeclampsia.
  • the pre-eclampsia detection kit using Adipsin as a detection index comprises a multi-well plate coated with an anti-human Adipsin monoclonal antibody, a biotin-labeled anti-human Adipsin monoclonal antibody (Biotin-AdipsinAb) detection solution, and Biotinylated anti-human Adipsin monoclonal antibody
  • Biotin-AdipsinAb Binding of avidin - horseradish peroxidase, chromogenic substrate 3', 3', 5, 5'-tetradecyl benzidine and Adipsin protein standards.
  • the above kit contains a multi-well plate coated with an anti-human Adipsin monoclonal antibody, preferably 0.9 to 1 g per anti-human Adipsin monoclonal antibody.
  • an anti-human Adipsin monoclonal antibody preferably 0.9 to 1 g per anti-human Adipsin monoclonal antibody.
  • the biotin-labeled anti-human Adipsin monoclonal antibody preferably 0.9 to 1 g per anti-human Adipsin monoclonal antibody.
  • Biotin-AdipsinAb assay consists mainly of biotinylated anti-human Adipsin monoclonal antibody (Biotin-AdipsinAb), bovine serum albumin, glycerol and phosphate buffer, biotinylated anti-human Adipsin monoclonal antibody (Biotin The concentration of -AdipsinAb is 24 mg/mL, the concentration of bovine serum albumin is 1.5 g ⁇ 3 g/100 mL, and the concentration of glycerol is 50 mL/100 mL.
  • Biotin-AdipsinAb The biotinylated anti-human Adipsin monoclonal antibody (Biotin-AdipsinAb) is composed of biotinyl-N-hydroxysuccinimide ester and anti-human Adipsin monoclonal antibody, acyl-N-hydroxysuccinimide
  • the mass ratio of the amine ester to the anti-human Adipsin monoclonal antibody is 0.5 to 1:7.
  • the kit of the present invention may also be provided with a sample diluent which is in a phosphate buffer solution (PBS) or a concentration of 0.01 mol/L at a concentration of 0.01 mol/L to 0.02 mol/L.
  • PBS phosphate buffer solution
  • concentration of bovine serum albumin was lg ⁇ 2 g / 100 mL in 0.02 mol / L trishydroxyl amino oxane buffer (Tris buffer, TBS) with bovine serum albumin.
  • the preparation method of the pre-eclampsia detection kit using Adipsin as the detection index of the present invention has the following steps:
  • Biotin-AdipsinAb and bovine serum albumin dialysis reaction solution and glycerol in a volume ratio of 1: 1 , mixed at room temperature to form biotin-labeled anti-human Adipsin monoclonal antibody
  • the anti-human Adipsin monoclonal antibody dilution is preferably added in an amount of 100 ⁇ 7 well, and the concentration is 1 g/100 mL.
  • the bovine serum albumin solution was added in an amount of 120 ⁇ 7 wells.
  • a biotin-labeled anti-human Adipsin monoclonal antibody is prepared.
  • the method of the present invention is further provided with a sample diluent which is in a phosphate buffer solution (PBS) at a concentration of 0.01 mol/L to 0.02 mol/L or a concentration of 0.01 mol/L to 0.02 mol. /L trihydroxydecylaminodecane buffer (Tris buffer, TBS) is prepared by adding bovine serum albumin, and the bovine serum albumin is added in an amount of lg ⁇ 2 g / 100 mL. limit.
  • PBS phosphate buffer solution
  • Tris buffer, TBS trihydroxydecylaminodecane buffer
  • the present invention provides a kit for detecting a pre-eclampsia with a new detection index and a preparation method thereof.
  • the test results show that: the sensitivity of the kit is 90%, and the specificity is about 80%. Therefore, the accuracy of pre-eclampsia detection can be improved.
  • test sample is a urine sample of a pregnant woman, it is a non-invasive test.
  • the kit of the invention is suitable for all pregnant women. DRAWINGS
  • FIG. 1 is a schematic view showing the structure of a porous plate in a pre-eclampsia detection kit using Adipsin as a detection index of the present invention.
  • Figure 2 shows the A450 value - Adipsin concentration standard curve.
  • Adipsin monoclonal antibody purchased from American R&D Company or RayBiotec Company
  • Adipsin protein standard product purchased from American R&D Company or RayBiotec Company
  • PBS Phosphate buffer
  • Trihydroxydecylaminodecane buffer (Tris buffer, TBS), purchased from the US sigma company; bovine serum albumin, purchased from the US sigma company;
  • ⁇ , ⁇ -dimercaptoamide purchased from American sigma company
  • Acyl-N-hydroxysuccinimide ester purchased from sigma, USA;
  • glycerol is analytical alcohol, purchased from the US sigma company;
  • Horseradish peroxidase purchased from Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co., Ltd.;
  • the perforated plate was a 96-well multi-well plate available from Nunc, Denmark, and its shape and construction are shown in Fig. 1.
