WO2013015331A1 - Ｎａｓｈモデル動物 - Google Patents

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nash
nash model
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fat diet
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憲広 久保田
範江 増岡
狩野　光芳
将一 角
稔秀 小林
百合子 永田
幸司 宮崎
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Yakult Honsha Co Ltd
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    • A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes

Definitions

  • the present invention relates to a NASH model animal showing a pathological condition similar to human non-alcoholic steatohepatitis (NASH) and a method for producing the same.
  • NASH non-alcoholic steatohepatitis
  • NASH nonalcoholic fatty liver disease
  • Non-patent Document 1 methionine and / or choline-deficient diet models
  • nitrite and hydroxylamine are administered to develop methemoglobinemia, and hypoxia in vivo
  • the model (patent document 2) etc. which form is known these cannot be said to reflect the pathological condition of NASH histologically.
  • Patent Document 3 a model mouse to which an N-acetyl- ⁇ -D-glucosaminidase inhibitor such as streptozotocin is administered
  • Patent Document 4 a model mouse to which a high fat diet and a tetracycline antibiotic are administered
  • Patent Document 2 a model mouse in which carbon tetrachloride is administered once.
  • the pathological findings of these animal models show only large fatty liver, and there is no inflammation around the central lobule vein and balloon-like swelling of hepatocytes, which is characteristic of NASH.
  • This animal model is hardly a human NASH model. Therefore, the subject of this invention is providing the NASH model animal which produces the pathological condition peculiar to human NASH, and its production method.
  • a drug that induces hepatic disorder while ingesting a high-fat diet to obesity (hereinafter referred to as a “health disorder”) ,
  • a hepatic disorder drug) is a large drop of fatty liver, inflammation around the central vein in the leaflet of the liver, and hepatocytes are swollen like a balloon.
  • the present inventors have found that a model animal having a specific pathological condition can be prepared, and that the use of the model animal can evaluate the NASH preventive and therapeutic effect of the test substance and can screen for NASH preventive and therapeutic agents.
  • the present invention provides a NASH model animal obtained by ingesting a high fat diet and administering a hepatotoxic agent four times or more.
  • the present invention also provides a method for producing a NASH model animal, characterized by ingesting a high fat diet and administering a hepatic disorder agent four or more times.
  • the present invention also provides a screening method for a NASH prophylactic / therapeutic agent characterized by using the NASH model animal.
  • the present invention provides a method for evaluating the NASH preventive and therapeutic effect of a test substance, characterized by using the NASH model animal.
  • the present invention also provides a NASH model animal which is a large fatty liver, has inflammation around the central vein in the lobule of the liver, and hepatocytes are swollen like a balloon.
  • the NASH model animal of the present invention is a large-scale fatty liver, has inflammation around the central vein in the lobule of the liver, and has the symptoms peculiar to human NASH that hepatocytes are swollen like a balloon. It is useful as a human NASH model. By using the NASH model animal of the present invention, it becomes possible to screen for drugs and foods effective for human NASH. It can also be used to evaluate NASH preventive and therapeutic effects of test substances.
  • A Group 1 (untreated control group).
  • B Group 2 (high fat diet control group).
  • C Group 3 (high fat diet + carbon tetrachloride once administration group).
  • DF Group 9 (high fat diet + carbon tetrachloride 8 administration group).
  • A Histological image of normal liver.
  • B Small fat droplets in hepatocytes observed from around the central vein to the middle leaflet zone.
  • C Small fat droplets observed from around the central vein to the middle leaflet zone as in the high fat diet control group.
  • D Large drop fatty liver (arrowhead).
  • E Balloon-like swelling of the hepatocytes observed around the central vein (arrow).
  • F Lymphocyte-dominated inflammatory cell infiltration around the central vein. *: Central vein. #: Portal area.
  • B Group 2 (high fat diet control group).
  • C Group 3 (high fat diet + carbon tetrachloride once administration group).
  • D Group 9 (high fat diet + carbon tetrachloride 8 dose group).
  • FIGS. 8A to 8C are diagrams showing fibrosis caused by administration of the high fat diet and carbon tetrachloride (0.25 mL / kg body weight) 8 times in Example 2.
  • FIG. A Large droplet fatty liver; Large droplet fat accumulates in hepatocytes from the central part of the leaflet to the peripheral part.
  • B Cytoplasmic vacuoles are positive for Sudan III staining (fat).
  • C Minor fibrosis around the central vein. *: Central vein.
  • A x10.
  • B, C x20.
  • A HE staining.
  • B Sudan III staining (frozen section).
  • C MT staining.
  • AB is a figure which shows the inflammatory condition by the high fat diet of Example 2, and carbon tetrachloride (0.25 mL / kg body weight) 8 times administration.
  • A Infiltration of inflammatory cells around the central vein.
  • B Balloon-like swelling of the hepatocytes observed around the central vein (arrow). *: Central vein.
  • B x40.
  • A, B HE staining. It is a figure which shows the histopathological change in the liver of a microbial cell test group.
  • A, B Normal diet group (normal liver).
  • C, D Control group (NASH).
  • E, F L. plantarum group (findings in which inflammation in leaflets was slightly suppressed).
  • G, H L.G. salivarius group (findings in which inflammation in leaflets was slightly suppressed).
  • AH x20.
  • B, D, F, H MT staining.
  • the NASH model animal of the present invention can be prepared by ingesting a high fat diet and administering a hepatopathy agent four times or more.
  • mice are not particularly limited, and examples include mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, monkeys, etc., but it is preferable to use mice.
  • a mouse it may be a normal mouse and may be a hybrid or strain, but a mouse used as an experimental animal, for example, C57BL / 6 mouse, C3H mouse, ICR mouse, BALB / c line A mouse or the like is preferable.
  • the high-fat diet may be a diet containing 20% by mass or more of fat, and a diet containing 30 to 80% by mass of fat, particularly a diet containing 40 to 60% by mass of fat is preferable.
  • fat all kinds of fat can be used regardless of animal fat and vegetable fat, and examples thereof include corn oil, soybean oil, rapeseed oil, beef tallow, and lard. Pork fat is preferred.
  • components other than fat in the high-fat diet may be normal dietary components, and may include proteins, carbohydrates, minerals, and the like.
  • the intake period of the high fat diet is not particularly limited as long as it is necessary for obesity to occur, but is preferably 2 weeks or more, more preferably 4 weeks or more, further 4 to 16 weeks, and particularly preferably 8 to 16 weeks. .
  • the start time of high fat diet intake is not particularly limited, but is preferably from 5 weeks of age. Moreover, what is necessary is just to let an animal ingest a high fat diet freely every day.
  • the hepatic disorder used is not particularly limited, and examples thereof include carbon tetrachloride, galactosamine, acetaminophen, LPS (lipopolysaccharide), and carbon tetrachloride is particularly preferable.
  • the administration frequency is preferably 4 to 10 times, more preferably 4 to 8 times. When the number of administrations is less than 4, no inflammation or fibrosis occurs in the liver, and symptoms unique to human NASH do not develop.
  • the means for administering the hepatic disorder agent is not particularly limited, such as intraperitoneal administration, intravenous administration, oral administration, and subcutaneous administration, but subcutaneous administration is preferred.
  • 0.05 to 0.5 mL / kg body weight / time is preferable, and 0.1 to 0.25 mL / kg body weight / time is more preferable. If it is less than 0.05 mL / kg body weight / time, it may not exhibit NASH symptoms, and if it is more than 0.5 mL / kg body weight / time, it does not develop symptoms peculiar to human NASH and normal liver damage.
  • the start time of administration of the hepatic disorder is not particularly limited, but is preferably 2 weeks after the start of high fat diet intake, more preferably 4 weeks after the start of high fat diet, and more preferably 8 weeks. Later.
  • the administration interval of the hepatotoxic agent is preferably 1 to 3 times a week, particularly preferably twice a week. In addition, it is preferable to continue ingesting a high fat diet during the period of administration of the hepatopathy agent.
  • More preferable high fat diet intake and hepatotoxic agent administration schedule is to take a high fat diet for 8 weeks or more and then continue to consume the high fat diet twice a week with 0.1 to 0 hepatotoxic agent 25 mL / kg body weight / dose, 4 times or more in total.
  • a high-fat diet is ingested and a hepatotoxic agent is administered four or more times, pathological findings peculiar to human NASH appear in animals.
  • the pathological condition is macroscopic fatty liver, inflammation around the central vein in the leaflet of the liver, and hepatocytes swollen like balloons.
  • the NASH model animal of the present invention is particularly useful as a pathological model of human NASH.
