CN112805789A - 诊断肝脂肪变性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于评估患者中非酒精性脂肪性肝炎(脂肪变性)的存在的新方法，其使用将生物标记物组合的函数，而且未将胆红素和身体质量指数用作函数中的标记物。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的非侵入性定量测试，其使得可以检测肝脂肪变性并且有助于鉴定处于非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)风险中的受试者，尤其是患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或纤维化的受试者。
背景技术
脂肪肝是一种可逆性疾病，其中大量的甘油三酯脂肪空泡通过脂肪变性的过程积累在肝细胞中。
非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)是脂肪肝的原因之一，其当脂肪由于除过量饮酒外的其他原因而在肝脏中沉积(脂肪变性)时会发生。NAFLD是发达国家中最常见的肝病。NAFLD是通常与代谢综合征的因素有关的疾病。
虽然肝脏可以保持脂肪而不破坏肝功能，但其也可能发展成非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，即脂肪变性与炎症和纤维化结合的状态(脂肪性肝炎)。NASH是一种进行性疾病：在10年的时间里，多达20％的NASH患者将发展为肝硬化，而且10％的患者将死于肝病。
因此，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是NAFLD的最严重形式，被认为是原因不明的肝硬化的主要原因。
活检是肝脂肪变性评估的常用参考。每当无可用或可行的成像工具(超声波检查，MRE)(例如大型流行病学研究)，则血清生物标记物和评分是诊断脂肪变性的可接受替代方法。
在对处于非酒精性脂肪肝疾病(NALFLD)和NASH风险中的受试者的大型研究中，欧洲指南已建议进行三种血液测试以诊断脂肪变性(EASL J Hepatol 2015)。最佳验证的脂肪变性评分为脂肪肝指数、SteatoTest(Poynard等人，2005，Comparative Hepatology 4：10)和NAFLD肝脂肪评分(Angulo等人，Hepatology 2007；45(4)：846-854)；它们均已在一般人群或3级肥胖人群中进行了外部验证，并且区别性地预测代谢、肝脏和心血管的结果/死亡率。这些评分与胰岛素抗性相关，并且可靠地预测脂肪变性的存在，而非严重程度(Fedchuk等人，Aliment Pharmacol Ther 2014；40：1209–1222)。
SteatoTest是使用九种生化标记物(它们易于评估)的原始组合来计算的，并且将α2-巨球蛋白、触珠蛋白、载脂蛋白A1、总胆红素、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、空腹葡萄糖、甘油三酯、胆固醇和丙氨酸转氨酶(ALT)与根据患者的年龄、性别、体重和身高(身体质量指数)调整的参数组合。
在SteatoTest的9种血清成分中，有两个是可能会影响结果可靠性的两个可变性来源：身体质量指数(BMI)和总胆红素。
NAFLD肝脂肪评分使用年龄、BMI、IGF/糖尿病(是/否)、血小板、AST、ALT和白蛋白(NAFLD评分＝-1.675+0.037×年龄(岁数)+0.094×BMI(kg/m2)+1.13×IFG/糖尿病(是＝1，否＝0)+0.99×AST/ALT比值-0.013×血小板(×109/L)–0.66×白蛋白(g/dL))。
这两个测试使用BMI作为公式中的变量。但是，Butler等人(2017，ClinicalNutrition ESPEN 22，112e115)和Sorkin等人(1999，American Journal ofEpidemiology，150(9)，969–977)表明BMI计算存在一定的可变性。特别地，经过多年人的身高会有下降，这通常在询问患者此种信息时未被考虑到。此外，人们可能不知道(或提供)他们的确切体重。总之，这意味着计算出的身体质量指数(BMI(kg/m2)＝体重(kg)/身高(m)2)通常不准确。
此外，Poynard等人(BMC Gastroenterol.2011；11：39)表明使用胆红素可能会引起假阳性，尤其是在患有吉尔伯特综合征或溶血的患者中。
US20170082603实质上涉及在患有肝病的个体中诊断肝纤维化的存在和/或严重程度和/或监测治疗的疗效的方法，其包括将各种标记物的值组合以通过数学函数获得评分。US20170082603中公开的方法可以用于已经被诊断出患有NASH的患者，因为它们使得能够检测朝向纤维化的进展，但是并不旨在确定NASH的存在。该文献未公开也未暗示根据特别是本文公开的方法来检测肝脂肪变性的可能性。
WO2014049131涉及一种用于评估受试者的肝脏中NASH病灶的存在和/或严重程度的体外非侵入性方法，其中所述方法包括以下步骤：a.在所述受试者的样品中测量至少一种生物标记物，优选1、2、3或4种生物标记物，所述生物标记物选自以下至少一种：i.至少一种反映细胞凋亡的生物标记物，和/或ii.至少一种反映人体测量学的生物标记物，和/或iii.至少一种反映代谢活性的生物标记物，和/或iv.至少一种反映肝脏状况的生物标记物；以及b.将所述至少一种生物标记物测量值组合于数学函数中。第23-24页公开的公式全部包括BMI。在该文献中未公开明确否认使用BMI和胆红素的选择。
WO2018050804公开了用于在患者中评估NAFLD和NAH的新方法，其通过数学函数组合血清标记物的测量。其中公开的函数全部包括胆红素。
即使Poynard等人(BMC Gastroenterol.2011；11：39)表明使用胆红素可能诱导假阳性，也没有暗示可以修正WO2018050804的测试以获得本文公开的能够诊断肝脂肪变性的方法。
Munteanu等人(Aliment Pharmacol Ther 2016；44：877–889)使用SAF评分作为组织学参考来评估FibroTest、SteatoTest和ActiTest对NAFLD患者的诊断性能。
发明内容
因此，需要开发新的测试来检测肝脂肪变性，特别是当与炎症(NASH)或纤维化相关联时，以简化这种多分析物生物标记物的可行性。该测试优选地应当具有与现有技术的测试(Steatotest)相同的质量。
通常，通过绘制接收工作特征(ROC)曲线并测量接收工作特征曲线下面积(AUROC)来确定测试的质量。
针对不同的阈值(从0到1)，根据测试获得的结果，在对患者分类后通过绘制灵敏度对(1-特异性)的曲线而绘制出ROC曲线。
通常公认的是，其下面积的值大于0.7的ROC曲线是良好的预测曲线。必须承认ROC曲线是允许预测测试的质量的曲线。最好使AUROC尽可能地接近1，此值描述了100％特异和灵敏的测试。
要提醒的是
(1)灵敏度是指在具有所寻求表型的个体中诊断为阳性(真阳性被检测到)的概率：如果患者具有该表型，则该测试为阳性。当假阴性数高时，灵敏度是低的。灵敏度的计算公式为SE＝(存在标识(sign)的具有表型的个体数)/(存在标识的具有表型的个体数+缺乏标识的具有表型的个体数)。
(2)特异性是指在没有所寻求表型的个体中诊断为阴性(真阴性未被检测到)的概率：如果患者未患病，则测试为阴性。假阳性数高时，特异性是低的。特异性的计算公式为SP＝(缺乏标识的不具有表型的个体数)/(缺乏标识的不具有表型的个体数+存在标识的不具有表型的个体数)。
(3)阳性预测值(PPV)：是指如果诊断测试为阳性则是患病(即患者不是假阳性)的概率：如果测试为阳性，则患者具有表型。阳性预测值的计算公式为PPV＝(存在标识的具有表型的个体数)/(存在标识的具有表型的个体数+存在标识的不具有表型的个体数)。
(4)阴性预测值(NPV)：是指如果诊断测试为阴性则是未患病(即患者不是假阴性)的概率：如果测试为阴性，则患者不具有表型。阴性预测值的计算公式为NPV＝(缺乏标识的不具有表型的个体数)/(缺乏标识的不具有表型的个体数+缺乏标识的具有表型的个体数)。
为了获得良好的诊断测试，重要的是同时提高特异性和灵敏度。
通常，诊断方法包括：
i.从患者收集信息的步骤；
ii.将所述信息与阈值比较的步骤；
iii.根据患者信息与阈值之间的差异推导出患者是否患有特定疾病、患者疾病的阶段或患者的状态是否将演变为给定状态的步骤。
作为说明
i.能从患者收集的信息可以直接地从患者收集(例如来自NMR、扫描仪、放射线照相、对比增强计算机断层扫描的图像)，或间接地从患者收集，例如来自已经从患者获取的生物样品(例如尿液、血液样品...)。信息可以是特定生物标记物的存在(或不存在)和/或水平，对病原决定因素(细菌或病毒DNA/RNA)是否特异，或升高的患者标记物水平；