  • the sterol-containing mouse anti-human Adipsin monoclonal antibody dilution was added to each well of a 96-well plate in an amount of 100 ⁇ 7 well, and coated at 4 ° C for 12 hours; After the expiration of the time, the bovine serum albumin solution at a concentration of 1 g/100 mL was added to each well of the multiwell plate in an amount of 120 ⁇ 7 wells and blocked at 37 ° C for 1 hour; after the blocking reaction was completed The porous plate was washed with a phosphate buffer solution having a pH of 7.2 and a concentration of 0.05 mol/L. When the unreacted material on the porous plate was removed, a porous plate coated with a mouse anti-human Adipsin monoclonal antibody was obtained, and then It is stored in a refrigerator at 4 °C for later use;
  • Biotinylated mouse anti-human Adipsin Monoclonal antibody Biotin-AdipsinAb
  • the reaction solution containing biotinylated mouse anti-human Adipsin monoclonal antibody Biotin-AdipsinAb
  • the phosphate buffer of L was dialyzed at 4 ° C for 12 hours, during which the dialysate was changed 3 times; then the bovine serum albumin was added to the reaction solution after dialysis, the bovine serum albumin The amount added is limited to a concentration of 4 g/100 mL;
  • Biotin-AdipsinAb bovine serum albumin dialysis reaction solution and glycerol in a volume ratio of 1: 1 , mixed at room temperature to form biotinylated mouse anti-human Adipsin monoclonal antibody
  • Each kit is equipped with avidin-horseradish peroxidase 12 mL, chromogenic substrate 3',3',5,5'-tetradecylbenzidine 12 mL, Adipsin protein standard (Adipsin) The concentration is 10 ng/mL) 1 mL and the sample diluent is 30 mL. The sample dilution is added to the bovine serum white in a concentration of 0.02 mol/L Tris buffer (Tris buffer, TBS).
  • Tris buffer Tris buffer
  • the protein is prepared by adding the bovine serum albumin to a concentration of 2 g/100 mL; the avidin-horseradish peroxidase and the biotin-labeled mouse anti-human Adipsin monoclonal antibody The volume ratio of the test solution was 1:1.
  • the sample to be tested is tested by the pre-eclampsia test kit prepared in Example 1.
  • Adipsin protein standard equipped in the kit described in Example 1 was set to the standard containing the highest concentration of Adipsin, and was designated as Standard 1, and the concentration of Adipsin was 6 ng/mL, and then the kit described in Example 1 was used. Diluted the Adipsin protein standard into a sample dilution
  • the experimental subjects were divided into the eclampsia group and the healthy control group according to the test results of the existing detection methods, and the urine samples of the two groups of pregnant women were collected.
  • a total of 40 samples of which samples 1-20 were taken from the eclampsia group, and samples 21-40 were taken from the healthy control group.
  • the sample dilution provided in the kit of Example 1 was a blank control.
  • Biotin-AdipsinAb detection solution 100 ⁇ of biotin-labeled mouse anti-human Adipsin monoclonal antibody (Biotin-AdipsinAb) detection solution was added to each well of a 96-well plate, and then the 96-well plate was covered with a film, and The 96-well plate was placed on a shaker and incubated at room temperature for 1.5 hours at a shaking state, and the shaking speed was 100 rpm. After the incubation time expired, the liquid in each of the sample wells was exhausted, and step (3) was followed. The method cleans the 96-well plate.
  • Biotin-AdipsinAb detection solution 100 ⁇ of biotin-labeled mouse anti-human Adipsin monoclonal antibody (Biotin-AdipsinAb) detection solution was added to each well of a 96-well plate, and then the 96-well plate was covered with a film, and The 96-well plate was placed on a shaker and incubated at room temperature for 1.5
  • Table 1 A450 values for standards
  • Table 2 A450 values of samples 1 ⁇ 20
  • Table 3 A450 values for samples 21 ⁇ 40
  • the A450 value of the blank control was 0.11045.
  • the average Adipsin concentration of samples 1-20 was calculated in Table 4, and the calculated result was 232.84 ⁇ 489.25 ng/mL.
  • the average Adipsin concentration of sample 21 -40 in Table 5 was calculated and found to be 4.21 ⁇ 3.14 ng/mL. From the calculation results, it can be seen that the difference between the average concentration of Adipsin in samples 1-20 from the eclampsia group and the average concentration of Adipsin in samples 21-40 from the healthy control group has statistical significance.
  • the detection limit of the Adipsin set by the kit of the present invention is 12 ng/mL, that is, the concentration of Adipsin in the sample to be tested is higher than 12 ng/ The mL was judged to be positive (ie, with pre-eclampsia), and the Adipsin concentration was lower than 12 ng/mL (ie, did not have pre-eclampsia).