  • the balloon-like swelling of the hepatocytes is not particularly limited in the place where the balloon-like swelling occurs, but it may occur around the central vein because it is more similar to the symptoms of human NASH.
  • Fatty liver means a state in which a large amount of fat is deposited in the liver, and more specifically, a state in which large fatty liver (deposition) and / or small fat accumulation (deposition) is observed.
  • large droplet fatty liver (deposition) needs to be observed in that it is more similar to human NASH.
  • the NASH model animal of the present invention preferably also exhibits a symptom that the liver tissue becomes fibrotic, and the NASH model animal that has developed until fibrosis is known as Matteoni et al. It can be a model animal of NASH that is well matched with NASH (Type 4) of the classification of the above, and has a more advanced disease state. In addition, it is more preferable that fibrosis occurs around the central vein because it is similar to the symptoms of human NASH.
  • the NASH model animal of the present invention is selected from serum aspartate aminotransferase (AST (GOT)), alanine aminotransferase (ALT (GPT)), free fatty acid (NEFA), and neutral fat (TG) 1
  • AST serum aspartate aminotransferase
  • ALT alanine aminotransferase
  • NEFA free fatty acid
  • TG neutral fat
  • the AST is 200 U / L or more, more preferably 500 U / L or more, and still more preferably 1000 U / L or more.
  • ALT is 300 U / L or more, more preferably 800 U / L or more, and still more preferably 1200 U / L or more.
  • Free fatty acid (NEFA) is 1000 ⁇ Eq / L or more, more preferably 1200 ⁇ Eq / L or more.
  • the neutral fat is 20 mg / dL or more, more preferably 30 mg / dL or more.
  • the NASH model animal of the present invention shows a pathological condition similar to the symptoms of human NASH.
  • the NASH model animal of the present invention exhibits symptoms specific to human NASH, and is useful for studying the pathology of NASH, as well as screening for NASH prophylactic and therapeutic agents (NASH prophylactic and therapeutic foods). Useful for. It is also useful for evaluating NASH preventive and therapeutic effects of test substances.
  • the NASH preventive and therapeutic effect of the test substance can be evaluated, and a NASH preventive and therapeutic agent can be screened.
  • the degree of liver damage can be determined by comparison with a test substance non-administered group and / or with a normal animal group (a normal diet group, a hepatotoxic agent non-administered group, etc.).
  • lactic acid bacteria are mentioned as an active ingredient of the NASH preventive and therapeutic agent screened by the screening method using the NASH model animal of the present invention.
  • a lactic acid bacterium has a lactic acid bacteria-containing high fat diet containing 1 ⁇ 10 10 / g of lactic acid bacteria for 12 weeks so that the daily intake is 3 g, and administration of the lactic acid bacteria-containing high fat diet is started.
  • Lactic acid bacteria when carbon tetrachloride (initial: 0.05 ml / kg body weight, second and subsequent times: 0.1 ml / kg body weight) was subcutaneously administered twice a week for a total of 8 times from week 9 to week 12 It is a lactic acid bacterium in which the value of serum ALT is reduced by 65% or more compared to non-administered mice.
  • thermophilus 2.6 g / day
  • tetrachloride from the 9th to 12th week from the start of administration of the high-fat diet containing bacterial powder Carbon (initial: 0.05 ml / kg body weight, second and later: 0.1 ml / kg body weight) is subcutaneously administered twice a week for a total of 8 times.
  • Blood is collected 24 hours after the final administration of carbon tetrachloride, and the ALT level in the serum is measured using transaminase CII test Wako (Wako Pure Chemical Industries).
  • lactic acid bacterium whose ALT value is reduced by 65% or more compared to a mouse not administered with lactic acid bacteria (a mouse administered with the high fat diet shown in Table 9 for 12 weeks and administered with carbon tetrachloride eight times in the same manner as described above). .
  • the average intake of feed per mouse in this lactic acid bacteria non-administered group is 2.5 g / day.
  • the intake per day is 3 g for 12 weeks to mice with a high fat diet containing 1 ⁇ 10 10 / g lactic acid bacteria.
  • Carbon tetrachloride (first time: 0.05 ml / kg BW, second time and later: 0.1 ml / kg BW) twice a week from the 9th to 12th week from the start of administration of the high-fat diet containing lactic acid bacteria, Even when administered subcutaneously a total of 8 times, the value of serum ALT is reduced by 65% or more compared to mice not administered with lactic acid bacteria. Moreover, it is more preferable to use a lactic acid bacterium in which the AST value in serum is reduced by 40% or more compared to a mouse not administered with a lactic acid bacterium. Preferably, the serum ALT value is decreased by 70% or more, more preferably 80% or more.
  • serum AST is reduced by 50% or more, more preferably 80% or more.
  • inflammation and fibrosis in the lobule which are symptoms unique to NASH, are preferably improved, and it has an excellent NASH preventive and therapeutic action.
  • These lactic acid bacteria can also be used as anti-inflammatory agents and anti-fibrotic agents in the leaflets.
  • Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus
  • Lactobacillus helveticus Lactobacillus helveticus
  • Lactobacillus salivarus Lactobacillus salivarius
  • Bacillus gasseri Lactobacillus fermentum
  • Lactobacillus reuteri Lactobacillus reuteri
  • Lactobacillus delbruxy subspecies Bulgaricus (Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus), Lactobacillus del bruecki subspecies.
  • Lactobacillus pulsium Lactobacillus pulsium, Lactobacillus pulsium, Lactobacillus johnsoniii, Lactobacillus johnsoniii, Lactobacillus johnsoniii Streptococcus bacteria such as Streptococcus salivarius), Lactococcus lactis subspecies. Lactococcus lactis subsp. Lactis, Lactococcus lactis subspecies. Lactococcus bacteria such as Lactococcus lactis subsp.
  • Cremoris Lactococcus raffinolactis, bacteria such as Enterococcus faecalis, Enterococcus ecterium c. ⁇ Breidobacterium breve, Bifidobacterium longum (Bifidobacterium longum), Bifidobacterium infantitis, Bifidobacterium address sentis (B) fibacterium adolescententis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium catenatumum, Bifidobacterumumumumum ), Bifidobacterium gallicum having a source isolated from the human intestine, Bifidobacterium lactis used in foods, Bifidobacterium galtis Idobakuteriumu animalis (Bifidobacterium animalis) lactic acid bacteria and the like.
  • Bifidobacterium bifidum Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Streptococcus thermophilus
  • Bifidobacterium bifidum YIT 10347 (FERM BP-10613: Date of deposit June 23, 2005), Lactobacillus plantarum YIT 0132 (FERM BP-11349: Date of deposit February 24, 2010), Lactobacillus salivaius YIT 0432 (FERM P-22129: date of deposit June 15, 2011), Streptococcus thermophilus YIT2001 (FERM BP-7538: date of deposit January 31, 2001 [2001])
  • At least one member selected from the group consisting of) is preferred.
  • the usage form of lactic acid bacteria can mention 1 or more chosen from the bacterial cell (live cell) and the processed material of the said bacterial cell, for example.
  • the treated product is not particularly limited as long as it is a treated product by a conventional method.
  • the treated cells dead cells
  • lyophilized products thereof cultures containing them
  • bacterial ultrasonic waves etc.
  • Crushing liquid, bacterial enzyme treatment liquid, solid residue separated by solid-liquid separation means such as filtration or centrifugation; treatment liquid from which cell wall has been removed by enzyme or mechanical means, concentrate of the treatment liquid, Diluted product, dried product thereof, etc .; Nucleic acid-containing fraction obtained by dissolving bacteria with a surfactant and then precipitating with ethanol, etc .;
  • separation / purification treatment such as separation by various chromatography.
  • the dead cells can be obtained, for example, by heat treatment, treatment with drugs such as antibiotics, treatment with chemical substances such as formalin, treatment with ultraviolet rays, treatment with radiation such as ⁇ rays.
  • the effectiveness can be expected regardless of whether it is a viable cell, dead cell, or other treated cell product, as long as it contains a certain number of viable cells at the end of cultivation of lactic acid bacteria.
  • the lactic acid bacteria for NASH preventive treatment can be provided.
  • use of the said lactic acid bacteria for NASH prophylactic / therapeutic agent manufacture can be provided.
  • use of the said lactic acid bacteria for NASH prevention treatment can be provided.
  • a NASH prophylactic treatment method characterized by ingesting an effective amount of the lactic acid bacteria can be provided.
  • the NASH preventive and therapeutic agent of the present invention can be used not only as a pharmaceutical product but also as a food / beverage product, a quasi-drug, a pet food and the like.
