WO2012177075A2 - 항생제 및 라이소포스파티딜콜린을 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료용 조성물 - Google Patents

항생제 및 라이소포스파티딜콜린을 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • composition for the treatment of immune enhancing or bacterial infectious diseases comprising antibiotics and lysophosphatidylcholinol
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating immune enhancing or bacterial infection disease comprising lysophosphatidylcholine or an analog thereof, and an antibiotic as an active ingredient, a method for treating immune enhancing or bacterial infection disease, comprising administering the substance, and It relates to a kit for the treatment of immune enhancing or bacterial infectious diseases comprising said substance. [Background technology]
  • Bacterial infection disease is a disease that occurs when bacteria start to live in the blood, body fluids and tissues, and is a great threat to humans due to the increase of antibiotic resistant microorganisms and the lack of development of new antibiotics.
  • Bacterial infectious diseases include peritonitis, pneumonia, osteomyelitis, cellulitis, meningitis, nephritis, enteritis, gastritis, esophagitis, duodenitis, colitis and sepsis. These bacterial infectious diseases are associated with fever conditions with neutrophil reduction, in which the immune system does not properly respond to infection, or with infection at suppression of the immune system (e.g. in patients receiving immunodeficiency diseases or immunosuppressants such as AIDS). Fever may be accompanied by a decrease in neutrophils. Recently, due to the increased expression of resistant bacteria to antibiotics, the difficulty in the treatment of bacterial infection diseases is increasing.
  • sepsis refers to a condition in which a serious inflammatory reaction occurs in the whole body due to infection with a microorganism.
  • sepsis In the United States alone, more than 200,000 people die per year from sepsis (Hoyert et al. Deaths: final data for 1997. Nat J. Vital Stat. Rep. 47: 1-104 (1999)). It is known to impair immune function by a deficiency of immunity and excessive lymphocytosis. Immune suppression has been consequently considered as an important factor in the death from sepsis and from defects in immune function by high dose chemotherapy or radiation therapy. Recovery remains an important clinical problem.
  • IFN-Y interferon-gamma
  • Lysophosphatidylcholine is a major component of oxidized low-density lipid proteins and is known to be useful in the treatment of sepsis (Yan et al. Therapeutic effects of lysophosphat idyl cho 1 ine in experimental sepsis.Nat. Med. 10: 161-167 (2004).
  • LPC Lysophosphatidylcholine
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a method for maximizing the therapeutic effect of lysophosphatidylcholine in high volume infections.
  • the present invention was completed by confirming that the administration of lysophosphatidylcholine and antibiotics significantly increased the therapeutic effect against immune enhancing or bacterial infectious diseases than when antibiotics or lyosatidylcholine were administered alone.
  • Still another object of the present invention is to provide a kit for treating immune enhancing or bacterial infectious diseases.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the treatment of immune enhancing or bacterial infectious diseases comprising (i) lysophosphatidylcholine or an analog thereof and (ii) an antibiotic as an active ingredient.
  • the present inventors have made intensive efforts to develop a method for maximizing the therapeutic effect of lysophosphatidylcholine in high volume infections.
  • the present invention was completed by confirming that the administration of lysophosphatidylcholine and antibiotics significantly enhanced the therapeutic effect against immune enhancing or bacterial infectious diseases than administration of antibiotics or lysopatidylcholine alone.
  • lysophosphatidylcholine or an analog thereof generally refers to an analog of phosphatidylcholine, with one fatty acid group removed as a result of partial hydrolysis of phosphatidylcholine by phospholipase enzymatic activity.
  • the present invention includes, without limitation, lysophosphatidylcholine and its analogs as long as they have a therapeutic effect on bacterial infectious diseases through immune boosting or immune boosting when used in combination with antibiotics.
  • lysophosphatidylcholine of the present invention is a compound represented by the following formula (1), or an ether analog of lysophosphatidylcholine represented by the following formula (2).
  • 3 ⁇ 4 is C 4 - alkenyl is the 30-or 30-alkyl, C 4, with one or more of the double bonds.
  • the compound of formula 1 of the present invention is La- lysophosphatidylcholine, stearoyl ( L ⁇ a- Lysophosphatidylcholine, Stearoyl; Lysolecithin, stearoyl); L— A —lysophosphatidylcholine, myristoyl (L ⁇ ⁇ ⁇ Lysophosphat idyl cho line, myr istoyl); L _a lyso phosphatidylcholine, palmitoyl ( L - a- Lysophosphatidylcholine, Palmitoyl; Lysolecithin, palmitoyl); DL - a - Lai bovine phosphatidylcholine, palmitoyl (DL - a - Lysophosphat i dy 1 cho 1 i ne, Palmitoyl); Is selected from the group consisting of; (Lysolecithin, oleo
  • the compound of formula 2 of the present invention is L - a -lysophosphatidylcholine, x- 0-alk-1-enyl (La-Lysophosphatidylcholine, -O-Alk-1-Enyl; Lysophosphat i da 1 cho 1 ine; 1; lysophosphatidylcholine , 0 ⁇ 3 ⁇ 4 : 3 ⁇ 4 (L- a -Lysophosphat i dy 1 cho 1 ine , ⁇ e Alky 1; Lyso ⁇ pi at e let act i vat ing factor)! DL -a-lysophosphatidylcholine, ⁇ ⁇ 0-nucleodecyl ( DL -a-a-
  • Lysophosphatidylcholine and its analogs are endogenous in mammals As it is a substance, safety is no less than proven.
  • the lysophosphatidylcholine of the present invention is an isomer thereof.
  • antibiotic is a metabolite produced by microorganisms, a substance that inhibits or kills the development of other microorganisms in a small amount, and includes both those made from antibiotics originally found in nature and chemically synthesized.
  • the antibiotics of the present invention may be administered in combination with lysophosphatidylcholine or an analog thereof, and include, without limitation, any antibiotics capable of maximizing the immune effect of lysophosphatidylcholine or an analog thereof or treating a bacterial infection disease.
  • the antibiotic of the present invention is a carbapenem antibiotic, a cephalosporin antibiotic, a glycopeptide antibiotic, a penicillin antibiotic, a quinolone antibiotic, a serine protease augin (serine) protease antibiotics, polymyxin antibiotics, aminoglycoside antibiotics, bacteriostatic antibiotics, and combinations of these antibiotics.
  • the carbapenem antibiotic includes doripenem
  • the cephalosporin antibiotic includes ceftriaxone sodium
  • the glycopeptide antibiotic is vancomycin hydrochloride.
  • the penicillin-based antibiotics include potassium benzylpenici 11 in
  • the quinolone antibiotics include DW286 (7— [3- (ami nomethyl ⁇ (me t hoxy imi no) -3-me).
  • the ratio between lysophosphatidylcholine or an analog thereof and an antibiotic included in the composition of the present invention may be determined according to the type of antibiotic included.
  • the weight ratio between lysophosphatidylcholine or analogs thereof and antibiotics included in the composition of the present invention is 1: 0.1-45, preferably 1: 0.2-45, more preferably 1 : 0.3-45, even more preferably 1: 0.4-45, even more preferably 1: 0.5-45.
  • the increase ratio between lysophosphatidylcholine or an analog thereof and an antibiotic included in the composition of the present invention is 1: 0.1-44, preferably 1: 0.2-44, more preferably May be 1: 0.3-44, even more preferably 1: 0.4-44, and even more preferably 1: 0.5-44.
  • the increase ratio between lysophosphatidylcholine or an analog thereof and an antibiotic included in the composition of the present invention is 1: 0.1-43, preferably 1: 0.2-43, more preferably May be 1: 0.3 ⁇ 43, more preferably 1: 0.4—43, and even more preferably 1: 0.5-43.
  • the weight ratio between lysophosphatidylcholine or an analog thereof and an antibiotic included in the composition of the present invention is 1: 0.1-42, preferably 1: 0.2-42, more preferably 1: 0.3 ⁇ 42, even more preferably 1: 0.4-42, even more preferably 1: 0.5-42.
  • the weight ratio between lysophosphatidylcholine or its analog and antibiotic contained in the composition of the present invention is 1: 0.1-41, preferably 1: 0.2 1:41, more preferably 1: 0.3-41, even more preferably 1: 0.4-41, even more preferably 1: 0.5-41.
  • the weight ratio between lysophosphatidylcholine or an analog thereof and an antibiotic included in the composition of the present invention is 1: 0.1-40, preferably 1: 0.2-40, more preferably 1: 0.3-40, even more preferably 1: 0.4-40, even more preferably 1: 0.5-40.
  • the term "DW286” may be used interchangeably with "DW286AA” or "DW286aa”.
  • the weight ratio between DW286 and lysophosphatidylcholine or an analog thereof contained in the composition of the present invention is 1: 0.1-5, preferably 1: 0.2-5, more preferably 1: 0.3-5, even more preferably 1: 0.4-5, even more preferably 1: 0.5-5, even more preferably 1: 0.6-5, even more preferably 1: 0. More preferably 1: 0.8-5, even more preferably 1: 0.9-5, even more preferably 1: 1-5, even more preferably 1: 1-4, even more preferably 1: 1-3, even more preferably 1: 2.
  • the present invention relates to a composition exhibiting a synergistic effect in the treatment of immune boosting or bacterial infectious diseases by the co-administration of antibiotics with lysophosphatidylcholine or an analog thereof.
  • the synergistic effect is a single effect when two or more ingredients are combined and used. It means to exhibit an effect that is higher than the sum of the effects exerted on the ingredient administration or an unexpected effect.
  • the term "combination" means the administration of a combination of two or more components simultaneously, or the administration of each of these components sequentially.
  • LPC LPC and DW286, Mix group (LPC: DW286 2: 1), and LPC-DW286 group (LPC pre-administration Post-DW286 administration group), E 286-LPC group (LPC-administered group after DW286 pre-administration), LPC-only group, and DW286-only group were evaluated in CPA-CLP induced sepsis mice and CPA-treated immunosuppressive and / or mutated mice It was.
  • the survival rate of the mouse model showed a high survival rate in the DW286-LPC group (Tables 12 and 13). Observation of the changes showed that the DW286-LPC group effectively inhibited the decrease in lymph organ weight caused by CPA administration (Table 15). Furthermore, as a result of observing the changes in blood leukocyte counts, the significant increase in leukocyte counts was found to be limited to the DW286-LPC group (Table 16), and the change in fractional counts of leukocytes was also higher in the DW286-LPC group than in the LPC alone group. Excellent effects were shown (Table 16).
  • the DW286-LPC group showed a high tendency to suppress the decrease and spleen atrophy of lymphocyte cells compared to the other groups (FIGS. 7 and 8) (Table 18).
  • immunohistochemistry of the thymus and spleen resulted in a significant decrease of CD3 +, CD4 +, CD8 + and TNF-a + cells in the spleen and thymus by CPA, but the combination of LPC and DW286-LPC was induced by CPA administration.
  • the combination formulation composition of the present invention is effective in the treatment of bacterial infection disease by immune enhancement or immune enhancement.
  • bacterial infectious disease refers to a disease caused by direct or indirect effects from bacteria infiltrated in vivo that can be treated by immune boosting, and is a disease infected after the immune system is suppressed. Even without a decrease in the number of patients with immunodeficiency diseases such as AIDS or immunosuppressive drugs, including fever or resistance to antibiotics.
  • the bacterial infection disease of the present invention includes peritonitis, pneumonia, osteomyelitis, cellulitis, meningitis, nephritis, heartitis, enteritis, gastritis, esophagitis, duodenitis, colitis, or sepsis.
  • peritonitis was induced by performing CLP (Cecal Ligation and Puncture).
  • CLP Cercal Ligation and Puncture
  • CLP Cal Ligation and Puncture
  • the term "immune” is a self-defense system existing in an animal body, and the various substances and living organisms that invade from the outside are considered to be oneself. A biological phenomenon that distinguishes and removes this intruder.
  • the term 'immune boost' refers to an increase in the specific or nonspecific, cellular immunity and / or humoral immune response of the host.
  • the composition of the present invention exhibits an immune enhancing effect through the combined administration of antibiotics and LPCs or analogs thereof even in a state where immunity is suppressed, and is useful in the treatment of bacterial infectious diseases eventually through such immune enhancement.
  • composition of the present invention comprises a pharmaceutically acceptable carrier and can be formulated for human or veterinary use.
  • compositions for oral administration may be presented as discrete units such as capsules or tablets; Powder or granules; Solvents, syrups or suspensions (in aqueous or non-aqueous liquids; edible blowing agents or whips; or emulsions).
  • Suitable excipients for tablets or hard gelatin accelerators are lactose, corn starch or derivatives thereof, stearic acid or salts thereof.
  • Suitable excipients for use in soft gelaline capsules include, for example, vegetable oils, waxes, fats, semi-solids or liquid polys. Excipients that can be used to prepare solvents and syrups are, for example, water, polyols and sugars.
  • oils such as vegetable oils can be used to provide oil-in-water or water-in-oil suspensions.
  • Pharmaceutical compositions adapted for transdermal administration can be presented as separate patches to enable intimate contact with the epidermis of the recipient for a long time.
  • compositions for parenteral administration include aqueous and non-aqueous sterile injectable solutions which may contain antioxidants, buffers, bacteriostats and solutes (which are substantially isotonic with the recipient's blood); And aqueous and non-water sterile suspending agents which may include suspending agents and thickening agents.
  • Excipients that can be used in the injectable solvents include, for example, water, alcohols, polys, glycerin and vegetable oils.
  • Such compositions may be presented in unit-dose (single) or multi-dose (several) containers, such as sealed ampoules and vials, and immediately before use, in sterile liquid carriers such as injectable water. Can be stored under freeze-drying conditions requiring only the addition of.
  • Immediate injection solutions and suspensions can be prepared from sterile powders, granules and tablets.
  • the invention provides a method of treating an immune enhancing or bacterial infectious disease comprising administering to a subject a therapeutically effective amount of (i) lysophosphatidylcholine or an analog thereof, and (ii) an antibiotic. to provide.
  • the lysophosphatidylcholine or its analogs, antibiotics, immune enhancing and bacterial infectious diseases are as described above, and in order to avoid excessive complexity by unnecessary repetitive description of the present specification, the common matters are described. Omit.
  • the concomitant administration of the substance may simultaneously or sequentially administer (i) lysophosphatidylcholine or an analog thereof, and ( ⁇ ) antibiotics, depending on the type of each antibiotic.
  • Dosing findings include factors such as the type and severity of the patient's disease, age, sex, drug activity, drug sensitivity, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, concurrent use of drugs, and other well-known factors in the medical field. It can be determined according to.
  • antibiotics and / or lysophosphatidylcholine or an analog thereof may be administered several times.
  • DW286 may be administered first, followed by lysophosphatidylcholine or an analog thereof.
  • DW286-administered group after LPC pre-administration DW286-LPC group (LPC-administered group after DW286 pre-administration), LPC-only group and DW286-only group were administered in CPA-CLP-induced sepsis mice and CPA-treated immunosuppressive and / or mutated mice.
  • the combination of antibiotic and LPC group showed higher immune enhancing effect and bacterial infection treatment than the single group, and the LPC group after DW286 pre-administration than the LPC-DW286 group after the LPC pre-administration.
  • the highest immune enhancing effect and bacterial infection treatment were shown.
  • the term "individual” refers to humans and mammals such as cows, horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, dogs, etc. that require immune enhancement, have bacterial infections, or are at risk of bacterial infections. Means, but is not limited thereto.
  • Antibiotics of the invention, and lysophosphatidylcholine or analogs thereof Administration to an individual can enhance immunity or treat bacterial infectious diseases.
  • the term "administration” means introducing a substance into an individual in any suitable manner, and the route of administration may be administered via any general route as long as it can reach the target tissue.
  • Lysophosphatidylcholine or analogs thereof, and antibiotics of the present invention may be administered in a therapeutically effective amount.
  • the term "therapeutically effective amount” means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level is defined as the disease type and severity, age, sex, Activity, sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of the drug, and other factors well known in the medical arts.
  • the agent may be administered single or multiple. In consideration of all the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the invention provides a kit for the treatment of an immune enhancing or bacterial infectious disease wherein (i) lysophosphatidylcholine or an analog thereof, and ( ⁇ ) antibiotics are contained in a single or separate container. .
  • the lysophosphatidylcholine or its analogs, antibiotics, immune boosting and bacterial infectious diseases are as described above, and in order to avoid excessive complexity due to unnecessary repetitive description of the present specification, the descriptions thereof are omitted. do.
  • the kit of the present invention comprises a separate amount of lysophosphatidylcholine or an analog thereof and an antibiotic It is contained in a container and may contain instructions for use of a pharmaceutically acceptable carrier kit.
  • the instructions provide a method of combining antibiotics, and LPCs or analogs thereof for the treatment of immune enhancing or bacterial infectious diseases; Order of administration or method of administration of LPC or an analog thereof after antibiotic administration; Or after the administration of the LPC or analog thereof, the sequence of administration or method of administration.
  • Concomitant administration of lysophosphatidylcholine or an analog thereof in combination with an antibiotic according to the present invention exerts a synergistic effect in terms of immune enhancing or therapeutic effects of bacterial infectious diseases.
  • the present invention can be usefully used for the treatment of diseases in which the immune system is suppressed through infection, and diseases infected after the immune system is suppressed, which can significantly improve the therapeutic effect of existing antibiotics or lysophosphatidylcholine.
  • Figure 1 is a simplified diagram showing the LPC administration group and the sequence of administration of the CPA-CLP induced model.
  • Figure 2 is a simplified diagram showing the administration group and the sequence of administration of LPC isomers and antibiotics of the CPA-CLP induced model.
  • Figure 3 is a simplified diagram showing the administration group and the order of administration of LPC and ciprotloxacin hydrochloride, benzylphenicillin potassium and ceftriaxone sodium in the CPA-CLP-induced model.
  • Figure 4 is a simplified diagram showing the administration group and the order of administration of LPC and doripenem, vancomycin hydrochloride, DW286aa, drotrecozin alpha (activated) of the CPA-CLP-induced model.