ii.在获得信息后，就将其与不同的值/标准进行比较，并评估相对于这些标准的偏差。作为说明，应将某些生物标记物的水平与健康患者通常观察到的水平以及患有该疾病的患者(或对于预后方法而言，已知后来会演变为特定疾病阶段的患者)通常观察到的水平进行比较。可存在阈值，其中超过该阈值的95％的患者患有疾病，而没有超过该阈值的95％的患者没有患有疾病。对于可以确定多个临床阶段的疾病，这种阈值可以区分不同的阶段。在此步骤ii中，可以将各种类型的信息与其各自的标准进行比较，以便能够在步骤iii中进行诊断(作为说明，可以使用从各种血液或血浆标记物的测量、扫描仪的图像和身体质量指数获得的值和信息)。
iii.最后的步骤实际上是通过特别是考虑到从患者收集的信息、如上所述的阈值来进行诊断(或者，确定预后)，即确定患者是否患有所寻疾病(或者患者是否将演变成给定的临床状态)。医生还可以考虑其他因素(例如所收集信息的一致性等)来进行诊断。
某些方法，例如本申请中公开的方法，还应包括步骤i.a)，其包括修正从患者获得的信息以便获得一种新型信息的步骤，所述新型信息是然后在步骤ii中与标准相比较的信息。此类修正是将函数中变量的值组合，并获得最终值。
还应注意的是，如本文公开的，仅测量患者血浆或血清中标记物水平的值并将其在算法中组合是方法的一部分，但仅提供中间结果(最终值或指数)，然后将其与参考指数(阈值)进行比较，以真正能够进行诊断。
还应注意，就输出值(由本文公开的公式计算出的指数)不是关于患者状态的明确答案的意义而言，本文公开的测试不是“金标准”测试。实际上，这些测试是基于统计学的，因此可能会有假阳性或假阴性结果，这就是为什么解释指数时医生的具体经验对于为每位患者做出预后和决定采取哪种随访是至关重要的原因。
然而，由于本文为指数的各种阈值提供的测试的特异性、灵敏度、阳性预测值和阴性预测值，因此在调研临床病例时，这些测试在为医生提供帮助方面具有极大的意义。因此，如上公开的步骤iii不是直接且立即来自步骤ii，因为医生必须根据临床和一般情况来解释结果才能得出结论。
因此，本发明涉及一种用于诊断受试者中脂肪变性的存在的体外方法，其包括以下步骤：
(a)在数学函数中组合至少三种生物标记物的值，所述值选自：
○测量的在受试者的血液、血清或血浆中循环的生化标记物的量，以及
○患者的身体特征
以便获得最终值。
函数还可以包括以下步骤：
(b)任选地将最终值与预定值进行比较，以及
(c)基于在(a)计算出的最终值来确定脂肪变性的存在，
条件是受试者的身体质量指数和胆红素水平未用作(a)中的生物标记物。
该方法在体外或离体进行。当在函数中组合至少三个，优选至少四个，优选至少五个，优选至少或正好六个，优选至少或正好七个，优选至少或正好八个，优选至少或正好九个生物标记物的值时是优选的。
以下描述了可用于执行本文公开的方法的一些函数。然而，应注意的是，遵循本发明的教导并且避免在所用标记物和变量中使用胆红素和BMI，获得和开发与本文公开的函数一样(或更)有效的其他函数没有技术上的困难。
还应注意，尽管已通过逻辑回归获得了本文的示例性函数，但是可以使用其他统计学方法来提供这样的函数，即其将使用各种标记物的值并提供指示脂肪变性存在的值。
尽管可以在所公开的函数中使用任何标记物，但是出于以上公开的原因应避免在函数中使用胆红素(总胆红素)和BMI。
预定值由本领域技术人员根据实际函数来计算和确定。优选具有第一预定值，在所述第一预定值以下，阴性预测值高于90％，优选高于95％，更优选高于98％。因此，任何低于该第一预定值的最终值将意味着患者没有脂肪变性。优选对函数进行归一化，使得该第一预定值为0.25。
也可以限定第二预定值，在所述第二预定值以上，阳性预测值高于75％，优选高于85％，更优选高于90％。因此，任何高于该第二预定值的最终值将意味着患者患有脂肪变性，并且应诊断NASH和纤维化(脂肪变性的两种严重并发症)。优选对函数进行归一化，使得该第二预定值为0.50。
本方法使用半定量函数，该半定量函数使得可以提供有关患者肝脏中脂肪变性的信息。这意指最终值越高，患者肝脏中的脂肪变性越严重。
本方法应由医生按以下方式使用：
当测试为阳性时(即，最终值高于预定阈值时)，医生将首先寻找可能引起脂肪变性且易于检测的任何其他肝病原因，即患者是否患有最常见酒精性脂肪变性、有特异性标记物的病毒性肝炎(乙型、丙型肝炎)、药物诱导性肝炎或者遗传性脂肪变性或传染性脂肪变性。如果排除了脂肪变性的这种潜在原因，医生将考虑其他代谢原因(例如超重、2-型糖尿病、血脂异常、高血压、高尿酸血症…)。存在的这种其他原因使得可以最终确定诊断，因为这些原因与肝脏中增加的脂肪有关。
还应注意的是，在检测到某些异常(例如常见肝标记物异常或者通过回波描记术检测到肝脏中的脂肪)之后，患者通常会咨询肝病学家，从而使得更容易地进行诊断。
因此，本文公开的方法通常将与其他现有测试(WO0216949中公开的Fibrotest和WO2018050804中公开的NASH测试)一起执行。获得所有这些测试的结果将使得医生能够对患者的肝病做出准确的诊断。
总之，还要考虑患者的一般状况和临床评估(这是诊断方法始终要考虑的)，最终值使得可确定脂肪变性的存在。因此，本方法使得可以得出患者中存在还是不存在脂肪变性的结论和/或诊断相关的炎症(NASH)或纤维化的存在。
该方法特别有益于检测脂肪变性的不存在(当最终值低于第一预定值时)，因为其使得可避免对患者进行任何不必要的检查，并在需要时指导医生调查其他原因。
在本方法中，优选以下一项或多项(以任一组合)：
(a)在步骤(a)中测量浓度的生化标记物中不包括胆红素；
(b)步骤(a)的生化标记物选自α2-巨球蛋白(A2M)、GGT(γ-谷氨酰转肽酶)、触珠蛋白、载脂蛋白A-I(apoA1)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、甘油三酯、总胆固醇、空腹葡萄糖、γ-球蛋白、白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、IL10、TGF-β1、apoA2、apoB、细胞角蛋白18、血小板数、凝血酶原水平、透明质酸、尿素、N-端III型原胶原蛋白、1型组织抑制剂金属蛋白酶(TIMP-1)、IV型胶原蛋白(Coll IV)、骨保护素、miRNA122、细胞角蛋白18、血清淀粉样蛋白A(SAA)、α-1-抗胰蛋白酶(同种型1)、果糖二磷酸醛缩酶A、果糖二磷酸醛缩酶B、富马酰乙酰乙酸酶、运甲状腺素蛋白、PR02275、C反应蛋白(同种型1)、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A11、DNA指导的RNA聚合酶I亚基RPA1、遮蔽蛋白(同种型1)、α骨骼肌肌动蛋白、主动脉平滑肌肌动蛋白、碱性磷酸酶、不典型(uncharacterized)蛋白C22orf30(同种型4)、血清淀粉样蛋白A2(同种型a)、载脂蛋白C-III、载脂蛋白E、载脂蛋白A-II、聚合免疫球蛋白受体、von Willebrand因子、氨基酰化酶-1、G蛋白偶联受体98(同种型1)、对氧磷酶/芳基酯酶1、补体成分C7、血红素结合蛋白(hemopexin)、补体C1q亚成分、对氧磷酶/内酰胺酶3、补体C2(片段)、多能蛋白聚糖(versican)核心蛋白(同种型Vint)、细胞外基质蛋白1(同种型1)、E3SUMO-蛋白连接酶RanBP2、触珠蛋白相关蛋白(同种型1)、脂联素、视黄醇结合蛋白、铜蓝蛋白(ceruloplasmin)、α2抗纤溶酶、抗凝血酶、甲状腺素结合蛋白、蛋白C、α2脂蛋白、四连蛋白、岩藻糖基化的A2M、岩藻糖基化的触珠蛋白、岩藻糖基化的apoA1和碳水化合物不足转铁蛋白；
(c)步骤(a)的生化标记物选自α2-巨球蛋白、AST(天冬氨酸转氨酶)、ALT(丙氨酸转氨酶)、GGT(γ-谷氨酰转肽酶)、总胆红素、触珠蛋白、apoA1、甘油三酯、总胆固醇、空腹葡萄糖、γ-球蛋白、白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、IL10、TGF-β1、apoA2、apoB、细胞角蛋白18和细胞角蛋白19成分、血小板数、凝血酶原水平、透明质酸、尿素、N-端III型原胶原蛋白、1型组织抑制剂金属蛋白酶(TIMP-1)、IV型胶原蛋白(Coll IV)和骨保护素；
(d)步骤(a)的生化标记物为α-2-巨球蛋白、ApoA1、GGT、触珠蛋白、ALT、AST、空腹葡萄糖、总胆固醇和甘油三酯；
(e)在数学函数中使用至少6个，更优选至少7个，更优选至少8个，更优选至少或恰好9个生化标记物；
(f)a)的函数还包括患者的至少一个，优选两个身体特征，所述身体特征选自患者的性别和年龄；
(g)BMI不用作患者的身体特征；
(h)(a)的函数包括对循环的α-2-巨球蛋白、ApoA1、GGT、触珠蛋白、ALT、AST、空腹葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯测量的值以及与患者的年龄和性别相对应的值；