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Abstract

一种以Adipsin为检测指标的子痫前期检测试剂盒，包括包被有抗人Adipsin单克隆抗体的多孔板、生物素标记的抗人Adipsin单克隆抗体检测液、与生物素标记的抗人Adipsin单克隆抗体结合的亲和素-辣根过氧化物酶、显色底物3'，3'，5，5'-四甲基联苯胺和Adipsin蛋白标准品。上述试剂盒的制备方法有以下工艺步骤：（1）制备包被有抗人Adipsin单克隆抗体的多孔板；（2）制备生物素标记的抗人Adipsin单克隆抗体检测液；（3）配备亲和素-辣根过氧化物酶、显色底物3'，3'，5，5'-四甲基联苯胺和Adipsin蛋白标准品。

Description

以 Adipsin为检测指标的子痫前期检测试剂盒及制备方法 本申请要求于 2011年 11月 17日提交中国专利局、 申请号为
201110365299.7、发明名称为"以 Adipsin为检测指标的子痫前期检测试剂盒及 制备方法"的中国专利申请的优先权， 其全部内容通过引用结合在本申请中。 技术领域
本发明属于医用试剂盒领域，特别涉及一种用于检测妊娠期妇女子痫前期 ( preeclampsia, 筒称 PE ) 的试剂盒及其制备方法。 背景技术
子痫前期（ preeclampsia, 筒称 PE )是发生于妊娠 20周后的产科并发症， 是孕妇和围产儿死亡的主要原因之一。子痫前期在全世界范围内孕产妇中的发 病率为 2-8%, 在我国孕产妇中的发病率可达 10%。 重度子痫前期患者可出现 高血压、 水肿和重度蛋白尿等严重的临床表现， 还容易并发肺水肿、 肾功能衰 竭、 HELLP综合征等不良结局， 远期罹患心血管疾病、 肾脏疾病和代谢性疾 病的风险也明显增高。 对于胎儿而言， 孕周越小， 存活率越低， 孕 32周之前 的早产儿， 死亡率高达 50%, 新生儿发生窒息、 颅内出血、 感染等严重并发症 的机率达 5-10%, 远期的代谢性疾病、 心血管疾病的发病率也增加， 严重影响 了子代的健康， 给家庭及社会带来沉重的心理及卫生经济负担。
现有技术关于子痫前期的临床诊断需满足如下三个依据： ( 1 )孕产妇自诉 有头痛、 头晕等临床症状； （2 )经临床医生检测， 孕产妇的血压符合高血压诊 断标准， 收缩压 /舒张压≥140/90 mmHg; ( 3 ) 24小时尿白蛋白定量检测结果为 24小时蛋白尿≥0.3 g/day。 24小时尿白蛋白定量检测需收集患者连续 24小时 的尿样进行检测。 这种方法采集样本的方法繁瑣， 耗时长。
Adipsin (又名 factor D , 或 complement factor D , 中文名为 "补体因子 D" ) 是月旨肪细胞产生的一种丝氨酸蛋白酶，存在于循环血液中， 与机体的脂肪代谢 密切相关。 健康妊娠妇女和患有子痫前期的妊娠妇女循环血液中的 Adipsin含 量稳定， 两组之间没有显著性差异。 但是， 由于患有子痫前期的妊娠妇女存在 血管内皮损伤， 肾脏的血管内皮细胞损伤造成肾脏渗透和回收功能受损，导致 高浓度的 Adipsin出现在患有子痫前期的妊娠妇女的尿样本中， 因此， 可以基 于这一研究基础将 Adipsin作为子痫前期的诊断与预测指标。 目前尚未发现以 尿样本中的 Adipsin含量作为子痫前期的检测指标的报道， 也未发现以尿样本 中的 Adipsin含量为检测指标的子痫前期检测试剂盒及其制备方法的报道。 发明内容
本发明的目的在于提供一种以尿样本中所含的 Adipsin为检测指标的新型 子痫前期检测试剂盒及其制备方法， 以筒化子痫前期的检测程序， 降低检测费 用， 减轻患者的痛苦。
本专利申请的发明人通过实验发现： Adipsin在健康妊娠妇女和患有子痫 前期的妊娠妇女循环血液中含量稳定， 子痫前期组血液中 Adipsin的含量为 2929.37±814.08 ng/mL, 健康妊娠组血液中 Adipsin的含量为 2359.76±667.63 ng/mL, 两组之间没有显著性差异。 但是， 由于患有子痫前期的妊娠妇女存在 血管内皮损伤， 肾脏的血管内皮细胞损伤造成肾脏渗透和回收功能受损，导致 高浓度的 Adipsin出现在患有子痫前期的妊娠妇女的尿样本中， 蛋白芯片筛选 实验发现： 确诊的子痫前期产妇与确诊的非子痫前期产妇相比（两组产妇的年 龄与妊娠周龄匹配， 无基础疾病， 无其他妊娠合并症）， 尿样本中的 Adipsin 浓度具有明显差异， 定量研究发现： 子痫前期组尿样本中 Adipsin的含量为 349.04±557.10 ng/mL,健康妊娠组尿样本中 Adipsin的含量为 8.69±6.34 ng/mL, 由于子痫前期组与健康妊娠组尿样本中 Adipsin的含量存在显著的差异， 因此 可将尿样本中 Adipsin的含量作为判断妊娠妇女是否患有子痫前期的检测指 标。
本发明所述以 Adipsin为检测指标的子痫前期检测试剂盒， 包括包被有抗 人 Adipsin单克隆抗体的多孔板、 生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体 ( Biotin-AdipsinAb )检测液、 与生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体
