WO2013021950A1

WO2013021950A1 - 新規ｆｇｆｒ４変異体の検出法

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Publication number: WO2013021950A1
Application number: PCT/JP2012/069869
Authority: WO
Inventors: 崇史二見; 竜也川瀬; 信昭新堂; 留美竹下
Original assignee: アステラス製薬株式会社
Priority date: 2011-08-05
Filing date: 2012-08-03
Publication date: 2013-02-14
Also published as: US9267176B2; EP2740803A1; US20140220035A1; JPWO2013021950A1; EP2740803A4; JP6036693B2

Abstract

癌の原因である新たな遺伝子変異を解明し、これにより、当該遺伝子変異又は当該変異を有するタンパク質の検出方法、被験者における癌の存在を検出する方法、被験者における癌を診断する方法、並びにそのためのプライマーセット、プローブ及び検出用キットを提供することを課題とする。被験者における線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）変異体の検出方法であって、被験者から得た試料中の、ＦＧＦＲ４チロシンキナーゼドメインの１８３番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法を提供する。

Description

新規ＦＧＦＲ４変異体の検出法

　本発明は、ＦＧＦＲ４の新規変異体の検出方法、及び該変異体の存在を指標とする癌の検出方法に関する。

　線維芽細胞増殖因子受容体（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＦＧＦＲ）は受容体チロシンキナーゼの１種であり、ＦＧＦＲのリガンドしては、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が知られている。ＦＧＦＲファミリーには、４つの受容体型ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ４の存在が知られている。これらの受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質内ドメインを有する膜貫通タンパク質から構成される。細胞外ドメインは２つ又は３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含む。ＦＧＦＲは、ＦＧＦＲ二量体、ＦＧＦ、及びヘパリングリカン又はプロテオグリカンの複合体において細胞表面で起こる二量体化によって活性化される、単量体チロシンキナーゼ受容体である。ＦＧＦについては、２２種の既知のＦＧＦが存在し、それぞれが１つ又は複数のＦＧＦＲと結合する能力を有する。ＦＧＦがＦＧＦＲに結合することで受容体チロシンキナーゼが活性化され、下流にシグナル伝達が行われる。ＦＧＦＲの発現部位や時期の差異によって、細胞遊走や細胞増殖などの複雑な生体機能を制御している。

　ＦＧＦＲファミリーのうち、ヒトのＦＧＦＲ４遺伝子については現在までに３つのスプライシングバリアント（ＦＧＦＲ４遺伝子バリアント１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００２０１１．３）、バリアント２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０２２９６３．２）、バリアント３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿２１３６４７．１））の存在が知られている。このうち、バリアント１及びバリアント３はＦＧＦＲ４のアイソフォーム１をコードし、バリアント２はＦＧＦＲ４のアイソフォーム２をコードする。ＦＧＦＲ４アイソフォーム１は全長８０２アミノ酸、アイソフォーム２は全長７６２アミノ酸からなり、アイソフォーム１とアイソフォーム２はその膜貫通ドメイン内の領域において異なるものの、細胞外ドメイン及び細胞膜内ドメインにおいて同一のアミノ酸配列を有する。

　ＦＧＦＲのチロシンキナーゼドメインは細胞膜内ドメインに存在し、種々の癌においてＦＧＦＲのチロシンキナーゼドメインにおける点変異が癌の活性化に関与していることが確認されている。このうち、ＦＧＦＲ４については、横紋筋腫において、アイソフォーム１における５３５番目に対応する位置でのアミノ酸変異（Ｎ５３５Ｋ、Ｎ５３５Ｄ）が見いだされており、これら点突然変異の導入が、ＦＧＦＲ４の恒常的な活性化を引き起こし、細胞内シグナルが異常に活性化され、癌化及び細胞増殖を引き起こしていることが報告されている（非特許文献１）。

　しかし、前記Ｎ５３５Ｋ及びＮ５３５Ｄ変異以外で、ＦＧＦＲ４のチロシンキナーゼドメイン内に活性化点変異が存在しているとの報告は無い。

ザ　ジャーナル　オブ　クリニカル　インベスティゲーション（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ），（英国），２００９年，１１巻，p．３３９５－３４０７

　癌の原因である新たな遺伝子変異を解明し、これにより、当該遺伝子変異又は当該変異を有するタンパク質の検出方法、被験者における癌の存在を検出する方法、被験者における癌を診断する方法、当該変異陽性の癌患者を同定する方法、並びにそのためのプライマーセット、プローブ及び検出用キットを提供することを課題とする。

　本発明は、チロシンキナーゼドメイン内に変異を有するＦＧＦＲ４が、胃癌患者から得た検体に存在すること（実施例１～２）、このＦＧＦＲ４遺伝子における変異が活性化変異であること（実施例５）、この変異ＦＧＦＲ４遺伝子の感染細胞が腫瘍形成能を有し、該遺伝子が癌の原因遺伝子であることを見出した（実施例７）。本発明者は、これらの知見から、この変異ＦＧＦＲ４遺伝子の癌の検出法を構築し、そのためのプライマーセット、プローブ及び検出用キットを提供し、この変異ＦＧＦＲ４遺伝子を検出することにより、ＦＧＦＲ４阻害剤治療の対象となる癌患者を選別することを可能とした。