(i)a)的函数将α-2-巨球蛋白、ApoA1、GGT、触珠蛋白、ALT、AST、空腹葡萄糖、总胆固醇和甘油三酯的测量值以及患者的年龄和性别组合；
(j)函数是逻辑函数，即通过逻辑回归获得的函数，如下所述；
(k)函数为半定量函数。
在一个特定的实施方案中，函数已通过以下方式获得：
a)评估一组患者中脂肪变性的存在，其中患者的循环生化标记物的值是已知的；
b)通过一维分析，鉴定以下的组之间值显著不同的循环生化标记物：
i.患有脂肪变性的患者，和
ii.没有脂肪变性的患者；
c)针对脂肪变性的发生，进行逻辑回归分析以评估和考量步骤b)中鉴定的标记物的独立判别值；
d)从而通过将这些鉴定的独立因子组合起来获得函数。
下面提供进一步说明这种用于获得诊断函数的过程。
在优选的实施方案中，函数为a0+a1×年龄(岁数)+a2×ApoA1(g/l)+a3×Log(A2M，g/l)+a4×Log(GGT，IU/l)+a5×Log(ALT，IU/l)+a6×Log(AST，IU/l)+a7×Log(Hapto，g/l)+a8×Log(甘油三酯TG，mmol/l)+a9×Log(总胆固醇CT，mmol/l)+a10×Log(空腹葡萄糖，g/l)+a11×性别(女性为0，男性为1)。
特别地，
a)4.8≤a0≤5.5，优选5≤a0≤5.3；
b)-0.03≤a1≤-0.015，优选-0.025≤a1≤-0.02；
c)0.9≤a2≤1.2，优选0.95≤a2≤1.05；
d)1.8≤a3≤2.2，优选1.95≤a3≤2.05；
e)-1.3≤a4≤-1.1，优选-1.2≤a4≤-1.1；
f)-1.45≤a5≤-1.2，优选-1.36≤a5≤-1.3；
g)0.5≤a6≤0.7，优选0.55≤a6≤0.65；
h)-0.35≤a7≤-0.22，优选-0.3≤a7≤-0.25；
i)-1.45≤a8≤-1.25，优选-1.4≤a8≤-1.3；
j)-0.8≤a9≤-0.6，优选-0.75≤a9≤-0.65；
k)-3.55≤a10≤-3.35，优选-3.5≤a10≤-3.4；
l)0.35≤a11≤0.55，优选0.4≤a11≤0.5。
在优选的实施方案中，函数为5.17-0.022×年龄(岁数)+1.02×ApoA1(g/l)+1.99×Log(A2M，g/l)-1.16×Log(GGT，IU/l)-1.33×Log(ALT，IU/l)+0.6×Log(AST，IU/l)-0.29×Log(Hapto，g/l)-1.35×Log(甘油三酯TG，mmol/l)-0.68×Log(总胆固醇CT，mmol/l)-3.46×Log(空腹葡萄糖，g/l)+0.46×性别(女性为0，男性为1)。
如上所提供的公式的系数已经四舍五入到小数点后第二位，并且使用四舍五入到小数点后一位(further)或更低(lower)小数位的系数的任何函数也可以如本文所公开地使用，因此将是等效的。
作为说明，使用四舍五入到小数点后第五位的系数的函数可以为5.17005-0.02202×年龄(岁数)+1.01850×ApoA1(g/l)+1.98726×Log(A2M，g/l)-1.16378×Log(GGT，IU/l)-1.32517×Log(ALT，IU/l)+0.60003×Log(AST，IU/l)-0.28781×Log(Hapto，g/l)-1.34979×Log(甘油三酯TG，mmol/l)-0.68426×Log(总胆固醇CT，mmol/l)-3.45945×Log(空腹葡萄糖，g/l)+0.46473×性别(女性为0，男性为1)。这种函数也是本发明的主题。
因此，本文公开的方法利用不同变量的值的离体组合，以获得指示患者中存在脂肪变性的最终结果。因此，将排除在患者身体上施加的任何步骤。在本文公开的方法中，应理解，测量其值并作为变量用于函数中的标记物是存在于患者的血液、血浆或血清中的循环蛋白质或天然成分。所选标记物的值应根据本领域已知的方法在预先采集的血液、血浆或血清样品上进行测量。这些值以根据本领域的单位表示。但是，如果本领域技术人员选择其他单位来表示测量值，则这将仅仅改变逻辑函数内的系数。因此本方法将仍然适用。
但是，在另一个实施方案中，本发明涉及一种用于预后患者中存在脂肪变性的方法，其包括以下步骤：从患者采集血液、血浆或血清，测量采集的样品中存在的标记物的值，以及通过如上公开的函数组合所测量的值。标记物如上所公开。因此，所述方法还可以包括获得(测量)逻辑函数中使用的不同值的步骤，例如测量已预先从患者采集的血液或血浆样品中如上所述各种生物标记物的浓度/值/量的步骤。
所述方法还可以包括以下步骤：将第一指数与预定阈值进行比较，特别是用以确定第一指数是高于还是低于所述阈值。
所述方法还可以包括以下步骤：如果第一指数超过所述阈值，则推导出所述患者中存在脂肪变性。
在此设计的测试是定量测试，最终结果值为0至1。可认为当最终结果等于或大于0.25时，患者很可能存在脂肪变性(如上所述)，因此需要进行治疗或随访。
在以上所述的方法中，将第一预定值设定为0.25，并且如果最终结果高于或等于0.25，则患者患有非酒精性脂肪性肝炎(脂肪变性)。
简而言之，对于低于0.25的最终值，患者没有脂肪变性。对于在0.25至0.50之间的最终值，需要对患者进行定期随访，并进行新的评估。对于在0.50至0.75之间的最终值，具有临床意义，应进行治疗(从饮食和运动开始)。高于0.75时，脂肪变性很明显，应开始强化治疗，患者可能还有其他肝病。
本发明还包括一种用于诊断患者中脂肪变性的设备，其包括：
a)第一装置，其中所述第一装置通过以下方式提供第一指数：通过逻辑函数将对患者的血清或血浆中存在的标记物所测量的值组合，其中所述第一逻辑函数为
a1+a2×Log(A2M，g/l)+a3×年龄(岁数)+a4×Log(ALT，IU/l)+a5 x(Apoa1，g/l)+a6×Log(AST，IU/l)+a7×Log(BILI，μmol/l)+a8×Log(CT，mmol/l)+a9×性别(女性为0，男性为1)+a10×Log(GGT，IU/l)+a11×Log(Hapto，g/l)+a12×Log(TG，mmol/l)；
其中
--8≤a1≤-7；
-0.1≤a2≤0.6，优选0.15≤a2≤0.55；
-0.02≤a3≤0.05，优选0.03≤a3≤0.04；
-1.1≤a4≤1.5，优选1.2≤a4≤1.4；
--0.2≤a5≤1.0；
-1.8≤a6≤2.3，优选1.95≤a6≤2.2；
-0.8≤a7≤1.6，优选0.9≤a7≤1.5；
--1.7≤a8≤-1.3，优选-1.6≤a8≤-1.4；
-0.015≤a9≤0.20；
-0.15≤a10≤0.25，优选0.20≤a10≤0.22；
--0.3≤a11≤0.1；
-0.9≤a12≤1.2，优选1.0≤a12≤1.1。
随后，所述第一指数可以用于确定所述患者中脂肪变性的存在以及是否有必要发起治疗或随访，特别是借助上表1。
在具体的实施方案中，第一装置是计算机化的。它可以是记录有公式的电子表格，当输入上述各种因素时，其提供作为输出的第一指数。它也可以是计算机程序，在接收到上述各种因素之后，其提供作为输出的第一指数。
第一装置可以表现出以下一项或多项(以任一组合)：
-在私有或公共网络中运行；
-从远隔地的发送者接收输入(上述各种因素的值)(即，将这些输入从与第一装置所在位置不同的位置发送到第一装置)；
-要求发送者在发送输入之前先确定自己的身份；
-以安全的方式接收输入(上述各种因素的值)；
-将输出(第一指数)发送到输入的发送者；
-将输出存储在数据库中(可能具有唯一的标识符，从而可以将输入、输出分配给该标识符)；
-为第一指数提供进一步的信息(例如与患者所属群体中的患病率相关的灵敏度和/或特异性和/或阳性预测值和/或阴性预测值)。
还可预见一种非暂时性计算机可读存储介质，其上存储有包括程序指令的计算机程序，当该计算机程序由数据处理设备运行时，该计算机程序可加载到数据处理单元中，并且适于使数据处理单元执行用于通过以下方式计算第一指数的方法：通过如上公开的逻辑函数将对患者的血清或血浆中存在的标记物所测量的值组合。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种包括计算机算法的微处理器，该计算机算法用于执行确定患者中脂肪变性的存在的方法：提供患者的血液标记物的值以及任选地提供年龄和分配给患者性别的值；以及执行数学函数(如上公开，或如上公开所获得的)以组合这些值来获得用于患者中存在脂肪变性的评分。
本发明还涉及函数、设备和/或微处理器的用途，以便通过使用函数并将结果与预定阈值进行比较以确定患者中脂肪变性的存在，从而对患者中脂肪变性的存在进行诊断。
本发明还涉及一种用于诊断患者中肝病的离体方法，其包括以下步骤：
-执行本文公开的方法以确定患者中脂肪变性的存在，
-确定患者中肝纤维化的存在，
-确定患者中肝炎症的存在，以及
根据上述确定的结果来诊断患者中的肝病。
当通过特别是经由Fibrotest在函数中组合生物标记物的值来确定肝纤维化时，是优选的。在其他实施方案中，通过振动控制的瞬时弹性成像对肝硬度进行离体测量来确定肝纤维化。