  • Figure 5 is a simplified diagram showing the administration of LPC and colistin, tobramycin, fusidic acid and the sequence of administration of the CPA-CLP-induced model.
  • Figure 6 is a simplified diagram showing the administration group and the order of administration of LPC and DW286AA in CPA-CLP induced model and CPA-induced immunosuppression model.
  • FIG. 7 is a CPA treatment group INTACT (a) ⁇ CPA control (b), LPC (c), Mix (d), DW286—shows histopathological profiles of the thymus in the LPC (e), LPC-DW286 (f), and DW285 (g) groups.
  • CPA control detected a decrease in lymphocyte cells in the thymus cortex.
  • this change in atrophy was effectively suppressed by the treatment of LPC, LPC-DW286, and DW286-LPC group, showing the highest inhibition tendency in the DW286-LPC group compared to other groups.
  • FIG. 8 shows spleen in INTACT (a), CPA control (b), LPC (c), Mix (d), DW286-LPC (e), LPC ⁇ DW286 (f), and DW285 (g) groups in CPA treatment group. It shows histopathological profile of. CPA control detected significant spleen atrophy and a decrease in lymphocyte cells. However, this change in atrophy was effectively suppressed by the treatment of LPC, LPC-DW286 and DW286—LPC group, showing the highest tendency of inhibition in the DW286-LPC group compared to other groups.
  • FIG. 9 shows spleen in INTACT (a), CPA control (b), LPC (c), Mix (d), DW286-LPC (e), LPC—DW286 (f), and DW285 (g) groups in CPA treatment group.
  • Figure shows changes in CD3 + cells.
  • CPA control showed a significant decrease in splenic CD3 + cells compared to INTACT control. However, this reduction was effectively reduced in all dose groups except DW286 compared to CPA CONTROL. In particular, similar or more desirable effects were detected in the DW286-LPC group compared to the LPC group.
  • FIG. 10 shows in the spleen in the INTACT (a), CPA control (b), LPC (c), Mix (d) DW286-LPC (e), LPC-DW286 (f), and DW285 (g) groups in the CPA treatment group.
  • Figure shows changes in CD4 + cells.
  • CPA control showed a significant decrease in splenic CD3 + cells compared to INTACT control. However, this reduction was effectively reduced in all dose groups except DW286 group compared to CPA CONTROL. In particular, similar or more desirable effects were detected in the DW286—LPC group compared to the LPC group.
  • FIG. 11 shows the spleen in the INTACT (a), CPA control (b), LPC (c), Mix (d) DW286-LPC (e), LPC—DW286 (f), and DW285 (g) groups in the CPA treatment group.
  • Figure shows changes in CD8 + cells.
  • CPA control showed a significant decrease in splenic CD3 + cells compared to INTACT control. However, this reduction was effectively reduced in all dose groups except DW286 compared to CPA CONTROL.
  • the DW286-LPC group had a similar or more desirable effect than the LPC group. Detected.
  • FIG. 12 shows spleen in INTACT (a), CPA control (b), LPC (c), Mix (d) DW286-LPC (e), LPC-DW286 (f), and DW285 (g) groups in the CPA treatment group.
  • CPA contn) l showed a marked decrease in splenic CD3 + cells compared to INTACT contr. But. This reduction was effectively reduced in all dose groups except the DW286 group compared to CPA CONTROL. In particular, similar or more desirable effects were detected in the DW286-LPC group as compared to the LPC group.
  • FIG. 13 CD3 + cells in the thymus in the INTACT (a), CPA control (b), LPC, Mix (d), DW286-LPC (e), LPC-DW286 (f), and DW285 (g) group in the CPA treatment group Figure shows the change of.
  • CPA contr there was a significant decrease in thymic CD3 + cells compared to INTACT contr. However, this reduction was effectively reduced in all dose groups except DW286 compared to CPA CONTROL. In particular, similar or more desirable effects were detected in the DW286—LPC group compared to the LPC group.
  • FIG. 14 shows mammary glands in INTACT (a), CPA control (b), LPC (c), Mix (d) DW286-LPC (e), LPC-DW286 (f), and DW285 (g) groups in the CPA treatment group.
  • Figure shows changes in CD4 + cells.
  • CPA control showed a significant decrease in thymic CD4 + cells compared to INTACT control. But. This reduction was effectively reduced in all dose groups except the DW286 group compared to CPA CONTROL. In particular, similar or more desirable effects were detected in the DW286-LPC group compared to the LPC group.
  • FIG. 15 shows thymus gland in INTACT (a), CPA control (b), LPC (c), Mix (d) DW286-LPC (e), LPC-DW286 (f), and DW285 (g) groups in CPA treatment group.
  • Figure shows changes in CD8 + cells.
  • CPA contn) l showed a significant decrease in thymic CD8 + cells compared to INTACT control. However, this reduction was effectively reduced in all dose groups except DW286 group compared to CPA control. In particular, similar or more desirable effects were detected in the DW286—LPC group compared to the LPC group.
  • FIG 16 shows the INTACT (a), CPA control (b), LPC (c), in the CPA treatment group
  • TNF- ⁇ in the thymus in the Mix (d), DW286-LPC (e), LPC—DW286 (f), and DW285 (g) groups
  • CPA control TNF- ⁇ cells in the thymus gland were markedly reduced compared to INTACT control. However, this reduction was effectively reduced in all dose groups except DW286 group compared to CPA control. In particular, similar or more desirable effects were detected in the DW286-LPC group as compared to the LPC group.
  • DW286 ([7 ⁇ [3_ (am i nome thyl) -4- (met hoxy imino) -3-me thyltetr ahydrolH-l-pyrrolyl] -1 cyclopropyl-6 f luoro—4— ⁇ ⁇ 1 , 4— dihydro [1, 8] naphthyr idine-3-carboxylic acid hydrochloric acid salt], Lpt, 20021) is a novel fluoro-naphthyridine antibiotic synthesized by an anabolic drug (Anyang, Korea) and LPC (lysophosphatidylcholine 18: 0 94%, GmbH PHISPH0LIPID, Germany).
  • 1-oleyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine (l-Oleoyl-S-hydroxy-sn-glycero-S-phosphocholine, l-01eoyl, isomer of LPC; 18: 1 LPC) and Ciprofloxacin hydrochloride hydrate (Cipro,), Benzyl penicillin 3 ⁇ 4 ⁇ (Potassium benzylpenici 11 in, Peni), Ceftriaxone sodium (Ceft), Dorifem (Dor ipenem, Dor i), Vancomycin hydrochloride (Vanco), drotrecogin alpha (activated) (Drotrecogin al fa (act ivated), Xigris), colistin, tobramycin, and fusidic acid, fusidin ) Were each purchased from Sigma et al.
  • ICR mice (6 weeks of age, SIX, Japan) were used after 7 or 8 days of debulking. Animals were assigned 5 or 4 birds per polycarbonate cage to a room with controlled temperature (201 25 ° 0, humidity (4 — 45%). Species: The memorization cycle is 12 hours: 12 hours, feeding (Samyang, Korea) And water were provided in an easy-to-access manner Experiments were divided into CPA-CLP and CPA-induced immunosuppressive mouse model groups All experimental animals were 'Guide for the Care' and 'Use of Laboratory Animals by Institute of Laboratory Animal Resources , Commission on Life Science, National Research Council, USA on 1996, Washington, DC 'Example 2: Preparation of Experimental Animal Models
  • CPA Cyclophosphamide ⁇ H 2 O, Sigma, USA
  • CPA is a widely used antitumor agent and can be used alone or in combination with other products. Treatment of CPA severely damages hematopoietic and lymphoid tissues, resulting in high leukopenia when used as an antitumor agent or as an implantation conditioning regimen in bone marrow.
  • CPA is known to be biologically inactive on its own until in vivo changes by microsomal enzymes that lead to the production of many active metabolites that allow alkylation of nucleic acids. cause.
  • CPA-induced immunosuppression and / or mutated mouse models are valuable animal models for detecting anti-mutagenic or desirable immunomodulatory effects.
  • T cells in the thymus and spleen, especially CD4 and CD8, are greatly reduced with a decrease in various cytokines, including TNF- ⁇ positive cells.
  • CPA a well-known immunosuppressant
  • CPA a well-known immunosuppressant
  • mice were opened under anesthesia with ketamine hydrochloride (ICN Biochemicals Inc., USA) and xylazine hydrochloride (Wacko Pure Chemical Industries Ltd., Japan) to expose the cecum.
  • a double ligation was performed just below the Ileocecal valve, followed by two penetrations using a 22-gauge needle, and the abdominal cavity was closed in the usual manner.
  • the abdominal cavity was closed again after the cecum exposure.
  • the same amount of saline was administered in the same way instead of CPA.
  • the CLP model is the closest mimic of human acute peritonitis and has been considered the most clinically relevant animal model for sepsis and a valuable animal model for detecting antiseptic effects (Urbaschek and Urbaschek, 1987; Yan et al. 2004). Ghiselli et al. 2006; Wirtz et al. 2006). The CLP model more closely reflects the clinical course of human abdominal sepsis, with endogenous bacterial lesions leading to multi-bacterial infection with systemic inflammatory reaction syndrome (Wichterman et al. 1980; Zantl et al. 1998; Maier et al. 2000; Emmanui 1 idis et al. 2001).
  • Example 3 Experimental Method
  • mice are Under Anesthesia by Ketamine and Xylazine
  • the caecum was opened to expose the cecum, and the exposed cecum was double ligated directly under the Ileocecal valve and then penetrated twice with a 22-gauge needle and closed the abdominal cavity in the usual manner.
  • the abdominal cavity was closed again after the cecum exposure.
  • the same amount of physiological saline was administered instead of CPA.
  • CLP was performed one day after the second dose of CPA.
  • CPA-CLP model Body weight at regeneration-Body weight at CLP (5 days),
  • CPA-treat model Body weight at regeneration-Body weight at first dose (2 days).
  • the wet-weight of the spleen and thymus was measured in absolute weight, and then the relative organ weight (% of body weight) was calculated by the following formula:
  • Relative organ weight [(absolute organ weight I individual body weight at sacrifice) X 100].
  • Bone marrow specimens of the CPA-treated model were made as follows. In short, bone marrow cells were collected from the femur in 3 ml of inactivated fetal bovine serum (GIBCO BRL, USA), centrifuged and plated on slides. Samples were dried and soaked in absolute methan for 10-20 minutes. Fixed slides were stained in the following manner:
  • thymus and spleen were sampled. Sample tissue was fixed in 10% neutral complete formalin. After embedding with paraffin, 3-4 ym specimens were prepared. Representative sections were stained with hematoxylin and eosin ( ⁇ & ⁇ , Hematoxylin & Eosin Stain) for optical microscopy. The histopathological profiles of the individual organs were then observed.
  • CD3 antigen determinant detection was performed in 10 mM Tris-1 mM EDTA buffer (pH 9.0), and CIM and CD8 detection in 1 mM EDTA buffer (pH 8.0) and TNF-a in 10 mM Citrate BuffeKpH 6.0).
  • the primary anti-serum used in this experiment is shown in Table 1 below.
  • the preheated water was bathed in a staining dish containing buffer until the temperature reached 95-KX C, and the slide was allowed to cool at room temperature for 20 minutes.
  • the samples were immunostained by the following steps. First, the sections were incubated for 30 minutes in methane and 0.3% 3 ⁇ 40 2 to block resistant phenoxidase activity at room temperature and then washed three times in 0.01 M PBS pH 7.2. The sections were then incubated in a normal horse serum blocking solution for 1 hour at room temperature to prevent nonspecific binding of immunoglobulins (Vector Lab. Inc., CA, USA. Dilution 1: 100).
  • Histomorphometry out of 1000 spleen or thyroid cells, each The number of immune response cells (CD3 +, CD4 +, CD8 + and TNF-a +) (N) / 1000 splenocytes or thyroid cells were observed through automated image analysis. Calculations were performed separately from the cortex and medulla in the thymus. 3-9. Statistical analysis
  • Rate of change for INTACT contr () l ()) [((Data for CPA contr () l-Data for INTACT control) / Data for INTACT control) X 100],
  • ICR mice (6-week-old males, SIX, Japan) were a total of 7 groups (10 per group) of CPA control group (Sham surgical medium group after CPA administration), CPA-CLP control group (CLP surgical medium group after CPA administration) ), LPC 1 mg / kg after CPA-CLP, CPA—LPC 2.5 mg / kg after CLP, LPC 5 mg / kg after CPA-CLP, LPC 10 mg / kg after CPA-CLP and LPC after CP / HXP It was divided into 20 mg / kg administration group. Doses were administered at 10 ml / kg using 4% serum serum albumin as a medium for 12 hours and 4 subcutaneous administrations.
  • LPC is 5% human serum It was dissolved in albumin (Green Cross, Korea) and administered at 10 ml / kg, respectively.
  • ICR mice (6-week-old males, SIX, Japan) were a total of 10 groups (10 per group) of CPA control group (Sham surgical medium group after CPA administration), CPA-CLP control group (CLP surgical medium group after CPA administration) ), LPC 5 mg / kg after CPA-CLP, Xigris 0.4 mg / kg after CPA-CLP, Xigris 2 mg / kg after CPA-CLP, LPA 5 mg / kg after CPA-CLP, after CPA-CLP It was divided into 18: 1 LPC 5 mg / kg administration group, 18: 0 LPC 5 mg / kg administration group after CPA-CLP, DW286M 10 mg / kg administration group after CPA-CLP, and DW286M 20 mg / kg administration group after CPA-CLP.
  • LPC, Xigris, 18: 0 LPC, and DW286AA can increase survival time in sepsis patients, especially in the DW286M 10 and 20 mg / kg dose groups, with a marked increase in survival time and survival rate.
  • the LPC 5 mg / kg group showed a better effect than the Xigris 2 mg / kg group
  • the 18: 0 LPC showed a better effect than the 18: 1 LPC, showing a similar effect to the same dose of LPC.
  • isomers of LPC may support therapeutic effects of immunopotentiating or bacterial infectious diseases.
  • Example 6 CPA—Analysis of Survival of LPC and Existing Antibiotic Alone and Co-administration in a CLP-Induced Model
  • LPC 5 mg / kg
  • Cipro 20 mg / kg
  • Peni 60 mg / kg
  • Ceft 25 mg / kg
  • LPC + Ci ro 5 + 20 mg / kg
  • LPC + Peni 5 +60 mg / kg
  • LPC + Ceft 5 + 25 mg / kg
  • DW286AA 5 ing / kg
  • every single test material is sterile
  • the solution was dissolved in physiological saline and administered at 10 ml / kg, respectively.
  • each drug was directly administered by dissolving an appropriate dose in a solution containing LPC (0.5 mg / ml).
  • Such a sequence of administration and administration group is shown briefly in FIG.
  • ICR mice (6-week-old males, SIX, Japan) were a total of 10 groups (10 per group) of CPA control group (Sham surgical medium group after CPA administration), CPA-CLP control group (CLP surgical medium group after CPA administration) , LPC 5 mg / kg group after CPA-CLP, DW286M 5 mg / kg group after CPA-CLP, Cipro 20 mg / kg group after CPA-CLP, Peni 60 mg / kg group after CPA-CLP , CPA— Ceft after CLP 25 mg / kg group, LPC + Cipro 5 + 20 mg / kg group after CPA-CLP, LPC + Peni 5 + 60 mg / kg group after CPA-CLP and LPC + Ceft 5 + 25 mg / kg group after CPA-CLP Divided by.
  • LPC (5 mg / kg), DW286AA (5 mg / kg), Dori (200 mg / kg), VancodO mg / kg), Xigris (2 mg / kg), LPC + DW286AA (5 + 5 mg / kg), LPC + Dori (5 + 200 mg / kg), LPC + Vanco (5 + 10 mg / kg), and LPC + Xigr is (5 + 2 mg / kg), respectively, in CPA-CLP sepsis mice after 6 hours of CLP surgery. After intravenous administration, changes in mortality and body weight were observed. All single test substances were dissolved in sterile saline solution and administered at 10 ml / kg, respectively.
  • each drug was administered by dissolving the appropriate dose directly in the solution containing LPC (0.5 mg / ml). It was.
  • Such a sequence of administration and administration group is shown briefly in FIG. Specifically, ICR mice (6 weeks old male, SIX, Japan) were 11 groups (10 per group) of CPA control group (Sham surgical medium group after CPA administration), CPA-CLP control group (CLP surgical medium group after CPA administration) ), LPC 5 mg / kg after CPA-CLP Dosage group, DW286AA 5 mg / kg after CPA-CLP, Dori 200 mg / kg after CPA-CLP, Vanco 10: mg / kg after CPA-CLP.
  • LPC + DW286AA, LPC + Dori, LPC + Vanco and LPC + Xigr is groups, 4 (4/10; 40%), 9 (9/10; 90%), 5 () after 3 days of CLP surgery, respectively. 5/10; 50%), 4 (4/10; 40%) and 3 (3/10; 30%) live cases were recognized (Table 9).
  • LPC 5 mg / kg
  • colistin 5 mg / kg
  • tobramycin 4 mg / kg
  • fusidin 80 mg / kg
  • LPC + col ist in 5 + 5 mg / kg
  • LPC + tobramycin 5 + 4 mg / kg
  • LPC + fusidin 5 + 80 mg / kg
  • ICR mice (6-week-old male, SIX, Japan) were divided into a total of 10 soldiers CPA control group (Sham surgical media administration group after CPA administration), CPA-CLP control group (CLP surgical media administration group after CPA administration), DW286AA after CPA-CLP administration.
