CN114019173B - 用于预测非综合征型唇腭裂的标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于预测非综合征型唇腭裂的标志物及其应用，该标志物包括载脂蛋白A、触珠蛋白、C‑反应蛋白中的一种或几种。在应用上，将载脂蛋白A、触珠蛋白、C‑反应蛋白中的一种或几种的检测试剂制备成预测胎儿非综合征型唇腭裂的产品，产品可以为芯片或试剂盒，通过这些产品检测妊娠中期母体血清中该标志物的表达水平可以准确预测非综合征型唇腭裂风险，特别是，通过筛查母体血清蛋白中的载脂蛋白A可以确定胎儿唇裂是否伴发腭裂。

Description

用于预测非综合征型唇腭裂的标志物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域，特别涉及一种用于预测非综合征型唇腭裂的标志物及其应用。
背景技术
唇腭裂是常见的先天性口腔颌面部畸形，占所有面部畸形的三分之二，其全球发生率约为1:700。唇腭裂患儿除了面部畸形之外，通常还伴有语音、听力、进食、颌骨发育及心理障碍等，给家庭和社会带来了沉重的精神压力和经济负担。根据解剖部位，唇腭裂可分为单纯唇裂(cleft lip only，CLO)、唇裂伴腭裂(cleft lip withpalate，CLP)和单纯腭裂(cleftpalate only，CPO)。CLO和CLP通常合并为一组，即唇裂伴或不伴腭裂(cleft lipwith orwithout the palate，CL/P)。另外，根据是否伴有其它的全身性或颅颌面先天畸形，唇腭裂又可分为综合征型和非综合征型，其中约70％CL/P和50％CPO为非综合征型唇腭裂(non-syndromic cleft lip with orwithout cleftpalate，NSCL/P)。
产前诊断可以帮助我们了解胎儿的健康状况，是减少先天性缺陷和遗传病胎儿出生的重要检测技术。目前，超声检查为产前诊断唇腭裂的首选非侵入性诊断技术。然而，由于胎儿颜面部结构复杂，该方法的准确性受到超声检查者技巧、胎儿位置、产妇体质、羊水量以及唇腭裂类型等因素影响。研究显示利用超声诊断早期发现CL/P的平均概率为65％，而发现CPO的概率则低于50％。对于唇腭裂疾病，准确的产前诊断可以给胎儿父母提供有效的咨询，他们可以提前了解胎儿具体唇腭裂类型、喂养方法、手术治疗方案、护理费用以及后代遗传概率等。另外，不同的唇腭裂类型可能会影响孕妇的分娩选择。因此，提高唇腭裂的产前诊断准确率尤为重要。
在孕妇的外周血中筛查畸形相关标志物目前被公认为产前诊断的最理想方式，它相对无创，可避免传统有创产前诊断方法(如羊水穿刺、脐血穿刺等)带来的风险，且方便在基层医院开展。孕期母体和胎儿之间存在相互物质交换，包括各类蛋白质、多肽、激素、生长因子和免疫调节因子等。母体发生生理变化以适应胎儿的生长发育，胎儿似母体内分泌器官产生大量的蛋白质通过母-胎界面进入母体循环。因此，在妊娠过程中可以在孕妇的外周血中检测到许多胎儿和母体释放的化学物质。当胎儿发育出现异常的时候，这些物质在母体外周血中的平衡可能会被打破，因此母体外周血标志物的识别有助于产前诊断标志物发现，并帮助更好地了解潜在的发病机制。例如，目前临床上已采用孕中期检测血清中甲胎蛋白、游离-β-绒毛膜促性腺激素和游离雌三醇的水平，筛查诊断唐氏综合征、开放性神经管缺陷和18-三体综合征等疾病。但目前尚无血清筛查技术用于NSCL/P产前诊断的相关报道。
发明内容
为了通过血清筛查技术预测非综合征型唇腭裂，本发明提供了一种用于预测非综合征型唇腭裂的标志物及其应用。
本发明提供的技术方案具体如下：
第一方面，提供一种用于预测非综合征型唇腭裂的标志物，该标志物包括载脂蛋白A(APOA)、触珠蛋白(HPT)、C-反应蛋白(CRP)中的一种或几种。
第二方面，提供一种用于预测非综合征型唇腭裂的检测试剂，该检测试剂能特异性检测上述用于预测非综合征型唇腭裂的标志物。
第三方面，提供上述用于预测非综合征型唇腭裂的标志物、上述用于预测非综合征型唇腭裂的检测试剂在制备预测胎儿非综合征型唇腭裂的产品中的应用。
在上述技术方案的基础上，产品通过检测孕妇体液样品中非综合征型唇腭裂标志物的表达水平来预测胎儿非综合征型唇腭裂。具体地，体液样品选自血液、血浆、血清、唾液、组织液、尿液、组织样品中的一种。进一步地，体液样品优选为妊娠中期母体血清。