当通过特别是经由NASH测试在函数中组合生物标记物的值来确定患者中肝炎症的存在时，是优选的。
用于执行本方法的设备也是本发明的主题。
特别地，本发明还涉及用于检测患者中肝病的方法和设备，包括以下步骤：
-执行本文公开的用于检测脂肪变性的方法，
-执行WO0216949中公开的用于确定肝纤维化的方法(Fibrotest)，
-执行用于确定炎症的方法(WO2018050804中公开的NASH测试)，
根据每种方法获得的结果来得出关于肝病的结论。
NASH测试的形式为a1+a2×Log(A2M，g/l)+a3×年龄(岁数)+a4×Log(ALT，IU/I)+a5 x(Apoa1，g/l)+a6×Log(AST，IU/l)+a7×Log(BILI，μmol/l)+a8×Log(CT，mmol/l)+a9×性别(女性为0，男性为1)+a10×Log(GGT，IU/l)+a11×Log(Hapto，g/l)+a12×Log(TG，mmol/l)；
其中
--8≤a1≤-7；
-0.1≤a2≤0.6，优选0.15≤a2≤0.55；
-0.02≤a3≤0.05，优选0.03≤a3≤0.04；
-1.1≤a4≤1.5，优选1.2≤a4≤1.4；
--0.2≤a5≤1.0；
-1.8≤a6≤2.3，优选1.95≤a6≤2.2；
-0.8≤a7≤1.6，优选0.9≤a7≤1.5；
--1.7≤a8≤-1.3，优选-1.6≤a8≤-1.4；
-0.015≤a9≤0.20；
-0.15≤a10≤0.25，优选0.20≤a10≤0.22；
--0.3≤a11≤0.1；
-0.9≤a12≤1.2，优选1.0≤a12≤1.1。
该NASH测试使得当最终结果高于0.25时可检测到炎症。
这些测试在本领域中是已知的，并且它们的用途没有进一步发展。
如上所述，本文公开的方法中使用的函数可以是通过逻辑回归获得的函数(可以称为逻辑函数)。
执行逻辑回归的方法在本领域中是已知的。总而言之，它们包括评估受试者群体之间标记物的个体差异(一个具有例如脂肪变性的输出，而另一个不具有输出)。可以选择变化最大的标记物，并进行逻辑回归分析以考量所选标记物的独立判别值。如果某些标记物在组之间无变化，则这些标记物在函数中的系数会很低(从而表明这些标记物的权重对于性状的存在没有真正的影响)。
然后可以对函数进行归一化(例如，使最终结果始终介于0至1之间)。
因此，本发明还涉及一种获得用于鉴定患者中脂肪变性的存在(或不存在)(或诊断脂肪变性)的函数的方法，其中所述函数将所述患者的血液/血清或血浆中生化标记物的浓度值以及任选的患者年龄、性别组合，所述方法包括以下步骤：
a)评估一组患者中脂肪变性的存在，其中患者的循环生化标记物的值是已知的；
b)通过一维分析，鉴定以下的组之间值显著不同的循环生化标记物：
i.患有脂肪变性的患者，和
ii.没有脂肪变性的患者
c)鉴定患者的年龄、性别是否在以下的组之间显著不同：
i.患有脂肪变性的患者，和
ii.没有脂肪变性的患者
d)针对脂肪变性的发生，进行逻辑回归分析以评估和考量步骤b)和c)中鉴定的标记物的独立判别值，其中身体质量指数和胆红素水平未纳入进行逻辑回归的标记物清单中；
e)从而通过组合这些鉴定的独立因子来获得函数，其中所述函数能够用于诊断受试者中非酒精性脂肪性肝炎(脂肪变性)的存在，并且不使用胆红素或BMI值。
在开发这种诊断测试的方法中，优选以下一项或多项(以任一组合)：
(a)在步骤a)中，使用包括至少100名患者的测试组；
(b)在a)的组中，至少50％的患者应表现出代谢综合征的至少一种因子(因此处于患有脂肪变性的风险)，而不是排除因子(慢性或急性肝病)；
(c)在a)的组中，至少10％的患者是没有脂肪变性且没有活动度(activity)的患者；
(d)步骤(a)的生化标记物选自α2-巨球蛋白(A2M)、GGT(γ-谷氨酰转肽酶)、触珠蛋白、载脂蛋白A-I(apoA1)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、甘油三酯、总胆固醇、空腹葡萄糖、γ-球蛋白、白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、IL10、TGF-β1、apoA2、apoB、细胞角蛋白18、血小板数、凝血酶原水平、透明质酸、尿素、N-端III型原胶原蛋白、1型组织抑制剂金属蛋白酶(TIMP-1)、IV型胶原蛋白(Coll IV)、骨保护素、miRNA122、细胞角蛋白18、血清淀粉样蛋白A(SAA)、α-1-抗胰蛋白酶(同种型1)、果糖二磷酸醛缩酶A、果糖二磷酸醛缩酶B、富马酰乙酰乙酸酶、运甲状腺素蛋白、PR02275、C反应蛋白(同种型1)、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A11、DNA指导的RNA聚合酶I亚基RPA1、遮蔽蛋白(同种型1)、α骨骼肌肌动蛋白、主动脉平滑肌肌动蛋白、碱性磷酸酶、不典型蛋白C22orf30(同种型4)、血清淀粉样蛋白A2(同种型a)、载脂蛋白C-III、载脂蛋白E、载脂蛋白A-II、聚合免疫球蛋白受体、von Willebrand因子、氨基酰化酶-1、G蛋白偶联受体98(同种型1)、对氧磷酶/芳基酯酶1、补体成分C7、血红素结合蛋白、补体C1q亚成分、对氧磷酶/内酰胺酶3、补体C2(片段)、多能蛋白聚糖核心蛋白(同种型Vint)、细胞外基质蛋白1(同种型1)、E3 SUMO-蛋白连接酶RanBP2、触珠蛋白相关蛋白(同种型1)、脂联素、视黄醇结合蛋白、铜蓝蛋白、α2抗纤溶酶、抗凝血酶、甲状腺素结合蛋白、蛋白C、α2脂蛋白、四连蛋白、岩藻糖基化的A2M、岩藻糖基化的触珠蛋白、岩藻糖基化的apoA1和碳水化合物不足转铁蛋白；
(e)步骤(a)的生化标记物选自α2-巨球蛋白、AST(天冬氨酸转氨酶)、ALT(丙氨酸转氨酶)、GGT(γ-谷氨酰转肽酶)、总胆红素、触珠蛋白、apoA1、甘油三酯、总胆固醇、空腹葡萄糖、γ-球蛋白、白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、IL10、TGF-β1、apoA2、apoB、细胞角蛋白18和细胞角蛋白19成分、血小板数、凝血酶原水平、透明质酸、尿素、N-端III型原胶原蛋白、1型组织抑制剂金属蛋白酶(TIMP-1)、IV型胶原蛋白(Coll IV)和骨保护素；
(f)步骤(a)的生化标记物为α-2-巨球蛋白、ApoA1、GGT、触珠蛋白、ALT、AST、空腹葡萄糖、总胆固醇和甘油三酯；
(g)在数学函数中使用至少6个，更优选至少7个，更优选至少8个，更优选至少或恰好9个生化标记物；
(h)最后获得的函数包括患者的至少一个，优选两个身体特征，所述身体特征选自患者的性别和年龄；
(i)函数包括对循环的α-2-巨球蛋白、ApoA1、GGT、触珠蛋白、ALT、AST、空腹葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯测量的值以及与患者的年龄和性别相对应的值；
(j)函数将α-2-巨球蛋白、ApoA1、GGT、触珠蛋白、ALT、AST、空腹葡萄糖、总胆固醇和甘油三酯的测量值以及患者的年龄和性别组合；
(k)方法还包括以下步骤：在包括至少100名患者的验证组中验证逻辑函数。
为了获得尽可能准确的函数，所述组中的患者数量应尽可能多，这表示其优选包括多于50名患者，优选多于100名患者，优选多于200名患者，更优选多于500名患者，或者甚至多于1000名患者。如所述，患者数量没有上限，越多越好。
在患者中诊断出脂肪变性后，医生就可以开始并提供相关的严重疾病、炎症(NASH)或纤维化的适当诊断。本发明还涉及一种用于治疗需要确认存在脂肪变性的NASH患者的方法，其包括以下步骤：执行如上所公开的诊断方法，以及根据其脂肪变性的程度向患者提供适当的治疗。在另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗患者的方法，其包括根据脂肪变性的程度向患者提供适当的脂肪变性治疗的步骤。当通过上述公开的方法计算出的最终值高于0.25，优选高于0.50时，尤其应该进行这样的治疗。
脂肪变性患者的主要治疗是饮食治疗，以便控制肥胖、高血糖、高血脂和过量铁水平(如果存在)。还应避免饮酒。还旨在减轻患者的体重。
当脂肪变性与NASH或纤维化相关联时，也可以向患者提供药物。作为说明，尤其是在没有糖尿病的NASH患者中，可以引用吡格列酮，这是一种2型糖尿病的药物。
维生素E也可以用于患有NASH且没有糖尿病或肝硬化的人。
也可以引用奥贝胆酸(obethicholic acid)来改善非酒精性脂肪性肝炎的组织学特征。(Neuschwander-Tetri等人，Lancet.2015Mar 14；385(9972)：956-65)。