　すなわち、本発明は、以下の［１］～［１５］に関する。
［１］被験者における線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）変異体の検出方法であって、被験者から得た試料中の、ＦＧＦＲ４チロシンキナーゼドメインの１８３番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。
［２］前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４における変異である、［１］に記載の方法。
（１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１の６３６番目のグリシンからシステインへの変異；又は
（２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２の５９６番目のグリシンからシステインへの変異。
［３］前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４における変異である、［１］又は［２］に記載の方法。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の６３６番目のグリシンからシステインへの変異；又は
（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の５９６番目のグリシンからシステインへの変異。
［４］下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、［１］又は［２］に記載の方法。
（１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１９０６番目のグアニンからチミンへの変異；又は
（２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２遺伝子の１７８６番目のグアニンからチミンへの変異。
［５］下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１９０６番目のグアニンからチミンへの変異；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１７８６番目のグアニンからチミンへの変異。
［６］前記変異がＦＧＦＲ４アイソフォーム１の６３６番目のグリシンからシステインへの変異である、［２］に記載の方法。
［７］前記変異が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の６３６番目のグリシンからシステインへの変異である、［６］に記載の方法。
［８］ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１９０６番目のグアニンからチミンへの変異の存在を検出する工程を包含する、［６］に記載の方法。
［９］配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１９０６番目のグアニンからチミンへの変異の存在を検出する工程を包含する、［６］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における領域を増幅できるように設計したプライマーセットを用いて、前記被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子における１９０６番目の塩基を含む領域；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子における１７８６番目の塩基を含む領域。
［１１］前記プライマーセットが、以下の（１）及び（２）からなる群より選択される、［１０］に記載の方法。
（１）配列番号１の塩基番号１から１９０５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１９０７から２４０９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；並びに
（２）配列番号３の塩基番号１から１７８５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１７８７から２２８９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
［１２］下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計したプローブを、前記被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１９０６番目のグアニンからチミンへの変異；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１７８６番目のグアニンからチミンへの変異。
［１３］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［１］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］前記被験者が癌患者である、［１］～［１３］のいずれかに記載の方法。
［１５］前記癌が胃癌である、［１４］に記載の方法。

　また、本発明は、以下の［１６］～［１８］に関する。
［１６］被験者における癌の存在を検出する方法であって、前記［１］～［１２］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［１７］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［１６］に記載の方法。
［１８］前記癌が胃癌である、［１６］又は［１７］に記載の方法。

　また、本発明は、以下の［１９］～［２３］に関する。
［１９］被験者における癌を診断する方法であって、前記［１］～［１２］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［２０］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［１９］に記載の方法。
［２１］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［１９］又は［２０］に記載の方法。
［２２］前記癌が胃癌である、［１９］又は［２０］に記載の方法。
［２３］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が胃癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［２２］に記載の方法。

　また、本発明は、以下の［２４］～［２７］に関する。
［２４］ＦＧＦＲ４阻害剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法であって、該被験者は癌患者であり、前記［１］～［１２］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［２５］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［２４］に記載の方法。
［２６］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者がＦＧＦＲ４阻害剤による治療の適応対象であると判定する工程をさらに包含する、［２４］又は［２５］に記載の方法。
［２７］前記癌が胃癌である、［２４］～［２６］のいずれかに記載の方法。

　また、本発明は、以下の［２８］～［３１］に関する。
［２８］被験者から得た試料中のＦＧＦＲ４チロシンキナーゼドメインの１８３番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出するためのプライマーセットであって、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における領域を増幅できるように設計した、プライマーセット。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子における１９０６番目の塩基を含む領域；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子における１７８６番目の塩基を含む領域。
［２９］以下の（１）及び（２）からなる群より選択される、［２８］に記載のプライマーセット。
（１）配列番号１の塩基番号１から１９０５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１９０７から２４０９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；並びに
（２）配列番号３の塩基番号１から１７８５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１７８７から２２８９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
［３０］前記被験者が癌患者である、［２８］又は［２９］に記載のプライマーセット。
［３１］前記癌が胃癌である、［３０］に記載のプライマーセット。

　また、本発明は、以下の［３２］～［３４］に関する。
［３２］被験者から得た試料中のＦＧＦＲ４チロシンキナーゼドメインの１８３番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出するためのプローブであって、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計した、プローブ。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１９０６番目のグアニンからチミンへの変異；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１７８６番目のグアニンからチミンへの変異。
［３３］前記被験者が癌患者である、［３２］に記載のプローブ。
［３４］前記癌が胃癌である、［３３］に記載のプローブ。