  • the number of lactic acid bacteria should be 1 ⁇ 10 9 or more.
  • the amount contained as a daily amount is preferable, the amount containing 5 ⁇ 10 9 to 2 ⁇ 10 12 as a daily amount is more preferable, and the amount containing 1 ⁇ 10 10 to 1 ⁇ 10 12 as a daily amount is further preferable.
  • the number of bacteria in the present invention is calculated based on the number of living bacteria at the end of lactic acid bacteria culture.
  • Example 1 Production of model animals The produced NASH model mice are shown below (Table 1). Carbon tetrachloride (0.1 mL / kg body weight) was subcutaneously administered to male C57BL / 6N mice fed with a high-fat diet (40% beef tallow mixed feed) and bred for 8 weeks under the following conditions. After the last administration, the blood was sacrificed under ether anesthesia. In addition, livers were collected from 5 animals in each group and fixed with 10% neutral buffered formalin. Table 2 shows the composition of the high fat diet. For Group 1 and Group 9, blood was collected from the abdominal aorta just prior to sacrifice. The obtained blood was left on ice for 1 hour or more, and then centrifuged at 3000 rpm for 15 minutes to prepare serum. When carbon tetrachloride was administered twice or more, the maximum number of administrations per week was set to twice.
  • Table 1 Carbon tetrachloride (0.1 mL / kg body weight) was subcutaneously administered to male C57BL / 6N mice
  • NASH requires large droplet fatty liver, lobular inflammation and balloon-like swelling of hepatocytes (Type 3 in Table 3), and in addition to these symptoms, when Mallory bodies or fibrosis is observed It is classified as Type 4.
  • hepatocytes Type 3 in Table 3
  • Mallory bodies or fibrosis is observed It is classified as Type 4.
  • inflammatory cell infiltration mainly consisting of lymphocytes and mild fibrosis were observed around the central vein ( FIG. 1F, FIG. 2D).
  • the incidence of inflammatory cell infiltration (inflammation) tended to increase in proportion to the number of administrations (Tables 4 and 5).
  • Fibrosis was observed around the central vein and surrounding hepatocytes (FIG. 2D), and was observed in each group at a rate of 3 to 4 out of 5 cases (Tables 4 and 5).
  • fibrosis images that progressed to bridging fibrosis as reported in human cirrhosis were not observed in all groups.
  • high fat diet + carbon tetrachloride 4 times administration group Group 7
  • high fat diet + carbon tetrachloride 6 times administration group Group 8
  • NASH diagnostic criteria Type 4 in Table 3 classified by Matteoni et al. It became clear.
  • NASH-like lesions are not induced in mice only by administration of a high-fat diet alone, but NASH-like lesions are also induced in the case of feeding a high-fat diet and single and double administration of carbon tetrachloride. It became clear that not. In addition, even after 72 hours from the single administration of carbon tetrachloride, the symptoms did not progress, and it became clear that NASH-like lesions were not induced. On the other hand, it became clear that NASH-like lesions were induced by administration of carbon tetrachloride four or more times, and that NASH-like lesions were induced strongly and frequently by increasing the number of administrations of carbon tetrachloride. .
  • NASH-like lesions can be induced by administering a hepatopathy agent at a dose lower than 1 ml / kg body weight / time, which is usually an amount that causes hepatopathy, and four times or more. It became clear. In view of the unclear generation mechanism of NASH, the reason why NASH-like lesions are induced by the above method is unclear.
  • Example 2 Except for the carbon tetrachloride dosage of 0.25 mL / kg body weight, the carbon tetrachloride was subcutaneously administered 8 times (2 times / week) in the same manner as in Example 1.
  • NASH model mice having the histopathological findings shown in Table 7 and the liver symptoms shown in FIGS. This mouse exhibited inflammation around the central vein, resulting in fibrosis, and large droplet fatty liver and hepatocyte balloon-like swelling.
  • Example 3 Test group and test schedule The following experiment was performed using C57BL / 6N strain, 7-week-old mice.
  • the normal diet group is a test group in which AIN93G, which is a general breeding feed, was ingested for 12 weeks.
  • AIN93G which is a general breeding feed
  • In the control group for the onset of NASH, intake of a high fat diet for 12 weeks and carbon tetrachloride (initial: 0.05 ml / kg body weight, second and subsequent: 0.1 ml / kg body weight) from week 9 to week 12 was administered subcutaneously a total of 8 times.
  • Each lactic acid bacteria administration group was ingested with a diet containing 0.05% of each freeze-dried bacterial powder based on the high fat diet of the control group (the number of bacteria in the feed: The number of bacteria in 1 g of feed is determined by the following formula: number of viable bacteria at the end of culture in culture medium / amount of bacterial powder produced by lyophilization (g) ⁇ weight of bacterial powder in 1 g of feed ( g) L.
  • Feed and drinking water were freely consumed in each test (average feed weight per mouse normal diet: 2.4 g / day, control: 2.5 g / day, L. Crispatus: 2.4 g / day)
  • Necropsy was performed 24 hours after the final administration of carbon tetrachloride, and blood and organs were collected. Serum was prepared from blood and used to measure AST and ALT. The collected liver was immersed and stored in a 10% neutral buffered formalin solution for histopathological analysis.
  • livers of each test group were used for histopathological analysis.
  • the liver fixed with a formalin solution was cut out by a conventional method, embedded in paraffin, and then the paraffin block was sliced into a thickness of about 4 ⁇ m, stained with Hematoxylin-Eosin (HE), and observed with an optical microscope.
  • HE Hematoxylin-Eosin
  • MT Masson's trichrome staining was performed on paraffin sections to prove collagen fibers. Intralobular inflammation and fibrosis were examined as diagnostic items for histopathology.
  • the grading of the pathological condition is that the entire visual field of the liver section is observed and no pathological condition is observed:-(negative), the pathological condition is 20% or less of the total visual field: ⁇ (very mild), the pathological condition is 20 to 50% of the total visual field : + (Mild), 50-80% of all visual fields: ++ (moderate), 80% or more of all visual fields: ++ (severe).
  • L. In the crisptus group neither AST nor ALT significantly decreased.
  • Table 10 shows the AST results.
  • Table 11 shows the results of ALT.
  • the number of bacteria that a mouse ingests per day is Bifidum: 2.12 ⁇ 10 9 , L. Plantarum: 3.2 ⁇ 10 9 , L. Salivarius: 9.62 ⁇ 10 8 , S. thermophilus: 2.45 ⁇ 10 8 . Since the weight of the mouse used was about 37 g, Bifidum: 5.73 ⁇ 10 10 / kg BW / day, L. Plantarum: 8.65 ⁇ 10 10 / kg BW / day, L.P. Sarivarius: 2.6 ⁇ 10 10 / kg BW / day, S. var. thermophilus: 6.62 ⁇ 10 9 / kg BW / day.
  • the lactic acid bacterium of the present invention has the advantage of exhibiting a higher effect with a smaller number of bacteria than the lactic acid bacterium described in JP-T-2005-512590.
  • NASH model animals can be used to screen for NASH preventive and therapeutic agents, and it has been shown that NASH preventive and therapeutic effects of test substances can also be evaluated.