( Biotin-AdipsinAb ) 结合的亲和素 -辣根过氧化物酶、 显色底物 3',3',5,5'-四曱 基联苯胺和 Adipsin蛋白标准品。
实验表明， 上述试剂盒所含包被有抗人 Adipsin单克隆抗体的多孔板， 优 选每孔包被抗人 Adipsin单克隆抗体 0.9 ~ 1 g。 上述试剂盒中， 所述生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体
( Biotin-AdipsinAb )检测液主要由生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体 ( Biotin-AdipsinAb )、 牛血清白蛋白、 甘油和磷酸盐緩沖液组成， 生物素标记 的抗人 Adipsin单克隆抗体 ( Biotin-AdipsinAb ) 的浓度为 24 mg/mL, 牛血清 白蛋白的浓度为 1.5 g ~ 3 g/100 mL, 甘油的浓度为 50 mL/100 mL。
所述生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体（ Biotin-AdipsinAb )由生物素 酰 -N羟基丁二酰亚胺酯和抗人 Adipsin单克隆抗体耦联而成， 酰 -N羟基丁二 酰亚胺酯与抗人 Adipsin单克隆抗体的质量比为 0.5~1： 7。
为了方便用户使用， 本发明所述试剂盒还可配备样本稀释液， 所述样本稀 释液是在浓度 0.01 mol/L ~ 0.02 mol/L的磷酸盐緩沖液（ PBS )或浓度 0.01 mol/L ~ 0.02 mol/L的三羟曱基氨基曱烷緩沖液（ Tris緩沖液， TBS ) 中加入牛 血清白蛋白配制而成， 牛血清白蛋白的浓度为 l g ~ 2 g/100 mL。
本发明所述以 Adipsin为检测指标的子痫前期检测试剂盒的制备方法， 工 艺步骤如下：
( 1 )制备包被有抗人 Adipsin单克隆抗体的多孔板
用 pH = 8 ~ 10的碳酸盐緩沖液将抗人 Adipsin单克隆抗体稀释为浓度 10 / mL稀释液， 在所述抗人 Adipsin单克隆抗体稀释液中加入无水曱醇， 无水曱醇的加入量以其浓度达到 3 mL/100 mL为限，然后将所述含曱醇的抗人 Adipsin单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内， 在 4°C包被至少 12小时； 包 被时间届满后， 将浓度为 1 g/100 mL的牛血清白蛋白溶液加入多孔板上的各 孔并在 37°C进行封闭反应， 反应时间至少为 1小时； 封闭反应结束后， 用 pH = 7.2的磷酸盐緩沖液洗涤多孔板， 当多孔板上的未反应物被去除后即获得包 被有抗人 Adipsin单克隆抗体的多孔板， 其保存温度为 4°C ;
( 2 )制备生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体（ Biotin-AdipsinAb )检 测液
① 以 Ν,Ν-二曱基曱酰胺为溶剂，生物素酰 -Ν羟基丁二酰亚胺酯为溶质配 制浓度为 50 g/ L的酰 -N羟基丁二酰亚胺酯溶液， 以 pH = 9.6的碳酸盐緩沖 液为溶剂， 抗人 Adipsin单克隆抗体为溶质配制浓度为 24 mg/mL的抗人 Adipsin单克隆抗体溶液， 将所述酰 -N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述抗人 Adipsin单克隆抗体溶液的混合液在搅拌下于室温反应至少 4小时， 即获得生 物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体（ Biotin-AdipsinAb ); 反应结束后， 将含 生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体 ( Biotin-AdipsinAb )的反应液装入透析 袋中， 用 pH = 9.2的磷酸盐緩沖液在 4°C进行透析， 透析时间至少为 12小时， 其间更换透析液至少 3次； 继后在透析后的所述反应液中加入牛血清白蛋白， 所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到 3 g ~ 6 g/100 mL为限；
②将步骤①制备的含生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体
( Biotin-AdipsinAb )和牛血清白蛋白的透析后反应液与甘油按体积比 1： 1计 量， 在室温下混合均匀即形成生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体
( Biotin-AdipsinAb )检测液， 其保存温度为 - 20°C；
( 3 ) 配备亲和素 -辣根过氧化物酶、 显色底物 3',3',5,5'-四曱基联苯胺和 Adipsin蛋白标准品。 所述亲和素 -辣根过氧化物酶、 3',3',5,5'-四曱基联苯胺和 Adip sin蛋白标准品均为市售商品， 可直接从市场购买。