　また、本発明は、以下の［３５］～［３７］に関する。
［３５］被験者から得た試料中のＦＧＦＲ４チロシンキナーゼドメインの１８３番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出するための検出用キットであって、前記［２８］又は［２９］に記載のプライマーセット或いは前記［３２］に記載のプローブの少なくとも１つを含む、検出用キット。
［３６］前記被験者が癌患者である、［３５］に記載の検出用キット。
［３７］前記癌が胃癌である、［３６］に記載の検出用キット。

　また、本発明は、以下の［３８］～［４５］に関する。
［３８］被験者における癌の存在を検出する方法であって、前記［２８］又は［２９］に記載のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、方法。
［３９］前記プライマーセットを用いて、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における領域を増幅させる工程を包含する、［３８］に記載の方法。
（１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１９０６番目の塩基を含む領域；又は
（２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２遺伝子の１７８６番目の塩基を含む領域。
［４０］前記プライマーセットを用いて、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における領域を増幅させる工程を包含する、［３８］又は［３９］に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１９０６番目の塩基を含む領域；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１７８６番目の塩基を含む領域。
［４１］被験者における癌の存在を検出する方法であって、前記［３２］に記載のプローブを、被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、方法。
［４２］前記プローブを、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異を含む領域にハイブリダイズさせる工程を包含する、［４１］に記載の方法。
（１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１９０６番目のグアニンからチミンへの変異；又は
（２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２遺伝子の１７８６番目のグアニンからチミンへの変異。
［４３］前記プローブを、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異を含む領域にハイブリダイズさせる工程を包含する、［４１］又は［４２］に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１９０６番目のグアニンからチミンへの変異；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１７８６番目のグアニンからチミンへの変異。
［４４］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［３８］～［４３］のいずれかに記載の方法。
［４５］前記癌が胃癌である、［３８］～［４４］のいずれかに記載の方法。

　また、本発明は、以下の［４６］～［５０］に関する。
［４６］被験者における癌を診断する方法であって、前記［３８］～［４３］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［４７］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［４６］に記載の方法。
［４８］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［４６］又は［４７］に記載の方法。
［４９］前記癌が胃癌である、［４６］又は［４７］に記載の方法。
［５０］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が胃癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［４９］に記載の方法。

　また、本発明は、以下の［５１］～［５４］に関する。
［５１］ＦＧＦＲ４阻害剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法であって、該被験者は癌患者であり、前記［３８］～［４３］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［５２］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［５１］に記載の方法。
［５３］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者がＦＧＦＲ４阻害剤による治療の適応対象であると判定する工程をさらに包含する、［５１］又は［５２］に記載の方法。
［５４］前記癌が胃癌である、［５１］～［５３］のいずれかに記載の方法。

　また、本発明は、以下の［５５］～［５６］に関する。
　［５５］ＦＧＦＲ４阻害剤を患者に投与する工程を包含する癌の治療方法であって、該患者が前記［２４］～［２６］及び［５１］～［５３］のいずれかに記載の方法によって同定された患者である、に記載の方法。
　［５６］前記癌が胃癌である、［５５］に記載の方法。

　また、本発明は、以下の［５７］～［５９］に関する。
［５７］ＦＧＦＲ４チロシンキナーゼドメインにおける１８３番目のグリシンからシステインへの変異を有する、ＦＧＦＲ４変異体ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［５８］試験物質が前記ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性又は発現を阻害するか否かを評価する工程を包含する、癌治療剤のスクリーニング方法。
［５９］前記癌が胃癌である、［５８］に記載の方法。

　本発明の検出方法は、ＦＧＦＲ４の新規変異体を検出する方法であり、癌患者（特に、胃癌患者）に対してＦＧＦＲ阻害剤の適用対象者であるか否かを鑑別することができる。また、本方法は、被験者における癌（特に、胃癌）を検出及び診断する方法として利用できる。また、本発明のプライマーセット、プローブ及び検出用キットは、本発明の方法に用いることができる。

《本発明の検出方法》
　本発明の検出方法は、被験者における線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）変異体の検出方法であって、被験者から得た試料中の、ＦＧＦＲ４チロシンキナーゼドメインの１８３番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出する工程を含む。

　被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された細胞組織、体液（血液、口腔粘液、循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ）、エキソソーム等）、生検された試料等を用いるが、好適には生検された試料を用いる。採取した試料からゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡを抽出して用いることができ、またその転写産物（ゲノムが転写及び翻訳される結果生じる産物；例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、蛋白質）を用いることができる。特には、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製して用いることが好ましい。

