WO2012157672A1 - 血管新生阻害剤の効果を予測する方法 - Google Patents

血管新生阻害剤の効果を予測する方法 Download PDF

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悠介 成田
幸範 箕嶋
山口　温美
雄亮 安達
一彦 山田
松井　順二
正史 門脇
高橋　健太郎
船橋　泰博
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Definitions

  • the present invention relates to a novel method for predicting the reactivity of a subject suffering from cancer to an angiogenesis inhibitor.
  • kinase inhibitors have been developed as anticancer agents.
  • a group of substances having inhibitory activity against receptor tyrosine kinases such as vascular endothelial growth factor (hereinafter sometimes referred to as “VEGF”) receptors have the property of inhibiting angiogenesis associated with cancer growth.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • no anticancer drug effective for all cancer types has yet been approved.
  • advanced malignant melanoma is highly metastatic and has an extremely poor prognosis, and therefore, it is difficult to develop an anticancer agent for malignant melanoma.
  • VEGF receptor fibroblast growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • B-Raf a kind of serine / threonine kinase, is known to activate an important MAP kinase pathway as a cell proliferation signal pathway as its cell proliferation signal.
  • B-Raf has been reported to be activated by mutation in various cancers (Non-patent Document 2).
  • the tumor suppressor gene PTEN phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10. encodes a lipid phosphatase that mainly controls PIP3 as a substrate and negatively regulates this signal.
  • PTEN has the function of inducing apoptosis by inhibiting the activation of Akt kinase and suppressing cell proliferation, but mutations and expression defects in PTEN cause excessive activation of Akt kinase, leading to cancer growth. It is known to cause (Non-patent Document 3). However, there has been no report associating the presence or absence of B-Raf mutation and the presence or absence of PTEN mutation or expression deficiency with the antitumor effects of angiogenesis inhibitors.
  • angiopoietin-1 (ANG1) and angiopoietin-2 (ANG2). It was. (B1) the expression level of ANG1 and ANG2 in the sample is low compared to the control value, (b2) the expression level of ANG2 in the sample is higher than the control value, or (b3) ANG1 and When the ratio of the expression levels of ANG2 was lower than the control value, it was revealed that subjects with tumors were highly responsive to angiogenesis inhibitors.
  • an angiogenesis inhibitor by using the ratio of the expression level of ANG1 and ANG2 or the ratio of the expression level of ANG1 and ANG2 or the presence or absence of B-Raf and PTEN mutation or expression deficiency in samples derived from subjects It is possible to predict the reactivity of the subject to an angiogenesis inhibitor without administering to the subject.
  • step (10) In the step (a), it is predicted that the subject has high reactivity with an angiogenesis inhibitor, (B) further comprising the step of quantifying the expression level of ANG1 and ANG2 in the sample derived from the tumor tissue of the subject, (B1) ANG1 expression level is low compared to control value (b2) ANG2 expression level is high compared to control value, or (b3) ratio of ANG1 and ANG2 expression level is control value
  • the subject is an indicator that the subject is highly responsive to angiogenesis inhibitors, (1) to (9).
  • step (a) it is predicted that the subject has high reactivity with an angiogenesis inhibitor, (C) selected from the group consisting of SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 and VEGFR1 in the sample derived from the tumor tissue of the subject
  • C1 SHC1 expression level is low compared to control value
  • c3 ARHGAP22 expression level is low compared to control value
  • (c4) SCG2 expression level is low compared to control value (c5) PML expression level is low compared to control value (c6) IL6 expression level is compared to control value Expensive (C7) CXCR4 expression level is high compared to the control value, (C8) The expression level of COL4A3 is high compared to the control value, (C8)
  • CXCR4A3 is high compared to the control value
  • the detection steps of the steps (a) to (c) further include a step of bringing a B-Raf and PTEN probe into contact with a sample derived from the tumor tissue of the subject (1) to (13) the method of.
  • the probe is preferably a nucleic acid probe, a specific antibody, or a combination thereof.
  • the angiogenesis inhibitor is 4- (3-chloro-4- (cyclopropylaminocarbonyl) aminophenoxy) -7-methoxy-6-quinolinecarboxamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • angiogenesis inhibitor for producing a medicament used for administration to a subject suffering from a tumor, wherein the subject is treated with the blood vessel by any one of the methods (1) to (14). Said use characterized in that it is predicted to be highly responsive to angiogenesis inhibitors.
  • the angiogenesis inhibitor is 4- (3-chloro-4- (cyclopropylaminocarbonyl) aminophenoxy) -7-methoxy-6-quinolinecarboxamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a pharmaceutical composition for treating a subject suffering from a tumor comprising an angiogenesis inhibitor, the subject responding to the angiogenesis inhibitor by any of the methods (1) to (14)
  • the pharmaceutical composition is characterized in that it is predicted to have high properties.
  • the angiogenesis inhibitor is 4- (3-chloro-4- (cyclopropylaminocarbonyl) aminophenoxy) -7-methoxy-6-quinolinecarboxamide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the pharmaceutical composition is 4- (3-chloro-4- (cyclopropylaminocarbonyl) aminophenoxy) -7-methoxy-6-quinolinecarboxamide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the angiogenesis inhibitor is preferably 4- (3-chloro-4- (cyclopropylaminocarbonyl) aminophenoxy) -7-methoxy-6-quinolinecarboxamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • 4- (3-Chloro-4- (cyclopropylaminocarbonyl) aminophenoxy) -7-methoxy-6-quinolinecarboxamide mesylate is particularly preferred.
  • the angiogenesis inhibitor is preferably 4- (3-chloro-4- (cyclopropylaminocarbonyl) aminophenoxy) -7-methoxy-6-quinolinecarboxamide or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the mesylate salt of (3-chloro-4- (cyclopropylaminocarbonyl) aminophenoxy) -7-methoxy-6-quinolinecarboxamide is particularly preferred.
  • the reactivity of a subject suffering from cancer to an angiogenesis inhibitor can be predicted.
  • an angiogenesis inhibitor particularly a VEGF receptor inhibitor, FGF receptor inhibitor, RET kinase inhibitor or KIT kinase inhibitor
  • a cancer patient in which the administration of the angiogenesis inhibitor is effective was selected.
  • an angiogenesis inhibitor can be administered, and cancer can be treated while reducing the risk of side effects.
  • FIG. 5 shows the correlation between the antitumor effect of melanoma cell E7080 and the percentage of pericyte blood vessels in the tumor. It is the figure which showed the expression level (a) of the protein of ANG1 and the expression level (b) of ANG1 mRNA when a melanoma cell is stratified by the presence or absence of the V600E mutation of BRAF. “+” Indicates that there is a mutation or expression defect, and “ ⁇ ” indicates that there is no mutation or expression defect.
  • PTEN In PTEN, “+” indicates that there is a mutation or expression defect, and “ ⁇ ” indicates that there is no mutation or expression defect. It is the figure which compared the ratio of the expression level of FGFR2 and FGFR3 when a melanoma cell is stratified by the presence or absence of a mutation of BRAF and PTEN, or an expression defect.
  • ⁇ BRAF wt / PTEN wt '' represents the case where BRAF and PTEN are wild type
  • ⁇ BRAF mu / PTEN mu '' represents the case where BRAF and PTEN have a mutation or expression defect
  • ⁇ BRAF mu / “PTEN wt” represents a case where BRAF has a mutation or expression deficiency and PTEN is wild type.
  • the present invention relates to a method for predicting the likelihood that a subject will respond to an angiogenesis inhibitor.
  • the method of the present invention comprises the steps of detecting the presence or absence of a B-Raf mutation or expression defect and the presence or absence of a PTEN mutation or expression defect in a sample derived from the tumor tissue of a subject. And in the said detection process, in the case of the following (a1) or (a2), the said test subject becomes a parameter
  • (A1) B-Raf is wild type and PTEN is wild type.
  • B-Raf has at least one mutation or expression deficient mutation selected from Table 1
  • PTEN has at least one mutation or expression deficient mutation selected from Table 2.
  • the present invention is a group consisting of SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 and VEGFR1 in a sample derived from the tumor tissue of the subject
  • C1 The expression level of SHC1 is low compared to the control value.
  • C2 NRP2 expression level is low compared to the control value.
  • C3 The expression level of ARHGAP22 is low compared to the control value.
  • the expression level of SCG2 is low compared to the control value.
  • C5 The expression level of PML is low compared to the control value.
  • C6 The expression level of IL6 is high compared to the control value.
  • C7 The expression level of CXCR4 is high compared to the control value.
  • C8 The expression level of COL4A3 is higher than the control value.
  • C9 The expression level of MEIS1 is higher than the control value.
  • the expression level of FGF9 is higher than the control value.
  • C11 The expression level of FGFR3 is higher than the control value.
  • C12 The expression level of FGFR2 is higher than the control value.
  • C15 The expression level of VEGFR1 is high compared to the control value.
  • the present invention includes a step of detecting the presence or absence of B-Raf and PTEN mutation or expression deficiency and the expression level of FGFR3 or FGFR2 in a sample derived from the tumor tissue of the subject. And in the said detection process, in the case of the following (d1) or (d2), the said test subject becomes a parameter
  • B-Raf and PTEN are wild type and express FGFR3 or FGFR2.
  • D2) B-Raf has at least one mutation or expression defect selected from Table 1
  • PTEN has at least one mutation or expression defect selected from Table 2, and FGFR3 or FGFR2 Is expressed.
  • the method of the present invention relates to a method for predicting reactivity to an angiogenesis inhibitor using the above index. That is, the method of the present invention detects the presence or absence of B-Raf and PTEN mutations or expression deletion mutations, or the expression level of ANG1 and ANG2 or the ratio of the expression levels of ANG1 and ANG2, and uses these detection results as indicators. And correlating with reactivity to an angiogenesis inhibitor.
  • the method of the present invention quantifies the expression level of SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 or VEGFR1, and uses these detection results as an index. And associating it with reactivity to an angiogenesis inhibitor.
  • the detection step may include a step of measuring the expression level or the ratio of the expression levels or a step of analyzing the obtained measurement results
  • the quantification step includes a step of measuring the expression level or the ratio of the expression levels.
  • the process of analyzing the obtained measurement result can be included.
  • the detection results and quantification results obtained by the method of the present invention are provided as information for determining whether or not a subject has high reactivity with an angiogenesis inhibitor. Such information is mainly used by medical personnel. When it is determined by the method of the present invention that there is a high possibility of reacting with an angiogenesis inhibitor, it can be expected that the effect of the angiogenesis inhibitor is effective (antitumor effect). It can be used as an index of treatment.
  • the angiogenesis inhibitor to be a target of the method of the present invention is a substance having angiogenesis inhibitory activity, and is a VEGF receptor inhibitor, FGF receptor inhibitor, PDGF receptor inhibitor, RET kinase inhibitor, KIT kinase inhibitor, epithelium
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • FGF receptor inhibitor FGF receptor inhibitor
  • PDGF receptor inhibitor PDGF receptor inhibitor
  • RET kinase inhibitor ase inhibitor
  • KIT kinase inhibitor epithelium
  • epithelium examples include growth factor (EGF) inhibitors, integrin inhibitors, matrix metalloprotease inhibitors, endogenous inhibitors.
  • VEGF receptor is a group of receptor tyrosine kinases, and in the present invention, VEGFR-1 (also referred to as Flt-1), VEGFR-2 (also referred to as KDR / Flk-1), VEGFR ⁇ 3 (also referred to as Flt-4). Furthermore, homologous amino acid sequence of any one of VEGFR-1, VEGFR-2 and VEGFR-3 and having VEGF receptor activity (current function is unknown, but in the future functionally the same family (Including those classified) are also included in the VEGF receptor. VEGF receptor activity can be measured by detecting phosphorylation of the receptor by ELISA or Western blotting using a specific antibody.
  • VEGF receptor inhibitor means an inhibitor having inhibitory activity against VEGF receptor. As long as the VEGF receptor inhibitor has an inhibitory activity on the VEGF receptor, it may have an inhibitory activity on other receptor tyrosine kinases and other in vivo molecules.
  • FGF receptor is a group of receptor tyrosine kinases, and in the present invention, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, and FGFR5 are collectively referred to. Furthermore, those having homology to any of the amino acid sequences of FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4 and FGFR5 and having FGF receptor activity (current function is unknown, but in the future functionally classified into the same family Are also included in the FGF receptor. The FGF receptor activity can be measured by detecting phosphorylation of the receptor by ELISA or Western blotting.
  • the “FGF receptor inhibitor” means an inhibitor having inhibitory activity against the FGF receptor. As long as the FGF receptor inhibitor has an inhibitory activity on the FGF receptor, it may have an inhibitory activity on other receptor tyrosine kinases and other biomolecules.
  • the “PDGF receptor” is a group of receptor tyrosine kinases, and in the present invention, it is a general term for PDGFR- ⁇ and PDGFR- ⁇ . Furthermore, it has homology to any of the amino acid sequences of PDGFR- ⁇ and PDGFR- ⁇ , and has PDGF receptor activity (currently unknown function, but functionally classified in the same family in the future) Are also included in the PDGF receptor. PDGF receptor activity can be measured by detecting the phosphorylation activity of the receptor by ELISA or Western blotting.
  • the “PDGF receptor inhibitor” means an inhibitor having inhibitory activity against the PDGF receptor. The PDGF receptor inhibitor may have inhibitory activity against other receptor tyrosine kinases and other biomolecules as long as it has inhibitory activity against the PDGF receptor.
  • RET kinase is a type of receptor tyrosine kinase and is a functional receptor for ligands of the glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) family.
  • GDNF glial cell-derived neurotrophic factor
  • RET kinase activity can be measured by detecting the phosphorylation activity of the receptor by ELISA or Western blotting.
  • RET kinase inhibitor means an inhibitor having inhibitory activity against RET kinase.
  • the RET kinase inhibitor may have inhibitory activity against other receptor tyrosine kinases and other biomolecules as long as it has inhibitory activity against RET kinase.
  • KIT kinase is also called c-Kit or SCF receptor, and is a kind of receptor tyrosine kinase.
  • KIT kinase inhibitor means an inhibitor having inhibitory activity against KIT kinase.
  • the KIT kinase inhibitor may have an inhibitory activity against other receptor tyrosine kinases and other biomolecules as long as it has an inhibitory activity against KIT kinase.
  • KIT kinase activity can be measured by detecting the phosphorylation activity of the receptor by ELISA or Western blotting.
  • EGF epidermal growth factor
  • EGF inhibitor means an inhibitor having an inhibitory activity on signaling induced by binding of EGF and its receptor.
  • the EGF inhibitor may have an inhibitory activity against other biomolecules as long as it has an inhibitory activity against signaling induced by EGF.
  • “Integrin” is one of cell surface proteins that mainly function as cell adhesion molecules.
  • the structure is composed of a heterodimer consisting of an ⁇ chain and a ⁇ chain, and 22 types of integrins have been confirmed by different combinations of ⁇ chains and ⁇ chains so far, forming an integrin family.
  • the “integrin inhibitor” means an inhibitor having an inhibitory activity on signaling induced by binding of an integrin and its receptor.
  • An integrin inhibitor may have an inhibitory activity against other biomolecules as long as it has an inhibitory activity on signaling induced by integrin.
  • Microx metalloproteases are a group of proteases dependent on zinc ions (Zn 2+ ) involved in the degradation of extracellular matrix. Matrix metalloproteases are known to promote angiogenesis by degrading the basement membrane around blood vessels. “Matrix metalloprotease inhibitor” means an inhibitor having inhibitory activity against matrix metalloprotease. The matrix metalloprotease inhibitor may have inhibitory activity against other biomolecules as long as it has inhibitory activity against matrix metalloprotease.
  • Endogenous inhibitory substance refers to an in vivo substance with angiogenesis inhibitory activity that is endogenously expressed by cells. Thrombospondin, prolactin, interferon ⁇ / ⁇ , interleukin-12, platelet factor 4 , Angiostatin, endostatin, or degradation products thereof.
  • “reactivity” to an angiogenesis inhibitor means a property that the growth of cancer cells is suppressed by administration of the angiogenesis inhibitor, and an index of sensitivity to the angiogenesis inhibitor. It is a property.
  • tumors are classified into benign tumors and malignant tumors, which are epithelial and non-epithelial, respectively.
  • cancer may refer to an epithelial malignant tumor.
  • “Highly responsive” to a subject's angiogenesis inhibitor refers to the property that the growth of tumor cells is strongly suppressed by the administration of an angiogenesis inhibitor. For example, an angiogenesis inhibitor is administered.
  • Tumor cell growth for example, when the growth rate or amount of tumor cells is 1/2 or less, preferably 1/5 or less, more preferably 1/10 or less compared to the control value, Alternatively, it can be said that the colony formation rate of tumor cells is 1/2 or less, preferably 1/5 or less, more preferably 1/10 or less compared to the control value.
  • the lesion in a clinical setting, for example, when an angiogenesis inhibitor is administered, the lesion remains at an increase of 20% compared to the control value.
  • the major axis sum of the target lesion is compared with the major axis sum before administration. A reduction of 30% or more, more preferably a case where all the target lesions disappear, is not limited to these examples.
  • sample derived from a subject's tumor tissue refers to tumor tissue collected from a subject, tumor cells released from tumor tissue such as circulating cancer cells, or DNA derived from tumor cells, RNA (eg, mRNA, miRNA) , TRNA, rRNA, ncRNA, dsRNA, snRNA, snoRNA, etc.), other nucleic acids or proteins, or those prepared from them in a form suitable for the practice of the present invention.
  • the tumor tissue or tumor cell collected from the subject may be a body fluid or blood.
  • the person who collects and prepares the sample may be the same person as the medical worker who performs the process of the present invention, or may be a different person.
  • the type of tumor to be predicted for reactivity to an angiogenesis inhibitor or the type of tumor affected by a subject is not particularly limited, and includes, for example, brain tumors (including pituitary adenomas and gliomas). ), Head and neck cancer, cervical cancer, jaw cancer, maxillary cancer, submandibular gland cancer, oral cancer (including tongue cancer, oral floor cancer, gingival cancer, buccal mucosa cancer, hard palate cancer), salivary gland cancer, sublingual gland Cancer, parotid gland cancer, nasal cavity cancer, sinus cancer (including maxillary sinus cancer, frontal sinus cancer, ethmoid sinus cancer, sphenoid sinus cancer), laryngeal cancer (supraglottic cancer, glottic cancer, subglottic cancer) ), Esophageal cancer, lung cancer (primary bronchial cancer, non-small cell lung cancer (including lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell lung cancer)), small cell lung cancer (buck
  • Tumors with a V600E mutation in B-Raf include, for example, melanoma, thyroid cancer, ovarian cancer, biliary tract cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer, glioma, myeloid leukemia and endometrial cancer (Schubbert et al., Nature Reviews Cancer, 2007, 7, p.295-309.). More preferred are melanoma, thyroid cancer, colon cancer, ovarian cancer, liver cancer, lung cancer, endometrial cancer and glioma, and more preferred is melanoma.
  • Whether a tumor is a tumor having a V600E mutation in B-Raf can also be examined using a method for detecting a mutation or expression deficiency in B-Raf described below.
  • Subjects in the present invention include subjects suffering from at least one of the above tumors. As long as the subject suffers from at least one of the above tumors, the subject may suffer from other diseases.
  • B-Raf (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1) (also referred to as “BRAF”) is a serine / threonine protein kinase belonging to the raf / mil family and determined from its mRNA. It means a gene (SEQ ID NO: 1) whose polynucleotide sequence is GenBank Accession No. NM_004333.4, and a GenBank Accession No. NP_004324.2 protein (SEQ ID NO: 2) translated therefrom. This protein has the function of regulating the MAP kinase / ERKs signaling pathway.
  • PTEN phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome10 is a gene (SEQ ID NO: 3) whose polynucleotide sequence determined from its mRNA is GenBank Accession No. NM_000314.4 and translated therefrom. GenBank Accession No. NP_000305.3 protein (SEQ ID NO: 4).
  • mutation of B-Raf or PTEN refers to substitution, deletion, insertion and substitution of one or more nucleotides in the polynucleotide sequence of B-Raf or PTEN and / or amino acids in the amino acid sequence. It means to be mutated by being added.
  • Raf or PTEN is judged to have a mutation.
  • Amino acid sequence mutation T599_V600insTT means that in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the B-Raf gene (SEQ ID NO: 1), a threonine 2 residue is inserted between the 599th threonine and the 600th valine; Or the variation
  • B-Raf is “wild type” when the presence or absence of at least one of the mutation sites shown in Table 1 is confirmed, the mutation is not detected, and the expression defect is not detected. Means state.
  • B-Raf being “wild type” is also referred to as “normal”.
  • the mutation of PTEN is one selected from those shown in Table 2 below.
  • the number between the alphabets indicates the position of the PTEN polynucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) or amino acid sequence (SEQ ID NO: 4), and the alphabet described before the number indicates the wild-type base sequence or It is an amino acid sequence, and the alphabet described after the number is the base sequence or amino acid sequence after mutation.
  • the nucleotide mutation T170G means that the nucleotide at position 170 in the protein coding region (SEQ ID NO: 3) of the PTEN gene is mutated from thymine to guanine
  • the amino acid mutation L57W is the corresponding protein.
  • Means that the 57th leucine is mutated to tryptophan.
  • Y76stop means that the 76th tyrosine codon in the amino acid sequence of PTEN was mutated to a stop codon and translation was stopped.
  • expression deficiency or “expression deficiency mutation” of PTEN refers to the protein of PTEN by deleting the PTEN gene or mutating the polynucleotide sequence of the PTEN gene (including the intron site). It means a state in which the expression of is lost. Therefore, when the detected amount of the polynucleotide and / or amino acid sequence of PTEN in the sample derived from the tumor tissue of the subject is statistically significantly reduced compared to the control value, or a preset cut When it is less than the off value, or when PTEN is below the detection limit, it is judged that PTEN is deficient in expression.
  • PTEN is “wild type” when the presence or absence of at least one of the mutation sites shown in Table 2 is confirmed and the mutation is not detected. means. Also, PTEN is “wild type” and PTEN is also “normal”.
  • ANG1 is angiopoietin-1 and “ANG2” is angiopoietin-2
  • polynucleotide sequences determined from mRNA are GenBank Accession No. NM_001146.3 and NM_00111888.1, respectively (ANG1 : SEQ ID NO: 45, ANG2: SEQ ID NO: 47) and protein translated therefrom (ANG1: SEQ ID NO: 46, GenBank Accession No. NP_001137.2, ANG2: SEQ ID NO: 48, GenBank Accession No. NP_001112360.1) To do.
  • SHC1 src homology2 domain containing transforming protein1
  • SEQ ID NO: 5 a gene whose polynucleotide sequence determined from its mRNA is GenBank Accession No. NM_003029.4, and translated therefrom It means the protein (SEQ ID NO: 6) of GenBank Accession No. NP_003020.2. This protein has functions related to apoptosis.
  • IL6 is a cytokine that plays an important role in hematopoiesis and inflammatory reactions, and a gene whose sequence determined from the mRNA is GenBank Accession No.NM_000600.3 (SEQ ID NO: 7) and the GenBank Accession No. NP_000591.1 protein (SEQ ID NO: 8) translated therefrom. This protein has a function of regulating the JAK / STAT signaling pathway and the MAP kinase / ERKs signaling pathway.
  • CXCR4 CXC chemokine receptor 4
  • fusin an ⁇ -chemokine receptor specific for stroma-derived factor 1
  • the polynucleotide sequence determined from its mRNA is GenBank Accession No. It means the gene (SEQ ID NO: 9) which is NM_001008540.1 and the GenBank Accession No. NP_001008540.1 protein (SEQ ID NO: 10) translated therefrom. This protein has a function of promoting cell migration.
  • COL4A3 (collagen, type IV, alpha 3) is a component constituting an extracellular matrix, and the gene whose polynucleotide sequence determined from the mRNA is GenBank Accession No.NM_000091.4 (SEQ ID NO: 11) and GenBank Accession No. NP_000082.2 protein (SEQ ID NO: 12) translated therefrom. This protein has a function of forming a cytoskeleton.
  • NBP2 neuropeptide-2
  • GenBankGenAccession No.NM_003872.2 SEQ ID NO: 13
  • GenBank Accession No. NP_003863.2 protein SEQ ID NO: 14
  • This protein has a function of promoting angiogenesis at the stage of development or canceration.
  • ARHGAP22 Rho GTPase activating protein 22
  • Rho GTPase activating protein 22 is a molecule involved in intracellular signal transduction, and a gene (sequence) whose polynucleotide sequence determined from the mRNA is GenBank Accession No. NM_021226.2 No. 17) and the GenBank Accession No. NP_067049.2 protein (SEQ ID NO: 18) translated therefrom. This protein has the function of controlling remodeling of the cytoskeleton.
  • SCG2 secretogranin2
  • secretogranin2 means a gene (SEQ ID NO: 49) whose polynucleotide sequence determined from its mRNA is GenBank Accession No. NM_003469.4, and GenBank Accession No. NP_003460 translated therefrom.
  • SEQ ID NO: 50 This protein is a secreted protein and has a function of promoting cell migration.
  • FGF9 fibroblast growth factor9
  • NM_002010 a secretory protein that plays an important role in cell differentiation and function maintenance
  • polynucleotide sequence determined from its mRNA is GenBank Accession No. NM_002010. 2 refers to the gene (SEQ ID NO: 51), and the GenBank Accession No. NP_002001.1 protein (SEQ ID NO: 52) translated therefrom. This protein has a function of interacting with FGFR3 described later.
  • PML promyelocytic leukemia
  • SEQ ID NO: 53 a gene whose polynucleotide sequence determined from the mRNA is GenBank Accession No. NM_002675.3, and This refers to the translated protein of GenBank Accession No. NP_002666.1 (SEQ ID NO: 54). This protein has a function of controlling cell growth as a tumor suppressor.
  • FGFR3 fibroblast growth factor receptor3
  • GenBank Accession No. NM_000142.3 It means the gene (SEQ ID NO: 55) and the protein (SEQ ID NO: 56) of GenBank Accession No. NP_000133.1 translated therefrom.
  • Two types of isoforms, FGFR3b and FGFR3c, are known for FGFR3.
  • FGFR2 fibroblast growth factor receptor2
  • FGFR2 fibroblast growth factor receptor2
  • NM_001144918.1 the polynucleotide sequence determined from the mRNA is GenBank Accession No. NM_001144918.1. It means the gene (SEQ ID NO: 57) and the GenBank Accession No. NP_001138390.1 protein (SEQ ID NO: 58) translated therefrom.
  • FGFR1 fibroblast growth factor receptor1
