WO2013061591A1 - バイオチップの作製方法 - Google Patents

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卓也 岡
中谷　将也
貴裕 野上
健樹 山本
篤 守法
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パナソニック株式会社
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Definitions

  • the present disclosure relates to a method for producing a biochip used for detection and analysis of biological samples such as nucleic acids, proteins, sugar chains, and lipids.
  • a microarray chip is used as a device for simultaneously detecting nucleic acid molecules and proteins in multiple items.
  • a nucleic acid to be a probe molecule is immobilized on a flat surface of a glass slide or a silicon substrate, and is reacted with a sample to be examined containing the nucleic acid molecule to be detected for hybridization reaction. Thereby, DNA or RNA specific to the base sequence of the probe nucleic acid can be detected.
  • immobilizing the probe nucleic acid in the form of an array on the slide glass plane it is possible to simultaneously detect many types of DNA and RNA. As a result, DNA can be analyzed efficiently, so that it is widely used not only in the research field but also in the clinical diagnosis field.
  • a biochip using a fibrous structure composed of silicon dioxide as a carrier for immobilizing probe molecules. It is known that minute signals can be detected with high sensitivity by utilizing the feature that silicon dioxide is low in fluorescence noise and is fibrous and has a large surface area.
  • the fibrous structure made of silicon dioxide is formed using a base material made of silicon as a raw material. (For example, refer to Patent Document 2).
  • the biochip substrate is a substrate that can form this fibrous structure, that is, a raw material for the fibrous structure. It was limited to the substrate. Therefore, it is difficult to incorporate on a resinous ⁇ -TAS (Micro-Total Analysis Systems) chip, and it may be difficult to improve the uniformity of the structural state of the structure for each biochip. There is a problem that the application of is limited.
  • ⁇ -TAS Micro-Total Analysis Systems
  • This disclosure is intended to provide a method for producing a biochip for expanding the application of the biochip.
  • the biochip manufacturing method of the present disclosure for solving the above-described problem is different from the step of forming a sheet-like fiber structure made of fibers using a fiber structure-forming substrate as a raw material and the fiber structure-forming substrate. And a transfer step of attaching the sheet-like fiber structure on a support substrate.
  • the sheet-like fiber structure can be formed on a support substrate different from the fiber structure-forming substrate that is the raw material of the fiber by the biochip manufacturing method of the present disclosure.
  • the sheet-like fiber structure can be disposed on a substrate that cannot be a raw material of the fiber, that is, any substrate that cannot directly form the fiber.
  • biochip applications can be further expanded.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view showing a biochip according to Embodiment 1 of the present disclosure.
  • FIG. 2 is a diagram showing a top view photograph of the biochip in the first embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 3 is a diagram showing a SEM image photograph of the biochip in the first embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 4A is a diagram illustrating a biochip manufacturing method according to Embodiment 1 of the present disclosure.
  • FIG. 4B is a diagram illustrating a biochip manufacturing method according to Embodiment 1 of the present disclosure.
  • FIG. 4C is a diagram showing a biochip manufacturing method according to Embodiment 1 of the present disclosure.
  • FIG. 4D is a diagram illustrating a biochip manufacturing method according to Embodiment 1 of the present disclosure.
  • FIG. 4E is a diagram illustrating a biochip manufacturing method according to Embodiment 1 of the present disclosure.
  • FIG. 4F is a diagram illustrating a biochip manufacturing method according to the first embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 5 is a top view showing the biochip in the first embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 6A is a diagram illustrating a biochip probe immobilization method according to Embodiment 1 of the present disclosure.
  • FIG. 6B is a diagram illustrating a biochip probe immobilization method according to Embodiment 1 of the present disclosure.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating a biochip reaction method according to the first embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 8 is a diagram illustrating a biochip detection method according to the first embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 9A is a diagram illustrating a biochip manufacturing method according to Embodiment 2 of the present disclosure.
  • FIG. 9B is a diagram showing a biochip manufacturing method according to Embodiment 2 of the present disclosure.
  • FIG. 9C is a diagram illustrating a biochip manufacturing method according to Embodiment 2 of the present disclosure.
  • FIG. 10A is a diagram illustrating a biochip manufacturing method according to Embodiment 2 of the present disclosure.
  • FIG. 10B is a diagram illustrating a biochip manufacturing method according to Embodiment 2 of the present disclosure.
  • FIG. 10C is a diagram illustrating a biochip manufacturing method according to the second embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 10D is a diagram illustrating a biochip manufacturing method according to the second embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 10E is a diagram illustrating a biochip manufacturing method according to the second embodiment of the present disclosure.
  • FIG. 1 is a cross-sectional view showing a configuration of a biochip 100 in the present embodiment.
  • a biochip 100 has a sheet-like fiber structure 1 and a support substrate 3 fixed (joined).
  • the sheet-like fiber structure 1 has, for example, a sheet-like structure connected in a planar direction by intertwining fibers 2 made of silicon dioxide.
  • the fiber 2 is preferably silicon dioxide made of amorphous. By being amorphous, the fiber 2 has flexibility.
  • the sheet-like fiber structure 1 is bonded onto the support substrate 3 so as to be parallel to the plane (upper surface) of the support substrate 3.
  • the support substrate 3 is made of a flat surface such as glass, resin, or metal.
  • the plane of the support substrate 3 preferably has irregularities within 0.05 ⁇ m, but is not limited to this.
  • the support substrate 3 is preferably made of a material having small autofluorescence such as glass or optical resin.
  • the support substrate 3 is made of a material having a small autofluorescence, so that it can be performed with low noise and can be highly sensitive.
  • a function according to the application can be imparted by surface modification. For example, when water repellency is imparted only to the surface of the support substrate 3 that is not bonded to the sheet-like fiber structure 1, the target aqueous solution is dropped on the sheet-like fiber structure 1 when dropped. It becomes easier to collect the desired aqueous solution only. Therefore, detection and analysis can be performed with a small amount of the target aqueous solution.
  • COC cyclic olefin copolymer
  • COP cycloolefin polymer
  • PC polycarbonate
  • PMMA polymethyl methacrylate
  • SAN styrene acrylonitrile
  • PS A highly transparent material such as polystyrene is preferred. By utilizing the transparency of these materials, it becomes possible to detect small optical noise.
  • optical resins such as COC and PMMA have a light transmittance of 90% or more.
  • the support substrate 3 may be made of a single material, or may be made of a plurality of materials.
  • a plurality of materials can be selected from glass, silicon, quartz, ceramic, resin, and metal materials to form the support substrate 3.
  • a support substrate 3 in which a first material and a second material are stacked can be used.
  • the bonding between the sheet-like fiber structure 1 and the support substrate 3 includes direct bonding and indirect bonding.
  • Direct bonding can be performed by, for example, plasma activation processing.
  • an adhesive such as a thermosetting resin or a UV curable resin can be used.
  • the joining method is not limited to these.
  • the sheet-like fiber structure 1 has a uniform thickness of, for example, 50 ⁇ m or more.
  • the optical signal on the sheet-like fiber structure 1 can be isolated from the autofluorescence of the support substrate 3, and the bioassay described later can be performed optically. Noise can be reduced and sensitivity can be increased.
  • FIG. 2 is a top micrograph of the biochip in the present embodiment
  • FIG. 3 is an SEM photograph of the biochip in the present embodiment.
  • the sheet-like fiber structure 1 is disposed on the support substrate 3 and is fixed with an adhesive or the like.
  • the sheet-like fiber structure 1 is placed on a support substrate 3 having a high transmittance such as a slide glass by applying Noland 68, which is a UV curable resin.
  • the adhesive can be cured by sandwiching the sheet-like fiber structure 1 with another glass slide and irradiating the entire surface with UV using an excimer UV device or the like from the surface coated with the UV curable resin.
  • the sheet-like fiber structure 1 can be formed so that the plurality of fibers 2 are bonded to each other at least at one place. As a result, the bonds between the fibers 2 become stronger and more difficult to disperse.
  • 4A to 4F show an example of a method for manufacturing the biochip 100 in the present embodiment.
  • the biochip 100 uses a fiber structure-forming substrate as a raw material to form a sheet-like fiber structure made of fibers, and affixes the sheet-like fiber structure on a support substrate different from the fiber structure-forming substrate. At least a transfer process.
  • particles or a substrate (fiber structure forming substrate 4) made of silicon is prepared as a raw material for the fiber 2 made of silicon dioxide. And the fiber structure formation base material 4 and the gas containing at least oxygen are mixed. Then, heat treatment is performed at 1000 to 1500 ° C. using a heater or the like to evaporate SiO (silicon oxide), and then re-adhere on the surface of the fiber structure forming substrate 4 to aggregate to form SiO 2 ( Silicon dioxide). Thereby, as shown to FIG. 4B, the fiber 2 is formed on the fiber structure formation base material 4. As shown in FIG.
  • a silicon substrate can be used.
  • an SOI (Silicon on Insulator) substrate whose silicon layer is made of silicon (100), a silicon (110) substrate, a silicon (111) substrate, a silicon substrate having other plane orientation, a glass substrate, or the like is used. Can do.
  • SiO 2 silicon dioxide
  • metals such as Fe, Co, Ni, or Au other than Pt, can be used, for example, and it is not specifically limited to the kind of metal.
