WO2013046995A1 - 酸化還元指示薬の色調変化を測定する方法 - Google Patents

酸化還元指示薬の色調変化を測定する方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2013046995A1
WO2013046995A1 PCT/JP2012/070903 JP2012070903W WO2013046995A1 WO 2013046995 A1 WO2013046995 A1 WO 2013046995A1 JP 2012070903 W JP2012070903 W JP 2012070903W WO 2013046995 A1 WO2013046995 A1 WO 2013046995A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
test
reagent
test piece
measurement
present
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/070903
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
英司 西永
苗穂 鈴木
隆志 ▲濱▼
功 福田
Original Assignee
ライオン株式会社
アークレイ株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ライオン株式会社, アークレイ株式会社 filed Critical ライオン株式会社
Priority to US14/348,199 priority Critical patent/US9598715B2/en
Priority to EP12835784.5A priority patent/EP2762883B1/en
Priority to JP2013536067A priority patent/JP6104165B2/ja
Priority to KR1020147008341A priority patent/KR102020253B1/ko
Priority to CN201280047646.4A priority patent/CN103842816B/zh
Publication of WO2013046995A1 publication Critical patent/WO2013046995A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/14—Streptococcus; Staphylococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C12Q1/06—Quantitative determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/9029—Oxidoreductases (1.) acting on -CH2- groups (1.17)