  • LPC (5 mg / kg), DW286AA (5 mg / kg), col ist in (5 mg / kg), tobramycin (4 mg / kg), fusdin (80 mg / kg), LPC + col ist in ( 5 + 5 mg / kg), LPC + tobramycin (5 + 4 mg / kg) and LPC + fusidin (5 + 80 mg / kg), respectively, were administered intravenously once 6 hours after CLP surgery to CPA-CLP sepsis mice. All single test substances were dissolved in sterile saline solution and administered at 10 ml / kg, respectively. In all combinations, LPC (0.5 m g / ml) Appropriate doses were administered directly to the dissolved solution, respectively. After administration, changes in mortality and body weight were observed by the method of Example 3-3. TABLE 10
  • LPC and DW286M alone, mixed (LPC: DW286M 2: 1), after LPC dose (2 times) after DW286M (2 times), after LPC after DW286AA dose to CPA-CLP mice and CPA-induced immunosuppressive mice
  • LPC and DW286AA alone, mixed (LPC: DW286M 2: 1), after LPC dose (2 times) after DW286M (2 times), after LPC after DW286AA dose to CPA-CLP mice and CPA-induced immunosuppressive mice
  • Postmortem mortality, thymic and spleen weight, blood white blood cell count, thymic and spleen numerical changes of CD3 +, CD4 +, CD8 + and TNF-a + cells were evaluated along with changes in the micronucleated polynuclear hematopoietic blood count in the bone marrow.
  • Such a sequence of administration and administration group is shown briefly in FIG. Appropriate amounts of candidates were dissolved in 5% serum serum albumin and administered at a concentration of 10 ml / kg, subcutaneously, four times at 12-hour intervals, 6 hours after surgery or 24 hours after CPA administration.
  • the same amount of 5) human serum albumin was administered in the same manner.
  • Example 3-3 By the method of Example 3-3, the number of deaths, survival and body weight were evaluated. As a result, no deaths were observed during the observation period in the INTACT and CPA CONTROL groups, but 6 and 3 deaths were observed in the CPA-CLP CONTROL group after 1 and 2 days after CLP, respectively. 9/9, 100%) died (Table 12).
  • LPC LPC-DW286 and DW286 groups, all experimental animals died after 4 days of CLP.
  • the Mix and DW286-LPC groups all experimental animals died after 5 days of CLP, and in the DW286- LPC group, compared to the Mix group. High initial survival was recognized (Table 12).
  • the slight decrease in weight gain after administration of the test substance is considered to be a secondary finding due to irritation following subcutaneous injection.
  • LPC and DW286M alone showed significant reduction in CP / HXP mortality, but showed better survival rate in DW286-LPC group than LPC and DW286M.
  • the initial survival rate was higher in the DW286 ⁇ LPC group than in the Mix (Table 13). Therefore, LPC administration after DW286M pretreatment in sepsis treatment may be expected to have a better therapeutic effect.
  • the organ weight was measured by the method of Example 3-4. As a result, the relative and absolute weight loss of spleen and thymus was observed in CPA contr compared with INTACT control. However, no significant increase in thymus weight was observed in LPC, Mix and DW286, and significant increase in spleen weight (p ⁇ 0.01) was observed in LPC, Mix and DW286-LPC, respectively (Table ⁇ 15). Table 15
  • Absolute mammary gland weights in the LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286, and DW286 groups varied by 13.31, 10.24, 7.17, 2.39, and —2.73%, respectively, and relative mammary gland weights were 7.56, 13.74, 9.51, and 5.47 compared to CPA control, respectively. And -3.12%. However, no significant increase was recognized in all dose groups.
  • Absolute and relative spleen weights showed —63.38 and _60.633 ⁇ 4> changes in the CPA control compared to INTACT contr. Absolute spleen gains varied from LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 and DW286 to 35.62, 28.77 31.28, 11.87 and —7.08%, relative weights of 40.69, 32.54, 32.96, compared to CPA contr, respectively. 14.38 and -7.46% change.
  • the total WBC count in the CPA control was -91.58% compared to the INTACT control.
  • the LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-D 286 and DW286 groups had 25.00 32.74, 61.31, 19.64 and -11.31% change compared to CPA contr, respectively. That is, it is known that a significant leukocyte reduction is generally caused by CPA administration. As a result of this experiment, it was observed that LPC suppresses the reduction of leukocytes caused by CPA administration relatively effectively, and the DW286-LPC administration group than LPC alone administration. It was confirmed that a better effect at. These results indicate that DW286 line administration is more effective in combination formulations. 9-5. Changes in WBC Fractional Counts in CPA-treated Models
  • the proportion of lymphocytes, neutrophils and monocytes in CPA control was 72.47, 88.11 and 456.43%, respectively, compared to I TACT control.
  • the proportion of lymphocytes in the LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 and DW286 groups changed to 268.78, 244.85, 290.37, 204.01 and -23.56%, and the ratio of neutrophils was -51.07, -46.05, -50.01,- 18.81 and -1.09%, and monocyte ratios were -85.27, -82.32, -91.16, -86.45 and 13.433 ⁇ 4> compared to CPA control.
  • Bone marrow micronucleated polyinflammatory red blood cells were observed by the method of Example 3-6.
  • CPA is known to increase the incidence of mutations, and is known to significantly increase micronucleated polycythemia in the bone marrow.
  • the CPA control significantly increased micronucleated polycythemia (MNPCEs) ( ⁇ .01) and decreased PCE / (PCE + NCE).
  • MNPCEs micronucleated polycythemia
  • PCE + NCE PCE /
  • n 9; (Mean sul S. D.); * p ⁇ 0.01 compared to intact control for MW days testing
  • the percentages of myeloid micronucleated polycythemia and polyinflammatory erythrocytes in CPA contml were changed by 1512.50 and -60.38% compared to I TACT control.
  • the MNPCE numbers varied by -14.34, -0.7802—12.02, -5.43, and -10.85%
  • the percentage of polyinflammatory red blood cells showed -12.98, 6.14, -11.80 -1.49 and -14.79%, respectively, compared to the CPA control.
  • Example 3-7 Histopathological changes were observed by the method of Example 3-7. As a result, a decrease in lymphocyte cells and significant spleen atrophy were detected in the CPA control in the thymic cortex. However, this change in atrophy was effectively suppressed by the treatment of LPC, LPC-D 286 and DW286-LPC. It showed the highest inhibition tendency compared to the other groups (Figs. 7 and 8). In histomorphometry, the number of white medulla in the spleen was significantly decreased in the CPA contr compared to the INTACT contr (p ⁇ 0.01 ), but significantly increased in all treatment groups except DW286 alone. Moreover, the reduction of lymphoid cells in the thymic cortex was also significantly inhibited in all dose groups compared to CPA control except the DW286 group (Table 18).
  • the number of white medulla in the spleen was -66.67% in CPA contr compared to INTACT contr. They showed 101.79, 71.43, 105.36, 101.79 and —1.79% change in the LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 and DW286 groups compared to CPA control.
  • the frequency of thymic cortical atrophy is 0, 100, 88.89, 88.89, 66.67, 77.78 and in the INTACT control, CPA control, LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 and DW286 groups. Each was observed at 10 OT. As a result of this experiment, LPC and DW286-LPC co-administration was observed to relatively effectively suppress the reduction of lymphocytes in lymphatic organs induced by CPA administration, and the better effect was observed in DW286-LPC administration group than LPC alone administration.
  • Example 3-8 Immunohistochemical analysis was performed by the method of Example 3-8. As a result, a significant decrease in CD3 +, CD4 +, CD8 + and TNF-a + cells in the spleen ( ⁇ .01) was observed in the CPA control compared to INTACT control, and a significant decrease in CD3 + and TNF ⁇ a + cells was observed in the thymus cortex. And water quality respectively. However, these cells were significantly increased compared to CPA contr in all dose groups except DW286 group. In particular, a similar or better reduction inhibitory effect was observed in the DW286-LPC group than the LPC alone group (Table 19 and FIGS. 9-16).
  • the number of CD3 +, CD4 + and CD8 + eel Is in the spleen CPA contr group was -68.32, -83.15 and -73.26% compared to INTACT control.
  • the number of CD3 + cells in the LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 and DW286 groups varied by 18.29, 77.26, 99.32, 81.03 and -14.02%, and the number of CD4 + cells 136.54, 99.76, 135.58, 79.81 and -10.82% CD8 + cells were 72.89, 48.81, 109.33, 38.83 and -10.63% compared to CPA contr.
  • the number of CD3 +, CD4 + and CD8 + cells in the CPA control group in the thyroid cortex was -75.41, 64.29 and 28.57% compared to the INTACT contr.
  • the number of CD3 + cells in the LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 and DW286 groups varied by 328.69, 216.61 323.44, 279.91 and -9.16%, and the number of CD8 + cells was 11,11, 33.33 compared to the number of CPA controls. , -7.41, 11.11 and 33.33%.
  • the number of CD3 +, CD4 + and CD8 + cells in the CPA control group in thyroid medulla showed -90.00, -8.33 and 28.57% change compared to INTACT contr.
  • the number of CD3 + cells in the LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 and DW286 groups changed to 2466.67 500.00, 2366.67, 2466.67 and -33.33%, and the number of CD4 + cells was -9.09, -18.18, compared to CPA control. -13.64, 4.55 and 27.27% change.
  • the number of CD8 + cells varied by -5.56, -11.11, -5.56, -16.67 and -22.22% compared to CPA control.
  • TNF- ⁇ + cells in the spleen, thymus cortex and medulla CPA contr showed changes of -51.73, -51.06 and 155.56% compared to INTACT contr.
  • LPC LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 and DW286 groups
  • spleen TNF-a + cells changed 36.75, 12.89, 34.84, 27.68 and -13.84%
  • TNF-a + cells in the thymus cortex were 65.22, 30.43, 60.87 , 30.43 and -13.04%
  • TNF-a + cells in the thymus medulla showed 133.33, 0.00, 0.00, 133.33 and 0.00% change compared to CPA control.
  • CPA resulted in a significant reduction in CD3 +, CD4 +, CD8 + and TNF—a + cells in the spleen and thymus, but the combination of LPC and DW286-LPC suppressed the reduction of these cells caused by CPA administration relatively effectively. It was observed that a better effect was observed in the DW286-LPC group than LPC alone.
  • LPC alone and the combination of LPC and DW286 were relatively associated with the immunosuppression induced by CPA administration and the death from sepsis caused by CPA—CLP. It was observed to inhibit effectively, especially when LPC was administered after DW286 line administration (DW286-LPC) was found to have the best effect.

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Abstract

본 발명은 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체, 및 항생제를 유효성분으로 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료용 약제학적 조성물, 상기 물질을 투여하는 단계를 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료 방법, 및 상기 물질을 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료용 키트에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭 Γ
항생제 및 라이소포스파티딜콜린올 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료용 조성물
【기술 분야】
본 발명은 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체 , 및 항생제를 유효성분으로 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료용 약제학적 조성물， 상기 물질을 투여하는 단계를 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료 방법, 및 상기 물질을 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료용 키트에 관한 것이다. 【배경 기술】
세균성 감염 질환은 세균이 혈액， 체액 및 조직 내에 출현하여 서식하기 시작하면서 발병하는 질환으로서， 항생제 저항 미생물의 증가와 더불어 새로운 항생제의 개발 부족으로 인하여 인간에게 큰 위협이 되고 있다. 세균성 감염 질환에는 복막염 , 폐렴， 골수염， 봉소염， 뇌막염， 신장염， 장염, 위염， 식도염, 십이지장염, 대장염 및 패혈증 등이 있다. 이러한 세균성 감염 질환은 감염에 대하여 면역계가 제대로 반웅하지 못하는 호중구 감소를 동반한 발열 상태， 또는 면역계의 억제 시에 (예, AIDS와 같이 면역결핍성 질환이나 면역억제제를 투여중인 환자에서) 감염에 대하여 호중구의 감소 없이 발열이 동반될 수 있다. 최근 항생제에 대한 내성균의 발현 증대로 인하여 세균성 감염 질환의 치료에 어려움이 증대되고 있다.
특히， 패혈증은 미생물에 감염되어 전신에 심각한 염증 반웅이 나타나는 상태를 말한다. 미국에서만 패혈증으로 1년에 200 ,000명이 넘는 사람이 사망하고 있으며 (Hoyert et al. Deaths: final data for 1997. Nat J. Vital Stat. Rep. 47：1-104(1999)), 패혈증은 내부 면역의 결함 및 과도한 림프구 아픕토시스에 의해 면역 기능을 손상시킨다고 알려져 있다. 면역 억제는 결과적으로 패혈증에 의한 사망에 중요한 인자로서 여겨져 왔으며， 고용량의 화학치료 또는 방사선 치료에 의한 면역기능의 결함으로부터의 회복은 중요한 임상적 문제로서 남아있다. 패혈증 환자에 있어서 인터페론 -감마 (IFN-Y )와 함께 대식세포의 활성화는 패혈증 환자에 유용한 효과를 가지며， 패혈증이 유발된 실험동물에서 호중성 백혈구 이상의 억제 및 림프구 아픕토시스의 억제 또한 패혈증 동물에 유용한 효과를 가진다고 알려져 왔다 (Yan et al. Therapeutic effects of lysophosphat idyl cho 1 ine in experimental sepsis. Nat. Med. 10:161-167(2004)).
한편, 라이소포스파티딜콜린 (Lysophosphatidylcholine, LPC)은 산화된 저 -밀도 지질 단백질의 주요 구성요소로 패혈증 치료에 유용한 것으로 알려져 있다 (Yan et al. Therapeutic effects of lysophosphat idyl cho 1 ine in experimental sepsis. Nat . Med. 10： 161- 167(2004)). 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 대량 감염에서 라이소포스파티딜콜린의 치료 효과를 극대화하기 위한 방법을 개발하기 위해 예의 노력하였다. 그 결과， 라이소포스파티딜콜린 및 항생제의 투여 시， 항생제 또는 라이소파티딜콜린을 단독으로 투여하는 경우보다 면역 증강 또는 세균성 감염 질환에 대한 치료 효과가 현저히 상승함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 면역 증강용 또는 세균성 감염 질환 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료용 키트를 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 (i) 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체, 및 (ii) 항생제를 유효성분으로 포함하는 면역 증강용 또는 세균성 감염 질환 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명자들은 대량 감염에서 라이소포스파티딜콜린의 치료 효과를 극대화하기 위한 방법을 개발하기 위해 예의 노력하였다. 그 결과, 라이소포스파티딜콜린 및 항생제의 투여 시， 항생제 또는 라이소파티딜콜린을 단독으로 투여하는 경우보다 면역 증강 또는 세균성 감염 질환에 대한 치료 효과가 현저히 상승함을 확인함으로써， 본 발명을 완성하였다.
본 명세서에서 용어， "라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체 "는 일반적으로 포스포리파제 효소활성에 의한 포스파티딜콜린의 부분적 가수분해의 결과로 하나의 지방산 그룹을 제거한 포스파티딜콜린의 유사체를 의미한다. 본 발명은 항생제와 병용하였을 때 면역 증강 또는 면역 증강을 통하여 세균성 감염 질환에 치료 효과를 가지는 한 라이소포스파티딜콜린 및 그 유사체를 제한 없이 포함한다.
본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면， 본 발명의 라이소포스파티딜콜린은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물， 또는 하기 화학식 2로 표시되는 라이소포스파티딜콜린의 에테르 유사체이다.
화학식 1
Figure imgf000005_0001
상기 식에서， Rr& C4— 30의 알킬이거나， 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 C4_30의 알케닐이고, 화학식 2
H ᅳ으
상기 식에서， ¾는 C4-30의 알킬이거나， 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 C4— 30의 알케닐이다.
바람직하게는， 본 발명의 화학식 1의 화합물은 L-a- 라이소포스파티딜콜린， 스테아로일 (Lᅳ a-Lysophosphatidylcholine, Stearoyl； Lysolecithin, stearoyl); L—A—라이소포스파티딜콜린， 미리스토일 (L一 α一 Lysophosphat idyl cho line, myr istoyl ); L_a一라이소 포스파티딜콜린， 팔미토일 (L-a-Lysophosphatidylcholine, Palmitoyl； Lysolecithin, palmitoyl); DL-a-라이소포스파티딜콜린， 팔미토일 (DL-a- Lysophosphat i dy 1 cho 1 i ne , Palmitoyl); 및 L-a-라이소포스파티딜콜린， 올레오일 (L—A一 Lysophosphat idyl choline, Oleoyl； Lysolecithin, oleoyl)로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 본 발명의 화학식 2의 화합물은 L-a- 라이소포스파티딜콜린， x-0—알크 -1-에닐 (L-a-Lysophosphatidylcholine, - O-Alk-1-Enyl； Lysophosphat i da 1 cho 1 ine)； 1피_라이소포스파티딜콜린， 0一 ¾： ¾ ( L- a -Lysophosphat i dy 1 cho 1 ine， ^ᅳ으 Alky 1； Lyso一 pi at e let act i vat ing factor)! DL-a-라이소포스파티딜콜린， χᅳ 0-핵사데실 (DL-a-
Lysophospha t i dy 1 cho 1 i ne , y -0-Hexadecyl； rac-Lyso-platelet activating factor); 및 L-α-라이소포스파티딜콜린， γ-0-핵사데실 (L-a-
Lysophosphatidylcholine , Y-0-Hexadecyl； Lysoᅳ pi ate let activating factor; Lyso-PAF-C 16)로 구성된 군에서 선택된다.
라이소포스파티딜콜린 및 그 유사체는 포유동물의 체내에 내재성 물질이므로 안전성은 입증된 것과 다름없다.