  • FGFR1 fibroblast growth factor receptor1
  • GenBank Accession No. NM_001174063.1 it means the gene (SEQ ID NO: 59) and the protein (SEQ ID NO: 60) of GenBank Accession No. NP_001167534.1 translated therefrom.
  • FGFR4 fibroblast growth factor receptor 4
  • FGFR4 fibroblast growth factor receptor4
  • NM_002011.3 the polynucleotide sequence determined from the mRNA. It means the gene (SEQ ID NO: 61) and the GenBank Accession No. NP_002002.3 protein (SEQ ID NO: 62) translated therefrom.
  • VEGFR1 vascular endothelial growth factor receptor 1
  • NM_001159920.1 means the gene (SEQ ID NO: 63) and the GenBank Accession No. NP_001153392.1 protein (SEQ ID NO: 64) translated therefrom.
  • the term “inhibitor” refers to a substance having an activity of inhibiting the function of a target molecule, for example, a compound, an antibody, an antisense oligonucleotide (“Antisense Drug Technology: Principles, Strategies, and Applications (Second Edition)”, CRC Press, 2007), RNAi oligonucleotides (“RNA Methodologies (Third Edition)”, Elsevier, 2005, Chapter 24), peptide nucleic acids (Kaihatsu et al., Chemistry & Biology, 2004, 11 (6), p.749- 758) and peptidic antagonists (Ladner et al., Drug Discovery Today, 2004, 9, p. 525-529).
  • the “angiogenesis inhibitor” means a substance having an activity of inhibiting angiogenesis, and is not particularly limited to the kind of the substance as long as it has such an activity.
  • examples include VEGF receptor inhibitors, FGF receptor inhibitors, PDGF receptor inhibitors, RET kinase inhibitors, KIT kinase inhibitors, EGF inhibitors, integrin inhibitors, matrix metalloprotease inhibitors, endogenous inhibitors, etc.
  • Preferred are VEGF receptor inhibitors, FGF receptor inhibitors, PDGF receptor inhibitors, RET kinase inhibitors and KIT kinase inhibitors more preferred are VEGF receptor kinase inhibitors and FGF receptor inhibitors, and most preferred are VEGF receptors.
  • it is a kinase inhibitor, it is not limited to these.
  • Organic acid salts such as tartaric acid, tosylic acid, stearic acid, benzoic acid, mesylic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, and trifluoroacetic acid, but are not limited thereto.
  • alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt
  • alkaline earth metal salts such as calcium salt and magnesium salt
  • organic base salts such as benzylethylenediamine, arginine, and lysine, and ammonium salts.
  • the angiogenesis inhibitor also includes an angiogenesis inhibitor that undergoes metabolism such as oxidation, reduction, hydrolysis, and conjugation in vivo.
  • the angiogenesis inhibitor also includes a compound that produces an angiogenesis inhibitor by being subjected to metabolism such as oxidation, reduction, and hydrolysis in vivo.
  • angiogenesis inhibitor used in the present invention is an antibody
  • examples of such antibodies include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies (Kohler et al., Nature, 1975, 256, p.495-497.), Chimeric antibodies ( Morrison et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1984, 81, p.6851-6855.), Single chain antibody (scFV) (Huston et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1988, 85, p.5879-5883 .; Rosenburg et al.
  • the antibody in the present invention may be modified with polyethylene glycol (PEG) or the like, if necessary.
  • the antibody in the present invention can be produced as a fusion protein with ⁇ -galactosidase, MBP, GST, GFP or the like, and may be detected without using a secondary antibody in an ELISA method or the like.
  • the antibody in the present invention may be modified so that the antibody can be recovered using avidin, streptavidin or the like by labeling the antibody with biotin or the like.
  • the antibody of the present invention can be produced according to a conventional method using a target protein or a partial fragment thereof or a cell expressing them as a sensitizing antigen ("Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, 2010, Chapter 11). .).
  • Polyclonal and monoclonal antibodies can be produced by methods well known to those skilled in the art (E. Harlow et al. (Ed.), “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.). Polyclonal antibodies can be obtained, for example, by administering an antigen to a mammal such as a mouse, rabbit or rat, collecting blood from the mammal, and separating and purifying the antibody from the collected blood. Methods of immunization are known to those skilled in the art and can be performed, for example, by administering the antigen one or more times.
  • the antigen (or a partial fragment thereof) can be used after being dissolved in an appropriate buffer, for example, an appropriate buffer containing a commonly used adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide. In some cases, adjuvants are not used depending on the conditions.
  • an appropriate buffer containing a commonly used adjuvant such as Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide. In some cases, adjuvants are not used depending on the conditions.
  • blood is collected from the mammal, and the blood is separated by conventional methods such as centrifugation, precipitation using ammonium sulfate or polyethylene glycol, various chromatographies, By purifying, a polyclonal antibody can be obtained as a polyclonal antiserum.
  • a hybridoma method can be mentioned as a method for producing a monoclonal antibody.
  • a mammal is first immunized in the same manner as polyclonal antibody production. It is preferable to perform partial blood collection after an appropriate number of days after immunization and to measure the antibody titer by a known method such as ELISA.
  • an antibody-producing hybridoma can be prepared by fusing B cells with myeloma cells according to a conventional method.
  • the myeloma cells used are not particularly limited, and known ones can be used.
  • a cell fusion method a method known in the art such as Sendai virus method, polyethylene glycol method, protoplast method, etc. can be arbitrarily selected and used.
  • the obtained hybridoma can be cultured in an HAT medium (hypoxanthine, aminopterin, and thymidine-containing medium) for an appropriate period according to a conventional method, and the hybridoma can be selected.
  • HAT medium hyperxanthine, aminopterin, and thymidine-containing medium
  • the hybridoma can be cloned.
  • a screening method a known antibody detection method such as an ELISA method or a radioimmunoassay method can be used.
  • a cloning method a method known in the art can be used. For example, a limiting dilution method and a FACS The law etc. can be used.
  • the obtained hybridoma can be cultured in an appropriate culture medium, or can be administered intraperitoneally, for example, which is compatible with the hybridoma.
  • the desired monoclonal antibody can be isolated and purified from the thus obtained culture solution or ascites by salting out, ion exchange chromatography, gel filtration, affinity chromatography or the like.
  • the isotype of the antibody in the present invention is not particularly limited.
  • the antibody in the present invention is preferably a neutralizing antibody that inhibits the vascular endothelial cell proliferation activity of the target protein by recognizing and binding to the target protein or a partial fragment thereof.
  • angiogenesis inhibitor suitable for the present invention are as follows, and can be produced or obtained according to literature methods described therein.
  • This compound is known to have inhibitory activity against VEGF receptor, PDGF receptor, KIT kinase and FLT3 kinase (Mendel et al., Clinical Cancer Research, 2003, 9, p.327-337.).
  • this compound is approved as a therapeutic agent for gastrointestinal stromal tumor (GIST) and renal cell carcinoma under the name of Sutent (registered trademark), and is commercially available.
  • GIST gastrointestinal stromal tumor
  • Sutent registered trademark
  • TKI-28 This compound is also called “TKI-28” and is known to have inhibitory activity against VEGF receptor, EGF receptor, PDGF receptor, KIT kinase, ErbB-2 and Src kinase (Guo et al., Cancer Biology & Therapy., 2005, 4, p. 1119-1126.).
  • This compound is also referred to as “BAY 43-9006” or “sorafenib” and can be prepared by the method described in US Pat. No. 7,235,576.
  • a possible form of the compound is tosylate, but is not limited thereto.
  • This compound is known to have inhibitory activity against VEGF receptor, PDGF receptor, KIT kinase and FLT3 kinase (Wilhelm et al., Cancer Research, 2004, 64, p. 7099-7109.).
  • this compound is approved as a therapeutic agent for hepatocellular carcinoma and renal cell carcinoma under the name Nexavar (registered trademark), and is commercially available.
  • Bevacizumab is an anti-VEGF humanized monoclonal antibody that inhibits the binding of VEGF and the VEGF receptor by binding to VEGF.
  • This antibody can be produced by the method described in WO94 / 10202. This antibody is approved for the treatment of colorectal cancer, non-small cell lung cancer, breast cancer, glioblastoma and renal cell carcinoma under the name Avastin (registered trademark), and is commercially available .
  • PI-88 also referred to as “muparfostat”, International Publication No. 96/33726; McKenzie et al., British Journal of Pharmacology, 2007, 151, p.1-14.
  • VEGF trap also referred to as “AVE-0005” or “aflibercept”.
  • RPI-4610 also referred to as “Angiozyme®”, US Pat. No. 5,180,818; US Pat. No. 6,346,398), 2- (8-hydroxy-6-methoxy-1-oxo-).
  • Preferred angiogenesis inhibitors in the present invention include 4- (3-chloro-4- (cyclopropylaminocarbonyl) aminophenoxy) -7-methoxy-6-quinolinecarboxamide, 5- (5-fluoro-2- Oxo-1,2-dihydroindole-3-ylidenemethyl) -2,4-dimethyl-1H-pyrrole-3-carboxylic acid (2-diethylaminoethyl) amide, 4-[(4-fluoro-2-methylindole-5 -Yl) oxy] -6-methoxy-7- [3- (pyrrolidin-1-yl) propoxy] quinazoline, N-methyl-2-[[3-[(E) -2- (2-pyridyl) ethenyl] -1H-indazol-6-yl] thio] benzamide, N- (4-chloro-3- (trifluoromethyl) phenyl) -N '-(4- (2 (N
  • the tumor tissue is further extracted from the excised tissue piece by a method such as the laser capture micro-dissection method (Murray et al. (Ed.), “Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols", Humana Press, 2004.)
  • a specific cell group may be cut out.
  • blood can be collected from a subject, and cancer cells circulating in peripheral blood can be isolated by, for example, the method of Kitago et al., And mutations or expression deficiencies of B-Raf and PTEN can be detected therefrom (Kitago). et al., Clinical Chemistry, 2009, 55 (4), p.757-764.).
  • GLCR gap-ligase chain reaction
  • telomere sequences When detecting mutations or loss of expression by determining nucleic acid sequences, it is possible to directly base a polymer DNA product extracted from a sample (also called extracted polymer DNA) or a product amplified by a polymerase chain reaction (PCR) reaction. Sequencing, Southern blot, Northern blot, PCR-strand conformation polymorphism (PCR-SSCP), allele-specific oligonucleotide probe (ASO), direct gel assay, Amplification Refractory Mutation System (ARMS), B-Raf and PTEN mutations or expression deficiencies can be detected by using a method such as a dot-blot analysis method using a mutation-specific oligomer or a method similar thereto.
  • PCR-SSCP PCR-strand conformation polymorphism
  • ASO allele-specific oligonucleotide probe
  • ASO Amplification Refractory Mutation System
  • B-Raf B-Raf and PTEN mutations or expression deficiencies
  • the nucleic acid probe used for detecting a B-Raf mutation or expression defect include, but are not limited to, the primers (SEQ ID NOs: 39 to 44) used in Example 1.
  • Examples of the nucleic acid probe used for detecting PTEN mutation or expression defect include, but are not limited to, the primers (SEQ ID NOs: 19 to 38) used in Example 1.
  • B-Raf is obtained by extracting genomic DNA from a sample derived from a subject according to a known method and performing PCR reaction on the obtained genomic DNA. And amplify the exon region of PTEN. The amplified DNA is confirmed to have the target length by 1% agarose gel electrophoresis, and then the PCR product is recovered from the gel and purified. Information such as gene mutation can be obtained by sequencing the purified product with a sequencer.
  • RNA is extracted from a sample derived from a subject according to a known technique, and cDNA is prepared based on the extracted RNA.
  • the extracted RNA can be quantified by techniques such as Northern blot analysis, DNA microarray, RT-PCR, and quantitative PCR. Preferred methods for quantifying RNA are DNA microarray and quantitative PCR, but the quantification method is not limited to the above method.
  • a cDNA library is prepared by fragmenting the prepared cDNA to about 200 bp and adding an adapter sequence for analysis by a next-generation sequencer.
  • the prepared library is bound to the flow cell via an adapter sequence, sequence primers are added to the formed cluster, and the fluorescence reading step is repeated for one base extension to perform data acquisition and analysis. Information such as mutations can be obtained.
  • a partial peptide having a wild-type amino acid sequence and a partial peptide having a mutant amino acid sequence are selected for the B-Raf and PTEN mutation sites.
  • an antibody specific for the mutation site can be prepared by a known technique.
  • An antibody specific to the expression deficient site can be prepared.
  • the expression defect site can be detected by not detecting with an antibody recognizing the wild type.
  • one kind of mutation-specific antibody may be used, or two or more kinds may be used in combination.
  • mutations and expression defects are detected by using mass spectrometry, for example, they can be detected by the method of Gabriel et al. Using the MassARRAY system manufactured by Sequenom (Gabriel et al., "Current Protocols in). Human Genomics ", John John Wiley & Sons, 2009, Unit 2.12.).
  • B-Raf and PTEN mutations or expression defects can be detected by any or a combination of the above methods.
  • (a1) B-Raf is wild-type and PTEN is wild-type, or (a2) B-Raf has at least one mutation selected from Table 1
  • the result is angiogenesis in the subject. It is an indicator of high reactivity to inhibitors.
  • Table 3 shows the forms of B-Raf and PTEN, which are indicators of the high reactivity of the test subject with angiogenesis inhibitors.
  • the B-Raf and PTEN forms that are particularly indicative of the high reactivity of the test subject to an angiogenesis inhibitor include the B-Raf having a V600E mutation, and This is when the result that PTEN has a mutation in T167A, Y68H or L112Q is obtained.
  • a method for quantifying the expression level of ANG1 or ANG2 in a sample derived from a tumor tissue of a subject is described below.
  • a sample derived from a subject's tumor tissue is collected by the method described above.
  • the expression level of ANG1 or ANG2 in the sample is quantified by a known method for the amount of mRNA or protein.
  • probes for quantifying the expression level of ANG1 or ANG2 include nucleic acid probes or antibodies against ANG1 or ANG2.
  • Nucleic acid probes can be purchased from, for example, Applied Biosystems ASSAYS-ON-DEMAND (ANG1 or ANG2 assay IDs are Hs00181613 and Hs00169867, respectively), and the expression level may be quantified according to the manual attached to the probe.
  • a nucleic acid probe can be appropriately set and prepared by using Perkin-Elmer Applied Biosystems Primer Express or equivalent software based on the nucleotide sequence of ANG1 or ANG2.
  • the comparison of a plurality of test substances is performed by correcting the quantitative value based on the mRNA level of a house keeping gene, preferably ⁇ -actin, in which the amount of transcription of each specimen has little variation.
  • a primer is used for detection with the fluorescent dye Cyber Green (intercalator).
  • the detection method using the master mix requires a probe in addition to the primer. Any of them can be designed by software, but when using a probe, one designed by Applied Biosystems is sold and may be used.
  • the protein expression level can be measured using a commercially available ELISA kit.
  • protein expression can be quantified by Western blotting, antibody array, mass spectrometry, or immunohistochemical staining.
  • Antibodies specific for ANG1 or ANG2 can also be prepared by the method described in the section of the angiogenesis inhibitor. When serum or plasma is used as a sample, quantification using ELISA or multiplex bead technology can be used.
  • the expression level of ANG1 or ANG2 can be quantified by any one or combination of the above methods.
  • a sample derived from a tumor tissue of a subject in order to quantify the expression level of ANG1 or ANG2, it is preferable to contact a sample derived from a tumor tissue of a subject with a probe.
  • the meaning of “contact” is the same as described above.
  • the “control” includes a sample obtained in the past, and the sample is used as a reference for future comparison with a test sample derived from a person who is predicted to have a therapeutic response. used. That is, the control value analyzes the expression level of ANG1 in patients who are affected by the same type of tumor and are rendered insensitive and in patients who are treated with specific angiogenesis inhibitors
  • the cutoff value obtained by this is meant, and the cutoff value can be easily set.
  • the control value is set as the cut-off value for the expression level of ANG1 in a sample derived from a tumor tissue of a patient group obtained as predicted to be therapeutically responsive to administration of an angiogenesis inhibitor. May be.
  • control value may mean a cut-off value set based on the presence or absence of B-Raf and PTEN mutations or expression defects.
  • control value means the expression level of ANG1 in a patient suffering from a tumor in which B-Raf is wild type.
  • preferred control values include the expression level of ANG1 in patients suffering from tumors where B-Raf and PTEN are wild type.
  • the form of ANG1 expression level which is an indicator that the subject's responsiveness to the angiogenesis inhibitor is high, is equivalent to the expression level of ANG1 in patients suffering from tumors in which B-Raf is wild type.
  • control includes a sample obtained in the past, and that sample is used as a reference for future comparisons with test samples derived from those with predicted therapeutic responsiveness. . That is, the control value analyzes the expression level of ANG2 in patients who are affected by the same type of tumor and are rendered insensitive and in patients who are administered a specific angiogenesis inhibitor The cutoff value obtained by this is meant, and the cutoff value can be easily set.
  • the control value is set as the cut-off value for the expression level of ANG2 in a sample derived from a tumor tissue of a patient group obtained as predicted to be therapeutically responsive to administration of an angiogenesis inhibitor. May be.
  • the control value may mean a cut-off value set based on the expression levels of ANG1 and ANG2.
  • the expression level of ANG2 being higher than the control value means that the expression level of ANG2 is higher than the expression level of ANG1 in its absolute value.
  • the preferred control value is that B-Raf has at least one mutation or expression defect selected from Table 1, and PTEN has at least one mutation or expression defect selected from Table 2. It means the expression level of ANG1 and ANG2 in patients suffering from the tumor they have.
  • the form of the expression level of ANG2 which is an indicator that the subject has high responsiveness to the angiogenesis inhibitor
  • B-Raf has at least one mutation selected from Table 1 or A result is obtained that is higher than the expression level of ANG1 in patients suffering from tumors that are deficient in expression and PTEN has at least one mutation selected from Table 2 or is deficient in expression
  • PTEN has at least one mutation selected from Table 2 or is deficient in expression
  • B-Raf has a V600E mutation and PTEN has a mutation in T167A, Y68H or L112Q Expression levels of ANG1 and ANG2 in patients suffering from certain tumors.
  • control includes a sample obtained in the past, and that sample is used as a reference for future comparisons with test samples derived from those with predicted therapeutic responsiveness. . That is, the control value is the expression level of ANG1 and ANG2 in the patient group that was affected by the same type of tumor and was made insensitive in the patient group that received the specific angiogenesis inhibitor. It means a cutoff value obtained by analyzing the ratio, and the cutoff value can be easily set.
  • control value is the ratio of the expression levels of ANG1 and ANG2 in a sample derived from the tumor tissue of a group of patients obtained as predicted to be therapeutically responsive to administration of an angiogenesis inhibitor (ANG1 expression Level / ANG2 expression level) may be set as a cutoff value.
  • control value may be a cut-off value set based on the presence or absence of a mutation or defective expression of B-Raf and PTEN instead of the analysis of the ratio of the expression levels of ANG1 and ANG2 described above.
  • the ratio of the expression levels of ANG1 and ANG2 in a patient group in which B-Raf has a mutation or expression loss and PTEN is a wild type can be used as a cut-off value.
  • the expression level of ANG1 and ANG2 in a patient suffering from a tumor in which B-Raf has at least one mutation or expression deficiency selected from Table 1 and PTEN is wild type More preferably, for example, the ratio of the expression levels of ANG1 and ANG2 in a patient suffering from a tumor in which B-Raf has a V600E mutation or an A145V mutation and PTEN is a wild type.
  • B-Raf has at least one mutation selected from Table 1 or is deficient in expression
  • PTEN has at least one mutation selected from Table 2 or is deficient in expression
  • B-Raf has a V600E mutation
  • PTEN has a mutation in T167A, Y68H or L112Q Ratio of expression levels of ANG1 and ANG2 in patients suffering from certain tumors.
  • the method for quantifying the expression levels of SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 and VEGFR1 in a sample derived from the tumor tissue of the subject is as follows. explain.
  • the method for quantifying the expression levels of SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 and VEGFR1 in a sample derived from a tumor tissue of a subject is as described above.
  • probes for quantifying the expression level of SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2, PML, IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 or VEGFR1 are commercially available products (for example, nucleic acids When using a probe, it is possible to use as appropriate (available from Applied Biosystems ASSAYS-ON-DEMAND).
  • the expression level of SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2, PML, IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 or VEGFR1 is a B-Raf and PTEN mutation or an expression defect. Since it correlates with the presence or absence, the expression level of these genes correlates with the antitumor effect, which is divided by the presence or absence of B-Raf and PTEN mutations or expression defects.
  • the expression level of SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2 and PML behaves similarly to the variation pattern of anti-tumor effects classified by the presence or absence of B-Raf and PTEN mutations or expression deficiencies.
  • the expression level of FGFR1 is higher than the control value.
  • the expression level of FGFR4 is compared with the control value.
  • the result is an indication that the subject is highly responsive to an angiogenesis inhibitor become.
  • the reactivity to an angiogenesis inhibitor can be predicted by examining one or more selected from (c1) to (c15) in combination.
  • SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2 and PML Compared to the expression levels of SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2 and PML in patients with tumors that have at least one mutation selected from or are deficient in expression and PTEN is a wild type When the result is low.
  • SHC1, NRP2, ARHGAP22 in a patient suffering from a tumor in which B-Raf has at least one mutation selected from Table 1 or is deficient in expression and PTEN is wild type
  • Preferred embodiments of SCG2 and PML expression levels include SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2 and SCG2 in patients suffering from tumors in which B-Raf has a V600E or A145V mutation and PTEN is wild type
  • the expression level of PML can be mentioned.
  • the expression levels of IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 and VEGFR1 are particularly indicative of high reactivity of the test subject to angiogenesis inhibitors
  • the form of IL6, CXCR4, COL4A3 in patients suffering from tumors in which B-Raf has at least one mutation selected from Table 1 or is deficient in expression and PTEN is wild type This is when a result that is higher than the expression levels of MEIS1, FGF9, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 and VEGFR1 is obtained.
  • IL-6, CXCR4, COL4A3 in patients suffering from tumors in which B-Raf has at least one mutation selected from Table 1 or is deficient in expression and PTEN is wild type A preferred embodiment of the expression level of MEIS1, FGF9, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 and VEGFR1 is a patient suffering from a tumor in which B-Raf has V600E or A145V mutation and PTEN is wild type Expression levels of IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 and VEGFR1.
  • the following measurement object measured from a sample of one patient (a) B-Raf and PTEN, (b) ANG1 and ANG2, or (c) At least one measurement result selected from the group consisting of SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2, PML, IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR3, FGFR2, FGFR1, FGFR4 and VEGFR1, and the result of each control
  • the measurement object may be quantified or detected using samples from a plurality of patients.
  • the presence or absence or expression level of the mutation to be measured is detected or measured in a predetermined number of patients (primary population), and the obtained detection value or measurement value is used as basic data.
  • Measurement data in a sample from one subject or samples from multiple populations (secondary population) can be compared.
  • the data of each patient obtained by the measurement can be incorporated into the value of the primary population and processed again to increase the number of cases of the target patient or secondary population. By increasing the number of cases, it is possible to improve the accuracy of predicting the possibility of response to an angiogenesis inhibitor.
  • the method according to the present invention can be used to predict the effectiveness of an angiogenesis inhibitor in a subject before the angiogenesis inhibitor is administered to the subject. And the test subject who can expect more the effect which an angiogenesis inhibitor has can be selected, and a disease can be treated. For example, when a higher anti-tumor effect can be expected than the average anti-tumor effect in subjects with similar symptoms, the anti-tumor effect is higher than other subjects suffering from the same cancer type. Can be expected, or can be expected to have a higher antitumor effect than a subject suffering from other cancer types. Therefore, the present invention is very useful clinically.
  • angiogenesis inhibitor or treatment of a tumor upon administration of an angiogenesis inhibitor or treatment of a tumor to a subject suffering from a tumor (a) presence or absence of a mutation or expression defect of B-Raf and PTEN, (B) the expression level of ANG1 and ANG2, or (c) at least one expression level selected from the group consisting of SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2, PML, IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR3 and FGFR2.
  • a tumor a) presence or absence of a mutation or expression defect of B-Raf and PTEN
  • B the expression level of ANG1 and ANG2
  • the angiogenesis inhibitor originally has an action of inhibiting angiogenesis. Therefore, even when the subject is determined not to be highly sensitive to the angiogenesis inhibitor, the angiogenesis inhibitor It is not expected not to have an antitumor effect.
  • a person who administers an angiogenesis inhibitor to a subject suffering from a tumor or a person who treats a tumor and a person who measures the above (a1) to (c15) may be the same person or different persons. It may be.
  • One expression level As an index, a method for administering an angiogenesis inhibitor or a method for treating a tumor to a subject suffering from a tumor is provided.
  • the predicted subject can be selected as an administration subject of the angiogenesis inhibitor.
  • the present invention provides a method for treating a subject suffering from a tumor who is predicted to have high reactivity to an angiogenesis inhibitor by the prediction method of the present invention by administration of the angiogenesis inhibitor.