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring a change in color tone of a redox indicator, which can be used for the measurement of cariogenic bacterial count, and a test piece used for the method.
  • a detection method using resazurin which is a redox indicator (Patent Documents 1 and 2), or a detection method using chemiluminescence based on reducing power such as NADH (Patent Document 3). Etc. are already known.
  • Resazurin normally exists as resazurin (maximum absorption wavelength 605 nm), which is an oxidized blue pigment, but NADH and NADPH (hereinafter collectively referred to as “NAD (P) H”) generated by bacterial metabolism. In some cases) and converted into resorufin, which is a reddish purple pigment (maximum absorption wavelength 573 nm). Resorufin is further reduced by NAD (P) H and converted to colorless hydroresazurin. Therefore, the number of bacteria in the test sample, mainly gram-positive bacteria including cariogenic bacteria, can be measured based on the color change of resazurin.
  • RD test “Showa” (trade name, manufactured by Showa Yakuhin Kako Co., Ltd.) and CAT21 Fast (trade name, manufactured by Wildent Co., Ltd.) are known as a system for measuring cariogenic bacteria using resazurin.
  • An electron carrier such as 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (1-methoxy PMS), phenazinium methyl sulfate (PMS), phenazine etsulfate (PES), for example, uses a tetrazolium salt as a color reagent. In the reaction system, it is used as a mediator for the oxidation-reduction reaction of tetrazolium salt. PMS can be used as a mediator in a reaction system that uses resazurin as a redox indicator (Patent Document 4), but diaphorase is preferred to PMS as a mediator (media). Patent Document 4).
  • An object of the present invention is to provide a novel means for measuring a change in color tone of a redox indicator, which can be used for measurement of cariogenic bacterial counts and the like.
  • the present inventors have determined that 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl as a component of a test reagent in a method for measuring the number of cariogenic bacteria using a test reagent containing resazurin as a color indicator. It has been found that the coloration reactivity is improved by adding sulfate (1-methoxy PMS). The inventor has found that the coloration reactivity is further improved by further adding sodium chloride, potassium chloride, sodium bromide, or potassium bromide as a component of the test reagent, and completed the present invention.
  • the present invention can be exemplified as follows.
  • a method for measuring a color change of a redox indicator Including reacting a test reagent with a test sample to measure a change in color tone, The method wherein the test reagent comprises a redox indicator, a redox reaction promoter, and a halogen salt.
  • the method according to [1] which is a method for measuring the number of cariogenic bacteria in a test sample.
  • [3] The method according to [1] or [2], wherein the redox indicator is resazurin.
  • a reagent for measuring NADH and NADPH comprising a redox indicator, a redox reaction accelerator, and a halogen salt.
  • test piece for use in the measurement of NADH and NADPH comprising a support carrier and an absorbent carrier carried on the support carrier, A test piece, wherein the absorbent carrier holds the reagent according to any one of [7] to [10].
  • the test piece according to [11] which is a test piece for use in measurement of cariogenic bacterial count.
  • the color change of the redox indicator can be clearly measured. Therefore, according to the present invention, the cariogenic bacterial count can be measured in a short time at room temperature. Therefore, according to the present invention, a large number of specimens can be processed in a short time without equipment such as a thermostatic device in a clinical site such as a dental clinic, and a simple and quick examination of cariogenic bacteria count is possible. It becomes.
  • FIG. 1 (A) is a plan view showing an embodiment of a test piece of the present invention
  • FIG. 1 (B) is a front view showing an embodiment of the test piece of the present invention
  • FIG. 2 is a diagram showing the effect of each examined component on the reflectance change ( ⁇ 4 minute reflectance) from 1 minute to 5 minutes after the start of the reaction.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating the effect of each studied component on the base reflectance.
  • FIG. 4 is a diagram showing the effect of each examined component on the ⁇ 4 reflectance.
  • FIG. 5 is a graph showing the correlation between the cariogenic bacterial count in the discharge liquid and the ⁇ 4 minute reflectance when the salt is added and when the 1-methoxy PMS concentration is 0.4 mM. .
  • FIG. 1 (A) is a plan view showing an embodiment of a test piece of the present invention
  • FIG. 1 (B) is a front view showing an embodiment of the test piece of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the effect of
  • FIG. 6 is a graph showing the correlation between the cariogenic bacterial count in the discharge liquid and the ⁇ 4 minute reflectance when the salt is added and when the 1-methoxy PMS concentration is 0.5 mM.
  • FIG. 7 is a diagram showing the correlation between the cariogenic bacterial count in the discharge liquid and the ⁇ 4 minute reflectance when the salt is added and when the 1-methoxy PMS concentration is 0.6 mM.
  • FIG. 8 is a diagram showing the effect of various salts on ⁇ 4 reflectance.
  • the method of the present invention is a method for measuring the coloration of a redox indicator characterized by using a redox indicator, a redox reaction accelerator, and a halogen salt.
  • the method of the present invention is a method for measuring a change in color tone of a redox indicator, and includes measuring a change in color tone by reacting a test reagent with a test sample, and the test reagent comprises a redox indicator
  • a method comprising an indicator, a redox reaction accelerator, and a salt of a halogen.
  • the oxidation-reduction indicator is an indicator that colors by an oxidation-reduction reaction using NAD (P) H as an electron donor. Therefore, the test reagent can be used as a NAD (P) H measurement reagent.
  • the method of the present invention can be used to detect NAD (P) H contained in a test sample and / or NAD (P) H produced in a reaction system. Therefore, according to the method of the present invention, for example, NAD (P) H generated by metabolism of bacteria contained in the test sample can be detected, and thereby bacteria contained in the test sample can be detected. Specific examples of such bacteria include cariogenic bacteria.
  • one aspect of the method of the present invention is a method for measuring the number of cariogenic bacteria in a test sample, and includes measuring a change in color tone by reacting a test reagent with the test sample.
  • the test reagent comprises a redox indicator, a redox reaction accelerator, and a halogen salt.
  • the method of the present invention will be described by exemplifying a method for measuring the cariogenic bacterial count.
  • the redox indicator, the redox reaction accelerator, and the halogen salt may be collectively referred to as “active ingredients”.
  • cariogenic bacteria refer to bacteria that can cause caries.
  • specific examples of cariogenic bacteria include Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, and the like. It is considered that the higher the cariogenic bacteria number, the higher the caries risk, that is, the risk of getting caries.
  • the test sample for measuring the cariogenic bacterial count is not particularly limited.
  • a test sample obtained from the oral cavity can be mentioned.
  • test samples obtained from the oral cavity include resting saliva (unstimulated saliva), stimulated saliva, and mouthwash discharge.
  • stimulated saliva include saliva collected by stimulation with gum.
  • mouthwash discharge liquid is preferred.
  • the mouthwash discharge liquid is obtained, for example, by containing purified water in the mouth and discharging it. Specifically, for example, 3 mL of purified water may be contained in the mouth for 10 seconds and discharged into the container. The volume of purified water and the time for the mouth can be changed as needed.
  • test sample for measuring the cariogenic bacteria number examples include samples containing cariogenic bacteria such as a cariogenic bacteria culture solution.
  • the culture solution of cariogenic bacteria may be, for example, a culture solution of an isolated cariogenic strain available from a biological resource bank such as ATCC.
  • the test reagent contains a redox indicator.
  • the oxidation-reduction indicator is not particularly limited as long as it is an indicator that colors by an oxidation-reduction reaction using NAD (P) H as an electron donor.
  • NAD (P) H is produced by bacterial metabolism. That is, the reduction of the redox indicator proceeds in accordance with the number of bacteria in the test sample, mainly gram-positive bacteria including cariogenic bacteria. Therefore, the change in color tone due to the reduction of the redox indicator reflects the cariogenic bacterial count.
  • “NAD (P) H as an electron donor” may be directly reduced by NAD (P) H or indirectly through another substance (mediator) reduced by NAD (P) H. May be reduced.
  • Specific examples of the redox indicator include resazurin, tetrazolium salt, methylene blue, and xylene blue. Of these, resazurin is preferred. These may be contained alone or in any combination.
  • Resazurin usually exists as resazurin (maximum absorption wavelength 605 nm), which is an oxidized blue pigment, but is reduced by NAD (P) H and converted to resorufin, which is a red-violet pigment (maximum absorption wavelength 573 nm). . Resorufin is further reduced by NAD (P) H and converted to colorless hydroresazurin.
  • the tetrazolium salt is reduced by NAD (P) H and converted into a formazan dye.
  • Specific examples of the tetrazolium salt include, for example, MTT (3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazole bromide), XTT (2,3-bis- (2- methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide), MTS (3- (4,5-dimethylthiol-2-yl) -5- (3-carboxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) ) -2H-tetrazolium), WST-1 (2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tet azolium), and WST-8 (2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3
  • the detection condition for the color reaction may be appropriately set according to the oxidation-reduction indicator used.
  • the concentration of the redox indicator is not particularly limited as long as the color reaction proceeds according to the number of cariogenic bacteria in the test sample, and the type of redox indicator used, other components, etc. It can set suitably according to these conditions.
  • the concentration of the redox indicator in the reagent impregnation solution used for preparing the test piece is preferably 0.01 to 1 mM, more preferably 0.05 to 0.3 mM, more preferably 0.1 to 0.16 mM.
  • the test reagent contains an oxidation-reduction reaction accelerator.
  • the redox reaction accelerator is not particularly limited as long as it is a compound that promotes the color reaction of the redox indicator by the redox reaction.
  • the oxidation-reduction reaction accelerator for example, a compound that is reduced by NAD (P) H to become a reduced type and has a function of reducing other substances can be mentioned.
  • NAD (P) H NAD
  • As another substance that is reduced by the reduction-type redox reaction accelerator there is a redox indicator.
  • oxidation-reduction reaction accelerator examples include 1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (1-methoxy PMS), phenazinium methyl sulfate (PMS), and phenazine etsulfate (PES). It is done. Of these, 1-methoxy PMS is preferred. These may be contained alone or in any combination.
  • the concentration of the redox reaction accelerator is not particularly limited as long as the color reaction proceeds according to the number of cariogenic bacteria in the test sample. It can set suitably according to various conditions, such as other components.
  • the concentration of the redox reaction accelerator in the reagent impregnation solution is preferably 0.01 to 5 mM, more preferably 0.05 to 1 mM, and further preferably 0.1 to 0.6 mM.
  • the test reagent contains a halogen salt.
  • the halogen salt refers to a salt in which a halogen ion and an arbitrary cation are ion-bonded.
  • the halogen salt include a fluoride salt, a chloride salt, a bromide salt, and an iodide salt.
  • the halogen salt is preferably a chloride salt or bromide salt, and more preferably a chloride salt.
  • the halogen salt is preferably a salt of a halogen and an alkali metal.
  • the alkali metal sodium or potassium is preferable.
  • sodium chloride, potassium chloride, sodium bromide, or potassium bromide is preferably used as the halogen salt. These may be contained alone or in any combination.
  • the concentration of the halogen salt is not particularly limited as long as the color reaction proceeds according to the number of cariogenic bacteria in the test sample, and the type of halogen salt used, other components, etc. It can set suitably according to these conditions.
  • the concentration of the halogen salt in the reagent impregnation solution is preferably 1 to 1000 mM, more preferably 5 to 500 mM, and particularly preferably 50 to 200 mM.
  • a decrease in the background of the color reaction can be expected.
  • the redox indicator is resazurin and the redox reaction accelerator is 1-methoxy PMS
  • resazurin and 1-methoxy PMS are mixed as compared with the case where resazurin is used alone.
  • the blue color of resazurin shifts to the red side, but the color tone of resazurin can be returned to the blue side by further adding a halogen salt.
  • test reagent may contain other components.
  • the test reagent preferably contains, for example, a carbon source.
  • the carbon source is preferably one that can assimilate cariogenic bacteria so that the metabolism of cariogenic bacteria can be activated.
  • Examples of the carbon source include saccharides and organic acids, and saccharides are preferable. Specific examples of the saccharide include sucrose and glucose, and sucrose is particularly preferable.
  • the concentration of the carbon source in the reagent impregnation solution is 1 to 1000 mM, more preferably 5 to 500 mM, and particularly preferably 20 to 250 mM.
  • the test reagent may contain a pH buffer, for example.
  • the pH buffer include a phosphate buffer, a HEPES buffer, a PIPES buffer, a MES buffer, a Tris buffer, and a GTA wide-area buffer.
  • the concentration of the pH buffer in the reagent impregnating solution is preferably 10 to 1000 mM, more preferably 20 to 500 mM, and particularly preferably 50 to 150 mM.
  • the pH of the reaction solution is usually, for example, pH 4.0 to 9.0, preferably 5.5 to 8.0.
  • the test reagent may contain a binder, for example.
  • the binder include polyvinyl alcohol (PVA), polyethylene glycol (PEG), polyvinyl pyrrolidone (PVP), and carboxymethyl cellulose.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • PEG polyethylene glycol
  • PVP polyvinyl pyrrolidone
  • carboxymethyl cellulose carboxymethyl cellulose.
  • the concentration of the binder in the reagent impregnation liquid is preferably 0.01 to 5%, more preferably 0.05 to 3%, and still more preferably 0.1 to 1%.
  • “%” of the binder concentration means w / v% unless otherwise specified.
  • test reagent may contain, for example, a drug that inhibits metabolism other than cariogenic bacteria.
  • agents include agents that are used to suppress the growth of bacteria other than cariogenic bacteria such as bacitracin, and agents that suppress the growth of gram-negative bacteria such as potassium tellurite. Can be mentioned.
  • the method of the present invention can be carried out using a test piece.
  • the test strip used in the method of the present invention (hereinafter also referred to as the test strip of the present invention) is a test strip that holds a test reagent containing a redox indicator, a redox reaction accelerator, and a halogen salt.
  • the test piece of the present invention may be a test piece for use in measurement of NAD (P) H, and one aspect thereof is a test piece for use in measurement of cariogenic bacterial count.
  • NAD (P) H NAD
  • the test piece for use in the measurement of the cariogenic bacterial count will be exemplified to describe the test piece of the present invention.
  • the test piece of the present invention preferably includes a support carrier and an absorbent carrier carried on the support carrier, and the absorbent carrier holds a test reagent.
  • the color reaction proceeds according to the number of cariogenic bacteria in the test sample.
  • FIG. 1 illustrates a test piece 1 that is an embodiment of the test piece of the present invention, which includes a support carrier 10 and an absorbent carrier 11 carried on the support carrier 10.
  • FIG. 1A is a plan view of the test piece 1
  • FIG. 1B is a front view of the test piece 1.
  • any carrier can be used as long as it can hold a test reagent and can measure a change in color tone based on the reduction of the redox indicator.
  • the absorbent carrier include paper, cellulose, porous ceramic, chemical fiber, synthetic resin woven fabric, and nonwoven fabric, and filter paper or glass fiber filter paper is preferable.
  • the filter paper or glass fiber filter paper for example, a commercially available one can be suitably used.
  • a planar carrier such as a film, a sheet, or a plate can be preferably used.
  • the support carrier may be made of plastic or paper.
  • plastic for example, various plastics such as polyethylene, polypropylene, polyester, and polyvinyl chloride can be used.
  • the support carrier for example, a carrier made of polyethylene terephthalate (PET) is preferable.
  • PET polyethylene terephthalate
  • the support carrier may be a composite material, and a composite material of polyester and polyethylene, a composite material in which polyethylene and aluminum are laminated, and other various composite materials can be used.
  • the thickness of the support carrier is preferably 10 to 500 ⁇ m, more preferably 50 to 300 ⁇ m.
  • At least one absorptive carrier holding a test reagent for cariogenic bacterial count measurement is provided, and two or more absorptive carriers may be provided.
  • the test piece of the present invention may include an absorptive carrier for measuring parameters other than the cariogenic bacterial count in addition to the absorptive carrier holding a test reagent for cariogenic bacterial count measurement.
  • the test piece of the present invention includes an optional test paper, for example, a dummy absorbent carrier that is not used for parameter measurement, in addition to the absorbent carrier for parameter measurement such as cariogenic bacteria count. May be.
  • each absorptive carrier may be appropriately arranged according to the type of detection device used.
  • various reflectance measuring devices can be suitably used. For example, when Pocket Chem UA PU-4010 (manufactured by ARKRAY, Inc.) is used as the detection device, each absorbent carrier is supported. It is preferably aligned linearly on the carrier.
  • the method for producing the test piece of the present invention is not particularly limited, and the test piece of the present invention can be produced, for example, by supporting an absorbent carrier on which a test reagent is previously held on a support carrier.
  • the method for holding the reagent on the absorbent carrier is not particularly limited.
  • the absorbent carrier may be immersed in the reagent solution, or the reagent solution may be spotted or coated on the absorbent carrier. Of the above, it is preferable to immerse the absorbent carrier in the reagent solution.
  • the reagent solution is a solution containing a test reagent.
  • the step of holding the reagent on the absorbent carrier may include a plurality of steps such as dipping, spotting or coating.
  • the absorbent carrier holding the reagent can be dried and used in the subsequent steps.
  • the test piece of the present invention can be produced by cutting the absorbent carrier holding the reagent as necessary and supporting it on a support carrier.
  • the test piece of the present invention may be manufactured by, for example, holding a test reagent on an absorbent carrier previously supported on a support carrier. In this case, it is preferable that the reagent is held on the absorbent carrier by spotting or applying the reagent solution to the absorbent carrier and then dried.
  • the method for supporting the absorbent carrier on the support carrier is not particularly limited, and for example, a commonly used adhesion technique can be suitably used. For example, it may be affixed with an adhesive tape or an adhesive.
  • the number of cariogenic bacteria can be measured without adjusting the temperature.
  • the reaction temperature may be room temperature.
  • the reaction temperature is usually 15 ° C. to 37 ° C., and may be 15 ° C. to 30 ° C.
  • the temperature may be appropriately adjusted.