在上述技术方案的基础上，产品为芯片、试剂盒或仪器。
在上述技术方案的基础上，产品包括特异性识别APOA的试剂。
第四方面，提供一种用于预测非综合征型唇腭裂风险的系统，包括：
获取模块，用于获取上述标志物的表达水平；
预测模块，用于根据获取模块获得的表达水平预测非综合征型唇腭裂风险评分，并输出风险评分；
其中，获取模块与预测模块之间通过无线和/或有线方式连接。
第五方面，提供一种用于预测非综合征型唇腭裂风险的仪器，该仪器上述用于预测非综合征型唇腭裂风险的系统。
本发明具有如下有益效果：
1.本发明在传统超声检查唇腭裂的基础上，扩增了产前诊断NSCL/P的手段；
2.本发明提高了NSCL/P检测效率，准确率受影响因素较少；
3.本发明对孕妇相对无创，操作过程简单，可避免传统有创产前诊断方法(如羊水穿刺、脐血穿刺等)带来的风险，且方便在基层医院开展，易于推广。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为利用本发明的产品检测NSCL/P的方法示意图。
图2为实施例1的ELISA检测结果；其中，图2A展示了健康胎儿(Con组)、非综合征型单纯唇裂胎儿(NSCLO组)、非综合征型唇裂伴腭裂胎儿(NSCLP组)的母体血清中HPT表达水平的对比；图2B展示了Con组、NSCLO组、NSCLP组的母体血清中CRP表达水平的对比；图2C展示了Con组、NSCLO组、NSCLP组的母体血清中APOA表达水平的对比；图2D展示了Con组与NSCL/P组(即NSCLO组+NSCLP组)的母体血清中HPT表达水平的对比；图2E展示了Con组与NSCL/P组的母体血清中CRP表达水平的对比；图2F展示了Con组与NSCL/P组的母体血清中APOA表达水平的对比。
图3为表1中ROC曲线分析结果；其中，图3A展示了NSCLO组以Con组为基准的ROC曲线分析结果；图3B展示了NSCLP组以Con组为基准的ROC曲线分析结果；图3C展示了NSCL/P组以Con组为基准的ROC曲线分析结果；图3D展示了NSCLP组以NSCLO组为基准的ROC曲线分析结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
针对目前在产前诊断中超声检查发现NSCL/P的准确率受多因素影响且检出率较低等缺点和不足，本发明利用iTRAQ技术对比了妊娠中期正常胎儿和NSCL/P胎儿母体血清蛋白表达情况，并通过靶向蛋白质组学MRM-MS技术和ELISA技术验证差异表达蛋白，最终筛选出3种NSCL/P标志蛋白(APOA、HPT和CRP)。结果表明，通过检测妊娠中期母体血清中这三种标志蛋白，可提高NSCL/P检测概率，有很好的应用前景。
在应用上，将载脂蛋白A(APOA)、触珠蛋白(HPT)、C-反应蛋白(CRP)中的一种或几种的检测试剂制备成预测胎儿非综合征型唇腭裂的产品，产品可以为芯片或试剂盒，还可以制造专门用于检测APOA、HPT、CRP中一种或几种的仪器，该仪器采用一种用于预测非综合征型唇腭裂风险的系统，该系统包括：
获取模块，用于获取上述标志物的表达水平；
预测模块，用于根据获取模块获得的表达水平预测非综合征型唇腭裂风险评分，并输出风险评分；
其中，获取模块与预测模块之间通过无线和/或有线方式连接。
以上产品可以通过检测孕妇体液样品中非综合征型唇腭裂标志物的表达水平来预测胎儿非综合征型唇腭裂。具体地，体液样品选自血液、血浆、血清、唾液、组织液、尿液、组织样品中的一种；进一步地，体液样品优选为妊娠中期母体血清。
在实际使用中，通过筛查妊娠中期母体血清蛋白检测非综合征型唇腭裂的方法，依次包括如下步骤：
1)妊娠中期(16～28周)抽取母体清晨空腹静脉血2mL；
2)室温静置2小时后离心收集血清；
3)用以上产品检测血清中APOA、HPT、CRP中一种或几种的表达水平。
以下通过具体实施例来阐述本发明的技术方案：
实施例1：采用筛查母体血清蛋白检测NSCL/P
通过筛查母体血清蛋白APOA、HPT和CRP检测NSCL/P(图1)。
对于年龄在22-34岁区段的孕妇，既往身体健康，不合并妊娠高血压、糖尿病等系统性疾病，且无影响发育的遗传病史，超声检查显示单胎，不确定胎儿是否伴发NSCL/P，可收集妊娠中期(16～28周)母体清晨空腹静脉血；
