JP6036693B2 - 新規fgfr4変異体の検出法 - Google Patents
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Description
[1]被験者における線維芽細胞増殖因子受容体4(FGFR4)変異体の検出方法であって、被験者から得た試料中の、FGFR4チロシンキナーゼドメインの183番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。
[2]前記変異が下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4における変異である、[1]に記載の方法。
(1)FGFR4アイソフォーム1の636番目のグリシンからシステインへの変異;又は
(2)FGFR4アイソフォーム2の596番目のグリシンからシステインへの変異。
[3]前記変異が下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4における変異である、[1]又は[2]に記載の方法。
(1)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるFGFR4の636番目のグリシンからシステインへの変異;又は
(2)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるFGFR4の596番目のグリシンからシステインへの変異。
[4]下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、[1]又は[2]に記載の方法。
(1)FGFR4アイソフォーム1遺伝子の1906番目のグアニンからチミンへの変異;又は
(2)FGFR4アイソフォーム2遺伝子の1786番目のグアニンからチミンへの変異。
[5]下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
(1)配列番号1に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子の1906番目のグアニンからチミンへの変異;又は
(2)配列番号3に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子の1786番目のグアニンからチミンへの変異。
[6]前記変異がFGFR4アイソフォーム1の636番目のグリシンからシステインへの変異である、[2]に記載の方法。
[7]前記変異が配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるFGFR4の636番目のグリシンからシステインへの変異である、[6]に記載の方法。
[8]FGFR4アイソフォーム1遺伝子の1906番目のグアニンからチミンへの変異の存在を検出する工程を包含する、[6]に記載の方法。
[9]配列番号1に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子の1906番目のグアニンからチミンへの変異の存在を検出する工程を包含する、[6]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10]下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4遺伝子における領域を増幅できるように設計したプライマーセットを用いて、前記被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
(1)配列番号1に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子における1906番目の塩基を含む領域;又は
(2)配列番号3に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子における1786番目の塩基を含む領域。
[11]前記プライマーセットが、以下の(1)及び(2)からなる群より選択される、[10]に記載の方法。
(1)配列番号1の塩基番号1から1905間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号1907から2409間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット;並びに
(2)配列番号3の塩基番号1から1785間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号3の塩基番号1787から2289間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
[12]下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計したプローブを、前記被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
(1)配列番号1に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子の1906番目のグアニンからチミンへの変異;又は
(2)配列番号3に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子の1786番目のグアニンからチミンへの変異。
[13]前記被験者から試料を得る工程を包含する、[1]〜[12]のいずれかに記載の方法。
[14]前記被験者が癌患者である、[1]〜[13]のいずれかに記載の方法。
[15]前記癌が胃癌である、[14]に記載の方法。
[16]被験者における癌の存在を検出する方法であって、前記[1]〜[12]のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
[17]前記被験者から試料を得る工程を包含する、[16]に記載の方法。
[18]前記癌が胃癌である、[16]又は[17]に記載の方法。
[19]被験者における癌を診断する方法であって、前記[1]〜[12]のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
[20]前記被験者から試料を得る工程を包含する、[19]に記載の方法。
[21]前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、[19]又は[20]に記載の方法。
[22]前記癌が胃癌である、[19]又は[20]に記載の方法。
[23]前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が胃癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、[22]に記載の方法。
[24]FGFR4阻害剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法であって、該被験者は癌患者であり、前記[1]〜[12]のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