  • the vapor pressure temperature of a raw material falls and it becomes easy to evaporate by making the pressure of the area
  • the temperature adjustment during the heating is performed in a state where oxygen is removed as much as possible in the temperature rising process.
  • the productivity of the fiber 2 is improved by performing, for example, several thousand Pa to 10 ⁇ 2 Pa under a low oxygen partial pressure with a small amount of oxygen added.
  • the fibers 2 formed in this way are entangled and overlapped to form a sheet-like fiber structure 1 having a high porosity.
  • the sheet-like fiber structure 1 is heated to about 1100 ° C. or more. As a result, when a part of the fiber 2 is melted by heat and there is a place where it is in contact with adjacent fibers in the cooling process, bonding occurs, and a strong sheet-like fiber structure 1 is formed.
  • the gas necessary for forming the fiber 2 is considered to be able to use a gas having an oxidizing action (that is, supplying oxygen) such as nitrous oxide N 2 O and carbon monoxide CO.
  • a gas having an oxidizing action that is, supplying oxygen
  • nitrous oxide N 2 O and carbon monoxide CO contain impurities other than oxygen, the formation process of the sheet-like fiber structure 1 may be affected, so appropriate control of concentration, temperature, and pressure is necessary. The detailed conditions for these are not mentioned.
  • the shape of the fiber 2 changes with conditions, such as the atmospheric pressure at the time of formation of the sheet-like fiber structure 1, atmospheric oxygen concentration, and atmospheric temperature, the fiber which has a desired shape by changing these conditions 2 and the sheet-like fiber structure 1 can be formed.
  • the fiber 2 in the formation process of the fiber 2, by providing a set temperature gradient at the initial and later stages of formation, the fiber 2 can be formed to have a density gradient with respect to the thickness direction of the sheet-like fiber structure 1.
  • a density gradient can be similarly formed by changing the concentration of a supply gas such as oxygen or nitrous oxide consumed for forming the fibers 2.
  • the fiber 2 can be controlled in diameter (thickness) under appropriate conditions, and has a diameter (thickness) of about 10 ⁇ m for a small one and about 1 ⁇ m for a large one.
  • the length of the fiber 2 can also be controlled depending on the conditions, but is generally 1 to 500 ⁇ m.
  • the sheet-like fiber structure 1 formed in this way since the surface area is extremely large and the porosity is high, the solid-liquid interface serving as the detection reaction field is integrated with high density, and the biochip 100 having high reactivity is obtained.
  • the fiber structure-forming substrate of the sheet-like fiber structure 1 formed on the fiber structure-forming substrate 4 A surface not bonded to 4 is pasted on the support substrate 3.
  • the fiber structure bonding means 5 is applied or laminated in advance on the upper surface of the support substrate 3.
  • the fiber structure bonding means 5 for example, PDMS or a material obtained by applying a sticky material such as an adhesive sheet on the support substrate 3 is used.
  • the fiber structure bonding means 5 is preferably made of a material having the same thermal expansion coefficient as that of the support substrate 3. For example, when glass is used as the support substrate 3, a glass coating agent or the like can be used as the fiber structure bonding means 5.
  • the sheet-like fiber structure 1 can be fixed on the support substrate 3 by using a material having adhesiveness as the fiber structure bonding means 5.
  • a test reaction such as an antigen-antibody reaction using a microarray is performed, the sheet-like fiber structure 1 can be held on the support substrate 3 without being peeled off.
  • versatility can be improved without limiting the support substrate 3 that can be fixed by applying an adhesive material.
  • the sheet-like fiber structure 1 is transferred to the support substrate 3 as shown in FIG. 4D.
  • the sheet-like fiber structure 1 can be formed so that the silicon substrate side has a higher density.
  • the surface bonded to the fiber structure forming substrate 4 side of the sheet-like fiber structure 1 can be reversed.
  • the density gradient can be reversed in the direction perpendicular to the surface of the sheet-like fiber structure 1. That is, the sheet-like fiber structure 1 bonded to the support substrate 3 has a higher density on the non-bonded surface than the bonded surface. And this high-density sheet-like fiber structure 1 surface can be used as a place for detection and analysis of a biological sample.
  • the upper surface of the sheet-like fiber structure 1 horizontal as shown in FIG. 4F by grind
  • a biochip is manufactured by a method in which the sheet-like fiber structure 1 and the support substrate 3 are transferred by being reversed so that the surface opposite to the surface on which the sheet-like fiber structure 1 and the support substrate 3 are bonded is the upper surface. Therefore, the upper surface of the sheet-like fiber structure 1 may be uneven during transfer, and a biochip with a flat surface of the sheet-like fiber structure 1 can be produced by polishing.
  • a horizontal plane can be formed using a polishing board. Further, for example, a spacer jig having a height of 20 to 50 ⁇ m is disposed on the support substrate 3 and polished with a glass plate or the like to leave the sheet-like fiber structure 1 having a thickness of 20 to 50 ⁇ m.
  • the horizontal surface can be polished.
  • the biochip 100 having a high reflectance and easy to detect optically can be formed.
  • the uniformity of the film thickness of the sheet-like fiber structure can be increased, and a biochip capable of realizing high detection accuracy can be manufactured.
  • FIG. 5 shows a plurality of circular sheet-like fiber structures 1 arranged in an array on a support substrate 3.
  • the diameter of the sheet-like fiber structure 1 is 10 ⁇ m to 5000 ⁇ m, and the circularity is preferably 0.9 or more.
  • the circular sheet-like fiber structures 1 are arranged on the support substrate 3 at equal intervals. For example, when using a sheet-like fiber structure 1 having a diameter of 200 ⁇ m, the sheet-like fiber structures 1 are arranged at a pitch of 300 ⁇ m. Fixed to 100 ⁇ m.
  • the addressability can also be changed, for example, by increasing the arrangement density of the sheet-like fiber structures 1 arranged in a honeycomb shape.
  • the biochip 100 of the present embodiment can be used for optical detection of proteins, for example.
  • FIG. 6A and 6B are diagrams showing a method for immobilizing the probe of the biochip 100.
  • FIG. 6A and 6B are diagrams showing a method for immobilizing the probe of the biochip 100.
  • an aqueous solution 51 containing a probe molecule 50 is prepared.
  • probe molecule 50 for example, an antibody or a recombinant protein having a specific binding ability to a substance to be detected is used, and any molecule that exhibits a specific binding mode can be used. Usually, these probe molecules 50 are handled in a state dissolved in an aqueous solution 51.
  • an aqueous solution 51 containing the probe molecules 50 is dropped and impregnated into the sheet-like fiber structure 1, and the probe molecules 50 are separated from the silicon dioxide of the sheet-like fiber structure 1 as shown in FIG. 6B.
  • the fibers 2 can be adsorbed or covalently bonded using spacer molecules.
  • the surface silanol group of the fiber 2 is surface-modified with a silane coupling agent, and an antibody molecule is covalently bonded using the introduced functional group.
  • a solution in which 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane is stirred in a 2% aqueous acetic acid solution and subjected to a hydrolysis reaction for 30 minutes to 1 hour is dropped onto the fiber 2 made of silicon dioxide, and then at room temperature for 30 minutes or more. React. Thereby, an epoxy group can be introduced into the surface of the fiber 2.
  • the probe molecule 50 is easily covalently bonded to the fiber 2 by dropping the aqueous solution 51 onto the fiber 2 surface-modified with the epoxy group. Can be made.
  • silane coupling agents having various types of functional groups with respect to the silanol group of the fiber 2 can be used.
  • a desired functional group can be introduced on the surface of the fiber 2
  • a highly versatile immobilization carrier can be provided as compared with the case where a resin carrier such as nitrocellulose is used.
  • the aqueous solution 51 is preferably dropped in an amount equal to the void volume of the sheet-like fiber structure 1.
  • the aqueous solution 51 containing the probe molecules 50 can be held in the voids of the sheet-like fiber structure 1, and the region that binds and reacts with the probe molecules can be defined.
  • FIG. 7 shows an example of the reaction method of the biochip 100
  • FIG. 8 shows an example of the biochip probe detection method.
  • an antibody 52 is immobilized as a probe molecule 50 on the surface of the fiber 2.
  • the aqueous solution 51 containing the antigen 54 and the label 55 as the substance 53 to be detected is dropped on the biochip 100, and the aqueous solution 51 is held in the voids of the sheet-like fiber structure 1.
  • the label 55 is captured on the fiber 2 made of silicon dioxide via the antigen 54.
  • the antigen 54 can be detected by quantifying the amount of the label 55.
  • a fluorescent molecule 56 such as Cy3 or Cy5 is suitable as the label 55, and fluorescence can be detected by irradiating light corresponding to each excitation wavelength.
  • a plurality of fluorescent molecules 56 having different fluorescence wavelengths can be used simultaneously.
  • the excitation light source 57 having an excitation wavelength specific to the fluorescent molecule 56 is irradiated with the excitation light X, and the fluorescence Y from the fluorescent molecule 56 is detected by the fluorescence detection means 58.
  • a laser emitting excitation light X having a wavelength of 532 nm can be used as the excitation light source 57, and the emitted fluorescence Y having a wavelength of 550 nm is detected by the fluorescence detection means 58.