바람직하게는， 본 발명의 라이소포스파티딜콜린은 이의 이성질체
(isomer)도 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서는， 라이소포스타딜콜린의 이성질체 및 항생제의 병용 투여가 이의 단독 투여보다 면역 증강 및 세균성 감염 질환에 우수한 치료 효과를 나타냄을 확인하였다 (표 4 및 5). 본 명세서에서 용어, "항생제' '는 미생물이 생산하는 대사산물로 소량으로 다른 미생물의 발육을 억제하거나 사멸시키는 물질로서, 원래 자연계에 있던 항생물질로 만든 것과 화학적으로 합성된 것을 모두 포함한다. 본 발명의 목적상 본 발명의 항생제는 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체와 병용 투여되어， 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체의 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료 효과를 극대화할 수 있는 항생제라면 제한 없이 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 항생제는 카바페넴계 (carbapenem) 항생제， 세팔로스포린계 (cephalosporin) 항생제, 당펩타이드계 (glycopeptide) 항생제， 페니실린계 항생제， 퀴놀른계 (quinolone) 항생제， 세린 프로테아제궤 (serine protease) 항생제, 폴리믹신계 (polymyxin) 항생제， 아미노글리코시드계 (aminoglycoside) 항생제, 살균계 (bacteriostatic) 항생제， 및 상기 항생제의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
보다 바람직하게는， 상기 카바페넴계 항생제는 도리페넴 (Doripenem)을 포함하고， 상기 세팔로스포린계 항생제는 세프트리악손 나트륨 (Ceftriaxone sodium)을 포함하며, 상기 당펩타이드계 항생제는 염산반코마이신 (Vancomycin hydrochloride)을 포함하고， 상기 페니실린계 항생제는 벤질페니실린 칼륨 (Potassium benzylpenici 11 in)을 포함하며， 상기 퀴놀론계 항생제는 DW286(7— [3- (ami nomethyl ¬ (me t hoxy i m i no ) -3-me t hy 11 e t r ahydr o- 1H- 1-pyr r o 1 y 1 ] - 1-cyc 1 opr opy 1 -6- f luoro-4-oxo-l, 4-di hydro [1,8] naphthyr idine-3-carboxyl ic acid hydrochloric acid salt) 및 시프로플톡사신염산염수화물 (Ciprofloxacin hydrochloride hydrate)을 포함하고, 상기 세린 프로테아제계 항생제는 드로트레코진 알파 (활성화된) (Drotrecogin alfa(activated))를 포함하며, 상기 폴리믹신계 (polymyxin) 항생제는 콜리스틴 (colist in)을 포함하고， 상기 아미노글리코시드계 (aminoglycoside) 항생제는 토브라마이신 (tobramycin)을 포함하며， 상기 살균계 (bacteriostatic) 항생제는 푸시딘산 (fusidic acid)을 포함한다. .
본 발명에서， 본 발명의 조성물에 포함되는 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체와 항생제간의 비을은 포함되는 항생제의 종류에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물에 포함되는 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체와 항생제간의 중량비는， 1:0.1-45， 바람직하게는 1:0.2-45， 보다 바람직하게는 1:0.3-45， 보다 더 바람직하게는 1:0.4-45， 보다 더 바람직하게는 1:0.5-45일 수 있다.
본 발명의 보다 바람직한 하나의 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물에 포함되는 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체와 항생제간의 증량비는, 1：0.1-44, 바람직하게는 1:0.2-44, 보다 바람직하게는 1:0.3-44, 보다 더 바람직하게는 1:0.4-44， 보다 더 바람직하게는 1:0.5-44일 수 있다. 본 발명의 보다 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 포함되는 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체와 항생제간의 증량비는， 1:0.1-43, 바람직하게는 1:0.2-43， 보다 바람직하게는 1:0.3ᅳ43， 보다 더 바람직하게는 1:0.4—43， 보다 더 바람직하게는 1:0.5-43일 수 있다. 본 발명의 보다 바람직한 하나의 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물에 포함되는 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체와 항생제간의 중량비는, 1:0.1-42， 바람직하게는 1:0.2-42， 보다 바람직하게는 1:0.3ᅳ 42， 보다 더 바람직하게는 1:0.4-42， 보다 더 바람직하게는 1:0.5-42일 수 있다. 본 발명의 보다 바람직한 하나의 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물에 포함되는 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체와 항생제간의 중량비는, 1：0.1-41, 바람직하게는 1:0.2ᅳ 41， 보다 바람직하게는 1:0.3-41， 보다 더 바람직하게는 1:0.4-41, 보다 더 바람직하게는 1:0.5-41일 수 있다. 본 발명의 보다 바람직한 하나의 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물에 포함되는 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체와 항생제간의 중량비는, 1:0.1-40, 바람직하게는 1:0.2-40， 보다 바람직하게는 1:0.3-40， 보다 더 바람직하게는 1:0.4—40, 보다 더 바람직하게는 1:0.5-40일 수 있다. 본 명세서에서 용어， "DW286" 은 "DW286AA" 또는 "DW286aa" 와 흔용되어 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면， 본 발명의 조성물에 포함되는 DW286과 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체간의 중량비는 1:0.1-5， 바람직하게는 1:0.2-5， 보다 바람직하게는 1:0.3-5， 보다 더 바람직하게는 1:0.4-5， 보다 더 바람직하게는 1:0.5-5， 보다 더 바람직하게는 1:0.6—5， 보다 더 바람직하게는 1:0.그 5, 보다 더 바람직하게는 1:0.8-5， 보다 더 바람직하게는 1:0.9-5， 보다 더 바람직하게는 1:1-5， 보다 더 바람직하게는 1:1-4， 보다 더 바람직하게는 1:1-3， 보다 더 바람직하게는 1:2일 수 있다.
본 발명은 항생제와 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체의 병용 투여에 의해 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료에 상승적 효과를 나타내는 조성물에 관한 것으로， 상승적 효과 (synergistic effect)란 둘 이상의 성분이 배합되어 사용될 때， 단일 성분투여 시 발휘되는 효과의 합보다 높은 효과 또는 예측되지 않던 상이한 효과를 발휘하는 것을 의미하는 것이다. 상기 용어, "배합" 은 둘 이상의 성분의 흔합을 동시에 투여하거나， 또는 이들 성분 각각을 순차적으로 투여하는 것을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서는， LPC 및 DW286의 병용 투여에 의한 면역 증강 및 세균성 감염 질환의 치료 효과를 확인하기 위하여， Mix군 (LPC: DW286 2:1)과， LPC-DW286군 (LPC 사전 투여 후 DW286 투여군), E 286-LPC군 (DW286 사전 투여 후 LPC 투여군), LPC 단독 투여군， 및 DW286 단독 투여군을 CPA-CLP 유발된 패혈증 마우스 및 CPA- 처리된 면역억제 및 /또는 변이된 마우스에서 평가하였다. 그 결과， 항생제 및 LPC 병용투여군인 Mix군， LPC-DW286군， 및 DW286-LPC군에서 단독 투여군에 비해 상승된 면역 증강 효과 및 세균성 감염 치료 효과를 관찰할 수 있었으며, DW286-LPC군 에서 가장 높은 면역 증강 효과 및 세균성 감염 치료 효과를 관찰하였다 (표 13). 아울러， DW286 이외에 시프로플록사신염산염수화물, 벤질페니실린 칼륨， 세프트리악손 나트륨, 도리페넴， 염산반코마이신 또는 드로트레코진 알파 (활성화된)， 콜리스틴， 토브라마이신， 및 푸시딘산 각각을 LPC와 병용 투여한 경우， LPC 단독 투여군에 비해 상승된 면역 증강 효과 및 세균성 감염 치료 효과가 나타났다 (표 6 내지 표 11).
구체적으로， 마우스 모델의 사망수 측정 결과 DW286-LPC군에서 높은 생존비율을 관찰하였으며 (표 12 및 13)， 장기 중량 (가슴색 및 비장)의 변화를 관찰한 결과 DW286-LPC 군은 CPA 투여에 의해 유발되는 임파 장기 중량의 감소를 효과적으로 억제하였다 (표 15). 나아가, 혈액 백혈구 수의 변화를 관찰한 결과, 유의성 있는 백혈구 수의 증가는 DW286-LPC 투여군에 국한됨을 발견하였으며 (표 16)， 백혈구의 분별 counts의 변화 또한 LPC 단독 투여군 보다 DW286-LPC 투여군에서 더 우수한 효과가 나타났다 (표 16). 림프구 세포의 감소 및 현저한 비장위축과 관련한 변화 측정 결과， DW286- LPC군은 다른 군 (도 7 및 8)에 비하여 림프구 세포의 감소 및 비장 위축에 대하여 높은 억제 경향을 보였다 (표 18). 또한, 가슴샘 및 비장의 면역조직화학 관찰 결과, CPA에 의해 현저한 비장 및 가슴샘 내 CD3+, CD4+, CD8+ 및 TNF-a+ 세포의 감소가 초래되었으나, LPC 및 DW286-LPC 병용 투여는 CPA 투여에 의해 유발되는 이들 세포의 감소를 비교적 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었으며， LPC 단독 투여보다 DW286-LPC 투여군에서 더 우수한 효과가 관찰되었다 (표 19). 이러한 결과를 통하여， 본 발명의 병용 제제 조성물이 면역 증강 또는 면역 증강에 의해 세균성 감염 질환 치료에 효과가 있음을 알 수 있다.
본 명세서에서 용어， "세균성 감염 질환' '은 면역 증강에 의해 치료될 수 있는， 생체내로 침투한 세균으로부터 직 /간접적인 영향을 받아 야기되는 질환을 의미하며， 면역계가 억제된 후 감염된 질병인 호중구의 감소가 없어도 AIDS와 같이 면역결핍성 질환이나 면역억제제를 투여중인 환자에서 발열이 동반하거나， 항생제에 대한 내성 등 다양한 질환을 포함한다.
바람직하게는， 본 발명의 세균성 감염 질환은 복막염， 폐렴, 골수염， 봉소염， 뇌막염, 신장염， 심장염， 장염， 위염， 식도염， 십이지장염， 대장염， 또는 패혈증을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서는 CLP(Cecal Ligation and Puncture)를 수행하여 복막염을 유발하였다. 본 발명의 일 실시예에서는 CLP 및 CPACCyclophosphamide · H20)를 처리한 모델을 이용하여 본 발명의 병용제제 조성물의 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료 효과를 확인하였다. CPA는 면역계의 면역반웅을 억제하는 물질이므로， 본 발명의 조성물이 면역반웅이 억제 (면역기능이 떨어진)된 질환에서도 효과가 丁
본 명세서에서 용어， "면역' '이란 동물 체내에 존재하는 자기방어 체계로서， 외부로부터 침입해 오는 각종 물질이나 생명체를 자기자신과 구별해내어 이 침입자를 제거하는 생물학적 현상을 말한다.
본 발명에서 용어 ' '면역 증강' '이란 숙주의 특이 또는 비특이， 세포성 면역 및 /또는 체액성 면역반웅을 상승시기는 것을 말한다. 본 발명의 조성물은 면역이 억제된 상태에서도 항생제와 LPC 또는 이의 유사체의 병용 투여를 통하여 면역 증강 효과를 나타내며， 이러한 면역 증강을 통해 종국적으로 세균성 감염 질환의 치료에 유용하다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고, 인체 또는 수의용으로 제형화될 수 있다.
경구 투여용의 약제학적 조성물은 별개의 단위， 예를 들면, 캅샐제 또는 정제; 산제 또는 과립제; 용제， 시럽 또는 현탁제 (수성 또는 비 -수성 액상물 중; 식용 발포제 또는 휩 (whip); 또는 에멀션)로 제시될 수 있다. 정제 또는 경질 젤라틴 갑셀제에 적합한 부형제로는 락토스， 옥수수 전분 또는 이의 유도체， 스테아르산 또는 이의 염이 있다. 연질 젤라린 캅셀제에 사용하기 적합한 부형제로는 예를 들어， 식물성 오일, 왁스， 지방， 반 -고형물 또는 액상 폴리을 등이 있다. 용제 및 시럽제를 제조하기 위해 사용될 수 있는 부형제로는 예를 들어, 물， 폴리올 및 당이 있다. 현탁제를 제조하기 위해， 오일 (예: 식물성 오일)을 사용하여 수중유 또는 유중수 현탁제를 제공할 수 있다. 경피 투여용으로 적웅시킨 약제학적 조성물은 장시간 동안 수용자의 표피와 친밀하게 접촉될 수 있도록 하기 위한 별개의 패치로서 제시될 수 있다.
비경구 투여용의 약제학적 조성물에는 산화방지제， 완충제， 정균제 (bacteriostat) 및 용질 (수용자의 혈액과 실질적으로 등 장성인)을 함유할 수 있는 수성 및 비 -수성 멸균 주사 용제; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비ᅳ수성 멸균 현탁제가 포함된다. 주사용 용제에 사용될 수 있는 부형제에는 예를 들어， 물, 알코을, 폴리을, 글리세린 및 식물성 오일이 포함된다. 이러한 조성물은 단위 -용량 (1회분) 또는 다중- 용량 (수 회분) 용기， 예를 들면, 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면， 주사용 수의 부가 만을 요구하는 동결 -건조 조건 하에 저장할 수 있다. 즉석의 주사 용제 및 현탁제는 멸균성 산제， 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 치료학적 유효량의 (i) 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체, 및 (ii) 항생제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는， 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 치료 방법에서， 상기 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체， 항생제， 면역 증강 및 세균성 감염 질환은 상기에서 설명한 바와 같으며, 본 명세서의 불필요한 반복 기재에 의한 과도한 복잡성을 피하기 위하여 공통 사항은 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 상기 물질의 병용 투여는 각각의 항생제의 종류에 따라， (i) 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체， 및 (Π) 항생제를 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다. 투여 간견은 환자의 질병 종류 및 중증도， 연령， 성별, 약물의 활성， 약물에 대한 민감도， 투여 시간， 투여 경로 및 배출 비율， 치료 기간， 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 또한， 상기 물질을 순차적으로 투여하는 경우에는 항생제 및 /또는, 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체를 수회에 걸쳐 투여할 수 있다.
바람직하게는， 본 발명의 항생제가 DW286인 경우에는 DW286을 먼저 투여한 후 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체를 투여할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서， Mix군 (LPC: DW286=2:1)과， LPCᅳ DW286군
(LPC 사전 투여 후 DW286 투여군), DW286-LPC군 (DW286 사전 투여 후 LPC 투여군)， LPC 단독 투여군 및 DW286 단독 투여군을 CPA-CLP 유발된 패혈증 마우스 및 CPA-처리 면역억제 및 /또는 변이된 마우스에서 평가한 결과, 항생제 및 LPC 병용투여군에서 단독 투여군에 비해 상승된 면역 증강 효과 및 세균성 감염 치료 효과를 관찰할 수 있었으며， LPC 사전 투여 후 E 286 투여군인 LPC-DW286군 보다 DW286 사전 투여 후 LPC 투여군인 DW286- LPC군에서 가장 높은 면역 증강 효과 및 세균성 감염 치료 효과가 나타났다. 본 명세서에서 용어, "개체 "는 면역 증강이 필요하거나, 세균성 감염 질환에 걸렸거나 세균성 감염 질환에 걸릴 위험이 있는 인간과 소， 말， 양， 돼지， 염소, 낙타， 영양, 개 등의 포유동물을 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 항생제， 및 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체를 개체에게 투여함으로써 면역을 증강시키거나 세균성 감염 질환을 치료할 수 있다.
본 명세서에서 용어， "투여''는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며， 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여， 정맥내 투여， 근육내 투여， 피하 투여， 피내 투여， 경구 투여， 국소 투여, 비내 투여， 폐내 투여， 직장내 투여 될 수 있으나， 이에 제한되지는 않는다. 또한， 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체， 및 항생제는 치료학적 유효량으로 투여될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "치료학적 유효량 "은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 /위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며， 유효 용량 수준은 환자의 질병 종류 및 중증도， 연령， 성별， 약물의 활성， 약물에 대한 민감도， 투여 시간， 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 물질은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며， 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체， 및 (Π) 항생제가 단일 또는 별개의 용기에 담겨져있는， 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서， 상기 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체， 항생제, 면역 증강 및 세균성 감염 질환은 상기에서 설명한 바와 같으며， 본 명세서의 불필요한 반복 기재에 의한 과도한 복잡성을 피하기 위하여 공통 사항은 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면， 본 발명의 키트에는 적량의 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체， 및 항생제가 별개의 용기에 담겨 있으며， 약학적으로 허용가능한 담체 키트의 사용을 위한 설명서를 포함할 수 있다. 상기 설명서는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료를 위한 항생제， 및 LPC 또는 이의 유사체의 흔합 방법; 항생제 투여 후 LPC 또는 이의 유사체의 투여 순서 또는 투여 방법; 또는 LPC 또는 이의 유사체의 투여 후 항생제 투여 순서 또는 투여 방법을 포함할 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(1) 본 발명에 따라 항생제와 함께 리소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체를 병용 투여하면 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료 효과면에서 상승효과를 발휘한다.
(2) 본 발명은 감염을 통한 면역계가 억제된 질환， 및 면역계가 억제된 후 감염된 질병의 치료 등에 유용하게 이용될 수 있어서， 기존의 항생제 또는 리소포스파티딜콜린의 치료 효과를 현저히 향상시킬 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 CPA-CLP로 유도된 모델의 LPC 투여군과 투여 순서를 간략히 나타낸 도이다.
도 2는 CPA-CLP로 유도된 모델의 LPC 이성질체 및 항생제의 투여 군과 투여 순서를 간략히 나타낸 도이다.
도 3은 CPA— CLP로 유도된 모델에서 LPC와 시프로틀록사신 염산염수화물， 벤질페니실린칼륨 및 세프트리악손 나트륨의 투여군과 투여 순서를 간략히 나타낸 도이다.
도 4는 CPA-CLP로 유도된 모델의 LPC와 도리페넴, 염산반코마이신， DW286aa, 드로트레코진 알파 (활성화된)의 투여군과 투여 순서를 간략히 나타낸 도이다.
도 5는 CPA-CLP로 유도된 모델의 LPC와 콜리스틴， 토브라마이신， 푸시딘산의 투여군과 투여 순서를 간략히 나타낸 도이다.
도 6은 CPA-CLP로 유도된 모델 및 CPA 유발 면역억제 모델에서 LPC와 DW286AA의 투여군과 투여 순서를 간략히 나타낸 도이다.
도 7은 CPA 처리군에서 INTACT(a)ᅳ CPA control (b), LPC(c), Mix(d), DW286— LPC(e), LPC-DW286(f ) , 및 DW285(g)군에서 가슴샘의 조직병리학적 프로파일을 나타낸 것이다. CPA control에서는 가슴샘 피질 내 림프구 세포의 감소를 탐지하였다. 그러나， 이러한 위축성의 변화는 LPC, LPC- DW286, 및 DW286-LPC군의 처리에 의해 효과적으로 억제되었으며， 다른 군에 비해 DW286-LPC군에서 가장 높은 억제 경향을 나타내었다.