[25]前記被験者から試料を得る工程を包含する、[24]に記載の方法。
[26]前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者がFGFR4阻害剤による治療の適応対象であると判定する工程をさらに包含する、[24]又は[25]に記載の方法。
[27]前記癌が胃癌である、[24]〜[26]のいずれかに記載の方法。
[28]被験者から得た試料中のFGFR4チロシンキナーゼドメインの183番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出するためのプライマーセットであって、下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4遺伝子における領域を増幅できるように設計した、プライマーセット。
(1)配列番号1に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子における1906番目の塩基を含む領域;又は
(2)配列番号3に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子における1786番目の塩基を含む領域。
[29]以下の(1)及び(2)からなる群より選択される、[28]に記載のプライマーセット。
(1)配列番号1の塩基番号1から1905間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号1907から2409間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット;並びに
(2)配列番号3の塩基番号1から1785間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号3の塩基番号1787から2289間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
[30]前記被験者が癌患者である、[28]又は[29]に記載のプライマーセット。
[31]前記癌が胃癌である、[30]に記載のプライマーセット。
[32]被験者から得た試料中のFGFR4チロシンキナーゼドメインの183番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出するためのプローブであって、下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計した、プローブ。
(1)配列番号1に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子の1906番目のグアニンからチミンへの変異;又は
(2)配列番号3に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子の1786番目のグアニンからチミンへの変異。
[33]前記被験者が癌患者である、[32]に記載のプローブ。
[34]前記癌が胃癌である、[33]に記載のプローブ。
[35]被験者から得た試料中のFGFR4チロシンキナーゼドメインの183番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出するための検出用キットであって、前記[28]又は[29]に記載のプライマーセット或いは前記[32]に記載のプローブの少なくとも1つを含む、検出用キット。
[36]前記被験者が癌患者である、[35]に記載の検出用キット。
[37]前記癌が胃癌である、[36]に記載の検出用キット。
[38]被験者における癌の存在を検出する方法であって、前記[28]又は[29]に記載のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、方法。
[39]前記プライマーセットを用いて、下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4遺伝子における領域を増幅させる工程を包含する、[38]に記載の方法。
(1)FGFR4アイソフォーム1遺伝子の1906番目の塩基を含む領域;又は
(2)FGFR4アイソフォーム2遺伝子の1786番目の塩基を含む領域。
[40]前記プライマーセットを用いて、下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4遺伝子における領域を増幅させる工程を包含する、[38]又は[39]に記載の方法。
(1)配列番号1に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子の1906番目の塩基を含む領域;又は
(2)配列番号3に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子の1786番目の塩基を含む領域。
[41]被験者における癌の存在を検出する方法であって、前記[32]に記載のプローブを、被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、方法。
[42]前記プローブを、下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4遺伝子における変異を含む領域にハイブリダイズさせる工程を包含する、[41]に記載の方法。
(1)FGFR4アイソフォーム1遺伝子の1906番目のグアニンからチミンへの変異;又は
(2)FGFR4アイソフォーム2遺伝子の1786番目のグアニンからチミンへの変異。
[43]前記プローブを、下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4遺伝子における変異を含む領域にハイブリダイズさせる工程を包含する、[41]又は[42]に記載の方法。
(1)配列番号1に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子の1906番目のグアニンからチミンへの変異;又は
(2)配列番号3に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子の1786番目のグアニンからチミンへの変異。
[44]前記被験者から試料を得る工程を包含する、[38]〜[43]のいずれかに記載の方法。
[45]前記癌が胃癌である、[38]〜[44]のいずれかに記載の方法。
[46]被験者における癌を診断する方法であって、前記[38]〜[43]のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
[47]前記被験者から試料を得る工程を包含する、[46]に記載の方法。
[48]前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、[46]又は[47]に記載の方法。
[49]前記癌が胃癌である、[46]又は[47]に記載の方法。
[50]前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が胃癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、[49]に記載の方法。