本发明所述方法中， 制备包被有抗人 Adipsin单克隆抗体的多孔板时， 所 述抗人 Adipsin单克隆抗体稀释液的加入量优选 100 μΙ7孔， 所述浓度为 1 g/100 mL的牛血清白蛋白溶液的加入量为 120 μΙ7孔。
本发明所述方法中， 制备生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体
( Biotin-AdipsinAb ) 时， 优选按酰 -N羟基丁二酰亚胺酯与抗人 Adipsin单克隆 抗体的质量比 = 0.5-1： 7量取所述酰 -N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述抗人 Adipsin单克隆抗体溶液形成混合液。
为方便用户， 本发明所述方法还配备了样本稀释液， 所述样本稀释液是在 浓度 0.01 mol/L ~ 0.02 mol/L的磷酸盐緩沖液 ( PBS )或浓度 0.01 mol/L ~ 0.02 mol/L的三羟曱基氨基曱烷緩沖液（Tris緩沖液， TBS ) 中加入牛血清白蛋白 配制而成， 所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到 l g ~ 2 g/100 mL为限。
本发明具有以下有益效果：
( 1 )本发明为子痫前期的检测提供了一种采用新检测指标的试剂盒及其 制备方法。
( 2 )使用本发明所述试剂盒， 可定量检测出妊娠妇女的尿样本中 Adipsin 的准确含量。
( 3 )使用本发明所述试剂盒对确诊子痫前期妇女和健康妊娠妇女进行采 样检测 （见实施例 2 ), 检测结果表明： 该试剂盒的敏感性为 90%, 特异性为 80%左右， 因而可提高子痫前期检测的准确性。
( 4 ) 由于检测样品是妊娠妇女的尿样本， 因而是一种无创检测。
本发明所述试剂盒适用于所有妊娠期妇女。 附图说明
图 1是本发明所述以 Adipsin为检测指标的子痫前期检测试剂盒中多孔板 的一种形状构造示意图。
图 2为 A450值- Adipsin浓度标准曲线。 具体实施方式
为了进一步了解本发明， 下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描 述， 但是应当理解， 这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点， 而不是 对本发明权利要求的限制。
以下以具体实施例说明本发明的效果，但本发明的保护范围不受以下实施 例的限制。 下面通过实施例对本发明所述以 Adipsin为检测指标的子痫前期检测试剂 盒及其制备方法和使用方法作进一步说明。
下述实施例中涉及的材料来源如下：
鼠抗人 Adipsin单克隆抗体， 购自美国 R&D公司或 RayBiotec公司； Adipsin蛋白标准品， 购自美国 R&D公司或 RayBiotec公司；
碳酸盐緩沖液（ CB ), 购自美国 sigma公司；
磷酸盐緩沖液（ PBS )， 购自美国 sigma公司；
三羟曱基氨基曱烷緩沖液（Tris緩沖液， TBS ), 购自美国 sigma公司； 牛血清白蛋白， 购自美国 sigma公司；
Ν,Ν-二曱基曱酰胺， 购自美国 sigma公司； 酰 -N羟基丁二酰亚胺酯， 购自美国 sigma公司；
甘油的规格是分析醇， 购自美国 sigma公司；
辣根过氧化物酶， 购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
3',3',5,5'-四曱基联苯胺， 购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
多孔板为 96孔的多孔板， 购自丹麦 Nunc公司， 其形状和构造如图 1所示。 实施例 1
本实施例中， 采用以下工艺步骤制备以 Adipsin为检测指标的子痫前期检 测试剂盒：
( 1 )制备包被有鼠抗人 Adipsin单克隆抗体的多孔板
用 pH = 9的碳酸盐緩沖液将鼠抗人 Adipsin单克隆抗体稀释为浓度 10 /mL的稀释液， 在抗体稀释液中加入无水曱醇， 无水曱醇的加入量以其浓度达 到 3 mL/100 mL为限， 然后将所述含曱醇的鼠抗人 Adipsin单克隆抗体稀释液 按 100 μΙ7孔的量加入 96孔板的各孔内， 在 4°C包被 12小时； 包被时间届满 后， 将浓度 1 g/100 mL的牛血清白蛋白溶液按 120 μΙ7孔的量加入多孔板上的 各孔并在 37°C进行封闭反应， 反应时间为 1小时； 封闭反应结束后， 用 pH = 7.2、 浓度为 0.05 mol/L的磷酸盐緩沖液洗涤多孔板， 当多孔板上的未反应物 被去除后即获得包被有鼠抗人 Adipsin单克隆抗体的多孔板，然后将其置于 4 °C 冰箱中保存备用；
( 2 )制备生物素标记的鼠抗人 Adipsin单克隆抗体（ Biotin-AdipsinAb ) 检测液