도 8은 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control (b), LPC(c), Mix(d), DW286-LPC(e), LPCᅳ DW286(f ) , 및 DW285(g)군에서 비장의 조직병리학적 프로파일을 나타낸 것이다. CPA control에서는 현저한 비장의 위축 및 림프구 세포의 감소를 탐지하였다. 그러나， 이러한 위축성의 변화는 LPC, LPC-DW286 및 DW286— LPC군의 처리에 의해 효과적으로 억제되었으며， 다른 군에 비해 DW286-LPC군에서 가장 높은 억제 경향을 나타내었다.
도 9는 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control (b), LPC(c), Mix(d), DW286-LPC(e), LPC— DW286(f ) , 및 DW285(g)군에서 비장 내 CD3+ 세포의 변화를 나타낸 도이다. CPA control에서는 INTACT control에 비해 비장의 CD3+ 세포의 현저한 감소를 보였다. 그러나， 이러한 감소는 CPA CONTROL과 비교하여 DW286군을 제외하고 모든 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 특히， LPC군에 비해 DW286-LPC군에서 유사하거나 더 바람직한 효과가 탐지되었다.
도 10은 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control (b), LPC(c), Mix(d) DW286-LPC(e), LPC-DW286(f ) , 및 DW285(g)군에서 비장 내 CD4+ 세포의 변화를 나타낸 도이다. CPA control에서는 INTACT control 비해 비장의 CD3+ 세포의 현저한 감소를 보였다. 그러나, 이러한 감소는 CPA CONTROL과 비교하여 DW286군을 제외하고 모든 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 특히， LPC군에 비해 DW286— LPC군에서 유사하거나 더 바람직한 효과가 탐지되었다.
도 11은 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control (b), LPC(c), Mix(d) DW286-LPC(e), LPC— DW286(f )， 및 DW285(g)군에서 비장 내 CD8+ 세포의 변화를 나타낸 도이다. CPA control에서는 INTACT control에 비해 비장의 CD3+ 세포의 현저한 감소를 보였다. 그러나， 이러한 감소는 CPA CONTROL과 비교하여 DW286군을 제외하고 모든 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 특히， LPC군에 비해 DW286-LPC군에서 유사하거나 더 바람직한 효과가 탐지되었다. , 도 12는 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control (b), LPC(c), Mix(d) DW286-LPC(e), LPC-DW286(f ) , 및 DW285(g)군에서 비장 내 TNF- α 세포의 변화를 나타낸 도이다. CPA contn)l에서는 INTACT contr 에 비해 비장의 CD3+ 세포의 현저한 감소를 보였다. 그러나. 이러한 감소는 CPA CONTROL과 비교하여 DW286군을 제외하고 모든 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 특히, LPC군에 비해 DW286-LPC군에서 유사하거나 더 바람직한 효과가 탐지되었다.
도 13은 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control (b), LPC, Mix(d), DW286-LPC(e), LPC-DW286(f ) , 및 DW285(g)군에서 가슴샘 내 CD3+ 세포의 변화를 나타낸 도이다. CPA contr 에서는 INTACT contr 에 비해 가슴샘의 CD3+ 세포의 현저한 감소를 보였다. 그러나， 이러한 감소는 CPA CONTROL과 비교하여 DW286군을 제외하고 모든 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 특히， LPC군에 비해 DW286— LPC군에서 유사하거나 더 바람직한 효과가 탐지되었다.
도 14는 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control (b), LPC(c), Mix(d) DW286-LPC(e), LPC-DW286(f ) , 및 DW285(g)군에서 가슴샘 내 CD4+ 세포의 변화를 나타낸 도이다. CPA control에서는 INTACT control에 비해 가슴샘의 CD4+ 세포의 현저한 감소를 보였다. 그러나. 이러한 감소는 CPA CONTROL과 비교하여 DW286군을 제외하고 모든 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 특히， LPC군에 비해 DW286-LPC군에서 유사하거나 더 바람직한 효과가 탐지되었다.
도 15는 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control (b), LPC(c), Mix(d) DW286-LPC(e), LPC-DW286 ( f ) , 및 DW285(g)군에서 가슴샘 내 CD8+ 세포의 변화를 나타낸 도이다. CPA contn)l에서는 INTACT control에 비해 가슴샘의 CD8+ 세포의 현저한 감소를 보였다. 그러나， 이러한 감소는 CPA control과 비교하여 DW286군을 제외하고 모든 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 특히， LPC군에 비해 DW286— LPC군에서 유사하거나 더 바람직한 효과가 탐지되었다.
도 16 은 CPA 처리군에서 INTACT(a), CPA control (b), LPC(c),
Mix(d), DW286-LPC(e), LPC— DW286(f )， 및 DW285(g)군에서 가슴샘 내 TNF- α 세포의 변화를 나타낸 도이다. CPA control 에서는 INTACT control 에 비해 가슴샘의 TNF-α 세포의 현저한 감소를 보였다. 그러나， 이러한 감소는 CPA control 과 비교하여 DW286 군을 제외하고 모든 투여군에서 효과적으로 감소하였다. 특히， LPC 군에 비해 DW286-LPC 군에서 유사하거나 더 바람직한 효과가 탐지되었다.
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실시예 1: 실험 재료 및 실험 동물의 준비
DW286 ( [ 7一 [ 3_ ( am i nome thyl )-4-(met hoxy imino) -3-me thyltetr ahydro- lH-l-pyrrolyl ]-1 cyclopropyl-6 f luoro—4—οχοᅳ 1， 4— dihydro[ 1 ,8] naphthyr idine-3-carboxyl ic acid hydrochloric acid salt] , Lpt , 20021)는 동화약품 (Anyang, Korea)에 의해 합성된 신규한 플로로 -나프티리딘 항생제이며， LPC (라이소포스파티딜콜린; 18:0 94%, GmbH PHISPH0LIPID, 독일)를 사용하였다. LPC의 이성질체 (isomer)인 1-올레일 -2-하이드록시- sn-글리세로 -3-포스포콜린 (l-Oleoyl-S-hydroxy-sn-glycero-S- phosphocholine, l-01eoyl; 18:1 LPC) 및 시프로플록사신염산염수화물 (Ciprofloxacin hydrochloride hydrate, Cipro, ) , 벤질페니실린 ¾· (Potassium benzylpenici 11 in, Peni ) , 세프트리악손 나트륨 (Ceftriaxone sodium, Ceft), 도리페넴 (Dor ipenem, Dor i ) , 염산반코마이신 (Vancomycin hydrochloride, Vanco), 드로트레코진 알파 (활성화된) (Drotrecogin al f a(act ivated) , Xigris), 콜리스틴 (colistin), 토브라마이신 (tobramycin)， 및 푸시딘산 (fusidic acid, fusidin)은 각각 시그마 등으로부터 구입하였다. LPC, DW286, 시프로플록사신염산염수화물， 벤질페니실린 칼륨， 세프트리악손 나트륨， 도리페넴, 염산반코마이신 및 드로트레코진 알파 (활성화된)는 데시케이터에 보관되어 빛과 습기에 의한 변성으로부터 보호하였다.
ICR 마우스 (수령 6주， SIX, Japan)를 7일 또는 8일의 적웅기간을 거친 후에 사용하였다. 동물은 폴리카보네이트 우리 당 5 또는 4 마리를 온도(201 25°0， 습도 (4 — 45%)가 조절된 방에 배정하였다. 명기:암기 사이클은 12시간: 12시간이며， 먹이 (삼양， Korea) 및 물은 접근하기 쉽게 제공하였다. 실험은 CPA-CLP 및 CPA로 유발된 면역억제 마우스 모델군으로 나누었다. 모든 실험 동물은 'Guide for the Care' 및 'Use of Laboratory Animals by Institute of Laboratory Animal Resources, Commission on Life Science, National Research Council, USA on 1996, Washington D.C.'에 의해 처리하였다. 실시예 2: 실험 동물 모델의 준비
2-1. CPA-유도된 면역억제 마우스 모델의 준비
수술 3일 및 1일 전에 각각 150 mg/kg 및 110 mg/kg의 CPA(Cyclophosphamide · H20, Sigma, USA)를 생리식염수에 녹여 10 m /kg의 농도로 단회 복강 주사하여 면역억제를 유발시켰다. INTACT control군에서는 CPA 대신 동일한 양의 생리식염수를 동일한 방법으로 투여하였다.
CPA는 널리 사용되는 항종양제이며， 단독으로 사용하거나 다른 생산물과 결합하여 사용한다. CPA의 처리는 조혈 및 림프성의 조직에 심각한 손상을 주므로， 항종양제로서 사용되거나 골수 내 이식전처리요법 (transplantation conditioning regimes)으로 사용하여 높은 백혈구 감소증을 초래한다. 핵산의 알킬화를 가능하게 하는 많은 활성 대사 산물의 생성을 이끄는 마이크로좀 효소에 의한 생체 내 변화 후까지 CPA는 스스로 생물학적 비활성화된다고 알려져 있으며， 자유라디칼의 생성과 DNA의 알킬화를 통해 염색체를 손상시켜 돌연변이를 유발한다. CPA 유도 면역억제 및 /또는 돌연변이된 마우스 모델은 항-돌연변이 효과 또는 바람직한 면역조절 효과를 탐지하기 위한 가치있는 동물 모델이다. 더욱이 CPA 처리에 의한 면역억제 및 백혈구 감소증을 유발함으로써 가슴샘 및 지라의 T 세포， 특히 CD4 및 CD8은 TNF-α 양성 세포를 포함하는 다양한 시토카인의 감소와 함께 크게 감소한다. 2- 2. CPA-CLP 모델의 준비
면역억제제로 잘 알려진 CPA를 다균성 감염을 증폭시키기 위해 CLP 실시 3 및 1일 전에 각각 150 mg/kg과 110 mg/kg의 CPA( Sigma, USA)를 생리 식염수에 녹여 10 ml /kg의 농도로 단회 복강 주사하여 면역억제를 유발시켰다. 이와 같이， CPA 처리 후 CLP를 실시하면 세균의 대량 감염 모델로서 사용할 수 있다. CLP를 위해 마우스를 케타민염산염 (Ketai ne hydrochloride, ICN Biochemicals Inc. , USA) 및 자일라진염산염 (Xylazine hydrochloride, Wako Pure Chemical Industries Ltd. , Japan)의 마취하에 개복하여 맹장을 노출하고， 노출된 맹장은 회맹판 (Ileocecal valve) 바로 아래를 이중 결찰한 다음 22-게이지 주사침을 이용하여 2회 관통시킨 다음 일반적인 방법에 준하여 복강을 폐쇄하였다. INTACT 및 CPA control군에서는 맹장 노출 후 다시 복강을 폐쇄하였으며， INTACT control 군에서는 CPA 대신 동일한 양의 생리식염수를 동일한 방법으로 투여하였다.
CLP 모델은 인간의 급성 복막염을 가장 가깝게 모방한 것으로 패혈증과 가장 임상적으로 연관된 동물모델이고 항ᅳ패혈증 효과를 탐지하기 위한 가치 있는 동물모델로 여겨져 왔다 (Urbaschek 및 Urbaschek, 1987； Yan et al. 2004； Ghiselli et al. 2006； Wirtz et al. 2006). CLP 모델은 인간의 복부 패혈증의 임상과정을 더 가깝게 반영한 것으로， 내인성의 세균 병소는 (septic focus) 전신성염증반웅증후군과 함께 다균성 감염을 초래한다 (Wichterman et al . 1980； Zantl et al . 1998； Maier et al . 2000； Emmanui 1 idis et al . 2001) . 실시예 3: 실험방법
3- 1. CPA-유발 면역억제 마우스 모델
면역억 ^제를 유발시키기 위해， 150 mg/kg과 110 mg/kg의 CPA를 생리 식염수에 녹여 CLP 수술 3 및 1일 전 또는 최초 투여시에 단회 복강 내로 투여하였다. INTACT control 군에서는， CPA 대신 동일한 양의 생리식염수를 동일한 방법으로 투여하였다. 3-2. CLP수술
마우스는 케타민 (Ket amine) 및 자일라진 (Xylazine)에 의해 마취하에 개복하여 맹장을 노출하고， 노출된 맹장은 회맹판 (Ileocecal valve) 바로 아래를 이중 결찰한 다음 22-게이지 주사침을 이용하여 2회 관통시킨 후 일반적인 방법에 준하여 복강을 폐쇄하였다. INTACT 및 CPA control 군에서는 맹장 노출 후 다시 복강을 폐쇄하였으며， INTACT control 군에서는 CPA 대신 동일한 양의 생리식염수를 동일한 방법으로 투여하였다. CLP는 CPA의 두번째 투여 후 하루 후에 수행하였다.
3-3. 사망수， 생존수 및 몸중량의 측정
CPA-CLP 모델에서， 몸중량, 생존수 및 사망수는 5일 동안 하루에 한 번씩 automatic electronic balances(Sartor ius Co., Ltd. , USA)로 측정하였으며， CPA-처리 모델에서는 2일 동안 하루에 한번씩 측정하였다. 증체량은 다음과 같이 계산하였다:
<증체량 (g)>
CPA-CLP model: 회생당시 몸중량 - CLP시 몸중량 (5 days),
CPA-treat model: 회생당시 몸증량 - 최초 투여시 몸중량 (2 days).
3-4. 장기 중량의 측정
CPA-처리 모델의 희생시에 비장 및 가슴샘의 습중량 (wet-weight)을 절대중량으로 측정하고， 그 후 상대적 장기 중량 (몸중량의 %)을 하기 식에 의해 계산하였다:
상대적 장기 중량 = [(절대적 장기 중량 I 희생 당시 개별적 몸중량) X 100].
3-5. 혈액 수집 및 WBC 계산
혈액은 CPA-처리 모델의 대정맥으로부터 수집하고, 총 혈액 백혈구 수는 카운팅 챔버를 이용하여 계산하였으며, 희석 피펫 (diluting pipette)과 희석 용액으로서 Turk 용액을 사용하여 계산하였다. 모든 숫자는 xioVmm3으로 계산하였다. 더욱이, 김자액으로 염색된 도말 혈액 샘플 내에서 산호성 백혈구, 호중성 백혈구， 단핵 백혈구 및 호염기성 백혈구의 세포수를 총 100 백혈구 중에서 계산하였다. 3-6. 골수 소핵 다염적혈구의 변화
CPA-처리 모델의 골수표본은 다음과 같이 만들어졌다. 요컨대, 골수세포는 비활성화된 우태아 혈청 3 ml 내의 대퇴골로부터 수집하였으며 (GIBCO BRL, USA), 원심분리하고, 슬라이드에 도말하였다. 표본은 건조시키고, absolute methan 에 담가 10— 20분 동안 고정하였다. 고정된 슬라이드는 하기와 같은 방법으로 염색하였다:
메이-그룬왈드 염색 (May-Grunwald stain) 3분，
메이-그룬왈드 염색 (May-Grunwald stain)(l:l diluted) 2분， 김자 염색 (1:6 diluted) 10분. 슬라이드는 무작위적으로 코드되고 두명의 다른 전문가에 의해 1000배 확대하에 관찰하였다. PCE (다염적혈구， Polychromatic erythrocyte)의 직경의 1/5에서 1/20의 범위 사이즈의 작고 둥글거나 타원형의 몸체는 소핵 다염적혈구수로서 계수하였다. 결과는 1000 PCE 내의 MNPCE (소핵 다염적혈구, PCE with one or more nuclei)의 수로서 표현하였다. 丽 PC士 S.D.의 평균 슷자를 계산하였다. 더욱이， PCE/(PCE+NCE) 비율은 세포독성 가능성을 탐지하기 위해 500 적혈구를 계산하였다. 3-7. 조직병리학
기관의 중량을 측정한 후에 가슴샘과 비장을 샘플화하였다. 샘플 조직은 10% 중성 완층 포르말린에 고정하였다. 파라핀으로 포매시킨 후， 3-4 ym 표본을 준비하였다. 대표적인 부분은 광학 현미경 검사를 위해 헤마특실린과 에오신 (Η&Ε, Hematoxylin & Eosin Stain)으로 염색하였다. 그 후 개별적인 기관의 조직병리학적 프로파일을 관찰하였다.
조직형태계측법-자동화된 이미지 분석을 사용하여 (Analysis Image Processing; SIS, Germany) 비장에서의 백색 수질의 수 (N) / 조직병리학 표본 (X 50)으로 비장 내 백색 수질 (white pulps)의 수를 계산하였다. 또한， 가슴샘 피질의 위축성의 (atrophic)변화 I 총 관찰된 가슴샘의 수를 계산하였다. 3-8. 면역화학조직법 (IHC)
탈 파라핀화한 후에 CD3 항원 결정기 검색은 10 mM Tris-1 mM EDTA 버퍼 (pH 9.0)에서 수행하였으며， 1 mM EDTA 버퍼 (pH 8.0) 및 TNF- a in 10 mM Citrate BuffeKpH 6.0)에서 CIM 및 CD8 검색을 상기 방법과 동일하게 수행하였다. 본 실험에 사용된 1차 항-혈청은 하기 표 1과 같다.
【표 1】
Figure imgf000023_0001
항-마우스 CD4(GK1.5)단일클론항체 CBL-13583 Chemicon Inc., CA, USA, 1:100
I f우스 CD8(Ly-2)단일 §론항체 CBL-1318 Chemicon Inc., CA, USA. 1:100 항 -TNF-α다클론성항체 HP800] Hycult biotechnology b.v., Netherlands.1:100 *A11 antisera were raised in rat.