  • the angiogenesis inhibitor originally has an action of inhibiting angiogenesis. Therefore, even when the subject is determined not to be highly sensitive to the angiogenesis inhibitor, the angiogenesis inhibitor It is not expected not to have an antitumor effect.
  • a person who administers an angiogenesis inhibitor to a subject suffering from a tumor or a person who treats a tumor and a person who measures the above (a1) to (c15) may be the same person or different persons. It may be.
  • One expression level As an index, a method of selecting a subject exhibiting high sensitivity to an angiogenesis inhibitor can be mentioned.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising an angiogenesis inhibitor.
  • the subject to which the pharmaceutical composition of the present invention is administered is a subject suffering from a tumor who is predicted to be highly likely to respond to an angiogenesis inhibitor by the method of the present invention.
  • the present invention also provides the use of an angiogenesis inhibitor for the manufacture of a medicament for use in administration to a subject suffering from a tumor.
  • the subject is predicted to be highly responsive to the angiogenesis inhibitor by the method of the present invention.
  • the present invention provides an angiogenesis inhibitor for the treatment of a subject suffering from a tumor, and the subject is predicted to be highly likely to respond to the angiogenesis inhibitor by the method of the present invention. It is.
  • the pharmaceutical composition of the present invention targeting tumor cells having B-Raf and PTEN mutations or expression deficiencies and a method for treating tumors may further be combined with one or more other antitumor agents.
  • Other antitumor agents are not particularly limited as long as they are preparations having an anticancer effect.
  • anti-tumor agents include, for example, irinotecan hydrochloride (CPT-11), carboplatin, oxaliplatin, 5-fluorouracil (5-FU), docetaxel (Taxotere (registered trademark)), paclitaxel, gemcitabine hydrochloride (Gemzar) (Registered trademark)), folinate calcium (leucovorin), bevacizumab (Avastin (registered trademark)), everolimus (Certican (registered trademark) or Affinitol (registered trademark)), and the like.
  • the other antitumor agent is dacarbazine or temozolomide when the cancer type that is the target of the tumor therapeutic agent is melanoma, and irinotecan hydrochloride, oxaliplatin, 5 -Fluorouracil, folinate calcium or bevacizumab; if pancreatic cancer, gemcitabine hydrochloride or bevacizumab; if ovarian cancer, carboplatin or gemcitabine hydrochloride; if renal cancer, bevacizumab or everolimus In the case of lung cancer, carboplatin, docetaxel or paclitaxel is particularly preferred.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used as a tumor therapeutic agent.
  • tumor therapeutic agent means an agent containing an antitumor agent, a cancer prognosis improving agent, a cancer recurrence preventing agent, a cancer metastasis inhibitor, and the like.
  • the effect of cancer treatment can be confirmed by findings such as radiographs and CT, histopathological diagnosis of biopsy, or by the value of a tumor marker.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is used, it can be administered orally or parenterally.
  • the dosage of the angiogenesis inhibitor is the degree of symptoms, the age, sex, body weight, sensitivity difference, administration method, administration timing, administration interval, nature of the pharmaceutical formulation, preparation of the subject Depends on the type, type of active ingredient, etc., and is not particularly limited, but is usually 0.1 mg to 10 g per day for adults (60 kg body weight), usually divided from once a week to 1 to 3 times a day Can be administered.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be made into an oral solid preparation, injection or the like.
  • the solid dosage form for oral use include tablets, coated tablets, granules, fine granules, powders, and capsules.
  • the injection include intravenous, subcutaneous, and intramuscular injections.
  • a freeze-dried product can be obtained by a conventional method.
  • commonly used excipients, binders, lubricants, coloring agents, flavoring agents, and the like, and stabilizers, emulsifiers, absorption promoters, surfactants, etc. can be used if necessary.
  • it is formulated by a conventional method by mixing ingredients used as raw materials for pharmaceutical preparations.
  • ingredients include, for example, animal and vegetable oils (soybean oil, beef tallow, synthetic glycerides, etc.), hydrocarbons (fluided ballaffins, squalane, solid paraffins, etc.), ester oils (octyldodecyl myristate, isopropyl myristate, etc.), higher alcohols ( Cetostearyl alcohol, behenyl alcohol, etc.), silicone resin, silicone oil, surfactant (polyoxyethylene fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyoxyethylene polyoxy) Propylene block copolymer, etc.), water-soluble polymers (hydroxyethyl cellulose, polyacrylic acid, carboxyvinyl polymer, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrole) , Methylcellulose, etc.), alcohol (ethanol, isopropanol,
  • inorganic acids hydroochloric acid, phosphoric acid, etc.
  • alkali metal salts of inorganic acids sodium phosphate, etc.
  • inorganic bases sodium hydroxide, etc.
  • organic acids lower fatty acids, citric acid, lactic acid, etc.
  • alkali metal salts of organic acids such as sodium citrate and sodium lactate
  • organic bases such as arginine and ethanolamine
  • preservative, antioxidant, etc. can be added as needed.
  • the present invention is directed to predicting the responsiveness of a tumor-affected subject to an angiogenesis inhibitor, which comprises B-Raf and PTEN or ANG1 and ANG2 probes.
  • angiogenesis inhibitor which comprises B-Raf and PTEN or ANG1 and ANG2 probes.
  • Provide kit Prediction of reactivity to an angiogenesis inhibitor can be performed by the method of the present invention.
  • the angiogenesis inhibitor preferably includes 4- (3-chloro-4- (cyclopropylaminocarbonyl) aminophenoxy) -7-methoxy-6-quinolinecarboxamide or a pharmaceutically acceptable salt thereof. It is done.
  • the pharmaceutical composition and / or kit of the present invention can be used for mammals (eg, humans, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the pharmaceutical composition and / or kit of the present invention may contain a packaging container, an instruction manual, a package insert, etc. in addition to the above-mentioned angiogenesis inhibitor or probe.
  • the packaging container, instruction manual, package insert, etc. can describe, for example, a combination for using one or a plurality of other anticancer agents in combination, and a form or mixture in which different substances are used at the time of administration.
  • the form, usage, dosage, etc. can be described. The usage and dose can be described with reference to the above.
  • Example 1 Detection of BRAF and PTEN mutation or expression deficiency Human melanoma cell lines SK-MEL-2, MeWo, CHL-1, HMV-1, HMCB, MDA-MB-435, LOX, G361, FEM, Obtain SEKI, SK-MEL-28, A375, and A2058 from the sources listed in the “Purchasers” column of Table 6, and use the Sanger method or the next-generation sequencing method (Bridge PCR method: Solexa / Illumina) Used to detect mutations or loss of expression of BRAF and PTEN.
  • Detection by Sanger method (i) Preparation of genomic DNA from melanoma cell line Genomic DNA was purified from about 1 ⁇ 10 6 cells using DNeasy Blood & Tissue Kit (purchased from QIAGEN). (ii) Amplification of PTEN exon region PTEN exon region was amplified by performing PCR reaction on the obtained genomic DNA. PCR reaction was performed with PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (purchased from Takara Bio Inc.).
  • Exon1 sense primer AGTCGCCTGTCACCATTTC (SEQ ID NO: 19)
  • Exon1 antisense primer ACTACGGACATTTTCGCATC (SEQ ID NO: 20)
  • Exon2 sense primer GTTTGATTGCTGCATATTTCAG (SEQ ID NO: 21)
  • Exon2 antisense primer GGCTTAGAAATCTTTTCTAAATG (SEQ ID NO: 22)
  • Exon3 sense primer AATGACATGATTACTACTCTA (SEQ ID NO: 23)
  • Exon3 antisense primer TTAATCGGTTTAGGAATACAA (SEQ ID NO: 24)
  • Exon4 sense primer CATTATAAAGATTCAGGCAATG (SEQ ID NO: 25)
  • Exon4 antisense primer GACAGTAAGATACAGTCTATC (SEQ ID NO: 26)
  • Exon5 sense primer ACCTGTTAAGTTTGTATGCAAC (SEQ ID NO: 27)
  • Exon5 antisense primer TCCAGGAAGAGGAAAG
  • RNA from melanoma 13 cell line Cells were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 . After a certain time, cell lysis was performed using a TRIZOL reagent (purchased from GIBCO BRL) according to the operation method attached to the reagent. Specifically, it is as follows. 1 ml of TRIZOL reagent was added to a culture area of 10 cm 2 and pipetting was performed several times to collect a liquid in which cells were lysed.
  • TRIZOL reagent purchased from GIBCO BRL
  • RNA was washed with 75% ethanol (purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and then air-dried and subjected to subsequent operations as total RNA.
  • PrimeSTAR GXL DNA Polymerase When using PrimeSTAR GXL DNA Polymerase, cDNA 100 ng, 5 ⁇ PrimeSTAR GXL Buffer 4 ⁇ L, dNTP mixture (2.5 mM) 1.6 ⁇ L, sense primer and antisense primer (each 5 pmol) (each 3 for B-Raf) ) PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.4 ⁇ l was prepared to a total volume of 20 ⁇ L, and the solution was reacted 40 times at 95 °C for 10 seconds, 55 °C for 15 seconds and 68 °C for 2 minutes. .
  • PTEN sense primer TCTGCCATCTCTCTCCTCCTTTT (SEQ ID NO: 37)
  • PTEN antisense primer TCTGACACAATGTCCTATTGCCAT (SEQ ID NO: 38)
  • BRAF sense primer 1 GCCCCGGCTCTCGGTTATAAGATG (SEQ ID NO: 39)
  • BRAF antisense primer 1 CCGTTCCCCAGAGATTCCAA (SEQ ID NO: 40)
  • BRAF sense primer 2 TGCCATTCCGGAGGAGGTGT (SEQ ID NO: 41)
  • BRAF antisense primer 2 GCCCATCAGGAATCTCCCAA (SEQ ID NO: 42)
  • BRAF sense primer 3 ATCTGGATCATCCCCTTCCGC (SEQ ID NO: 43)
  • BRAF antisense primer 3 CCCGGAACAGAAAGTAAAGCCTCTAG (SEQ ID NO: 44)
  • PCR products were collected in one tube for each cell line, and blunt-ended in a total volume of 10 ⁇ L using DNA Blunting Kit (purchased from Takara Bio Inc.). Then, after pelletizing DNA by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation, ligation treatment was performed at 16 ° C. for 6 hours in a total volume of 10 ⁇ L using DNA Ligation Kit (purchased from Takara Bio Inc.). The ligated DNA was pelleted by phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • Genomic DNA Sample Prep Kit (purchased from Illumina) was used to create a library according to the attached procedure. The outline of the method is as follows. After DNA is fragmented by nebulization, the DNA is blunted and the 5 'end is phosphorylated. After adding the adapter, a product having a length between 150 bp and 200 bp is recovered from the gel and purified by 2% agarose gel electrophoresis. After performing PCR using the purified DNA as a template, the DNA was purified, and absorbance was measured to confirm the concentration and purity.
  • Example 2 Calculation of antitumor effect of angiogenesis inhibitor in mouse model transplanted with melanoma cell line
  • Each of the human melanoma cell lines used in Example 1 was shown in the column of "culture medium" in Table 6 (10 The cells were cultured in a 5% carbon dioxide incubator until they became about 80% confluent. After culturing, each cell was recovered by trypsin-EDTA treatment according to a conventional method. Suspend each cell with phosphate buffer or Matrigel solution (mixed phosphate buffer and Matrigel at 1: 1 ratio), 1x10 8 cells / mL or 5x10 7 cells / mL suspension Prepared.
  • phosphate buffer or Matrigel solution mixed phosphate buffer and Matrigel at 1: 1 ratio
  • E7080 4- (3-Chloro-4- (cyclopropylaminocarbonyl) aminophenoxy) -7-methoxy-6-quinolinecarboxamide mesylate (hereinafter referred to as E7080) from the time when the tumor volume became about 200 mm 3 after transplantation. 100 mg / kg / day was orally administered, and the major axis and minor axis of the tumor were measured daily with a digimatic caliper (Mitsutoyo).
  • the antitumor effect ( ⁇ T / C) of the angiogenesis inhibitor in the mouse model was calculated by calculating the tumor volume and the specific tumor volume by the following formula.
  • Tumor volume (TV) tumor major axis (mm) x tumor minor axis 2 (mm 2 ) / 2
  • Antitumor effect ( ⁇ T / C) (TV in drug administration group ⁇ TV before administration start) / (TV in control group ⁇ TV before administration start) ⁇ 100
  • FIG. 1 shows ⁇ T / C on day 7 after the start of administration. In FIG. 1, the cell lines classified in Example 1 were used.
  • the anti-tumor effect ( ⁇ T / C) of E7080 on melanoma cells is as follows: BRAF and PTEN are both wild type, BRAF and PTEN are both mutated or defective, or BRAF is mutated and PTEN In the absence of mutations, they were 16, 23, and 45%, respectively, and the antitumor effects of E7080 were especially seen when both BRAF and PTEN were either mutated or lacked expression. It is clear that the antitumor effect of E7080 differs when melanoma cells are stratified by the presence or absence of BRAF and PTEN mutations (Figure 1), and the presence or absence of BRAF and PTEN mutations predicts the effect of E7080 It was shown to be an indicator.
  • Example 3 Correlation with the ratio of blood vessels covered with pericytes (perisite) due to the presence or absence of mutation or expression deficiency in BRAF and PTEN In tumor tissues, angiogenesis is not performed normally. A phenomenon is observed in which blood vessels covered with pericytes are not formed.
  • a human melanoma cell line transplanted mouse model was prepared according to the method of Example 2. After the transplantation, when the tumor volume became about 100-300 mm 3 , the mice were killed with CO 2, and the transplanted tumor tissues were removed by surgery.
  • a tumor tissue section was prepared from the extracted tumor tissue, and the section was stained. Specifically, about 5 mm inside from the periphery of the tumor tissue was cut with a knife, and the tissue was embedded with OCT compound. Thereafter, the tissue was frozen with dry ice, and a frozen tissue was prepared at -80 ° C. About the frozen tissue, a section having a thickness of 8 ⁇ m was prepared, attached to a slide glass, washed with running water, and allowed to stand at 4 ° C. for 10 minutes with cold acetone to prepare a sample.
  • the sample was washed three times with a 0.01 M phosphate buffer solution containing 0.1% Tween 20 (hereinafter referred to as PBS for washing) and allowed to react at room temperature for 10 minutes with the avidin blocking solution of DAKO biotin blocking kit. After the reaction, the sample was washed three times with PBS for washing, and reacted at room temperature for 10 minutes with the biotin blocking solution of the kit. Thereafter, the sample was washed 3 times with PBS for washing, and reacted with normal serum in the VECTOR STAIN ABC peroxidase rat IgG kit at room temperature for 20 minutes.
  • PBS 0.01 M phosphate buffer solution containing 0.1% Tween 20
  • anti-CD31 antibody (clone name: MEC13.3, rat IgG, PharMingen, BD Biosciences) is a primary antibody diluted 600-fold with 0.1M phosphate buffer containing 1% fetal bovine serum. was added and allowed to react overnight at 4 ° C. After washing, the biotin-labeled secondary antibody in the kit was added and allowed to react for 30 minutes at room temperature. After washing, the mixture was further reacted for 30 minutes at room temperature with the avidin reagent in the kit. Thereafter, the plate was washed three times with 0.01 M phosphate buffer, developed with DAB, and stained with CD31.
  • the sample was washed with running water and then washed 3 times with Tris buffer. Thereafter, alkaline phosphatase-labeled anti- ⁇ -SMA antibody (clone name: 1A4, mouse IgG, SIGMA-ALDRICH) diluted 100-fold with Tris buffer was reacted with the sample at room temperature for 1 hour. Thereafter, the plate was washed 3 times with Tris buffer, developed with a fuchsin solution in the DAKO LSAB kit, and stained with ⁇ -SMA.
  • alkaline phosphatase-labeled anti- ⁇ -SMA antibody (clone name: 1A4, mouse IgG, SIGMA-ALDRICH) diluted 100-fold with Tris buffer was reacted with the sample at room temperature for 1 hour. Thereafter, the plate was washed 3 times with Tris buffer, developed with a fuchsin solution in the DAKO LSAB kit, and stained with ⁇ -SMA.
  • Example 4 Expression control of ANG1 and ANG2 by presence or absence of BRAF and PTEN mutation or expression deficiency (1) Correlation between presence or absence of BRAF and PTEN mutation or expression deficiency and expression of ANG1 and ANG2 Human melanoma In cell lines, the correlation between the presence or absence of BRAF and PTEN mutations or expression defects and the expression of ANG1 and ANG2 was examined using quantitative RT-PCR and ELISA. 1. Verification by quantitative RT-PCR method For the human melanoma cell line used in Example 1, total RNA was prepared in the same manner as in Example 1 (2) (i) and used for the subsequent measurements. .
  • Quantitative RT-PCR of various angiogenic factors and various angiogenic factor receptors is performed using gene-specific probes (TaqMan Gene Expression Assays mixture, purchased from Applied Biosystems ASSAYS-ON-DEMAND) and BioMark TM system for gene analysis (Fluidigm was purchased as follows based on the operation manual. Table 7 shows the gene name of the angiogenic factor and angiogenic factor receptor used and the assay ID of the purchased probe. The operation was performed in three stages: reverse transcription reaction, pre-amplification and PCR reaction.
  • reverse transcription reaction add 6.5 ⁇ L of RNase Free dH2O to the prepared RNA, add 5 ⁇ PrimeScript buffer 2 ⁇ L, PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 ⁇ L, Oligo dT Primer (50 ⁇ M) 0.5 ⁇ L, Random 6
  • the reaction was stopped by heating at 85 ° C. for 5 seconds to obtain a cDNA solution.
  • the obtained cDNA solution was subjected to the second stage pre-amplification reaction.
  • the pre-amplification reaction was performed by separating 56.25 ⁇ L of a solution obtained by adding 58 ⁇ L of low-TE buffer to 42 ⁇ L of gene-specific Primer / Probe, and adding 112.5 ⁇ L of PreAmp Master Mix and 56.25 ⁇ L of cDNA solution to this.
  • the reaction was carried out at 95 ° C. for 10 minutes. Subsequently, 14 reaction cycles consisting of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 4 minutes were performed.
  • the reaction solution after the reaction was diluted 1: 5 with TE buffer, and this was used as a preamplification solution.
  • the obtained preamplification solution was subjected to the third stage PCR reaction.
  • a calibration curve was prepared using an mRNA sample in which all samples were mixed in equal amounts.
  • the gene expression level in each melanoma cell line was calculated from the calibration curve by Ct (abbreviation of threshold ⁇ cycle value, which is the number of PCR cycles necessary for a PCR product to reach a certain concentration).
  • Ct abbreviation of threshold ⁇ cycle value, which is the number of PCR cycles necessary for a PCR product to reach a certain concentration.
  • the value obtained by correcting the expression level of the gene in each melanoma cell line with the ⁇ -actin expression level was used as the ratio of gene expression level in each melanoma cell line and used for comparative analysis.
  • the graph with BRAF of “-” includes the results of each antitumor effect for the cell lines of SK-MEL-2, MeWo, CHL-1, HMV-1 and HMCB shown in Table 6. is there.
  • the graph with a BRAF of “+” included the results of each antitumor effect for the cell lines MDA-MB-435, LOX, G361, FEM, SEKI, SK-MEL-28, A375 and A2058 shown in Table 6. Is.
  • the graph with PTEN of “-” shows the cells of SK-MEL-2, MeWo, CHL-1, HMV-1, HMCB, MDA-MB-435, LOX, G361, FEM and SEKI shown in Table 6.
  • the results of each antitumor effect for the line are included.
  • the graph with a PTEN of “+” includes the results of the antitumor effects for the cell lines of SK-MEL-28, A375 and A2058 shown in Table 6.
  • the mRNA expression level of ANG1 (No. 11 in Table 7) is significantly enhanced in the human melanoma cell line in which the BRAF mutation is present (FIG. 4 (b)), and the expression level of ANG1 protein is the BRAF mutation.
  • human melanoma cell lines with the presence of phenotype it was revealed that the cell line was enhanced (FIG. 4 (a)).
  • the mRNA expression level of ANG2 (No. 12 in Table 7) is increased in the human melanoma cell line in which the mutation of PTEN exists (FIG. 5 (b)), and the ANG2 (No. 12 in Table 7) protein is increased. It was revealed that the expression level was significantly enhanced in the human melanoma cell line in which the PTEN mutation was present (FIG. 5 (a)).
  • ANG1 binds to the TIE-2 receptor, and ANG1-TIE-2 signal is a blood vessel It is known to induce maturation.
  • ANG2 binds competitively with ANG1, but downstream signals do not flow from the receptor to which ANG2 is bound, and ANG1 is not expressed (or expression is low), that is, under normal BRAF conditions.
  • VEGF signals contribute to vascularization and survival, and do not cause vascular maturation.
  • ANG1-TIE-2 signaling is affected or the ratio of ANG1 protein expression level to ANG2 protein expression level (ANG1 / ANG2) is verified did.
  • FIG. 6 the classification of each cell line was the same as that performed in Example 1.
  • the ratio of ANG1 protein expression level to ANG2 protein expression level (ANG1 / ANG2) when melanoma cells are stratified by the presence or absence of BRAF and PTEN mutations is the same as when BRAF and PTEN are both wild type.
  • BRAF and PTEN had mutation or expression deficiency, they showed a tendency to decrease, and when BRAF had mutation or expression deficiency and PTEN was wild type, it showed a tendency to increase (FIG. 6).
  • BRAF has a mutation or expression deficiency and PTEN is wild type
  • both BRAF and PTEN are wild type
  • BRAF and PTEN have mutation or expression deficiency.
  • the ratio of the expression level of ANG2 was significantly lower. This means that ANG1 / ANG2 shows a similar tendency in BRAF and PTEN mutations or expression deficiencies to combinations of mutations that are likely to be reactive with E7080.
  • angiogenesis inhibitors are defined by the presence or absence of BRAF and PTEN mutations or expression deficiencies. It has been clarified that the ratio of skin cells is decreasing, and that the cause is involved in the regulation of expression of ANG1 and ANG2, which are involved in perivascular angiogenesis.
  • ANG1 is not expressed or ANG1 expression is low, that is, when BRAF is normal, especially when FGFR3 is expressed, FGFR kinase inhibitors can be expected to directly kill cancer cells, and E7080 has normal BRAF.
  • the antitumor effect may be enhanced.
  • vascular maturation depends on ANG2 expression, and when ANG2 is highly expressed, that is, PTEN is mutated or expressed. It was suggested that maturation did not occur due to competitive inhibition of ANG1 and ANG2 in the case of deficiency, and that vascular maturation occurred when ANG2 was low expressed, ie, when PTEN was normal.
  • E7080 when the expression of ANG1 and ANG2 is high, E7080 can mainly be expected to have an antitumor effect by inhibiting angiogenesis, and when the expression of ANG1 is high and the expression of ANG2 is low, the expression of ANG2 is the expression of ANG1 It was suggested that the antitumor effect by E7080 can be expected at higher levels. Therefore, the effect of E7080 can be predicted by using the expression level of ANG1 and ANG2 or the ratio of the expression levels as an index.
  • Example 5 Correlation between presence or absence of BRAF and PTEN mutation or expression deficiency and expression of SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR1, FGFR4 and VEGFR1 In melanoma cell lines Verification was performed using the microarray method.
  • Example 1 Extraction of total RNA from sample
  • a mouse model transplanted with human melanoma cell types was prepared in the same manner as in Example 2. After transplantation, tumors with a tumor volume of 200 mm 3 or more were prepared. At this stage, the mice were killed, the transplanted tumor tissue was removed, and total RNA was prepared in the same manner as in Example 1 (2) (i), and subjected to the subsequent operations.
  • RNA Quantification by DNA microarray Schena et al. Method (Schena et al., Science, 1995, 270, p.467-470), Lockhart et al. Method (Lockhart et al., Nature Biotechnology, 1996, 14, p. .1675-1680) or cDNA synthesis and biotin labeling based on the latest Affimetrix GeneChip (registered trademark) Array Station operation manual. Thereafter, hybridization to an Affimetrix DNA microarray (Human Genome U133 Plus 2.0 Array) and measurement were performed based on the operation manual, and data was acquired.
  • Affimetrix DNA microarray Human Genome U133 Plus 2.0 Array
  • the expression levels of IL6, CXCR4, COL4A3, MEIS1, FGF9, FGFR1, FGFR4 and VEGFR1 are significantly reduced from the expression level when BRAF is mutated and PTEN is wild type.
  • the expression levels of SHC1, NRP2, ARHGAP22, SCG2 and PML were found to increase significantly from the expression level when BRAF has a mutation and PTEN is wild type. Therefore, when the expression level of SHC1, IL6, CXCR4, COL4A3, NRP2, MEIS1, ARHGAP22, SCG2, FGF9, PML, FGFR1, FGFR4, and VEGFR1 is stratified by the presence or absence of BRAF and PTEN mutation or expression loss , It became clear that it changed significantly.
  • the expression level of SHC1 is significantly reduced compared to the control value
  • IL6 expression level is significantly increased compared to the control value
  • the expression level of CXCR4 is significantly increased compared to the control value
  • the expression level of COL4A3 is significantly increased compared to the control value
  • the expression level of NRP2 is significantly reduced compared to the control value
  • the expression level of MEIS1 is significantly increased compared to the control value
  • the expression level of ARHGAP22 is significantly reduced compared to the control value
  • the expression level of SCG2 is significantly reduced compared to the control value
  • the expression level of FGF9 is significantly increased compared to the control value
  • the expression level of PML is significantly reduced compared to the control value
  • the expression level of FGFR1 is significantly increased compared to the control value
  • the expression level of FGFR4 is significantly increased compared to the control value, It suggested that the expression level of VEGFR1 was significantly increased compared to the control value.
  • Example 6 Correlation between the presence or absence of BRAF and PTEN mutation or expression loss and the expression of FGFR3 and FGFR2
  • human melanoma cell lines the presence or absence of BRAF and PTEN mutation or expression loss and the expression of FGFR3 and FGFR2
  • the correlation was verified using the quantitative RT-PCR method.
  • a human melanoma cell type transplant model mouse was prepared in the same manner as in Example 2, and the same method as in Example 1 (2) (i) was used.
  • Total RNA was prepared, and quantitative RT-PCR was performed in the same manner as in item 1 of Example 4.
  • Table 8 shows the gene names of the angiogenic factor and angiogenic factor receptor used and the assay ID of the purchased probe, and the results are shown in FIG.
  • the present invention provides a method for predicting the reactivity of a subject to an angiogenesis inhibitor.
  • the prediction result obtained by the method of the present invention can be used as information for selecting an angiogenesis inhibitor in the treatment of a tumor.
  • SEQ ID NO: 1 B-Raf polynucleotide sequence, GenBank Accession No. NM_004333.4
  • SEQ ID NO: 2 B-Raf amino acid sequence, GenBank Accession No. NP_004324.2
  • SEQ ID NO: 3 PTEN polynucleotide sequence, GenBank Accession No. NM_000314.4
  • SEQ ID NO: 4 PTEN amino acid sequence, GenBank Accession No. NP_000305.3
  • NP_003020.2 SEQ ID NO: 7: IL6 polynucleotide sequence, GenBank Accession No. NM_000600.3 Sequence number 8: IL6 amino acid sequence, GenBank Accession No.NP_000591.1
  • SEQ ID NO: 10 CXCR4 amino acid sequence, GenBank Accession No. NP_001008540.1
  • NP_000082.2 SEQ ID NO: 13 NRP2 polynucleotide sequence, GenBank Accession No. NM_003872.2 SEQ ID NO: 14: NRP2 amino sequence, GenBank Accession No. NP_003863.2 SEQ ID NO: 15: MEIS1 polynucleotide sequence, GenBank Accession No. NM — 002398.2 Sequence number 16: MEIS1 amino acid sequence, GenBank Accession No.NP_002389.1 SEQ ID NO: 17: ARHGAP22 polynucleotide sequence, GenBank Accession No.
  • NM_000142.3 SEQ ID NO: 56: FGFR3 amino acid sequence, GenBank Accession No. NP_000133.1 SEQ ID NO: 57: FGFR2 polynucleotide sequence, GenBank Accession No. 7.NM_001144918.1 SEQ ID NO: 58: FGFR2 amino acid sequence, GenBank Accession No. NP_001138390.1 SEQ ID NO: 59: FGFR1 polynucleotide sequence, GenBank Accession No. NM_001174063.1 SEQ ID NO: 60: FGFR1 amino acid sequence, GenBank Accession No. NP_001167534.1 SEQ ID NO: 61: FGFR4 polynucleotide sequence, GenBank Accession No.