  • the reaction time can be appropriately set according to various conditions such as reaction temperature and reagent components.
  • the reaction time is usually 1 to 10 minutes, for example.
  • the reaction time may be 5 minutes.
  • the cariogenic bacterial count can be measured based on the measured change in color tone.
  • “measuring the cariogenic bacterial count” is not limited to calculating the cariogenic bacterial count value itself in the test sample, but the cariogenic bacterial count in the test sample.
  • the degree may be determined by dividing into at least two stages, preferably three or more stages. Specifically, for example, it may be determined whether the number of cariogenic bacteria in the test sample corresponds to three stages of “low”, “medium”, or “high”. What is necessary is just to set suitably the specific number of bacteria at the time of classifying in a several step according to clinical data and the aspect of the test sample to be used.
  • the color change, cariogenic bacterial count value, or cariogenic bacterial count measured by the method of the present invention is used to determine the caries risk of the subject from whom the test sample was collected. May be.
  • the caries risk of the subject who has collected the test sample based on the change in color tone, the value of the cariogenic bacterial count, or the degree of cariogenic bacterial count is at least two stages, preferably 3 Alternatively, the determination may be made by dividing into more stages. Specifically, for example, it may be determined whether the caries risk of the subject who has collected the test sample corresponds to “low”, “medium”, or “high”. In the method of the present invention, the determination of the caries risk is also an aspect of “measuring cariogenic bacteria count”.
  • the color change, cariogenic bacterial count value, or cariogenic bacterial count measured by the method of the present invention may be used alone to determine caries risk. It may be used in combination with parameters.
  • Measurement of cariogenic bacterial count based on color change is obtained by obtaining correlation data between cariogenic bacterial count and color change using a cariogenic bacterial standard sample with a known bacterial count. This can be done using data.
  • the correlation data is, for example, a calibration curve.
  • correlation data including caries risk may be set and used.
  • the change in color tone means an increase or decrease in absorbance at a specific wavelength and / or a shift in the maximum absorption wavelength based on the reduction of the redox indicator. That is, in the method of the present invention, by reducing a part or all of the redox indicator, the increase and decrease in absorbance at a specific wavelength and / or depending on the amount and / or ratio of the reduced redox indicator. A shift in the maximum absorption wavelength occurs.
  • the change in color tone can be measured by an optical detection device.
  • the change in color tone is preferably measured as an increase or decrease in absorbance at a specific wavelength.
  • the increase / decrease in absorbance at a specific wavelength is usually reflected by irradiating the colored portion, that is, the absorbent carrier portion on which the test sample is spotted, with reflection of the specific wavelength over time. It can be measured by obtaining the rate change value.
  • An increase in absorbance at a particular wavelength can be measured as a decrease in reflectivity at that particular wavelength.
  • the decrease in absorbance at a particular wavelength can be measured as an increase in reflectance at that particular wavelength.
  • the certain period of time may be from the time immediately after the test sample is deposited until a certain time elapses, or from a certain time after the test sample is deposited until a certain time elapses. .
  • the length of the certain time can be appropriately set according to various conditions such as the reaction time, but is usually 1 to 10 minutes, for example, and may be 2 to 8 minutes.
  • the time point after spotting of the test sample can be appropriately set according to various conditions such as the reaction time. For example, it is 5 seconds to 3 minutes after spotting of the test sample. Preferably, after 10 seconds to 2 minutes, it is more preferable.
  • the reaction time may be 5 minutes, and the change in reflectance in 4 minutes from 1 minute to 5 minutes after the start of the reaction may be measured.
  • the change value of the reflectance can be calculated as a difference between measured values obtained by measuring the reflectance at least twice.
  • the reflectivity may be measured three or more times.
  • the change value of the reflectivity over a certain period of time may be calculated as the change rate of the reflectivity based on the reflectivity measured a plurality of times.
  • the number of times of reflectance measurement can be reduced. For example, when it is assumed that the reflectivity at a certain point in time immediately after the spotting of the test sample or after the spotting of the test sample is a constant value regardless of the number of cariogenic bacteria in the test sample It is also possible to measure the reflectivity only once when an arbitrary time has passed and calculate the change value of the reflectivity as the difference between the measured value and the certain value. The fixed value only needs to be determined when calculating the change value of the reflectance.
  • the reflectivity at a certain point in time immediately after the spotting of the test sample or after the spotting of the test sample is a constant value regardless of the cariogenic bacterial count in the test sample
  • measuring the reflectance itself may be regarded as “measuring the increase or decrease in absorbance”.
  • the increase / decrease in absorbance may be measured based on at least one wavelength for measurement, but may be measured based on two or more wavelengths including at least one wavelength for measurement.
  • two or more measurement wavelengths may be used, and the measurement wavelength and the reference wavelength for removing the influence of the background may be individually set and used.
  • the wavelength of the light source used for measuring the increase / decrease in absorbance can be appropriately set according to the redox indicator used and the detection device.
  • the wavelength for measurement may be the maximum absorption wavelength in the oxidized form of the redox indicator to be used, the maximum absorption wavelength in the reduced form, or other wavelengths.
  • the measurement wavelength can be 630 to 635 nm
  • the reference wavelength can be 750 to 760 nm.
  • the shift of the maximum absorption wavelength can be measured by comparing the maximum absorption wavelength before and after a certain time.
  • the maximum absorption wavelength can be specified by irradiating a colored portion, that is, an absorbent carrier portion spotted with a test sample, and measuring the reflectance at each wavelength.
  • the conditions for measuring the shift of the maximum absorption wavelength may be the same as the case of measuring the increase / decrease in absorbance at a specific wavelength, except that the maximum absorption wavelength is specified using light of a plurality of wavelengths.
  • the above data acquired for measuring the change in color tone that is, the reflectance at a specific wavelength, the change value of the reflectance calculated therefrom, the maximum absorption wavelength, etc. are collectively referred to below.
  • Reflectance data Sometimes referred to as “reflectance data”.
  • the optical detection device is not particularly limited.
  • a reflectance measurement device for urine test paper or blood test paper can be used.
  • a reflectance measuring instrument for urine test paper for example, Pocketchem UA PU-4010 (manufactured by ARKRAY, Inc.) can be used.
  • Pocketchem UA PU-4010 manufactured by ARKRAY, Inc.
  • the photometric unit irradiates the colored part with two types of light with different wavelengths from the multi-LED, that is, the light of the measurement wavelength and the light of the reference wavelength, and the color tone changes based on the reflectance Can be measured.
  • the reaction time is room temperature for 5 minutes.
  • the measurement can be performed at a measurement wavelength of 635 nm and a reference wavelength of 760 nm.
  • the progress of the resazurin reduction reaction is detected as a decrease in absorbance at 635 nm, that is, as an increase in reflectance when irradiated with 635 nm light.
  • the reaction time is 5 minutes, for example, the reflectance change in 4 minutes from 1 minute to 5 minutes after the start of the reaction may be measured.
  • the method of the present invention may further include, for example, a measured color change, a calculated cariogenic bacterial count value, a determined cariogenic bacterial count degree, and / or a determined caries risk. May include a step of outputting the degree of the above, and may include a step of outputting a comment based on the measurement / judgment results.
  • a comment explains, for example, a measurement / judgment result.
  • An example of a comment is “There are few rodents in saliva and it is in good condition”.
  • the output can be performed, for example, by displaying on a display unit provided in the reflectance measuring device.
  • the display unit is not particularly limited as long as it can display information such as characters and images.
  • a liquid crystal display including an LED backlight is preferably used.
  • the display is performed in an arbitrary form such as a character, a figure, a symbol, a color, or a combination thereof.
  • the output mode is not particularly limited as long as the information output by the doctor, dental hygienist, or subject can be recognized.
  • the output mode may be printed and output by voice.
  • information may be output by arbitrarily combining visual display on the display unit, output by printing, output by sound, and the like.
  • each process such as acquisition of reflectance data, calculation of cariogenic bacteria count, and measurement / judgment results and output of comments may be executed by a single computer, It may be executed by a plurality of physically independent computers.
  • the acquired reflectance data may be transmitted to another device using a telecommunication line or the like, and calculation such as calculation of cariogenic bacteria count may be performed by the other device.
  • the measurement / judgment result may be transmitted to another device using a telecommunication line or the like, and the other device may display the measurement / judgment result and information such as a comment based thereon.
  • the reflectance data is input on the WEB, the reflectance data is transmitted to the calculation server, and the calculation server calculates the cariogenic bacteria count.
  • a mode of displaying the measurement / determination results on the WEB can be exemplified.
  • a charging system based on data transmission / reception using a telecommunication line or the like may be employed. Examples of such a charging system include a system that charges when a user displays a measurement / determination result on a WEB browser or when a file containing the measurement / determination result has been downloaded. . Charging can be performed by any method such as a display / download metering system and a flat-rate system that charges in accordance with a period such as day, week, or month.
  • the method of the present invention has been described above by exemplifying a method for measuring the cariogenic bacterial count.
  • the method of the present invention is not limited to the measurement of the cariogenic bacterial count, but NAD contained in the test sample. It can be used in any method that utilizes detection of (P) H and / or NAD (P) H produced in the reaction system.
  • the method of the present invention can be used to detect an enzymatic reaction that directly or indirectly produces NAD (P) H. It should be noted that the method of the present invention may or may not aim at measuring NAD (P) H itself.
  • the method of the present invention may include the step of calculating the amount or degree of NAD (P) H based on the measured color change, depending on the embodiment, based on the measured color change.
  • a step of calculating the amount or degree of the detection target related to the NAD (P) H amount may be included.
  • the color reaction may be advanced in other arbitrary modes without being limited to the above-described mode using the test piece.
  • the color reaction may be allowed to proceed in a container containing the test reagent.
  • NAD (P) H contained in the test sample and / or NAD (P) H generated in the container can be obtained by placing the test sample and the test reagent in an arbitrary container.
  • the color reaction can be allowed to proceed according to the amount.
  • limit especially as a container For example, a tube and a test tube are mentioned.
  • the color reaction may be detected in any other mode without being limited to the mode using the detection device as described above.
  • a change in color tone may be measured with the naked eye.
  • the reaction is started from the beginning of the reaction.
  • the test sample and all of the active ingredients may or may not be contained in the reaction system.
  • the test reagent may be added to the reaction system after the production of NAD (P) H sufficiently proceeds in the test sample.
  • each active ingredient may be added to the reaction system at different timings.
  • the halogen salt is usually added to the reaction system until the test sample, the redox indicator, and the redox reaction accelerator are in the reaction system. It is preferably added, and more preferably added in advance to a redox indicator or a mixture of a redox indicator and a redox reaction accelerator.
  • the test reagent may be provided in any form as long as it contains each active ingredient.
  • the test reagent may be provided while being held on the test piece as described above, or may be provided in an arbitrary container.
  • the test reagent may be provided after being formulated in any form such as solid, liquid, or gel.
  • use additives such as excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents, diluents, surfactants, solvents, etc. that are usually used as pharmaceutical carriers. Can do.
  • the test reagent can be used in the method of the present invention as it is, or diluted, dispersed, or dissolved with water, physiological saline, buffer solution or the like.
  • each active ingredient may be mixed and contained in the test reagent, or may be separately contained in the test reagent without being mixed.
  • the concentration of each active ingredient in the test reagent of the present invention may be appropriately set depending on various conditions such as the purpose of measurement. For example, in the liquid state mixed with the test sample in the reaction system, The concentration may be a preferable concentration.
  • test reagent of the present invention may be provided as a kit for NAD (P) H measurement or cariogenic bacterial count measurement.
  • the kit is not particularly limited as long as it contains the test reagent of the present invention.
  • ⁇ Reagent impregnation liquid formulation> The concentration shown in Table 1 is obtained with respect to the basic composition in which 42 mg of resazurin sodium (manufactured by Tokyo Kasei), 120 mL of 1M phosphate buffer (pH 6.0) and 12 g of sucrose (manufactured by Nacalai Tesque) are dissolved in 1100 mL of distilled water. Each component to be studied was added to a reagent impregnating solution.
  • reagent portion The reagent impregnating solution was impregnated with filter paper and dried at 50 ° C. for 15 minutes to obtain a test paper.
  • Each produced test paper was cut into a width of 5 mm ⁇ 300 mm, and this was pasted on a PET film with a 100 mm ⁇ 280 mm adhesive.
  • This test paper pasted PET film was cut into a width of 5 mm to obtain a test piece of 100 mm ⁇ 5 mm.
  • the test paper portion holding the reagent may be referred to as “reagent portion”.
  • ⁇ Measurement method 10 ⁇ L of a bacterial solution of Streptococcus mutans (ATCC 25175) suspended in distilled water so as to have a concentration of 10 9 CFU / mL was dropped on the reagent part of the test piece and placed at room temperature.
  • the reflectance change also referred to as ⁇ 4 minute reflectance
  • the reflectance change from 1 minute to 5 minutes at a measurement wavelength of 635 nm / reference wavelength of 760 nm of each test paper was measured using a reflectance measuring instrument.
  • Test piece preparation> The reagent impregnating solution was impregnated with filter paper and dried at 50 ° C. for 15 minutes to obtain a test paper. Each produced test paper was cut into a width of 5 mm ⁇ 300 mm, and this was pasted on a PET film with a 100 mm ⁇ 280 mm adhesive. This test paper pasted PET film was cut into a width of 5 mm to obtain a test piece of 100 mm ⁇ 5 mm.
  • ⁇ Measurement method> First, the base reflectance of each test piece was measured. Distilled water (10 ⁇ L) was dropped onto the reagent part of the test piece and placed at room temperature. The reflectance after 1 minute at a measurement wavelength of 635 nm / reference wavelength of 760 nm of each test paper was measured using a reflectance measuring instrument, and used as a base reflectance.
  • each test piece was evaluated separately.
  • 10 ⁇ L of a bacterial solution of Streptococcus mutans (ATCC 25175) suspended in distilled water so as to have a concentration of 10 9 CFU / mL was dropped on the reagent part of the test piece and placed at room temperature.
  • the reflectance change ( ⁇ 4 minute reflectance) from 1 minute to 5 minutes after the measurement wavelength 635 nm / reference wavelength 760 nm of each test paper was measured using a reflectance measuring instrument.
  • Test piece preparation> The reagent impregnating solution was impregnated with filter paper and dried at 50 ° C. for 15 minutes to obtain a test paper. Each produced test paper was cut into a width of 5 mm ⁇ 300 mm, and this was pasted on a PET film with a 100 mm ⁇ 280 mm adhesive. This test paper pasted PET film was cut into a width of 5 mm to obtain a test piece of 100 mm ⁇ 5 mm.
  • ⁇ Measurement method> With the cooperation of 12 volunteers, the discharge liquid obtained by rinsing with 3 mL of purified water for 10 seconds and discharging into a container was used as a test sample. 10 ⁇ L of each test sample was dropped on the reagent part of the test piece, and the change in reflectance ( ⁇ 4 minute reflectance) after 1 minute at the measurement wavelength 635 nm / reference wavelength 760 nm of each test paper was reflected. Measured using a rate measuring instrument. In addition, the number of cariogenic bacteria in the test sample was measured by a plate culture method (MSB medium).
  • MSB medium plate culture method
  • Results are shown in FIG. 5, FIG. 6, and FIG.
  • the ⁇ 4 minute reflectance was improved by adding KCl or NaCl further. Therefore, the effectiveness of KCl or NaCl was shown in the examination using the discharge liquid as well as the examination using the bacterial solution of Streptococcus mutans.
  • the group to which KCl or NaCl was added it was revealed that the same ⁇ 4 minute reflectance was exhibited at any concentration of 1-methoxy PMS between 0.4 mM and 0.6 mM. With such a high ⁇ 4 reflectance, for example, the number of cariogenic bacteria in the discharged liquid can be determined in three stages.
  • Test piece preparation> The reagent impregnating solution was impregnated with filter paper and dried at 50 ° C. for 15 minutes to obtain a test paper. Each produced test paper was cut into a width of 5 mm ⁇ 300 mm, and this was pasted on a PET film with a 100 mm ⁇ 280 mm adhesive. This test paper pasted PET film was cut into a width of 5 mm to obtain a test piece of 100 mm ⁇ 5 mm.
  • ⁇ Measurement method> With the cooperation of 12 volunteers, the discharge liquid obtained by rinsing with 3 mL of purified water for 10 seconds and discharging into a container was used as a test sample. 10 ⁇ L of each test sample was dropped on the reagent part of the test piece, and the change in reflectance ( ⁇ 4 minute reflectance) after 1 minute at the measurement wavelength 635 nm / reference wavelength 760 nm of each test paper was reflected. Measured using a rate measuring instrument.
  • the color change of the redox indicator can be clearly measured. Therefore, according to the present invention, the cariogenic bacterial count can be measured in a short time at room temperature. Therefore, according to the present invention, a large number of specimens can be processed in a short time without equipment such as a thermostatic device in a clinical site such as a dental clinic, and the number of cariogenic bacteria can be measured easily and quickly. It becomes.
  • the measurement result can be suitably used, for example, for determining the caries risk of the subject. Therefore, the present invention is useful for prevention of caries and the like.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