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Abstract

　ヒトのＮＡＳＨ特有の病態を生じるＮＡＳＨモデル動物及びその作製方法を提供する。　高脂肪食を摂取させ、肝障害剤を４回以上投与することにより得られるＮＡＳＨモデル動物。

Description

ＮＡＳＨモデル動物
　本発明は、ヒトの非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）に類似した病態を示すＮＡＳＨモデル動物及びその作製方法に関する。
　近年、肥満の人で飲酒習慣がないにも関わらず、脂肪肝から肝硬変や肝がんになる患者が増えている。脂肪性肝疾患のうち、明らかな飲酒歴がないのにも関わらず、アルコール性肝障害に類似した脂肪性肝障害を認める症例をＮｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｆａｔｔｙ　ｌｉｖｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ（ＮＡＦＬＤ）といい、そのうち肝組織で肝細胞の風船様腫大を伴う脂肪性肝炎を認める症例を特にＮＡＳＨと呼んでいる。当該ＮＡＳＨは、肝硬変や肝がんになるリスクが高いことから、この予防、治療手段の開発が望まれている。
　ＮＡＳＨ治療薬の開発には、その病態モデルが必要である。ＮＡＳＨ又はＮＡＦＬＤのモデル動物としては、メチオニン及び／又はコリン欠乏食モデル（非特許文献１、特許文献１）、亜硝酸塩やヒドロキシルアミンを投与してメトヘモグロビン血症を発症させ、生体内低酸素状態を形成させるモデル（特許文献２）等が知られているが、これらはいずれも組織学的にＮＡＳＨの病態を反映しているとは言い難い。また、ストレプトゾトシンなどのＮ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニダーゼ阻害剤を投与するモデルマウス（特許文献３）、高脂肪食とテトラサイクリン系抗生物質を投与するモデルマウス（特許文献４）、高脂肪食摂取と四塩化炭素を１回投与するモデルマウス（非特許文献２）も報告されている。
特開２００６－３４９４５７号公報 ＷＯ２００８／０１８１９１ 特開２００９－１７８１４３号公報 ＷＯ２００６／０３０７９２
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　２３（２００８）１６３５－１６４８ Ｗｏｒｌｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　２００５；１１（９）：１３９２－１３９５
　しかしながら、これらの動物モデルの病理所見では、大滴性脂肪肝のみが認められ、ＮＡＳＨに特有の肝細胞における小葉中心静脈周囲における炎症および肝細胞の風船様腫大は認められないことから、これらの動物モデルはヒトのＮＡＳＨモデルとは言い難い。
　従って、本発明の課題は、ヒトのＮＡＳＨ特有の病態を生じるＮＡＳＨモデル動物及びその作製方法を提供することにある。
　そこで本発明者は、ヒトのＮＡＳＨ特有の病態を呈するモデル動物を作製すべく種々検討したところ、全く意外にも、高脂肪食を摂取させて肥満にさせるとともに、肝障害を誘発する薬剤（以下、肝障害剤という）を４回以上投与することにより、大滴性脂肪肝であり、肝臓の小葉内の中心静脈周囲に炎症があり、肝細胞が風船様に腫大しているという、ヒトのＮＡＳＨ特有の病態を有するモデル動物が作製できること、さらに当該モデル動物を用いれば被験物質のＮＡＳＨ予防治療効果が評価でき、ＮＡＳＨ予防治療剤がスクリーニングできることを見出し、本発明を完成した。
　従って、本発明は、高脂肪食を摂取させ、肝障害剤を４回以上投与することにより得られるＮＡＳＨモデル動物を提供するものである。
　また、本発明は、高脂肪食を摂取させ、肝障害剤を４回以上投与することを特徴とするＮＡＳＨモデル動物の作製方法を提供するものである。
　また、本発明は、前記ＮＡＳＨモデル動物を用いることを特徴とする、ＮＡＳＨ予防治療剤のスクリーニング方法を提供するものである。
　さらに、本発明は、前記ＮＡＳＨモデル動物を用いることを特徴とする、被験物質のＮＡＳＨ予防治療効果の評価方法を提供するものである。
　また、本発明は、大滴性脂肪肝であり、肝臓の小葉内の中心静脈周囲に炎症があり、肝細胞が風船様に腫大しているＮＡＳＨモデル動物を提供するものである。
　本発明のＮＡＳＨモデル動物は、大滴性脂肪肝であり、肝臓の小葉内の中心静脈周囲に炎症があり、肝細胞が風船様に腫大しているという、ヒトのＮＡＳＨ特有の症状を有することから、ヒトＮＡＳＨモデルとして有用である。本発明のＮＡＳＨモデル動物を用いれば、ヒトのＮＡＳＨに有効な医薬や食品のスクリーニングが可能となる。また、被験物質のＮＡＳＨ予防治療効果の評価にも用いることができる。
実施例１の高脂肪食及び四塩化炭素（０．１ｍＬ／ｋｇ体重）投与による肝細胞の組織学的変化を示す図である。Ａ：Ｇｒｏｕｐ　１（無処置対照群）。Ｂ：Ｇｒｏｕｐ　２（高脂肪食対照群）。Ｃ：Ｇｒｏｕｐ　３（高脂肪食＋四塩化炭素１回投与群）。Ｄ～Ｆ：Ｇｒｏｕｐ　９（高脂肪食＋四塩化炭素８回投与群）。Ａ：正常な肝臓の組織像。Ｂ：中心静脈周囲から小葉中間帯にかけて観察された肝細胞内の小脂肪滴。Ｃ：高脂肪食対照群と同じく中心静脈周囲から小葉中間帯にかけて観察された小脂肪滴。Ｄ：大滴性脂肪肝（矢頭）。Ｅ：中心静脈周囲に観察された肝細胞の風船様腫大（矢印）。Ｆ：中心静脈周囲におけるリンパ球主体の炎症細胞浸潤。＊：中心静脈。＃：門脈域。Ａ～Ｄ，Ｆ：×２０。Ｅ：×４０。Ａ～Ｆ：Ｈ－Ｅ染色。 実施例１の高脂肪食及び四塩化炭素（０．１ｍＬ／ｋｇ体重）投与による線維化を示す図である。Ａ：Ｇｒｏｕｐ　１（無処置対照群）。Ｂ：Ｇｒｏｕｐ　２（高脂肪食対照群）。Ｃ：Ｇｒｏｕｐ　３（高脂肪食＋四塩化炭素１回投与群）。Ｄ：Ｇｒｏｕｐ　９（高脂肪食＋四塩化炭素　８回投与群）。Ａ：正常な肝臓の組織像。Ｂ、Ｃ：中心静脈周囲、門脈域ともに線維化は確認されなかった。Ｄ：中心静脈周囲において肝細胞を取り囲むように線維化が観察された。＊中心静脈。＃：門脈域。Ａ～Ｄ：×２０。Ｍ－Ｔ染色。 Ａ～Ｃは実施例２の高脂肪食及び四塩化炭素（０．２５ｍＬ／ｋｇ体重）８回投与による線維化を示す図である。Ａ：大滴性脂肪肝；小葉中心部から周辺部にかけて肝細胞内に大滴性脂肪が蓄積。Ｂ：細胞質内の空胞はＳｕｄａｎＩＩＩ染色陽性（脂肪）。Ｃ：中心静脈周囲の軽微な線維化。＊：中心静脈。＃：門脈域。Ａ：×１０。Ｂ，Ｃ：×２０。Ａ：Ｈ－Ｅ染色。Ｂ：ＳｕｄａｎＩＩＩ染色（凍結切片）。Ｃ：Ｍ－Ｔ染色。 Ａ～Ｂは実施例２の高脂肪食及び四塩化炭素（０．２５ｍＬ／ｋｇ体重）８回投与による炎症症状を示す図である。Ａ：中心静脈周囲の炎症性細胞の浸潤。Ｂ：中心静脈周囲に観察された肝細胞の風船様腫大（矢印）。＊：中心静脈。Ａ：×２０。Ｂ：×４０。Ａ、Ｂ：Ｈ－Ｅ染色。 菌体試験群の肝臓における病理組織学的変化を示す図である。Ａ、Ｂ：通常食群（正常肝）。Ｃ、Ｄ：コントロール群（ＮＡＳＨ）。Ｅ、Ｆ：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ群（小葉内炎症が軽微に抑制された所見）。Ｇ、Ｈ：Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ群（小葉内炎症が軽微に抑制された所見）。Ａ－Ｈ：×２０。Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ：ＨＥ染色。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ：Ｍ－Ｔ染色。
　本発明のＮＡＳＨモデル動物は、高脂肪食を摂取させ、肝障害剤を４回以上投与することにより作製できる。
　用いられる動物は、特に制限されるものではなく、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、サル等を挙げることができるが、マウスを用いることが好ましい。マウスを用いる場合は、通常のマウスであればよく、雑種でも系統種でもよいが、実験動物として用いられているマウス、例えばＣ５７ＢＬ／６系マウス、Ｃ３Ｈ系マウス、ＩＣＲ系マウス、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス等が好ましい。
　高脂肪食としては、脂肪を２０質量％以上含有する食餌であればよく、さらに脂肪を３０～８０質量％含有する食餌、特に脂肪を４０～６０質量％含有する食餌が好ましい。ここで脂肪としては、動物性脂肪、植物性脂肪にかかわらず、あらゆる種類の脂肪を用いることができ、コーン油、大豆油、なたね油、牛脂、豚脂を例示することができるが、特に牛脂、豚脂が好ましい。また高脂肪食中の脂肪以外の成分は、通常の食餌成分であればよく、タンパク質、炭水化物、ミネラル等を含んでもよい。
　高脂肪食の摂取期間は、肥満が生じるのに必要な期間であればよく、特に制限されないが、２週間以上が好ましく、さらに４週間以上、さらに４～１６週間、特に８～１６週間が好ましい。また高脂肪食摂取の開始時期は特に制限されないが、５週齢からが好ましい。また、高脂肪食は、動物に毎日自由摂取させればよい。
　用いられる肝障害剤は特に制限されるものではなく、例えば、四塩化炭素、ガラクトサミン、アセトアミノフェン、ＬＰＳ（リポ多糖）等を挙げることができるが、特に四塩化炭素が好ましい。
　肝障害剤は、４回以上投与することが、動物にヒトＮＡＳＨ特有の症状を発症させる点で重要である。投与回数は４～１０回が好ましく、４～８回がより好ましい。投与回数が４回未満の場合には、肝臓に炎症や線維化が生じず、ヒトのＮＡＳＨ特有の症状が発症しない。