예열수를 버퍼를 포함하는 염색접시에 온도가 95-KX C에 이를 때까지 bath한 후 염색접시를 실온에 두고 슬라이드를 20분 동안 식혔다. 항원결정기 검색 후에 표본은 하기와 같은 단계에 의해 면역 염색하였다. 우선， 절편을 실온에서 내성의 페톡시다제 활성을 차단하기 위해 메탄을 및 0.3% ¾02에서 30분 동안 배양한 후， 0.01M PBS(pH 7.2)에서 3회 세척하였다. 다음으로 항습기에서 절편을 normal horse serum blocking solution에서 1시간 동안 실온에서 배양하여 면역글로불린의 비특이적 결합을 막았다 (Vector Lab. Inc. , CA, USA. Dilution 1:100). 그 후 0.01M PBS에서 3회 세척한 후, 4°C 항습기에서 4가지 유형의 1차 항혈청과 함께 12시간 동안 절편을 배양하였다. 그 후， 0.01M PBS에서 3회 세척하였다. 절편을 비오린이 부착된 만능 이차항체와 함께 항습기에서 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 그 후 0.01M PBS에서 3회 세척하였다. 절편을 ABC 시약 (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Lab. Inc. , CA, USA. Dilution 1:50)과 함께 항습기에서 1시간 동안 실온에서 배양한 후 0.01M PBS에서 3회 세척하였다. 표본을 Peroxidae substrate kit (Vector Lab. Inc. , CA)에서 실온에서 30초 동안 배양하였다. 그 후 0.01M PBS로 3회 세척하였다. Mayer's hematoxylin 용액으로 대조염색한 후 흐르는 수듯물에서 30분 동안 세척하였다. 95% 에탄올을 통해 2분， 100% 에탄올에서 3시간 동안 건조시킨 후 자일렌에서 2시간 동안 세척하였다. 그 푸 permanent mounting medium이 있는 Covers lip 및 광학현미경하에서 관찰하였다 (Zeiss, Germany) .
조직형태계측법 -1000개의 비장 또는 가슴샘 세포 중에서， 각 면역반웅세포 (CD3+, CD4+, CD8+ 및 TNF- a+)의 수 (N)/1000개의 비장세포 또는 가슴샘 세포를 자동화된 이미지 분석을 통해 관찰하였다. 가슴샘에서 피질과 수질에서 분리하여 계산을 수행하였다. 3-9. 통계분석
평균 및 표준편차 (평균土 S.D.)를 계산하였다. 통계학적 분석은 Mann-Whitney U-Wi lcoxon Rank Sum W test (願 test) with SPSS for Windows (Release 6.1.3. , SPSS Inc. , USA)를 사용하여 수행하였다. CPA-처리 모델에서 INTACT 및 CPA 대조군， CPA 대조군 및 테스트군 사이의 차이에 대한 테스트 물질의 효율의 이해를 돕기 위해 아래 식을 사용하였다:
INTACT contr()l에 대한 변화율 ( ))=[ ((CPA contr()l의 데이터 -INTACT control의 데이터 )/ INTACT control의 데이터) X 100] ,
CPA control에 대한 변화율 (¾>)=[ ((테스트 군의 데이터 -CPA control의 데이터 ) /CPA cont r 01의 데이터) x 100 ] . 실시예 4: CPA-CLP로 유도된 모델에서 LPC농도의 생존에 미치는 영향 분석
CPA로 면역억제를 유발시킨 다음， CLP(Cecal ligation 및 puncture)로 패혈증을 유발시킨 마우스를 이용하여， LPC의 투여 용량별 약효를 확인하고자 하였다. 5용량 (1， 2.5, 5， 10 및 20 mg/kg)의 LPC를 CPA-CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후부터 12시간 간격으로 4회 피하 투여한 다음 사망률 및 체중의 변화를 관찰하였다. LPC는 5% human albumin (녹십자， Korea)에 용해시켜 10 ml/kg으로 각각 투여하였다. 이와 같은 투여군과 투여 순서를 도 1에 간단히 나타내었다.
구체적으로， ICR 마우스 (6 주령 수컷， SIX, Japan)를 총 7개 군 (군 당 10마리)인 CPA 대조군 (CPA 투여 후 Sham 수술 매체 투여군)， CPA-CLP 대조군 (CPA 투여 후 CLP 수술 매체 투여군)， CPA-CLP 후 LPC 1 mg/kg 투여군， CPA— CLP 후 LPC 2.5 mg/kg 투여군， CPA-CLP 후 LPC 5 mg/kg 투여군 CPA-CLP 후 LPC 10 mg/kg 투여군 및 CP/HXP 후 LPC 20 mg/kg 투여군으로 나누었다. 투여는 12시간 4희 피하투여로 5% 인혈청 알부민을 매체로 사용하여 10 ml /kg으로 투여하였다. 즉， 5용량의 LPC를 CLP 수술 6시간 후부터 12시간 간격으로 총 4회 경부 피하에 투여하였다. LPC는 5% 인혈청 알부민 (녹십자, Korea)에 용해시켜 10 ml /kg으로 각각 투여하였으며, Sham
¾ CLP 대초군에서는 10 ml /kg의 5% 인혈청 알부민 만을 동일한-간격으 피하 투여하였다. 투여 후， 사망률 및 체중의 변화를 상기 실시예 3-3의 방법으로 관찰하였다.
[표 2】
CPA-CLP패혈층마우스 M¾(SEP00e)£|사 ^를에
i mm m
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000026_0001
그 결과， 상기 표 2 및 3메서 알 수 있듯이， 모든 CPA 대조군 마우스는 관찰기간인 7일 동안 생존하였으나， CLP 대조 ^에서는 CLP 2일 이내에 10마리 중 10마리가 사망하여 100%의 사망를을 나타내었고， LPC 1 및 .2.5 mg/kg 투여군에서는 각각 CLP 4 및 5일 이내에 모든 실험동물이 사망하였으며, LPC 5, 10 및 20 mg/kg 투여군에서는 CLP 수술 7일 후 모든 실험동물이 사망하였다 (표 2). 한편, LPC 1 mg/kg 투여군의 모든 실험동물이 사망한 CLP 수술 4일 후 LPC 2.5, 5， 10 및 20 mg/kg 투여군의 생존율은 각각 10, 30, 50 및 40%였다 (표 3).
모든 CPA-CLP 수술군에서는 사망 직전 CPA 대조군에 비해 현저한 체중 감소를 나타내었으나， 모든 LPC 투여군에서는 CPA-CLP 투여군과 비교하여 의미있는 체중의 변화는 일어나지 않았다.
이와 같은 패혈증에 있어서 가장 중요시되고 있는 지표로 알려진 생존시간의'증가가 CPA-CLP 口ᅵᅳ우스에서 모든 5용량의 LPC의 투여에 의해 현저히 증가되었으므로， LPC는 패혈증 환자의 생존시간을 높일 수 있음을 알 수 있다. 아울러, LPC 1, 2.5, 5 및 10 mg/kg 투여군에서는 투여용량 의존적인 생존시간 연장효과가 인정되었으나， 20 mg/kg 투여군에서는 10 mg/kg 투여군과 유사하거나 비교적 낮은 효과가 인정되어, LPC의 CPAᅳ CLP 모델에서의 최소 유효용량은 1 mg/kg 전후로 판단되며， 최적 유효용량은 10 mg/kg으로 관찰되었다 . 실시예 5: CPA-CLP로 유도된 모델에서 LPC의 이성질체의 투여가 생존에 미치는 영향 분석
CPA로 면역억제를 유발시킨 다음， CLP로 패혈증을 유발시킨 마우스를 이용하여, LPC와 Xigris, LPA, 18:1 LPC, 18:0 LPC 및 DW286M의 약효를 비교하고자 하였다. 5 mg/kg의 LPC, LPA, 18:1 LPC, 18:0 LPC, 0.4 및 2 mg/kg의 Xigris, 10 및 20 mg/kg의 DW286AA를 각각 CPA-CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후에 단회 정맥 투여한 다음， 사망률 및 체중의 변화를 관찰하였다. 모든 실험물질은 멸균 생리식염수에 용해시켜 10 ml /kg으로 각각 투여하였다. 이와 같은 투여 순서와 투여군은 도 2에 간단히 나타내었다.
구체적으로， ICR 마우스 (6 주령 수컷， SIX, Japan)를 총 10개 군 (군 당 10마리)인 CPA 대조군 (CPA 투여 후 Sham 수술 매체 투여군)， CPA-CLP 대조군 (CPA 투여 후 CLP 수술 매체 투여군)， CPA-CLP 후 LPC 5 mg/kg 투여군， CPA-CLP 후 Xigris 0.4 mg/kg 투여군， CPA-CLP 후 Xigris 2 mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 LPA 5 mg/kg 투여군， CPA-CLP 후 18:1 LPC 5 mg/kg 투여군， CPA-CLP 후 18:0 LPC 5 mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 DW286M 10 mg/kg 투여군 및 CPA-CLP 후 DW286M 20 mg/kg 투여군으로 나누었다. 투여는 멸균 생리식염수를 매체로 사용하여 CLP 수술 6시간 후 10 ml/kg으로 단회 정맥 투여하였다. 즉, 5 mg/kg의 LPC, LPA, 18:1 LPC, 18:0 LPC, 0.4 및 2 mg/kg의 Xigris, 10 및 20 mg/kg의 DW286AA를 각각 CPA-CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후에 단회 정맥 투여하였다. 모든 실험물질은 멸균 생리식염수에 용해시켜 10 ml/kg으로 각각 투여하였으며， Sham 및 CLP 대조군에서는 10 ml/kg의 멸균 생리식염수만을 단회 정맥 투여하였다. 투여 후, 사망률 및 체중의 변화를 상기 실시예 3- 3의 방법으로 관찰하였다. 【표 4】
Figure imgf000028_0002
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【표 51
Figure imgf000028_0003
： ' '그 결과， - 기 - 표 및ᅳ 5에서ᅳᅳ 알~ 주ᅳ ¾훗이 모든 CPA 대조군 마우스는 관찰기간인 10일 동안 생존하였으나，ᅳ CLP 대초군에서는； CLP 2。4 이내에 10마리 중 10마리가 사망하여 100%의 사망률을 나타내었고， LPC 5 mg/kg, Xigris 0.4 및 2 mg/kg, 18:0 LPC 5 mg/kg 투여군에서는 CLP 8일 이내에 모든 실험동물이 사망하였으며， LPA 5 mg/kg투여군에서는 CLP 수술 3일 후 모든 실험동물이 사망하였다 (표 4). 한편， 18:1 LPC 5 mg/kg 투여군에서는 모든 실험동물이 CLP 수술 2일 후 사망하였으며， DW286M 10 및 20 mg/kg 투여군에서는 각각 CLP 수술 10일 후에도 각각 3마리의 생존례 (3/10； 30%)가 인정되었다 (표 5).
모든 CPA-CLP 수술군에서는 사망 직전 CPA 대조군에 비해 현저한 체중 감소를 나타내었으며， LPC 5 mg/kg, DW286aa 10 및 20 mg/kg 투여군에서 각각 CLP 수술 1일 후 CPA-CLP 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 체중의 증가가 인정된 이외에， 모든 투여군에서는 CPA-CLP 투여군과 비교하여 의미 있는 체중의 변화는 인정되지 않았다.
이러한 결과들은， LPC, Xigris, 18:0 LPC 및 DW286AA는 패혈증 환자의 생존 시간을 높일 수 있다는 것을 뒷받침하며， 특히 DW286M 10 및 20 mg/kg 투여군에서 현저한 생존시간 및 생존률의 증가를 나타낸다. LPC 5 mg/kg 투여군은 Xigris 2 mg/kg 투여군보다 더 우수한 효과가 인정되었고, 18:0 LPC는 18:1 LPC보다 우수한 효과를 나타내어, 동일한 용량의 LPC와 유사한 효과를 나타내었으며， 이러한 결과는 LPC 뿐만 아니라， LPC의 이성질체도 면역증강 또는 세균성 감염 질환의 치료 효과가 있을 수 있다는 것을 뒷받침하는 것이다. 실시예 6: CPA— CLP로 유도된 모델에서 LPC와 기존 항생제와의 단독 및 병용투여가 생존에 미치는 영향 분석
CPA로 면역억제를 유발시킨 다음, CLP로 패혈증을 유발시킨 마우스를 이용하여， I C와 CiproCCi rof loxacin hydrochloride hydrate) , Peni (Potassium benzylpenici 11 in) 및 Ceft (Ceftriaxone sodium)의 병용 효과를 비교하고자 하였다. LPC(5 mg/kg) , Cipro(20 mg/kg), Peni (60 mg/kg), Ceft(25 mg/kg) , LPC+Ci ro (5+20 mg/kg) , LPC+Peni (5+60 mg/kg) 및 LPC+Ceft(5+25 mg/kg)를 각각 CPA-CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후에 단회 정맥 투여한 다음， 사망률 및 체중의 변화를 관찰하였다. 또한, DW286AA(5 ing/kg)을 대조약물로 사용하였으며 , 모든 단일 실험물질은 멸균 생리식염수에 용해시켜 10 ml/kg으로 각각 투여하였고， 모든 복합 조성군에서는 각각의 약물을 LPC(0.5 mg/ml)가 용해되어 있는 용액에 직접 적절 용량을 각각 용해시켜 투여하였다. 이와 같은 투여 순서와 투여군은 도 3에 간단히 나타내었다.
구체적으로 ICR 마우스 (6 주령 수컷， SIX, Japan)를 총 10개 군 (군 당 10마리)인 CPA 대조군 (CPA 투여 후 Sham 수술 매체 투여군)， CPA-CLP 대조군 (CPA 투여 후 CLP 수술 매체 투여군)， CPA-CLP 후 LPC 5 mg/kg 투여군， CPA-CLP 후 DW286M 5 mg/kg 투여군， CPA-CLP 후 Cipro 20 mg/kg 투여군， CPA-CLP 후 Peni 60 mg/kg 투여군， CPA— CLP 후 Ceft 25 mg/kg 투여군， CPA-CLP 후 LPC+Cipro 5+20 mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 LPC+Peni 5+60 mg/kg 투여군 및 CPA-CLP 후 LPC+Ceft 5+25 mg/kg 투여군으로 나누었다. 투여는 멸균 생리식염수를 매체로 사용하여 CLP 수술 6시간 후 10 ml/kg으로 단회 정맥 투여하였다. 즉, LPC(5 mg/kg) , DW286AA(5 mg/kg) Cipro(20 mg/kg) , Peni (60 mg/kg) , Ceft(25 mg/kg) , LPC+Ci pro (5+20 mg/kg) LPC+Peni (5+60 mg/kg) 및 LPC+Ceft (5+25 mg/kg)를 각각 CP/HXP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후에 단회 정맥 투여하였다. 모든 단일 실험물질은 멸균 생리식염수에 용해시켜 10 ml/kg으로 각각 투여하였고, 모든 복합 조성군에서는 각각의 약물을 LPC(0.5 mg/ml)가 용해되어 있는 용액에 직접 적절 용량을 각각 용해시켜 투여하였다. 투여 후， 사망률 및 체중의 변화를 상기 실시예 3-3의 방법으로 관찰하였다.
【표 6]
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【¾7】
CPA-GLP Ι 1 미 스 M (SEP011)£| 존¾ (
대 S UP ¾형 제; "gssf m
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그 결과， 상기 표 6 및 .7에서 알 수 있듯이 , £든 CPA；대조군 마;웨는 ¾찰 "기간¾ᅳ '3일 #안 ½>¾ - , ¾ ' 및ᅳ ' Peni 투여군에서는 CLP 2일 이내에 10마리— 중 10마리가 사망하여，: 100%의. 사망를 · '나타내었 iV'LPC:
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LP i i厂후여군어ᅵ서는 CLP 3일 이내에 모든 실험,동물이 사망하였다. 그러나， LPC 단독 또는 항생제 단독보다， LPC와의 병용군인 LPC+Cipro, LPC+Peni， LPC+Ceft군에서는 사망율이 줄어들거나 사망시간이 지연되었다 (표 6). 한편， LPC+Ceft 및 DW286aa 투여군에서는 CLP 수술 3일 후에도 각각 3(3/10; 30%) 및 7(7/10; 70%) 마리의 생존례가 인정되었다 (표 7).
모든 CPA— CLP 수술군에서는 CLP 수술 1일 후부터 CPA 대조군에 비해 현저한 체중 감소를 나타내었으며， LPC 투여군에서 CLP 수술 1일 후 CPA- CLP 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.05) 체중의 감소를 나타낸 이외에， 모든 투여군에서는 CPA-CLP 투여군과 비교하여 의미 있는 체중의 변화는 나타나지 않았다.