　現在まで、ＦＧＦＲ４には２つのアイソフォーム、アイソフォーム１及び２が存在することが知られている。ＦＧＦＲ４アイソフォーム１は全長８０２アミノ酸からなるＦＧＦＲ４であり、例えば、野生型のＦＧＦＲ４アイソフォーム１は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされる。ＦＧＦＲ４アイソフォーム２は全長７６２アミノ酸からなるＦＧＦＲ４であり、例えば、野生型のＦＧＦＲ４アイソフォーム２は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされる。ＦＧＦＲ４のアイソフォーム１及び２は、その細胞膜内領域において共通のチロシンキナーゼドメインを有する。本明細書中で使用される場合、ＦＧＦＲ４のチロシンキナーゼドメインとは、ＦＧＦＲ４アイソフォーム１のアミノ酸第４５４～７６４位、アイソフォーム２のアミノ酸第４１４～７２４位にそれぞれ対応する、３１１アミノ酸からなる領域を意味する。野生型のＦＧＦＲ４アイソフォーム１及び２のチロシンキナーゼドメインは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなり、配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされる。

　本発明の方法における検出対象となる変異（「検出対象変異」とも称する）は、ＦＧＦＲ４のチロシンキナーゼドメイン内の変異であり、具体的には、ＦＧＦＲ４のチロシンキナーゼドメインの１８３番目のグリシンからシステインへの変異である。本検出対象変異の代表的な例としては、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４チロシンキナーゼドメインの１８３番目のグリシンからシステインへの変異が挙げられる。本検出対象変異は、ＦＧＦＲ４遺伝子のチロシンキナーゼドメインコード領域における変異に起因し、従って、本発明の方法において遺伝子変異の存在を検出してもよい。このような遺伝子変異の代表的な例としては、配列番号９に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子のチロシンキナーゼドメインコード領域の５４７番目のグアニンからチミンへの変異が挙げられる。

　前述の検出対象変異は、ＦＧＦＲ４アイソフォーム１においては６３６番目のグリシンからシステインへの変異に対応し、ＦＧＦＲ４アイソフォーム２においては５９６番目のグリシンからシステインへの変異に対応する。また、これらの変異にそれぞれ対応するＦＧＦＲ４遺伝子における変異としては、ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１９０６番目のグアニンからチミンへの変異、ＦＧＦＲ４アイソフォーム２遺伝子の１７８６番目のグアニンからチミンへの変異が挙げられる。

　本発明の方法における検出対象変異のより具体的な例としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の６３６番目のグリシンからシステインへの変異、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の５９６番目のグリシンからシステインへの変異が挙げられる。また、これらに対応するＦＧＦＲ４遺伝子における変異の例としては、配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１９０６番目のグアニンからチミンへの変異、配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１７８６番目のグアニンからチミンへの変異が挙げられる。

　本発明の方法においては、検出対象変異を有するタンパク質（「変異型タンパク質」とも称する）又は検出対象変異を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド（「変異型ポリヌクレオチド」とも称する）のいずれを検出対象としてもよい。変異型タンパク質の例としては、配列番号６又は配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、変異型ポリヌクレオチドの例としては、配列番号５又は配列番号７に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。

　本発明の検出方法において変異型ポリヌクレオチドの存在を検出する場合、本検出工程は、被験者から得た試料のゲノムＤＮＡ中の変異型ポリヌクレオチドの存在を検出すること、あるいは、被験者から得た試料から抽出したゲノムＤＮＡの転写産物（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を調製し、変異型ポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの存在を検出することにより実施できる。ゲノムＤＮＡの抽出、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの調製は当該分野で公知の方法で行うことができ、市販のキットを用いて簡便に行うことができる。

　本検出工程は、当該分野で公知の遺伝子変異解析方法を使用することができる。例えば、本検出工程は、被験者から得た試料由来の核酸（例えば、ｍＲＮＡやｃＤＮＡ等）に対して公知の核酸増幅方法（ＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＬＣＲ法（Ｌｉｇａｓｅ　ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ法（Ｓｔｒａｎｄ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｎｄ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ法（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ’ｓ　ＴＭＡ　ｓｙｓｔｅｍ）等）を用いて、変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異に対応する部分を含む領域（「検出対象変異領域」とも称する）を増幅させる工程を含み、増幅後、この増幅産物について配列決定を行うことによって変異の有無を確認することができる。このような配列決定法としては、ダイレクトシーケンス法等の当該分野で公知の方法を使用することができる。

　前述の核酸増幅方法に用いられるプライマーは、変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異領域を増幅できるものであれば、特には限定されず、変異型ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計する。プライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ；ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等を利用してできる。また、増幅産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。