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Abstract

　本発明は、腫瘍を罹患する被験者に対する血管新生阻害剤の効果を予測する方法を提供することを目的とする。本発明は、腫瘍を罹患する被験者に対する血管新生阻害剤の効果を予測する方法であって、当該被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中のB-Rafの突然変異または発現欠損の有無およびPTENの突然変異または発現欠損の有無を測定する工程を含む方法を提供する。本発明の方法によって、B-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無を指標とすることにより、血管新生阻害剤を被験者に投与せずに当該血管新生阻害剤の抗腫瘍効果を予測することが可能である。

Description

血管新生阻害剤の効果を予測する方法
　本発明は、癌を罹患する被験者の血管新生阻害剤に対する反応性を予測する新規方法に関するものである。
　多くのキナーゼ阻害剤が、抗癌剤として開発されている。特に、血管内皮細胞増殖因子（以下、「VEGF」と称する場合がある）レセプターなどの受容体型チロシンキナーゼに対して阻害活性を有する物質の一群は、癌の成長に伴う血管新生を阻害する性質を持ち、新世代の抗癌剤として注目されている。
　しかし、全ての癌種に有効な抗癌剤は未だに承認されていない。特に、進行した悪性のメラノーマは、転移性が高く、予後が極めて悪いため、悪性メラノーマに対する抗癌剤の開発は困難である。
　一方で、抗癌剤による治療は、一般に強い吐き気や全身倦怠感などの副作用を伴うため、治療効果が期待できない被験者への投与は回避すべきである。したがって、ある抗癌剤の投与前に被験者の治療効果を予測できるバイオマーカーは、無効な薬剤の投与の回避や、副作用の軽減などを可能とするため、その開発が待望されている。
　ところで、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドは、VEGFレセプター、繊維芽細胞増殖因子（以下、「FGF」と称する場合がある）レセプター、血小板由来増殖因子（以下、「PDGF」と称する場合がある）レセプター、RETキナーゼ、KITキナーゼなどの受容体型チロシンキナーゼに対して阻害活性を有するマルチキナーゼ阻害剤として使用されており、優れた血管新生阻害効果と抗増殖効果を示す（特許文献１;特許文献２;非特許文献１）。
　また、セリン／スレオニンキナーゼの一種であるB-Rafは、その活性化により、細胞増殖シグナルとして細胞増殖シグナル経路として重要なMAPキナーゼ経路を活性化することが知られている。そして、B-Rafは、様々な癌において突然変異による活性化を起こしていることが報告されている（非特許文献２）。
　さらに、癌抑制遺伝子であるPTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10) は、主にPIP3を基質とし、このシグナルを負に制御する脂質ホスファターゼをコードしている。PTENはAktキナーゼの活性化を阻害することによりアポトーシスを誘導し、細胞増殖を抑制する機能を有するが、PTENの突然変異や発現欠損は、Aktキナーゼの過剰な活性化を引き起こし、癌の増殖を引き起こすことが知られている（非特許文献３）。
　しかし、B-Rafの突然変異の有無およびPTENの突然変異または発現欠損の有無と、血管新生阻害剤の抗腫瘍効果を関連付けた報告はこれまでにない。
国際公開第02/032872号 国際公開第2007/136103号
Matsui et al., Clinical Cancer Research, 2008, 14(17), p.5459-5465. Davies et al., Nature, 2002, 417, p.949-954. Besson et al., European Journal of Biochemistry, 1999, 263, p. 605-611.
　本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、癌を罹患する被験者の血管新生阻害剤、特に、VEGFレセプター阻害剤、FGFレセプター阻害剤、RETキナーゼ阻害剤またはKITキナーゼ阻害剤への反応性を予測する方法を見出すことにある。
　また、本発明の解決しようとする課題は、上記の予測方法により癌を罹患する被験者を選択し、血管新生阻害剤を投与することにより、これを治療することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、驚くべきことに、B-Rafの突然変異とPTENの突然変異または発現欠損が同時に起こることが、癌細胞の血管新生阻害剤への反応性と相関することを見出した。
　より詳細には、本発明者らは、メラノーマ細胞の血管新生阻害剤への反応性を調べた結果、（a1）B-RafおよびPTENが野生型であるもの、あるいは、（a2）B-RafおよびPTENが突然変異または発現欠損しているものが、血管新生阻害剤への反応性が高いことを明らかにした。
　さらに、本発明者らは、メラノーマ細胞におけるB-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無が、アンジオポエチン-1（ANG1）およびアンジオポエチン-2（ANG2）の発現レベルとも相関していることを見出した。すなわち、（b1）サンプル中のANG1およびANG2の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（b2）サンプル中のANG2の発現レベルが対照の値より高い場合、または（b3）ANG1およびANG2の発現レベルの比が、対照の値よりも低い場合に、腫瘍を罹患する被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことを明らかにした。
　よって、被験者に由来するサンプルにおけるB-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無、ANG1およびANG2の発現レベル、または、ANG1およびANG2の発現レベルの比を指標とすることにより、血管新生阻害剤を当該被験者に投与せずに、当該被験者の血管新生阻害剤への反応性を予測することが可能になった。
　さらに、本発明者らは、メラノーマ細胞におけるB-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無に応じて変動する血管新生阻害剤の抗腫瘍効果のパターンが、SHC1、IL6、CXCR4、COL4A3、NRP2、MEIS1、ARHGAP22、SCG2、FGF9、PML、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1の発現レベルとも相関していることを見出した。すなわち、（c1）SHC1の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c2）IL6の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、（c3）CXCR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、（c4）COL4A3の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、（c5）NRP2の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c6）MEIS1の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合または（c7）ARHGAP22の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c8）SCG2の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c9）FGF9の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、（c10）PMLの発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c11）FGFR3の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、（c12）FGFR2の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、（c13）FGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、（c14）FGFR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、（c15）VEGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、に腫瘍を罹患する被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことを明らかにした。
　すなわち本発明は、以下に関する。
（１）腫瘍を罹患する被験者の血管新生阻害剤に対する反応性を予測する方法であって、
（a）前記被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中の、B-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無を検出する工程を含み、当該検出工程においては、
（a1）B-Rafが野生型であり、PTENが野生型である、または
（a2）B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異もしくは発現欠損変異を有しており、PTENが表２から選ばれる少なくとも１つの突然変異もしくは発現欠損変異を有している場合が、当該被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標である、前記方法。
（２）前記（a）の検出工程において、B-Rafが野生型であり、PTENが野生型である場合、前記被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標である、（１）の方法。
（３）前記（a）の検出工程において、B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異または発現欠損変異を有しており、PTENが表２から選ばれる少なくとも１つの突然変異または発現欠損変異を有している場合、前記被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標である、（１）の方法。
（４）前記B-Rafの突然変異が、V600Eのアミノ酸配列の突然変異又は前記変異に対応するヌクレオチド配列の突然変異である、（１）または（３）の方法。
（５）前記PTENの突然変異が、A499G、T202CおよびT335Aからなる群から選ばれる少なくとも１つのヌクレオチド配列の突然変異、またはT167A、Y68HおよびL112Qからなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列の突然変異である、（１）または（３）の方法。
（６）前記血管新生阻害剤が、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドまたはその薬理学的に許容される塩である、（１）～（５）の方法。
（７）前記血管新生阻害剤が、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドのメシル塩である、（６）の方法。
（８）前記腫瘍がB-RafにV600E突然変異を有する腫瘍であることを特徴とする、（１）～（７）の方法。
（９）前記腫瘍がメラノーマ、甲状腺癌、大腸癌、卵巣癌、肝癌、肺癌、子宮内膜癌または神経膠腫であることを特徴とする、（１）～（８）の方法。
（１０）前記（a）工程において、前記被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことが予測されており、
（b）前記被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中の、ANG1およびANG2の発現レベルを定量する工程をさらに含み、当該定量工程においては、
（b1）ANG1の発現レベルが対照の値と比較して低い
（b2）ANG2の発現レベルが、対照の値と比較して高い、または
（b3）ANG1およびANG2の発現レベルの比が対照の値と比較して低い
場合が、当該被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標である、
（１）～（９）の方法。
（１１）前記（a）工程において、前記被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことが予測されており、
（c）前記被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中の、SHC1、IL6、CXCR4、COL4A3、NRP2、MEIS1、ARHGAP22、SCG2、FGF9、PML、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1からなる群から選ばれる少なくとも１つの発現レベルを定量する工程をさらに含み、当該定量工程においては、
（c1）SHC1の発現レベルが、対照の値と比較して低い
（c2）NRP2の発現レベルが、対照の値と比較して低い
（c3）ARHGAP22の発現レベルが、対照の値と比較して低い
（c4）SCG2の発現レベルが、対照の値と比較して低い
（c5）PMLの発現レベルが、対照の値と比較して低い
（c6）IL6の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
（c7）CXCR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
（c8）COL4A3の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
（c9）MEIS1の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
（c10）FGF9の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
（c11）FGFR3の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
（c12）FGFR2の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
（c13）FGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
（c14）FGFR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い、または
（c15）VEGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
場合が、当該被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標である、（１）～（９）の方法。
（１２）腫瘍を罹患する被験者の血管新生阻害剤に対する反応性を予測する方法であって、
（b）前記被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中の、ANG1およびANG2の発現レベルを定量する工程を含み、当該定量工程においては、
（b1）ANG1の発現レベルが対照の値と比較して低い
（b2）ANG2の発現レベルが、対照の値と比較して高い、または
（b3）ANG1およびANG2の発現レベルの比が対照の値と比較して低い
場合が、当該被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標である、
前記方法。
（１３）前記（b）工程において、前記被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことが予測されており、
（c）前記被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中の、SHC1、IL6、CXCR4、COL4A3、NRP2、MEIS1、ARHGAP22、SCG2、FGF9、PML、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1からなる群から選ばれる少なくとも１つの発現レベルを定量する工程をさらに含み、当該定量工程においては、
（c1）SHC1の発現レベルが、対照の値と比較して低い、
（c2）NRP2の発現レベルが、対照の値と比較して低い、
（c3）ARHGAP22の発現レベルが、対照の値と比較して低い、
（c4）SCG2の発現レベルが、対照の値と比較して低い、
（c5）PMLの発現レベルが、対照の値と比較して低い、
（c6）IL6の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
（c7）CXCR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
（c8）COL4A3の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
（c9）MEIS1の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
（c10）FGF9の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
（c11）FGFR3の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
（c12）FGFR2の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
（c13）FGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
（c14）FGFR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い、または
（c15）VEGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
場合が、当該被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標である、（１２）の方法。
（１４）前記工程（a）～（c）の検出工程においては、さらに前記被験者の腫瘍組織に由来するサンプルにB-RafおよびPTENのプローブを接触させる工程を含む、（１）～（１３）の方法。特に、前記プローブが、核酸プローブ、特異的抗体またはそれらの組み合わせであることが好ましい。
（１５）血管新生阻害剤の投与により腫瘍を罹患する被験者を治療する方法であって、当該被験者は、（１）～（１４）の方法により、当該血管新生阻害剤に対する反応性が高いことが予測されていることを特徴とする、前記方法。
（１６）前記血管新生阻害剤が、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドまたはその薬理学的に許容される塩である、（１５）の方法。
（１７）腫瘍を罹患する被験者への投与に使用する医薬を製造するための血管新生阻害剤の使用であって、当該被験者は、（１）～（１４）のいずれかの方法により、当該血管新生阻害剤に対する反応性が高いことが予測されていることを特徴とする、前記使用。
（１８）前記血管新生阻害剤が、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドまたはその薬理学的に許容される塩である、（１７）の使用。
（１９）血管新生阻害剤を含む、腫瘍を罹患する被験者の治療用医薬組成物であって、当該被験者は、（１）～（１４）のいずれかの方法により、当該血管新生阻害剤に対する反応性が高いことが予測されていることを特徴とする、前記医薬組成物。
（２０）前記血管新生阻害剤が、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドまたはその薬理学的に許容される塩である、（１９）の医薬組成物。
（２１）腫瘍を罹患する被験者の治療のための血管新生阻害剤であり、当該被験者は、当該治療投与を行う医者またはその他の医療従事者によって、（１）ないし（１４）のいずれかの方法により、当該血管新生阻害剤へ反応する可能性が高いことが予測されていることを特徴とする、前記血管新生阻害剤。
　前記血管新生阻害剤としては、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドまたはその薬理学的に許容される塩であることが好ましく、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドのメシル酸塩が特に好ましい。
（２２）B-RafおよびPTEN、または、ANG1およびANG2のプローブを含み、（１）ないし（１４）のいずれかの方法により、腫瘍を罹患する被験者の血管新生阻害剤に対する反応性を予測することを特徴とする、腫瘍を罹患する被験者の血管新生阻害剤に対する反応性を予測するためのキット。
　前記血管新生阻害剤としては、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドまたはその薬理学的に許容される塩が好ましく、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドのメシル酸塩が特に好ましい。
　本発明により、癌を罹患する被験者の血管新生阻害剤、特に、VEGFレセプター阻害剤、FGFレセプター阻害剤、RETキナーゼ阻害剤またはKITキナーゼ阻害剤への反応性を予測することができる。
　その結果、癌を罹患する被験者に対し、血管新生阻害剤の投与が有効か否かを判断した上で投与することができるため、当該血管新生阻害剤の投与が有効である癌患者を選択したうえで、血管新生阻害剤を投与することができ、副作用のリスクを低減しつつ、癌を治療することができる。
メラノーマ細胞をBRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無により層別化した場合のE7080の抗腫瘍効果を示した図である。BRAFにおいて「＋」は突然変異または発現欠損を有している場合、「－」は突然変異または発現欠損を有していない場合を表す。PTENにおいて、「＋」は突然変異または発現欠損を有している場合、「－」は突然変異または発現欠損を有していない場合を示す。 メラノーマ細胞をBRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無により層別化した場合の腫瘍中のペリサイト血管の割合を示した図である。BRAFにおいて「＋」は突然変異または発現欠損を有している場合、「－」は突然変異または発現欠損を有していない場合を表す。PTENにおいて、「＋」は突然変異または発現欠損を有している場合、「－」は突然変異または発現欠損を有していない場合を示す。 メラノーマ細胞のE7080の抗腫瘍効果および腫瘍中のペリサイト血管の割合との相関を示したものである。 メラノーマ細胞をBRAFのV600E突然変異の有無により層別化した場合の、ANG1のタンパク質の発現量（ａ）およびANG1のmRNAの発現量（ｂ）を示した図である。「＋」は突然変異または発現欠損を有している場合、「－」は突然変異または発現欠損を有していない場合を表す。 メラノーマ細胞をPTENの突然変異または発現欠損の有無により層別化した場合の、ANG2のタンパク質の発現量（ａ）およびANG2のmRNAの発現量（ｂ）を示した図である。「＋」は突然変異または発現欠損を有している場合、「－」は突然変異または発現欠損を有していない場合を示す。 メラノーマ細胞をBRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無により層別化した場合のANG1およびANG2の発現レベルの比を比較した図である。BRAFにおいて「＋」は突然変異または発現欠損を有している場合、「－」は突然変異または発現欠損を有していない場合を表す。PTENにおいて、「＋」は突然変異または発現欠損を有している場合、「－」は突然変異または発現欠損を有していない場合を示す。 メラノーマ細胞をBRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無により層別化した場合のFGFR2およびFGFR3の発現レベルの比を比較した図である。「BRAF wt/PTEN wt」はBRAFおよびPTENが野生型である場合を表し、「BRAF mu/PTEN mu」はBRAFおよびPTENに突然変異または発現欠損を有している場合を表し、「BRAF mu/PTEN wt」はBRAFに突然変異または発現欠損を有しており、PTENが野生型である場合を表す。
　以下に本発明の実施の形態について説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
　なお、本明細書において引用した文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。
　本発明は、被験者が血管新生阻害剤に反応する可能性を予測する方法に関するものである。
　本発明の方法は、被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中の、B-Rafの突然変異または発現欠損の有無、およびPTENの突然変異または発現欠損の有無を検出する工程を含む。そして、当該検出工程において、次の（a1）または（a2）の場合は、当該被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標となる。
（a1）B-Rafが野生型であり、PTENが野生型である。
（a2）B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異もしくは発現欠損変異を有しており、PTENが表２から選ばれる少なくとも１つの突然変異もしくは発現欠損変異を有している。
　また、本発明の方法は、被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中の、ANG1およびANG2の発現レベルを定量する工程を含む。そして、当該定量工程において、次の（b1）、（b2）または（b3）の場合、これらの定量結果は、当該被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標となる。
（b1）ANG1の発現レベルが対照の値と比較して低い。
（b2）ANG2の発現レベルが対照の値と比較して高い。
（b3）ANG1およびANG2の発現レベルの比が、対照の値と比較して低い。
　さらに、本発明は、前記被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中の、SHC1、IL6、CXCR4、COL4A3、NRP2、MEIS1、ARHGAP22、SCG2、FGF9、PML、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1からなる群から選ばれる少なくとも１つの発現レベルを定量する工程を含む。そして、当該定量工程において、次の（c1）～（c15）に該当する場合、これらの定量結果は、当該被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標となる。
（c1）SHC1の発現レベルが、対照の値と比較して低い。
（c2）NRP2の発現レベルが、対照の値と比較して低い。
（c3）ARHGAP22の発現レベルが、対照の値と比較して低い。
（c4）SCG2の発現レベルが、対照の値と比較して低い。
（c5）PMLの発現レベルが、対照の値と比較して低い。
（c6）IL6の発現レベルが、対照の値と比較して高い。
（c7）CXCR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い。
（c8）COL4A3の発現レベルが、対照の値と比較して高い。
（c9）MEIS1の発現レベルが、対照の値と比較して高い。
（c10）FGF9の発現レベルが、対照の値と比較して高い。
（c11）FGFR3の発現レベルが、対照の値と比較して高い。
（c12）FGFR2の発現レベルが、対照の値と比較して高い。
（c13）FGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い。
（c14）FGFR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い。
（c15）VEGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い。
　さらに、本発明は、前記被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中の、B-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無、並びにFGFR3またはFGFR2の発現レベルを検出する工程を含む。そして、当該検出工程において、次の（d1）または（d2）の場合は、当該被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標となる。
（d1）B-RafおよびPTENが野生型であり、FGFR3またはFGFR2を発現する。
（d2）B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異もしくは発現欠損を有しており、PTENが表２から選ばれる少なくとも１つの突然変異もしくは発現欠損を有しており、FGFR3あるいはFGFR2を発現する。
　さらに、本発明の方法は、上記指標を用いて血管新生阻害剤に対する反応性を予測する方法に関する。
　すなわち、本発明の方法は、B-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損変異の有無、あるいはANG1およびANG2の発現レベルまたはANG1およびANG2の発現レベルの比を検出し、これらの検出結果を指標として、血管新生阻害剤に対する反応性と関連づける工程を含む。また、本発明の方法は、SHC1、IL6、CXCR4、COL4A3、NRP2、MEIS1、ARHGAP22、SCG2、FGF9、PML、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4またはVEGFR1の発現レベルを定量し、これらの検出結果を指標として、血管新生阻害剤に対する反応性と関連づける工程を含む。
　本発明において、検出工程には、発現レベルまたは発現レベルの比の測定工程あるいは得られた測定結果を分析する工程を含めることができ、定量工程には、発現レベルまたは発現レベルの比の測定工程あるいは得られた測定結果を分析する工程を含めることができる。
　本発明の方法により得られた上記検出結果及び定量結果は、被験者が血管新生阻害剤に対する反応性が高いか否かを判定するための情報として提供される。これらの情報は、主として医療従事者によって利用される。
　本発明の方法により、血管新生阻害剤に反応する可能性が高いと判断されたときは、血管新生阻害剤の効果が有効であること（抗腫瘍効果）が期待でき、本発明の方法は癌治療の指標として利用することができる。
　本発明の方法の対象となる血管新生阻害剤は、血管新生阻害活性を有する物質であり、VEGFレセプター阻害剤、FGFレセプター阻害剤、PDGFレセプター阻害剤、RETキナーゼ阻害剤、KITキナーゼ阻害剤、上皮成長因子（EGF）阻害剤、インテグリン阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、内因性阻害物質等が挙げられる。
　「VEGFレセプター」は、受容体型チロシンキナーゼの一群であり、本発明においては、VEGFR-1（Flt-1とも称される）、VEGFR-2（KDR/Flk-1とも称される）、VEGFR-3（Flt-4とも称される）を総称するものである。さらに、VEGFR-1、VEGFR-2およびVEGFR-3のいずれかのアミノ酸配列に相同性を有し、かつ、VEGFレセプター活性を有するもの（現在機能が未知であるが、将来機能的に同じファミリーに分類されるものを含む）も、VEGFレセプターに含まれる。VEGFレセプター活性は、当該レセプターのリン酸化を特異的抗体を用いたELISAやウェスタンブロッティング法により検出することで測定することができる。
　本発明において、「VEGFレセプター阻害剤」とは、VEGFレセプターに対する阻害活性を有する阻害剤を意味する。VEGFレセプター阻害剤は、VEGFレセプターに対する阻害活性を有している限り、他の受容体型チロシンキナーゼやその他の生体内分子に対しても阻害活性を有していても良い。
　「FGFレセプター」は、受容体型チロシンキナーゼの一群であり、本発明においては、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4およびFGFR5を総称するものである。さらに、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4およびFGFR5のいずれかのアミノ酸配列に相同性を有し、かつ、FGFレセプター活性を有するもの（現在機能が未知であるが、将来機能的に同じファミリーに分類されるものを含む）も、FGFレセプターに含まれる。FGFレセプター活性は、当該レセプターのリン酸化をELISAやウェスタンブロッティング法により検出することで測定することができる。
　本発明において、「FGFレセプター阻害剤」とは、FGFレセプターに対する阻害活性を有する阻害剤を意味する。FGFレセプター阻害剤は、FGFレセプターに対する阻害活性を有している限り、他の受容体型チロシンキナーゼやその他の生体分子に対しても阻害活性を有していても良い。
　「PDGFレセプター」は、受容体型チロシンキナーゼの一群であり、本発明においては、PDGFR-αおよびPDGFR-βを総称するものである。さらに、PDGFR-αおよびPDGFR-βのいずれかのアミノ酸配列に相同性を有し、かつ、PDGFレセプター活性を有するもの（現在機能が未知であるが、将来機能的に同じファミリーに分類されるものを含む）も、PDGFレセプターに含まれる。PDGFレセプター活性は、当該レセプターのリン酸化活性をELISAやウェスタンブロッティング法により検出することで測定することができる。
　本発明において、「PDGFレセプター阻害剤」とは、PDGFレセプターに対する阻害活性を有する阻害剤を意味する。PDGFレセプター阻害剤は、PDGFレセプターに対する阻害活性を有している限り、他の受容体型チロシンキナーゼやその他の生体分子に対しても阻害活性を有していても良い。
　「RETキナーゼ」は、受容体型チロシンキナーゼの一種であり、グリア細胞由来神経栄養因子（GDNF）ファミリーのリガンドに対する機能的レセプターである。本発明においては、さらに、RETキナーゼのアミノ酸配列と相同性を有し、かつ、RETキナーゼ活性を有するもの（現在機能が未知であるが、将来機能的に同じファミリーに分類されるものを含む）もRETキナーゼも含まれる。RETキナーゼ活性は、当該レセプターのリン酸化活性をELISAやウェスタンブロッティング法により検出することで測定することができる。
　本発明において、「RETキナーゼ阻害剤」とは、RETキナーゼに対する阻害活性を有する阻害剤を意味する。RETキナーゼ阻害剤は、RETキナーゼに対する阻害活性を有している限り、他の受容体型チロシンキナーゼやその他の生体分子に対しても阻害活性を有していても良い。
　「KITキナーゼ」は、c-KitまたはSCFレセプターとも称され、受容体型チロシンキナーゼの一種である。本発明においては、さらに、KITキナーゼのアミノ酸配列と相同性を有し、かつ、KITキナーゼ活性を有するもの（現在機能が未知であるが、将来機能的に同じファミリーに分類されるものを含む）も、KITキナーゼに含まれる。
　本発明において、「KITキナーゼ阻害剤」とは、KITキナーゼに対する阻害活性を有する阻害剤を意味する。KITキナーゼ阻害剤は、KITキナーゼに対する阻害活性を有している限り、他の受容体型チロシンキナーゼやその他の生体分子に対しても阻害活性を有していても良い。KITキナーゼ活性は、当該レセプターのリン酸化活性をELISAやウェスタンブロッティング法により検出することで測定することができる。
　「EGF」とは、上皮成長因子のことであり、「EGF阻害剤」とはEGFとそのレセプターの結合により誘導されるシグナリングに対する阻害活性を有する阻害剤を意味する。EGF阻害剤は、EGFが誘導するシグナリングに対する阻害活性を有している限り、他の生体分子に対しても阻害活性を有していても良い。
　「インテグリン」とは、主に細胞接着分子として機能する細胞表面タンパク質の一つである。その構造はα鎖とβ鎖からなるヘテロダイマーで構成されており、これまでに異なるα鎖とβ鎖の組合せにより２２種のインテグリンが確認され、インテグリンファミリーを形成している。「インテグリン阻害剤」とは、インテグリンとそのレセプターとの結合により誘導されるシグナリングに対する阻害活性を有する阻害剤を意味する。インテグリン阻害剤は、インテグリンが誘導するシグナリングに対する阻害活性を有している限り、他の生体分子に対しても阻害活性を有していても良い。
　「マトリックスメタロプロテアーゼ」とは、細胞外マトリックスの分解に関わる亜鉛イオン（Zn2+）依存性のプロテアーゼの一群である。マトリックスメタロプロテアーゼは、血管周囲の基底膜を分解することにより血管新生を促進することが知られている。「マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤」とは、マトリックスメタロプロテアーゼに対する阻害活性を有する阻害剤を意味する。マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤は、マトリックスメタロプロテアーゼに対する阻害活性を有している限り、他の生体分子に対しても阻害活性を有していても良い。
　「内因性阻害物質」とは細胞が内在的に発現する、血管新生阻害活性を有する生体内物質のことであり、トロンボスポンジン、プロラクチン、インターフェロンα／β、インターロイキン－１２、血小板第４因子、アンジオスタチン、エンドスタチン、あるいはそれらの分解物を含む。
　本発明において、血管新生阻害剤への「反応性」とは、血管新生阻害剤を投与されることによって、癌細胞の増殖が抑制される性質を意味し、血管新生阻害剤に対する感受性の指標となる性質である。
　ここで、「腫瘍」は良性腫瘍および悪性腫瘍に分類され、それぞれ上皮性と非上皮性がある。本発明において、「癌」は上皮性の悪性腫瘍をいう場合がある。
　被験者の血管新生阻害剤への「反応性が高い」とは、血管新生阻害剤を投与されることによって、腫瘍細胞の増殖が強く抑制される性質をいい、例えば、血管新生阻害剤を投与されることによって、腫瘍細胞の増殖、例えば腫瘍細胞の増殖する速度または増殖する量が対照の値に比べて、１／２以下、好ましくは１／５以下、さらに好ましくは１／１０以下の場合、または、腫瘍細胞のコロニー形成率が対照の値に比べて、１／２以下、好ましくは１／５以下、さらに好ましくは１／１０以下の場合をいうことができる。
　あるいは、臨床現場においては、例えば、血管新生阻害物質を投与した時に対照の値と比較して病変が２０％の増加にとどまる、好ましくは標的病変の長径和が投与前の長径和と比較して３０％以上の減少、さらに好ましくは全ての標的病変が消失する場合をいうことができるが、これらの例に限定されるものではない。
　本発明において、「被験者の腫瘍組織に由来するサンプル」とは、被験者から採取された腫瘍組織、循環癌細胞など腫瘍組織から遊離した腫瘍細胞または腫瘍細胞に由来するDNA、RNA（例えばmRNA、miRNA、tRNA、rRNA、ncRNA、dsRNA、snRNA、snoRNAなど）、その他の核酸もしくはタンパク質、あるいはそれらから本発明の実施に適する形態に調製されたものを意味する。被験者から採取された腫瘍組織または腫瘍細胞は体液または血液であってもよい。なお、サンプルの採取や調製を行なう者は、本発明の工程を行う医療従事者と同一人物でも良く、別人物であっても良い。
　本発明において、「医療従事者」とは、医師、歯科医師、検査技師（検査受託会社において検査を行う者も含む）、看護師、その他の医療機関の職員を言う。
　本発明において、血管新生阻害剤への反応性を予測する対象となる腫瘍の種類、または被験者の罹患する腫瘍の種類は、特に限定されず、例えば、脳腫瘍（下垂体腺腫、神経膠腫を含む）、頭頸部癌、頚癌、顎癌、上顎癌、顎下腺癌、口腔癌（舌癌、口腔底癌、歯肉癌、頬粘膜癌、硬口蓋癌を含む）、唾液腺癌、舌下腺癌、耳下腺癌、鼻腔癌、副鼻腔癌（上顎洞癌、前頭洞癌、篩骨洞癌、蝶型骨洞癌を含む）、喉頭癌（声門上癌、声門癌、声門下癌を含む）、食道癌、肺癌（気管支原生癌、非小細胞肺癌（肺腺癌、扁平上皮癌、大細胞肺癌を含む）、小細胞肺癌（燕麦細胞型（リンパ球様型）、中間細胞型を含む）、混在小細胞・大細胞肺癌を含む）、乳癌、膵癌（膵管癌を含む）、胃癌（スキルス胃癌、未分化胃癌（低分化腺癌、印環細胞癌、粘液癌を含む）を含む）、胆道癌（胆管癌、胆嚢癌を含む）小腸または十二指腸の癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌、結腸・直腸癌、盲腸癌、Ｓ状結腸癌、上行結腸癌、横行結腸癌、下行結腸癌を含む）、膀胱癌、腎癌（腎細胞癌を含む）、肝癌（肝細胞癌、肝内胆管癌を含む）、前立腺癌、子宮癌（子宮頸癌、子宮体癌を含む）、卵巣癌、甲状腺癌、咽頭癌（上咽頭癌、中咽頭癌、下咽頭癌を含む）、肉腫（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、カポジ肉腫、筋肉腫、血管肉腫、線維肉腫など）、悪性リンパ腫（ホジキン型リンパ腫、非ホジキン型リンパ腫を含む）、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（CML）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）および急性リンパ性白血病（ALL）、リンパ腫、多発性骨髄腫（MM）、骨髄異型成症候群などを含む）および皮膚癌（基底細胞癌、有棘細胞癌、メラノーマ、菌状息肉症、セザリー症候群、日光角化症、ボーエン病、パージェット病を含む）を挙げることができ、好ましくは、B-RafにV600E突然変異のある腫瘍である。B-RafにV600E突然変異のある腫瘍とは、例えば、メラノーマ、甲状腺癌、卵巣癌、胆道癌、大腸癌、肝癌、膵臓癌、乳癌、肺癌、神経膠腫、骨髄性白血病および子宮内膜癌である（Schubbert et al., Nature Reviews Cancer, 2007, 7, p.295-309.）。より好ましくは、メラノーマ、甲状腺癌、大腸癌、卵巣癌、肝癌、肺癌、子宮内膜癌および神経膠腫であり、さらに好ましくは、メラノーマである。腫瘍がB-RafにV600E突然変異のある腫瘍であるかどうかは、後述するB-Rafの突然変異または発現欠損の検出方法を用いて調べることもできる。
　本発明における被験者は、上記腫瘍の少なくとも１種に罹患している被験者が含まれる。被験者が上記腫瘍の少なくとも１種に罹患している限り、当該被験者は他の疾患に罹患していてもよい。
　本発明において、「B-Raf」（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1）（「BRAF」ともいう）とは、raf/milファミリーに属するセリン/スレオニンプロテインキナーゼであり、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No. NM_004333.4である遺伝子（配列番号１）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_004324.2のタンパク質（配列番号２）を意味する。このタンパク質は、MAPキナーゼ/ERKsシグナリング経路を調節する機能を有する。
　本発明において、「PTEN」（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome10）とは、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No. NM_000314.4である遺伝子（配列番号３）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_000305.3のタンパク質（配列番号４）を意味する。
　本発明において、B-RafまたはPTENの「突然変異」とは、B-RafまたはPTENのポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列中のアミノ酸が一つまたは複数個置換、欠失、挿入および／または付加されることにより変異することを意味する。したがって、B-RafまたはPTENのポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列中のアミノ酸が一つまたは複数個置換、欠失、挿入および／または付加された状態が検出されたときに、B-RafまたはPTENは突然変異を有していると判断される。
　本発明において、B-Rafの突然変異は、例えば以下の表１に示されるものから選ばれる一のアミノ酸配列変異または当該アミノ酸配列変異に対応する塩基配列変異である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
 