LPC 및 각각의 항생제의 단일 투여군에 비해 LPC+Cipro, LPC+Peni 및
LPC+Ceft 투여군에서 나타난 생존률의 증가는， LPC와 항생제의 병용에 의해 이들의 효과가 증가되는 것을 뒷받침하는 것으로， 본 발명의 병용 제제가 면역증강 및 세균성 감염 질환의 치료에 우수한 효과가 있음을 시사하는 것이다. 실시예 7: CPA-CLP로 유도된 모델에서 LPC와 기존 항생제와의 단독 및 병용투여가 생존에 미치는 영향 분석
CPA로 면역억제를 유발시킨 다음， CLP로 패혈증을 유발시킨 마우스를 이용하여， LPC, Dori (Dor ipenem) , Vanco( Vancomycin hydrochloride) 및 Xigris(Drotrecogin al fa(act ivated) )의 병용 효과를 비교하고자 하였다. LPC(5 mg/kg), DW286AA(5 mg/kg) , Dori (200 mg/kg) , VancodO mg/kg) , Xigris(2 mg/kg) , LPC+DW286AA(5+5 mg/kg) , LPC+Dori (5+200 mg/kg) , LPC+Vanco(5+10 mg/kg) 및 LPC+Xigr is(5+2 mg/kg)를 각각 CPA-CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후에 단회 정맥 투여한 다음， 사망률 및 체중의 변화를 관찰하였다. 모든 단일 실험물질은 멸균 생리식염수에 용해시켜 10 ml /kg으로 각각 투여하였고， 모든 복합 조성군에서는 각각의 약물을 LPC (0.5 mg/ml)가 용해되어 있는 용액에 직접 적절 용량을 각각 용해시켜 투여하였다. 이와 같은 투여 순서와 투여군은 도 4에 간단히 나타내었다. 구체적으로， ICR 마우스 (6 주령 수컷， SIX, Japan)를 총 11개 군 (군 당 10마리)인 CPA 대조군 (CPA 투여 후 Sham 수술 매체 투여군)， CPA-CLP 대조군 (CPA 투여 후 CLP 수술 매체 투여군)， CPA-CLP 후 LPC 5 mg/kg 투여군， CPA-CLP 후 DW286AA 5 mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 Dori 200 mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 Vanco 10: mg/kg .투여군—， CPA-CLP-ᅳ후 ' Xigris- 2- mg/kg: 투여군ᅳ CPA-CLP 후 LPC+DW286AA 5+5 mg/kg 투여군， CPA—CLP 후 LPC+Dori 5+200 mg/kg 투여군， CPA-CLP 후 LPC+Vanco 5+10 mg/kg 투여군 및 CPA-CLP 후 LPC+Xigris 5+2 mg/kg 투여군으로 나누었다. 투여는 멸균 생리식염수를 매체로 사용하여 CLP 수술 6시간 후 10 ml/kg으로 단회 정맥 투여하였다. - 즉， LPC(5 mg/kg), DW286AAC5 mg/kg) , Dori (200 mg/kg) , VancoClO mg/kg), Xigris(2 mg/kg) , LPC+DW286AA(5+5 mg/kg) , LPC+Dori (5+200 mg/kg) , LPC+Vanco (5+ 10 mg/kg) 및 LPC+Xigris(5+2 mg/kg)를 각각 CPA—CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후에 단회 정맥 투여하였다. 모든 단일 실험물질은 멸균 생리식염수에 용해시켜 10 ml/kg으로 각각 투여하였고， 모든 복합 조성군에서는 각각의 약물을 LPC(0.5 mg/ml)가 용해되어 있는 용액에 직접ᅳ적절 용량을 각각 용해시켜 투여하였다. 투여 '사망률 ,및 - 체중의 변화를 상기 실시예 3ᅳ3의 방법으로 관찰하였다.
【표 8】 .:
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【표 9]
Cm-GLP패¾ 후스 ΐ(δΕΡύ1¾ ¾：존臺
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그 결과， 상기 표 8 및 9에서 알 수 있듯이， 모든 CPA 대조군 마우스는 관찰기간인 3일 동안 생존하였으나， CLP 대조군에서는 CLP 2일 이내에 10마리 중 10마리가 사망하여, 100%의 사망를을 나타내었고, Vanco 투여군에서는 각 CLP 3일 이내에 모든 실험동물이 사망하였으며， LPC, Dori 및 Xigris 투여군에서는 CLP 3 이내에 '각각 9, 8, 10마리씩 실험동물이 사망하였다. 그러나, LPC 단독 또는 DW286M, Dori, Vanco 및 igris 단독보다 LPC와의 병용 군인 LPC+Dori, LPC+Vanco, LPC+Xigr is군에서 사망를이 줄어들거나 사망시간이 지연되었다 (표 8). 한편， DW286M, LPC+DW286AA, LPC+Dori, LPC+Vanco 및 LPC+Xigr is 투여군에서는 CLP 수술 3일 후에도 각각 4(4/10; 40%)， 9(9/10； 90%), 5(5/10； 50%) , 4(4/10； 40%) 및 3(3/10; 30%) 마리의 생존례가 인정되었다 (표 9).
모든' CPA-CLP 수술군에서는 CLP 수술 1일 후부터 CPA 대조군에 비해 현저한 체증 감소를 나타내었으나， 모든 약물 투여군에서는ᅵ CPA-CLP 투ᅳ여군과-비: ΞΙ"하여ᅳᅳ 미 있는 ^중의 변화는 나지 ¾았 .'
이와 같은 LPC 및 각각의 단일 투여군에.비해 LPC+DW286AA, LPC+Dori LPC+Vanco" ¾ " LPC+Xigr is 투여군에서 ' 인청된 생존흩 ~및 생존기간의 층가는 LPC 병용에 의해 이들의 효과가 증가됨을 의미하며, 이러한 결과는 본 발명의 병용 제제의 면역증강 또는 세균성 감염 질환에 대한 우수한 치료 효과를 뒷받침하는 것이다. 실시예 8: CPA-CLP로 유도된 모델에서 LPC와 항생제와의 단독 및 병용투여가 생존에 미치는 영향 분석
CPA로 면역억제를 유발시킨 다음， CLP로 패혈증을 유발시킨 마우스를 이용하여, LPC와 Colistin, Tobra(Tobramycin) 및 Fusidin( fusidic acide sodium)의 병용 효과를 비교하고자 하였다. LPC(5 mg/kg) , colistin (5 mg/kg) , tobramycin(4 mg/kg) , fusidin(80 mg/kg) , LPC+col ist in (5+5 mg/kg) , LPC+tobramycin(5+4 mg/kg) 및 LPC+fusidin(5+80 mg/kg)를 각각 CPA-CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후에 단회 정맥 투여한 다음， 사망률 및 체중의 변화를 관찰하였다. 또한, DW286A 5 mg/kg)을 대조약물로 사용하였으며, 모든 단일 실험물질은 멸균 생리식염수에 용해 시켜 10 ml /kg으로 각각 투여하였고 , 모든 복합 조성군에서는 각각의 약물을 LPC(0.5 nig/ml)가 용해되어 있는 용액에 직접 적절 용량을 각각 용해시켜 투여하였다. 이와 같은 투여 순서와 투여군은 도 5에 간단히 나타내었다.
구체적으로， ICR 마우스 (6 주령 수컷, SIX, Japan)를 총 10개 군인 CPA 대조군 (CPA 투여 후 Sham수술 매체 투여군), CPA-CLP 대조군 (CPA 투여 후 CLP 수술 매체 투여군)， CPA-CLP 후 DW286AA 5 mg/kg 투여군， CPA-CLP 후 LPC 5 mg/kg 투여군， CPA-CLP 후 colistin 5 mg/kg 투여군， CPA—CLP 후 tobramycin 4 mg/kg 투여군， CPA-CLP 후 fusidin 80 mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 LPC+col ist in 5+5 mg/kg 투여군, CPA-CLP 후 LPC+tobramycin 5+4 mg/kg 투여군 및 CPA-CLP 후 LPC+fusidin 5+80 mg/kg 투여군으로 나누었다. 투여는 멸균 생리식염수를 매체로 사용하여 CLP 수술 6시간 후 10 ml/kg으로 단회 정맥 투여하였다. 즉， LPC(5 mg/kg) , DW286AA(5 mg/kg) , col ist in(5 mg/kg) , tobramycin(4 mg/kg) , fusdin(80 mg/kg) , LPC+col ist in (5+5 mg/kg) , LPC+tobramycin(5+4 mg/kg) 및 LPC+fusidin(5+80 mg/kg)를 각각 CPA-CLP 패혈증 마우스에 CLP 수술 6시간 후에 단회 정맥 투여하였다. 모든 단일 실험물질은 멸균 생리식염수에 용해시켜 10 ml /kg으로 각각 투여하였고， 모든 복합 조성군에서는 각각의 약물을 LPC(0.5 mg/ml)가 용해되어 있는 용액에 직접 적절 용량을 각각 용해시켜 투여하였다. 투여 후， 사망률 및 체중의 변화를 상기 실시예 3-3의 방법으로 관찰하였다. [표 10】
CPA-GLP패헐충마우스모1 (SEP013)의사망 ¾에 대한 LPC및항생제병용의효과
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【표 : 11】 cHi rn s攀 i M
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一 ： ' '： ΐ.'결과， 상기 a 10 ϊί어 i서 알 수 있봇이 /모든 CPA 대조군 마우스는 관찰기간인 3일 동안 생존하였으나， CLP 대조군에서는 CLP '2일 이내에 10마리 중 10마리가 사망하여， 100%의 사망률을 나타내었고， LPC, Fusidin, colistin 및 tobramycin 단독 투여군에서는 CLP 3일 이내에 각각 9， 8， 9 및 8마리의 동물이 사망하였다. 그러나， LPC와 colistin, tobramycin 및 fusidin 병합 투여군에서는 사망률이 즐어들거나 사망시간이 지연되었다 (표 10). 한편 , DW286AA, LPC+col istin, LPC+ tobramycin 및 LPC+fusidin 투여군에서는 CLP 수술 3일 후에도 각각 8(8/10; 80%) , 4 (4/10； 40%) , 5(5/10； 50%) 및 5(5/10； 50%) 마리의 생존례가 인정되었다 (표 11). 모든 CPA-CLP 수술군에서는 CLP 수술 1일 후부터 CPA 대조군에 비해 현저한 체중 감소를 나타내었으나， 모든 약물 투여군에서는 CPA-CLP 투여군과 비교하여 의미 있는 체중의 변화는 나타나지 않았다.
이와 같은 LPC 및 각각의 단일 투여군에 비해 LPC+col istin, LPC+ tobramycin 및 LPC+fusidin 투여군에서 인정된 생존률 및 생존기간의 증가 결과는 LPC와 병용에 의해 이들의 효과가 증가됨을 의미하며， 이러한 결과는 본 발명의 병용 제제의 면역증강 또는 세균성 감염 질환에 대한 우수한 치료 효과를 뒷받침하는 것이다. 실시예 9: LPC와 신규 퀴놀린계 항생제인 DW286AA와의 병용이 생존에 미치는 영향 분석
패혈증에 대한 새로운 치료제 개발과정 증 LPC 및 DW286M의 최적 병용 투여방밥을 찾기 위하여， CPA— CLP 및 CPA로 유발된 면역억제 마우스를 이용하여 평가하였다. CPA-CLP 마우스 및 CPA 유발 면역억제 마우스에 LPC 및 DW286AA를 단독， 흔합 (LPC:DW286M 2:1)， LPC 선 투여 후 (2회) DW286M 후 투여 (2회)， DW286AA 선 투여 후 LPC 후 투여 후 사망률， 가슴샘 및 비장 중량， 혈중 백혈구수， 가슴샘 및 비장내 CD3+, CD4+, CD8+ 및 TNF-a + 세포의 수적 변화를 골수 내 소핵 다염적혈구수의 변화와 함께 평가하였다. 총 8 또는 9군 (매체 대조군 포함)으로 군 당 수컷 각각 9마리를 INTACT CONTROL: 정상 매체 대조군 (매체: 5% 인혈청 알부민)， CPA CONTROL: CPA 유발 면역억제 매체 대조군, CPA-CLP CONTROL: CPA 및 CLP 실시 매체 대조군, LPC: LPC 1 mg/kg 투여군， Mix: LPC-DW286AA(2: 1) 복합조성 0.75 mg/kg 투여군， DW286-LPC: DW286 0.5 mg/kg 2회 선 투여 후 LPC 1 mg/kg 2회 투여군， LPC-DW286: LPC 1 mg/kg 2회 선 투여 후 DW286M 0.5 mg/kg 2회 투여군， DW286: DW286AA 0.5 mg/kg 투여군으로 나누었다. 이와 같은 투여 순서와 투여군은 도 6에 간단히 나타내었다. 적정량의 후보 물질들을 5% 인혈청 알부민에 용해시켜 10 ml/kg의 농도로， 수술 6시간 후 또는 CPA투여 종료 24시간 후부터 12시간 간격으로 총 4회 피하주사로 투여하였다. INTACT, CPA 또는 CPA-CLP CONTROL군에서는 동일한 양의 5 ) 인혈청 알부민을 동일한 방법으로 투여하였다.
9-1. LPC 및 DW286aa의 투여 순서에 따른사망수 및 몸중량 평가
상기 실시예 3-3의 방법으로， 사망수， 생존수 및 몸중량을 평가하였다. 그 결과， INTACT 및 CPA CONTROL군에서는 관찰기간 동안 사망례가 전혀 인정되지 않았으나， CPA-CLP CONTROL군에서는 CLP 1일 및 2일 후에 각각 6 및 3례의 사망례가 인정되어 CLP 2일 후에 모든 실험동물 (9/9, 100%)이 사망하였다 (표 12). 한편, LPC, LPC-DW286 및 DW286군에서는 CLP 4일 후 모든 실험동물이 사망하였고， Mix 및 DW286-LPC 군에서는 CLP 5일 후 모든 실험동물이 사망하였으며， Mix군에 비해 DW286- LPC 군에서 더 높은 초기 생존율이 인정되었다 (표 12).
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** p<0.05 MW태스트에 대한 intact contror의 것고 ϋ|교
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1)사망한동울의 수 /¾찰한동울:의총수 (Survival rate)
CLP 수술 1일 후， CPA 및 CLP 처리군에서 유의적인 (pO.Ol or p<0.05) 몸중량의 감소가 INTACT contra과 비교하여 탐지되었다. 그러나， 모든 테스트군은 본 발명의 CPA 또는 CPA-CLP control과 비교하여 몸중량의 의미있는 변화가 관찰되지 않았다 (표 12). 투여기간 동안의 증체량은 CPA control군의 경우， INTACT control에 비해 -3.95%의 변화를 나타내었으며, LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286 투여군에서는 CPA control에 비해 각각 -12.35, -17.65, 2.16, -8.82 및 ᅳ 1.37%의 변화를 나타내었다. 모든 CPA 투여군에서 인정된 체중 감소는 CPA의 직접적인 독성 증상으로 인한 것으로 판단되며， LPC 및 DW286은 CPA 투여에 의해 유발되는 체중 감소를 억제하지 못하는 것으로 관찰되었다.
한편， 시험물질 투여 후 초래된 경미한 증체량의 감소는 피하주사에 따른 자극 등에 의한 이차적 소견으로 판단된다.
또한， LPC 및 DW286M의 단독 투여시에도 CP/HXP에 의한 사망례를 현저히 감소시키는 것으로 관찰되었으나 각각의 단독 투여보다는 흔합조성 및 DW286M 선투여 후 LPC를 투여한 DW286-LPC 군에서 더 우수한 생존율을 나타내었으며， 특히 Mix 보다 DW286ᅳ LPC 군에서 더 높은 초기 생존율을 나타내어 (표 13)， 패혈증 치료시 DW286M 선 투여 후 LPC를 투여하는 것이 더 우수한 치료 효과를 나타낼 것으로 기대할 수 있다.
【표 13】
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9-2. CPA-처리 모델의 몸중량의 변화
모든 CPA 처리군은 INTACT control과 비교하여 유의적인 몸중량 감소를 보였다 (ρθ.01). 본 발명의 CPA control군과 비교하여 모든 테스트군에서 몸증량의 의미없는 변화가 감지되었다. 더욱이， CPA control을 포함하는 모든 테스트군에서 희생물에 최초의 투여 후 유사한 몸중량 증가를 관찰하였다 (표 14).
【표 14】
-처리 아우스에서 중량의 변화관찰
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9-3. CPA-처리 모델의 장기 중량의 변화
상기 실시예 3-4의 방법으로 장기 중량을 측정하였다. 그 결과, INTACT control과 비교하여 CPA contr 에서 상대적이고 절대적인 비장 및 가슴샘의 중량의 감소를 관찰하였다. 그러나， 유의적이지 않은 가슴샘 중량의 증가를 LPC, Mix 및 DW286에서 관찰하였으며， 유의적인 비장 중량의 증가를 (p<0.01) CPA control과 비교하여 LPC, Mix 및 DW286-LPC 에서 각각 관찰하였다 (표 15). 【표 15]
CPA-처리 아우스에서 절대 및 상대 기관중량의 변화관찰
Figure imgf000042_0001
n=9; (Mean土 S.D.), g or %;상대 중량 (%) = [(절대 기관중량 /희생당시 몸 중량) 100]; * p<0.01 MW日|스트에 대한 intact control과의 비교; #p<0.01誦테스트에 의한 CPA control의 것과 비교 절대 및 상대 가슴샘 중량은, CPA contr 에서 INTACT control과 비교하여 각각 -55.74 및 -52.62% 변화하였다. LPC, Mix, DW286-LPC, LPC- DW286 및 DW286군에서 절대적인 가슴샘 중량은 13.31， 10.24， 7.17, 2.39 및 —2.73% 변화되었고, 상대적인 가슴샘 중량은 CPA control과 비교하여 각각 7.56， 13.74, 9.51, 5.47 및 -3.12% 변화하였다. 그러나， 유의성 있는 증가는 모든 투여군에서 인정되지 않았다.
절대적이고 상대적인 비장의 중량은， CPA control에서 INTACT contr 과 비교하여 —63.38 및 _60.63¾> 변화를 나타내었다. 절대적인 비장의 증량은 LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286에서 35.62, 28.77 31.28, 11.87 및 —7.08%로 변화되었으며， 상대적인 비장의 중량은 CPA contr 과 비교하여 각각 40.69， 32.54, 32.96, 14.38 및 -7.46% 변화를 나타내었다.
모든 CPA 투여군에서 인정된 비장 및 가슴샘의 중량 감소는 림프구의 감소에 따른 변화로 생각되며, LPC 및 DW286-LPC 병용투여는 CPA 투여에 의해 유발되는 임파 장기 중량의 감소를 효과적으로' 억제하는 것으로 관찰되었으며， LPC 단독 투여보다 Mix 및 LPC-DW286 투여군에서 유사하거나 비교적 낮은 감소 억제 효과가 나타났다. 9-4. CPA-처리 모델에서 총 혈액 WBC수의 변화
상기 실시예 3-5의 방법으로 혈액 수집 및 WBC를 계산하였다. 그 결과, INTACT control에 비해 모든 CPA 유발군에서는 유의성 있는 (ρθ.01) 혈증 총 백혈구수의 감소가 일어났으나， CPA control에 비해 DW286 투여군을 제외한 모든 투여군에서 현저한 총 백혈구수의 증가가 관찰되었으나 유의성 있는 (ρ<0·01) 증가는 DW286-LPC 투여군에 국한되어 나타났다 (표 16).