  • a CCD or a photomultiplier tube is used as the fluorescence detection means 58, and detection can be performed with high sensitivity by using a fluorescence filter that transmits only a desired fluorescence wavelength.
  • the fluorescence derived from the fluorescent molecule 56 serving as the label 55 is extinguished by noise due to autofluorescence of the resin itself, and is detected with high sensitivity. Is difficult.
  • the structure for immobilizing the probe molecule 50 is the fiber 2 made of silicon dioxide. Since silicon dioxide has almost no autofluorescence, it can be detected with high sensitivity even if the fluorescence noise is low and the fluorescence signal is weak.
  • a distance of 50 ⁇ m can be created between the support substrate 3 and the fluorescent molecules 56.
  • a condensing lens with a focal depth of 50 ⁇ m or less as the fluorescence detection means 58, only the fluorescence signal on the sheet-like fiber structure 1 can be detected, and detection with extremely little noise is performed. Will be able to.
  • the probe molecules 50 for capturing the substance 53 to be detected must be immobilized at a high density.
  • a reaction field that easily reacts with the substance 53 to be detected can be provided.
  • the conventional resin substrate has a problem that it is difficult to increase the density of probe molecules because the surface area is small.
  • the diameter of the fiber 2 made of silicon dioxide constituting the sheet-like fiber structure 1 of the present disclosure is as thin as several tens of nm, the specific surface area is large. Therefore, a large surface on which the probe molecule 50 can be immobilized can be provided. .
  • the sheet-like fiber structure 1 has a high porosity. For this reason, a space in which the substance to be detected that reacts with the inspection probe stays is secured, and the detection sensitivity increases as the reactivity with the probe increases.
  • the upper surface shape of the sheet-like fiber structure 1 is preferably circular. By forming the sheet-like fiber structure 1 in a circle and predefining the spot size, a stable spot diameter can be realized without causing a change in the spot diameter depending on the viscosity of the solution.
  • the probe solution when the probe solution is spotted, the probe solution diffuses concentrically on the carrier. Therefore, when the sheet-like fiber structure 1 is formed in a circle, the density of the probe solution diffusing on the carrier becomes uniform and fixed. The probe density distribution is uniform. For this reason, the density distribution of the signal after use in the bioassay becomes uniform, and the detection accuracy is improved.
  • the fiber structure-forming substrate 4 separated from the sheet-like fiber structure 1 can be reused to form a new sheet-like fiber structure 1.
  • a silicon substrate is used as the fiber structure forming substrate 4, for example, silicon is supplied from the fiber structure forming substrate 4 to form the fiber 2 made of silicon dioxide. Therefore, the fiber 2 made of silicon dioxide can be efficiently formed without supplying silicon gas or the like from the outside.
  • the material efficiency of the sheet-like fiber structure 1 is increased, and the manufacturing cost can be suppressed.
  • a biochip having a fibrous structure composed of silicon dioxide can be accurately formed at a low cost using an arbitrary base material.
  • the manufacturing method of the biochip which consists of one sheet-like fiber structure 1 was demonstrated here, the biochip which has the some sheet-like fiber structure 1 by the same method is also possible.
  • a plurality of fibers 2 may be formed in an array on a single fiber structure forming substrate 4 so that the array pattern of the plurality of sheet-like fiber structures 1 is maintained and arranged on the support substrate 3. .
  • a sheet-like fiber structure 1 that has been efficiently subjected to a plurality of surface treatments can be disposed on one support substrate 3.
  • the surface treatment refers to introducing a chemical functional group into the surface of the fiber 2, for example, introducing an amino group or a cationic group into the surface of the fiber 2 using a silane coupling agent.
  • the difference from the first embodiment described above is that in the transfer step of attaching the sheet-like fiber structure 1 on the support substrate 3, the sheet-like fiber structure 201 is peeled off from the fiber structure-forming substrate 204 and then transferred to the support substrate 203. This is the point that was pasted.
  • 9A to 9C show an example of a method for manufacturing the biochip 200 in the present embodiment.
  • the fiber structure-forming base material of the sheet-like fiber structure 201 formed on the fiber structure-forming base material 204 is attached onto the support substrate 203.
  • a sheet-like fiber structure 201 composed of fibers 202 is formed from the fiber structure-forming substrate 204 by the method described in Embodiment 1 or the like.
  • the sheet-like fiber structure 201 is peeled from the fiber structure-forming substrate 204.
  • the sheet-like fiber structure 201 and the fiber structure-forming substrate 204 stress is used. Available stresses are described below. For example, when silicon is used as the fibrous structure forming base material 204, stress is generated from the difference in thermal expansion coefficient between silicon and silicon dioxide by forming at a suitable temperature. The sheet-like fiber structure 201 and the fiber structure-forming substrate 204 can be intentionally peeled off by stress. Further, after the sheet-like fiber structure 201 is formed, the sheet-like fiber structure 201 is formed into a fiber structure by shearing between the sheet-like fiber structure 201 and the fiber structure-forming substrate 204 with a diamond knife or the like. It can be recovered from the substrate 204.
  • a water vapor explosion occurs in a minute space between the sheet-like fiber structure 201 and the fiber structure-forming substrate 204 by immersing the fiber structure-forming substrate 204 in pure water and heating and boiling the pure water.
  • the bond between the sheet-like fiber structure 201 and the fiber structure-forming substrate 204 can be sheared using steam explosion.
  • the sheet-like fiber structure 201 peeled from the fiber structure forming substrate 204 is captured and recovered by a fiber structure capturing substrate (not shown). Since the fiber 202 has a high porosity, it is light in weight and can be easily captured and recovered using static electricity.
  • the sheet-like fiber structure 201 can be captured by charging the surface of the fiber structure-capturing substrate using an electrostatic charging device or the like and bringing it close to the sheet-like fiber structure 201.
  • silicon can be used for the fiber structure capturing substrate.
  • a groove is formed in the fiber structure capturing substrate at a position where the sheet-like fiber structure 201 is captured.
  • the groove is large enough to accommodate the sheet-like fiber structure 201 and has a groove height lower than the film thickness of the sheet-like fiber structure 201.
  • the fiber structure-capturing substrate can be pressed without contacting the fiber structure-forming substrate 204.
  • the sheet-like fiber structure 201 having a film thickness of 50 to 80 ⁇ m is transferred, the sheet-like fiber structure 201 can be held without being damaged by using a groove having a groove height of 10 to 30 ⁇ m. .
  • the sheet-like fiber structure 201 is affixed on the support substrate 203.
  • heat melting As a joining method of the sheet-like fiber structure 201 and the support substrate 203, for example, heat melting can be used.
  • the support substrate 203 and the sheet-like fiber structure 201 can be joined by thermally melting a part of the fibers 202 by heating. It can.
  • the main component of the fiber 202 is silicon dioxide, silicon, quartz, ceramic, or the like can be used as the support substrate 203.
  • the support substrate 203 and the sheet-like fiber structure 201 are joined by thermally melting a part of the support substrate 203 by heating.
  • the main component of the fiber 202 is silicon dioxide, glass, resin, or the like can be used as the support substrate 203.
  • Bonding of the support substrate 203 and the sheet-like fiber structure 201 by heat melting can be easily performed without using an adhesive or the like, and cost can be reduced.
  • a highly volatile organic component such as an adhesive is not used for bonding, the biochip 200 with less contamination on the fibers 202 can be provided.
  • the first material is more than the second material.
  • a material having a low melting point is desirable because it facilitates bonding to the support substrate 203.
  • a material having a melting point lower than that of silicon dioxide such as a phosphorous silica glass (PSG) film or a borophosphosilica glass (BPSG) film, is used as the first material, and silicon or quartz is used as the second material.
  • a support substrate 203 in which a second material is bonded in advance can be used. A portion of the first material is melted by heating at a temperature above the melting point of the first material and below the melting point of silicon dioxide.
  • the sheet-like fiber structure 201 can be bonded to the support substrate 203 without melting the fibers 202. For this reason, the sheet-like fiber structure 201 can be bonded to the support substrate 203 while maintaining a high surface area and porosity.
  • the melting point of the first material is more preferably 1000 degrees or less.
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • an adhesive layer to be applied in advance to the support substrate 203 for example, a UV curable resin is applied on a COC resin substrate, the sheet-like fiber structure 201 is transferred, and then irradiated with UV to be bonded. Can do.
  • the adhesive can be cured by UV irradiation from the back surface (the surface that is not bonded) of the sheet-like fiber structure 201.
  • the adhesive can be cured with a UV irradiation amount smaller than the UV irradiation from the joint surface, and can be completely cured so that no uncured adhesive remains.
  • the sheet-like fiber structure 201 has a density gradient with respect to the sheet thickness direction, and is molded so that the density of the fibers 202 is higher when bonded to the support substrate 203. Can do.
  • the porosity distribution in the thickness direction of the sheet-like fiber structure 201 can be formed.
  • the upper part of the sheet-like fiber structure 201 is deeper.
  • the porosity is higher than that.
  • the diffusion resistance of the solution is smaller in the upper part than in the deep part of the sheet-like fiber structure 201, and the diffusion of the solution does not stop at the upper part and easily penetrates to the deep part.