　核酸増幅方法を用いる別の公知の遺伝子変異解析方法として、ＲＦＬＰ法（制限酵素断片長多型解析法）、ＴａｑＭａｎ法、アレル特異的プライマーＰＣＲ（ＡＳＰ－ＰＣＲ）法、ＳＳＣＰ法等のＰＣＲに基づく方法も使用可能である。ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲにより検出対象変異領域を増幅した後、変異に基づき制限酵素認識部位に変化が生じる場合に、その制限酵素処理後の核酸断片の差異を電気泳動により解析する。ＴａｑＭａｎ法は、５’末端に蛍光物質（ＦＡＭ、ＶＩＣ等）、３’末端にクエンチャー（消光）物質で修飾したプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲ反応系に添加する方法である。本方法では、検出対象変異領域に対してＴａｑＭａｎプローブをハイブリダイズさせ、プライマーからのＰＣＲ反応を行うと、伸長反応におけるＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりＴａｑＭａｎプローブが分解され、それにより蛍光物質がプローブより遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光物質から蛍光が発し、これにより目的の変異が検出される。ＡＳＰ－ＰＣＲ法は、３’末端に検出対象変異部位を有するようにプライマーを設計し、ＰＣＲによる核酸増幅の有無を検出する方法である。ＳＳＣＰ法では、検出対象変異領域をＰＣＲ増幅した後、一本鎖ＤＮＡに分離し、これを非変性ゲルでの電気泳動により分離する。変異によりＤＮＡの高次構造が変化し、これがゲル上の移動度の差異を反映する。

　また別の公知の遺伝子変異解析方法として、プローブハイブリダイゼーションに基づく方法も使用可能であり、例えば、ＤＮＡチップ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、融解曲線解析法等が挙げられる。ＤＮＡチップ法では、検出対象変異領域を含むＤＮＡを基板上に配置し、被験者由来の核酸をＤＮＡチップにハイブリダイズさせ、ハイブリダイズの有無を確認する。Ｉｎｖａｄｅｒ法では、検出対象変異部位の前後にハイブリダイズする２種の核酸（Ｉｎｖａｄｅｒオリゴ及びシグナルプローブ）を被験者由来の核酸に反応させた後、形成されるＤＮＡの三重鎖構造を認識するＣｌｅｖａｓｅ酵素を作用させ、シグナルプローブ中のＦｌａｐを遊離させる。次いで、Ｆｌａｐが検出用ＦＲＥＴ　Ｐｒｏｂｅとハイブリダイズし、これに同酵素が再度作用し、ＦＲＥＴ　Ｐｒｏｂｅから遊離された蛍光物質の蛍光を検出する。融解曲線解析法は、検出対象変異領域に蛍光標識プローブをハイブリダイズさせた後、徐々に温度を上昇させ、温度上昇に伴う蛍光の変化を測定して融解曲線を作成する。これにより、変異の有無に伴う融解温度の変化を確認する。

　また別の公知の遺伝子変異解析方法として、プライマーエクステンションに基づく方法も使用可能であり、例えば、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法が挙げられる。ＳＮａＰｓｈｏｔ法では、検出対象変異部位に隣接するプライマーと蛍光標識したｄｄＮＴＰを用い、プライマーから一塩基のみを伸長させて取り込まれた塩基を検出する。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法では、プライマー伸長反応において、１種類ずつｄＮＴＰを添加し、ポリメラーゼの反応によりｄＮＴＰが取り込まれるとピロリン酸が生じる。生じたピロリン酸をルシフェラーゼによる蛍光反応で検出し、発光ピークパターンから塩基配列を決定する。

　当業者であれば、使用する遺伝子変異解析方法に基づいて、使用されるプライマー及びプローブを適宜設計することができ、特に限定されることはないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。

　本発明の検出方法においては、被験者から得た試料中の変異型タンパク質の存在を検出してもよく、例えば、変異型タンパク質を特異的に認識する抗体を用いて実施できる。このような抗体の作製及び抗体を用いたタンパク質の検出は、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる。

　本発明の方法において、検出対象変異が被験者から得た試料から検出された場合、当該被験者が癌（特には胃癌）に罹患している可能性が高いと判定できる

　また、本発明の方法における検出工程は、被験者における癌（特には胃癌）の存在の検出方法、又は被験者における癌の診断方法に使用することができる。本発明の診断方法は、本発明の検出工程に加えて、当該変異が被験者から得た試料から検出された場合に、被験者が癌（特には胃癌）に罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでもよい。また、当該検出工程は、ＦＧＦＲ４阻害剤による治療の適応対象となる被験者（胃癌などの癌患者）を同定する方法にも使用することができる。本発明の同定方法は、当該検出工程に加えて、当該変異が被験者から得た試料から検出された場合に、被験者がＦＧＦＲ４阻害剤による治療の適応対象であると判定する工程を含んでもよい。

《本発明のプライマーセット、プローブ、検出用キット》
　本発明のプライマーセットは、被験者から得た試料中のＦＧＦＲ４チロシンキナーゼドメインの１８３番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出するためのプライマーセットであって、本発明の検出工程における変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異領域を増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む。アンチセンスプライマーは、変異型ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなり、センスプライマーは、変異型ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなる。

　好ましくは、本発明のプライマーセットは、配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子における１９０６番目の塩基を含む領域、又は配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子における１７８６番目の塩基を含む領域を増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む。

　本発明のプライマーセットの具体的な態様としては、以下（１）及び（２）からなる群より選択されるプライマーセットが挙げられる：
（１）配列番号１の塩基番号１から１９０５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１９０７から２４０９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；並びに
（２）配列番号３の塩基番号１から１７８５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１７８７から２２８９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。