【표 16】
CPA-¾¾ W우스에서혈중 WBC수의변화 ¾이의분별 countSi 대조군 EII스트군
혈중 WBC
LPG Mix DW28 PC LPC-DW286 DW286
Figure imgf000043_0001
CPA control에서 혈액 총 WBC 숫자는 INTACT control과 비교하여 ― 91.58% 변화를 보였다. LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-D 286 및 DW286군에서 CPA contr 과 비교하여 각각 25.00 32.74, 61.31, 19.64 및 -11.31% 변화하였다. 즉, CPA 투여시 일반적으로 현저한 백혈구 감소가 초래되는 것으로 알려져 있는데， 본 실험의 결과， LPC는 CPA 투여에 의해 유발되는 백혈구의 감소를 비교적 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었으며， LPC 단독 투여보다 DW286-LPC 투여군에서 더 우수한 효과가 나타남을 확인하였다. 이러한 결과는， 병용 제제의 경우 DW286 선 투여가 보다 효과가 좋다는 것을 나타낸다. 9-5. CPA-treated model에서 WBC의 분별 counts의 변화
분별 count 결과, CPA에 의한 백혈구의 감소는 주로 림프구 감소에 의한 변화로 관찰되었으며， 상대적으로 중성호성 백혈구 및 단핵구 비율의 증가가 초래된 것으로 관찰되었다 (표 16). 한편， 본 실험의 결과 LPC및 DW286-LPC 병용투여는 CPA 투여에 의해 유발되는 백혈구의 감소를 비교적 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었으며， LPC 단독 투여보다 DW286-LPC 투여군에서 더 우수한 효과가 인정되었다.
CPA control에서의 림프구， 중성호성백혈구 및 단핵구의 비율은 I TACT control과 비교하여 각각 ᅳ 72.47， 88.11 및 456.43% 변화하였다. LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286군에서 림프구의 비율은 268.78， 244.85, 290.37, 204.01 및 -23.56%로 변화하였으며， 중성호성 백혈구의 비율은 -51.07， -46.05, -50.01， -18.81 및 -1.09%의 변화를 나타내었고， 단핵구의 비율은 CPA control과 비교하여 -85.27， -82.32, -91.16, -86.45 및 13.43¾>의 변화를 나타내었다.
9-6. CPA-treated model에서 골수 MNPCEs의 변화
상기 실시예 3-6의 방법으로 골수 소핵 다염적혈구 변화를 관찰하였다. 그 결과， CPA는 돌연변이 발생률을 높이는 물질로 알려져 있으며， 골수 내의 소핵다염적혈구를 현저히 증가시키는 것으로 알려져 있다. INTACT contr 과 비교하여 CPA control에서는 소핵 다염적혈구 (MNPCEs)는 유의적으로 증가하고 (ρθ.01) PCE/(PCE+NCE)는 감소하였다. 모든 투여군에서 CPA control에 비해 의미있는 소핵다염적혈수 및 PCE 비율의 변화가 일어나지 않았다 (표 17).
【표 17]
CPAᅳ처리 마우스에서 S수 MNPCE및 PCE/(NCE+PCE)의 변화관찰
Figure imgf000045_0001
n=9;(Mean士 S.D.); *p<0.01 MW日 I스트에 대한 intact control과의 비교
CPA contml에서 골수 소핵 다염적혈구 및 다염적혈구의 비율은 I TACT control과 비교하여 1512.50 및 -60.38% 변화하였다. LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 D 286 군에서 MNPCE 수는 -14.34, -0.78ᅳ—12.02， -5.43 및 -10.85%의 변화를 나타내었으며， 다염적혈구의 비율 (PCE/(PCE+NCE))은 각각 CPA control과 비교하여 -12.98, 6.14, -11.80 -1.49 및 -14.79%로 변화를 나타내었다.
이와 같은 결과는， LPC 및 DW286 단독 투여와 병용 투여 모두 CPA에 의해 골수 내 소핵 다염적혈구 세포의 증가에 별다른 영향을 미치지 않는 것을 뒷받침하는 것이다. 다염적혈구의 비율은 실험물질의 골수 내 세포 독성을 평가하는 항목으로， 본 실험의 결과 모든 CPA 투여군에서는 현저한 PCE 비율의 감소가 초래되었으며， 이러한 PCE 비율의 감소는 CPA의 과량 투여에 의한 것으로 판단된다.
9-7. CPA-처리 모델에서 가슴샘과 비장의 조직병리적 변화
상기 실시예 3-7의 방법으로 조직병리적 변화를 관찰하였다. 그 결과, 가슴샘 피질에서 림프구 세포의 감소 및 현저한 비장 위축이 CPA control에서 탐지되었다. 그러나， 이러한 위축성의 변화는 LPC, LPC-D 286 및 DW286-LPC의 처리에 의해 효과적으로 억제되었으며， DW286-LPC 군은 다른 군에 비하여 가장 높은 억제 경향을 보였다 (도 7 및 8). 조직형태계측법에서， 비장에서의 백색 수질의 수는 (p<0.01) INTACT contr 과 비교하여 CPA contr 에서 유의성 있게 감소되었으나， DW286 단독 투여군을 제외한 모든 투여군에서 유의적으로 증가하였다. 더욱이, 가슴샘 피질에서의 림프성 세포의 감소는 역시 DW286군을 제외한 CPA control과 비교하여 모든 투여군에서 현저히 억제되었다 (표 18).
【표 18】 조직 병리학에서 CPA-처리 마우스에서 비장 및 가승생의 조직형태계측학적 변화 1 ; 가승생: 가승생 피질의 위축발생 |2)
Figure imgf000046_0001
; #p<0.01日|스트 의 CPA control의 ¾과 비교
비장 내 백색 수질의 수는 CPA contr이에서 INTACT contr 과 비교하여 -66.67%의 변화를 보였다. 그들은 LPC, Mix, DW286-LPC, LPC- DW286 및 DW286 군에서는 CPA control과 비교하여 101.79， 71.43, 105.36, 101.79 및 —1.79% 의 변화를 나타내었다.
가슴샘 피질 위축 빈도 (가슴샘 피질에서의 림프성 세포의 감소 현상)는 INTACT control, CPA control, LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286군에서 0， 100， 88.89, 88.89， 66.67, 77.78 및 10OT로 각각 관찰되었다. 본 실험의 결과， LPC및 DW286-LPC 병용투여는 CPA 투여에 의해 유발되는 임파 장기 내 림프구의 감소를 비교적 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었으며， LPC 단독 투여보다 DW286-LPC 투여군에서 더 우수한 효과가 인정되었다.
9-8. CPA-처리 모델에서 가슴샘 및 비장의 면역조직화학분석
상기 실시예 3-8의 방법으로 면역조직화학 분석을 수행하였다. 그 결과， 비장의 CD3+, CD4+, CD8+ 및 TNF-a+ 세포의 유의적인 감소 (ρθ.01)는 INTACT control과 비교하여 CPA control에서 관찰되었으며， CD3+ 및 TNFᅳ a+ 세포의 유의적인 감소는 가슴샘의 피질 및 수질에서 각각 관찰되었다. 그러나， 이러한 세포는 DW286 군를 제외한 모든 투여군에서 CPA contr 에 비해 유의성 있게 증가하였다. 특히， LPC 단독 투여군보다 DW286-LPC 군에서 유사하거나 더 우수한 감소 억제 효과가 인정되었다 (표 19 및 도 9 내지 16).
면역조직화학 g에서 CPA-처리 Q우스에서 비 §및 가슴생에서 CD3+, CD4+, CD 및 TNF-CC+세포 SI조직 형태 계 적 변화
―
Figure imgf000048_0001
비장 내 CPA contr 군에서 CD3+, CD4+ 및 CD8+ eel Is의 수는 INTACT control과 비교하여 -68.32， -83.15 및 -73.26%의 변화를 보였다. LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286군의 CD3+ 세포의 수는 18.29, 77.26, 99.32, 81.03 및 -14.02% 변화하였으며, CD4+ 세포의 수는 136.54， 99.76, 135.58, 79.81 및 -10.82% 변화하였으며， CD8+ 세포는 CPA contr 과 비교하여 72.89, 48.81, 109.33， 38.83 및 -10.63% 변화하였다.
가슴샘 피질 내 CPA control 군에서 CD3+, CD4+ 및 CD8+ 세포의 수는 INTACT contr 과 비교하여 —75.41， 64.29 및 28.57% 변화하였다. LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286군의 CD3+ 세포의 수는 328.69， 216.61 323.44, 279.91 및 -9.16% 변화하였으며， CD8+ 세포의 수는 CPA control의 수와 비교하여 11,11， 33.33, -7.41, 11.11 및 33.33% 변화하였다.
가슴샘 수질 내 CPA control 군에서 CD3+, CD4+ 및 CD8+ 세포의 수는 INTACT contr 과 비교하여 -90.00， -8.33 및 28.57%의 변화를 나타내었다. LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286군에서 CD3+ 세포의 수는 2466.67 500.00, 2366.67, 2466.67 및 -33.33%로 변화하였으며， CD4+ 세포의 수는 CPA control과 비교하여 -9.09, -18.18, -13.64, 4.55 및 27.27% 변화하였다. CD8+ 세포의 수는 CPA control과 비교하여 -5.56, -11.11, - 5.56, -16.67 및 -22.22% 변화하였다.
비장， 가슴샘 피질 및 수질 내 CPA contr 에서 TNF— α+ 세포는 INTACT contr 과 비교하여 -51.73， —51.06 및 ᅳ 155.56%의 변화를 보였다. LPC, Mix, DW286-LPC, LPC-DW286 및 DW286 군에서 비장의 TNF-a+ 세포는 36.75， 12.89， 34.84, 27.68 및 -13.84% 변화하였으며， 가슴샘 피질 내 TNF- a + 세포는 65.22， 30.43, 60.87， 30.43 및 -13.04% 변화하였으며， 가슴샘 수질 내 TNF-a+ 세포는 CPA control과 비교하여 133.33， 0.00, 0.00， 133.33 및 0.00% 변화를 나타내었다. 즉， CPA에 의해 현저한 비장 및 가슴샘 내 CD3+, CD4+, CD8+ 및 TNF— a+ 세포의 감소가 초래되었으나， LPC 및 DW286-LPC 병용 투여는 CPA 투여에 의해 유발되는 이들 세포의 감소를 비교적 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었으며， LPC 단독 투여보다 DW286-LPC 투여군에서 더 우수한 효과가 인정되었다.
LPC 단독 및 LPC와 DW286의 병용 투여는 CPA 투여에 의해 유발되는 면역억제 및 CPA— CLP에 의해 초래되는 패혈증에 의한 사망례를 비교적 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었으며， 특히 DW286 선 투여 후 LPC를 투여하는 경우 (DW286-LPC)에 가장 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과들은， 본 발명의 LPC를 다양한 항생제와 동시에 또는 순차적으로 병용 투여하는 경우， LPC 단독의 투여보다 현저한 면역증강 효과 및 세균성 감염 질환의 우수한 치료 효과를 나타낼 수 있음을 뒷받침하는 것이다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
(i) 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체,
유효성분으로 포함하는 면역 증강용 또는 세균성
약제학적 조성물.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 라이소포스파티딜콜린은
표시되며, 상기 라이소포스파티딜콜린의 유사체는
표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 조성물.
화학식 1
Figure imgf000051_0001
상기 식에서， Rr C4-30의 알킬이거나， 하나 또는 그 이상의 이증결합을 지닌 C4-30의 알케닐이고，
화학식 2
Figure imgf000051_0002
상기 식에서， ¾는 C4-30의 알킬이거나， 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 C4-30의 알케닐이다. 【청구항 3】
제 2 항에 있어서， 상기 화학식 1 의 화합물은 L-a- 라이소포스파티딜콜린， 스테아로일； L-a -라이소포스파티딜콜린 , 미리스토일; L-Q-라이소포스파티딜콜린， 팔미토일; DLᅳ α_ 라이소포스파티딜콜린， 팔미토일; 및 L-tt-라이소포스파티딜콜린， 올레오일로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 4]
제 2 항에 있어서， 상기 화학식 2의 화합물은 L-a - 라이소포스파티딜콜린， χ— 0-알크— I-에닐; L-a-라이소포스파티딜콜린， vᅳ 0- 알킬; DL-a-라이소포스파티딜콜린， X-C)-핵사데실; 및 L-a- 라이소포스파티딜콜린， χ-ο-핵사데실로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물. 【청구항 5】
제 1 항에 있어서, 상기 라이소포스파티딜콜린은 이성질체 (isomer)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 6】
제 1 항에 있어서， 상기 항생제는 카바페넴계 (carbapenem) 항생제， 세팔로스포린계 (cephalosporin) 항생제, 당펩타이드계 (glycopeptide) 항생제， 페니실린계 항생제， 퀴놀론계 (quinolone) 항생게, 세린 프로테아제계 (serine protease) 항생제， 폴리믹신계 (polymyxin) 항생제， 아미노글리코시드계 (aminoglycoside) 항생제， 살균계 (bacter iostat ic) 항생제， 및 상기 항생제의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 7】
제 6 항에 있어서， 상기 카바페넴계 항생제는 도리페넴 (Doripenem)이고, 상기 세팔로스포린계 항생제는 세프트리악손 나트륨 (Ceftriaxone sodium)이며， 상기 당펩타이드계 항생제는 염산반코마이신 (Vancomycin hydrochloride)이고， 상기 페니실린계 항생제는 벤질페니실린 칼륨 (Potassium benzylpenici 11 in)이며, 상기 퀴놀론계 항생제는 DW286 ( 7- [ 3- ( am i nome thyl )-4-(met hoxy imino) -3-me thyltetr ahydro- lH-l-pyrrolyl ]-l-cyclopropyl-6-f luoro-4-oxo-l , 4-dihydro[l,8] naphthyr idine-3-carboxyl ic acid hydrochloric acid salt) 또는 시프로플톡사신염산염수화물 (Ciprofloxacin hydrochloride hydrate)이고， 상기 세린 프로테아제계 항생제는 드로트레코진 알파 (활성화된) (Drotrecogin alfa(activated))이며, 상기 폴리믹신계 (polymyxin) 항생제는 콜리스틴 (col ist in)이고, 상기 아미노글리코시드계 (aminoglycoside) 항생제는 토브라마이신 (tobramycin)이며， 상기 살균계 (bacteriostatic) 항생제는 푸시딘산 (fusidic acid)인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 8]
제 1 항에 있어서， 상기 세균성 감염 질환은 복막염， 폐렴， 골수염， 봉소염， 뇌막염, 신장염, 심장염， 장염， 위염， 식도염， 십이지장염， 대장염, 또는 패혈증인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 9]
(i) 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체， 및 (Π) 항생제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는， 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료 방법.
【청구항 10】
제 9 항에 있어서, 상기 (i) 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체 , 및 (Π) 항생제는 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법. 【청구항 111
(i) 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체， 및 (Π) 항생제가 단일 또는 별개의 용기에 담겨져있는， 면역 증강 또는 세균성 감염 질환의 치료용 키트.
【청구항 12】
제 11 항에 있어서， 상기 키트는 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체， 및 항생제의 흔합 방법; 항생제 투여 후 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체의 투여 순서 또는 투여 방법; 또는 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유사체의 투여 후 항생제 투여 순서 또는 투여 방법이 기재된 설명서를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
PCT/KR2012/004942 2011-06-23 2012-06-22 항생제 및 라이소포스파티딜콜린을 포함하는 면역 증강 또는 세균성 감염 질환 치료용 조성물 WO2012177075A2 (ko)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020141676A (ja) * 2013-09-26 2020-09-10 ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール リゾホスファチジルコリンの足場を利用する組成物及び方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101951933B1 (ko) * 2013-03-12 2019-02-25 주식회사 아리바이오 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유도체를 포함하는 지질나노물질 및 이의 제조방법
LT6177B (lt) 2014-10-10 2015-07-27 Uab "Biocentras" Fermentų kompleksų išskyrimas iš steptomyces gougerotii 101, daugiafermentinių biopreparatų ruošimas bei taikymas
WO2019060761A1 (en) * 2017-09-21 2019-03-28 The Scripps Research Institute NEW THERAPIES FOR TREATING AND PREVENTING CHRONIC RHINO-SINUSITIS

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4019571A1 (de) * 1990-06-20 1992-01-02 Hoechst Ag Pharmazeutische kombinationspraeparate enthaltend cephalosporin- und xanthinderivate und deren verwendung
US6165997A (en) * 1997-11-20 2000-12-26 Statens Serum Institut Phospholipids having antimicrobial activity with or without the presence of antimicrobials
KR20050034584A (ko) * 2001-10-05 2005-04-14 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 Ｓｉｒｓ/패혈증의 치료 및 예방 방법 및 이를 위한조성물
WO2003080071A1 (en) * 2002-03-25 2003-10-02 Biosynergen, Inc. Novel therapeutical use of agonist ligands specific to g2a receptor
KR100849448B1 (ko) * 2002-08-22 2008-07-30 주식회사 바이오시너젠 라이소포스파티딜콜린 또는 그 유사체를 포함하는 선천성면역 증강 조성물
MX2009009918A (es) * 2007-03-23 2009-10-19 Basilea Pharmaceutica Ag Medicamentos combinados para el tratamiento de infecciones bacterianas.
KR101071852B1 (ko) 2009-05-06 2011-10-11 충남대학교산학협력단 도코사헥사에노일 리소포스파티딜콜린을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Guide for the Care and Use of Laboratory Animals", 1996, INSTITUTE OF LABORATORY ANIMAL RESOURCES, COMMISSION ON LIFE SCIENCE
See also references of EP2740479A4
YAN ET AL.: "Therapeutic effects of lysophosphatidylcholine in experimental sepsis.", NAT. MED., vol. 10, 2004, pages 161 - 167, XP002735046, DOI: doi:10.1038/nm989

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020141676A (ja) * 2013-09-26 2020-09-10 ナショナル ユニヴァーシティー オブ シンガポール リゾホスファチジルコリンの足場を利用する組成物及び方法

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