　う蝕原性菌数の測定等に利用できる、酸化還元指示薬の色調変化を測定する手段を提供する。酸化還元指示薬の色調変化を測定する方法であって、検査試薬と被検試料とを反応させて色調の変化を測定することを含み、前記検査試薬が、酸化還元指示薬、酸化還元反応促進剤、およびハロゲンの塩を含む、方法により酸化還元指示薬の色調変化を測定する。

Description

酸化還元指示薬の色調変化を測定する方法
　本発明は、う蝕原性菌数の測定等に利用できる、酸化還元指示薬の色調変化を測定する方法、およびそのために用いられる試験片に関する。
　口腔内には多種の細菌が存在するが、中でもう蝕を引き起こすものをう蝕原性菌という。例えば、唾液中のう蝕原性菌数が高ければう蝕リスク、すなわち口腔がどの程度虫歯に罹患しやすい状態にあるかを示すリスク、が高いと考えられる。う蝕原性菌の検出法としては、酸化還元指示薬であるレサズリンを用いた検出法（特許文献１、２）や、ＮＡＤＨ等の還元力に基づく化学発光を利用した検出法（特許文献３）等が既に知られている。
　レサズリンは、通常は酸化型の青色色素であるレサズリン（極大吸収波長６０５ｎｍ）として存在するが、細菌の代謝により生じるＮＡＤＨやＮＡＤＰＨ（以降、これらを総称して「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ」と記載する場合がある）により還元され、赤紫色色素（極大吸収波長５７３ｎｍ）であるレゾルフィンへと変換される。また、レゾルフィンは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈによりさらに還元され、無色のハイドロレサズリンへと変換される。よって、レサズリンの色調変化に基づき、被検試料中の細菌、主に、う蝕原性菌を含むグラム陽性菌の菌数を測定することができる。レサズリンを利用したう蝕原性菌数の測定システムとしては、ＲＤテスト「昭和」（商品名、昭和薬品化工株式会社製）やＣＡＴ２１ファスト（商品名、ウィルデント社製）が知られている。
　１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェート（１－メトキシＰＭＳ）、フェナジニウムメチルサルフェート（ＰＭＳ）、フェナジンエトサルフェート（ＰＥＳ）等の電子キャリアーは、例えば、テトラゾリウム塩を呈色試薬として用いる反応系において、テトラゾリウム塩の酸化還元反応のメディエーター（ｍｅｄｉａｔｏｒ）として利用されている。また、ＰＭＳは、レサズリンを酸化還元指示薬として利用する反応系においてメディエーター（ｍｅｄｉａｔｏｒ）として利用できるとされているが（特許文献４）、メディエーター（ｍｅｄｉａｔｏｒ）としてはＰＭＳよりジアホラーゼが好ましいとされている（特許文献４）。
　しかしながら、このような酸化還元指示薬やメディエーターを利用する反応系において、さらに塩化ナトリウムや塩化カリウム等の塩を利用することは知られていない。
特開昭５８－２２５０２９号公報 特開２００４－０９３３３５号公報 特開平１０－２１０９９８号公報 特開昭６２－２３９９９９号公報
　上述した従来のう蝕原性菌数の測定システムでは、３２℃～３７℃の温調と１５～２０分の反応時間が必要であり、歯科医院等での短時間でのう蝕原性菌数の測定は不可能であった。また、温調を行わない場合、さらに反応所要時間が増大するという問題があった。すなわち、従来のう蝕原性菌数の測定法においては、反応温度や所要時間という点で改善の余地があった。本発明は、う蝕原性菌数の測定等に利用できる、酸化還元指示薬の色調変化を測定する新規な手段を提供することを課題とする。
　本発明者らは、鋭意検討の結果、レサズリンを呈色指示薬として含む検査試薬を用いたう蝕原性菌数の測定方法において、検査試薬の成分として１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェート（１－メトキシＰＭＳ）を添加することにより呈色反応性が向上することを見出した。本発明者は、検査試薬の成分として塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、または臭化カリウムをさらに添加することにより、呈色反応性がさらに向上することを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち本発明は、以下の通り例示できる。
[１]
　酸化還元指示薬の色調変化を測定する方法であって、
　検査試薬と被検試料とを反応させて色調の変化を測定することを含み、
　前記検査試薬が、酸化還元指示薬、酸化還元反応促進剤、およびハロゲンの塩を含む、方法。
[２]
　被検試料中のう蝕原性菌数を測定する方法である、[１]に記載の方法。
[３]
　前記酸化還元指示薬が、レサズリンである、[１]または[２]に記載の方法。
[４]
　前記酸化還元反応促進剤が、１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェート、フェナジニウムメチルサルフェート、またはフェナジンエトサルフェートである、[１]～[３]のいずれかに記載の方法。
[５]
　前記ハロゲンの塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、または臭化カリウムである、[１]～[４]のいずれかに記載の方法。
[６]
　支持担体と、該支持担体に担持される吸収性担体とを備える試験片であって、前記吸収性担体が前記検査試薬を保持する試験片を用いて測定が行われる、[１]～[５]のいずれかに記載の方法。
[７]
　酸化還元指示薬、酸化還元反応促進剤、およびハロゲンの塩を含む、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの測定試薬。
[８]
　前記酸化還元指示薬が、レサズリンである、[７]に記載の試薬。
[９]
　前記酸化還元反応促進剤が、１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェート、フェナジニウムメチルサルフェート、またはフェナジンエトサルフェートである、[７]または[８]に記載の試薬。
[１０]
　前記ハロゲンの塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、または臭化カリウムである、[７]～[９]のいずれかに記載の試薬。
[１１]
　支持担体と、該支持担体に担持される吸収性担体とを備える、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの測定に用いるための試験片であって、
　前記吸収性担体が[７]～[１０]のいずれかに記載の試薬を保持する、試験片。
[１２]
　う蝕原性菌数の測定に用いるための試験片である、[１１]に記載の試験片。
　本発明により、酸化還元指示薬の色調変化を明瞭に測定することができる。よって、本発明により、室温下、短時間でう蝕原性菌数を測定することができる。よって、本発明によれば、歯科医院等の臨床現場において、恒温装置等の設備なしに多数の検体を短時間に処理することができ、簡便且つ迅速なう蝕原性菌数の検査が可能となる。
図１（Ａ）は、本発明の試験片の一実施形態を示す平面図であり、図１（Ｂ）は、本発明の試験片の一実施形態を示す正面図である。 図２は、各検討成分が反応開始１分後から５分後の反射率変化（Δ４分反射率）に与える効果を示す図である。 図３は、各検討成分がベース反射率に与える効果を示す図である。 図４は、各検討成分がΔ４分反射率に与える効果を示す図である。 図５は、１－メトキシＰＭＳ濃度が０．４ｍＭである場合の、塩を添加した場合と添加しない場合における吐出液中う蝕原性菌数とΔ４分反射率との相関を示す図である。 図６は、１－メトキシＰＭＳ濃度が０．５ｍＭである場合の、塩を添加した場合と添加しない場合における吐出液中う蝕原性菌数とΔ４分反射率との相関を示す図である。 図７は、１－メトキシＰＭＳ濃度が０．６ｍＭである場合の、塩を添加した場合と添加しない場合における吐出液中う蝕原性菌数とΔ４分反射率との相関を示す図である。 図８は、各種塩類がΔ４分反射率に与える効果を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の方法は、酸化還元指示薬、酸化還元反応促進剤、およびハロゲンの塩を利用することを特徴とする、酸化還元指示薬の呈色を測定する方法である。
　すなわち、本発明の方法は、酸化還元指示薬の色調変化を測定する方法であって、検査試薬と被検試料とを反応させて色調の変化を測定することを含み、前記検査試薬が、酸化還元指示薬、酸化還元反応促進剤、およびハロゲンの塩を含む、方法である。
　本発明の方法において、酸化還元指示薬は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを電子供与体とする酸化還元反応により呈色する指示薬である。よって、前記検査試薬は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの測定試薬として利用できる。
　同様に、本発明の方法は、被検試料に含まれるＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび／または反応系において生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの検出に利用できる。よって、本発明の方法により、例えば、被検試料に含まれる細菌の代謝により生じるＮＡＤ（Ｐ）Ｈを検出することができ、それにより、被検試料に含まれる細菌を検出できる。そのような細菌として、具体的には、例えば、う蝕原性菌が挙げられる。
　すなわち、本発明の方法の一態様は、被検試料中のう蝕原性菌数を測定する方法であって、検査試薬と被検試料とを反応させて色調の変化を測定することを含み、前記検査試薬が、酸化還元指示薬、酸化還元反応促進剤、およびハロゲンの塩を含む、方法である。以下、う蝕原性菌数を測定する方法を例示して、本発明の方法を説明する。なお、以下、酸化還元指示薬、酸化還元反応促進剤、およびハロゲンの塩を総称して「有効成分」という場合がある。
　本発明において、う蝕原性菌とは、う蝕を引き起こす原因となりうる菌をいう。う蝕原性菌としては、具体的には、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）及びストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｏｂｒｉｎｕｓ）等が挙げられる。う蝕原性菌数が多い程、う蝕リスク、すなわち虫歯に罹患するリスクが高まると考えられる。
　本発明において、う蝕原性菌数の測定を行う被検試料は特に限定されない。例えば、う蝕原性菌数の測定を行う被検試料としては、口腔から得られる被検試料が挙げられる。口腔から得られる被検試料としては、例えば、安静時唾液（非刺激唾液）、刺激唾液、洗口吐出液が挙げられる。刺激唾液としては、ガムで刺激して採取した唾液が挙げられる。これらの中では、洗口吐出液が好ましい。洗口吐出液は、例えば、精製水を口に含み、吐き出すことにより得られる。具体的には、例えば、３ｍＬの精製水を１０秒間口に含み、容器に吐き出せばよい。精製水の容量や、口に含む時間は、必要により適宜変更することができる。得られた被検試料は特段の前処理なく以降の操作に利用できるが、必要に応じて、適宜希釈等の追加操作を行ってもよい。また、う蝕原性菌数の測定を行う被検試料としては、う蝕原性菌の培養液等のう蝕原性菌を含む試料が挙げられる。う蝕原性菌の培養液は、例えば、ＡＴＣＣ等の生物資源バンクから入手できる単離されたう蝕原性菌株の培養液であってよい。
　本発明において、検査試薬は、酸化還元指示薬を含む。本発明において、酸化還元指示薬とは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを電子供与体とする酸化還元反応により呈色する指示薬であれば特に限定されない。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、細菌の代謝により生じる。すなわち、被検試料中の細菌、主に、う蝕原性菌を含むグラム陽性菌の生菌数に応じて酸化還元指示薬の還元が進行する。よって、酸化還元指示薬の還元による色調の変化は、う蝕原性菌数を反映する。なお、「ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを電子供与体とする」とは、直接ＮＡＤ（Ｐ）Ｈにより還元されてもよく、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈにより還元される他の物質（ｍｅｄｉａｔｏｒ）を介して間接的に還元されてもよい。酸化還元指示薬としては、具体的には、例えば、レサズリン、テトラゾリウム塩、メチレンブルー、およびキシレンブルーが挙げられる。これらの中では、レサズリンが好ましい。これらは単独で含まれていてもよく、任意の組み合わせで含まれていてもよい。