  • the solution diffused in the deep part is likely to diffuse upward, the solution in the sheet-like fiber structure 201 is easily replaced.
  • the manufacturing method of the biochip which consists of one sheet-like fiber structure 201 was demonstrated here, the biochip which has several sheet-like fiber structure 201 by the same method is also possible.
  • the sheet-like fiber structures 201 After forming the sheet-like fiber structures 201 from the separate fiber structure-forming base materials 204 and performing surface treatment on each, the sheet-like fiber structures 201 may be attached to the support substrate 203.
  • the surface treatment of the plurality of sheet-like fiber structures 201 can be efficiently performed on one support substrate 203.
  • the sheet-like fiber structure 201 when the sheet-like fiber structure 201 is peeled from the fiber structure-forming substrate 204, the sheet-like fiber structure 201 is cut to an arbitrary size and then transferred onto an arbitrary support substrate 203 to thereby generate a biochip. May be produced.
  • the unevenness in structure can be reduced by cutting and using the sheet-like fiber structure 201 from a region where there is no unevenness in the fiber structure. it can.
  • the uniformity is improved by selecting and transferring a uniform portion on the fiber structure.
  • FIG. 10A to 10E show another example of a method for manufacturing the biochip 200.
  • FIG. 10A to 10E show another example of a method for manufacturing the biochip 200.
  • the sheet-like fiber structure 201 is cut using the cutting means 60 as shown in FIG. 10B. Cut into small parcels.
  • the fiber structure capturing body 61 having the adsorbing means 62 is disposed on the upper surface of the cut sheet-like fiber structure 201, and the sheet-like fiber structure 201 is adsorbed by the adsorbing means 62. .
  • the sheet-like fiber structure 201 is captured by the fiber structure capturing body 61.
  • the sheet-like fiber structure 201 is arrange
  • a Thomson blade type or a binacle type can be used as the cutting means 60.
  • the fiber structure 201 can be easily cut out.
  • the fiber structure capturing body 61 is, for example, vacuum tweezers, and can capture the sheet-like fiber structure 201 with a suction force. In this case, it becomes easy to control the capture and detachment of the sheet-like fiber structure 201 by adjusting the suction force of the vacuum tweezers, so that the transfer is facilitated.
  • the adsorbing means 62 for example, a material obtained by curing PDMS is used.
  • a material obtained by curing PDMS is used.
  • the sheet-like fiber structure 201 is captured using the adhesive force of PDMS. can do.
  • the support substrate 203 is not particularly limited as a material, and any material can be used as long as the fiber structure bonding means 205 can be disposed.
  • a water-soluble gel such as polyethylene glycol or sodium silicate can be used as the fiber structure bonding means 205 on the support substrate 203 in which a gold thin film is formed on a silicon wafer.
  • the sheet-like fiber structure 201 can be bonded together with the polymerization, the sheet-like fiber structure 201 can be disposed on the gold thin film.
  • a photo-curing resin or a sheet-like adhesive may be disposed as the fiber structure bonding means 205 in the flow path of the support substrate 203 having a micro flow path.
  • the sheet-like fiber structure 201 can be transcribe
  • the support substrate 203 is preferably made of resin from the viewpoint of easy formation of the microchannel. By using such a transfer method, the sheet-like fiber structure 201 composed of the fibers 202 can also be disposed on the resin.
  • the biochip manufacturing method according to the present disclosure is used for manufacturing devices used in bioassays such as proteomics research and disease diagnosis.

Abstract

　本開示では、様々な素材形状の支持基板（３）上にシート状繊維構造体（１）を配置させることによって、バイオチップに比べて蛍光ノイズの極めて小さく、プローブ分子を高密度に固定化でき、被検知物質と効率良く反応することができるバイオチップを低コストで精度良く形成することを目的としている。　上記問題を解決するために本開示のバイオチップ（１００）作製方法は、繊維構造体形成基材を原料として繊維（２）からなるシート状繊維構造体（１）を形成する工程と、繊維構造体形成基材とは異なる支持基板（３）上にシート状繊維構造体（１）を貼り付ける転写工程とを少なくとも有している。

Description

バイオチップの作製方法
　本開示は、例えば核酸、タンパク質、糖鎖、脂質、などの生体試料の検出や分析に用いられるバイオチップの作製方法に関するものである。
　従来のバイオチップのアプリケーションの一例では、核酸分子やタンパク質を同時に多項目で検出するデバイスとして、マイクロアレイチップが利用されている。ＤＮＡ分子を検出するためのＤＮＡマイクロアレイは、スライドガラスやシリコン基板の平面上に、プローブ分子となる核酸を固定化し、被検知核酸分子を含んだ被検査試料と反応させ、ハイブリダイゼーション反応させる。これにより、プローブ核酸の塩基配列に特異的なＤＮＡやＲＮＡを検出することができる。このプローブ核酸をスライドガラス平面上にアレイ状に固定化することで、多種類のＤＮＡやＲＮＡを同時に検出することができる。これにより、ＤＮＡの分析を効率良く行うことができるため、研究分野だけでなく臨床診断分野においても広く用いられている。