　肝障害剤の投与手段は、腹腔投与、静脈投与、経口投与、皮下投与等、特に限定されるものではないが、皮下投与が好ましい。また投与量は、通常の肝障害を生じさせる量である１ｍｌ／ｋｇ体重／回よりも低用量であることが、ヒトＮＡＳＨ特有の症状を発症させるために重要であり、具体的には、０．０５～０．５ｍＬ／ｋｇ体重／回が好ましく、０．１～０．２５ｍＬ／ｋｇ体重／回がより好ましい。０．０５ｍＬ／ｋｇ体重／回よりも少ないと、ＮＡＳＨの症状を呈しない場合があり、０．５ｍＬ／ｋｇ体重／回よりも多いと、ヒトＮＡＳＨ特有の症状を発症せず、通常の肝障害モデル動物となってしまう場合があるため好ましくない。また、初回の投与量は２回目以降よりも少ない方が死亡個体数が減少するため好ましい。肝障害剤の投与開始時期は、特に限定されるものではないが、高脂肪食摂取開始後２週間後からが好ましく、特に高脂肪食開始後４週間後からがより好ましく、さらに好ましくは８週間後からである。また、肝障害剤の投与間隔は、週に１～３回が好ましく、週に２回が特に好ましい。なお、肝障害剤投与期間中も高脂肪食は摂取し続けるのが好ましい。
　より好ましい高脂肪食の摂取と肝障害剤投与のスケジュールは高脂肪食を８週間以上摂取させた後、高脂肪食の摂取を続けつつ、週に２回、肝障害剤を０．１～０．２５ｍＬ／ｋｇ体重／回、合計４回以上皮下投与するというものである。
　高脂肪食を摂取させ、肝障害剤を４回以上投与すれば、動物にヒトＮＡＳＨ特有の病理所見が現われる。その病態とは、大滴性脂肪肝であり、肝臓の小葉内の中心静脈周囲に炎症があり、風船様に腫大した肝細胞が認められることである。従来のＮＡＳＨモデルでは、小葉内の中心静脈周囲における炎症及び風船様腫大と、大滴性脂肪肝との両方の病理所見が生じるものがなかった。従って、本発明のＮＡＳＨモデル動物は、ヒトのＮＡＳＨの病態モデルとして特に有用である。ここで、肝細胞の風船様腫大について、風船様腫大が生じる場所は特に限定されるものではないが、ヒトＮＡＳＨの症状により類似しているという点から中心静脈周囲に生じていることが好ましい。また、脂肪肝とは、肝臓に大量の脂肪が沈着した状態のことをいい、より詳細には、大滴性脂肪肝（沈着）及び／又は小脂肪的蓄積（沈着）が認められる状態であるが、ヒトのＮＡＳＨにより類似しているという点で、大滴性脂肪肝（沈着）が認められるものである必要がある。
　また、本発明のＮＡＳＨモデル動物は、さらに肝組織が線維化するという症状も呈していることが好ましく、線維化まで生じているＮＡＳＨモデル動物は、ＮＡＳＨの診断基準としてよく知られているＭａｔｔｅｏｎｉらの分類のＮＡＳＨ（Ｔｙｐｅ　４）によく合致しており、より病態が進んだＮＡＳＨのモデル動物となり得る。また、ヒトＮＡＳＨの症状に類似しているという点から、線維化は中心静脈周囲に生じていることがより好ましい。
　さらに、本発明のＮＡＳＨモデル動物は、血清中のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ（ＧＯＴ））、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ（ＧＰＴ））、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）、中性脂肪（ＴＧ）から選ばれる１以上が通常飼料で飼育された動物に比べて高いものである。好ましくは、ＡＳＴは、２００Ｕ／Ｌ以上、より好ましくは５００Ｕ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは１０００Ｕ／Ｌ以上である。ＡＬＴは３００Ｕ／Ｌ以上、より好ましくは８００Ｕ／Ｌ以上であり、さらに好ましくは１２００Ｕ／Ｌ以上である。遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）は１０００μＥｑ／Ｌ以上、より好ましくは１２００μＥｑ／Ｌ以上である。中性脂肪は２０ｍｇ／ｄＬ以上、より好ましくは３０ｍｇ／ｄＬ以上である。ヒトＮＡＳＨ患者においても、上記の指標は健常人に比べて高いことが報告されており、本発明のＮＡＳＨモデル動物は、ヒトＮＡＳＨの症状に類似した病態を示すものである。
　本発明のＮＡＳＨモデル動物は、ヒトのＮＡＳＨ特有の症状を呈しており、ＮＡＳＨの病態の研究用として有用であるとともに、ＮＡＳＨ予防治療剤（ＮＡＳＨ予防治療薬、ＮＡＳＨ予防治療用食品）などのスクリーニングに有用である。また、被験物質のＮＡＳＨ予防治療効果の評価にも有用である。
　動物に高脂肪食を摂取させ、肝障害剤の投与前、投与の間及び／又は投与後に被験物質を投与し、肝障害剤を４回以上投与した後、肝障害の程度を観察することにより、該被験物質のＮＡＳＨ予防治療効果が評価でき、ＮＡＳＨ予防治療剤のスクリーニングができる。ここで、肝障害の程度は、被験物質非投与群との対比、及び／又は正常動物群（通常食群、肝障害剤非投与群など）との対比により行うことができる。
　本発明のＮＡＳＨモデル動物を用いたスクリーニング方法によりスクリーニングされたＮＡＳＨ予防治療剤の有効成分としては、特定の乳酸菌が挙げられる。そのような乳酸菌は、乳酸菌を１×１０１０／ｇ含有する乳酸菌含有高脂肪食をマウスに１２週間、１日当たりの摂取量が３ｇとなるように摂取させ、前記乳酸菌含有高脂肪食の投与開始から数えて９週目～１２週目に四塩化炭素（初回：０．０５ｍｌ／ｋｇ体重、２回目以降：０．１ｍｌ／ｋｇ体重）を週２回、合計８回皮下投与した際に、乳酸菌非投与のマウスに比べて血清中ＡＬＴの値が６５％以上低下する乳酸菌である。より詳細には、後記表９に記載の菌末含有高脂肪食（菌末含有高脂肪食あたりの菌数：菌末含有高脂肪食１ｇ中の菌数は以下の式で求める：培養液中の培養終了時の生菌数／凍結乾燥で製造された菌末量（ｇ）×菌末含有高脂肪食１ｇ中の菌末の重量（ｇ）。Ｌ．Ｃｒｉｓｐａｔｕｓ：２．４７×１０１２／１．７５４×０．０００５＝７．０４×１０８／ｇ、Ｂ．Ｂｉｆｉｄｕｍ：２．７４×１０１２／１．５５×０．０００５＝８．８４×１０８／ｇ、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ：７．３６×１０１２／２．７３７×０．０００５＝１．３４×１０９／ｇ、Ｌ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：２．４×１０１２／２．９９５×０．０００５＝４．０１×１０８／ｇ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：４．６×１０１１／２．４４４×０．０００５＝９．４１×１０７／ｇ）を１２週間自由摂取させ（マウス１匹あたりの飼料の平均摂取重量　Ｌ．Ｃｒｉｓｐａｔｕｓ：２．４ｇ／日、Ｂ．Ｂｉｆｉｄｕｍ：２．４ｇ／日、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ：２．４ｇ／日、Ｌ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：２．４ｇ／日、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：２．６ｇ／日）、菌末含有高脂肪食の投与開始から数えて９週目～１２週目に四塩化炭素（初回：０．０５ｍｌ／ｋｇ体重、２回目以降：０．１ｍｌ／ｋｇ体重）を週２回、合計８回皮下投与する。四塩化炭素を最終投与してから２４時間後に血液を採取し、血清中のＡＬＴ値をトランスアミナーゼＣＩＩ　テストワコー（和光純薬）を用いて測定する。そのＡＬＴ値が、乳酸菌非投与のマウス（表９に記載の高脂肪食を１２週間投与し、前記と同様に四塩化炭素を８回投与したマウス）に比べて６５％以上低下する乳酸菌である。この乳酸菌非投与群のマウス１匹あたりの飼料の平均摂取量は、２．５ｇ／日である。この時にマウスが摂取した乳酸菌の菌数は、いずれの菌種でも１×１０１０／ｇ×３ｇ×７×１２＝２．５２×１０１２よりも少ないものであるが、これよりも少ない菌数で、乳酸菌非投与のマウスに比べてＡＬＴが６５％以上低下する場合は、乳酸菌を１×１０１０／ｇ含有する高脂肪食をマウスに１２週間、１日当たりの摂取量が３ｇとなるように摂取させ、前記乳酸菌含有高脂肪食の投与開始から数えて９週目～１２週目に四塩化炭素（初回：０．０５ｍｌ／ｋｇＢＷ、２回目以降：０．１ｍｌ／ｋｇＢＷ）を週２回、合計８回皮下投与した際にも、乳酸菌非投与のマウスに比べて血清中ＡＬＴの値が６５％以上低下するものである。また、乳酸菌非投与のマウスに比べて、血清中のＡＳＴの値が４０％以上低下する乳酸菌を用いることがより好ましい。また好ましくは、血清中ＡＬＴの値が７０％以上、より好ましくは８０％以上低下するものである。また好ましくは、血清中ＡＳＴが５０％以上低下し、さらに好ましくは８０％以上低下するものである。また好ましくはＮＡＳＨ特有の症状である小葉内の炎症、線維化が改善し、優れたＮＡＳＨ予防治療作用を有するものである。また、これらの乳酸菌は、小葉内の抗炎症剤、抗線維化剤として用いることもできる。