　表１において、アルファベットに挟まれた数字は、B-Rafのアミノ酸配列（配列番号２）の位置を示し、数字の前に記載されたアルファベットは野生型のアミノ酸であり、数字の後に記載されたアルファベットは変異後のアミノ酸である。
　例えば、アミノ酸配列変異のD587Aとは、B-Raf遺伝子（配列番号１）のアミノ酸配列（配列番号２）において、587番目のアスパラギン酸がアラニンに突然変異していること、または、このアミノ酸配列の変異に対応するポリヌクレオチドの塩基配列の変異を意味する。
　アミノ酸配列変異のV600Eとは、B-Raf遺伝子（配列番号１）のアミノ酸配列（配列番号２）において、600番目のバリンがグルタミン酸に突然変異していること、または、対応するポリヌクレオチドの塩基配列の変異、例えば、1798～1800番目の塩基配列「gtg」において、1799位のヌクレオチドがチミンからアデニンへ突然変異していることを意味する。
　アミノ酸配列変異のK601delとは、B-Raf遺伝子（配列番号１）のアミノ酸配列（配列番号２）において、601番目のリジンが欠失していること、または、対応するポリヌクレオチドの塩基配列の変異を意味する。
　アミノ酸配列変異のT599_V600insTTとは、B-Raf遺伝子（配列番号１）のアミノ酸配列（配列番号２）において、599番目のトレオニンと600番目のバリンの間にトレオニン２残基が挿入されていること、または、対応するポリヌクレオチドの塩基配列の変異を意味する。
　本発明において、B-Rafの「発現欠損」または「発現欠損変異」とは、B-Raf遺伝子が欠失すること、またはB-Raf遺伝子（イントロン部位を含む）のポリヌクレオチド配列が突然変異することにより、B-Rafのタンパクの発現が消失している状態を意味する。したがって、被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中のB-Rafのポリヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の検出量が、対照の値に比べて統計学的に有意に減少しているとき、または予め設定したカットオフ値未満であるとき、あるいはB-Rafが検出限界以下であるときは、B-Rafは発現欠損していると判断される。
　本発明において、B-Rafが「野生型」であるとは、表１に示される突然変異部位の少なくとも一の有無を確認した際、当該突然変異が検出されず、かつ、発現欠損も検出されない状態を意味する。また、B-Rafが「野生型」であることをB-Rafが「正常下」であるともいう。
　本発明において、PTENの突然変異は、以下の表２に示されるものから選ばれる一のものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　表２において、アルファベットに挟まれた数字は、PTENのポリヌクレオチド配列（配列番号３）又はアミノ酸配列（配列番号４）の位置を示し、数字の前に記載されたアルファベットは野生型の塩基配列又はアミノ酸配列であり、数字の後に記載されたアルファベットは変異後の塩基配列又はアミノ酸配列である。例えば、ヌクレオチド変異のT170Gとは、PTEN遺伝子のタンパクコード領域（配列番号３）の170位のヌクレオチドがチミンからグアニンに突然変異していることを意味し、アミノ酸変異のL57Wとは、対応するタンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）において、57番目のロイシンがトリプトファンに突然変異していることを意味する。Y76stopとは、PTENのアミノ酸配列の76番目のチロシンのコドンがストップコドンに変異して翻訳停止となったことを意味する。
　本発明において、PTENの「発現欠損」または「発現欠損変異」とは、PTEN遺伝子が欠失すること、またはPTEN遺伝子（イントロン部位を含む）のポリヌクレオチド配列が突然変異することにより、PTENのタンパクの発現が消失している状態を意味する。したがって、被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中のPTENのポリヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の検出量が、対照の値に比べて統計学的に有意に減少しているとき、または予め設定したカットオフ値未満であるとき、あるいはPTENが検出限界以下であるときは、PTENは発現欠損していると判断される。
　本発明において、PTENが「野生型」であるとは、表２に示される突然変異部位の少なくとも一の有無を確認した際、当該突然変異が検出されず、かつ、発現欠損も検出されない状態を意味する。また、PTENが「野生型」であることをPTENが「正常下」であるともいう。
　本発明において、「ANG1」とはアンジオポエチン-1、「ANG2」とはアンジオポエチン-2であり、mRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がそれぞれGenBank Accession No. NM_001146.3、NM_00111888.1である遺伝子（ANG1：配列番号４５、ANG2：配列番号４７）、およびそこから翻訳されるタンパク質（ANG1：配列番号４６、GenBank Accession No. NP_001137.2、ANG2：配列番号４８、GenBank Accession No. NP_001112360.1）を意味する。
　本発明において、「SHC1」（src homology2 domain containing transforming protein1）とは、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No. NM_003029.4である遺伝子（配列番号５）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_003020.2のタンパク質（配列番号６）を意味する。このタンパク質は、アポトーシスに関連する機能を有する。
　本発明において、「IL6」（interleukin6）とは、造血や炎症反応において重要な役割を果たすサイトカインであり、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No.NM_000600.3である遺伝子（配列番号７）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_000591.1のタンパク質（配列番号８）を意味する。このタンパク質は、JAK/STATシグナリング経路やMAPキナーゼ/ERKsシグナリング経路を調節する機能を有する。
　本発明において、「CXCR4」（CXC chemokine receptor4）とは、fusinとも呼ばれ、ストローマ由来因子１に対して特異的なαケモカインレセプターであり、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No.NM_001008540.1である遺伝子（配列番号９）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_001008540.1のタンパク質（配列番号１０）を意味する。このタンパク質は、細胞の遊走を促進する機能を有する。
　本発明において、「COL4A3」（collagen, type IV, alpha 3）、とは、細胞外マトリックスを構成する成分であり、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No.NM_000091.4である遺伝子（配列番号１１）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_000082.2のタンパク質（配列番号１２）を意味する。このタンパク質は、細胞骨格を形成する機能を有する。
　本発明において、「NRP2」（neuropilin-2）とは、細胞膜貫通型の受容体タンパクであり、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No.NM_003872.2である遺伝子（配列番号１３）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_003863.2のタンパク質（配列番号１４）を意味する。このタンパク質は、発生段階や癌化の段階で血管新生を促進する機能を有する。
　本発明において、「MEIS1」（Meis homeobox 1）とは、HOX遺伝子群の一つであり、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No. NM_002398.2である遺伝子（配列番号１５）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_002389.1のタンパク質（配列番号１６）を意味する。このタンパク質は、分化誘導を制御する機能を有する。
　本発明において、「ARHGAP22」（Rho GTPase activating protein 22）とは、細胞内シグナル伝達に関与する分子であり、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No. NM_021226.2である遺伝子（配列番号１７）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_067049.2のタンパク質（配列番号１８）を意味する。このタンパク質は、細胞骨格のリモデリングを制御する機能を有する。
　本発明において、「SCG2」（secretogranin2）とは、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No. NM_003469.4である遺伝子（配列番号４９）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_003460.2のタンパク質（配列番号５０）を意味する。このタンパク質は、分泌タンパクであり、細胞の遊走を促進する機能を有する。
　本発明において、「FGF9」（fibroblast growth factor9）とは、細胞の分化や機能維持に重要な役割を果たしている分泌系タンパクであり、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No. NM_002010.2である遺伝子（配列番号５１）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_002001.1のタンパク質（配列番号５２）を意味する。このタンパク質は、後述するFGFR3と相互作用する機能を有する。
　本発明において、「PML」（promyelocytic leukemia）とは、転写因子の一種であり、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No. NM_002675.3である遺伝子（配列番号５３）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_002666.1のタンパク質（配列番号５４）を意味する。このタンパク質は、癌抑制因子として細胞の増殖を制御する機能を有する。
　本発明において、「FGFR3」（fibroblast growth factor receptor3）とは、細胞の増殖や分化を促進する機能を有するタンパク質であり、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No. NM_000142.3である遺伝子（配列番号５５）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_000133.1のタンパク質（配列番号５６）を意味する。FGFR3にはFGFR3bおよびFGFR3cの2種類のアイソフォームが知られている。
　本発明において、「FGFR2」（fibroblast growth factor receptor2）とは、細胞の増殖や分化を促進する機能を有するタンパク質であり、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No. NM_001144918.1である遺伝子（配列番号５７）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_001138390.1のタンパク質（配列番号５８）を意味する。
　本発明において、「FGFR1」（fibroblast growth factor receptor1）とは、細胞の増殖や分化を促進する機能を有するタンパク質であり、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No. NM_001174063.1である遺伝子（配列番号５９）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_001167534.1のタンパク質（配列番号６０）を意味する。
　本発明において、「FGFR4」（fibroblast growth factor receptor4）とは、細胞の増殖や分化を促進する機能を有するタンパク質であり、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No. NM_002011.3である遺伝子（配列番号６１）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_002002.3のタンパク質（配列番号６２）を意味する。
　本発明において、「VEGFR1」（vascular endothelial growth factor receptor1）とは、細胞の増殖や分化、血管の新生を促進する機能を有するタンパク質であり、そのmRNAから決定されたポリヌクレオチド配列がGenBank Accession No. NM_001159920.1である遺伝子（配列番号６３）、およびそこから翻訳されるGenBank Accession No. NP_001153392.1のタンパク質（配列番号６４）を意味する。
　本発明において、「阻害剤」とは、標的分子の機能を阻害する活性を有する物質、例えば化合物、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド（“Antisense Drug Technology: Principles, Strategies, and Applications (Second Edition)”, CRC Press, 2007）、RNAiオリゴヌクレオチド（“RNA Methodologies (Third Edition)”, Elsevier, 2005, Chapter 24）、ペプチド核酸（Kaihatsu et al., Chemistry & Biology, 2004, 11(6), p.749-758）およびペプチド性アンタゴニスト（Ladner et al., Drug Discovery Today, 2004,9, p.525-529）を意味する。
　本発明において、「血管新生阻害剤」は、血管新生を阻害する活性を有する物質を意味し、そのような活性を有する限り、物質の種類に特に限定されるものではない。例えば、VEGFレセプター阻害剤、FGFレセプター阻害剤、PDGFレセプター阻害剤、RETキナーゼ阻害剤、KITキナーゼ阻害剤、EGF阻害剤、インテグリン阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、内因性阻害物質等が挙げられ、好ましくはVEGFレセプター阻害剤、FGFレセプター阻害剤、PDGFレセプター阻害剤、RETキナーゼ阻害剤およびKITキナーゼ阻害剤であり、より好ましくはVEGFレセプターキナーゼ阻害剤およびFGFレセプター阻害剤であり、最も好ましくはVEGFレセプターキナーゼ阻害剤であるが、これらに限定されない。
　本発明において使用される血管新生阻害剤が化合物の場合は、酸または塩基と薬理学的に許容される塩を形成する場合もある。本発明における血管新生阻害剤は、これらの薬理学的に許容される塩をも包含する。酸との塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩およびギ酸、酢酸、乳酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、トシル酸、ステアリン酸、安息香酸、メシル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸塩などを挙げることができるが、これらに限定されない。また、塩基との塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、N, N’-ジベンジルエチレンジアミン、アルギニン、リジンなどの有機塩基塩、アンモニウム塩などを挙げることができるが、これらに限定されない。
　また、本発明において使用される血管新生阻害剤が化合物の場合、これら化合物の溶媒和物および光学異性体が存在する場合には、それらの溶媒和物および光学異性体が含まれる。溶媒和物は、例えば、水和物、非水和物などを挙げることができ、好ましくは水和物を挙げることができるが、これらに限定されない。溶媒は、例えば、水、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、n-プロパノール）、ジメチルホルムアミドなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
　さらに、本発明において、血管新生阻害剤が化合物の場合は、結晶でも非結晶でもよく、また、結晶多形が存在する場合には、それらのいずれかの結晶形の単一物であっても混合物であってもよい。
　また、本発明において、血管新生阻害剤は、生体内で酸化、還元、加水分解、抱合などの代謝を受ける血管新生阻害剤をも包含する。また、本発明において、血管新生阻害剤は、生体内で酸化、還元、加水分解などの代謝を受けて血管新生阻害剤を生成する化合物をも包含する。
　本発明において使用される血管新生阻害剤が抗体の場合、当該抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（Kohler et al., Nature, 1975, 256, p.495-497.）、キメラ抗体（Morrison et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1984, 81, p.6851-6855.）、一本鎖抗体(scFV)(Huston et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 1988, 85, p.5879-5883.; Rosenburg et al. (Ed.), "The Pharmacology of Monoclonal Antibody, vol.113", Springer Verlag, 1994, p.269-315.)、ヒト化抗体（Jones et al., Nature, 1986, 321, p.522-525.）、多特異性抗体（Millstein et al., Nature, 1983, 305, p.537-539; Paulus, Behring Institute Mitteilungen, 1985, 78, p.118-132; van Dijk et al., International Journal of Cancer 1989, 43, p.344-349.）、完全ヒト抗体（McCafferty et al., Nature, 1990, 348, p.552-554.; Lonberg et al., Nature, 1994, 368, p.856-859.; Green et al., Nature Genetics, 1994, 7, p.13-21.）および、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fvなどの抗体断片などが挙げられ、好ましくはモノクローナル抗体が挙げられる。さらに、本発明における抗体は、必要に応じ、ポリエチレングリコール(PEG)等により修飾されていてもよい。その他、本発明における抗体は、β-ガラクトシダーゼ、MBP、GST、GFP等との融合タンパク質として製造されることができ、ELISA法などにおいて二次抗体を用いずに検出できるようにしてもよい。また、本発明における抗体は、ビオチン等により抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の回収を行い得るように改変されていてもよい。
　本発明における抗体は、標的タンパク質もしくはその部分断片、またはそれらを発現する細胞を感作抗原として常法に従い製造することができる（"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, 2010, Chapter 11.）。この場合、標的タンパク質またはその部分断片は、Fc領域、GST、MBP、GFP、APなどとの融合タンパク質であってもよい。
　本発明における抗体の標的タンパク質は、血管新生に関与する生体内分子であっても、その受容体であってもよい。例えば、VEGFレセプター阻害剤においては、抗VEGF抗体であっても、抗VEGFレセプター抗体であっても良い。
　ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は、当業者に周知の方法で作製することができる（E. Harlow et al. (Ed.), "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring HarborLaboratory, 1988.）。
　ポリクローナル抗体は、例えば、抗原をマウス、ウサギ、ラットなどの哺乳動物に投与し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離、精製することにより得ることができる。免疫感作の方法は当業者に公知であり、例えば抗原を１回以上投与することにより行うことができる。また、抗原（またはその部分断片）は、適当な緩衝液、例えば、完全フロイントアジュバントまたは水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができるが、投与経路や条件等に応じてアジュバントを使用しない場合もある。
　最後の免疫感作から１～２か月後に当該哺乳動物から血液を採取して、該血液を、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いた沈澱、各種クロマトグラフィー等の常法によって分離、精製することにより、ポリクローナル抗血清として、ポリクローナル抗体を得ることができる。
　モノクローナル抗体を産生する方法としては、ハイブリドーマ法を挙げることができる。ハイブリドーマ法は、まず、ポリクローナル抗体の産生と同様に哺乳動物を免疫感作する。免疫後、適当な日数を経過した後に部分採血を行い、ELISA法などの公知方法で抗体価を測定することが好ましい。
　次いで、感作の終了した免疫動物から脾臓を摘出し、B細胞を得る。次いで、B細胞を常法に従いミエローマ細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを作製することができる。用いられるミエローマ細胞は特に限定されず、公知のものを使用できる。細胞の融合方法は、センダイウイルス法、ポリエチレングリコール法、プロトプラスト法等、当該分野で公知の方法を任意に選択して用いることができる。得られたハイブリドーマは、常法に従い、HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン含有培地）中で適当な期間培養し、ハイブリドーマの選択を行うことができる。次いで、目的とする抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った後、当該ハイブリドーマのクローニングを行うことができる。
　スクリーニング法としては、ELISA法やラジオイムノアッセイ法などの公知の抗体検出方法を用いることができ、また、クローニング法としては、当該分野で公知の方法を用いることができ、例えば、限界希釈法およびFACS法等を用いることができる。得られたハイブリドーマは、適当な培養液中で培養するか、あるいはハイブリドーマと適合性のある、例えばマウス腹腔内に投与することができる。こうして得られる培養液中または腹水中から、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等により、所望のモノクローナル抗体を単離精製することができる。
　また、本発明における抗体のアイソタイプは特に限定されない。
　本発明における抗体は、標的タンパク質またはその部分断片を認識し結合することで、標的タンパク質の血管内皮細胞増殖活性を阻害する中和抗体であることが好ましい。
　本発明に好適な血管新生阻害剤の具体例は以下の通りであり、それぞれに記載の文献の方法にしたがって製造または入手できる。
　４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミド（式(IV)）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
  
 
　この化合物は、国際公開第02/032872号に記載の方法で製造することができる。この化合物の取り得る形態としては、メタンスルホン酸塩が好ましいが、これに限定されない。この化合物は、メシル酸塩の形態をとった場合、「E7080」とも称される。この化合物は、VEGFレセプター、FGFレセプター、RETキナーゼ、KITキナーゼなどの受容体型チロシンキナーゼに対して阻害活性を有することが知られている（国際公開第2007/136103号、Matsui et al., Clinical Cancer Research, 2008, 14(17), p.5459-5465.）。
　Ｎ－（４－ブロモ－２－フルオロフェニル）－６－メトキシ－７－［２－（１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－１－イル）エトキシ］キナゾリン－４－アミン
　この化合物は、「ZD4190」とも称され、Hennequin et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1999, 42, p.5369-5389.に記載の方法で製造できる。この化合物は、VEGFレセプター阻害活性を有することが知られている（Wedge et al., Cancer Research, 2000, 60,p.970-975）。
　Ｎ－（４－ブロモ－２－フルオロフェニル）－６－メトキシ－７－［（１－メチルピペリジン－４－イル）メトキシ］キナゾリン－４－アミン（式(3))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  
 
　この化合物は、「ZD6474」または「vandetanib」とも称され、Hennequin et al, Journal of Medicinal Chemistry, 2002, 45, p.1300-1312.に記載の方法で製造できる。また、この化合物は、VEGFレセプター阻害活性を有することが知られている。
　３－［（２，４－ジメチルピロール－５－イル）メチレン］－２－インドリノン（式(4))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
  
 
　この化合物は、「SU5416」または「semaxanib」とも称され、Sun et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1998, 41, p.2588-2603.、米国特許第5792783号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター阻害活性を有することが知られている（Fong et al., Cancer Research, 1999, 59, p.99-106.）。
　（Z）－３－［（２，４－ジメチル－５－（２－オキソ－１，２－ジヒドロインドール－３－イリデンメチル）－１Ｈ－ピロール－３－イル）－プロピオン酸（式(5))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  
 
　この化合物は、「SU6668」とも称され、Sun et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1999, 42, p.5120-5130.に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター、FGFレセプターおよびPDGFレセプターへの阻害活性を有することが知られている（Laird et al., Cancer Research, 2000, 60, p.4152-4160.）。
　５－（５－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロインドール－３－イリデンメチル）－２，４－ジメチル－１Ｈ－ピロール－３－カルボン酸（２－ジエチルアミノエチル）アミド（式(6))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
  
 
　この化合物は、「SU11248」、または「sunitinib」とも称され、Sun et al., Journal of Medicinal Chemistry, 2003, 46, p.1116-1119.に記載の方法で製造することができる。この化合物の取り得る形態としては、リンゴ酸塩が好ましいが、これに限定されない。この化合物は、VEGFレセプター、PDGFレセプター、KITキナーゼおよびFLT3キナーゼへの阻害活性を有することが知られている（Mendel et al., Clinical Cancer Research, 2003, 9, p.327-337.）。また、この化合物は、Sutent（登録商標）の名で、消化管間質腫瘍（GIST）およびの腎細胞癌の治療薬として承認されており、市販のものから入手できる。
　Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン ３－｛５，６，７，１３－テトラヒドロ－９－［（１－メチルエトキシ）メチル］－５－オキソ－１２Ｈ－インデノ（２，１－a）ピロロ（３，４－ｃ）カルバゾール－１２－イル｝プロピルエステル（式(7))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
  
 
　この化合物は、「CEP-7055」とも称され、Gingrich et al., Journal of Medicinal Chemistry, 2003, 46, p.5375-5388.に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター阻害活性を有することが知られている。
　３－（４－ブロモ－２，６－ジフルオロ－ベンジルオキシ）－５－［３－（４－ピロリジン－１－イル－ブチル）－ウレイド］－イソチアゾール－４－カルボアミド（式(8))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
  
 
　この化合物は、「CP-547,632」とも称され、国際公開第99/62890号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター阻害活性を有することが知られている（Beebe et al., Cancer Research, 2003, 63, p.7301-7309.）。
　Ｎ－｛２－クロロ－４－［（６，７－ジメトキシ－４－キナゾリニル）オキシ］フェニル｝－Ｎ’－プロピルウレア（式(9))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
  
 
　この化合物は、「KRN633」とも称され、国際公開第00/43366号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター阻害活性を有することが知られている（Nakamura et al., Molecular Cancer Therapeutics, 2004, 3, p.1639-1649.）。
　１－（４－クロロアニリノ）－４－（４－ピリジルメチル）フタラジン（式(10))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
  
 
　この化合物は、「PTK787/ZK 222584」または「vatalanib」とも称され、国際公開第98/35958号に記載の方法により製造できる。この化合物は、VEGFレセプター阻害活性を有することが知られている（Wood et al., Cancer Research, 2000, 60, p.2178-2189.）。
　Ｎ－｛２－クロロ－４－［（６，７－ジメトキシ－４－キノリル）オキシ］フェニル｝－Ｎ’－（５－メチル－３－イソキサゾリル）ウレア（式(11))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
  
 
　この化合物は、「KRN951」とも称され、国際公開第02/088110号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター、PDGFレセプター、およびKITキナーゼに対して阻害活性を有することが知られている（Nakamura et al., Cancer Research, 2006, 66, p.9134-9142.）。
　４－［（４－フルオロ－２－メチルインドール－５－イル）オキシ］－６－メトキシ－７－［３－（ピロリジン－１－イル）プロポキシ］キナゾリン（式(12))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
  
 

　この化合物は、「AZD2171」または「cediranib」とも称され、国際公開第00/47212号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター阻害活性を有することが知られている（Cancer Research, 2005, 65, p.4389-4400.）。
　Ｎ‐メチル‐２‐［［３‐［（Ｅ）‐２‐（２‐ピリジル）エテニル］‐１Ｈ‐インダゾール‐６‐イル］チオ］ベンズアミド（式(13))

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
  
 
　この化合物は、「AG-013736」、または「axitinib」とも称され、国際公開第01/02369号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター阻害活性を有することが知られている（Kelly et al., Targeted Oncology, 2009, 4, p.297-305.）。
　５－（（Z）－（５－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロ－３H－インドール－３－イリデン）メチル）－N－（（２S）－２－ヒドロキシ－３－モルホリン－４－イルプロピル）－２，４－ジメチル－１H－ピロール－３－カルボキサミド（式(14))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
  
 
　この化合物は、「SU14813」とも称され、米国特許第6653308号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター、PDGFレセプター、KITキナーゼおよびFLT3キナーゼに対して阻害活性を有することが知られている（Patyna et al., Molecular Cancer Therapy 2006, 5, p.1774-1782.）。
　３－（（キノリン－４－イルメチル）アミノ）－N－（４－（トリフルオロメトキシ）フェニル）チオフェン－２－カルボキサミド（式(15))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
  