　また、近年、プローブ分子を固定化する担体としてニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフルオライドなどの樹脂を用いたプロテインアレイが用いられている。プローブ分子として抗体やリコンビナントタンパク質などを用い、ウイルス抗原やホルモンなどのタンパク質やペプチドなどの被検知物質と反応させることによって多種類の被検知物質を同時に検出することができる。プロテインアレイの場合、樹脂表面が疎水性であることがプローブ分子の固定化に好適で、プローブ分子を簡単に効率良く固定することができる。そのため、プロテオミクス研究に用いられており、こうしたタンパク質を検出するためのプロテインアレイが開示されている（例えば、特許文献１参照）。
　また、プローブ分子を固定化する担体として二酸化ケイ素で構成された繊維状の構造体を用いたバイオチップが知られている。二酸化ケイ素であるため蛍光ノイズが低く、繊維状であるため表面積が大きいという特徴を利用して、微小シグナルを高感度に検出できることが知られている。二酸化ケイ素からなる繊維状の構造体は、シリコンからなる基材を原料として形成される。（例えば、特許文献２参照）。
特表２００５－５０４３０９号公報 国際公開第２００９／０３４６９７号
　従来、二酸化ケイ素で構成された繊維状の構造体を用いたプローブ分子の固定化において、バイオチップの基板は、この繊維状の構造体を形成できる基板、すなわち繊維状の構造体の原料となる基板に限定されていた。そのため、樹脂性のμ－ＴＡＳ（Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｔａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）チップ上に組み込むことが困難である、バイオチップ毎の構造体の構造状態の均一性を高めることが困難な場合があるなど、バイオチップの応用が限定されるという課題があった。
　本開示は、バイオチップの応用を広げるためのバイオチップの作製方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するための本開示のバイオチップの作製方法は、繊維構造体形成基材を原料として繊維からなるシート状繊維構造体を形成する工程と、前記繊維構造体形成基材とは異なる支持基板上に前記シート状繊維構造体を貼り付ける転写工程とを少なくとも有している。
　本開示のバイオチップの作製方法により、繊維の原料となる繊維構造体形成基材とは異なる支持基板にシート状繊維構造体を形成することができる。その結果、シート状繊維構造体を、繊維の原料となり得ない基板、すなわち繊維を直接形成することのできない任意の基板上に配置させることができる。これにより、バイオチップのアプリケーションをさらに広く展開することができる。
図１は、本開示の実施の形態１におけるバイオチップを示す断面図である。 図２は、本開示の実施の形態１におけるバイオチップの上面写真を示す図である。 図３は、本開示の実施の形態１におけるバイオチップのＳＥＭ画像写真を示す図である。 図４Ａは、本開示の実施の形態１におけるバイオチップの製造方法を示す図である。 図４Ｂは、本開示の実施の形態１におけるバイオチップの製造方法を示す図である。 図４Ｃは、本開示の実施の形態１におけるバイオチップの製造方法を示す図である。 図４Ｄは、本開示の実施の形態１におけるバイオチップの製造方法を示す図である。 図４Ｅは、本開示の実施の形態１におけるバイオチップの製造方法を示す図である。 図４Ｆは、本開示の実施の形態１におけるバイオチップの製造方法を示す図である。 図５は、本開示の実施の形態１におけるバイオチップを示す上面図である。 図６Ａは、本開示の実施の形態１におけるバイオチップのプローブ固定化方法を示す図である。 図６Ｂは、本開示の実施の形態１におけるバイオチップのプローブ固定化方法を示す図である。 図７は、本開示の実施の形態１におけるバイオチップの反応方法を示す図である。 図８は、本開示の実施の形態１におけるバイオチップの検出方法を示す図である。 図９Ａは、本開示の実施の形態２におけるバイオチップの製造方法を示す図である。 図９Ｂは、本開示の実施の形態２におけるバイオチップの製造方法を示す図である。 図９Ｃは、本開示の実施の形態２におけるバイオチップの製造方法を示す図である。 図１０Ａは、本開示の実施の形態２におけるバイオチップの製造方法を示す図である。 図１０Ｂは、本開示の実施の形態２におけるバイオチップの製造方法を示す図である。 図１０Ｃは、本開示の実施の形態２におけるバイオチップの製造方法を示す図である。 図１０Ｄは、本開示の実施の形態２におけるバイオチップの製造方法を示す図である。 図１０Ｅは、本開示の実施の形態２におけるバイオチップの製造方法を示す図である。
　以下、本開示を実施するための形態について、図面を参照しながら説明する。なお、本開示はこれら実施の形態に限定されるものではない。
　（実施の形態１）
　以下、本開示の実施の形態１におけるバイオチップ１００について図面を用いて説明する。
　図１は本実施の形態におけるバイオチップ１００の構成を示す断面図である。図１に示すように、バイオチップ１００は、シート状繊維構造体１と支持基板３とが固定化（接合）されている。
　シート状繊維構造体１は、例えば、二酸化ケイ素からなる繊維２が絡み合うことで平面方向に接続されたシート状の構造をしている。繊維２は、アモルファスからなる二酸化ケイ素であることが望ましい。アモルファスであることにより、繊維２が柔軟性を有する。
　シート状繊維構造体１は、支持基板３の平面（上面）と平行になるように支持基板３上に接合されている。
　支持基板３は、例えば、ガラス、樹脂、金属などの平面からなる。支持基板３の平面は、０．０５μｍ以内の凹凸を持つことが好ましいが、これに限定されるものではない。
　凹凸が大きい場合は、平面スキャンする際の焦点距離によるシグナル強度にバラツキが発生する場合がある。
　支持基板３は、ガラス、光学樹脂など、自家蛍光の小さな素材を用いることが好ましい。
　バイオチップ１００を用いてタンパク質などを光学検出する場合、支持基板３が自家蛍光の小さい素材であることによって低ノイズで実施することができ、高感度化することができる。
　また、支持基板３として、シリコン、石英、セラミックなど、表面修飾しやすい素材を用いることも好ましい。表面修飾により用途に応じた機能を付与することができる。例えば、支持基板３の表面上であって、シート状繊維構造体１と結合していない表面にだけ撥水性を付与すると、目的の水溶液を滴下した際に、シート状繊維構造体１の上にだけ目的の水溶液を集めることが容易になる。そのため、少量の目的の水溶液で検出、分析をすることができる。
　また、支持基板３として樹脂を用いる場合は、ＣＯＣ（環状オレフィン共重合体）、ＣＯＰ（シクロオレフィン重合体）、ＰＣ（ポリカーボネイト）、ＰＭＭＡ（ポリメタクリル酸メチル）、ＳＡＮ（スチレン　アクリロニトリル）、ＰＳ（ポリスチレン）など透過度の高い素材が好ましい。これら素材の透過性を利用して、光学的ノイズの小さな検出ができるようになる。特に、ＣＯＣ、ＰＭＭＡなどの光学樹脂は、９０％以上の光透過性を有する。蛍光検出でバイオアッセイを行う場合、バイオチップ１００の裏面、すなわち支持基板３のシート状繊維構造体１接合面と対向する面から励起光を照射し、蛍光シグナルを検出することができるようになる。このため、バイオアッセイを行う検出装置の構成を簡略化し、小型化できるため、オンサイトでのバイオアッセイ、特にＰＯＣＴ（Ｐｏｉｎｔ　ｏｆ　Ｃａｒｅ　Ｔｅｓｔｉｎｇ）などの臨床現場で用いることができるようになる。
　なお、支持基板３は、単一の材料からなるものを用いてもよいが、複数の材料からなるものを用いてもよい。ガラス、シリコン、石英、セラミック、樹脂、金属の材料の中から複数の材料を選択して、支持基板３とすることができる。例えば、第一の材料と第二の材料とを積層した支持基板３を用いることができる。
　シート状繊維構造体１と支持基板３の接合は、直接的な接合と間接的な接合とがある。直接的な接合は、例えば、プラズマ活性化処理により行える。間接的な接合は、例えば、熱硬化樹脂やＵＶ硬化樹脂などの接着剤を用いることができる。接合方法はこれらに限定されない。
　シート状繊維構造体１としては例えば５０μｍ以上の均一な厚みを有していることが望ましい。５０μｍ以上の厚みを有していることで、シート状繊維構造体１上の光学的シグナルを支持基板３の自家蛍光から隔離することができ、後に記載するバイオアッセイを光学的に実施する際のノイズを低減させ、高感度化ができるようになる。
　図２は本実施の形態におけるバイオチップの上面顕微鏡写真、図３は本実施の形態におけるバイオチップのＳＥＭ写真である。
　図２、図３に示すように、シート状繊維構造体１は支持基板３上に配置され、接着剤などで固定化されている。例えば、スライドガラスなどの透過率の高い支持基板３上にＵＶ硬化樹脂であるノーランド６８などを塗布し、シート状繊維構造体１をのせる。さらに、シート状繊維構造体１を別のスライドガラスなどで挟持し、ＵＶ硬化樹脂を塗布した面からエキシマＵＶ装置などを利用して全面にＵＶ照射することによって接着剤を硬化させることができる。
　また、複数の繊維２がそれぞれ少なくとも一箇所で互いに結合するようにシート状繊維構造体１を形成することもできる。これによって互いの繊維２の結合がより強固になり、さらに分散しづらくなるので取扱いやすい。
　次に、バイオチップ１００の製造方法の一例を示す。
　図４Ａ～図４Ｆは、本実施の形態におけるバイオチップ１００の製造方法の一例である。
　バイオチップ１００は、繊維構造体形成基材を原料として、繊維からなるシート状繊維構造体を形成する工程と、この繊維構造体形成基材とは異なる支持基板上にシート状繊維構造体を貼り付ける転写工程とを少なくとも有している。
　例えば、シリコンからなる基材上に二酸化ケイ素からなるシート状繊維構造体を形成する工程と、シリコン基材とは異なる支持基板上にシート状繊維構造体を貼り付ける転写工程とを少なくとも有している。
