JP4415612B2

JP4415612B2 - プラスチック基板の接合方法および接合基板

Info

Publication number: JP4415612B2
Application number: JP2003307062A
Authority: JP
Inventors: 兼久横山
Original assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2003-08-29
Publication date: 2010-02-17
Anticipated expiration: 2023-08-29
Also published as: JP2005074775A

Description

本発明は、表面に微細流路を有するプラスチック製の基板とその蓋となるプラスチック製の基板との接合方法および接合基板に関するものである。

近年、微細流路を利用した、各種反応、分離、分析のための手法が研究され、一部実用化されてきている。このような微細流路を利用した手法はマイクロフルイディクスと呼ばれている。マイクロフルイディクスは、微細流路を利用することで、従来のマクロ的な環境と異なった物質の挙動を利用することで、反応の高効率化、省エネルギー化、省資源化が期待できる。
このようなマイクロフルイディクスの手法は、生命化学の分野でも、利用され始めている。キャピラリー電気泳動は生命化学分野におけるマイクロフルイディクスの一例である。
生命化学の分野では、細胞機能の発現状況や各種ストレスへの応答性をみるため、各々の機能またはストレス応答に係る遺伝子の発現状況や蛋白の発現量を検出する。

これらの分析目標となる蛋白類は、生体内では微量に発現するものが、殆どであり、微細流路中での分析では、微量なサンプルを扱うこととなり、より微量な検出が必要となる。微量な検出を行なうにあたり、特許文献１に記載されているように、微細流路中で免疫反応を行い、検出を熱レンズ顕微鏡や蛍光顕微鏡など光学的に検出される。光学的に検出するには、流路は透明性を有することが必要である。
従来、マイクロフルイディクスに用いられる微細流路基板は、主にガラス基板が用いられてきた。ガラス基板上に微細流路を形成するには、例えば、基板に金属、フォトレジスト樹脂をコートし、マイクロパターンを焼いた後エッチング処理を施し、その後陽極接合などでガラス基板を接合する。
ガラス基板は、微細流路の加工効率が悪く、多量に使用される用途への展開は困難である、また、割れ易い特性は、生物化学の分野で使用および臨床検査分野での使用の際のバイオハザード面を考慮した場合、適応は難しい。
そこで、大量に作製でき、かつ割れ難い材質として、プラスチックが有用となる。

プラスチック基板同士の接合方法の１つに熱溶着がある。熱溶着による基板の接合を行なう場合、基板と接触する熱板部分の表面状態がそのまま転写されることから、基板の光学的特性を保持するには、光学的に平滑な熱板が必要なる。
さらに、熱溶着では、熱板へ成形した硬い基板を設置するため、数多くの基板の接合を行なうと熱板表面にキズをつけることとなり、熱板の基板表面のキズが、熱溶着後の基板外面に転写され、基板の光学特性を劣化させる要因となる。
細胞内の癌遺伝子の発現状況やその他マーカーとなる蛋白の発現状況の検出には、検出目的となる蛋白を特異的に捕捉する抗体などの捕捉分子を用いるが、これら捕捉分子は熱に弱い。微細流路中に捕捉分子を組み入れ、目的とする蛋白を検出する場合、熱溶着では基板全体に熱が加わるため、予め基板に捕捉分子を組み入れての接合は難しい。そのため、特許文献１に開示されているように、後で抗体等を固定化した微細なビーズを流路内に後で充填することが必要となる。

他のプラスチックの接合方法として超音波溶着が用いられるが、基板全体を溶着しようとすると基板の外面や基板全体の歪みが生じやすく、顕微鏡で検出できる光学特性を保持することは難しい。
さらに、超音波溶着では、超音波により基板同士の摩擦により発生する熱でプラスチック同士を溶かして、冷却し接合する原理で溶着されるが、基板同士の摩擦により、微細なプラスチック片が発生し、未済流路中に落下し、微細流路を塞ぐ要因となる。