　このような性質を有する乳酸菌であれば、その種類は特に制限されるものではなく、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・デルブルッキィーサブスピーシーズ．ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブルッキィーサブスピーシーズ．デルブルッキィー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ　ｓｕｂｓｐ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチスサブスピーシーズ．ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチスサブスピーシーズ．クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ　ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトコッカス・ラフィノラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ）等のラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）等のエンテロコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンチィス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アングラータム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｎｇｕｌａｔｕｍ）、ヒトの腸内から分離される由来を持つビフィドバクテリウム・ガリカム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇａｌｌｉｃｕｍ）、食品に利用されているビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｎｉｍａｌｉｓ）等の乳酸菌が挙げられる。これらの中でも特に、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サーモフィルスからなる群から選ばれる１種以上が好ましく、さらにビフィドバクテリウム・ビフィダム　ＹＩＴ　１０３４７（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０６１３：寄託日　平成１７[２００５]年６月２３日）、ラクトバチルス・プランタラム　ＹＩＴ　０１３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１１３４９：寄託日　平成２２[２０１０]年２月２４日）、ラクトバチルス・サリバリウス　ＹＩＴ　０４３２（ＦＥＲＭ　Ｐ－２２１２９：寄託日　平成２３[２０１１]年６月１５日）、ストレプトコッカス・サーモフィルス　ＹＩＴ２００１（ＦＥＲＭ　ＢＰ－７５３８：寄託日　平成１３[２００１]年１月３１日）からなる群から選ばれる１種以上が好ましい。また、これらの菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＩＰＯＤ）（〒３０５－８５６６　茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。なお、特表２００５－５１２５９０号公報に記載のストレプトコッカス・サーモフィラス・エス・エス・ピー・サリヴァリウス（ＣＤ８株）（ＤＳＭ１４６６７）は、現在の分類では、ストレプトコッカス・サリバリウスに分類されるべきものであり、ストレプトコッカス・サーモフィルスとは別種の菌である。
　なお、乳酸菌の使用形態は、例えば、細菌菌体（生菌）及び当該細菌菌体の処理物から選ばれる１以上を挙げることができる。当該処理物としては、常法の処理による処理物であれば特に限定されず、例えば、加熱菌体（死菌体）、その凍結乾燥物、それらを含有する培養物、細菌の超音波等による破砕液、細菌の酵素処理液、それらを濾過や遠心分離等の固液分離手段によって分離した固体残渣等；細胞壁を酵素若しくは機械的手段により除去した処理液、当該処理液の濃縮物、それらの希釈物、それらの乾燥物等；細菌を界面活性剤等によって溶解した後、エタノール等によって沈殿させて得られる核酸含有画分；前記細菌の超音波等による破砕液や細胞の酵素処理液等に対し、例えば各種クロマトグラフィーによる分離などの分離・精製処理を行ったもの等が挙げられる。
　前記死菌体は、例えば、加熱処理、抗生物質等の薬物による処理、ホルマリン等の化学物質による処理、紫外線による処理、γ線等の放射線による処理により得ることができる。後述のように、乳酸菌の培養終了時の生菌数を一定量含有するものであれば、生菌・死菌・その他の菌体処理物を問わず、有効性が期待できる。
　また、本発明によれば、ＮＡＳＨ予防治療のための前記乳酸菌が提供できる。また、ＮＡＳＨ予防治療剤製造のための前記乳酸菌の使用が提供できる。またＮＡＳＨ予防治療のための前記乳酸菌の使用が提供できる。さらに、前記乳酸菌の有効量を摂取することを特徴とするＮＡＳＨ予防治療方法が提供できる。
　また、本発明のＮＡＳＨ予防治療剤は、医薬品として用いるだけでなく、飲食品、医薬部外品、ペットフード等として用いることもできる。
　また、本発明のＮＡＳＨ予防治療剤の有効成分である乳酸菌を使用する際の投与量に厳格な制限はない。対象者や適用疾患等の様々な使用態様によって得られる効果が異なるため、適宜投与量を設定することが望ましいが、ＮＡＳＨ予防治療作用の点で、乳酸菌の菌数を、１×１０９以上を１日量として含有する量が好ましく、５×１０９～２×１０１２を１日量として含有する量がより好ましく、１×１０１０～１×１０１２を１日量として含有する量がさらに好ましい。なお、本発明における菌数は乳酸菌培養終了時の生菌数に基づいて算出する。
　次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
実施例１
（１）モデル動物の作製
　作製したＮＡＳＨモデルマウスを以下に示した（表１）。
　高脂肪食（牛脂４０％混餌飼料）を自由摂取させて８週間飼育した雄のＣ５７ＢＬ／６Ｎ系マウスに下記の条件で四塩化炭素（０．１ｍＬ／ｋｇ体重）を皮下投与し、四塩化炭素を最後に投与してから下記の時間が経過した後、エーテル麻酔下で放血屠殺した。また、各群５匹から肝臓を採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定した。また表２に高脂肪食の組成を示した。
　Ｇｒｏｕｐ１とＧｒｏｕｐ９については、放血屠殺する直前に、腹部大動脈から採血した。得られた血液を１時間以上氷上にて放置した後、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離を行い、血清を調製した。
　なお、四塩化炭素を２回以上投与する場合は、１週間の最大投与回数が２回となるようにした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（２）病理組織学的観察
　固定後の肝臓を常法により切り出し、パラフィン包埋後、パラフィンブロックを約４μｍの厚さに薄切し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－Ｅｏｓｉｎ（Ｈ－Ｅ）染色を施して、光学顕微鏡にて観察した。さらに膠原線維の有無を確認するためにパラフィン切片にＭａｓｓｏｎ’ｓ　ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（Ｍ－Ｔ）染色を実施した。
（３）血液生化学性状の測定
　７１７０型自動分析装置（（株）日立製作所）を用いて、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ（ＧＯＴ））、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ（ＧＰＴ））、遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）、中性脂肪（ＴＧ）を測定した。
（４）ＮＡＳＨの診断基準
　現在、臨床におけるＮＡＳＨの病理組織学的診断基準には、Ｍａｔｔｅｏｎｉらの分類（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　１９９９，１１６：１４１３－１４１９）、Ｋｌｅｉｎｅｒらの分類（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　２００５，　４１：１３１３－１３２１）、及びＢｒｕｎｔらの分類（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　１９９９，　９４：２４６７－２４７４）がある。米国肝臓学会　Ｓｉｎｇｌｅ　Ｔｏｐｉｃ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　２００２ではＮＡＳＨの必須所見として大滴性脂肪肝、小葉内炎症、肝細胞の風船様腫大をあげ、ＮＡＦＬＤのＴｙｐｅ　３（Ｍａｔｔｅｏｎｉらの分類（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　１９９９，１１６：１４１３－１４１９））以上をＮＡＳＨと組織診断している（表３）。また、日本肝臓学会でも組織診断基準にＭａｔｔｅｏｎｉらの分類を奨励している。これらのことから今回、ＭａｔｔｅｏｎｉらによるＮＡＦＬＤの分類をＮＡＳＨの診断基準として用いた。
　すなわち、ＮＡＳＨは大滴性脂肪肝、小葉内炎症および肝細胞の風船様腫大を必須とし（表３のＴｙｐｅ　３）、これらの症状に加えて、マロリー小体又は線維化が認められる場合はＴｙｐｅ　４に分類される。
　また、臨床でのヒトＮＡＳＨでは大滴性脂肪肝、小葉内炎症、風船様腫大及び／又は線維化が中心静脈周囲で生じていることが報告されていることから、上記の症状が中心静脈周囲で生じている場合に、ヒトＮＡＳＨの症状により類似した病態ということができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（５）結果
　（ａ）高脂肪食対照群（Ｇｒｏｕｐ　２）の病理組織的変化
　高脂肪食対照群（Ｇｒｏｕｐ　２）では中心静脈周囲から小葉中間帯において、肝細胞に小脂肪滴が認められた（図１Ｂ）。小脂肪滴は無処置対照群では観察されなかったことから高脂肪食の投与に起因した変化と考えられた。