　第一に、シート状繊維構造体を形成する工程の一例を示す。
　まず、図４Ａに示すように、二酸化ケイ素からなる繊維２の原料としてシリコンからなる粒子あるいは基板（繊維構造体形成基材４）を準備する。そして、繊維構造体形成基材４と少なくとも酸素が含まれるガスとを混合させる。そして、ヒータなどを用いて１０００～１５００℃で熱処理することにより、ＳｉＯ(亜酸化シリコン)を蒸発し、その後に繊維構造体形成基材４表面上に再付着させて凝集することでＳｉＯ２（二酸化ケイ素）となる。これにより、図４Ｂに示すように、繊維構造体形成基材４上に繊維２を形成する。
　繊維構造体形成基材４としては、例えばシリコン基板を用いることができる。シリコン基板以外に、シリコン層がシリコン（１００）からなるＳＯＩ（Ｓｉｌｉｃｏｎ　ｏｎ　Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）基板、シリコン（１１０）基板、シリコン（１１１）基板およびその他の面方位を有したシリコン基板、ガラス基板などを用いることができる。
　加熱時に形成されたＳｉＯの周辺に核となる物質が存在すると、ＳｉＯが凝集を起こし、さらに雰囲気中の酸素を取り込んでＳｉＯ２（二酸化ケイ素）となるため、効率よく繊維２が形成される。
　なお、核となる物質とは、例えば、Ｐｔの他に、Ｆｅ、Ｃｏ、ＮｉまたはＡｕ等の金属を用いることができ、特に金属の種類には限定されない。
　ただし、核となる物質は必ずしも必要ではない。
　なお、加熱する領域の圧力を大気圧より低くしておくことにより、原料の蒸気圧温度が下がり、蒸発しやすくなるので、繊維２をより多く形成することができる。特に、上記加熱時の温度調整は、昇温過程においては出来るだけ酸素を取り除いた状態で行う。昇温後の温度維持過程においては少量の酸素を追加した低酸素分圧下、例えば数１０００Ｐａ～１０-２Ｐａで行うことにより、繊維２の生産性が向上する。
　そして、このように形成した繊維２が絡み合って重なり合うことによって、高い空隙率を有するシート状繊維構造体１が形成される。
　この時、複数の繊維２を少なくとも一箇所で互いに結合させる場合は、シート状繊維構造体１におよそ１１００℃以上の熱を加える。その結果、繊維２の一部が熱溶融し、冷却過程で隣り合う繊維で接触している箇所があると結合を起こし、強固なシート状繊維構造体１を形成するのである。
　なお、繊維２を形成するために必要なガスは酸素の他に、亜酸化窒素Ｎ２Ｏ、一酸化炭素ＣＯなど、酸化作用を有する（つまり酸素を供給する）ガスも使用可能と考えられる。ただし、これらは酸素とは別の不純物を含むため、シート状繊維構造体１の形成過程に影響を及ぼす場合があるので、適切な濃度・温度・圧力といった制御が必要であるが、本開示ではこれらについて詳細な条件については言及しない。
　なお、シート状繊維構造体１の形成時における雰囲気の圧力、雰囲気の酸素濃度、雰囲気の温度等の条件により繊維２の形状が変わるため、これらの条件を変えることによって所望の形状を持った繊維２およびシート状繊維構造体１を形成することが出来る。
　例えば、繊維２の形成工程において、形成初期と後期で設定温度の勾配を設けることによって、シート状繊維構造体１の厚み方向に対して密度勾配を持つように形成することができる。なお、繊維２の形成に消費する酸素や亜酸化窒素などの供給ガス濃度を変化させることでも同様に密度勾配を形成させることができる。
　例えば、適切な条件のもとでは繊維２は、直径（太さ）を制御することが可能となり、小さいものでは１０ｎｍ、大きいものでは１μｍ程度の直径（太さ）を持ったものとなる。なお、繊維２の長さもまた、条件によって制御が可能であるが、一般的に１～５００μｍである。このように形成されたシート状繊維構造体１においては、表面積が極めて大きく空隙率が高いため、検出反応場となる固液界面が高密度に集積され、反応性の高いバイオチップ１００となる。
　次に、繊維構造体形成基材４とは異なる支持基板３上にシート状繊維構造体１を貼り付ける転写工程の一例を示す。
　支持基板３上にシート状繊維構造体１を貼り付ける方法としては、例えば図４Ｃに示すように、繊維構造体形成基材４に形成されたシート状繊維構造体１の繊維構造体形成基材４と結合していない面を、支持基板３上に貼る。
　この時、支持基板３の上面には予め繊維構造体結合手段５が塗布あるいは積層されていることが好ましい。繊維構造体結合手段５とは、例えば、ＰＤＭＳや、接着剤シートのような粘着性を持った材料を支持基板３上に塗布したものが用いられる。繊維構造体結合手段５は、支持基板３と熱膨張係数が等しい材料を用いることが望ましい。例えば、支持基板３としてガラスを使用する場合、繊維構造体結合手段５としてガラスコーティング剤などを用いることができる。
　このように、粘着性を持った材料を繊維構造体結合手段５として用いることによって、支持基板３上にシート状繊維構造体１を固定化することができる。これにより、マイクロアレイを用いた抗原抗体反応のような検査反応を実施した際も、シート状繊維構造体１が剥がれることなく支持基板３上に保持できるようになる。
　また、粘着性の材料を塗布することによって固定化できる支持基板３に制限を設けることなく汎用性を上げることができるようになる。
　そして、繊維構造体形成基材４をシート状繊維構造体１から引き離すことによって、図４Ｄに示すように、支持基板３にシート状繊維構造体１を転写する。
　繊維構造体形成基材４としてシリコン基板を用い、繊維２を成長させる場合、シリコン基板側の方が高密度になるようにシート状繊維構造体１を形成することができる。
　上述の方法では、シート状繊維構造体１の繊維構造体形成基材４側に接合していた面を反転させることができる。このため、シート状繊維構造体１の表面に垂直な方向において、密度勾配を反転させることができる。すなわち、支持基板３に接合したシート状繊維構造体１は、接合面よりも接合していない面の方が高密度となる。そして、この高密度なシート状繊維構造体１表面を生体試料の検出や分析の場として用いることができる。
　なお、図４Ｅに示すように、シート状繊維構造体１の上面を研磨手段４０にて研磨することで、図４Ｆに示すように、シート状繊維構造体１の上面を水平にすることが好ましい。シート状繊維構造体１と支持基板３とが接合していた面とは反対側の面が上面になるように反転させて転写する方法でバイオチップを作製している。従って、転写時にシート状繊維構造体１の上面が凸凹になっている場合があり、研磨することでシート状繊維構造体１の表面が平坦なバイオチップを作製できる。
　研磨手段４０としては例えば、研磨盤を用いて水平面を形成することができる。また、例えば２０～５０μｍの高さを有したスペーサー治具を、支持基板３上に配置し、ガラス板などで研磨することによって、２０～５０μｍの厚みのシート状繊維構造体１を残して、水平面を研磨することができる。
　また、シート状繊維構造体１の表面を水平にすることができるため、反射率の高い、光学的に検出しやすいバイオチップ１００を形成することができる。
　これにより、シート状繊維構造体の膜厚の均一性を高めることができ、高い検出精度を実現できるバイオチップを作製することができるようになる。
　なお、図５に示すように、バイオチップ１００は、支持基板３上に複数のシート状繊維構造体１が配置されていても良い。図５は、複数の円形のシート状繊維構造体１を支持基板３上にアレイ状に配置させたものを示している。シート状繊維構造体１の直径は１０μｍ～５０００μｍのものが用いられ、円形度は０．９以上であることが望ましい。円形のシート状繊維構造体１は等間隔で支持基板３上に配置され、例えば直径２００μｍのシート状繊維構造体１を用いる場合、３００μｍピッチで配置することによってシート状繊維構造体１の間が１００μｍに固定される。
　なお、ハニカム状に配置する、シート状繊維構造体１の配置密度を上げるなど、アドレス性を変化させることもできる。
　本実施の形態のバイオチップ１００は、例えば、タンパク質の光学検出に用いることができる。
　次に、バイオチップ１００をタンパク質の光学検出に用いる場合のプローブの固定化について、説明する。
　図６Ａおよび図６Ｂは、バイオチップ１００のプローブの固定化方法を示す図である。
　まず、プローブ分子５０を含有した水溶液５１を準備する。
　プローブ分子５０として、例えば、被検知物質に対する特異的結合能を持つ抗体やリコンビナントタンパク質が用いられているが、特異的結合様式を示す分子であればいずれも用いることができる。通常これらのプローブ分子５０は、水溶液５１に溶解された状態で取り扱われる。
　例えば図６Ａに示すように、プローブ分子５０を含有した水溶液５１をシート状繊維構造体１に滴下し含浸させ、図６Ｂに示すように、プローブ分子５０をシート状繊維構造体１の二酸化ケイ素からなる繊維２に吸着、あるいは、スペーサー分子を用いて共有結合で結合させることができる。
　例えば、繊維２の表面シラノール基に対して、シランカップリング剤による表面修飾を行い、導入された官能基を利用して抗体分子を共有結合させる方法がとられる。例えば３－グリシドキシプロピルトリメトキシシランを２％酢酸水溶液中で攪拌し、加水分解反応を３０分～１時間行った溶液を二酸化ケイ素からなる繊維２上に滴下し、室温下で３０分以上反応させる。これによって、繊維２の表面にエポキシ基を導入することができる。導入されたエポキシ基は抗体などのタンパク質と脱水縮合して共有結合されるため、エポキシ基で表面修飾した繊維２上に水溶液５１を滴下することによって、容易にプローブ分子５０を繊維２に共有結合させることができる。
　また、繊維２のシラノール基に対して様々な種類の官能基を有するシランカップリング剤を使用することができる。その結果、繊維２の表面に所望の官能基を導入することができるため、ニトロセルロースなどの樹脂担体を用いた場合に比べて、汎用性の高い固定化担体を提供することができる。
　水溶液５１は、シート状繊維構造体１の空隙体積と等量滴下することが好ましい。シート状繊維構造体１の空隙内にプローブ分子５０を含んだ水溶液５１を保持させることができ、プローブ分子と結合反応する領域を規定することができる。