　レサズリンは、通常は酸化型の青色色素であるレサズリン（極大吸収波長６０５ｎｍ）として存在するが、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈにより還元され、赤紫色色素（極大吸収波長５７３ｎｍ）であるレゾルフィンへと変換される。また、レゾルフィンは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈによりさらに還元され、無色のハイドロレサズリンへと変換される。
　テトラゾリウム塩は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈにより還元され、ホルマザン色素へと変換される。テトラゾリウム塩として、具体的には、例えば、ＭＴＴ（３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－２－ｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌ－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）、ＸＴＴ（２，３－ｂｉｓ－（２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｎｉｔｒｏ－５－ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ－５－ｃａｒｂｏｘａｎｉｌｉｄｅ）、ＭＴＳ（３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－５－（３－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－２－（４－ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）、ＷＳＴ－１（２－（４－ｉｏｄｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（２，４－ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）、およびＷＳＴ－８（２－（２－ｍｅｔｈｏｘｙ－４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－３－（４－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－５－（２，４－ｄｉｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）－２Ｈ－ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）が挙げられる。これらの中では、ＷＳＴ－１またはＷＳＴ－８が好ましい。
　なお、酸化還元指示薬の吸収スペクトルは指示薬ごとに異なるため、呈色反応の検出条件は用いる酸化還元指示薬に応じて適宜設定すればよい。
　本発明の方法において、酸化還元指示薬の濃度は、被検試料中のう蝕原性菌数に応じて呈色反応が進行する限り特に限定されず、用いる酸化還元指示薬の種類やその他の成分等の諸条件に応じて適宜設定できる。例えば、試験片を用いてう蝕原性菌数の測定を行う場合には、試験片の作製に用いる試薬含浸液中の酸化還元指示薬の濃度は、好ましくは０．０１～１ｍＭ、より好ましくは０．０５～０．３ｍＭ、さらに好ましくは０．１～０．１６ｍＭである。
　本発明において、検査試薬は、酸化還元反応促進剤を含む。本発明において、酸化還元反応促進剤とは、酸化還元反応による酸化還元指示薬の呈色反応を促進する化合物であれば特に限定されない。酸化還元反応促進剤としては、例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈにより還元されて還元型となり、他の物質を還元する機能を有する化合物が挙げられる。還元型の酸化還元反応促進剤により還元される他の物質としては、酸化還元指示薬が挙げられる。酸化還元反応促進剤として、具体的には、例えば、１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェート（１－メトキシＰＭＳ）、フェナジニウムメチルサルフェート（ＰＭＳ）、フェナジンエトサルフェート（ＰＥＳ）が挙げられる。これらの中では、１－メトキシＰＭＳが好ましい。これらは単独で含まれていてもよく、任意の組み合わせで含まれていてもよい。
　本発明の方法において、酸化還元反応促進剤の濃度は、被検試料中のう蝕原性菌数に応じて呈色反応が進行する限り特に限定されず、用いる酸化還元反応促進剤の種類やその他の成分等の諸条件に応じて適宜設定できる。例えば、試薬含浸液中の酸化還元反応促進剤の濃度は、好ましくは０．０１～５ｍＭであり、より好ましくは０．０５～１ｍＭであり、さらに好ましくは０．１～０．６ｍＭである。
　本発明において、検査試薬は、ハロゲンの塩を含む。本発明において、ハロゲンの塩とは、ハロゲンイオンと任意の陽イオンとがイオン結合した塩をいう。ハロゲンの塩としては、例えば、フッ化物塩、塩化物塩、臭化物塩、ヨウ化物塩が挙げられる。ハロゲンの塩としては、塩化物塩または臭化物塩が好ましく、塩化物塩がより好ましい。また、ハロゲンの塩としては、ハロゲンとアルカリ金属との塩が好ましい。アルカリ金属としては、ナトリウムまたはカリウムが好ましい。ハロゲンの塩として、具体的には、塩化ナトリウム塩化カリウム、臭化ナトリウム、または臭化カリウムが好ましく用いられる。これらは単独で含まれていてもよく、任意の組み合わせで含まれていてもよい。
　本発明の方法において、ハロゲンの塩の濃度は、被検試料中のう蝕原性菌数に応じて呈色反応が進行する限り特に限定されず、用いるハロゲンの塩の種類やその他の成分等の諸条件に応じて適宜設定できる。例えば、試薬含浸液中のハロゲンの塩の濃度は、好ましくは１～１０００ｍＭ、より好ましくは５～５００ｍＭ、特に好ましくは５０～２００ｍＭである。
　ハロゲンの塩が含まれることにより、例えば、呈色反応のバックグラウンドの低下が期待できる。具体的には、例えば、酸化還元指示薬がレサズリンであり、酸化還元反応促進剤が１－メトキシＰＭＳである場合、レサズリンを単独で用いる場合と比較して、レサズリンと１－メトキシＰＭＳとを混合して用いる場合には、レサズリンの青色が赤色側にシフトするが、さらにハロゲンの塩を加えることで、レサズリンの色調を青色側に戻すことができる。上述の通り、レサズリン（青色）はＮＡＤ（Ｐ）Ｈによりレゾルフィン（赤紫色）へと還元されるため、レサズリンの青色が赤色側にシフトすることは、呈色反応のバックグラウンドの増大を意味し、また、色調の変化可能な範囲が当該シフトの分だけ制限されることを意味する。よって、ハロゲンの塩によりレサズリンの色調が青色側に戻ることは、呈色反応のバックグラウンドの低下を意味し、また、色調の変化可能な範囲を拡張できることを意味する。したがって、本発明の方法においては、ハロゲンの塩が含まれることにより、ハロゲンの塩が含まれない場合と比較して、色調変化を明瞭に測定できる。よって、ハロゲンの塩は、色調変化に基づくう蝕原性菌数の測定に効果的である。
　また、被検試料中のう蝕原性菌数に応じて呈色反応が進行する限り、検査試薬はその他の成分を含んでいてもよい。
　検査試薬は、例えば、炭素源を含んでいるのが好ましい。炭素源は、う蝕原性菌の代謝を活性化できるよう、う蝕原性菌が資化可能なものが好ましい。炭素源としては、糖類や有機酸が挙げられ、糖類が好ましい。糖類として、具体的には、スクロースやグルコースが挙げられ、特にスクロースが好ましい。炭素源が含まれる場合、試薬含浸液における炭素源の濃度は、１～１０００ｍＭ、より好ましくは５～５００ｍＭ、特に好ましくは２０～２５０ｍＭである。
　また、検査試薬は、例えば、ｐＨ緩衝剤を含んでいてもよい。ｐＨ緩衝剤として、具体的には、例えば、リン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、ＰＩＰＥＳバッファー、ＭＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ＧＴＡ広域バッファーが挙げられる。ｐＨ緩衝剤が含まれる場合、試薬含浸液におけるｐＨ緩衝剤の濃度は、好ましくは１０～１０００ｍＭ、より好ましくは２０～５００ｍＭ、特に好ましくは５０～１５０ｍＭである。反応液のｐＨは、例えば、通常ｐＨ４．０～９．０であり、好ましくは５．５～８．０である。
　また、検査試薬は、例えば、バインダーを含んでいてもよい。バインダーとして、具体的には、例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、カルボキシメチルセルロースが挙げられる。バインダーが含まれる場合、試薬含浸液におけるバインダーの濃度は、好ましくは０．０１～５％、より好ましくは０．０５～３％、さらに好ましくは０．１～１％である。なお、本発明において、バインダーの濃度の「％」は、特記しない限りｗ／ｖ％を意味する。
　また、検査試薬は、例えば、う蝕原性菌以外の代謝を阻害する薬剤を含んでいてもよい。そのような薬剤として、具体的には、例えば、バシトラシン等のう蝕原性菌以外の細菌の増殖抑制に利用される薬剤や、亜テルル酸カリウム等のグラム陰性菌の増殖を抑制する薬剤が挙げられる。
　これらの成分はいずれも、それぞれ単独で含まれていてもよく、任意の組み合わせで含まれていてもよい。
　本発明の方法は、試験片を用いて実施できる。本発明の方法に用いられる試験片（以下、本発明の試験片ともいう）は、酸化還元指示薬、酸化還元反応促進剤、およびハロゲンの塩を含む検査試薬を保持する試験片である。本発明の試験片は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの測定に用いるための試験片であってよく、その一態様は、う蝕原性菌数の測定に用いるための試験片である。以下、う蝕原性菌数の測定に用いるための試験片を例示して、本発明の試験片を説明する。
　本発明の試験片は、好ましくは、支持担体と、当該支持担体に担持される吸収性担体を備え、当該吸収性担体が検査試薬を保持する。検査試薬を保持する吸収性担体部分に被検試料を点着することで、被検試料中のう蝕原性菌数に応じて呈色反応が進行する。図１には、支持担体１０と、支持担体１０に担持される吸収性担体１１とを備える、本発明の試験片の一実施形態である試験片１を例示する。図１（Ａ）は、試験片１の平面図であり、図１（Ｂ）は、試験片１の正面図である。
　吸収性担体としては、検査試薬を保持でき、且つ酸化還元指示薬の還元に基づく色調の変化の測定が可能である限りにおいて、いかなる担体でも使用できる。すなわち、吸収性担体としては、例えば、紙、セルロース、多孔質セラミック、化学繊維、合成樹脂製織布、及び不織布が挙げられ、濾紙またはガラス繊維濾紙であるのが好ましい。濾紙またはガラス繊維濾紙としては、例えば、市販のものを好適に用いることができる。
　支持担体としては、フィルム、シート、またはプレート等の平面状担体を好ましく用いることができる。支持担体は、プラスチック製や紙製であってよい。プラスチックとしては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、及びポリ塩化ビニルなど種々のプラスチックを用いることができる。支持担体としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）製担体が好ましい。また、支持担体は複合材であってもよく、ポリエステルとポリエチレンの複合材やポリエチレンとアルミを積層した複合材、その他種々の複合材が利用できる。支持担体の厚さは、１０～５００μｍであるのが好ましく、５０～３００μｍであるのがより好ましい。
　本発明の試験片において、う蝕原性菌数測定用の検査試薬を保持する吸収性担体は、少なくとも１つ備えられていればよく、２またはそれ以上備えられていてもよい。
　また、本発明の試験片は、う蝕原性菌数測定用の検査試薬を保持する吸収性担体に加えて、う蝕原性菌数以外のパラメータ測定用の吸収性担体を備えていてもよい。さらに、本発明の試験片は、う蝕原性菌数等のパラメータ測定用の吸収性担体に加えて、任意の試験紙、例えばパラメータの測定には用いられないダミーの吸収性担体を備えていてもよい。本発明の試験片が複数の吸収性担体を備える場合、各吸収性担体は、用いられる検出機器の種類等に応じて適宜配列すればよい。検出機器としては種々の反射率測定機器を好適に使用することができるが、例えば、検出機器としてポケットケムＵＡ　ＰＵ－４０１０（アークレイ株式会社製）を使用する場合には、各吸収性担体は支持担体上に直線状に整列しているのが好ましい。