取静脉血2mL置于无添加剂的采血管中，室温静置2小时，离心，2000g，20min，小心吸取上清，即为血清；
采用ELISA方法检测血清中APOA、HPT和CRP等蛋白的表达水平，结果如图2所示。血清建议稀释浓度分别为2000倍、300000倍和100倍，推荐试剂盒分别为APOA(ab212165；Abcam公司，英国)、HPT(KE00148,Proteintech公司，中国)和CRP(KE00004,Proteintech公司，中国)；
若孕妇血清中HPT<179.3μg/mL，CRP>685.8ng/mL，其胎儿患非综合征型唇腭裂(NSCL/P)的概率为64.91％，特异性为76.67％；
若孕妇血清中APOA<56.95μg/mL，HPT<289.7μg/mL，CRP>728.2ng/mL，其胎儿患非综合征型单纯唇裂(NSCLO)的概率为68％，特异性为73.33％；
若孕妇血清中APOA>112.6μg/mL，HPT<179.3μg/mL，CRP>685.8ng/mL，其胎儿患非综合征型唇裂伴腭裂(NSCLP)的概率为56.25％，特异性为96.67％(表1)。
如图2所示，与Con组母体血清相比，NSCLO组中HPT蛋白表达明显降低(图2A)，NSCLP组HPT表达明显降低(图2A)、CRP和APOA表达显著升高(图2B、图2C)；与NSCLO组母体血清相比，NSCLP组APOA表达显著升高(图2C)；若将NSCLO组和NSCLP组合并成NSCL/P组，与Con组母体血清相比，NSCL/P组HPT表达明显降低(图2D)、CRP表达显著升高(图2E)，而APOA表达无明显差异(图2F)。
实施例2：采用筛查母体血清蛋白判断胎儿唇裂是否伴发腭裂
通过图1所示方法筛查母体血清蛋白APOA确定胎儿唇裂是否伴发腭裂：对于年龄在22-34岁区段的孕妇，既往身体健康，不合并妊娠高血压、糖尿病等系统性疾病，且无影响发育的遗传病史，超声检查显示单胎妊娠且有明显唇裂，不确定胎儿是否伴发腭裂，可收集妊娠中期(16～28周)母体清晨空腹静脉血；收集血清及ELISA检测APOA蛋白水平，过程同实施例1；
若孕妇血清中APOA>56.95μg/mL，其胎儿患NSCLP的概率为84.375％，特异性为68％(表1)。
表1：母体血清中APOA、HPT和CRP蛋白水平检测NSCL/P的参考值
Figure BDA0003360272600000081
表1表明两种或三种蛋白联合检测NSCL/P、NSCLO或NSCLP能力较高，而单独检测APOA可区分NSCLO和NSCLP。图3展示了表1中各组特异度和灵敏度的关系。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.用于预测非综合征型唇腭裂的标志物或其检测试剂在制备预测胎儿非综合征型唇腭裂的产品中的应用，其特征在于：所述用于预测非综合征型唇腭裂的标志物为载脂蛋白A、触珠蛋白、C-反应蛋白三者的组合或触珠蛋白与C-反应蛋白的组合，所述检测试剂能特异性检测所述用于预测非综合征型唇腭裂的标志物；所述产品通过检测孕妇妊娠中期体液样品中非综合征型唇腭裂标志物的表达水平来预测胎儿非综合征型唇腭裂；所述体液样品选自血液、血浆、血清中的一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品为芯片、试剂盒或仪器。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述产品包括特异性识别载脂蛋白A的试剂。
4.一种用于预测非综合征型唇腭裂风险的系统，其特征在于：包括：
获取模块，用于获取用于预测非综合征型唇腭裂的标志物的表达水平；所述用于预测非综合征型唇腭裂的标志物为载脂蛋白A、触珠蛋白、C-反应蛋白三者的组合或触珠蛋白与C-反应蛋白的组合；
预测模块，用于根据所述获取模块获得的表达水平预测非综合征型唇腭裂风险评分，并输出风险评分；
其中，所述获取模块与所述预测模块之间通过无线和/或有线方式连接。
5.一种用于预测非综合征型唇腭裂风险的仪器，其特征在于：使用权利要求4所述的用于预测非综合征型唇腭裂风险的系统。
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