也可以使用其他药物，例如乙基-二十碳五烯酸或二十碳五烯酸乙酯(ethylicosapentate)(临床试验NCT01154985)、丝图珠单抗(simtuzumab)(GS 6624)(临床试验，NCT01672866和NCT01672879)、GFT 505(临床试验NCT01694849)、利拉鲁肽(临床试验NCT01237119)、氯沙坦(临床试验NCT01051219)、cenicriviroc(临床试验NTC002217475)、司隆色替(selonsertib)和aramchol。
该方法的特别益处在于，其使得可以管理患者的随访以及患者中脂肪变性的程度，并且仅对随着时间推移未得到改善的部分患者提出进一步的诊断测试(例如活检)。
以下实施例旨在描述本发明的一个方面，但不应限制本发明。
附图说明
图1：用于构建、验证和靶向的群体。
图2：对于脂肪变性>＝5％的诊断，SteatoTest-2与原始SteatoTest相比是非劣效性的。
图注：1根据试验的纳入标准，在24周活检时对NASH患者进行分析，而在基线活检时不存在脂肪变性<5％(72例病例)。在24周分析的63例病例中，只有3例没有脂肪变性(<5％)。由于该样本量非常小，所以比较性能很弱。为了进行整合的分析，将所有72例基线活检病例包括在内。
2AUROC在慢性丙型肝炎中通过谱效应而大大降低，因为患有最低脂肪变性(1-4％)的病例代表着如CRN评分定义的S0的732/918(80％)。可惜，这些最小脂肪变性等级在代谢性疾病中没有描述。
3AUROC通过对照组的谱效应而增加，因为献血者的脂肪变性测试中位数比活检对照低得多，从而增加了特异性。脂肪变性的患病率没有显著增加。
4AUROC受到对照大幅增加的患病率的极大影响，虽然其测试中位数更高，而与整合的活检群体相比，脂肪变性的患病率除以二。
5添加献血者的亚组并不会显著改变AUROC。
图3：司隆色替试验中脂肪变性、NASH和纤维化生物标记物的减少。在24周时，NAS改善的患者vs没有改善的患者：SteatoTest-2减少-0.02vs+0.04(P＝0.03)，SteatoTest减少-0.014vs+0.014(P＝0.02)，NashTest-2减少-0.06vs+0.01和FibroTest减少-0.02vs+0.02(P＝0.04)。
具体实施方式
实施例
实施例1.概述
方法：对2997名活检患者的五个不同亚组进行了评估以用于测试构建和验证，四个用于评估脂肪变性风险增加的目标群体中脂肪变性的患病率。使用非劣效性检验(0.10界值)和Lin一致性系数，将SteatoTest-2的性能与参考测试进行了比较。
结果：SteatoTest-2的AUROC不比参考测试差(P<0.001)。在SteatoTest-2和参考测试中AUROC根据亚组和脂肪变性的患病率而有所不同，其中分别在2997例活检病例中为0.772(95％CI 0.713-0.820)vs 0.786(0.729-0.832)，以及在5776例(包括没有脂肪变性风险因子的健康受试者作为对照)的病例中为0.822(0.810-0.834)vs 0.868(0.858-0.878)。Lin系数是高度一致的(P<0.001)，从假定的NAFLD中的0.74(0.74-0.74)到构建亚组中的0.91(0.89-0.93)。
结论：SteatoTest-2在诊断脂肪变性方面比第一代SteatoTest简单且不逊于该第一代SteatoTest，而且不受身体质量指数和胆红素的限制。
实施例2.患者和方法
研究设计
前瞻性分析患者亚组(图1)的研究的主要目的是构建一种简化的新型SteatoTest-2，该SteatoTest-2与第一代SteatoTest高度一致且不逊于该第一代SteatoTest，其在一般群体中适用性更高并且假阳性风险更低。还在用于治疗NASH的司隆色替的前瞻性试验中，根据在治疗前后的配对活检对SteatoTest-2进行了评估。
第二目的是在复制组织学NASH算法(CRN或FLIP)的非侵入性算法中评估SteatoTest-2在与NashTest-2(如WO2018050804中所公开)组合使用时的性能，所述组织学NASH算法需要脂肪变性的存在来诊断NASH(Poynard等人，Eur JGastroenterolHepatol.2018；30：384-391；Poynard等人，Eur J Gastroenterol Hepatol.2018；30：569-577)。
评估了SteatoTest-2 AUROC的可变性，涉及脂肪变性的患病率、谱效应、炎症程度、纤维化阶段、空腹葡萄糖和BMI。最后，对SteatoTest-2进行了中度和显著脂肪变性的CRN等级的验证(欧洲肝脏研究协会(EASL)；欧洲糖尿病研究协会(EASD)；欧洲肥胖症研究协会(EASO)。EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the management ofnon-alcoholic fatty liver disease.J Hepatol.2016；64：1388-402)。
患者和对照
包括总共9个不同亚组的个体数据。所有数据先前均已公布(图1)。第一是原始测试的构建亚组(C1)，包括307例具有不同脂肪变性病因的病例、和对照(6.Poynard等人,Comp Hepatol 2005；4：10)。四个亚组用于验证，(V1)包括600名NAFLD患者(Munteanu等人，Aliment Pharmacol Ther 2016；44：877–889)；(V2)包括481名肥胖患者(Poynard等人，PLoS One.2012；7：e30325)；(V3)包括72名NASH患者(Loomba等人，Hepatology.2017)；和(V4)包括1537名患有慢性丙型肝炎的患者(Poynard等人，J Hepatol.2011；54：227-235)。这五个亚组进行了活检。最后，在脂肪变性风险增加的目标受试者中，使用四个无活检亚组来评估由SteatoTest-2和SteatoTest推测的脂肪变性的患病率；(T1)327名献血者(Jacqueminet等人，Clin Gastroenterol Hepatol.2008；6：828-31)；(T2)7416名健康志愿者(Poynard等人，BMC Gastroenterol 2010；10：40)；(T3)359名2型糖尿病患者(Jacqueminet等人，同上)以及(T4)133045名NAFLD患者(Munteanu等人，2016，同上)。具有低风险或极低风险的对照在统计学部分中进行描述。
组织学参考
所有活检均由经验丰富的病理学家(对历史活检报告、测试结果和其他临床数据不了解)评分。对于主要终点，使用了本领域已知的FLIP-CRN评分系统。除泡沫微囊泡(microvesicle)以外，脂肪变性评分(S)评估并从0到3对大型或中型脂滴的量进行估计(S0：<5％；S1：5–33％，轻度；S2：>33–66％，中度；S3：≥66％，显著)。活动度等级(A，从0到4)是肝细胞气球样变(0–2)和小叶炎症(0–2)的未加权加和。A0(A＝0)的病例没有活动度；A1(A＝1)轻度活动度；A2(A＝2)中度活动度；A3(A＝3)严重活动度，A4(A＝4)非常严重的活动度。纤维化阶段(F)通过以下评分进行评估：阶段0(F0)＝无；阶段1(F1)＝1a或1b窦周区3或1c门脉纤维化；阶段2(F2)＝窦周和门静脉周纤维化，无桥接；阶段3(F3)＝桥接纤维化，阶段4(F4)＝肝硬化。为了减少观察者间差异并根据新的SAF-FLIP组织学分类对读数进行标准化，使用由FLIP病理学协会成员(Frederic Charlotte对C1、V1、V2，Pierre Bedossa对C1、V1、V4，Dina Tianakos对V1)或CRN(Zack Goodman对V1和V3)审核的报告。
血液测试
FibroTest、ActiTest和原始SteatoTest获得了分别用于诊断METAVIR纤维化阶段(包括肝硬化)、SAF等效活动度和SAF等效脂肪变性等级的“体外诊断多元指数测定法”的专利(Bedossa等人，Hepatology 2012；56：1751-9)。构建了定量的NashTest-2，并在1081名有代谢性肝病风险的患者中进行了内部验证(Poynard等人，Eur J GastroenterolHepatol.2018；30：569-577)。这些测试仅在线可用，并包括临床安全算法。无论何种慢性肝病，推荐的截止值均相同。分析仪和试剂盒是经过BioPredictive验证和推荐的分析仪和试剂盒，所有对照测定均在PitiéSalpêtrière医院的参考生物化学部门进行。
在最近的NAFLD指南中推荐的原始SteatoTest用作比较对象(欧洲肝脏研究协会(EASL)，同上)。SteatoTest-2是通过回归分析构建的，没用BMI或总胆红素作为成分，但是使用AST。因此，新测试在其专利配方中包括以下十种成分：α2-巨球蛋白、载脂蛋白A1、触珠蛋白、GGT、ALT、AST、总胆固醇和空腹葡萄糖，并且该新测试根据年龄和性别进行了调整。
统计学分析