 
　この化合物は、「OSI-930」とも称され、国際公開第2004/063330号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター、PDGFレセプターおよびKITキナーゼに対して阻害活性を有することが知られている（Petti et al., Molecular Cancer Therapeutics, 2005, 4, p.1186-1197.）。
　６－（２，６－ジクロロフェニル）－８－メチル－２－フェニルアミノ－８H－ピリド[２，３－ｄ]ピリミジン－７－オン（式(16))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
  
 
　この化合物は、「TKI-28」とも称され、VEGFレセプター、EGFレセプター、PDGFレセプター、KITキナーゼ、ErbB-2およびSrcキナーゼに対して阻害活性を有することが知られている（Guo et al., Cancer Biology & Therapy., 2005, 4, p. 1119-1126.）。
　２－（（１，６－ジヒドロ－６－オキソ－ピリジン－３－イルメチル）アミノ）－N－（３－（トリフルオロメチル）フェニル）－３－ピリジン－カルボキサミド（式(17))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
  
 
　この化合物は、「ABP309」とも称され、国際公開第01/55114号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター、PDGFレセプター、KITキナーゼ等に阻害活性を有することが知られている（Brueggen et al., EJC Supplements, 2004, 2, p.8 (Abs 172).）。
　４－（４－（４－クロロ－フェニルアミノ）－フロ[２，３－ｄ]ピリダジン－７－イルオキシメチル）－ピリジン－２－カルボアミド（式(18))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
  
 
　この化合物は、「BAY 57-9352」または「telatinib」とも称され、国際公開第01/23375号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター、PDGFレセプターおよびKITキナーゼに対して阻害活性を有することが知られている（Eskens et al., Journal of Clinical Oncology, 2009, 27, p.4169-4176.）。
　Ｎ－（４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル）－Ｎ’－（４－（２－（Ｎ－メチルカルバモイル）－４－ピリジルオキシ）フェニル尿素（式(19))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
  
 
　この化合物は、「BAY 43-9006」または「sorafenib」とも称され、米国特許第7235576号に記載の方法で製造することができる。この化合物の取り得る形態としては、トシル酸塩が好ましいが、これに限定されない。この化合物は、VEGFレセプター、PDGFレセプター、KITキナーゼおよびFLT3キナーゼに対して阻害活性を有することが知られている（Wilhelm et al., Cancer Research, 2004, 64, p.7099-7109.）。また、この化合物は、Nexavar（登録商標）の名で、肝細胞癌およびの腎細胞癌の治療薬として承認されており、市販のものから入手できる。
　４－アミノ－５－フルオロ－３－（６－（４－メチル－ピペラジン－１－イル）－１H－ベンズイミダゾール－２－イル）－１H－キノリン－２－オン（式(20))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
  
 
　この化合物は、「CHIR-258」または「dovitinib」とも称され、国際公開第02/22598号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター、FGFレセプター、PDGFレセプター、CSF-1レセプター、KITキナーゼおよびFLT3キナーゼに対して阻害活性を有することが知られている（Trudel et al., Blood, 2005, 105, p.2941-2948.）。
　４－（４－（１－アミノ－１－メチル－エチル）－フェニル）－２－（４－（２－モルホリン－４－イル－エチル）－フェニルアミノ）－ピリミジン－５－カルボニトリル（式(21))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
  
 
　この化合物は、「JNJ17029259」とも称され、Reuman et al., Journal of Organic Chemistry, 2008, 73, p.1121-1123.に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター、FGFレセプター、PDGFレセプターおよびFLT3キナーゼに対して阻害活性を有することが知られている（Emanuel et al., Molecular Pharmacology, 2004, 66, P.635-647.）。
　［６－［４－［（４－エチルピペラジン－１－イル）メチル］フェニル］－７H－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－４－イル］－（（R）－１－フェニルエチル）アミン（式(22))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
  
 
　この化合物は、「AEE-788」とも称され、国際公開第03/013541号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター、FGFレセプターおよびEGFレセプターに対して阻害活性を有することが知られている（Traxler et al., Cancer Research, 2004,64, p.4931-4941.）。
　９－（１－メチルエトキシ）メチル－１２－（３－ヒドロキシプロピル）－６H,７H,１３H－インデノ［２，１－a］ピロロ［３，４－ｃ］カルバゾール－５－オン（式(23))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
  
 
　この化合物は、「CEP-5214」とも称され、国際公開第02/17914号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター阻害活性を有することが知られている（Ruggeri et al., Cancer Research, 2003, 63, p.5978-5991.）。
　N－（２，４－ジフルオロフェニル）－N’－｛４－[（６，７－ジメトキシ－４－キノリル）－オキシ]－２－フルオロフェニル｝尿素（式(24))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
  
 
　この化合物は、「Ki8751」とも称され、国際公開第00/43366号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター、PDGFレセプターおよびKITキナーゼに対して阻害活性を有することが知られている（Kubo et al., Journal of Medicinal Chemistry, 2005, 48, p.1359-1366.）。
　N－［４－（３－アミノ－１Ｈ－インダゾール－４－イル）フェニル］－N’－（２－フルオロ－５－メチルフェニル）尿素（式(25))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
  
 
　この化合物は、「ABT-869」または「linifanib」とも称され、国際公開第2004/113304号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター、PDGFレセプター、CSF-1レセプター、KITキナーゼおよびFLT3キナーゼに対して阻害活性を有することが知られている（Guo et al., Molecular Cancer Therapy, 2006, 5, p.1007-1013.）。
　２－メチル－６－［２－（１－メチル－１H－イミダゾール－２－イル）－チエノ［３，２－ｂ］ピリジン－７－イルオキシ］－ベンゾ［ｂ］チオフェン－３－カルボン酸メチルアミド（式(26))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
  
 
　この化合物は、「AG-028262」とも称され、国際公開第03/106462号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター阻害活性を有することが知られている（Mancuso et al., Journal of Clinical Investigation, 2006, 116, p.2610-2621.）。
　（R）－１－（４－（４－フルオロ－２－メチル－１H－インドール－５－イルオキシ）－５－メチルピロロ［１，２－ｆ］［１，２，４］トリアジン－６－イルオキシ）プロパン－２－オール（式(27))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
  
 
　この化合物は、「BMS-540215」または「brivanib」とも称され、国際公開第2004/009601号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター阻害活性を有することが知られている（Bhide et al., Journal of Medicinal Chemistry, 2006, 49, p.2143-2146.）。
　（S）－（（R）－１－（４－（４－フルオロ－２－メチル－１H－インドール－５－イルオキシ）－５－メチルピロロ［１，２－ｆ］［１，２，４］トリアジン－６－イルオキシ）プロパン－２－オール）２－アミノプロパノエート（式(28))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
  
 
　この化合物は、「BMS-582664」または「brivanib alaninate」とも称され、国際公開第2004/009601号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター阻害活性を有することが知られている（Bhide et al., Journal of Medicinal Chemistry, 2006, 49, p.2143-2146.）。
　３－［（４－モルホリン－４－イル－フェニルアミノ）－メチレン］－１，３－ジヒドロインドール－２－オン（式(29))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
  
 
　この化合物は、「AGN-199659」とも称され、国際公開第03/027102号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター阻害活性を有することが知られている。
　５－［［４－［（２，３－ジメチル－２H－インダゾール－６－イル）メチルアミノ］ピリミジン－２－イル］アミノ］－２－メチルベンゼンスルホンアミド（式(30))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
  
 
　この化合物は、「GW-786034」または「pazopanib」とも称され、国際公開第02/059110号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター、PDGFレセプターおよびKITキナーゼに対して阻害活性を有することが知られている（Bukowski et al., Nature Reviews Drug Discovery, 2010, 9, p.17-18.）。
　（３Z）－３－［６－（２－モルホリン－4－イルエトキシ）キノリン－２（１H）－イリデン］－１，３－ジヒドロ－２H－インドール－２－オン（式(31))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
  
 
　この化合物は、「YM-231146」とも称され、VEGFレセプター阻害活性を有することが知られている（Amino et al., Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2005, 28, p.2096-2101.）。
　２－（（２－（（４－（４－（４－（ｔｅｒｔ－ブチル）アニリノ）フェノキシ）－６－メトキシ－７－キノリル）オキシ）エチル）アミノ）－１－エタノール（式(32))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
  
 
　この化合物は、「Ki23057」とも称され、国際公開第03/033472号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター、FGFレセプター、PDGFレセプターおよびKITキナーゼに対して阻害活性を有することが知られている（Shimizu et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2004, 14, p.875-879.）。
　「ベバシズマブ」
　ベバシズマブは、抗VEGFヒト化モノクローナル抗体であり、VEGFに結合することにより、VEGFとVEGFレセプターの結合を阻害する。この抗体は、国際公開第94/10202号に記載の方法により、製造することができる。この抗体は、Avastin（登録商標）の名で、結腸・直腸癌、非小細胞肺癌、乳癌、膠芽腫および腎細胞癌の治療薬として承認されており、市販のものから入手することができる。
　１－［２－アミノ－６－（３，５－ジメトキシフェニル）－ピリド（２，３－ｄ）ピリミジン－７－イル］－３－tert－ブチルウレア（式(33))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
  
 
　この化合物は、「PD166866」とも称され、Hamby et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1997, 40, p.2296-2303.に記載の方法で製造することができる。この化合物は、FGFレセプター阻害活性を有することが知られている。
　１－tert－ブチル－３－［２－（４－ジエチルアミノ）ブチルアミノ－６－（３，５－ジメトキシフェニル）－ピリド（２，３－ｄ）ピリミジン－７－イル］ウレア（式(34))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
  
 
　この化合物は、「PD173074」とも称され、米国特許第5733913号に記載の方法によって製造することができる。この化合物は、FGFレセプター阻害活性を有することが知られている（Mohammadi et al., EMBO J., 1998, 17, p.5896-5904.）。
　４－［４－［N－（４－ニトロフェニル）カルバモイル］－１－ピペラジニル］－６，７－ジメトキシキナゾリン（式(35))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
  
 
　この化合物は、「CT52923」とも称され、国際公開第98/14437号に記載の方法で製造することができる。この化合物は、PDGFレセプターおよびKITキナーゼに対して阻害活性を有することが知られている（Yu et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2001, 298, p.1172-1178.）。
　３－Z－[１－(４－(N－((４－メチルピペラジン－１－イル)メチルカルボニル)－N－メチルアミノ)アニリノ)－１－フェニルメチレン]－６－メトキシカルボニル－２－インドリノン（式(36))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
  
 
　この化合物は、「BIBF 1120」または「intedanib」とも称され、国際公開第01/27081号に記載の方法によって、製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター、FGFレセプター、PDGFレセプター、KITキナーゼ、FLT3キナーゼ、Lck等に対して阻害活性を有することが知られている（Hilberg et al., Cancer Research, 2008, 68, p.4774-4782.）。
　Ｎ－（３，３－ジメチルインドリン－６－イル）｛２－［（４－ピリジルメチル）アミノ］（３－ピリジル）｝カルボキサミド（式(37))
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
  
 
　この化合物は、「AMG706」または「motesanib」とも称され、米国特許第6878714号に記載の方法により、製造することができる。この化合物は、VEGFレセプター、PDGFレセプター、RETキナーゼおよびKITキナーゼに対して阻害活性を有することが知られている（Polverino et al., Cancer Research, 2006, 66, p.8715-8721.）。
　本発明における血管新生阻害剤としては、他にも、「PI-88」（「muparfostat」とも称される。国際公開第96/33726号; McKenzie et al., British Journal of Pharmacology, 2007, 151, p.1-14.）、VEGF trap(「AVE-0005」または「aflibercept」とも称される。国際公開第00/75319号; Tew et al., Clinical Cancer Research, 2010, 16, p.358-366.）、「RPI-4610」（「Angiozyme（登録商標）」とも称される。米国特許第5180818号; 米国特許第6346398号）、２－（８－ハイドロキシ－６－メトキシ－１－オキソ－１H－２－ベンゾピラン－３－イル）プロピオン酸（「NM-3」とも称される。国際公開第97/48693号; Agata et al., Cancer Chemotherapy & Pharmacology, 2005, 56, p.610-614.）、「IMC-1121b」（「ramucirumab」とも称される。米国特許第6811779号; Journal of ClinicalOncology, 2010, 28, p.780-787.）、「IMC-18F1」（国際公開第95/21868号; Wu et al., Clinical Cancer Research, 2006, 12, p.6573-6584.）等が挙げられる。
　本発明における血管新生阻害剤として好ましいものとしては、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミド、５－（５－フルオロ－２－オキソ－１，２－ジヒドロインドール－３－イリデンメチル）－２，４－ジメチル－１Ｈ－ピロール－３－カルボン酸（２－ジエチルアミノエチル）アミド、４－［（４－フルオロ－２－メチルインドール－５－イル）オキシ］－６－メトキシ－７－［３－（ピロリジン－１－イル）プロポキシ］キナゾリン、Ｎ‐メチル‐２‐［［３‐［（Ｅ）‐２‐（２‐ピリジル）エテニル］‐１Ｈ‐インダゾール‐６‐イル］チオ］ベンズアミド、Ｎ－（４－クロロ－３－（トリフルオロメチル）フェニル）－Ｎ’－（４－（２－（Ｎ－メチルカルバモイル）－４－ピリジルオキシ）フェニル尿素、５－［［４－［（２，３－ジメチル－２H－インダゾール－６－イル）メチルアミノ］ピリミジン－２－イル］アミノ］－２－メチルベンゼンスルホンアミドおよびベバシズマブまたはその薬理学的に許容される塩であり、特に好ましくは、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドまたはその薬理学的に許容される塩である。４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドの薬理学的に許容される塩として好ましくは４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドのメシル酸塩である。
　被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中のB-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無を測定する方法を、以下に説明する。
　腫瘍組織は、例えば、被験者より外科的処置（例えば、バイオプシーなど）にて摘出することにより得ることができる。被験者から採取される腫瘍組織の大きさは、腫瘍組織におけるB-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損を測定できる大きさであればよい。例えば、固形癌の場合は、バイオプシーにより採取したときの大きさ（例えば、2～3 mm）でよく、メスにより組織片を切除したときの大きさでもよく、限定されるものではない。
　また、腫瘍組織は、摘出した組織片からさらに、laser capture micro-dissection法（Murray et al. (Ed.), "Laser Capture Microdissection: Methods and Protocols", Humana Press, 2004.）等の手法により、特定の細胞群を切り出したものであってもよい。
　さらに、被験者より血液を採取し、例えば、Kitagoらの方法により、末梢血中に循環する癌細胞を単離し、そこからB-RafおよびPTENの突然変異あるいは発現欠損を検出することもできる（Kitago et al., Clinical Chemistry, 2009, 55(4), p.757-764.）。
　また、gap-ligase chain reaction (GLCR)法などの高感度の核酸検出法を用いることにより、血液中を循環するDNAから、直接に、B-RafおよびPTENの突然変異あるいは発現欠損を検出してもよい（Chuang et al., Head and Neck, 2010, 32, p.229-234.）。
　B-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損は、核酸配列の決定による方法、核酸または特異的抗体をプローブとして用いる方法、マス・スペクトロメトリーによる方法等の公知の方法により検出できるが、被験者の腫瘍組織由来のサンプルとプローブとを接触させる方法が好ましい。B-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損を検出するためのプローブとしては、B-RafまたはPTENに対する核酸プローブまたは特異的抗体が挙げられる。「接触させる」とは、被験者の腫瘍組織に由来するサンプルとプローブとが反応可能な条件下に両者を存在させることを意味し、例えば、限定されるものではないが、サンプルとプローブとを混合すること、サンプルにプローブをハイブリダイズさせることなどが挙げられる。
　核酸配列の決定により突然変異や発現欠損を検出する場合、サンプルから抽出された高分子DNA産物（抽出高分子DNAともいう）またはそれをpolymerase chain reaction（PCR）反応により増幅した産物について、直接塩基配列決定法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、PCR-strand conformation polymorphism (PCR-SSCP)法、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブ（ASO）法、ダイレクトゲルアッセイ法、Amplification Refractory Mutation System (ARMS)法、突然変異特異的オリゴマーによるdot blot解析法などの方法またはそれに類似した手法を用いることで、B-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損を検出できる。また、Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer（Applied Biosystems社）、Roche 454 Genome Sequencer FLX System（Roche社）、Genome AnalyzerII（illumina社）、Applied Biosystems SOLiD System（Applied Biosystems社）、HeliScope Single Molecule Sequencer（Helicos社）などの次世代シークエンサーによってもB-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損を検出することもできる（"Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, 2010, Chapter 7.）。B-Rafの突然変異または発現欠損を検出するために使用される核酸プローブは、例えば、実施例１で使用されるプライマー（配列番号３９～４４）が挙げられるがこれに限定されない。PTENの突然変異または発現欠損を検出するために使用される核酸プローブは、例えば、実施例１で使用されるプライマー（配列番号１９～３８）が挙げられるがこれに限定されない。
　突然変異や発現欠損の検出をサンガー法を利用して行う場合、被験者に由来するサンプルから公知の手法に従ってゲノムDNAを抽出し、得られたゲノムDNAに対しPCR反応を行うことで、B-RafおよびPTENのエクソン領域の増幅を行う。増幅されたDNAを１％アガロースゲル電気泳動法により、目的の長さであることを確認した上で、PCR産物をゲルから回収して、精製を行う。精製した産物をシークエンサーにて配列決定を行うことで遺伝子変異等の情報を得ることが可能である。
　突然変異や発現欠損の検出を次世代シーケンサーで行う場合を以下に説明する。
　たとえば次世代シーケンサーとしてIllumina社製のGenome AnalyzerIIを用いる場合、被験者に由来するサンプルから公知の手法に従ってRNAを抽出し、抽出されたRNAをもとにcDNAを調製する。抽出されたRNAは、ノーザンブロット解析、DNAマイクロアレイ、RT-PCR、定量的PCR等の技術により定量できる。RNAの好ましい定量法としてはDNAマイクロアレイ、定量的PCRであるが、定量法は上記の方法に限定されるものではない。
　調製されたcDNAに対し、次世代シーケンサーによる解析用に200bp程度に断片化させてアダプター配列を付加させたcDNAライブラリーを作成する。作成したライブラリーをアダプター配列を介してフローセル上に結合させ、形成されたクラスターにシーケンスプライマーを添加し、１塩基の伸長について蛍光の読み取りステップを繰り返し行うことで、データ取得および解析を行い、遺伝子変異等の情報を得ることが可能である。
　特異的抗体をプローブとして用いることにより突然変異や発現欠損を検出する場合、B-RafおよびPTENの突然変異部位について、野生型のアミノ酸配列を有する部分ペプチドおよび変異型のアミノ酸配列を有する部分ペプチドをそれぞれ抗原とすることで、公知の手法により、突然変異部位に特異的な抗体を作製することができる。発現欠損を検出する場合、B-RafおよびPTENの発現欠損部位について、野生型のアミノ酸配列を有する部分ペプチドおよび発現欠損させたアミノ酸配列を有する部分ペプチドをそれぞれ抗原とすることで、公知の手法により、発現欠損部位に特異的な抗体を作製することができる。PTENの発現欠損部位に特異的な抗体の作製には、野生型を認識する抗体で検出されないことで発現欠損部位を検出することができる。突然変異または発現欠損を検出する場合、突然変異特異的抗体は１種を用いてもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
　マス・スペクトロメトリーを用いることにより突然変異や発現欠損を検出する場合、例えば、Sequenom社製のMassARRAYシステムを用い、Gabrielらの方法により、検出することができる（Gabriel et al., "Current Protocols in Human Genomics", John Wiley & Sons, 2009, Unit 2.12.）。
　B-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損は、上記方法のいずれかまたは組み合わせて検出することができる。
　上記の検出において、（a1）B-Rafが野生型であり、かつPTENが野生型であるか、または、（a2）B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異を有しているもしくは発現欠損しており、かつ、PTENが表２から選ばれる少なくとも１つの突然変異を有しているもしくは発現欠損しているとの結果が得られたときは、当該結果は、被験者において血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標になる。被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標となるB-RafおよびPTENの形態を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
  
 
　上記表２の（a2）において、特に被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標となるB-RafおよびPTENの形態は、B-RafがV600E突然変異を有しており、かつ、PTENがT167A、Y68HまたはL112Qに突然変異を有しているとの結果が得られたときである。
　被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中のANG1またはANG2の発現レベルを定量する方法を、以下に説明する。
　被験者の腫瘍組織に由来するサンプルは、上記の方法により採取される。
　サンプル中のANG1またはANG2の発現レベルは、mRNAまたはタンパク質の量を公知の方法で定量する。
　mRNAを定量する場合、ノーザンブロット解析、DNAマイクロアレイ、RT-PCR、定量的PCR等の公知の技術を用いることができるが、DNAマイクロアレイまたは定量的PCRであることが好ましい。
　ANG1またはANG2の発現レベルを定量するためのプローブとしては、ANG1またはANG2に対する核酸プローブまたは抗体が挙げられる。核酸プローブは、例えば、Applied Biosystems社のASSAYS-ON-DEMANDより購入でき（ANG1またはANG2のアッセイIDはそれぞれHs 00181613、Hs 00169867）、プローブに付属のマニュアルに従って発現レベルを定量すればよい。あるいは、ANG1またはANG2のヌクレオチド配列をベースにPerkin-Elmer Applied Biosystems社のPrimer Expressもしくはそれと同等のソフトウェアを使用することにより核酸プローブを適宜設定し作製することもできる。
　複数の被検物質の比較は、定量値を各検体の転写量に変動の少ないhouse keeping遺伝子、好ましくはβ-actinのmRNAレベルにより補正して行う。なお、mRNAをRT-PCRに用いる場合、蛍光色素サイバーグリーン（インターカレーター）での検出にはプライマーを用いる。一方で、マスターミックスを用いた検出方法ではプライマーの他にプローブが必要となる。いずれもソフトウェアで設計可能であるが、プローブを用いる場合はApplied Biosystems社が設計したものが販売されているので、それを用いてもよい。
　また、タンパク質の発現レベルについては市販のELISAキットを用いて測定することができる。あるいは、ウェスタンブロッティング、抗体アレイ、マススペクトロメトリー、免疫組織染色によってもタンパク質の発現を定量可能である。ANG1またはANG2に対して特異的な抗体は、前記血管新生阻害剤の項で説明した方法により作製することもできる。サンプルに血清あるいは血漿を用いた場合には、ELISAやマルチプレックビーズ技術を用いた定量が利用可能である。
　ANG1またはANG2の発現レベルは、上記方法のいずれかまたは組み合わせて定量することができる。
本発明において、ANG1またはANG2の発現レベルを定量するには、被験者の腫瘍組織由来のサンプルとプローブとを接触させることが好ましい。「接触させる」ことの意味は、前記と同様である。
　上記の検出において、（b1）ANG1の発現レベルが対照の値と比較して低いか、（b2）ANG2の発現レベルが対照の値と比較して高いか、または、（b3）ANG1およびANG2の発現レベルの比が、対照の値と比較して低いとの結果が得られたときは、当該結果は、被験者において血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標になる。被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標となるANG1およびANG2の発現レベルの形態を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
  