　より好ましくは、本発明のプライマーセットは、配列番号９に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子のチロシンキナーゼドメインコード領域における５４７番目の塩基を含む領域を増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含み、具体的な態様としては、以下に示すプライマーセットが挙げられる：
配列番号９の塩基番号１から５４６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号９の塩基番号５４８から９３３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。

　本発明のプライマーセットは、本発明の方法において使用することができ、例えば、本発明の方法において、本発明のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を含んでもよい。

　本発明のプローブは、被験者から得た試料中のＦＧＦＲ４チロシンキナーゼドメインの１８３番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出するためのプローブであって、本発明の検出工程における変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異領域にハイブリダイズすることができるように設計したプローブである。本発明のプローブは、変異型ポリヌクレオチド又はその相補鎖中の検出対象変異領域にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなる。

　好ましくは、本発明のプローブは、配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１９０６番目のグアニンからチミンへの変異、又は配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１７８６番目のグアニンからチミンへの変異を含む領域にハイブリダイズするように設計される。

　本発明のプローブは、本発明の方法において使用することができ、例えば、本発明の方法において、被験者から得た試料中の核酸に本発明のプローブをハイブリダイズさせる工程を含んでもよい。

　前記「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。

　前記プライマーセットにおいては、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。また、本発明のプライマー及びプローブは、通常、１５～４０塩基、好ましくは１６～２４塩基、更に好ましくは１８～２４塩基、特に好ましくは２０～２４塩基の鎖長を有する。

　本発明のプライマーセット及びプローブは、例えば、化学合成法によって当業者に容易に製造することができ、また、検出方法に応じて、蛍光標識等で標識化してもよい。

　本発明の検出用キットは、被験者から得た試料中のＦＧＦＲ４チロシンキナーゼドメインの１８３番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出するためのキットであり、好ましくは、本発明のプライマーセット又は本発明のプローブの少なくとも１つを含む。本発明のプライマーセット、プローブ及び検出用キットは、前述の本発明の方法において使用することもできる。例えば、本発明の方法は、本発明のプライマーセットを用いて検出対象変異領域を増幅する工程を含んでもよく、本発明のプローブを検出対象変異領域にハイブリダイズさせる工程を含んでよい。

《本発明の治療方法》
　本発明の治療方法は、本発明のＦＧＦＲ４変異体の陽性の癌（特には胃癌）患者にＦＧＦＲ４阻害剤を投与する工程を包含する、癌の治療方法である。本発明の治療方法において、前述の方法を用いて、ＦＧＦＲ４阻害剤による治療の適応対象と同定された患者を治療することができる。ＦＧＦＲ４阻害剤としては、ＰＤ１７３０７４（例えば、Ｃｌｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．２００５　Ｆｅｂ　１；１１（３）：１３３６－４１）、抗ＦＧＦＲ４抗体（例えば、ＭＡｂｓ．　２０１１；３（４）：３７６－８６）など当業者に公知の種々のＦＧＦＲ４阻害剤が使用できる。

《本発明のスクリーニング方法》
　本発明者らによって同定されたＦＧＦＲ４変異体は、胃癌患者においてその存在が検出され、癌の原因遺伝子であることも確認された。従って、本発明のＦＧＦＲ４変異体の活性又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法は、本発明のＦＧＦＲ４変異体の陽性の癌（好ましくは胃癌）治療剤をスクリーニングする方法として利用できる。

　例えば、本発明のスクリーニング方法は、本発明のＦＧＦＲ４変異体に試験物質を接触させ、その活性が阻害されるか否かを分析するか、又は本発明のＦＧＦＲ４変異体を発現する細胞に試験物質を接触させ、その活性又は発現が阻害されるか否かを分析することによって実施することができる。本発明のＦＧＦＲ４変異体の活性（即ち自己リン酸化活性）が阻害されたか否かは、試験物質を接触させた本発明のＦＧＦＲ４変異体のチロシンリン酸化レベルの変化を分析することにより判定でき、これは、当該分野で公知のアッセイ方法を用いて実施可能である。また、本発明のＦＧＦＲ４変異体の発現が阻害されたか否かは、試験物質を接触させた本発明のＦＧＦＲ４変異体を発現する細胞におけるｍＲＮＡ又は蛋白質の発現を抑制するか否かにより分析することにより判定でき、これは、定量的ＰＣＲ法やＥＬＩＳＡ法などの当該分野で公知の方法を用いて実施可能である。あるいは、後述の実施例のように、本発明のＦＧＦＲ４変異体を発現する細胞をヌードマウスに接種し、該マウスに試験物質を投与した場合の、腫瘍増殖に対する阻害作用を確認してもよい。