方案和分析遵循适于脂肪变性的FibroSTARD建议。先前讨论了代谢性肝病的FLIP和CRN标准定义的局限性及其对非侵入性测试的构建的影响(Poynard等人，Eur JGastroenterol Hepatol.2018；30：384-391；Poynard等人，Eur J GastroenterolHepatol.2018；30：569-577)。这些局限性包括在CRN组的参考研究中仅2.2％(13/576)没有脂肪变性和炎症活动度的病例存在适当的组织学对照。
根据用于原始SteatoTest的构建的相同亚组，使用所有成分从307例病例的样本量回顾性地构建了SteatoTest-2(C1)。为确保新测试和参考测试的AUROC之间的非劣效性检验的适当性能，并且确保不同数据亚组的一致性相关性的适当性能，大于2000名处于代谢或病毒性脂肪变性风险的受试者(进行集中活检)包括在内。两个验证亚组V3和V4先前没有公布用于评估SteatoTest的性能。
对于非劣效性的主要终点，直接比较了根据经验估算的AUROC，而未使用非二元AUROC，因为相同患者在每个数据亚组中同时接受了新测试和参考测试。主要终点是要比较所有计入的活检病例的测试结果，所述测试结果用于诊断脂肪变性(从S1到S3的CRN等级)到没有脂肪变性(S0)的所有等级。
为防止以前的生物标记物研究(其包括少于30例无脂肪变性的病例)的局限性，讨论了大量对照，验证亚组(V1-V4)的158例具有经组织学证实为CRN-S0等级的病例，以及T1(＝207)和T2(n＝2562)亚组的2779名无活检对照(图2)。根据与研究的对照相同的标准(该标准用于评估局部质子磁共振波谱(MRS)性能)，通过以下定义这些无活检对照：肝脏的甘油三酯含量(HTGC)：无可识别的风险因子，BMI低于25kg/m2，无糖尿病，空腹葡萄糖低于6.1mmol/L，最低饮酒量(女性20g，男性30g)，并且没有已知的肝病。第二终点是在三个对照组(活检+T1-对照，活检+T2-对照，活检+T1+T2-对照)中评估的具有特异性的AUROC。
截止值基于用于MRS的方法。在该研究中，在345名无脂肪变性风险的对照中评估的HTGC的95％百分位数为5.56％。这对应于55.6mg/g的肝水平，被认为是MRS的正常上限(ULN)的截止值，是没有脂肪变性的参考值(S0等级)。在我们的研究中，所选择的截止值优化了ST2的高阴性预测值(至少90％)来诊断脂肪变性≥5％。根据成人中脂肪变性患病率的通常范围(17–46％)，选择18.1％(95％CI 17.2％-18.9％；1336/7395)作为预定患病率，以确定SteatoTest-2的新截止值的阴性预测值。预先在连续健康志愿者中评估了这一患病率，这些志愿者代表40岁或40岁以上的法国人群。
使用预测NAS-CRN脂肪变性等级1至3与等级0(无脂肪变性或少于5％的肝细胞)的AUROC之间的差异的非劣效性检验(0.10界值)，在C1至V4亚组中将SteatoTest-2的性能与参考SteatoTest进行了比较。进行灵敏度分析以评估可变性因子的影响(炎症等级、纤维化阶段、肥胖症和空腹葡萄糖(具有对于胰岛素抵抗为6.1，而对于2型糖尿病为7.0的两个截止值))。
为了确保Steatotest-2和SteatoTest对脂肪变性等级的预测在所有亚组中都相似，在两种测试之间评估了Lin一致性系数的水平和显著性。
根据组织学评分和对照亚组，以图形表示所有测试的中位数和四分位数分布。Tukey-Kramer检验使用均值差的置信区间和P值同时比较了所有对。使用以下公式构建带凹槽箱线图：中位数±(1.57xIQR/√n)。如果两个箱线的凹槽不重叠，则中位数显著不同。
在司隆色替试验的患者中，在基线和治疗24周时进行了肝活检和包括血清标记物的SteatoTest、SteatoTest-2、NashTest-2和FibroTest。在没有(无反应者)和有(反应者)组织学改善(定义为NAFLD活动度评分中≥1分的改善)的患者之间比较在基线和治疗24周时的配对测试结果的差异。所有分析均不了解方案中所述的治疗效果。
基于标准CRN算法(脂肪变性≥5％)或先前公布的用于显著活动度(FLIP评分A2)的FLIP算法，评估了脂肪变性的定义(由SteatoTest2推测)对在无活检患者的亚组中由NashTest-2推测的NASH患病率的影响。在大量人群中使用的目的是：针对至少为脂肪变性等级S1的受试者确定SteatoTest-2的灵敏度截止值；以及确定具有临床显著性NASH(即CRN或FLIP评分系统中至少为等级N2)的那些病例。
所有统计学分析均使用NCSS-12.0和R进行。
实施例3.结果
所包括的受试者的特征
通过SAF评分系统评估了总共2997名经过活检和组织学评分的患者。尽管所包括的受试者的特征已经在以前的出版物中公布，但是本整合数据库的价值在于其广泛的特征，这使得可以根据可变性因子来评估血液测试的稳健性。年龄的IQR在34至61岁之间。组织学脂肪变性的患病率为7.3％至24.5％的范围，NASH为13.7％至100％的范围，肝硬化为0％至42.6％的范围，T2糖尿病的患病率为7.5％至70.8％的范围，肥胖症(BMI≥30)为13.6％至100％的范围。肥胖受试者的亚组较年轻，其中女性百分比更高，晚期纤维化的患病率比其他亚组低。
新的SteatoTest-2
与SteatoTest不同，SteatoTest-2不包括BMI或总胆红素，但包含AST，其余9个成分具有不同的独立系数。
记录了在脂肪变性风险增加的四个目标亚组中的临床特征以及通过血液测试推测的脂肪变性和NASH的等级及纤维化阶段。如所预期的，由SteatoTest推测的脂肪变性患病率从献血者中的15.5％增加到接受了FibroTest的受试者中的84.4％。
SteatoTest-2的AUROC不比作为比较对象的参考SteatoTest差。所有非劣效性检验均显著(P<0.001)(图2)。SteatoTest-2和SteatoTest的AUROC结果根据对照组和脂肪变性的患病率而有所不同：在2997例活检病例(脂肪变性的患病率62％)中分别为0.772(95％CI 0.713-0.820)和0.786(0.729-0.832)，在5776例包括无脂肪变性风险因子且无活检的对照的病例(脂肪变性的患病率为32％)中分别为0.822(0.810-0.834)和0.868(0.858-0.878)(图2)。
评估了对照选择对SteatoTest-2 AUROC的影响。AUROC从对照-S0-活检的0.734(95％CI 0.715-0.751)变化为对照-S0-活检-T1-T2的0.822(0.810-0.834)。由于脂肪变性病例的谱总是由活检限定(阶段S1至S3)，因此测试的灵敏度没有变化。因此，AUROC既受与测试特异性直接相关的对照组的谱的影响，也受脂肪变性患病率从32％到62％的变化的影响。当将对照-T1(n＝207，SteatoTest-2中位数＝0.15)添加到对照-S0-活检中时，AUROC从0.734(0.715-0.751)略微增加到0.767(0.750-0.782)，并且脂肪变性的患病率从62％降至58％。当将对照-T2(n＝2562，SteatoTest-2中位数＝0.30)添加到对照-S0-活检时，AUROC0.815(0.803-0.827)显著增加，并且脂肪变性的患病率从62％显著降低至34％。
在所有亚组中，Lin系数均高度一致(P<0.001)，并且在A4中的0.74(0.74-0.74)至C1中的0.91(0.89-0.93)之间。
SteatoTest-2的截止值
Steato-Test-2中的上限95％百分位数(ULN)在177名BMI<25和空腹葡萄糖<6.1的献血者中为0.40。选择该截止值作为ST2的ULN，以预测是否存在至少5％的脂肪变性。根据中位数和95％置信区间推荐以下截止值：S1>＝0.40，S2>＝0.55，S3>＝0.62。
当针对18％的预定患病率进行调整时，使用0.40截止值的整合活检数据库的灵敏度为79％(77-85)，具有92％的预测值。相应的特异性为50％(47-53)。
根据CRN或FLIP简化算法推测的NASH患病率之间的比较
在NAFLD亚组中，脂肪变性的患病率为84.7％。使用CRN算法的临床显著性NASH(中度或重度)的患病率为72.3％(434/600)，而使用FLIPA2算法的所述患病率为80.3％(482/600)，其显著地(P＝0.001)有8.0％(95％CI 3-13％)的不同。
在肥胖受试者的亚组中脂肪变性的患病率为65.5％。使用CRN算法的临床显著性NASH的患病率为16.6％(80/481)，而使用FLIP-A2算法的所述患病率为18.1％(87/481)，其非显著地有1.5％(-4％；6％；P＝0.55)的不同。
无论是CRN还是FLIP简化的定义，所有纳入NASH试验亚组的患者在纳入时均具有组织学脂肪变性和NASH，并且全都具有通过SteatoTest-2推测的脂肪变性。