他の接合方法として、接着剤による接合方法も考えられるが、接着剤の塗布には接着剤を溶剤等に展開する必要があり、十分な接合強度を得ることができるまでに長時間の放置時間を必要とする。また、接着剤の溶解に用いた溶剤が接合した基板内に残留することとなり、微量なサンプルを扱う検出への影響が懸念される。
特開２００１−００４６２８号公報

本発明の課題は、微細流路を有する基板本体とその蓋となる基板の接合を、微細流路部分の光学特性を保持しかつ、抗体などの熱に弱い機能性物質を予め組み入れても、これら機能性物質の機能を損なうことなく、接合を可能にすることである。

本発明者は、透明な基板を用い、微細流路をもったプラスチック基板表面の微細流路以外の部分に光吸収体を塗布等により導入することにより、微細流路の形状を保った接合が可能であること、及び微細流路には熱が加わらないことを見出し、本発明を完成するに到った。

即ち本発明は、
（１）表面に生物学的活性を有する物質が固定されている微細流路を有するプラスチック製の本体基板と覆いとなるプラスチック製の蓋基板との接合方法であって、本体基板と蓋基板が光学的な透明性を有し、（ａ）本体基板表面の微細流路を除く部分にレーザー光を吸収する性質を有する光吸収体を導入する工程、（ｂ）本体基板を蓋基板で覆う工程、及び（ｃ）レーザー光を基板全体に照射し溶着させる工程を有することを特徴とするプラスチック基板の接合方法、
（２）光吸収体を導入する工程が、光吸収体を塗布する工程を有する（１）のプラスチック基板の接合方法、
（３）生物学的活性が、蛋白、核酸、糖鎖、脂質のいずれか、またはこれらの複合物を捕獲する機能である（１）又は（２）のプラスチック基板の接合方法、
（４）生物学的活性が酵素活性である（１）〜（３）いずれかのプラスチック基板の接合方法、
である。

本発明のプラスチック基板の接合方法によれば、微細流路を損傷することなく、微細流路部分の透明性を保持したまま、プラスチック基板の接合が可能となる。さらに、予め生物活性物質を微細流路中に固定した際、生物活性を損なうことなく、基板の接合が可能となる。

以下、本発明のプラスチック基板の接合方法について詳細に説明する。
まず、本発明に使用する本体基板及び蓋基板の形状は、DNAマイクロアレイ、プロテインマイクロアレイ等スライドグラス状等が基本的な形状であるが、円盤状の形状等その他の形状でも差し支えない。
本発明の本体基板及び蓋基板に使用するプラスチックの材質であるが、光学的に透明性を有し、不透過性および耐水性を有するものであれば基本的には制限はない。
さらに、捕獲した生体由来物の検出に何を用いるかで、基板の材質に制限が加わるが、蛍光により検出を行なう場合は、蛍光が発しないことが必要である。このようなプラスチック材料としてとしてETFEや飽和環状ポリオレフィンなどが挙げられる。
吸光度による検出を行なう場合は、ポリスチレン、ポリエチレン、飽和環状ポリオレフィン、ポリカーボネート等が挙げられるが、ポリスチレンが安価であり好適である。

本体基板表面の微細流路には、核酸や蛋白を固定するための活性基を導入して用いる。活性基としては、静電的に核酸や蛋白を固定するもの、又は共有結合を形成し固定するもの、あるいは特異的な相互作用によるもの等が挙げられ、具体的には、アルデヒド基、アミノ基、エポキシ基、チオール基、水酸基、カルボキシル基、カルボジイミド基などが挙げられる。

基板のレーザー溶着について、記載する。
まず、微細流路を表面に有する本体基板表面の流路以外の部分に、光吸収体を導入する。光吸収体としては、染料または顔料が好ましく、更に黒色のものが光吸収効率が高く好適である。光吸収体は、溶液状に調整して塗布するのが好ましく、スタンプ方式が、流路部分を残して光吸収体を塗布するのに好適な方法である。