[51]FGFR4阻害剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法であって、該被験者は癌患者であり、前記[38]〜[43]のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
[52]前記被験者から試料を得る工程を包含する、[51]に記載の方法。
[53]前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者がFGFR4阻害剤による治療の適応対象であると判定する工程をさらに包含する、[51]又は[52]に記載の方法。
[54]前記癌が胃癌である、[51]〜[53]のいずれかに記載の方法。
[55]FGFR4阻害剤を患者に投与する工程を包含する癌の治療方法であって、該患者が前記[24]〜[26]及び[51]〜[53]のいずれかに記載の方法によって同定された患者である、に記載の方法。
[56]前記癌が胃癌である、[55]に記載の方法。
[57]FGFR4チロシンキナーゼドメインにおける183番目のグリシンからシステインへの変異を有する、FGFR4変異体ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
[58]試験物質が前記ポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性又は発現を阻害するか否かを評価する工程を包含する、癌治療剤のスクリーニング方法。
[59]前記癌が胃癌である、[58]に記載の方法。
本発明の検出方法は、被験者における線維芽細胞増殖因子受容体4(FGFR4)変異体の検出方法であって、被験者から得た試料中の、FGFR4チロシンキナーゼドメインの183番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出する工程を含む。
本発明のプライマーセットは、被験者から得た試料中のFGFR4チロシンキナーゼドメインの183番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出するためのプライマーセットであって、本発明の検出工程における変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異領域を増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む。アンチセンスプライマーは、変異型ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下(好ましくは、よりストリンジェントな条件下)でハイブリダイズする核酸分子(好ましくは、少なくとも16塩基の核酸分子)からなり、センスプライマーは、変異型ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件(好ましくは、よりストリンジェントな条件下)でハイブリダイズする核酸分子(好ましくは、少なくとも16塩基の核酸分子)からなる。
(1)配列番号1の塩基番号1から1905間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号1の塩基番号1907から2409間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット;並びに
(2)配列番号3の塩基番号1から1785間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号3の塩基番号1787から2289間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
配列番号9の塩基番号1から546間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号9の塩基番号548から933間の任意の連続する少なくとも16塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
本発明の治療方法は、本発明のFGFR4変異体の陽性の癌(特には胃癌)患者にFGFR4阻害剤を投与する工程を包含する、癌の治療方法である。本発明の治療方法において、前述の方法を用いて、FGFR4阻害剤による治療の適応対象と同定された患者を治療することができる。FGFR4阻害剤としては、PD173074(例えば、Clin Cancer Res.2005 Feb 1;11(3):1336−41)、抗FGFR4抗体(例えば、MAbs. 2011;3(4):376−86)など当業者に公知の種々のFGFR4阻害剤が使用できる。
本発明者らによって同定されたFGFR4変異体は、胃癌患者においてその存在が検出され、癌の原因遺伝子であることも確認された。従って、本発明のFGFR4変異体の活性又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法は、本発明のFGFR4変異体の陽性の癌(好ましくは胃癌)治療剤をスクリーニングする方法として利用できる。
胃癌患者組織由来RNA(米国アステランド社)St041検体RNAに対して、逆転写酵素(SuperScriptIII、ライフテクノロジーズ社)及びオリゴ(dT)プライマー(オリゴ(dT)20プライマー、ライフテクノロジーズ社)を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、cDNAを合成した。
胃癌患者組織由来RNA(米国アステランド社)83サンプルに対して、実施例1と同じ方法を用いて、G636C−FGFR4変異の有無を確認した。
G636C−FGFR4のORF全長をタンパク質として発現するため、まず野生型FGFR4(アイソフォーム1)をクローニングした。配列番号14(制限酵素サイトとして、SpeIを含む)及び配列番号15(制限酵素サイトとして、XhoIを含む)のプライマーにて、全長FGFR4(UltimateTM ORFCard for Clone ID IOH13371:ライフテクノロジーズ社)を鋳型として、DNAポリメラーゼ(PrimeSTAR GXL DNA Polymerase;タカラバイオ株式会社)を用いてPCR(98℃10秒、55℃15秒、68℃2分を30サイクル)を行った。本PCR産物をクローニングベクター(TOPO XL PCR Cloning Kit;ライフテクノロジーズ社)にクローニングした(FGFR4/TOPO XL)。
FGFR4/TOPO XL及びG636C−FGFR4/TOPO XLを鋳型として、配列番号18および配列番号19のプライマーにて、DNAポリメラーゼ(PrimeSTAR GXL DNA Polymerase;タカラバイオ株式会社)を用いてPCR(98℃10秒、55℃15秒、68℃2分を30サイクル)を行った。増幅されたDNA断片を電気泳動した後、ゲルから切り出し、カラム精製を行った。これらPCR断片を、EcoRVにて切断したpTracerTM−CMV Bsd(ライフテクノロジーズ社)に、In−Fusionクローニングシステム(In-Fusion(登録商標)Advantage PCR Cloning Kit w/Cloning Enhancer;タカラバイオ株式会社)にてクローニングした。これら野生型及び変異体FGFR4について作製したベクターを、FGFR4/pTracer−CMV−Bsd及びG636C−FGFR4/pTracer−CMV−Bsdと称する。