 
　ここで、上記b1において、「対照」には、過去に得られたサンプルを含み、当該サンプルは治療上の反応性が予測された者に由来するテストサンプルとの将来の比較のためのレファレンスとして使用される。すなわち、対照の値は、同じ種類の腫瘍に罹患し、特定の血管新生阻害剤が投与された患者集団において非感受性とされた患者群と感受性とされた患者群におけるANG1の発現レベルを分析することにより得られるカットオフ値を意味し、当該カットオフ値は容易に設定可能である。例えば、対照の値は、血管新生阻害剤の投与により治療上反応性があると予測されたものとして得られた患者群の腫瘍組織に由来するサンプルにおけるANG1の発現レベルをカットオフ値として設定してもよい。
　あるいは、対照の値は、B-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無に基づいて設定したカットオフ値を意味してもよい。この場合、対照の値は、B-Rafが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるANG1の発現レベルを意味する。この場合において、好ましい対照の値として、B-RafおよびPTENが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるANG1の発現レベルが挙げられる。
　この場合において、被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標となるANG1の発現レベルの形態は、B-Rafが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるANG1の発現レベルと同等以下であるとの結果が得られたときであり、特に好ましくはB-Rafが野生型であり、PTENが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるANG1の発現レベルと同等以下であるとの結果が得られたときである。
　上記b2において、「対照」には、過去に得られたサンプルを含み、当該サンプルは治療上の反応性が予測された者に由来するテストサンプルとの将来の比較のためのレファレンスとして使用される。すなわち、対照の値は、同じ種類の腫瘍に罹患し、特定の血管新生阻害剤が投与された患者集団において非感受性とされた患者群と感受性とされた患者群におけるANG2の発現レベルを分析することにより得られるカットオフ値を意味し、当該カットオフ値は容易に設定可能である。例えば、対照の値は、血管新生阻害剤の投与により治療上反応性があると予測されたものとして得られた患者群の腫瘍組織に由来するサンプルにおけるANG2の発現レベルをカットオフ値として設定してもよい。
　あるいは、対照の値は、ANG1およびANG2の発現レベルに基づいて設定したカットオフ値を意味してもよい。この場合、ANG2の発現レベルが対照の値より高いとは、ANG2の発現レベルがその絶対値においてANG1の発現レベルより高いことを意味する。この場合において、好ましい対照の値とは、B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異もしくは発現欠損を有しており、PTENが表２から選ばれる少なくとも１つの突然変異もしくは発現欠損を有している腫瘍に罹患している患者におけるANG1およびANG2の発現レベルを意味する。
　この場合において、特に、被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標となるANG2の発現レベルの形態は、B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異を有しているまたは発現欠損しており、かつPTENが表２から選ばれる少なくとも１つの突然変異を有しているまたは発現欠損している腫瘍に罹患している患者におけるANG1の発現レベルより高いとの結果が得られたときである。
　B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異を有しているまたは発現欠損しており、かつ、PTENが表２から選ばれる少なくとも１つの突然変異を有しているまたは発現欠損している腫瘍に罹患している患者におけるANG1およびANG2の発現レベルの好ましい態様としては、B-RafがV600E突然変異を有しており、かつ、PTENがT167A、Y68HまたはL112Qに突然変異を有している腫瘍に罹患している患者におけるANG1およびANG2の発現レベルが挙げられる。
　上記b3において、「対照」には、過去に得られたサンプルを含み、当該サンプルは治療上の反応性が予測された者に由来するテストサンプルとの将来の比較のためのレファレンスとして使用される。すなわち、対照の値は、同じ種類の腫瘍に罹患し、特定の血管新生阻害剤が投与された患者集団において非感受性とされた患者群と感受性とされた患者群におけるANG1およびANG2の発現レベルの比を分析することにより得られるカットオフ値を意味し、当該カットオフ値は容易に設定可能である。例えば、対照の値は、血管新生阻害剤の投与により治療上反応性があると予測されたものとして得られた患者群の腫瘍組織に由来するサンプルにおけるANG1およびANG2の発現レベルの比（ANG1発現レベル/ANG2発現レベル）をカットオフ値として設定してもよい。
　あるいは、対照の値は、上記のANG1およびANG2の発現レベルの比の分析に代えて、B-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無に基づいて設定したカットオフ値であってもよい。
　この場合、好ましい対照の値としては、B-Rafが突然変異または発現欠損を有し、PTENが野生型である患者群におけるANG１およびANG2の発現レベルの比をカットオフ値とすることが可能であり、好ましくは、B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異もしくは発現欠損を有しており、かつ、PTENが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるANG1およびANG2の発現レベルの比であり、より好ましくは、例えばB-RafがV600E変異またはA145V変異を有し、PTENが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるANG1およびANG2の発現レベルの比である。
　この場合において、特に、被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標となるANG1およびANG2の発現レベルの比の形態は、1) B-Rafが野生型であり、かつPTENが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるANG1およびANG2の発現レベルの比と同等以下である、2）B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異を有しているもしくは発現欠損しており、かつPTENが表２から選ばれる少なくとも１つの突然変異を有しているもしくは発現欠損している腫瘍に罹患している患者におけるANG1およびANG2の発現レベルの比と同等以下である、または3）B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異を有しているもしくは発現欠損しており、かつPTENが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるANG1およびANG2の発現レベルの比より低いとの結果が得られたときである。
　B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異を有しているもしくは発現欠損しており、かつ、PTENが表２から選ばれる少なくとも１つの突然変異を有しているもしくは発現欠損している腫瘍に罹患している患者におけるANG1およびANG2の発現レベルの比の好ましい態様としては、B-RafがV600E突然変異を有しており、PTENがT167A、Y68HまたはL112Qに突然変異を有している腫瘍に罹患している患者におけるANG1およびANG2の発現レベルの比が挙げられる。B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異を有しているまたは発現欠損しており、PTENが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるANG1およびANG2の発現レベルの比の好ましい態様としては、B-RafがV600EまたはA145V突然変異を有しており、PTENが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるANG1およびANG2の発現レベルの比が挙げられる。
　被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中のSHC1、IL6、CXCR4、COL4A3、NRP2、MEIS1、ARHGAP22、SCG2、FGF9、PML、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1の発現レベルを定量する方法を、以下に説明する。
　被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中のSHC1、IL6、CXCR4、COL4A3、NRP2、MEIS1、ARHGAP22、SCG2、FGF9、PML、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1の発現レベルを定量する方法は、上記の被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中のANG1およびANG2の発現レベルを定量する方法において、定量対象をSHC1、IL6、CXCR4、COL4A3、NRP2、MEIS1、ARHGAP22、SCG2、FGF9、PML、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4またはVEGFR1のmRNAまたはタンパク質に変更する以外は同様である。
　あるいは、DNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析を行って、被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中のSHC1、IL6、CXCR4、COL4A3、NRP2、MEIS1、ARHGAP22、SCG2、FGF9、PML、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4またはVEGFR1の発現レベルを定量することも可能である。
　上記の検出において、SHC1、NRP2、ARHGAP22、SCG2、PML、IL6、CXCR4、COL4A3、MEIS1、FGF9、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4またはVEGFR1の発現レベルを定量するためのプローブは市販品（例えば、核酸プローブを使用する場合、Applied Biosystems社のASSAYS-ON-DEMANDより購入可）を適宜利用することが可能である。
　上記の検出において、SHC1、NRP2、ARHGAP22、SCG2、PML、IL6、CXCR4、COL4A3、MEIS1、FGF9、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4またはVEGFR1の発現レベルはB-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無と相関することから、これら遺伝子の発現レベルはB-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無で区分される抗腫瘍効果と相関する。SHC1、NRP2、ARHGAP22、SCG2およびPMLの発現レベルはB-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無で区分される抗腫瘍効果の変動パターンと同様の挙動を示し、IL6、CXCR4、COL4A3、MEIS1、FGF9、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1の発現レベルはB-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無で区分される抗腫瘍効果の変動パターンと反対の挙動示す。
　したがって、（c1）SHC1の発現レベルが、対照の値と比較して低い、（c2）NRP2の発現レベルが、対照の値と比較して低い、（c3）ARHGAP22の発現レベルが、対照の値と比較して低い、（c4）SCG2の発現レベルが、対照の値と比較して低い、（c5）PMLの発現レベルが、対照の値と比較して低い、（c6）IL6の発現レベルが、対照の値と比較して高い、（c7）CXCR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い、(c8)COL4A3の発現レベルが、対照の値と比較して高い、(c9)MEIS1の発現レベルが、対照の値と比較して高い、(c10)FGF9の発現レベルが、対照の値と比較して高い、(c11)FGFR3の発現レベルが、対照の値と比較して高い、(c12)FGFR2の発現レベルが、対照の値と比較して高い、(c13)FGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い、(c14)FGFR4の発現レベルが、対照の値と比較して高いまたは(c15)VEGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、との結果が得られたときは、当該結果は、被験者における血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標になる。血管新生阻害剤に対する反応性は、(c1)から(c15)から選ばれる１つまたは複数を組み合わせて検討することにより予測することができる。
　上記（c1）～（c15）において、対照の値とは、B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異もしくは発現欠損を有しており、かつ、PTENが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるSHC1、NRP2、ARHGAP22、SCG2、PML、IL6、CXCR4、COL4A3、MEIS1、FGF9、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4またはVEGFR1の発現レベルを意味する。
　上記（c1）～（c5）において、特に、被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標となるSHC1、NRP2、ARHGAP22、SCG2およびPMLの発現レベルの形態は、B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異を有しているもしくは発現欠損しており、かつPTENが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるSHC1、NRP2、ARHGAP22、SCG2およびPMLの発現レベルと比較して低いとの結果が得られたときである。
　この場合において、B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異を有しているまたは発現欠損しており、かつPTENが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるSHC1、NRP2、ARHGAP22、SCG2およびPMLの発現レベルの好ましい態様としては、B-RafがV600EまたはA145V突然変異を有しており、PTENが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるSHC1、NRP2、ARHGAP22、SCG2およびPMLの発現レベルが挙げられる。
　上記（c6）～（c15）において、特に、被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標となるIL6、CXCR4、COL4A3、MEIS1、FGF9、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1の発現レベルの形態は、B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異を有しているまたは発現欠損しており、PTENが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるIL6、CXCR4、COL4A3、MEIS1、FGF9、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1の発現レベルと比較して高いとの結果が得られたときである。
　この場合において、B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異を有しているまたは発現欠損しており、PTENが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるIL6、CXCR4、COL4A3、MEIS1、FGF9、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1の発現レベルの好ましい態様としては、B-RafがV600EまたはA145V突然変異を有しており、PTENが野生型である腫瘍に罹患している患者におけるIL6、CXCR4、COL4A3、MEIS1、FGF9、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1の発現レベルが挙げられる。
　被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標となるSHC1、NRP2、ARHGAP22、SCG2、PML、IL6、CXCR4、COL4A3、MEIS1、FGF9、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1の発現の形態を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
  
 
　本発明の別の態様において、一人の患者のサンプルから測定された以下の測定対象：
(a)B-RafおよびPTEN、
(b)ANG1およびANG2、または
(c)SHC1、NRP2、ARHGAP22、SCG2、PML、IL6、CXCR4、COL4A3、MEIS1、FGF9、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1からなる群から選ばれる少なくとも１つの測定結果を、それぞれの対照の結果と比較することで、血管新生阻害剤に対する反応性を関連づけるほかに、複数の患者由来のサンプルを用いて上記測定対象を定量又は検出する場合がある。従って、予め規定された数の患者（１次母集団）において上記測定対象の変異の有無または発現量を検出または測定し、得られた検出値または測定値を基本データとして、この基本データと、１人の被験者由来のサンプルまたは複数の集団（２次母集団）由来のサンプルにおける測定データとを比較することができる。
　あるいは、測定により得られたそれぞれの患者のデータを前記１次母集団の値に組み込んで再度データ処理し、対象となる患者または２次母集団の例数を増やすこともできる。例数を増やすことにより、血管新生阻害剤に対する反応可能性の予測精度を高めることができる。
　本発明に係る方法は、血管新生阻害剤を被験者に投与する前に、当該被験者における血管新生阻害剤の有効性の程度を予測するのに用いることができる。そして、血管新生阻害剤の有する効果をより期待できる被験者を選択して、疾患の治療を行うことができる。より抗腫瘍効果を奏する場合として、例えば、同様の症状の被験者における平均的な抗腫瘍効果よりも高い抗腫瘍効果を期待できる場合、同一の癌種に罹患した他の被験者よりも高い抗腫瘍効果を期待できる場合、または他の癌種に罹患した被験者よりも高い抗腫瘍効果を期待できる場合などをあげることができる。したがって、本発明は、臨床上非常に有用である。
　本発明の別の態様として、腫瘍に罹患した被験者に対して血管新生阻害剤の投与または腫瘍の治療に際して
（a）B-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無、
（b）ANG1およびANG2の発現レベル、または
（c）SHC1、NRP2、ARHGAP22、SCG2、PML、IL6、CXCR4、COL4A3、MEIS1、FGF9、FGFR3およびFGFR2からなる群から選ばれる少なくとも１つの発現レベル、
を指標とした情報を使用する方法を提供する。上記の通り、（a1）B-Rafが野生型であり、PTENが野生型である場合、（a2）B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異または発現欠損を有し、PTENが表２から選ばれる少なくとも１つの突然変異または発現欠損を有する場合、（b1）ANG1の発現レベルが対照の値と比較して低い場合、（b2）ANG1の発現レベルが、対照の値と比較して同等以上で、ANG2の発現レベルがANG1の発現を相殺する発現レベルである場合、（b3）ANG1およびANG2の発現レベルの比が、対照の値よりも低い場合、（c1）SHC1の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c2）NRP2の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c3）ARHGAP22の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c4）SCG2の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c5）PMLの発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c6）IL6の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、（c7）CXCR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c8)COL4A3の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c9)MEIS1の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c10)FGF9の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c11)FGFR3の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c12)FGFR2の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c13)FGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c14)FGFR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c15)VEGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、が、当該被験者に対して、血管新生阻害剤を投与すること、または腫瘍を治療することは有効であることの指標となる。当該指標を用いて被験者の血管新生阻害剤への反応性の高さや被験者が血管新生阻害剤に反応する可能性を検討することができ、検討結果は、被験者への血管新生阻害剤の投与の是非、または血管新生阻害剤を用いる腫瘍の治療レジメン等を選択する際の有用な情報として参照することができる。ただし、本発明において血管新生阻害剤は、本来血管新生を阻害する作用を有するため、被験者が血管新生阻害剤に対して高感受性でないと判断されたときであっても、当該血管新生阻害剤が抗腫瘍効果を奏さないと予測されるものではない。
　なお、腫瘍に罹患した被験者に対して血管新生阻害剤を投与する者または腫瘍を治療する者と、上記（a1）～（c15）の測定を行う者とは、それぞれ同一人であっても別人であってもよい。
　本発明の別の態様として、
（a）B-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無、
（b）ANG1およびANG2の発現レベル、または
（c）SHC1、IL6、CXCR4、COL4A3、NRP2、MEIS1、ARHGAP22、SCG2、FGF9、PML、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1からなる群から選ばれる少なくとも１つの発現レベル、
を指標として、腫瘍に罹患した被験者に対して血管新生阻害剤を投与する方法または腫瘍を治療する方法を提供する。上記の通り、（a1）B-Rafが野生型であり、PTENが野生型である場合、（a2）B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異または発現欠損を有し、PTENが表２から選ばれる少なくとも１つの突然変異または発現欠損を有している場合、（b1）ANG1の発現レベルが対照の値と比較して低い場合、（b2）ANG1の発現レベルが、対照の値と比較して同等以上で、ANG2の発現レベルがANG1の発現を相殺する発現レベルである場合、（b3）ANG1およびANG2の発現レベルの比が、対照の値と比較して低い場合、（c1）SHC1の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c2）NRP2の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c3）ARHGAP22の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c4）SCG2の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c5）PMLの発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c6）IL6の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、（c7）CXCR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c8)COL4A3の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c9)MEIS1の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c10)FGF9の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c11)FGFR3の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c12)FGFR2の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c13)FGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c14)FGFR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合または(c15)VEGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、が、当該被験者に対して、血管新生阻害剤を投与すること、または腫瘍を治療することは有効であることの指標となる。被験者への血管新生阻害剤の投与の是非、または血管新生阻害剤を用いる腫瘍の治療レジメン等を選択する際に、血管新生阻害剤を投与すること、または腫瘍を治療することは有効であると予測された被験者は、血管新生阻害剤の投与対象として選択することができる。したがって、本発明は、腫瘍に罹患した被験者であって、本発明の予測方法により血管新生阻害剤に対する反応性が高いことが予測されている被験者を、血管新生阻害剤の投与により治療する方法を含む。ただし、本発明において血管新生阻害剤は、本来血管新生を阻害する作用を有するため、被験者が血管新生阻害剤に対して高感受性でないと判断されたときであっても、当該血管新生阻害剤が抗腫瘍効果を奏さないと予測されるものではない。
　なお、腫瘍に罹患した被験者に対して血管新生阻害剤を投与する者または腫瘍を治療する者と、上記（a1）～（c15）の測定を行う者とは、それぞれ同一人であっても別人であってもよい。
　本発明の別の態様として、
（a）B-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無、
（b）ANG1およびANG2の発現レベル、または
（c）SHC1、IL6、CXCR4、COL4A3、NRP2、MEIS1、ARHGAP22、SCG2、FGF9、PML 、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1からなる群から選ばれる少なくとも１つの発現レベル、
を指標として、血管新生阻害剤に対して高感受性を示す被験者を選択する方法を挙げることができる。上記の通り、（a1）B-Rafが野生型であり、PTENが野生型である場合、（a2）B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異または発現欠損を有し、PTENが表２から選ばれる少なくとも１つの突然変異または発現欠損を有している場合、（b1）ANG1の発現レベルが対照の値と比較して低い場合、（b2）ANG1の発現レベルが、対照の値と比較して同等以上で、ANG2の発現レベルがANG1の発現を相殺する発現レベルである場合、（b3）ANG1およびANG2の発現レベルの比が、対照の値と比較して低い場合、（c1）SHC1の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c2）NRP2の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c3）ARHGAP22の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c4）SCG2の発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c5）PMLの発現レベルが、対照の値と比較して低い場合、（c6）IL6の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、（c7）CXCR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c8)COL4A3の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c9)MEIS1の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c10)FGF9の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c11)FGFR3の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c12)FGFR2の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c13)FGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、(c14)FGFR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合または(c15)VEGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い場合、が、当該被験者が、血管新生阻害剤に対して高感受性を示すことの指標となる。したがって、このような被験者を、血管新生阻害剤に対する高感受性を示す被験者として選択することができる。
　なお、血管新生阻害剤に対して高感受性を示す被験者を選択する者と、上記（a1）～（c15）の測定を行う者とは、それぞれ同一人であっても別人であってもよい。
　本発明の別の態様として、本発明は血管新生阻害剤を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物を投与する対象は、腫瘍を罹患する被験者であって、本発明の方法により血管新生阻害剤へ反応する可能性が高いことが予測されている者である。また、本発明は、腫瘍を罹患する被験者への投与に使用する医薬を製造するための血管新生阻害剤の使用を提供する。当該被験者は本発明の方法により血管新生阻害剤に対する反応性が高いことが予測されている者である。また、本発明は、腫瘍を罹患する被験者の治療のための血管新生阻害剤を提供し、当該被験者は本発明の方法により血管新生阻害剤へ反応する可能性が高いことが予測されている者である。
　B-RafおよびPTENの突然変異または発現欠損を有する腫瘍細胞を標的とした本発明の医薬組成物ならびに腫瘍の治療方法には、さらに一または複数の他の抗腫瘍剤を組み合わせてもよい。他の抗腫瘍剤は、抗癌作用を有する製剤であれば、特に限定されない。他の抗腫瘍剤としては、例えば、塩酸イリノテカン（CPT-11）、カルボプラチン、オキサリプラチン（oxaliplatin）、5-フルオロウラシル（5-FU）、ドセタキセル（タキソテール（登録商標））、パクリタキセル、塩酸ゲムシタビン（ジェムザール（登録商標））、ホリナートカルシウム（ロイコボリン）、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、エベロリムス（サーティカン（登録商標）またはアフィニトール（登録商標））などが挙げられる。また、前記他の抗腫瘍剤としては、腫瘍治療剤の対象となる癌種が、メラノーマである場合には、ダカルバジンまたはテモゾロマイドであり、大腸癌である場合には、塩酸イリノテカン、オキサリプラチン、5-フルオロウラシル、ホリナートカルシウムまたはベバシズマブであり、膵癌である場合には、塩酸ゲムシタビンまたはベバシズマブであり、卵巣癌である場合には、カルボプラチンまたは塩酸ゲムシタビンであり、腎癌である場合には、ベバシズマブまたはエベロリムスであり、肺癌である場合には、カルボプラチン、ドセタキセルまたはパクリタキセルが特に好ましい。
　本発明の医薬組成物は、腫瘍治療剤として使用することができる。本発明において、腫瘍治療剤とは、抗腫瘍剤、癌予後改善剤、癌再発予防剤、癌転移抑制剤などを含むものをいう。
　癌治療の効果は、レントゲン写真、CT等の所見や生検の病理組織診断により、あるいは腫瘍マーカーの値により確認することができる。
　本発明の医薬組成物を使用する場合には、経口もしくは非経口的に投与することができる。本発明の医薬組成物を使用する場合、血管新生阻害剤の投与量は、症状の程度、被験者の年齢、性別、体重、感受性差、投与方法、投与時期、投与間隔、医薬製剤の性質、調剤、種類、有効成分の種類等によって異なり、特に限定されないが、通常成人（体重60 kg）１日あたり0.1mgから10gを、通常、１週間に１回から、１日１～３回に分けて投与することができる。
　本発明の医薬組成物は、経口用固形製剤、注射剤などにすることができる。経口用固形剤形は、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤が挙げられる。注射剤は、静脈、皮下、筋肉内注射剤などが挙げられ、その際、必要により常法により凍結乾燥物とすることもできる。
　これら製剤化には通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤など、および必要により安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤などを使用することができ、一般に医薬品製剤の原料として用いられる成分を配合して常法により製剤化される。
　これらの成分としては例えば、動植物油（大豆油、牛脂、合成グリセライドなど）、炭化水素（流動バラフィン、スクワラン、固形パラフィンなど）、エステル油（ミリスチン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピルなど）、高級アルコール（セトステアリルアルコール、ベヘニルアルコールなど）、シリコン樹脂、シリコン油、界面活性剤（ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマーなど）、水溶性高分子（ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロースなど）、アルコール（エタノール、イソプロパノールなど）、多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトールなど）、糖（グルコース、ショ糖など）、無機粉体（無水ケイ酸、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、ケイ酸アルミニウムなど）、精製水などが挙げられる。ｐＨ調整のためには無機酸（塩酸、りん酸など）、無機酸のアルカリ金属塩（りん酸ナトリウムなど）、無機塩基（水酸化ナトリウムなど）、有機酸（低級脂肪酸、クエン酸、乳酸など）、有機酸のアルカリ金属塩（クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウムなど）、有機塩基（アルギニン、エタノールアミンなど）などを用いることができる。また、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤などを添加することができる。
　本発明の別の態様として、本発明はB-RafおよびPTEN、または、ANG1およびANG2のプローブを含むことを特徴とする、腫瘍を罹患する被験者の血管新生阻害剤に対する反応性を予測するためのキットを提供する。血管新生阻害剤に対する反応性の予測は、本発明の方法により実施することができる。前記血管新生阻害剤としては、好ましくは、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドまたはその薬理学的に許容される塩が挙げられる。
　本発明の医薬組成物および／またはキットは、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して、用いることができる。
　本発明の医薬組成物および／またはキットは、上記の血管新生阻害剤またはプローブの他に、包装容器、取扱説明書、添付文書等を含んでいてもよい。包装容器、取扱説明書、添付文書等には、例えば、一または複数の他の抗癌剤を併用して用いるための組み合わせを記載することができ、また、別々の物質を投与時に併用する形態または混合物としての形態について、用法、用量などを記載することができる。用法、用量は、上記を参照して記載することができる。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限られるものではない。
［実施例１］BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の検出
　ヒトメラノーマ細胞株SK-MEL-2、MeWo、CHL-1、HMV-1、HMCB、MDA-MB-435、LOX、G361、FEM、SEKI、SK-MEL-28、A375、A2058をそれぞれ表６の「購入先」の欄に示した入手先から入手し、それぞれ、Sanger法または次世代シークエンス法（Bridge PCR法：Solexa/Illumina）を用いて、BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損を検出した。
（１）Sanger法による検出
(i) メラノーマ細胞株からのゲノムDNAの調製
　約1×106個の細胞からDNeasy Blood & Tissue Kit(QIAGEN社より購入)を用いてゲノムDNAの精製を行った。
(ii) PTENエクソン領域の増幅
　得られたゲノムDNAに対しPCR反応を行うことで、PTENのエクソン領域の増幅を行った。PCR反応はPrimeSTAR GXL DNA Polymerase (タカラバイオ株式会社より購入) にて行った。ゲノムDNA 100 ng, 5×PrimeSTAR GXL Buffer 4μL, dNTP mixture (2.5 mM) 1.6μL, センスプライマーおよびアンチセンスプライマー(それぞれ5 pmol), PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.4μlを全体容量20μLになるように調整し、その溶液を95℃ 10秒、55℃ 15秒、68℃ 30秒の反応を40回行った。
　PCR反応に用いたプライマー配列を以下に示す。
　Exon1 センスプライマー： AGTCGCCTGTCACCATTTC（配列番号19）
　Exon1 アンチセンスプライマー： ACTACGGACATTTTCGCATC（配列番号20）
　Exon2 センスプライマー： GTTTGATTGCTGCATATTTCAG（配列番号21）
　Exon2 アンチセンスプライマー： GGCTTAGAAATCTTTTCTAAATG（配列番号22）
　Exon3 センスプライマー： AATGACATGATTACTACTCTA（配列番号23）
　Exon3 アンチセンスプライマー： TTAATCGGTTTAGGAATACAA（配列番号24）
　Exon4 センスプライマー： CATTATAAAGATTCAGGCAATG（配列番号25）
　Exon4 アンチセンスプライマー： GACAGTAAGATACAGTCTATC（配列番号26）
　Exon5 センスプライマー： ACCTGTTAAGTTTGTATGCAAC（配列番号27）
　Exon5 アンチセンスプライマー： TCCAGGAAGAGGAAAGGAAA（配列番号28）
　Exon6 センスプライマー： CATAGCAATTTAGTGAAATAACT（配列番号29）
　Exon6 アンチセンスプライマー： GATATGGTTAAGAAAACTGTTC（配列番号30）
　Exon7 センスプライマー： TGACAGTTTGACAGTTAAAGG（配列番号31）
　Exon7 アンチセンスプライマー： GGATATTTCTCCCAATGAAAG（配列番号32）
　Exon8 センスプライマー： CTCAGATTGCCTTATAATAGT（配列番号33）
　Exon8 アンチセンスプライマー： TCATGTTACTGCTACGTAAAC（配列番号34）
　Exon9 センスプライマー： AAGGCCTCTTAAAGATCATG（配列番号35）
　Exon9 アンチセンスプライマー： TTTTCATGGTGTTTTATCCCT（配列番号36）
(iii) PCR産物の回収
　1％アガロースゲル電気泳動法により、目的の長さであることを確認したPCR産物をゲルから回収し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega社より購入)を用いて精製を行った。精製したゲノムDNAに対し、市販のキットを用いてPCRを行い、配列を決定した。
（２）次世代シークエンス法による検出
(i) メラノーマ13細胞株からの全RNAの調製
　細胞を5％CO2条件下37℃にて培養した。一定時間後にTRIZOL試薬（GIBCO BRL社より購入）を用い、試薬に添付された操作法に従って細胞溶解を行った。
　具体的には以下のとおりである。培養面積10cm2に対して1 mlのTRIZOL試薬を加え、数回ピペッティングを行い、細胞が溶解した液体を回収した。回収したサンプルを遠心した後、得られた上清を室温で５分間放置後、使用したTRIZO試薬1 mlに対して0.2 mlの割合でクロロフォルム（純正化学社より購入）を添加した。この溶液を15秒間激しく振盪、攪拌し室温で2～3分間放置後遠心を行った（12000×g、10分間、4℃）。遠心後水層を新しいチューブに移し、使用したTRIZO試薬1 mlに対して0.5 mlの割合でイソプロピルアルコール（和光純薬社より購入）を加え、室温で10分間放置後遠心を行った（12000×g、10分間、4℃）。得られた沈殿を75％エタノール（和光純薬社より購入）にて洗浄した後風乾し、全RNAとして以降の操作に供した。
(ii) BRAFおよびPTENのタンパク質をコードする配列の増幅
　上記で得られたRNAを鋳型としてHigh capacity cDNA Reverse Transcription kitの添付文書の方法に従いcDNAを合成した。
　得られたメラノーマ13細胞株のcDNAに対しPCR反応を行うことで、B-RafおよびPTENのタンパク質をコードする配列の増幅を行った。PCR反応はPrimeSTAR GXL DNA Polymerase (タカラバイオ株式会社より購入) あるいはPhusion High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes社より購入) にて行った。PrimeSTAR GXL DNA Polymeraseを用いる場合には、cDNA 100 ng, 5×PrimeSTAR GXL Buffer 4μL, dNTP mixture (2.5 mM) 1.6μL, センスプライマーおよびアンチセンスプライマー（それぞれの5 pmol）(B-Rafについては各３種プライマーでの反応を実施), PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.4μlを全体容量20μLになるように調製し、その溶液を95℃ 10秒、55℃ 15秒、68℃ 2分の反応を40回行った。Phusion High-Fidelity DNA Polymeraseの場合には、cDNA 100 ng, 5×Phusion GC Buffer 4μL, dNTP mixture (2.5 mM) 1.6μL, センスプライマーおよびアンチセンスプライマー（それぞれ10 pmol）, Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 0.2μLを全体容量20μLになるように調製し、その溶液を98℃ 10秒、55℃ 30秒、72℃ 2分の反応を40回行った。
　PCR反応に用いたプライマー配列を以下に示す。
PTENセンスプライマー：TCTGCCATCTCTCTCCTCCTTTT（配列番号37）
PTENアンチセンスプライマー：TCTGACACAATGTCCTATTGCCAT（配列番号38）
BRAFセンスプライマー1： GCCCCGGCTCTCGGTTATAAGATG（配列番号39）
BRAFアンチセンスプライマー1： CCGTTCCCCAGAGATTCCAA（配列番号40）
BRAFセンスプライマー2： TGCCATTCCGGAGGAGGTGT（配列番号41）
BRAFアンチセンスプライマー2： GCCCATCAGGAATCTCCCAA（配列番号42）
BRAFセンスプライマー3： ATCTGGATCATCCCCTTCCGC（配列番号43）
BRAFアンチセンスプライマー3： CCCGGAACAGAAAGTAAAGCCTCTAG（配列番号44）
(iii) PCR産物の回収、精製、平滑末端化、連結処理
　1％アガロースゲル電気泳動法により、目的の長さであることを確認したPCR産物をゲルから回収し、Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega社より購入) を用いて精製を行った。精製したPCR産物を細胞株ごとに1つのチューブにまとめ、DNA Blunting Kit（タカラバイオ株式会社より購入）により全量10μL中にて平滑末端化を行った。その後、フェノール/クロロフォルム抽出、エタノール沈殿によりDNAをペレット化した後、DNA Ligation Kit (タカラバイオ株式会社より購入)を用いて全量10μL中にて連結処理を16℃で6時間行った。連結処理したDNAはフェノール/クロロフォルム抽出、エタノール沈殿によりDNAをペレット化した。
(iv) 次世代シーケンサーでの解析のためのライブラリー作製
　Genomic DNA Sample Prep Kit (Illumina社より購入) を用い、添付の操作法に従ってライブラリーの作成を行った。方法の概要は以下の通りである。
　DNAをネブライゼーションにより断片化を行った後、DNAの平滑末端化と5’末端のリン酸化を行う。アダプターを付加した後、2％アガロースゲル電気泳動法により150 bpから200 bpの間の長さの産物をゲルから回収し精製する。精製したDNAを鋳型としてPCRを行った後DNAを精製し、吸光度測定を行い濃度と純度の確認を行った。
(v) 次世代シーケンサーでのデータ取得
　GAII DNA Sample Cluster Generation Kit（Illumina社より購入）および36-Cycle SBS Sequencing Kit（Illumina社より購入）を用い、添付の操作法に従ってクラスター形成およびGenome Analyzer II（Illumina社）でのデータ取得を行った。1レーン当たり1細胞株由来のサンプルを3 pMol用いた。サイクル数は36あるいは76サイクルで行った。
(vi) データ解析
　Illumina社製IPAR/GAPipelineを用いてTIFF形式の画像からTXT形式の配列情報を作成、FASTQ形式に変換後、MAQを用いて関連遺伝子のRefseq配列情報をリファレンスとしてアライメントを行った。抽出されたSNPs情報に内製ソフトウェアを用いてアミノ酸置換情報等を付加及びGFF形式に変換し、Gbrowseを用いて変異情報及びdepth情報(突然変異または発現欠損情報）を確認した。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
  