本体基板に光吸収体を導入した後、透明な蓋基板を本体基板上に合わせ、レーザー光を基板全体に照射し、基板の接合を行なう。使用するレーザー光は、一般にプラスチックの溶着に用いられているものでよく、レーザー溶着機に使用されているものをそのまま用いることができる。レーザーとしては、高出力のYAGレーザーなどが好適である。

プラスチック基板にレーザー光を照射すると、基板の透明な部分はレーザー光が透過し、その部分の温度は上昇することはなく、光吸収体があるところでは、レーザー光が吸収され、レーザーのエネルギーが吸収され、プラスチック表面の温度が上昇し、プラスチックが溶融し溶着されることになる。流路部分には、光吸収体が導入されていないことから、温度の上昇はほとんど起こらず、流路部分の損傷が起こらず、光学的特性を保つことができることにより、顕微鏡による吸光や蛍光の観察や検出が可能となる。また、温度に弱い物質を予め導入しておいても、活性を保つことが可能となる。

次に、実際の接合例について、流路中に予めある蛋白に対する抗体を固定化して接合する例について記載する。
２５ｍｍ×７５ｍｍ程度で厚さ０．５〜１．５ｍｍ程度で、表面に微細流路を図１に示すように配置した基板を射出成形により成形し、本体基板とする。同じ大きさで微細流路がない基板を成形し、蓋基板とする。本体基板に低温酸素プラズマなどにより親水化処理を施した後、微細流路中の抗体固定部（３）にアミノシランを反応させ、さらにグルタルアルデヒドを反応させることによりアルデヒド基を導入する。PBS（−）等の緩衝液中に抗体を適当な濃度で溶解させ、抗体溶液を調製し、続いて、直径４０μｍ程度のピンで抗体固定部に抗体溶液を点着し放置する。放置時間は室温で３０分から２時間程度、４℃で６〜１２時間程度である。放置の後純水等の中に浸漬し洗浄を行い、BSA等をPBS(-)中に溶解させたブロッキング溶液中に浸漬しブロッキングを施した後、洗浄液中に基板を浸漬し洗浄した後、室温で乾燥する。続いて、本体基板の流路を除く部分に黒色顔料を塗布し、蓋基板で覆った後、レーザー光を蓋基板側から基板全体に照射し接合を行なう。最後に溶液の流通を行なうためのポート（６，７）を設ける。
以上のようにして、微細流路に検出用の抗体を固定化した接合基板を得ることができる。

（実施例１）
２５ｍｍ×７５ｍｍ、厚さ０．５ｍｍの大きさで、表面に、幅100μｍ深さ50μｍの微細流路を図１に示すように配置した基板を飽和環状ポリオレフィン樹脂で射出成形により成形し、本体基板とした。同じ大きさで微細流路がない基板を同じく飽和環状ポリオレフィン樹脂で成形し、蓋基板とした。本体基板に低温酸素プラズマにより親水化処理を施した後、微細流路中の抗体固定部（３）にアミノシランを反応させ、さらにグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。PBS（−）中に抗ラットアルブミン抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、抗体溶液を調製した。続いて、直径４０μｍのピンで抗体固定部に点着した。３０分間放置したのち純水中に浸漬し洗浄を行い、１％BSAをPBS(-)中に溶解させたブロッキング溶液中に浸漬しブロッキングを施した後、洗浄液中に基板を浸漬し洗浄した後、室温で乾燥した。続いて、本体基板の流路を除く部分に黒色顔料を塗布し、蓋基板で覆った後、レーザー光を蓋基板側から基板全体に照射し接合を行なった。溶液の流通を行なうためのポート（６，７）を設け、ラットアルブミンを検出する生体由来物検出基板として、感度評価試験に供した。