HEK293細胞を24ウェルプレートに2×105個播種した後、トランスフェクション試薬(Lipofectamine 2000;ライフテクノロジーズ社)を用いてFGFR4/pTracer−CMV−Bsd又はG636C−FGFR4/pTracer−CMV−Bsdをそれぞれ400ng遺伝子導入した。翌日、細胞をSDSサンプルバッファーにて溶解し、ウエスタンブロッティングを行った。抗リン酸化FGFR4抗体(Cell Signaling Technology)及び抗リン酸化ERK1/2抗体(Cell Signaling Technology)にて検出した結果、FGFR4/pTracer−CMV−Bsdに比べ、G636C−FGFR4/pTracer−CMV−Bsdを導入したHEK293細胞のFGFR4の自己リン酸化の亢進及びERKのリン酸化亢進が認められた。以上より、G636Cが活性化変異であることが示された。
FGFR4/TOPO XLをSpeI、XhoIで消化し、核酸断片をSpeI、SalI消化したレンチウイルス発現ベクター(pLenti6.3/V5−TOPO;ライフテクノロジーズ社)のマルチクローニングサイトに存在するSpeI−SalIサイトにクローニングした(FGFR4/pLenti6.3と命名)。同様の手法にて、G636C−FGFR4/TOPO XLから、レンチウイルス発現ベクターG636C−FGFR4/pLenti6.3を構築した。
in vivoにおける造腫瘍能を検討するため本細胞株をヌードマウスに移植し腫瘍形成能を検討した。FGFR4/NIH3T3−e7、FGFR4/NIH3T3−f7、G636C−FGFR4/NIH3T3−c1、及びG636C−FGFR4/NIH3T3−c2の各細胞をヌードマウスの皮下に3×106個ずつ接種し22日間観察した。その結果、FGFR4/NIH3T3−e7又はFGFR4/NIH3T3−f7を移植したマウスでは腫瘍形成が確認されなかった。一方、G636C−FGFR4/NIH3T3−c1又はG636C−FGFR4/NIH3T3−c2を移植したマウスにおいては、いずれも腫瘍形成が確認された。以上から、G636C−FGFR4は癌の原因遺伝子であることが示された。
Claims (11)
- 被験者における線維芽細胞増殖因子受容体4(FGFR4)変異体の検出方法であって、被験者から得た試料中の、FGFR4チロシンキナーゼドメインの183番目のグリシンからシステインへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。
- 前記変異が下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4における変異である、請求項1に記載の方法。
(1)FGFR4アイソフォーム1の636番目のグリシンからシステインへの変異;又は
(2)FGFR4アイソフォーム2の596番目のグリシンからシステインへの変異。 - 前記変異が下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4における変異である、請求項1に記載の方法。
(1)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるFGFR4の636番目のグリシンからシステインへの変異;又は
(2)配列番号4に示されるアミノ酸配列からなるFGFR4の596番目のグリシンからシステインへの変異。 - 下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、請求項1に記載の方法。
(1)FGFR4アイソフォーム1遺伝子の1906番目のグアニンからチミンへの変異;又は
(2)FGFR4アイソフォーム2遺伝子の1786番目のグアニンからチミンへの変異。 - 下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、請求項1に記載の方法。
(1)配列番号1に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子の1906番目のグアニンからチミンへの変異;又は
(2)配列番号3に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子の1786番目のグアニンからチミンへの変異。 - 下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4遺伝子における領域を増幅できるように設計したプライマーセットを用いて、前記被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、請求項1に記載の方法。
(1)配列番号1に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子における1906番目の塩基を含む領域;又は
(2)配列番号3に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子における1786番目の塩基を含む領域。 - 下記(1)乃至(2)に記載のFGFR4遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計したプローブを、前記被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項1に記載の方法。
(1)配列番号1に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子の1906番目のグアニンからチミンへの変異;又は
(2)配列番号3に示される塩基配列からなるFGFR4遺伝子の1786番目のグアニンからチミンへの変異。 - 前記被験者が癌患者である、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 前記癌が胃癌である、請求項8に記載の方法。
- 被験者における癌の存在を検出する方法であって、請求項1〜7のいずれかに記載の工程、及びFGFR4チロシンキナーゼドメインの183番目のグリシンからシステインへの変異が被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が癌に罹患している可能性が高いと判定する工程を包含する、方法。
- FGFR4阻害剤による治療の適応対象となる被験者を同定する方法であって、該被験者は癌患者であり、請求項1〜7のいずれかに記載の工程、及びFGFR4チロシンキナーゼドメインの183番目のグリシンからシステインへの変異が被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者がFGFR4阻害剤による治療の適応対象であると判定する工程を包含する、方法
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