　通常のニトロセルロースなどからなる構造体にプローブ分子を含有した水溶液を滴下した場合、構造体の空隙内を水溶液が浸透していく際にクロマト現象が発生する。その結果、液滴の外周部と中心部でプローブの濃度勾配が発生し、均一にプローブ分子５０を固定化することが難しい。しかし、空隙率の高いシート状繊維構造体１に対して、上記方法で滴下することによって、プローブ分子５０の密度ムラを発生させることなく均一に固定化することができる。
　次に、このプローブ分子５０を固定化したバイオチップ１００を用いた際の反応方法、検出方法について図面を用いて説明する。
　図７はバイオチップ１００の反応方法の一例を、図８は、バイオチップのプローブ検出方法の一例を示している。
　図７に示すように、繊維２の表面にはプローブ分子５０として抗体５２が固定化されている。
　バイオチップ１００に被検知物質５３である抗原５４及び標識５５を含んだ水溶液５１を滴下し、この水溶液５１をシート状繊維構造体１の空隙内に保持させる。抗体５２と抗原５４とが反応し特異的結合することによって、抗原５４を介して標識５５が二酸化ケイ素からなる繊維２上に捕捉される。特異的結合をしていない未反応物を洗い流すことによって、反応した抗原５４量に依存した標識５５のみがシート状繊維構造体１に残る。
　そして、図８に示すように、この標識５５の量を定量することによって抗原５４を検出することができる。標識５５としては例えば、Ｃｙ３やＣｙ５などの蛍光分子５６が好適で、それぞれの励起波長に一致した光を照射することによって蛍光を検出することができる。あるいは、異なる蛍光波長を有する複数の蛍光分子５６を同時に用いることもできる。
　蛍光分子５６に特異的な励起波長を有する励起光源５７で、励起光Ｘを照射し、蛍光分子５６からの蛍光Ｙを蛍光検知手段５８で検出する。例えば蛍光分子５６としてＣｙ３を用いた場合は、５３２ｎｍの波長の励起光Ｘを発するレーザーを励起光源５７として用いることができ、放出される５５０ｎｍの波長の蛍光Ｙを蛍光検知手段５８で検出することができる。蛍光検知手段５８としては例えばＣＣＤや光電子倍増管などが用いられ、所望の蛍光波長だけ透過する蛍光フィルターを用いることで高感度に検出することができる。
　樹脂基板をプローブ分子５０の固定化のための構造体として用いた場合は、樹脂自体の自家蛍光のため、標識５５となる蛍光分子５６由来の蛍光がノイズに消され、高感度に検出することが難しい。本実施の形態においては、プローブ分子５０の固定化のための構造体が二酸化ケイ素からなる繊維２である。二酸化ケイ素は自家蛍光をほとんど有していないため、蛍光ノイズが低く、蛍光シグナルが微弱であっても感度良く検出することができる。
　また、シート状繊維構造体１の膜厚を５０μｍ以上とすることによって、支持基板３と蛍光分子５６の間に５０μｍの距離を作ることができる。例えば蛍光検知手段５８として焦点深度が５０μｍ以下の集光レンズを併用することで、シート状繊維構造体１上の蛍光シグナルのみを検出することができるようになり、ノイズの極めて少ない検出を行うことができるようになる。
　より高感度なバイオアッセイを行うためには、より多くの被検知物質５３を捉える必要がある。このためには第一に、被検知物質５３を捕捉するためのプローブ分子５０が高密度に固定化されていなければならない。プローブ分子５０を高密度に固定化することによって、被検知物質５３と反応しやすい反応場を提供することができる。従来の樹脂基板では表面積が小さいために、プローブ分子の高密度化が難しいという課題があった。
　本開示のシート状繊維構造体１を構成する二酸化ケイ素からなる繊維２の径は数十ｎｍと細いため比表面積が大きく、このため、プローブ分子５０を固定化しうる大きな表面を提供することができる。
　また、二酸化ケイ素からなる繊維２の径は数十ｎｍと細いため、シート状繊維構造体１は高い空隙率を有している。このため検査プローブと反応する被検知物質が滞留する空間が確保され、プローブとの反応性が上がることによって検出感度が上がる。
　シート状繊維構造体１の上面形状は、円形であることが好ましい。シート状繊維構造体１を円形に形成し、あらかじめスポットの大きさを規定することで、溶液の粘性に依存したスポット径の変化を生じさせず、安定したスポット径を実現することができる。
　また、プローブ溶液をスポットした場合、担体上で同心円状に拡散するため、シート状繊維構造体１を円形に形成した場合、担体上を拡散するプローブ溶液の密度が均一になり、固定化されるプローブ密度分布が均一になるという特徴を有する。このため、バイオアッセイに使用した後のシグナルの密度分布も均一になり、検知精度が改善される。
　シート状繊維構造体１を乖離した繊維構造体形成基材４は、新たなシート状繊維構造体１の形成に再利用することができる。繊維構造体形成基材４として、例えばシリコン基板を用いる場合、二酸化ケイ素からなる繊維２の形成のために繊維構造体形成基材４からシリコンが供給される。そのため、外部からシリコンガスなどを供給しなくても効率よく二酸化ケイ素からなる繊維２を形成することができる。
　このように、シート状繊維構造体１の形成基板と支持基板３を分けることによって、シート状繊維構造体１の材料効率が高まり、製造原価を抑えることができる。
　よって、二酸化ケイ素で構成された繊維状の構造体を有したバイオチップを任意の基材を用いて低コストで精度良く形成できる。
　なお、ここでは、一つのシート状繊維構造体１からなるバイオチップの作製方法について説明したが、同様の方法によって複数のシート状繊維構造体１を有するバイオチップを作製することも可能である。例えば、一枚の繊維構造体形成基材４にアレイ状に複数の繊維２を形成させることによって、複数のシート状繊維構造体１のアレイパターンを維持したまま支持基板３に配置させてもよい。
　あるいは、別々の繊維構造体形成基材４からシート状繊維構造体１を形成し、それぞれに表面処理を行ったのちに、それらのシート状繊維構造体１を支持基板３に貼り付けてもよい。一つの支持基板３に効率よく複数の表面処理を行ったシート状繊維構造体１を配置することができる。
　ここで、表面処理とは、繊維２の表面に化学官能基を導入することを言い、例えば、シランカップリング剤を用いて繊維２の表面にアミノ基やカチオン基などを導入することをいう。
　（実施の形態２）
　以下、本開示の実施の形態２におけるバイオチップの作製方法について、説明する。
　前述の実施の形態１と異なる点は、支持基板３上にシート状繊維構造体１を貼り付ける転写工程において、シート状繊維構造体２０１を繊維構造体形成基材２０４から剥離後に支持基板２０３に貼り付けた点である。
　図９Ａ～図９Ｃは、本実施の形態におけるバイオチップ２００の製造方法の一例である。
　支持基板２０３上にシート状繊維構造体２０１を貼り付ける方法としては、例えば図９Ｃに示すように、繊維構造体形成基材２０４に形成されたシート状繊維構造体２０１の繊維構造体形成基材２０４と結合していた面を、支持基板２０３上に貼る。
　図９Ａに示すように、実施の形態１において説明した方法などにより、繊維構造体形成基材２０４から繊維２０２からなるシート状繊維構造体２０１を形成する。
　次に、図９Ｂに示すように、繊維構造体形成基材２０４からシート状繊維構造体２０１を剥離させる。
　シート状繊維構造体２０１と繊維構造体形成基材２０４を乖離（剥離）するには、応力を用いる。利用できる応力を以下で説明する。例えば繊維構造体形成基材２０４としてシリコンを用いた場合、適切な温度で形成させることによって、シリコンと二酸化ケイ素の熱膨張係数の違いから応力を発生させる。応力によってシート状繊維構造体２０１と繊維構造体形成基材２０４とを意図的に剥離させることができる。また、シート状繊維構造体２０１を形成した後に、シート状繊維構造体２０１と繊維構造体形成基材２０４の間をダイアモンドナイフなどでせん断することによって、シート状繊維構造体２０１を繊維構造体形成基材２０４から回収することができるようになる。
　あるいは、繊維構造体形成基材２０４を純水に浸漬させ、純水を加熱し煮沸させることによって、シート状繊維構造体２０１と繊維構造体形成基材２０４の間の微小空間で水蒸気爆発を発生させ、水蒸気爆発を利用してシート状繊維構造体２０１と繊維構造体形成基材２０４の結合をせん断することができる。
　繊維構造体形成基材２０４から剥離されたシート状繊維構造体２０１は、繊維構造体捕捉基板（図示せず）で捕捉し回収する。繊維２０２は空隙率が高いために重量が軽く、静電気を用いて容易に捕捉回収することができる。例えば、繊維構造体捕捉基板の表面を静電気帯電装置などを用いて帯電させ、シート状繊維構造体２０１に近づけることによってシート状繊維構造体２０１を捕捉することができる。ここで繊維構造体捕捉基板には例えばシリコンを用いることができる。
　繊維構造体捕捉基板を用いる場合には、繊維構造体捕捉基板にはシート状繊維構造体２０１を捕捉する箇所に溝が形成されていることが好ましい。溝は、シート状繊維構造体２０１が収納できる大きさで、シート状繊維構造体２０１の膜厚よりも溝高の低くなっている。溝を形成しておくことによって、シート状繊維構造体１を転写する際、繊維構造体捕捉基板が繊維構造体形成基材２０４に接触することなく押止することができる。例えば５０～８０μｍの膜厚を有するシート状繊維構造体２０１を転写する場合、１０～３０μｍの溝高の溝を用いることで、シート状繊維構造体２０１を破損させることなく押止することができる。
　そして、図９Ｃに示すように、シート状繊維構造体２０１を支持基板２０３へ貼り付ける。
　シート状繊維構造体２０１と支持基板２０３との接合方法として、例えば、熱溶融を用いることができる。
　支持基板２０３として、繊維２０２の主成分よりも融点の高いものを用いた場合、加熱によって繊維２０２の一部を熱溶融させることで支持基板２０３とシート状繊維構造体２０１とを接合させることができる。例えば繊維２０２の主成分が二酸化ケイ素である場合は、シリコン、石英、セラミックなどを支持基板２０３として用いることができる。
　あるいは、支持基板２０３として、二酸化ケイ素よりも融点の低いものを用いた場合、加熱によって支持基板２０３の一部を熱溶融させることによって、支持基板２０３とシート状繊維構造体２０１とを接合させることができる。例えば繊維２０２の主成分が二酸化ケイ素である場合は、ガラスや樹脂などを支持基板２０３として用いることができる。
　熱溶融による支持基板２０３とシート状繊維構造体２０１との接合は接着剤などを用いずに簡便に結合させることができ、コストを低減させることもできる。また接合に、接着剤などの揮発性の高い有機成分を使用しないので、繊維２０２に対する汚染が少ないバイオチップ２００を提供することができる。