　以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。

［実施例１］　胃癌臨床検体にけるＧ６３６Ｃ変異ＦＧＦＲ４（Ｇ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４）ポリヌクレオチドの発見
　胃癌患者組織由来ＲＮＡ（米国アステランド社）Ｓｔ０４１検体ＲＮＡに対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、ライフテクノロジーズ社）及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（オリゴ（ｄＴ）２０プライマー、ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。

　次に、配列番号１１および配列番号１２のプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｖｅｒ．２；東洋紡）を用いてＰＣＲ（９８℃３０秒、５２℃３０秒、６８℃３０秒を３５サイクル）を行った。その後、前述ＰＣＲ産物をカラム（ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；キアゲン社）を用いて精製した。その後、配列番号１３のプライマーを用いて、上記で得た精製ＰＣＲ産物を鋳型として、シークエンス反応を実施した（Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）。

　この結果、ＦＧＦＲ４アイソフォーム１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ_００２０１１．３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿２１３６４７．１）のコーディング領域（配列番号１）における１９０６番目、ＦＧＦＲ４アイソフォーム２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０２２９６３．２）のコーディング領域（配列番号３）における１７８６番目にそれぞれ対応する位置での、グアニン（Ｇ）からチミン（Ｔ）への置換が見いだされた。この変異は、アイソフォーム１のアミノ酸配列（配列番号２）における６３６番目、アイソフォーム２のアミノ酸配列（配列番号４）における５９６番目にそれぞれ対応するアミノ酸位置での、グリシン（Ｇ）からシステイン（Ｃ）への変異に相当する。この変異を有するＦＧＦＲ４変異体をＧ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４とも称する。

［実施例２］　胃癌サンプルにおけるＧ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４の検出
　胃癌患者組織由来ＲＮＡ（米国アステランド社）８３サンプルに対して、実施例１と同じ方法を用いて、Ｇ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４変異の有無を確認した。

　その結果、サンプルＳｔ０４１で、前述のＧ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４変異が検出された。このことから、上記方法により、胃癌臨床検体由来の試料中のＧ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４の存在を検出することができ、Ｇ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４の陽性患者を選択できることが示された。

［実施例３］　野生型及び変異体ＦＧＦＲ４のクローニング
　Ｇ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４のＯＲＦ全長をタンパク質として発現するため、まず野生型ＦＧＦＲ４（アイソフォーム１）をクローニングした。配列番号１４（制限酵素サイトとして、ＳｐｅＩを含む）及び配列番号１５（制限酵素サイトとして、ＸｈｏＩを含む）のプライマーにて、全長ＦＧＦＲ４（Ｕｌｔｉｍａｔｅ^TM　ＯＲＦＣａｒｄ　ｆｏｒ　Ｃｌｏｎｅ　ＩＤ　ＩＯＨ１３３７１：ライフテクノロジーズ社）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分を３０サイクル）を行った。本ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ＴＯＰＯ　ＸＬ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）にクローニングした（ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ　ＸＬ）。

　次に、ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ　ＸＬを鋳型に、配列番号１６及び配列番号１７のプライマーを用いてＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ；タカラバイオ株式会社）にて、Ｇ６３６Ｃ変異を導入した（Ｇ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ　ＸＬ）。作製したＧ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４の塩基配列及びアミノ酸配列を、配列番号５及び配列番号６にそれぞれ示す。

［実施例４］　野生型及び変異体ＦＧＦＲ４の発現ベクターの作製
　ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ　ＸＬ及びＧ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ　ＸＬを鋳型として、配列番号１８および配列番号１９のプライマーにて、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分を３０サイクル）を行った。増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動した後、ゲルから切り出し、カラム精製を行った。これらＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＶにて切断したｐＴｒａｃｅｒ^TM－ＣＭＶ　Ｂｓｄ（ライフテクノロジーズ社）に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングシステム（Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ　ｗ／Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ；タカラバイオ株式会社）にてクローニングした。これら野生型及び変異体ＦＧＦＲ４について作製したベクターを、ＦＧＦＲ４／ｐＴｒａｃｅｒ－ＣＭＶ－Ｂｓｄ及びＧ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４／ｐＴｒａｃｅｒ－ＣＭＶ－Ｂｓｄと称する。

［実施例５］　Ｇ６３６Ｃ変異が活性化変異であることの確認
　ＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレートに２×１０⁵個播種した後、トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００；ライフテクノロジーズ社）を用いてＦＧＦＲ４／ｐＴｒａｃｅｒ－ＣＭＶ－Ｂｓｄ又はＧ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４／ｐＴｒａｃｅｒ－ＣＭＶ－Ｂｓｄをそれぞれ４００ｎｇ遺伝子導入した。翌日、細胞をＳＤＳサンプルバッファーにて溶解し、ウエスタンブロッティングを行った。抗リン酸化ＦＧＦＲ４抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）にて検出した結果、ＦＧＦＲ４／ｐＴｒａｃｅｒ－ＣＭＶ－Ｂｓｄに比べ、Ｇ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４／ｐＴｒａｃｅｒ－ＣＭＶ－Ｂｓｄを導入したＨＥＫ２９３細胞のＦＧＦＲ４の自己リン酸化の亢進及びＥＲＫのリン酸化亢進が認められた。以上より、Ｇ６３６Ｃが活性化変異であることが示された。