　本発明の試験片を製造する方法は、特に限定されず、本発明の試験片は、例えば、検査試薬を予め保持させた吸収性担体を支持担体に担持させることにより製造することができる。試薬を吸収性担体に保持させる手法は特に限定されず、例えば、吸収性担体を試薬溶液に浸漬してもよく、吸収性担体に試薬溶液を点着または塗布してもよい。上記のうち、吸収性担体を試薬溶液に浸漬するのが好ましい。なお、試薬溶液とは、検査試薬を含有する溶液である。試薬を吸収性担体に保持させる工程は、複数回の浸漬ないし点着または塗布等の工程を含んでいてもよい。試薬を保持させた吸収性担体は、乾燥させて以降の工程に用いることができる。試薬を保持させた吸収性担体を、必要に応じて切断し、支持担体に担持させることにより、本発明の試験片を製造できる。また、本発明の試験片は、例えば、支持担体に予め担持させた吸収性担体に検査試薬を保持させることにより製造されてもよい。この場合には、吸収性担体に試薬溶液を点着または塗布することにより、試薬を吸収性担体に保持させ、その後乾燥させるのが好ましい。本発明の試験片において、吸収性担体を支持担体に担持させる方法は、特に制限されず、例えば、通常用いられる接着手法を好適に用いることができる。例えば、粘着テープにより貼付してもよく、接着剤により貼付してもよい。
　本発明の方法によれば、温調を行うことなくう蝕原性菌数の測定が可能である。すなわち、反応温度は室温であってよい。具体的には、例えば、反応温度は、通常１５℃～３７℃であり、１５℃～３０℃であってもよい。なお、本発明の方法においては、適宜、温調を行ってもよい。
　本発明の方法において、反応時間は、反応温度や試薬成分等の諸条件に応じて適宜設定することができる。反応時間は、例えば、通常１～１０分である。例えば、反応時間は５分であってもよい。
　本発明の方法においては、測定された色調の変化に基づき、う蝕原性菌数を測定できる。なお、「う蝕原性菌数を測定する」とは、被検試料中のう蝕原性菌数の値自体を算出することに限られず、被検試料中のう蝕原性菌数の程度を、少なくとも２段階、好ましくは３またはそれ以上の段階に区分して判定することであってもよい。具体的には、例えば、被検試料中のう蝕原性菌数が、「少ない」、「中程度」、または「多い」の３段階のいずれに該当するかを判定すればよい。複数段階に区分する場合の具体的な菌数は、臨床データや、用いる被検試料の態様に応じて適宜設定すればよい。一例を挙げると、３ｍＬの精製水で１０秒間洗口することで得られる洗口吐出液中のう蝕原性菌数として、１０6ＣＦＵ／ｍＬ未満の場合に「少ない」、１０6ＣＦＵ／ｍＬ以上で１０7ＣＦＵ／ｍＬ未満の場合に「中程度」、１０7ＣＦＵ／ｍＬ以上の場合に「多い」と判定してもよい。
　本発明の方法により測定された色調の変化、う蝕原性菌数の値、またはう蝕原性菌数の程度は、被検試料を採取した被検者のう蝕リスクの判定に利用してもよい。例えば、色調の変化、う蝕原性菌数の値、またはう蝕原性菌数の程度に基づいて、被検試料を採取した被検者のう蝕リスクを、少なくとも２段階、好ましくは３またはそれ以上の段階に区分して判定してもよい。具体的には、例えば、被検試料を採取した被検者のう蝕リスクが「低い」、「中程度」、または「高い」の３段階のいずれに該当するかを判定すればよい。本発明の方法においては、そのようにう蝕リスクを判定することも、「う蝕原性菌数を測定する」ことの一態様であるものとする。なお、本発明の方法により測定された色調の変化、う蝕原性菌数の値、またはう蝕原性菌数の程度は、単独でう蝕リスクの判定に利用されてもよく、その他のパラメータと組み合わせて利用されてもよい。
　色調の変化に基づくう蝕原性菌数の測定は、菌数が既知のう蝕原性菌標準試料を用いてう蝕原性菌数と色調の変化との相関データを取得し、当該相関データを利用して行えばよい。相関データとは、例えば検量線である。また、う蝕リスクの判定を行う場合には、さらに、う蝕リスクを含めた相関データを設定し利用すればよい。
　本発明の方法において、色調の変化とは、酸化還元指示薬の還元に基づく特定の波長における吸光度の増減および／または極大吸収波長のシフトをいう。すなわち、本発明の方法においては、酸化還元指示薬の一部または全部が還元されることにより、還元された酸化還元指示薬の量および／または比率に応じて、特定の波長における吸光度の増減および／または極大吸収波長のシフトが生じる。
　本発明の方法において、色調の変化は、光学的な検出機器により測定できる。色調の変化は、特定の波長における吸光度の増減として測定されるのが好ましい。
　特定の波長における吸光度の増減は、通常、当該特定の波長の光を、呈色部位、すなわち被検試料を点着した吸収性担体部分に照射し、当該特定の波長における一定時間の経過による反射率の変化値を取得することにより測定できる。特定の波長における吸光度の増加は、当該特定の波長における反射率の減少として測定できる。特定の波長における吸光度の減少は、当該特定の波長における反射率の増加として測定できる。一定時間とは、被検試料の点着直後から任意の時間が経過するまでであってもよく、被検試料の点着後のある時点からさらに任意の時間が経過するまでであってもよい。一定時間の長さは、反応時間等の諸条件に応じて適宜設定することができるが、例えば、通常１～１０分であり、２～８分であってもよい。被検試料の点着後のある時点とは、反応時間等の諸条件に応じて適宜設定することができるが、例えば、被検試料の点着の５秒後～３分後であるのが好ましく、１０秒後～２分後であるのがより好ましい。具体的には、例えば、反応時間を５分として、反応開始後１分～５分までの４分間における反射率変化を測定してもよい。反射率の変化値は、反射率を少なくとも２回測定し、測定値の差として算出できる。反射率は、３またはそれ以上の回数測定されてもよい。一定時間の経過による反射率の変化値は、複数回測定された反射率に基づき、反射率の変化速度として算出されてもよい。
　また、被検試料の点着直後または被検試料の点着後のある時点での反射率を測定する必要がない場合には、反射率の測定回数を減らすことができる。例えば、被検試料の点着直後または被検試料の点着後のある時点での反射率を被検試料中のう蝕原性菌数によらず一定の値であると仮定した場合には、それから任意の時間が経過した時点で１回のみ反射率の測定を行い、測定値と当該一定の値との差として反射率の変化値を算出することも可能である。当該一定の値は、反射率の変化値を算出する際に決定されていればよい。なお、被検試料の点着直後または被検試料の点着後のある時点での反射率を被検試料中のう蝕原性菌数によらず一定の値であると仮定した場合には、それから任意の時間が経過した時点での反射率とう蝕原性菌数との相関データを利用することで、反射率の変化値自体を算出せずにう蝕原性菌数を測定することも可能である。このように反射率の変化値自体は算出されずにう蝕原性菌数が測定される場合には、反射率を測定すること自体を、「吸光度の増減を測定する」こととみなしてよく、また、本発明の方法における「色調の変化を測定する」こととみなしてよい。すなわち、このように反射率の変化値自体は算出されずにう蝕原性菌数が測定される場合も、色調の変化に基づいてう蝕原性菌数を測定することに含まれる。
　吸光度の増減は、少なくとも１つの測定用の波長に基づき測定されればよいが、少なくとも１つの測定用の波長を含む２またはそれ以上の波長に基づいて測定されてもよい。例えば、２またはそれ以上の測定用の波長を利用してもよく、測定用の波長と、バックグラウンドの影響を除くための参照用の波長とを個別に設定し利用してもよい。吸光度の増減を測定するために用いる光源の波長は、用いる酸化還元指示薬や検出機器に応じて適宜設定できる。測定用の波長は、用いる酸化還元指示薬の酸化型での極大吸収波長であってもよく、還元型での極大吸収波長であってもよく、それ以外の波長であってもよい。例えば、酸化還元指示薬としてレサズリンを用いる場合には、測定波長を６３０～６３５ｎｍ、参照波長を７５０～７６０ｎｍとすることができる。
　極大吸収波長のシフトは、一定時間の経過前後における極大吸収波長を比較することにより測定できる。極大吸収波長は、複数の波長の光を、呈色部位、すなわち被検試料を点着した吸収性担体部分に照射し、各波長における反射率を測定することにより特定できる。極大吸収波長のシフトを測定するための条件は、複数の波長の光を用いて極大吸収波長を特定すること以外は、特定の波長における吸光度の増減を測定する場合と同様であってよい。
　なお、色調の変化を測定するために取得される上記のようなデータ、すなわち、特定の波長における反射率や、それから算出される反射率の変化値、極大吸収波長等を総称して、以下、「反射率データ」という場合がある。
　光学的な検出機器としては、特に限定されないが、例えば、尿試験紙用あるいは血液試験紙用の反射率測定機器を使用することができる。尿試験紙用の反射率測定機器としては、例えば、ポケットケムＵＡ　ＰＵ－４０１０（アークレイ株式会社製）を使用することができる。ポケットケムＵＡ　ＰＵ－４０１０を用いる場合には、二波長反射測光法による測定を行うことができる。ポケットケムＵＡ　ＰＵ－４０１０において、測光部では、マルチＬＥＤより波長の異なる２種類の光、すなわち測定波長の光、及び参照波長の光を呈色部位に照射し、その反射率に基づき色調の変化を測定することができる。
　具体的には、例えば、酸化還元指示薬としてレサズリンを用いた試験片を用い、検出機器としてポケットケムＵＡ　ＰＵ－４０１０（アークレイ株式会社製）を使用する場合には、室温、５分の反応時間で、測定波長を６３５ｎｍ、参照波長を７６０ｎｍとして測定を行うことができる。この条件では、レサズリンの還元反応の進行は、６３５ｎｍの吸光度の減少として、すなわち６３５ｎｍの光を照射した際の反射率の増加として検出される。反応時間を５分とした場合には、例えば、反応開始後１分～５分までの４分間における反射率変化を測定すればよい。
　本発明の方法は、さらに、例えば、測定された色調の変化、算出されたう蝕原性菌数の値、判定されたう蝕原性菌数の程度、および／または判定されたう蝕リスクの程度を出力する工程を含んでいてもよく、また、これらの測定・判定結果に基づきコメントを出力する工程を含んでいてもよい。コメントとは、例えば、測定・判定結果を説明するものである。コメントの例としては「唾液中のムシ歯菌は少なく、良好な状態です。」が挙げられる。出力は、例えば、反射率測定機器に設けられた表示部に表示することで行うことができる。表示部は、文字や画像等の情報を表示できるものである限り、特に限定されず、例えばＬＥＤバックライトを備えた液晶ディスプレイが好適に用いられる。表示は、文字、図形、記号、色彩又はこれらの結合等の任意の形式により行われる。なお、出力の態様は、医師、歯科衛生士、又は被検者等が出力された情報を認識できる限り特に制限されず、例えば、印刷して出力してもよく、音声によって出力してもよい。また、表示部における視覚的な表示、印刷による出力、及び音声による出力等を任意に組み合わせて情報の出力を行ってもよい。
　本発明の方法において、反射率データの取得、う蝕原性菌数の算出等の演算、および測定・判定結果やコメントの出力等の各工程は、単一のコンピュータにより実行されてもよく、物理的に独立した複数のコンピュータにより実行されてもよい。例えば、取得した反射率データを電気通信回線等を利用して他の装置に送信し、当該他の装置でう蝕原性菌数の算出等の演算を行ってもよい。また、測定・判定結果を電気通信回線等を利用して他の装置に送信し、当該他の装置で当該測定・判定結果やそれに基づくコメント等の情報を表示してもよい。そのような様態としては、例えば、ＷＥＢ上で反射率データを入力して、演算用のサーバーに反射率データを送信し、当該演算用サーバーでう蝕原性菌数の算出等の演算を行い、さらに測定・判定結果をＷＥＢ上で表示する様態が例示できる。また、電気通信回線等を利用したデータの送受信に基づく課金システムを採用してもよい。そのような課金システムとしては、例えば、利用者がＷＥＢブラウザ上で測定・判定結果を表示させた時点で、あるいは、測定・判定結果を含むファイルのダウンロードを完了した時点で課金するシステムが挙げられる。課金は、表示・ダウンロード従量制、及び日、週、または月など期間に応じて課金する定額制等の任意の方式で実施することができる。
　以上、う蝕原性菌数を測定する方法を例示して本発明の方法を説明したが、本発明の方法は、う蝕原性菌数の測定に限られず、被検試料に含まれるＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび／または反応系において生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの検出を利用する任意の方法に利用できる。例えば、本発明の方法は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを直接的あるいは間接的に生成する酵素反応の検出に利用することができる。なお、本発明の方法は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの測定自体を目的としてもよく、そうでなくともよい。う蝕原性菌数を測定する方法およびそれに関連する検査試薬や試験片等に関する上述の説明は、本発明の方法の他の態様にも準用できる。例えば、本発明の方法は、その態様に応じて、測定された色調変化に基づいてＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量または程度を算出する工程を含んでいてもよく、測定された色調変化に基づいてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ量と関連する検出対象の量または程度を算出する工程を含んでいてもよい。