（比較例１）
２５ｍｍ×７５ｍｍ、厚さ０．５ｍｍの大きさで、表面に、幅100μｍ深さ50μｍの微細流路を図１に示すように配置した基板を飽和環状ポリオレフィン樹脂で射出成形により成形し、本体基板とした。同じ大きさで微細流路がない基板を同じく飽和環状ポリオレフィン樹脂で成形し、蓋基板とした。本体基板に低温酸素プラズマにより親水化処理を施した後、微細流路中の抗体固定部（３）にアミノシランを反応させ、さらにグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。PBS（−）中に抗ラットアルブミン抗体を１μｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、抗体溶液を調製した。続いて、直径４０μｍのピンで抗体固定部に点着した。３０分間放置したのち純水中に浸漬し洗浄を行い、１％BSAをPBS(-)中に溶解させたブロッキング溶液中に浸漬しブロッキングを施した後、洗浄液中に基板を浸漬し洗浄した後、室温で乾燥した。続いて、蓋基板で覆い熱板温度130℃で2分間圧力をかけ加熱を行い本体基板と蓋基板の接合を行い、溶液の流通を行なうためのポート（６，７）を設け、ラットアルブミンを検出する生体由来物検出基板として、感度評価試験に供した。

（蛋白検出試験）
ＰＢＳ（−）中にラットアルブミンを０．１μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌの濃度に溶解しラットアルブミン溶液を調製した。各濃度のラットアルブミン溶液を基板のポートから20μｌ／ｍｉｎの送液スピードで3分間、基板のポートから流した。次にTWEEN２０を０．５％含む洗浄駅をポートから流路内に20μｌ／ｍｉｎの送液スピードで3分間流し洗浄を行なった。続いてローダミンを標識した抗ラットアルブミン抗体溶液（１μｇ／ｍｌでＰＢＳ（−）に溶解）を、20μｌ／ｍｉｎの送液スピードで3分間流した後、TWEEN２０を０．５％含む洗浄駅をポートから流路内に20μｌ／ｍｉｎの送液スピードで3分間流し洗浄を行なった。最後にポートから超純水を20μｌ／ｍｉｎの送液スピードで3分間流した。
共焦点レーザースキャナーで、抗体固定部（３）の蛍光スポットの強度を測定した。ラットアルブミン溶液の各濃度について実施例１の基板のスポット蛍光強度を１００とした、相対強度を表１に示す。ラットアルブミン溶液の各濃度について、実施例１の基板上で測定されたスポットの蛍光強度のSN比を１００としたSN比の比較を表２に示す。ここでＳ／Ｎ比とは、抗体固定部以外の蛍光強度で抗体固定部の蛍光スポット強度を除して算出した。

表１から、実施例１の接合基板ではスポットにおける蛍光強度が高く、感度が高いことが明白である。表２からも実施例１基板ではS／Ｎ比が高く検出感度が高いことが明白である。

本発明によれば、生命科学分野におけるマイクロフルイディクスの展開において、本接合方法により、抗体などの生体由来物を組み込んだプラスチック製基板の供給が可能となる。さらに、マイクロフルイディクスの臨床検査用途への展開容易となる。

本発明に使用する本体基板の一実施例の概略平面図である。本発明の接合基板の一実施例となる概略平面図である。

符号の説明

１本体基板
２微細流路
３抗体固定化部
４注入ポート接続部
５排出ポート接続部
６注入ポート
７排出ポート

Claims

表面に生物学的活性を有する物質が固定されている微細流路を有するプラスチック製の本体基板と覆いとなるプラスチック製の蓋基板との接合方法であって、本体基板と蓋基板が光学的な透明性を有し、（１）本体基板表面の微細流路を除く部分にレーザー光を吸収する性質を有する光吸収体を導入する工程、（２）本体基板を蓋基板で覆う工程、及び（３）レーザー光を基板全体に照射し溶着させる工程を有することを特徴とするプラスチック基板の接合方法。
光吸収体を導入する工程が、光吸収体を塗布する工程を有する請求項１記載のプラスチック基板の接合方法。
生物学的活性が、蛋白、核酸、糖鎖、脂質のいずれか、またはこれらの複合物を捕獲する機能である請求項１又は２記載のプラスチック基板の接合方法。
生物学的活性が酵素活性である請求項１〜３いずれか記載のプラスチック基板の接合方法。