［実施例６］　野生型及び変異体ＦＧＦＲ４のレンチウイルス発現ベクターの作製
　ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ　ＸＬをＳｐｅＩ、ＸｈｏＩで消化し、核酸断片をＳｐｅＩ、ＳａｌＩ消化したレンチウイルス発現ベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＴＯＰＯ；ライフテクノロジーズ社）のマルチクローニングサイトに存在するＳｐｅＩ－ＳａｌＩサイトにクローニングした（ＦＧＦＲ４／ｐＬｅｎｔｉ６．３と命名）。同様の手法にて、Ｇ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ　ＸＬから、レンチウイルス発現ベクターＧ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４／ｐＬｅｎｔｉ６．３を構築した。

　上記、ＦＧＦＲ４／ｐＬｅｎｔｉ６．３又はＧ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４／ｐＬｅｎｔｉ６．３をそれぞれ３μｇ、パッケージング用プラスミド９μｇ（ＶｉｒａＰｏｗｅｒ^TM　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｍｉｘ；ライフテクノロジーズ社）と共に、トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００；ライフテクノロジーズ社）を用いて、２９３ＦＴ細胞パッケージング細胞（ライフテクノロジーズ社）に導入した。導入３日後の培養上清を、レンチウイルスとして回収し、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Ｓｉｇｍａ社）を６μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞に添加した。２日後にＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養上清をＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社）に１０％牛血清（インビトロジェン社）及びＢｌａｓｔｃｉｄｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）５μｇ／ｍｌを添加したものに交換し、さらに２週間培養を続け、野生型ＦＧＦＲ４及びＧ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４をそれぞれ安定発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞を２株ずつ（それぞれ、ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３－ｅ７及びＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３－ｆ７、並びにＧ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３－ｃ１及びＧ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３－ｃ２と命名）を取得した。

［実施例７］　Ｇ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４の腫瘍形成能の検討
　ｉｎ　ｖｉｖｏにおける造腫瘍能を検討するため本細胞株をヌードマウスに移植し腫瘍形成能を検討した。ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３－ｅ７、ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３－ｆ７、Ｇ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３－ｃ１、及びＧ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３－ｃ２の各細胞をヌードマウスの皮下に３×１０⁶個ずつ接種し２２日間観察した。その結果、ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３－ｅ７又はＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３－ｆ７を移植したマウスでは腫瘍形成が確認されなかった。一方、Ｇ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３－ｃ１又はＧ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３－ｃ２を移植したマウスにおいては、いずれも腫瘍形成が確認された。以上から、Ｇ６３６Ｃ－ＦＧＦＲ４は癌の原因遺伝子であることが示された。

　本発明の検出方法は、ＦＧＦＲ４の新規変異体を検出する方法であり、癌患者（特に、胃癌患者）に対してＦＧＦＲ阻害剤の適用対象者であるか否かを鑑別するのに有用である。また、本方法は、被験者における癌（特に、胃癌）を検出及び診断する方法としても有用である。また、本発明のプライマーセット、プローブ及び検出用キットは、本発明の方法に用いることができる。

Claims

　被験者における線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）変異体の検出方法であって、被験者から得た試料中の、ＦＧＦＲ４チロシンキナーゼドメインの１８３番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。
　前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４における変異である、請求項１に記載の方法。
（１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１の６３６番目のグリシンからシステインへの変異；又は
（２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２の５９６番目のグリシンからシステインへの変異。
　前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４における変異である、請求項１に記載の方法。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の６３６番目のグリシンからシステインへの変異；又は
（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の５９６番目のグリシンからシステインへの変異。
　下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
（１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１９０６番目のグアニンからチミンへの変異；又は
（２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２遺伝子の１７８６番目のグアニンからチミンへの変異。
　下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１９０６番目のグアニンからチミンへの変異；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１７８６番目のグアニンからチミンへの変異。
　下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における領域を増幅できるように設計したプライマーセットを用いて、前記被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、請求項１に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子における１９０６番目の塩基を含む領域；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子における１７８６番目の塩基を含む領域。
　下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計したプローブを、前記被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項１に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１９０６番目のグアニンからチミンへの変異；又は
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１７８６番目のグアニンからチミンへの変異。
　前記被験者から試料を得る工程を包含する、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
　前記被験者が癌患者である、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
　前記癌が胃癌である、請求項９に記載の方法。
　被験者における癌の存在を検出する方法であって、請求項１～７のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
　被験者における癌を診断する方法であって、請求項１～７のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
　ＦＧＦＲ４阻害剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法であって、該被験者は癌患者であり、請求項１～７のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
　ＦＧＦＲ４阻害剤を患者に投与する工程を包含する癌の治療方法であって、該患者が請求項１３に記載の方法によって同定された患者である、方法。