　また、本発明の方法においては、測定の目的等の諸条件によっては、上記のような試験片を用いる態様に限られず、その他の任意の態様で呈色反応を進行させてもよい。例えば、本発明の方法においては、上記検査試薬を含む容器内で呈色反応を進行させてもよい。具体的には、例えば、被検試料と上記検査試薬とを任意の容器内に入れることで、被検試料に含まれるＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよび／または容器内において生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量に応じて呈色反応を進行させることができる。容器としては、特に制限されないが、例えば、チューブや試験管が挙げられる。
　また、本発明の方法においては、測定の目的等の諸条件によっては、上記のような検出機器を用いる態様に限られず、その他の任意の態様で呈色反応を検出してもよい。例えば、本発明の方法においては、肉眼で色調の変化を測定してもよい。しかしながら、通常、ハロゲンの塩による呈色反応のバックグラウンドの低下効果を有効に利用するためには、光学的な検出機器を用いて定量的に色調変化を測定するのが好ましく、また、色調変化の定量的な測定結果に基づき、定量的にう蝕原性菌数の測定等を行うのが好ましい。
　また、本発明の方法においては、測定の目的等の諸条件によっては、最終的に酸化還元指示薬、酸化還元反応促進剤、およびハロゲンの塩が有効成分として利用される限り、反応開始時から被検試料およびそれら全ての有効成分が反応系に含まれていてもよく、そうでなくともよい。例えば、被検試料においてＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成が十分に進行した後、検査試薬を反応系に添加してもよい。また、例えば、各有効成分を異なるタイミングで反応系に添加してもよい。なお、ハロゲンの塩による呈色反応のバックグラウンドの低下効果を得るため、通常、ハロゲンの塩は、被検試料、酸化還元指示薬、および酸化還元反応促進剤が反応系にそろうまでに反応系に添加されるのが好ましく、あらかじめ酸化還元指示薬や、酸化還元指示薬と酸化還元反応促進剤との混合物に添加しておくのがより好ましい。
　また、本発明において、検査試薬は、各有効成分を含む限り任意の態様で提供されてよい。例えば、検査試薬は、上記のように試験片に保持されて提供されてもよく、任意の容器に入れて提供されてもよい。また、検査試薬は、固体状、液体状、ゲル状等の任意の形態で製剤化されて提供されてもよい。製剤化にあたっては、製剤担体として通常使用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、又は溶剤等の添加剤を使用することができる。検査試薬は、そのまま、あるいは水、生理食塩水、緩衝液等を用いて希釈、分散、又は溶解し、本発明の方法に利用できる。このように希釈、分散、又は溶解等した場合にも、本発明の検査試薬の範囲に含まれることは言うまでもない。なお、各有効成分は、混合されて検査試薬に含まれていてもよいし、混合されず別個に検査試薬に含まれていてもよい。本発明の検査試薬における各有効成分の濃度は、測定の目的等の諸条件によって適宜設定すればよいが、例えば、反応系において被検試料と混合された液体状態で、上述の試薬含浸液における好ましい濃度となるような濃度であってよい。
　また、本発明の検査試薬は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ測定用、またはう蝕原性菌数測定用等のキットとして提供されてよい。キットは、本発明の検査試薬を含む限り特に制限されない。
　以下、実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実験例１］増感剤の決定
　本実験例では、レサズリンを酸化還元指示薬として用いる際に、増感剤として利用できる化合物のスクリーニングを行った。
＜試薬含浸液処方＞
　レサズリンナトリウム（東京化成製）４２ｍｇ、１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０)１２０ｍＬ、スクロース（ナカライテスク製）１２ｇを蒸留水１１００ｍＬで溶解した基本組成に対し、表１に示す濃度となるように各検討成分を添加し、試薬含浸液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜試験片作製＞
　上記試薬含浸液に濾紙を含浸したのち、５０℃で１５分間乾燥させ、試験紙を得た。作製した各試験紙を５ｍｍ×３００ｍｍ幅にカットし、これを１００ｍｍ×２８０ｍｍの粘着剤を貼付したＰＥＴフィルムに貼付した。この試験紙貼付ＰＥＴフィルムを５ｍｍ幅にカットし、１００ｍｍ×５ｍｍの試験片を得た。なお、以下、試薬を保持する試験紙部分を「試薬部分」という場合がある。
＜測定方法＞
　上記試験片の試薬部分に、濃度が１０9ＣＦＵ／ｍＬとなるように蒸留水で懸濁したストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ、ＡＴＣＣ２５１７５）の菌液を１０μＬ滴下して、室温に置いた。各試験紙の測定波長６３５ｎｍ／参照波長７６０ｎｍにおける１分後から５分後の反射率変化（Δ４分反射率ともいう）を、反射率測定機器を用いて測定した。
＜結果＞
　結果を図２に示す。検討の結果、基本組成に１－メトキシＰＭＳを加えることによってΔ４分反射率が顕著に上昇することが明らかとなった。
［実験例２］ベース反射率低下剤の決定
　本実験例では、レサズリンを酸化還元指示薬として、１－メトキシＰＭＳを増感剤として用いる際に、ベース反射率（すなわち反射率のバックグラウンド値）を低下させることができる化合物のスクリーニングを行った。
＜処方＞
　レサズリンナトリウム（東京化成製）４２ｍｇ、１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０)１２０ｍＬ、スクロース（ナカライテスク製）１２ｇ、１－メトキシＰＭＳ（同仁化学製）２４２ｍｇを蒸留水１１００ｍＬで溶解した基本組成に対し、表２に示す濃度となるように各検討成分を添加し、試薬含浸液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜試験片作製＞
　上記試薬含浸液に濾紙を含浸したのち、５０℃で１５分間乾燥させ、試験紙を得た。作製した各試験紙を５ｍｍ×３００ｍｍ幅にカットし、これを１００ｍｍ×２８０ｍｍの粘着剤を貼付したＰＥＴフィルムに貼付した。この試験紙貼付ＰＥＴフィルムを５ｍｍ幅にカットし、１００ｍｍ×５ｍｍの試験片を得た。
＜測定方法＞
　まず、各試験片のベース反射率の測定を行った。上記試験片の試薬部分に蒸留水を１０μＬ滴下して、室温に置いた。各試験紙の測定波長６３５ｎｍ／参照波長７６０ｎｍにおける１分後の反射率を、反射率測定機器を用いて測定し、ベース反射率とした。
　さらに、別途、各試験片のう蝕原性菌に対する反応性の評価を行った。上記試験片の試薬部分に、濃度が１０9ＣＦＵ／ｍＬとなるように蒸留水で懸濁したストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ、ＡＴＣＣ２５１７５）の菌液を１０μＬ滴下して、室温に置いた。各試験紙の測定波長６３５ｎｍ／参照波長７６０ｎｍにおける１分後から５分後の反射率変化（Δ４分反射率）を、反射率測定機器を用いて測定した。
＜結果＞
　ベース反射率の測定結果を図３に示す。検討の結果、基本組成にＫＣｌあるいはＮａＣｌを添加することによって、著しくベース反射率が低下することが明らかとなった。
　さらに、反応性の評価を行なった結果を図４に示す。増感剤である１－メトキシＰＭＳのみを加えた場合と比較して、ＫＣｌあるいはＮａＣｌを併用することによりΔ４分反射率がさらに上昇し、反応性が格段に向上することが明らかとなった。
［実験例３］吐出液を用いた検討
　本実験例では、洗口吐出液を被検試料として用いて、ＫＣｌまたはＮａＣｌの添加効果を検討した。
＜処方＞
　レサズリンナトリウム（東京化成製）４２ｍｇ、１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０)１２０ｍＬ、スクロース（ナカライテスク製）１２ｇを蒸留水１１００ｍＬで溶解した基本組成に対し、表３に示す濃度となるように１－メトキシＰＭＳとＫＣｌあるいはＮａＣｌを添加し、試薬含浸液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜試験片作製＞
　上記試薬含浸液に濾紙を含浸したのち、５０℃で１５分間乾燥させ、試験紙を得た。作製した各試験紙を５ｍｍ×３００ｍｍ幅にカットし、これを１００ｍｍ×２８０ｍｍの粘着剤を貼付したＰＥＴフィルムに貼付した。この試験紙貼付ＰＥＴフィルムを５ｍｍ幅にカットし、１００ｍｍ×５ｍｍの試験片を得た。
＜測定方法＞
　１２名のボランティアの協力を得て、３ｍＬの精製水で１０秒間洗口し、容器に吐き出すことで得られた吐出液を被検試料とした。上記試験片の試薬部分に、各被検試料を１０μＬ滴下して、各試験紙の測定波長６３５ｎｍ／参照波長７６０ｎｍにおける１分後から５分後の反射率変化（Δ４分反射率）を、反射率測定機器を用いて測定した。また、被検試料中のう蝕原性菌数の測定をプレート培養法（ＭＳＢ培地）にて行なった。
　結果を図５、図６、図７に示す。基本組成に１－メトキシＰＭＳのみを添加した対照群と比較して、さらにＫＣｌまたはＮａＣｌを添加することにより、Δ４分反射率の向上が認められた。よって、ストレプトコッカス・ミュータンスの菌液を用いた検討と同様に、吐出液を用いた検討においてもＫＣｌまたはＮａＣｌの有効性が示された。また、ＫＣｌまたはＮａＣｌの添加群では、１－メトキシＰＭＳの濃度が０．４ｍＭ～０．６ｍＭのいずれの場合においても同程度の高いΔ４分反射率を示すことが明らかとなった。このような高いΔ４分反射率により、例えば、吐出液中のう蝕原性菌数の大小を３段階に区分して判定することができる。
［実験例４］各種塩類の添加効果の検討
　本実験例では、洗口吐出液を被検試料として用いて、各種塩類の添加効果を検討した。
＜処方＞
　レサズリンナトリウム（東京化成製）４２ｍｇ、１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ６．０)１２０ｍＬ、スクロース（ナカライテスク製）１２ｇを蒸留水１１００ｍＬで溶解した基本組成に対し、表４に示す濃度となるように１－メトキシＰＭＳと各種塩類を添加し、試薬含浸液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜試験片作製＞
　上記試薬含浸液に濾紙を含浸したのち、５０℃で１５分間乾燥させ、試験紙を得た。作製した各試験紙を５ｍｍ×３００ｍｍ幅にカットし、これを１００ｍｍ×２８０ｍｍの粘着剤を貼付したＰＥＴフィルムに貼付した。この試験紙貼付ＰＥＴフィルムを５ｍｍ幅にカットし、１００ｍｍ×５ｍｍの試験片を得た。
＜測定方法＞
　１２名のボランティアの協力を得て、３ｍＬの精製水で１０秒間洗口し、容器に吐き出すことで得られた吐出液を被検試料とした。上記試験片の試薬部分に、各被検試料を１０μＬ滴下して、各試験紙の測定波長６３５ｎｍ／参照波長７６０ｎｍにおける１分後から５分後の反射率変化（Δ４分反射率）を、反射率測定機器を用いて測定した。
　結果を表５および図８に示す。基本組成に１－メトキシＰＭＳのみを添加した対照群と比較して、さらにＫＢｒまたはＮａＢｒを添加することにより、Δ４分反射率の向上が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　本発明により、酸化還元指示薬の色調変化を明瞭に測定することができる。よって、本発明により、室温下、短時間でう蝕原性菌数を測定することができる。よって、本発明によれば、歯科医院等の臨床現場において、恒温装置等の設備なしに多数の検体を短時間に処理することができ、簡便且つ迅速なう蝕原性菌数の測定が可能となる。測定結果は、例えば、被検者のう蝕リスクの判定に好適に用いることができる。よって、本発明は、う蝕の予防等に有用である。
１・・・試験片
１０・・・支持担体
１１・・・吸収性担体