① 以 Ν,Ν-二曱基曱酰胺为溶剂， 生物素酰 -Ν羟基丁二酰亚胺酯为溶质配 制浓度为 50 g/ L的酰 -N羟基丁二酰亚胺酯溶液， 以 pH = 9.6、 浓度为 1 mol/L 的碳酸盐緩沖液为溶剂、 鼠抗人 Adipsin单克隆抗体为溶质配制浓度为 24 mg/mL的鼠抗人 Adipsin单克隆抗体溶液， 按酰 -N羟基丁二酰亚胺酯与与鼠抗 人 Adipsin单克隆抗体的质量比 = 1： 7量取所述酰 -N羟基丁二酰亚胺酯溶液和 所述鼠抗人 Adipsin单克隆抗体溶液形成混合液， 将所述酰 -N羟基丁二酰亚胺 酯溶液和所述鼠抗人 Adipsin单克隆抗体溶液的混合液在搅拌下（磁力搅拌器， 搅拌速度 200转 /分） 于室温反应 4小时， 即获得生物素标记的鼠抗人 Adipsin 单克隆抗体（ Biotin-AdipsinAb );反应结束后，将含生物素标记的鼠抗人 Adipsin 单克隆抗体（Biotin-AdipsinAb ) 的反应液装入透析袋中， 用 pH = 9.2、 浓度为 0.05 mol/L的磷酸盐緩沖液在 4°C进行透析， 透析时间为 12小时， 其间更换透析 液 3次； 继后在透析后的所述反应液中加入牛血清白蛋白， 所述牛血清白蛋白 的加入量以其浓度达到 4 g/100 mL为限；
②将步骤①制备的含生物素标记的鼠抗人 Adipsin单克隆抗体
( Biotin-AdipsinAb )和牛血清白蛋白的透析后反应液与甘油按体积比 1： 1计 量， 在室温下混合均匀即形成生物素标记的鼠抗人 Adipsin单克隆抗体
( Biotin-AdipsinAb )检测液,其保存温度为 - 20°C ;
( 3 )每个试剂盒配备亲和素-辣根过氧化物酶 12 mL、 显色底物 3',3',5,5'- 四曱基联苯胺 12 mL, Adipsin蛋白标准品（ Adipsin的浓度为 10 ng/mL ) 1 mL 和样本稀释液 30 mL,样本稀释液是在浓度浓度 0.02 mol/L的三羟曱基氨基曱 烷緩沖液（Tris緩沖液， TBS ) 中加入牛血清白蛋白配制而成， 所述牛血清白 蛋白的加入量以其浓度达到 2 g/100 mL为限； 所述亲和素 -辣根过氧化物酶与 生物素标记的鼠抗人 Adipsin单克隆抗体检测液的体积比为 1 : 1。 实施例 2
本实施例以实施例 1制备的子痫前期检测试剂盒对待测样本进行检测。
1、 待测样本
( 1 )标样准备
将实施例 1所述试剂盒中配备的 Adipsin蛋白标准品设为含 Adipsin浓度 最高的标样， 命名为标样 1 , 其 Adipsin的浓度为 6 ng/mL, 然后用实施例 1 所述试剂盒中配备的样本稀释液将所述 Adipsin蛋白标准品分别稀释成
Adipsin浓度为 2000 pg/mL、 666.7 pg/mL, 222.2 pg/mL, 74.07 pg/mL, 24.69 pg/mL、 8.23 pg/mL的标样， 依次命名为标样 2、 标样 3、 标样 4、 标样 5、 标 样 6和标样 7, 共计有 7个标样。
( 2 )试样
以四川大学华西第二医院门诊及住院的孕妇为实验对象，根据现有检测方 法的检测结果将实验对象分为子痫组和健康对照组，收集两组孕妇的尿样本作 为试样， 共计 40个试样， 其中， 试样 1-20取自于子痫组， 试样 21-40取自于 健康对照组。
( 3 ) 空白对照
实施例 1所述试剂盒中配备的样本稀释液——为空白对照。
2、 样本检测
( 1 )检测前将试剂盒的所有试剂、待测样本緩慢均衡至室温（ 18°C~25 °C );
( 2 )将步骤 1所准备的标样、 空白对照、 试样分别加入包被有鼠抗人 Adipsin单克隆抗体的 96孔板上的相应加样孔中， 各标样、 空白对照、 试样均 设复孔对照； 各加样孔中的加样量为 100 L。 用胶膜遮盖所述 96孔板， 并将 所述 96孔板置于振摇仪上在振摇状态下室温孵育 2.5小时， 振摇速度为 100 转 /分。
( 3 )孵育时间届满后， 吸尽各加样孔中的液体， 在自动洗板机上设置清 洗程序，以 400 μΙ7孔洗液（浓度 0.02 mol/L的磷酸盐緩沖液或浓度为 0.02 mol/L 的 Tris緩沖液）将每个加样孔清洗两次， 每次清洗时， 洗液需在孔中停留 10 秒〜 15秒； 清洗完毕后， 将 96孔板翻转， 使各加样孔孔口向下， 在吸水滤纸 上轻拍使各加样孔中残留的洗液完全去除。
( 4 ) 向 96孔板上的各加样孔中分别加入 100 μΐ生物素标记的鼠抗人 Adipsin单克隆抗体（ Biotin-AdipsinAb )检测液， 然后用胶膜遮盖所述 96孔 板， 并将所述 96孔板置于振摇仪上在振摇状态下室温孵育 1.5小时， 振摇速 度为 100转 /分； 孵育时间届满后， 吸尽各加样孔中的液体， 按步骤（3 )所述 方法清洗所述 96孔板。
( 5 )向所述 96孔板上的各加样孔中分别加入 100 μL亲和素 -辣根过氧化 物酶， 然后用胶膜遮盖所述 96孔板， 并将所述 96孔板置于振摇仪上在振摇状 态下室温孵育 1.5小时， 振摇速度为 100转 /分； 孵育时间届满后， 吸尽各加样 孔中的液体， 按步骤（3 )所述方法清洗所述 96孔板。