　（ｂ）高脂肪食＋四塩化炭素１回投与後の経時的な病理組織的変化（Ｇｒｏｕｐ　３～５）
　高脂肪食＋四塩化炭素の１回投与群（Ｇｒｏｕｐ　３～５）において、高脂肪食対照群（Ｇｒｏｕｐ　２）と同様に、小脂肪滴が中心静脈周囲から小葉中間帯において認められた（図１Ｃ）。しかし、これらの群においては、ＮＡＦＬＤに観察される大滴性脂肪肝、及びＮＡＳＨに観察される肝細胞の風船様細胞や線維化などの所見は確認されなかった（表４、５，図１Ｃ）。
　（ｃ）高脂肪食＋四塩化炭素の投与回数増加に伴う病理組織的変化（Ｇｒｏｕｐ　６～９）
　高脂肪食＋四塩化炭素の複数回投与群（Ｇｒｏｕｐ　６～９）では大滴性脂肪肝が認められた（図１Ｄ）。この大滴性脂肪肝は四塩化炭素の投与回数の増加に伴い、発生頻度が高く、かつ強くなる傾向が認められた（表４、５）。一方、中心静脈周囲における小脂肪滴は減少する傾向が認められた（表４、５）。これまでに大滴性脂肪肝及び小脂肪滴の相互関係についての報告はないが、大滴性脂肪肝は四塩化炭素の複数回投与に起因した変化であると考えられた。さらに四塩化炭素の複数回投与群（Ｇｒｏｕｐ　６～９）において肝細胞の風船様腫大が中心静脈周囲に５例中２～３例の割合で各群に認められた（図１Ｅ）。
　また、高脂肪食＋四塩化炭素を４回以上投与した群（Ｇｒｏｕｐ　７～９）では、中心静脈周囲においてリンパ球を主体とした炎症細胞浸潤（炎症）及び軽度の線維化が観察された（図１Ｆ，図２Ｄ）。炎症細胞浸潤（炎症）の発生頻度は、投与回数に比例して増加する傾向が認められた（表４、５）。線維化は中心静脈周辺かつ肝細胞を取り囲むように認められ（図２Ｄ）、５例中３～４例の割合で各群に認められた（表４、５）。しかし、ヒトの肝硬変で報告されているようなｂｒｉｄｇｉｎｇ　ｆｉｂｒｏｓｉｓまで進行した線維化像はすべての群において認められなかった。
　病理組織学的検査の結果、高脂肪食＋四塩化炭素を１回投与した群（Ｇｒｏｕｐ　３～５）においては、肝細胞内に小脂肪滴の蓄積のみ認められたが、高脂肪食＋四塩化炭素を４回以上投与した群においては、臨床でのヒトＮＡＳＨで報告されている大滴性脂肪肝、中心静脈周囲の炎症細胞浸潤（炎症）、中心静脈周囲の肝細胞の風船様腫大及び中心静脈周囲の線維化が観察された。高脂肪食＋四塩化炭素を４回以上投与した群のうち、高脂肪食＋四塩化炭素の４回投与群（Ｇｒｏｕｐ　７）及び高脂肪食＋四塩化炭素の６回投与群（Ｇｒｏｕｐ　８）では５例中１例、高脂肪食＋四塩化炭素の８回投与群（Ｇｒｏｕｐ　９）では５例中３例が、Ｍａｔｔｅｏｎｉらが分類したＮＡＳＨの診断基準（表３のＴｙｐｅ　４）に一致することが明らかになった。
（ｄ）血液生化学性状（Ｇｒｏｕｐ　１、９）
　血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ、遊離脂肪酸、中性脂肪を測定したところ、高脂肪食＋四塩化炭素の８回投与群（Ｇｒｏｕｐ　９）で通常食群（Ｇｒｏｕｐ　１）に対して有意に高かった（表６）。
　ＡＳＴ、ＡＬＴ、遊離脂肪酸、中性脂肪は、ヒトＮＡＳＨ患者でも健常人に比べて上昇していることが報告されており、ヒトＮＡＳＨと同様の結果が得られた。
　今回の結果から、マウスでは高脂肪食の単独投与のみではＮＡＳＨ様病変は誘発されず、高脂肪食の給餌かつ四塩化炭素の単回投与及び２回投与の場合においても、ＮＡＳＨ様病変は誘発されないことが明らかとなった。また、四塩化炭素を単回投与してから７２時間経過させても、症状が進行することはなく、ＮＡＳＨ様病変は誘発されないことが明らかとなった。
　一方、四塩化炭素を４回以上投与することでＮＡＳＨ様病変が誘発されること、さらに四塩化炭素の投与回数の増加によりＮＡＳＨ様病変が強くかつ高頻度に誘導されることが明らかとなった。
　また、四塩化炭素８回投与群では、血液生化学性状もヒトＮＡＳＨと類似した結果を示すことが明らかとなった。
　ＮＡＳＨの発生機序については十分明らかにされておらず、複数回に渡って肝臓に障害を与えることでＮＡＳＨが誘発されるとの報告もない。今回の結果から、肝障害剤を、通常、肝障害を生じさせる量である１ｍｌ／ｋｇ体重／回よりも低用量で、かつ４回以上投与することにより、ＮＡＳＨ様病変が誘発されることが明らかとなった。ＮＡＳＨの発生機序が未だ不明確な点に鑑みると、ＮＡＳＨ様病変が前記の方法により誘発される理由は、不明である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
実施例２
　四塩化炭素の投与量を０．２５ｍＬ／ｋｇ体重とした以外は、実施例１と同様に四塩化炭素皮下投与８回（２回／週）を行った。
　その結果、表７に示す病理組織所見、図３、４に示す肝臓症状を有するＮＡＳＨモデルマウスを得た。このマウスは、中心静脈周囲に炎症を呈し、線維化を生じており、また、大滴性脂肪肝、肝細胞の風船様腫大を呈した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例３
（１）試験群および試験スケジュール
　以下の実験は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系統、７週齢のマウスを用いて行った。通常食群は、一般的な飼育飼料であるＡＩＮ９３Ｇを１２週間摂取させた試験群である。コントロール群にはＮＡＳＨ発症のため、１２週間の高脂肪食摂取と９～１２週目にかけて四塩化炭素（初回：０．０５ｍｌ／ｋｇ　体重、２回目以降：０．１ｍｌ／ｋｇ体重）を週２回、合計８回皮下投与した。各乳酸菌投与群には、コントロール群の高脂肪食をベースとして各凍結乾燥菌末を０．０５％混餌した飼料を摂取させた（飼料中の菌数：菌末は培養液を凍結乾燥して製造した。飼料１ｇ中の菌数は以下の式で求める：培養液中の培養終了時の生菌数／凍結乾燥で製造された菌末量（ｇ）×飼料１ｇ中の菌末の重量（ｇ）。Ｌ．Ｃｒｉｓｐａｔｕｓ：２．４７×１０１２／１．７５４×０．０００５＝７．０４×１０８／ｇ、Ｂ．Ｂｉｆｉｄｕｍ：２．７４×１０１２／１．５５×０．０００５＝８．８４×１０８／ｇ、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ：７．３６×１０１２／２．７３７×０．０００５＝１．３４×１０９／ｇ、Ｌ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：２．４×１０１２／２．９９５×０．０００５＝４．０１×１０８／ｇ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：４．６×１０１１／２．４４４×０．０００５＝９．４１×１０７／ｇ）。四塩化炭素の投与方法および投与タイミングはコントロール群と同じである。ＡＩＮ９３Ｇ、高脂肪食および乳酸菌菌末を含有した高脂肪食の組成は表９に記載した。各試験ともに飼料および飲料水は自由に摂取させた（マウス１匹あたりの飼料の平均摂取重量　通常食：２．４ｇ／日、コントロール：２．５ｇ／日、Ｌ．Ｃｒｉｓｐａｔｕｓ：２．４ｇ／日、Ｂ．Ｂｉｆｉｄｕｍ：２．４ｇ／日、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ：２．４ｇ／日、Ｌ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：２．４ｇ／日、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：２．６ｇ／日）。
　四塩化炭素を最終投与してから２４時間後に剖検を行ない、血液および臓器を採取した。血液から血清を調製しＡＳＴ、ＡＬＴの測定に用いた。また採取した肝臓は、病理組織解析用として１０％中性緩衝ホルマリン溶液に浸漬し保存した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
（２）血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ値の測定
　血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ値はトランスアミナーゼＣＩＩ　テストワコー（和光純薬）を用いて測定した。操作はマニュアルに従って行なった。
（３）病理組織解析
　各試験群、３～４個体の肝臓を病理組織解析に用いた。ホルマリン溶液にて固定した肝臓を常法により切り出し、パラフィン包埋後、パラフィンブロックを約４μｍの厚さに薄切し、Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－Ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色を施して、光学顕微鏡にて観察した。さらにコラーゲン線維を証明するためにパラフィン切片にＭａｓｓｏｎ’ｓ　ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（ＭＴ）染色を実施した。
　病理組織の診断項目として小葉内炎症、線維化を調べた。
　病態のグレーディングは、肝臓切片の全視野を観察して、病態が認められない：－（陰性）、病態が全視野の２０％以下：±（極軽度）、病態が全視野の２０～５０％：＋（軽度）、病態が全視野の５０～８０％：＋＋（中程度）、病態が全視野の８０％以上：＋＋＋（重度）とした。
（４）結果
（ａ）血清中のＡＳＴ，ＡＬＴ値の測定