Claims (12)

  1. 　酸化還元指示薬の色調変化を測定する方法であって、
    　検査試薬と被検試料とを反応させて色調の変化を測定することを含み、
    　前記検査試薬が、酸化還元指示薬、酸化還元反応促進剤、およびハロゲンの塩を含む、方法。
  2. 　被検試料中のう蝕原性菌数を測定する方法である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記酸化還元指示薬が、レサズリンである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記酸化還元反応促進剤が、１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェート、フェナジニウムメチルサルフェート、またはフェナジンエトサルフェートである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記ハロゲンの塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、または臭化カリウムである、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　支持担体と、該支持担体に担持される吸収性担体とを備える試験片であって、前記吸収性担体が前記検査試薬を保持する試験片を用いて測定が行われる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　酸化還元指示薬、酸化還元反応促進剤、およびハロゲンの塩を含む、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの測定試薬。
  8. 　前記酸化還元指示薬が、レサズリンである、請求項７に記載の試薬。
  9. 　前記酸化還元反応促進剤が、１－メトキシ－５－メチルフェナジニウムメチルサルフェート、フェナジニウムメチルサルフェート、またはフェナジンエトサルフェートである、請求項７または８に記載の試薬。
  10. 　前記ハロゲンの塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、または臭化カリウムである、請求項７～９のいずれか１項に記載の試薬。
  11. 　支持担体と、該支持担体に担持される吸収性担体とを備える、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの測定に用いるための試験片であって、
    　前記吸収性担体が請求項７～１０のいずれか１項に記載の試薬を保持する、試験片。
  12. 　う蝕原性菌数の測定に用いるための試験片である、請求項１１に記載の試験片。
PCT/JP2012/070903 2011-09-30 2012-08-17 酸化還元指示薬の色調変化を測定する方法 WO2013046995A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/348,199 US9598715B2 (en) 2011-09-30 2012-08-17 Method for measuring color change of oxidation-reduction indicator
EP12835784.5A EP2762883B1 (en) 2011-09-30 2012-08-17 Method for determining color change in oxidation-reduction indicator
JP2013536067A JP6104165B2 (ja) 2011-09-30 2012-08-17 酸化還元指示薬の色調変化を測定する方法
KR1020147008341A KR102020253B1 (ko) 2011-09-30 2012-08-17 산화 환원 지시약의 색조 변화를 측정하는 방법
CN201280047646.4A CN103842816B (zh) 2011-09-30 2012-08-17 测定氧化还原指示剂的色调变化的方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011217921 2011-09-30
JP2011-217921 2011-09-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013046995A1 true WO2013046995A1 (ja) 2013-04-04

Family

ID=47995046

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/070903 WO2013046995A1 (ja) 2011-09-30 2012-08-17 酸化還元指示薬の色調変化を測定する方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9598715B2 (ja)
EP (1) EP2762883B1 (ja)
JP (1) JP6104165B2 (ja)
KR (1) KR102020253B1 (ja)
CN (1) CN103842816B (ja)
WO (1) WO2013046995A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019004400A1 (ja) * 2017-06-30 2019-01-03 ライオン株式会社 齲蝕の有無又はその発症リスクの判定方法及びバイオマーカー

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150056606A1 (en) * 2013-08-20 2015-02-26 Linda Marie Petter Tissue tester
ITUA20162034A1 (it) * 2016-03-25 2017-09-25 Mbd Diagnostics Ltd Dispositivo e relativa composizione reagente per la diagnosi delle infezioni alle vie urinarie
EP3584577A4 (en) * 2017-02-14 2020-04-29 Fujifilm Corporation IMMUNOLOGICAL TEST DEVICE
JP7209701B2 (ja) * 2017-10-03 2023-01-20 アベイルズ メディカル，インコーポレイテッド レドックス反応に基づいて微生物の濃度及び抗感染剤に対する微生物の感受性を決定する装置、システム、及び方法
US20190300927A1 (en) * 2018-03-27 2019-10-03 SeLux Diagnostics, Inc. Metabolic assay for bacterial growth and gram typing
US11053531B2 (en) 2019-05-31 2021-07-06 Linda Marie Petter Tester paper and methods of use thereof for detecting a bacterial infection
US20220112536A1 (en) * 2020-10-08 2022-04-14 Trividia Health, Inc. Oxygen-insensitive electrochemical biosensor and methods of use thereof

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58225029A (ja) 1982-06-21 1983-12-27 Showa Yakuhin Kako Kk う蝕簡易判別用具
JPS62239999A (ja) 1986-04-11 1987-10-20 Arinobu Fujimura Ｎａｄ（ｐ）ｈの半定量法
JPH10210998A (ja) 1997-01-29 1998-08-11 Eiken Chem Co Ltd 細菌検査方法
JP2004093335A (ja) 2002-08-30 2004-03-25 Namitekku:Kk 口腔内感染診断用培地組成物および口腔内感染の診断方法
JP2004219309A (ja) * 2003-01-16 2004-08-05 Sapporo Imuno Diagnostic Laboratory:Kk 唾液糖測定方法および測定キット
JP2004233289A (ja) * 2003-01-31 2004-08-19 Asahi Kasei Corp Ｎａｄセンサ
JP2010256357A (ja) * 2009-04-24 2010-11-11 Lifescan Scotland Ltd 酵素試薬インクの製造方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3741876A (en) * 1970-08-06 1973-06-26 Mason Res Inst Inc Method of measuring enzyme reaction rates
FI91085C (fi) * 1991-01-24 1994-05-10 Orion Yhtymae Oy Menetelmä gram-negatiivisten bakteerien määrittämiseksi ja erottamiseksi
CN1046315C (zh) * 1991-10-11 1999-11-10 应浙鸿 一种多剂型厌氧指示剂
US5354658A (en) * 1993-01-28 1994-10-11 Dennis Wright Non-radioactive method for detecting a labelled segment and a solution or composition therefor
US6204040B1 (en) * 1999-04-22 2001-03-20 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Gluconobacter suboxydans sorbitol dehydrogenase, genes and methods of use thereof
EP2200562B1 (en) * 2007-10-26 2014-04-23 3M Innovative Properties Company Dental composition for detecting bacteria, kit of parts and use thereof
US7678250B2 (en) * 2008-01-22 2010-03-16 Home Diagnostics, Inc. Reagent compositions for use in electrochemical detection
JP5981350B2 (ja) * 2010-12-28 2016-08-31 ライオン株式会社 口腔状態の判定方法、並びにそのために用いられる分析用具、装置、及びプログラム

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58225029A (ja) 1982-06-21 1983-12-27 Showa Yakuhin Kako Kk う蝕簡易判別用具
JPS62239999A (ja) 1986-04-11 1987-10-20 Arinobu Fujimura Ｎａｄ（ｐ）ｈの半定量法
JPH10210998A (ja) 1997-01-29 1998-08-11 Eiken Chem Co Ltd 細菌検査方法
JP2004093335A (ja) 2002-08-30 2004-03-25 Namitekku:Kk 口腔内感染診断用培地組成物および口腔内感染の診断方法
JP2004219309A (ja) * 2003-01-16 2004-08-05 Sapporo Imuno Diagnostic Laboratory:Kk 唾液糖測定方法および測定キット
JP2004233289A (ja) * 2003-01-31 2004-08-19 Asahi Kasei Corp Ｎａｄセンサ
JP2010256357A (ja) * 2009-04-24 2010-11-11 Lifescan Scotland Ltd 酵素試薬インクの製造方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP2762883A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019004400A1 (ja) * 2017-06-30 2019-01-03 ライオン株式会社 齲蝕の有無又はその発症リスクの判定方法及びバイオマーカー

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140067077A (ko) 2014-06-03
US9598715B2 (en) 2017-03-21
JP6104165B2 (ja) 2017-03-29
US20140322749A1 (en) 2014-10-30
EP2762883A1 (en) 2014-08-06
EP2762883B1 (en) 2019-04-17
JPWO2013046995A1 (ja) 2015-03-26
EP2762883A4 (en) 2015-04-15
CN103842816B (zh) 2016-06-29
KR102020253B1 (ko) 2019-09-10
CN103842816A (zh) 2014-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6104165B2 (ja) 酸化還元指示薬の色調変化を測定する方法
JP5981350B2 (ja) 口腔状態の判定方法、並びにそのために用いられる分析用具、装置、及びプログラム
JP4515786B2 (ja) 全血中の分析対象物の計測に対するヘマトクリットの影響を減らす方法ならびに当該方法で有用な試験キット及び試験用品
CN1207393C (zh) 用于分析物测定的试剂测试条带
JP6518289B2 (ja) 分析物濃度を決定するための方法
CN105021596B (zh) 基于浓度梯度的多层膜干化学检测试条
US20090075389A1 (en) Method for determining an analyte in a fluid
JP2003114214A (ja) 分析物濃度決定において使用するための方法および装置
JPH0611447A (ja) 分析物の分光光度定量分析のための改良酸化カツプリング染料
HU176045B (en) Diagnostical composition for determining uric acid
CN104937106A (zh) 用于监测生物流体的系统和方法
JPS63289440A (ja) 成分の定量方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12835784

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2013536067

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20147008341

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012835784

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14348199

Country of ref document: US