( 6 ) 向所述 96孔板上的各加样孔中分别加入 100 μ 3',3',5,5'-四曱基联苯 胺，然后在室温避光孵育 10分钟，孵育时间届满后，向各加样孔中分别加入 100 终止液， 所述终止液为硫酸和亚硫酸钠配制的水溶液， 硫酸的浓度为 2 mol/L, 亚克酸钠的浓度为 0.1 mol/L。 ( 7 )将所述 96孔板放置在酶标仪中， 用酶标仪测各孔的 A450值（光密 度值或吸光度值）， 所测结果见下表（表中的 A450值为两孔的加权平均值）。
表 1 : 标样的 A450值
Figure imgf000010_0001
表 2: 试样 1 ~ 20的 A450值
Figure imgf000010_0002
表 3: 试样 21 ~ 40的 A450值
Figure imgf000010_0003
空白对照的 A450值为 0.11045。
( 8 )根据各标样的 A450值与各标样中 Adipsin的浓度， 制作 A450值-
Adipsin浓度标准曲线 (见图 2 ), 并得到计算公式 y = 0.0008x + 0.0067, 式中， y为被测样品的 A450值， X为被测样品中 Adipsin的含量。
( 9 )根据所测各试样的 A450值， 用公式 y = 0.0008x + 0.0067计算各试 样中 Adipsin的浓度， 计算结果见下表：
表 4: 试样 1 ~ 20的计算结果（ Adipsin浓度单位： ng/mL ) 试样 1 2 3 4 5 6 7
Adipsin 78.71875 39.03125 1105.094 434.4063 123.9375 908.5313 1423.125 浓 度
试样 8 9 10 11 12 13 14
Adipsin 243.625 309.4063 79.71875 1613.656 50.8125 158.1875 195.5938 浓 度
试样 15 16 17 18 19 20
Adipsin 23.1875 76.9063 146.9063 48.21875 91 77
浓 度 表 5: 试样 21 ~ 40的计算结果（ Adipsin浓度单位： ng/mL )
Figure imgf000011_0001
计算表 4中试样 1 ~ 20的 Adipsin平均浓度，其计算结果为 232.84±489.25 ng/mL。 计算表 5中试样 21 -40的 Adipsin平均浓度， 其计算结果为 4.21±3.14 ng/mL。 从计算结果可以看出， 取自于子痫组的试样 1 ~ 20中的 Adipsin平均 浓度与取自于健康对照组的试样 21 ~ 40中的 Adipsin平均浓度的差异具有统 计学意义。
根据健康对照组的均数 ±2χ标准差的计算结果设为检测限， 因此， 本发明 所述试剂盒设置的 Adipsin检测限为 12 ng/mL, 即待测样本中 Adipsin浓度高 于 12 ng/mL判定为阳性（即患有子痫前期）， Adipsin浓度低于 12 ng/mL判 定为阴性（即未患有子痫前期）。 本发明提出的以 Adipsin为检测指标的子痫前期检测试剂盒及制备方法已 通过实施例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范 围内对本文所述的子痫前期检测试剂盒及制备方法进行改动或适当变更与组 合， 来实现本发明技术。 特别需要指出的是， 所有相类似的替换和改动对本领 域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明的精神、 范围和内 容中。

Claims

权 利 要 求
1、 一种以 Adipsin为检测指标的子痫前期检测试剂盒， 其特征在于所述 试剂盒包括包被有抗人 Adipsin单克隆抗体的多孔板、 生物素标记的抗人
Adipsin单克隆抗体检测液、与生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体结合的亲 和素 -辣根过氧化物酶、显色底物 3',3',5,5'-四曱基联苯胺和 Adipsin蛋白标准品。
2、 根据权利要求 1所述的以 Adipsin为检测指标的子痫前期检测试剂盒， 其特征在于所述多孔板每孔包被抗人 Adipsin单克隆抗体 0.9 ~ 1 g。
3、 根据权利要求 1或 2所述的以 Adipsin为检测指标的子痫前期检测试 剂盒， 其特征在于所述生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体检测液主要由生 物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体、 牛血清白蛋白、 甘油和磷酸盐緩沖液组 成，生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体的浓度为 24 mg/mL ,牛血清白蛋白 的浓度为 1.5 g ~ 3 g/100 mL, 甘油的浓度为 50 mL/100 mL。
4、 根据权利要求 3所述的以 Adipsin为检测指标的子痫前期检测试剂盒， 其特征在于所述生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体由生物素酰 -N羟基丁二 酰亚胺酯和抗人 Adipsin单克隆抗体耦联而成，酰 -N羟基丁二酰亚胺酯与抗人 Adipsin单克隆抗体的质量比为 0.5~1： 7。