　血清中のＡＳＴ値を測定したところ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ群では有意な低下が認められた（Ｌ．　ｐｌａｎｔａｒｕｍ　ｐ＝０．０２６、　Ｌ．ｓａｒｉｖａｒｉｕｓ　ｐ＝０．０２１）。Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ群では低下の傾向が認められた（ｐ＝０．０７）。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ群でも低下の傾向が認められた。また血清中のＡＬＴ値を測定したところ、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ群では有意な低下が認められた（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ　ｐ＝０．０３１、　Ｌ．　ｐｌａｎｔａｒｕｍ　ｐ＝０．０１２、Ｌ．　ｓａｒｉｖａｒｉｕｓ　ｐ＝０．００８）。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ群では低下の傾向が認められた（ｐ＝０．０５４）。しかし、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ群については、ＡＳＴ、ＡＬＴともに顕著な低下は認められなかった。ＡＳＴの結果を表１０に示す。ＡＬＴの結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
（ｂ）病理組織解析
　肝臓の病理組織解析を行ない、菌体投与が肝臓におよぼす影響を調べた。その結果、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ群、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ群、Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ群の一部の個体では小葉内炎症がコントロール群に比べて軽微であった。また、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ群、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの一部の個体では、線維化がコントロール群に比べて軽微であった。結果を図５、表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　マウス１匹が一日あたりに摂取する菌数は、Ｂ．Ｂｉｆｉｄｕｍ：２．１２×１０９、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ：３．２×１０９、Ｌ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：９．６２×１０８、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：２．４５×１０８である。使用したマウスの体重は約３７ｇであるから、マウス摂取量は、Ｂ．Ｂｉｆｉｄｕｍ：５．７３×１０１０／ｋｇＢＷ／日、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ：８．６５×１０１０／ｋｇＢＷ／日、Ｌ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：２．６×１０１０／ｋｇＢＷ／日、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：６．６２×１０９／ｋｇＢＷ／日である。アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）のガイダンスに従い、マウス摂取量をヒト摂取量に換算すると（計算方法：ヒト投与量（／ｋｇＢＷ／日）＝マウス投与量（／ｋｇＢＷ／日）×３（マウス体表面換算係数）／３７（ヒト体表面換算係数））、ヒト摂取量は、Ｂ．Ｂｉｆｉｄｕｍ：４．６５×１０９／ｋｇＢＷ／日、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ：７．０１×１０９／ｋｇＢＷ／日、Ｌ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：２．１１×１０９／ｋｇＢＷ／日、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：５．３７×１０８／ｋｇＢＷ／日である。ヒトの体重を７０ｋｇとすると、マウスと同様の効果を奏するために、ヒト１人が一日に摂取すべき菌数は、Ｂ．Ｂｉｆｉｄｕｍ：３．２６×１０１１、Ｌ．Ｐｌａｎｔａｒｕｍ：４．９１×１０１１、Ｌ．Ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ：１．４８×１０１１、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：３．７６×１０１０である。これはいずれも特表２００５－５１２５９０号公報に記載の１兆８０００億（１．８×１０１２）よりも少ない。したがって、本願発明の乳酸菌は、特表２００５－５１２５９０号公報に記載の乳酸菌よりも少ない菌数で、より高い効果を奏するという有利な点をもつものである。
　以上の結果から、ＮＡＳＨモデル動物を用いて、ＮＡＳＨ予防治療剤のスクリーニングができることが示され、被験物質のＮＡＳＨ予防治療効果の評価も可能であることが示された。

Claims (23)

  1. 　高脂肪食を摂取させ、肝障害剤を４回以上投与することにより得られるＮＡＳＨモデル動物。
  2. 　高脂肪食が、脂肪を４０～６０質量％含むものである請求項１記載のＮＡＳＨモデル動物。
  3. 　肝障害剤の投与量が０．０５～０．５ｍＬ／ｋｇ体重／回である請求項１又は２記載のＮＡＳＨモデル動物。
  4. 　肝障害剤の投与回数が４～８回である請求項１～３のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物。
  5. 　肝障害剤の投与が皮下投与である請求項１～４のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物。
  6. 　高脂肪食の摂取期間が、２週間以上である請求項１～５のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物。
  7. 　肝障害剤が、四塩化炭素である請求項１～６のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物。
  8. 　ＮＡＳＨモデル動物がマウスである請求項１～７のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物。
  9. 　大滴性脂肪肝であり、肝臓の小葉内の中心静脈周囲に炎症があり、肝細胞が風船様に腫大している請求項１～８のいずれか１項に記載のＮＡＳＨモデル動物。
  10. 　肝組織が線維化している請求項１～９のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物。
  11. 　血清中のＡＳＴ、ＡＬＴ、遊離脂肪酸、中性脂肪から選ばれる１以上が、通常飼料で飼育された動物に比べて高いものである請求項１～１０のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物。
  12. 　血清中のＡＳＴが２００Ｕ／Ｌ以上であり、ＡＬＴが３００Ｕ／Ｌ以上であり、遊離脂肪酸が１０００μＥｑ／Ｌ以上であり、中性脂肪が２０ｍｇ／ｄＬ以上である請求項１～１１のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物。
  13. 　大滴性脂肪肝であり、肝臓の小葉内の中心静脈周囲に炎症があり、肝細胞が風船様に腫大しているＮＡＳＨモデル動物。
  14. 　高脂肪食を摂取させ、肝障害剤を４回以上投与することを特徴とするＮＡＳＨモデル動物の作製方法。
  15. 　高脂肪食が、脂肪を４０～６０質量％含むものである請求項１４記載のＮＡＳＨモデル動物の作製方法。
  16. 　肝障害剤の投与量が０．０５～０．５ｍＬ／ｋｇ体重／回である請求項１４又は１５記載のＮＡＳＨモデル動物の作製方法。
  17. 　肝障害剤の投与回数が４～８回である請求項１４～１６のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物の作製方法。
  18. 　肝障害剤の投与が皮下投与である請求項１４～１７のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物の作製方法。
  19. 　高脂肪食の摂取期間が、２週間以上である請求項１４～１８のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物の作製方法。
  20. 　肝障害剤が、四塩化炭素である請求項１４～１９のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物の作製方法。
  21. 　ＮＡＳＨモデル動物がマウスである請求項１４～２０のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物の作製方法。
  22. 　請求項１～１３のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物を用いることを特徴とする、ＮＡＳＨ予防治療剤のスクリーニング方法。
  23. 　請求項１～１３のいずれか１項記載のＮＡＳＨモデル動物を用いることを特徴とする、被験物質のＮＡＳＨ予防治療効果の評価方法。
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