　支持基板２０３が第一の材料と第二の材料とからなり、支持基板２０３の第一の材料とシート状繊維構造体２０１とが接合する場合、第一の材料は、第二の材料よりも融点の低い材料であることが支持基板２０３への接合が容易となり望ましい。
　例えば、ホスホラスシリカガラス（ＰＳＧ）膜やボロホスホシリカガラス（ＢＰＳＧ）膜など二酸化ケイ素より融点の低い材料を第一の材料とし、シリコンや石英などを第二の材料とし、第一の材料と第二の材料とをあらかじめ接合した支持基板２０３を用いることができる。第一の材料の融点より高く二酸化ケイ素の融点より低い温度で加熱することによって、第一の材料の一部を溶融させる。その結果、繊維２０２を溶融することなく、シート状繊維構造体２０１を支持基板２０３に結合させることができる。このため、シート状繊維構造体２０１を高い表面積と空隙率を維持したまま支持基板２０３に結合させることができるようになる。
　第一の材料の融点は１０００度以下であることがより好ましい。
　なお、支持基板２０３にあらかじめ塗布しておく接着層として、例えばポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を用いることによって、繊維２０２を押止することによって支持基板２０３とシート状繊維構造体２０１とを強固に結合させることができる。
　あるいは、支持基板２０３にあらかじめ塗布しておく接着層として、例えばＣＯＣ樹脂基板上にＵＶ硬化樹脂を塗布しておき、シート状繊維構造体２０１を転写した後、ＵＶを照射して、結合させることができる。この場合、光学樹脂ＣＯＣは光透過率が高いため、シート状繊維構造体２０１の接合の裏面（接合していない面）からＵＶ照射し、接着剤を硬化させることができる。これにより、接合面からＵＶ照射するよりも少ないＵＶ照射量で接着剤を硬化させることができ、未硬化接着剤が残らないように完全硬化させることができるようになる。
　この場合、熱溶融させることなく簡便に結合させることができ、コストを低減させることができる。
　本実施の形態においては、シート状繊維構造体２０１をシート厚み方向に対して密度勾配を有しており、支持基板２０３と結合している方が繊維２０２の密度が高くなるように成型することができる。このように、繊維２０２の密度分布を厚み方向に設けることによって、シート状繊維構造体２０１の厚み方向に空隙率の分布を形成することができる。
　本実施の形態のバイオチップ２００を生体試料の検出や分析をするために、生体試料を含む溶液をシート状繊維構造体２０１に滴下させる場合、シート状繊維構造体２０１の上部の方が深部に比べて空隙率が高くなる。溶液の拡散抵抗はシート状繊維構造体２０１の深部より上部の方が小さく、溶液の拡散が上部で止まることなく深部まで浸透しやすい。また、深部に拡散した溶液は上部に拡散しやすくなるため、シート状繊維構造体２０１内の溶液の置換が容易に起こる。
　バイオチップ２００を用いてバイオアッセイを行う場合、検出感度を上げるためには、被検知物質とプローブ分子との接触確率を高める必要がある。本実施の形態のように厚み方向に空隙率の分布を設けることによって、厚みを持った担体上での溶液の拡散を効率よく行うことができるようになり、厚みを持った担体の深部も有効に検出反応に利用することができるようになる。このため、感度良くバイオアッセイを行うことができるようになる。
　なお、ここでは、一つのシート状繊維構造体２０１からなるバイオチップの作製方法について説明したが、同様の方法によって複数のシート状繊維構造体２０１を有するバイオチップを作製することも可能である。
　別々の繊維構造体形成基材２０４からシート状繊維構造体２０１を形成し、それぞれに表面処理を行ったのちに、それらのシート状繊維構造体２０１を支持基板２０３に貼り付けてもよい。一つの支持基板２０３において、効率よく複数のシート状繊維構造体２０１の表面処理を行うことができる。
　あるいは、一枚の繊維構造体形成基材２０４からシート状繊維構造体２０１を剥離した後にシート状繊維構造体２０１を表面処理することも可能である。
　次に、繊維構造体形成基材２０４からシート状繊維構造体２０１を剥離させる他の一例を示す。
　例えば、繊維構造体形成基材２０４からシート状繊維構造体２０１を剥離させる際に、シート状繊維構造体２０１を任意の大きさに切断した後に任意の支持基板２０３上に転写することでバイオチップを作製してもよい。
　シート状繊維構造体を作製した後、繊維構造のムラがあった場合でも、繊維構造上ムラのない領域からシート状繊維構造体２０１を切断して用いることによって構造上のムラを軽減させることができる。例えば、繊維構造上均一な部分を選別してから転写することによって均一性が改善される。
　図１０Ａ～図１０Ｅは、バイオチップ２００の作製方法の他の一例を示している。
　図１０Ａに示すように、繊維構造体形成基材２０４上に上記方法でシート状繊維構造体２０１を形成した後、図１０Ｂに示すように、切断手段６０を用いてシート状繊維構造体２０１を小区画に切断する。
　その後、図１０Ｃに示すように、切断されたシート状繊維構造体２０１の上面部に吸着手段６２を有する繊維構造体捕捉体６１を配置し、シート状繊維構造体２０１を吸着手段６２に吸着させる。これによりシート状繊維構造体２０１を繊維構造体捕捉体６１に捕捉させる。
　そして、図１０Ｄに示すように、繊維構造体結合手段２０５が表面に配置された支持基板２０３上にシート状繊維構造体２０１を配置させる。その後、図１０Ｅに示すように、切断されたシート状繊維構造体２０１を繊維構造体結合手段２０５に押し当てる。これによって、シート状繊維構造体２０１を支持基板２０３に接合させ、転写する。
　切断手段６０としては、例えば、トムソン刃型やビナクル型などを用いることができ、例えば、６ｍｍ四方の正方形の形状の型を用いることで、プロテインアレイなどで汎用的に用いられる大きさのシート状繊維構造体２０１を簡単に切り出すことができる。
　また、繊維構造体捕捉体６１は、例えば、真空ピンセットとし、吸引力でシート状繊維構造体２０１を捕捉することができる。この場合、真空ピンセットの吸引力を調節することによってシート状繊維構造体２０１の捕捉と着脱を制御することが容易になるため、転写が容易になる。
　また、吸着手段６２として、例えばＰＤＭＳを硬化させた素材を用い、例えば６ｍｍ四方の正方形の接触面を有したＰＤＭＳを用いることによって、ＰＤＭＳの粘着力を利用してシート状繊維構造体２０１を捕捉することができる。
　また、支持基板２０３としては素材として特に限定されることなく、繊維構造体結合手段２０５を配置できるものであればよい。
　例えば、シリコンウエハ上に金薄膜を形成した支持基板２０３上に、繊維構造体結合手段２０５としてポリエチレングリコールや珪酸ナトリウムなどの水溶性ゲルを用いることもできる。この場合、重合とともにシート状繊維構造体２０１を結合することができるため、金薄膜上にシート状繊維構造体２０１を配置することができるようになる。
　また、マイクロ流路を有した支持基板２０３の流路内に、光硬化樹脂やシート状の接着剤を繊維構造体結合手段２０５として配置してもよい。これにより、流路内にシート状繊維構造体２０１を転写させることができる。マイクロ流路の形成容易性の観点から支持基板２０３は樹脂からなることが好ましい。このような転写工法を用いることによって樹脂上にも繊維２０２から構成されるシート状繊維構造体２０１を配置することができる。
　以上のように、本開示にかかるバイオチップ製造方法は、例えばプロテオミクス研究や病気の診断などのバイオアッセイに用いるデバイスの製造に利用される。
　１，２０１　シート状繊維構造体
　２，２０２　繊維
　３，２０３　支持基板
　４，２０４　繊維構造体形成基材
　５，２０５　繊維構造体結合手段
　４０　研磨手段
　５０　プローブ分子
　５１　水溶液
　５２　抗体
　５３　被検知物質
　５４　抗原
　５５　標識
　５６　蛍光分子
　５７　励起光源
　５８　蛍光検知手段
　６０　切断手段
　６１　繊維構造体捕捉体
　６２　吸着手段
　１００，２００　バイオチップ
　Ｘ　励起光
　Ｙ　蛍光

Claims (8)

  1. 　繊維構造体形成基材を原料として繊維からなるシート状繊維構造体を形成する工程と、
    　前記繊維構造体形成基材とは異なる支持基板上に前記シート状繊維構造体を貼り付ける転写工程とを少なくとも有しているバイオチップの作製方法。
  2. 　前記転写工程において、
    　前記支持基板に前記シート状繊維構造体の前記繊維構造体形成基材と接合していた面とは異なる面を貼り付ける工程を備えた請求項１に記載のバイオチップの作製方法。
  3. 　前記転写工程において、
    　前記支持基板に前記シート状繊維構造体の前記繊維構造体形成基材と接合していた面を貼り付ける工程を備えた請求項１に記載のバイオチップの作製方法。
  4. 　前記転写工程において、
    　前記繊維構造体形成基材に形成された前記シート状繊維構造体を、繊維構造体結合手段によって繊維構造体形成基材より剥離する工程を備えた請求項１に記載のバイオチップの作製方法。
  5. 　前記繊維構造体結合手段が、粘着性を有する基板である請求項４に記載のバイオチップの作製方法。
  6. 　前記転写工程において、
    　前記繊維構造体形成基材上に形成された前記シート状繊維構造体を任意の大きさに切り取る切断工程を備えた請求項１に記載のバイオチップの作製方法。
  7. 　前記繊維構造体形成基材がシリコンからなり、
    　前記シート状繊維構造体を構成する繊維が二酸化ケイ素を含んでいることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップの作製方法。
  8. 　前記支持基板上に転写された前記シート状繊維構造体の表面を削る研磨工程を少なくとも含む請求項２に記載のバイオチップ作製方法。
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JP6727459B1 (ja) * 2019-02-28 2020-07-22 三菱電機株式会社 分析方法および試料作製装置

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