5、 根据权利要求 1或 2所述的以 Adipsin为检测指标的子痫前期检测试 剂盒， 其特征在于还包括样本稀释液， 所述样本稀释液是在浓度 0.01 mol/L ~ 0.02 mol/L的磷酸盐緩沖液或浓度 0.01 mol/L ~ 0.02 mol/L的三羟曱基氨基曱 烷緩沖液中加入牛血清白蛋白配制而成， 牛血清白蛋白的浓度为 1 g ~ 2 g/100mL。
6、 根据权利要求 3所述的以 Adipsin为检测指标的子痫前期检测试剂盒， 其特征在于还包括样本稀释液， 所述样本稀释液是在浓度 0.01 mol/L ~ 0.02 mol/L的磷酸盐緩沖液或浓度 0.01 mol/L ~ 0.02 mol/L的三羟曱基氨基曱烷緩 沖液中加入牛血清白蛋白配制而成， 牛血清白蛋白的浓度为 1 g ~ 2 g/100 mL。
7、 根据权利要求 4所述的以 Adipsin为检测指标的子痫前期检测试剂盒， 其特征在于还包括样本稀释液， 所述样本稀释液是在浓度 0.01mol/L ~ 0.02 mol/L的磷酸盐緩沖液或浓度 0.01 mol/L ~ 0.02 mol/L的三羟曱基氨基曱烷緩 沖液中加入牛血清白蛋白配制而成， 牛血清白蛋白的浓度为 l g ~ 2 g/100 mL。
8、 一种以 Adipsin为检测指标的子痫前期检测试剂盒的制备方法， 其特 征在于工艺步骤如下：
( 1 )制备包被有抗人 Adipsin单克隆抗体的多孔板
用 pH = 8 ~ 10的碳酸盐緩沖液将抗人 Adipsin单克隆抗体稀释为浓度 10 g/mL的稀释液， 在所述抗人 Adipsin单克隆抗体稀释液中加入无水曱醇， 无水曱醇的加入量以其浓度达到 3 mL/lOO mL为限，然后将所述含曱醇的抗人 Adipsin单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内， 在 4°C包被至少 12小时； 包 被时间届满后， 将浓度为 1 g/100 mL的牛血清白蛋白溶液加入多孔板上的各 孔并在 37°C进行封闭反应， 反应时间至少为 1小时； 封闭反应结束后， 用 pH = 7.2的磷酸盐緩沖液洗涤多孔板， 当多孔板上的未反应物被去除后即获得包 被有抗人 Adipsin单克隆抗体的多孔板；
( 2 )制备生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体检测液
① 以 Ν,Ν-二曱基曱酰胺为溶剂，生物素酰 -Ν羟基丁二酰亚胺酯为溶质配 制浓度为 50 g/ L的酰 -N羟基丁二酰亚胺酯溶液， 以 pH = 9.6的碳酸盐緩沖 液为溶剂， 抗人 Adipsin单克隆抗体为溶质配制浓度为 24 mg/mL的抗人 Adipsin单克隆抗体溶液， 将所述酰 -N羟基丁二酰亚胺酯溶液和所述抗人 Adipsin单克隆抗体溶液的混合液在搅拌下于室温反应至少 4小时， 即获得生 物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体；
反应结束后， 将含生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体的反应液装入透 析袋中， 用 pH = 9.2的磷酸盐緩沖液在 4°C进行透析， 透析时间至少为 12小 时， 其间更换透析液至少 3次； 继后在透析后的所述反应液中加入牛血清白蛋 白， 所述牛血清白蛋白的加入量以其浓度达到 3 g ~ 6 g/100 mL为限；
②将步骤①制备的含生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体和牛血清白 蛋白的透析后反应液与甘油按体积比 1： 1计量，在室温下混合均匀即形成生物 素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体检测液；
( 3 ) 配备亲和素 -辣根过氧化物酶、 显色底物 3',3',5,5'-四曱基联苯胺和 Adipsin蛋白标准品。
9、 根据权利要求 8所述的以 Adipsin为检测指标的子痫前期检测试剂盒 的制备方法， 其特征在于还配备样本稀释液， 所述样本稀释液是在浓度 0.01 mol/L ~ 0.02 mol/L的磷酸盐緩沖液或浓度 0.01 mol/L ~ 0.02 mol/L的三羟曱基 氨基曱烷緩沖液中加入牛血清白蛋白配制而成，所述牛血清白蛋白的加入量以 其浓度达到 1 g ~ 2 g/100 mL为限。
10、 根据权利要求 8或 9所述的以 Adipsin为检测指标的子痫前期检 测试剂盒的制备方法， 其特征在于：
( 1 )制备包被有抗人 Adipsin单克隆抗体的多孔板时， 所述抗人 Adipsin单 克隆抗体稀释液的加入量为 100 μΐ /孔，所述浓度为 1 g/100 mL的牛血清白蛋白 溶液的加入量为 120 μΐ /孔；
( 2 )制备生物素标记的抗人 Adipsin单克隆抗体时， 按酰 -N羟基丁二酰亚 胺酯与抗人 Adipsin单克隆抗体的质量比 = 0.5 ~ 1： 7量取所述酰 -N羟基丁二酰 亚胺酯溶液和所述抗人 Adipsin单克隆抗体溶液形成混合液。
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