献血者亚组中脂肪变性的患病率为15.5％。使用CRN算法的临床显著性NASH(中度或重度)的患病率为3.1％(10/322)，而使用FLIPA2算法的所述患病率为5.3％(17/322)，其非显著地(P＝0.17)有2.2％(-1.2；6.8％)的不同。
在健康志愿者亚组中脂肪变性的患病率为50.1％。使用CRN算法的临床显著性NASH(中度或重度)的患病率为22.5％(1667/7416)，而使用FLIPA2算法的所述患病率为29.9％(2220/7416)，其显著地(P<0.001)有7.5％(6.0；8.9％)的不同。
在糖尿病患者的亚组中脂肪变性的患病率为85.2％。使用CRN算法的临床显著性NASH(中度或重度)的患病率为41.8％(150/359)，而使用FLIPA2算法的所述患病率为44.6％(160/359)，其非显著地(P＝0.45)有2.8％(-4.7；10.3％)的不同。
在司隆色替试验中的SteatoTest-2、NashTest-2、FibroTest改善(图3)
将所有72名患有NASH和阶段2(35％)或3(65％)纤维化的患者包括在内。在基线时，所有患者的NAS评分均≥5(100％)。在24周时，49％的患者的NAS改善了至少1分。改善的患者与没有改善的患者相比，分别是SteatoTest-2减少-0.02vs+0.04(P＝0.03)(图3的A)，SteatoTest减少-0.014vs+0.014(P＝0.02)(图3的B)，NashTest-2减少-0.06vs+0.01(图3的C)，FibroTest减少-0.02vs+0.02(P＝0.04)(图3的D)。尽管NASH疾病严重程度的范围狭窄(仅等级2和等级3)，但NashTest-2预测NAS改善的AUROC为0.700(95％CI 0.543，0.809；p＝0.003)。
灵敏度分析
无论相关的炎症活动度、纤维化阶段、空腹葡萄糖水平或肥胖症如何，SteatoTest-2的AUROC均不比参考SteatoTest差。唯一的例外是没有活动度的丙型肝炎患者的小型亚组，其中只有11例患有脂肪变性。在两个亚组中由于脂肪变性的患病率达98％(亦即在患有晚期纤维化且空腹葡萄糖>＝7mmol/L的肥胖患者中)，无法进行统计学比较。
与CRN脂肪变性的等级相关
用SteatoTest-2进行组织学分级，发现在疾病的所有不同阶段都有显著差异。S0、S1、S2和S3的中位数分别为0.40、0.53、0.60。
实施例4.讨论
在这项研究中描述了用于诊断脂肪变性的新血液测试的构建和表征，并验证了其结果不比参考SteatoTest差，参考SteatoTest是公认的比较对象(欧洲肝脏研究协会，同上)。这项新测试的优势在于其成分不包括身体质量指数或总胆红素，身体质量指数和总胆红素是造成显著差异的两个原因。
非劣效性及与比较对象的一致性
已证实，在代谢性肝病(超重、2型糖尿病、血脂异常)以及慢性丙型肝炎的活检患者中，对于肝脂肪变性的最常见病因，Steato-test2不比比较对象差。为了评估其特异性，还证实了这项新测试在脂肪变性风险较低(包括一般人群)的亚组和极低风险组(例如献血者、健康志愿者和无脂肪变性的丙型肝炎)中均是非劣效性的。此外，在所有亚组中都证实了这两种测试之间高度显著的定量一致性。在考虑了特别是以下的主要可变性来源后，AUROC的比较证实了非劣效性：脂肪变性的患病率，纤维化的阶段，炎症活动度的等级，以及糖尿病的患病率，肥胖症，具有标准截止值(6.1和7.0mmol/L)的空腹葡萄糖的增加。
对照的选择和影响
这项研究强调了对照(无脂肪变性)和病例(患有脂肪变性)的选择在评估生物标记物的AUROC的研究中的重要性。这项新测试的构建考虑了先前研究的方法学局限性，涉及样本量以及脂肪变性的定义和对照及其对AUROC的影响。
由于在健康对照中或在代谢性肝病病例中进行活检和正常肝功能测试的伦理学限制，所以采用与MRS所用标准相同的纳入标准作为我们的参考，以定义脂肪变性的存在或不存在并定义在SteatoTest-2中的ULN。在构建脂肪变性生物标记物时，认为应在指南中推荐这些标准以使方法学标准化，从而防止人为分歧。
是否基于MRS进行活检来选择脂肪变性的患者，会显著影响生物标记物研究中的AUROC。如果一项研究被设计首先使用MRS，则仅对根据MRS患有脂肪变性的受试者进行活检，用于评估特异性的对照将是那些根据MRS而不是根据活检而患有脂肪变性的患者。这显然是罕见的，并且与频繁使用的情况不符。因此，这些研究不能可靠地评估用于脂肪变性的特异性和AUROC。这种策略对于评估NASH生物标记物的价值也存在问题，因为活检时在有或没有脂肪变性<5％的情况下可能存在气球样变和小叶炎症。由于这些局限性，已决定的是要在大样本中评估脂肪变性生物标记物的特异性。像第一代SteatoTest一样，498名慢性病毒性肝炎患者的所有可用活检包括在内，无脂肪变性风险的1537名受试者作为对照，MRS的ULN用作我们的ULN的基础(Szczepaniak等人，Am J Physiol Endocrinol Metab.2005；288：462-8)。
在这项研究中，证实了对照的任意选择在通过AUROC评估脂肪变性非侵入性测试时的影响。在不改变测试灵敏度的情况下，AUROC“人为地”从活检-对照的0.734变化为活检+T1+T2-对照的0.822。结果既受对照组的谱的影响，也受脂肪变性患病率根据无脂肪变性病例的选择从32％变化到62％的影响。由于脂肪变性的患病率在20％至50％之间变化(通过MRS推测)，因此必须根据这些可变性来源来评估新的脂肪变性生物标记物的性能，避免间接比较AUROC。
用于显著(S2级)和严重(S3)CRN等级的脂肪变性的性能
还首次显示SteatoTest-2在CRN评分的四个阶段之间有显著区别。尽管我们研究中的半定量相关性和组织学阶段之间的显著差异与MRS(其比任何血液测试具有更好的与肝细胞脂肪变性百分比的相关性)的结果不相似，但目的是验证无实际MRS局限性的稳健测试。虽然SteatoTest-2的主要价值是其灵敏度和相关的用于诊断至少5％脂肪变性的高阴性预测值(92％)，但脂肪变性的测试值与组织学等级之间也存在显著相关性。此外，AUROC(0.603；0.577-0.229；P<0.001vs随机)对于诊断S2、S3 vs S1的临床价值有限。实际上，该AUROC是在狭窄范围的脂肪变性谱内评估的，没有S0对照或没有无脂肪变性风险的对照。
在NASH配对活检中的验证(图3)
在司隆色替的第二阶段试验中首次证实，三种非侵入性测试SteatoTest-2、NashTest-2和FibroTest的变化可以可靠地预测NASH患者的NAS评分的改善。这证实了，配对的SteatoTest-2检测到患有中度和重度等级脂肪变性的患者中脂肪变性的改善，这在活检和MRS中也观察到。
尽管进行了回顾性设计，但SteatoTest-2显然不比参考SteatoTest差，并且与参考SteatoTest高度一致，参考SteatoTest已广泛用于脂肪变性的诊断并已通过指南的验证。
总而言之，新的多分析物SteatoTest-2简化了用于诊断脂肪变性的参考SteatoTest，并且被认为不比参考SteatoTest差，而且没有由身体质量指数引起的变异性以及与未结合的胆红素相关的假阳性风险。
Claims (15)
1.一种用于诊断受试者中肝脂肪变性的存在的体外方法，其包括以下步骤：
(a)在函数中组合至少三种生物标记物的值，所述值选自：
○测量的在所述受试者的血液、血清或血浆中循环的生化标记物的量，以及任选地；
○患者的身体特征；
以便获得最终值，
(b)任选地将所述最终值与预定值进行比较，以及
(c)基于在(a)计算出的所述最终值来确定脂肪变性的存在，
条件是所述受试者的身体质量指数和胆红素水平未用作(a)中的生物标记物。
2.根据权利要求1所述的体外方法，其中，所述循环的生化标记物选自α2-巨球蛋白(A2M)、GGT(γ-谷氨酰转肽酶)、触珠蛋白、载脂蛋白A-I(apoA1)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、甘油三酯、总胆固醇、空腹葡萄糖、γ-球蛋白、白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、IL10、TGF-β1、apoA2、apoB、细胞角蛋白18、血小板数、凝血酶原水平、透明质酸、尿素、N-端III型原胶原蛋白、1型组织抑制剂金属蛋白酶(TIMP-1)、IV型胶原蛋白(Coll IV)、骨保护素、miRNA122、细胞角蛋白18、血清淀粉样蛋白A(SAA)、α-1-抗胰蛋白酶(同种型1)、果糖二磷酸醛缩酶A、果糖二磷酸醛缩酶B、富马酰乙酰乙酸酶、运甲状腺素蛋白、PR02275、C反应蛋白(同种型1)、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A11、DNA指导的RNA聚合酶I亚基RPA1、遮蔽蛋白(同种型1)、α骨骼肌肌动蛋白、主动脉平滑肌肌动蛋白、碱性磷酸酶、不典型蛋白C22orf30(同种型4)、血清淀粉样蛋白A2(同种型a)、载脂蛋白C-III、载脂蛋白E、载脂蛋白A-II、聚合免疫球蛋白受体、von Willebrand因子、氨基酰化酶-1、G蛋白偶联受体98(同种型1)、对氧磷酶/芳基酯酶1、补体成分C7、血红素结合蛋白、补体C1q亚成分、对氧磷酶/内酰胺酶3、补体C2(片段)、多能蛋白聚糖核心蛋白(同种型Vint)、细胞外基质蛋白1(同种型1)、E3 SUMO-蛋白连接酶RanBP2、触珠蛋白相关蛋白(同种型1)、脂联素、视黄醇结合蛋白、铜蓝蛋白、α2抗纤溶酶、抗凝血酶、甲状腺素结合蛋白、蛋白C、α2脂蛋白、四连蛋白、岩藻糖基化的A2M、岩藻糖基化的触珠蛋白、岩藻糖基化的apoA1和碳水化合物不足转铁蛋白。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的体外方法，其中，所述函数包括至少一个变量，所述变量选自受试者的性别和年龄。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的体外方法，其中，所述函数包括对循环的α-2-巨球蛋白、ApoA1、GGT、触珠蛋白、ALT、AST、空腹葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯测量的值以及与患者的年龄和性别相对应的值。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的体外方法，其中，所述函数为通过逻辑回归获得的逻辑函数。
6.根据权利要求5所述的体外方法，其中，所述函数通过以下方式获得：
a)评估一组患者中脂肪变性的存在，其中患者的循环生化标记物的值是已知的；
b)通过一维分析，鉴定以下的组之间值显著不同的循环生化标记物：
i.患有脂肪变性的患者，和
ii.没有脂肪变性的患者
c)针对脂肪变性的发生，进行逻辑回归分析，以评估和考量步骤b)中鉴定的标记物的独立判别值；
d)从而通过将这些鉴定的独立因子组合起来，获得函数。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的体外方法，其中，所述函数为a0+a1×年龄(岁数)+a2×ApoA1(g/l)+a3×Log(A2M，g/l)+a4×Log(GGT，IU/l)+a5×Log(ALT，IU/l)+a6×Log(AST，IU/l)+a7×Log(Hapto，g/l)+a8×Log(甘油三酯TG，mmol/l)+a9×Log(总胆固醇CT，mmol/l)+a10×Log(空腹葡萄糖，g/l)+a11×性别(女性为0，男性为1)。
8.根据权利要求7所述的体外方法，其中：
a)4.8≤a0≤5.5，优选5≤a0≤5.3；
b)-0.03≤a1≤-0.015，优选-0.025≤a1≤-0.02；
c)0.9≤a2≤1.2，优选0.95≤a2≤1.05；
d)1.8≤a3≤2.2，优选1.95≤a3≤2.05；
e)-1.3≤a4≤-1.1，优选-1.2≤a4≤-1.1；
f)-1.45≤a5≤-1.2，优选-1.36≤a5≤-1.3；
g)0.5≤a6≤0.7，优选0.55≤a6≤0.65；
h)-0.35≤a7≤-0.22，优选-0.3≤a7≤-0.25；
i)-1.45≤a8≤-1.25，优选-1.4≤a8≤-1.3；
j)-0.8≤a9≤-0.6，优选-0.75≤a9≤-0.65；
k)-3.55≤a10≤-3.35，优选-3.5≤a10≤-3.4；
l)0.35≤a11≤0.55，优选0.4≤a11≤0.5。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的体外方法，其中，所述函数为5.17-0.022×年龄(岁数)+1.02×ApoA1(g/l)+1.99×Log(A2M，g/l)-1.16×Log(GGT，IU/l)-1.33×Log(ALT，IU/l)+0.6×Log(AST，IU/l)-0.29×Log(Hapto，g/l)-1.35×Log(甘油三酯TG，mmol/l)-0.68×Log(总胆固醇CT，mmol/l)-3.46×Log(空腹葡萄糖，g/l)+0.46×性别(女性为0，男性为1)。
10.根据权利要求9所述的体外方法，其中，预定值为0.25，并且当最终结果高于或等于0.25时，则患者患有非酒精性脂肪性肝炎(脂肪变性)，而当最终结果低于0.25时，则患者没有非酒精性脂肪性肝炎(脂肪变性)。
11.一种获得用于鉴定患者中存在脂肪变性的函数的方法，其中，所述函数将所述患者的血液/血清或血浆中生化标记物的浓度值以及任选的患者年龄、性别进行组合，所述方法包括以下步骤：
a)评估一组患者中脂肪变性的存在，其中患者的循环生化标记物的值是已知的；
b)通过一维分析，鉴定以下的组之间值显著不同的循环生化标记物：
i.患有脂肪变性的患者，和
ii.没有脂肪变性的患者
c)鉴定患者的年龄、性别是否在以下的组之间显著不同：
i.患有脂肪变性的患者，和
ii.没有脂肪变性的患者
d)针对脂肪变性的发生，进行逻辑回归分析以评估和考量步骤b)和c)中鉴定的标记物的独立判别值，其中身体质量指数和胆红素水平未纳入进行逻辑回归的标记物清单中；
e)从而通过组合这些鉴定的独立因子来获得函数，其中所述函数能够用于诊断受试者中非酒精性脂肪性肝炎(脂肪变性)的存在，并且不使用胆红素或BMI的值。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，步骤b)的生化标记物选自α2-巨球蛋白(A2M)、GGT(γ-谷氨酰转肽酶)、触珠蛋白、载脂蛋白A-I(apoA1)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、甘油三酯、总胆固醇、空腹葡萄糖、γ-球蛋白、白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、IL10、TGF-β1、apoA2、apoB、细胞角蛋白18、血小板数、凝血酶原水平、透明质酸、尿素、N-端III型原胶原蛋白、1型组织抑制剂金属蛋白酶(TIMP-1)、IV型胶原蛋白(CollIV)、骨保护素、miRNA122、细胞角蛋白18、血清淀粉样蛋白A(SAA)、α-1-抗胰蛋白酶(同种型1)、果糖二磷酸醛缩酶A、果糖二磷酸醛缩酶B、富马酰乙酰乙酸酶、运甲状腺素蛋白、PR02275、C反应蛋白(同种型1)、富含亮氨酸的α-2-糖蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A11、DNA指导的RNA聚合酶I亚基RPA1、遮蔽蛋白(同种型1)、α骨骼肌肌动蛋白、主动脉平滑肌肌动蛋白、碱性磷酸酶、不典型蛋白C22orf30(同种型4)、血清淀粉样蛋白A2(同种型a)、载脂蛋白C-III、载脂蛋白E、载脂蛋白A-II、聚合免疫球蛋白受体、von Willebrand因子、氨基酰化酶-1、G蛋白偶联受体98(同种型1)、对氧磷酶/芳基酯酶1、补体成分C7、血红素结合蛋白、补体C1q亚成分、对氧磷酶/内酰胺酶3、补体C2(片段)、多能蛋白聚糖核心蛋白(同种型Vint)、细胞外基质蛋白1(同种型1)、E3 SUMO-蛋白连接酶RanBP2、触珠蛋白相关蛋白(同种型1)、脂联素、视黄醇结合蛋白、铜蓝蛋白、α2抗纤溶酶、抗凝血酶、甲状腺素结合蛋白、蛋白C、α2脂蛋白、四连蛋白、岩藻糖基化的A2M、岩藻糖基化的触珠蛋白、岩藻糖基化的apoA1、碳水化合物不足转铁蛋白、α-甲胎蛋白(AFP)、岩藻糖基化的AFP、HSP27(热休克蛋白)、HSP70、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)以及尤其是作为一种由SCCA和IgM组成的循环免疫复合物的SCCA-IgM IC、高尔基体蛋白73(GP73)、α-L-岩藻糖苷酶(AFU)、Des-γ-羧基凝血酶原(DCP或PIVKA)、骨桥蛋白(OPN)和人羰基还原酶。
13.一种用于诊断患者中肝病的离体方法，其包括以下步骤：
-执行权利要求1至10中任一项所述的方法以确定患者中脂肪变性的存在，
-确定患者中肝纤维化的存在，
-确定患者中肝炎症的存在，以及
根据上述确定的结果来诊断患者中的肝病。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，通过以下方式确定肝纤维化：通过特别是Fibrotest，在函数中组合生物标记物的值，或者通过振动控制的瞬时弹性成像对肝硬度进行离体测量。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，通过以下方式确定患者中肝炎症的存在：通过特别是NASH测试，在函数中组合生物标记物的值。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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