 
［実施例２］メラノーマ細胞株移植マウスモデルにおける血管新生阻害剤の抗腫瘍効果の算出
　実施例１で使用したヒトメラノーマ細胞株を、それぞれ表６の「培養液」の欄に示した培地（10％FBS含）で約80％コンフルレントとなるまで培養した（5％炭酸ガスインキュベーター内）。培養後、常法に従いトリプシン－EDTA処理により、各細胞を回収した。各細胞をリン酸緩衝液、あるいはマトリゲル液（リン酸緩衝液とマトリゲルを１：１公比にて混和）で懸濁し、1×108 cells/mLまたは5×10７cells/mL懸濁液に調製した。そして、細胞懸濁液を0.1 mLずつヌードマウス体側皮下に移植し、ヒトメラノーマ細胞株移植マウスモデルを作製した。
　移植後、腫瘍体積が約200 mm3になった時点から、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドメシル酸塩（以下、E7080と言う）100 mg/kg/dayを経口投与し、経日的に腫瘍長径および短径をデジマチックキャリパ（Mitsutoyo）で測定した。下記式で腫瘍体積、比腫瘍体積を算出することで、当該マウスモデルにおける血管新生阻害剤の抗腫瘍効果（ΔT/C）を算定した。
　腫瘍体積（TV）＝腫瘍長径（mm）×腫瘍短径2（mm2）／2
　抗腫瘍効果（ΔT/C）＝（薬剤投与群のTV-投与開始前のTV）/（コントロール群のTV-投与開始前のTV）×100
　投与開始後７日目のΔT/Cを図1に示す。図１において、各細胞株の分類は、実施例１にて行ったものを用いた。
　メラノーマ細胞に対するE7080の抗腫瘍効果（ΔT/C)は、BRAFおよびPTENがともに野生型の場合、BRAFおよびPTENがともに突然変異または発現欠損がある場合、またはBRAFに突然変異を有しかつPTENに突然変異を有さない場合、それぞれ16、23、45％であり、E7080の抗腫瘍効果は特にBRAFおよびPTENがともに突然変異または発現欠損がある場合とない場合にみられた。E7080の抗腫瘍効果はメラノーマ細胞をBRAFおよびPTENの突然変異の有無により層別化した場合に異なることが明らかであり（図１）、BRAFおよびPTENの突然変異の有無がE7080の効果を予測する指標となることが示された。
［実施例３］BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無による周皮細胞（ペリサイト）で覆われた血管の割合との相関性
　腫瘍組織においては、血管新生が正常に行われない結果、周皮細胞で覆われる血管が形成されない現象が観察される。腫瘍細胞をBRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無により層別化した場合に周皮細胞で覆われた血管の割合に変化がみられるか検証を行った。
　実施例１で使用したヒトメラノーマ細胞株を用いて、実施例２の方法に従いヒトメラノーマ細胞株移植マウスモデルを作成した。移植後、腫瘍体積が約100-300mm3になった時点で、マウスをCO2にて致死せしめ、移植された腫瘍組織を外科手術により摘出した。
　その後、摘出された腫瘍組織から腫瘍組織切片を作成し、当該切片について染色を行った。
　具体的には、腫瘍組織の周辺部より約5 mm内側をナイフで切断し、当該組織をOCTコンパウンドで包埋した。その後、当該組織をドライアイスで凍結し、-80℃にて凍結組織を作製した。当該凍結組織について、厚さ8μmの切片を作製し、スライドガラスに貼り付けた後、流水洗浄を行い、冷アセトンで4℃、10分静置し、サンプルを作製した。その後、0.1％Tween20含有0.01 Mリン酸緩衝液（以下、洗浄用PBSという）でサンプルを3回洗浄し、DAKOビオチンブロッキングキットのアビジンブロッキング溶液にて10分間室温で反応させた。反応後、洗浄用PBSでサンプルを3回洗浄し、当該キットのビオチンブロッキング溶液にて室温で10分間反応させた。その後、サンプルを洗浄用PBSで3回洗浄し、VECTOR STAIN ABCペルオキシダーゼ ラットIgGキット内の正常血清にて室温で20分間反応させた。サンプルから反応溶液を除去後、1％ウシ胎児血清含有0.1Mリン酸緩衝液にて600倍希釈した１次抗体である抗CD31抗体（クローン名：MEC13.3、ラットIgG、PharMingen, BD Biosciences）を添加し、4℃で一晩反応させた。その後、洗浄し、当該キット内のビオチン標識した２次抗体を添加し室温で30分間反応させ、洗浄した後、当該キット内のアビジン試薬でさらに室温で30分間反応させた。その後、0.01Mリン酸緩衝液にて3回洗浄し、DABにて発色させ、CD31の染色を行った。
　次に、サンプルを流水にて水洗後、トリスバッファーにて3回洗浄を行った。その後、サンプルにトリスバッファーにて100倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗α-SMA抗体（クローン名：1A4、マウスIgG、SIGMA-ALDRICH）を室温で1時間反応させた。その後、トリスバッファーにて3回洗浄し、DAKO LSABキット内のフクシン溶液にて発色させ、α-SMAの染色を行った。
　染色後のサンプルを顕微鏡観察下で、CCDカメラHYPER SCOPE (KEYENCE)にて血管数およびペリサイトで覆われた血管数を1サンプルあたり５ヶ所程度測定し、その平均を単位面積辺りの血管数またはペリサイト数として換算した。また、血管数に占めるペリサイト血管の割合をそれぞれのメラノーマ細胞株で算出した。結果を図２に示す。図２において、各細胞株の分類は、実施例１にて行ったものを用いた。
　BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無によりメラノーマ細胞を階層化した場合、腫瘍組織中のペリサイトで覆われている血管の割合が異なる傾向を示した（図２）。また、E7080の抗腫瘍効果と腫瘍組織中ペリサイトで覆われている血管の割合について分析したところ、腫瘍組織中ペリサイトで覆われている血管の割合はE7080の抗腫瘍効果と高い相関性を示した（図３）ことから、BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無が腫瘍中の血管の性状に影響を与え、腫瘍中のペリサイトで覆われている血管の割合を変動させることを示唆した。その結果、腫瘍中のペリサイトで覆われている血管の割合が低いメラノーマ細胞ではE7080が効果を示しやすい血管になっている可能性が示唆され、BRAFおよびPTENがともに野生型の場合と、BRAFおよびPTENがともに突然変異または発現欠損を有している場合において特にE7080が効果を示しやすいことが示唆された。
［実施例４］BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無による、ANG1およびANG2の発現制御
（１）BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無とANG1およびANG2の発現との相関性
　ヒトメラノーマ細胞株において、BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無とANG1およびANG2の発現との相関性について定量的RT-PCR法およびELISA法を用いて検証した。
１．定量的RT-PCR法による検証
　実施例１で使用しているヒトメラノーマ細胞株について、実施例１（２）（i）の項目と同様の方法で全RNAを準備し、以降の測定に供した。
　各種血管新生因子および各種血管新生因子受容体の定量的RT-PCRは、遺伝子特異的プローブ（TaqMan Gene Expression Assays mixture、Applied Biosystems社ASSAYS-ON-DEMANDより購入）および遺伝子解析用BioMarkTMシステム（Fluidigm社より購入）を用いて操作マニュアルに基づき、以下のように行った。使用した血管新生因子および血管新生因子受容体の遺伝子名および購入したプローブのアッセイIDを表７に示す。
　操作は、逆転写反応、プレ増幅及びPCR反応の3段階で行った。
　最初の段階である逆転写反応は、準備したRNAにRNase Free dH2O 6.5μLを添加し、これに5×PrimeScript buffer 2μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL、Oligo dT Primer (50μM) 0.5μL、Random 6 mer (100μM) 0.5μLを加え、37℃にて15分間反応させた後、85℃にて5秒間加熱することにより反応を停止させ、cDNA液を得た。得られたcDNA液を第2段階のプレ増幅反応に供した。
　プレ増幅反応は、遺伝子特異的なPrimer/Probe 42μLにlow-TE bufferの58μLを加えた溶液のうち56.25μLを分取し、これにPreAmp Master Mixを112.5μL、cDNA液を56.25μLを加え、95℃ 10分間反応させた。次いで95℃ 15秒間、60℃ 4分間からなる反応サイクルを14サイクル行った。反応後の反応液をTE bufferにて1:5に希釈し、これをプレ増幅液とした。得られたプレ増幅液を第3段階のPCR反応に供した。
　Sample液として2×ABI Master Mixの275μLにLoading Bufferを27.5μLを加え、その溶液の5.5μLに作製したプレ増幅液の4.5μLを加えた。またアッセイ液としては水 4750μLに10％ Tweenを加え、その溶液の5μLに20×assaysを5μL加えることで作製した。Sample液およびアッセイ液のそれぞれを48.48 Dynamic trayに加え、NanoFlex ICFコントローラーにてサンプルを充填後、Biomark（Fluidigm Corporation）にて測定を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
  
 
　得られたPCR産物から各遺伝子の定量解析を行なうため、検量線の作成は、全てのサンプルを等量混和したmRNAサンプルを用いて行なった。各メラノーマ細胞株での遺伝子発現量は、検量線からCt（threshold cycle 値の略であり、PCR産物がある一定の濃度に達するのに必要なPCRのサイクル数である）を算出した。各メラノーマ細胞株における遺伝子の発現量をβ-actin発現量で補正した値を各メラノーマ細胞株における遺伝子の発現量比とし、比較解析に用いた。
２．ELISAによる検証
　実施例１で使用しているヒトメラノーマ細胞を実施例２の方法に従いヒトメラノーマ細胞株移植マウスモデルを作成した。移植後、腫瘍体積が100 mm3以上になった段階でマウスを壊死せしめ、移植された腫瘍組織を回収した。腫瘍組織に細胞溶解液（セルシグナリング社より購入）を添加することで細胞液を作成し、-80℃にて保存した。調製液中のANG1タンパク質の発現レベル、ANG2タンパク質の発現レベルおよびそれらの比（ANG1/ANG2）をELISA Kit（R&D systemsより購入）にて測定し、検量線を元に定量した。
　結果を図４，５に示す。図４において、BRAFが「-」のグラフは、表６に示すSK-MEL-2、MeWo、CHL-1、HMV-1およびHMCBのセルラインについての各抗腫瘍効果の結果を包含したものである。BRAFが「+」のグラフは、表６に示すMDA-MB-435、LOX、G361、FEM、SEKI、SK-MEL-28、A375およびA2058のセルラインについての各抗腫瘍効果の結果を包含したものである。図５において、PTENが「-」のグラフは、表６に示すSK-MEL-2、MeWo、CHL-1、HMV-1、HMCB、MDA-MB-435、LOX、G361、FEMおよびSEKIのセルラインについての各抗腫瘍効果の結果を包含したものである。PTENが「+」のグラフは、表６に示すSK-MEL-28、A375およびA2058のセルラインについての各抗腫瘍効果の結果を包含したものである。
　ANG1（表７中No.11）のmRNA発現レベルは、BRAFの突然変異が存在するヒトメラノーマ細胞株では有意に亢進し（図４（ｂ））、ANG1タンパク質の発現レベルは、BRAFの突然変異が存在するヒトメラノーマ細胞株では亢進していることが明らかとなった（図４（a））。
　また、ANG2（表７中No.12）のmRNA発現レベルは、PTENの突然変異が存在するヒトメラノーマ細胞株では亢進し（図５（ｂ））、ANG2（表7中No.12）タンパク質の発現レベルは、PTENの突然変異が存在するヒトメラノーマ細胞株では有意に亢進していることが明らかとなった（図５（a））。
（２）BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無と、ANG1とANG2の発現レベルの比（ANG1/ANG2）の相関性
　ANG1はTIE-2レセプターに結合し、ANG1-TIE-2シグナルは血管の成熟を誘導することが知られている。TIE-2レセプターには、ANG2がANG1と競合的に結合するが、ANG2が結合したレセプターからは下流のシグナルは流れず、ANG1が発現していない（あるいは発現が低い）状況、すなわちBRAF正常下ではVEGFのシグナルが血管の新生や生存に寄与し、血管の成熟化が引き起こされないことが知られている。
　メラノーマ細胞をBRAFおよびPTENの突然変異の有無により層別化した場合にANG1-TIE-2シグナリングに影響を与えるか、ANG1タンパク質の発現レベルとANG2タンパク質の発現レベルの比（ANG1/ANG2）を検証した。結果を図６に示す。図６において、各細胞株の分類は、実施例１にて行ったものを用いた。
　メラノーマ細胞をBRAFおよびPTENの突然変異の有無により層別化した場合のANG1タンパク質の発現レベルとANG2タンパク質の発現レベルの比（ANG1/ANG2）は、BRAFおよびPTENがともに野生型である場合と、BRAFおよびPTENに突然変異または発現欠損がある場合に低くなる傾向を示し、BRAFに突然変異または発現欠損があり、PTENが野生型である場合に高くなる傾向を示した（図６）。また、BRAFに突然変異または発現欠損があり、PTENが野生型である場合と比較して、BRAFおよびPTENがともに野生型である場合と、BRAFおよびPTENに突然変異または発現欠損がある場合のANG1およびANG2の発現レベルの比は有意に低くなることを示した。これは、BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損において、E7080に対して反応性を示しやすいタイプの変異の組合せとANG1/ANG2が似た傾向を示していることを意味している。
　以上の結果から、血管新生阻害剤の抗腫瘍効果は、BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無により規定されていることが明らかとなり、BRAFの突然変異がない被験者については腫瘍組織血管の周皮細胞の割合が減少していること、その原因としてペリサイト血管形成に関与しているANG1およびANG2の発現制御が関与していることが明らかとなった。ANG1を発現していないあるいはANG1の発現が低い場合、すなわちBRAFが正常な状況では、特にFGFR3を発現する場合FGFRキナーゼ阻害剤は癌細胞に対する直接の殺傷作用が期待でき、E7080はBRAFが正常でFGFR3を発現するメラノーマ患者については血管新生阻害に加えて抗腫瘍効果が増強される可能性を示唆した。
　一方、ANG1の発現が高い場合、すなわちBRAFが突然変異または発現欠損を有している場合、ANG2の発現に血管の成熟化が依存し、ANG2が高発現の場合、すなわちPTENが突然変異または発現欠損を有している場合にはANG1とANG2の競合阻害により成熟化が起こらず、ANG2が低発現の場合、すなわちPTENが正常な場合には血管の成熟化が起こることを示唆した。よって、ANG1およびANG2の発現が高い場合には、E7080は主に血管新生阻害による抗腫瘍効果を期待でき、ANG1の発現が高くかつANG2の発現が低い場合には、ANG2の発現がANG1の発現より高いレベルであればE7080による抗腫瘍効果を期待できることを示唆した。
　従って、ANG1およびANG2の発現レベルまたは発現レベルの比を指標とすることによりE7080の効果を予測することが可能となった。
［実施例５］BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無と、SHC1、IL6、CXCR4、COL4A3、NRP2、MEIS1、ARHGAP22、SCG2、FGF9、PML、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1の発現との相関性
　ヒトメラノーマ細胞株において、BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無とSHC1、IL6、CXCR4、COL4A3、NRP2、MEIS1、ARHGAP22、SCG2、FGF9、PML、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1の発現との相関性についてDNAマイクロアレイ法を用いて検証した。
１．サンプルから全RNAの抽出
　実施例１で使用しているヒトメラノーマ細胞について、実施例２と同様の方法でヒトメラノーマ細胞種移植マウスモデルを作製し、移植後、腫瘍体積が200 mm3以上の腫瘍になった段階で、マウスを致死させ、移植された腫瘍組織を摘出し、実施例１（２）（i）の項目と同様の方法で全RNAを準備し、以降の操作に供した。
２．RNAの定量
１）DNAマイクロアレイによる定量
　Schenaらの方法（Schena et al., Science, 1995, 270， p.467-470）、Lockhartらの方法（Lockhart et al.， Nature Biotechnology， 1996, 14，p.1675-1680）または最新のAffimetrix社のGeneChip(登録商標)Array Stationの操作マニュアルに基づきcDNA合成とビオチン標識を行った。その後、Affimetrix社のDNAマイクロアレイ（Human Genome U133 Plus 2.0 Array）へのハイブリダイズと測定を操作マニュアルに基づき実施し、データを取得した。
　３．データ解析
　データは累積カイ自乗法によるトレンド検定を行うことにより、統計解析処理を行い、BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無により発現量に有意な変化のある遺伝子群を抽出した。
　その結果、IL6、CXCR4、COL4A3、MEIS1、FGF9、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1の発現量は、BRAFに突然変異があり、PTENが野生型である場合の発現量を境に有意に減少しており、SHC1、NRP2、ARHGAP22、SCG2およびPMLの発現量は、BRAFに突然変異があり、PTENが野生型である場合の発現量を境に有意に増加していることが明らかとなった。よって、SHC1、IL6、CXCR4、COL4A3、NRP2、MEIS1、ARHGAP22、SCG2、FGF9、PML、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1の発現量がBRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無によりメラノーマ細胞を階層化した場合、有意に変化していることが明らかになった。
　すなわち、被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高い場合、
　SHC1の発現レベルは、対照の値と比較して有意に減少しており、
　IL6の発現レベルが、対照の値と比較して有意に増加しており、
　CXCR4の発現レベルが、対照の値と比較して有意に増加しており、
　COL4A3の発現レベルが、対照の値と比較して有意に増加しており、
　NRP2の発現レベルが、対照の値と比較して有意に減少しており、
　MEIS1の発現レベルが、対照の値と比較して有意に増加しており、
　ARHGAP22の発現レベルが、対照の値と比較して有意に減少しており、
　SCG2の発現レベルが、対照の値と比較して有意に減少しており、
　FGF9の発現レベルが、対照の値と比較して有意に増加しており、
　PMLの発現レベルが、対照の値と比較して有意に減少しており、
　FGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して有意に増加しており、
　FGFR4の発現レベルが、対照の値と比較して有意に増加しており、
　VEGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して有意に増加していることを示唆した。
［実施例６］BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無とFGFR3およびFGFR2の発現との相関性
　ヒトメラノーマ細胞株において、BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無とFGFR3およびFGFR2の発現との相関性について定量的RT-PCR法を用いて検証した。
　実施例１で使用しているヒトメラノーマ細胞株を用いて実施例２と同様の方法でヒトメラノーマ細胞種移植モデルマウスを作製し、実施例１（２）（i）の項目と同様の方法で全RNAを準備し、実施例４の項目１と同様の方法で定量的RT-PCRを行った。使用した血管新生因子および血管新生因子受容体の遺伝子名および購入したプローブのアッセイIDを表８に示すとともに、結果を図７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
  
 
　その結果、FGFR3およびFGFR2の発現量は、BRAFに突然変異があり、PTENが野生型である場合の発現量を境に有意に減少しており、BRAFおよびPTENの突然変異または発現欠損の有無によりメラノーマ細胞を階層化した場合、有意に変化していることが明らかになった（図７）。
　すなわち、被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高い場合、
　FGFR2の発現レベルが、対照の値と比較して有意に増加しており、
　FGFR3の発現レベルが、対照の値と比較して有意に増加している
ことを示唆した。
　本発明により、被験者の血管新生阻害剤に対する反応性を予測する方法が提供される。本発明の方法により得られた予測結果は、腫瘍の治療に際し血管新生阻害剤を選択するための情報として利用することができる。
配列番号１：B-Rafポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No. NM_004333.4
配列番号２：B-Rafアミノ酸配列、GenBank Accession No. NP_004324.2
配列番号３：PTENポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No. NM_000314.4
配列番号４：PTENアミノ酸配列、GenBank Accession No. NP_000305.3
配列番号５：SHC1ポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No.NM_003029.4
配列番号６：SHC1アミノ酸配列、GenBank Accession No. NP_003020.2
配列番号７：IL6ポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No.NM_000600.3
配列番号８：IL6アミノ酸配列、GenBank Accession No.NP_000591.1
配列番号９：CXCR4ポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No.NM_001008540.1
配列番号１０：CXCR4アミノ酸配列、GenBank Accession No.NP_001008540.1
配列番号１１：COL4A3ポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No.NM_000091.4
配列番号１２：COL4A3アミノ酸配列、GenBank Accession No.NP_000082.2
配列番号１３：NRP2ポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No.NM_003872.2
配列番号１４：NRP2アミノ配列、GenBank Accession No. NP_003863.2
配列番号１５：MEIS1ポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No.NM_002398.2
配列番号１６：MEIS1アミノ酸配列、GenBank Accession No.NP_002389.1
配列番号１７：ARHGAP22ポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No.NM_021226.2
配列番号１８：ARHGAP22アミノ酸配列、GenBank Accession No.NP_067049.2
配列番号１９～４４：合成ＤＮＡ
配列番号４５：ANG1ポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No. NM_001146.3
配列番号４６：ANG1アミノ酸配列、GenBank Accession No. NP_001137.2
配列番号４７：ANG2ポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No. NM_001118888.1
配列番号４８：ANG2アミノ酸配列、GenBank Accession No. NP_001112360.1
配列番号４９：SCG2ポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No.NM_003469.4
配列番号５０：SCG2アミノ酸配列、GenBank Accession No.NP_003460.2
配列番号５１：FGF9ポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No.NM_002010.2
配列番号５２：FGF9アミノ酸配列、GenBank Accession No.NP_002001.1
配列番号５３：PMLポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No.NM_002675.3
配列番号５４：PMLアミノ酸配列、GenBank Accession No.NP_002666.1
配列番号５５：FGFR3ポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No. NM_000142.3
配列番号５６：FGFR3アミノ酸配列、GenBank Accession No. NP_000133.1
配列番号５７：FGFR2ポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No. 7.NM_001144918.1
配列番号５８：FGFR2アミノ酸配列、GenBank Accession No. NP_001138390.1
配列番号５９：FGFR1ポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No. NM_001174063.1
配列番号６０：FGFR1アミノ酸配列、GenBank Accession No. NP_001167534.1
配列番号６１：FGFR4ポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No. NM_002011.3
配列番号６２：FGFR4アミノ酸配列、GenBank Accession No. NP_002002.3
配列番号６３：VEGFR1ポリヌクレオチド配列、GenBank Accession No. NM_001159920.1
配列番号６４：VEGFR1アミノ酸配列、GenBank Accession No. NP_001153392.1

Claims (22)

  1. 腫瘍を罹患する被験者の血管新生阻害剤に対する反応性を予測する方法であって、
    （a）前記被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中の、B-Rafの突然変異または発現欠損の有無、およびPTENの突然変異または発現欠損の有無を検出する工程を含み、当該検出工程においては、
    （a1）B-Rafが野生型であり、PTENが野生型である、または
    （a2）B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異もしくは発現欠損を有しており、PTENが表２から選ばれる少なくとも１つの突然変異もしくは発現欠損を有している
    場合が、当該被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標である、
    前記方法。
  2. 前記（a）の検出工程において、B-Rafが野生型であり、かつ、PTENが野生型である場合、前記被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記（a）の検出工程において、B-Rafが表１から選ばれる少なくとも１つの突然変異または発現欠損を有しており、PTENが表２から選ばれる少なくとも１つの突然変異または発現欠損を有している場合、前記被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記B-Rafの突然変異が、V600Eのアミノ酸配列の突然変異又は前記変異に対応するヌクレオチド配列の突然変異である、請求項１または請求項３に記載の方法。
  5. 前記PTENの突然変異が、A499G、T202CおよびT335Aからなる群から選ばれる少なくとも１つのヌクレオチド配列の突然変異、またはT167A、Y68HおよびL112Qからなる群から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸配列の突然変異である、請求項１または請求項３に記載の方法。
  6. 前記血管新生阻害剤が、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドまたはその薬理学的に許容される塩である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記血管新生阻害剤が、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドのメシル酸塩である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記腫瘍がB-RafにV600E突然変異を有する腫瘍であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記腫瘍がメラノーマ、甲状腺癌、大腸癌、卵巣癌、肝癌、肺癌、子宮内膜癌または神経膠腫であることを特徴とする、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記（a）工程において、前記被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことが予測されており、
    （b）前記被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中の、ANG1およびANG2の発現レベルを定量する工程をさらに含み、当該定量工程においては、
    （b1）ANG1の発現レベルが対照の値と比較して低い
    （b2）ANG2の発現レベルが、対照の値と比較して高い、または
    （b3）ANG1およびANG2の発現レベルの比が対照の値と比較して低い
    場合が、当該被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標である、
    請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記（a）工程において、前記被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことが予測されており、
    （c）前記被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中の、SHC1、IL6、CXCR4、COL4A3、NRP2、MEIS1、ARHGAP22、SCG2、FGF9、PML、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1からなる群から選ばれる少なくとも１つの発現レベルを定量する工程をさらに含み、当該定量工程においては、
    （c1）SHC1の発現レベルが、対照の値と比較して低い、
    （c2）NRP2の発現レベルが、対照の値と比較して低い、
    （c3）ARHGAP22の発現レベルが、対照の値と比較して低い、
    （c4）SCG2の発現レベルが、対照の値と比較して低い、
    （c5）PMLの発現レベルが、対照の値と比較して低い、
    （c6）IL6の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    （c7）CXCR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    （c8）COL4A3の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    （c9）MEIS1の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    （c10）FGF9の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    （c11）FGFR3の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    （c12）FGFR2の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    （c13）FGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    （c14）FGFR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い、または
    （c15）VEGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    場合が、当該被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 腫瘍を罹患する被験者の血管新生阻害剤に対する反応性を予測する方法であって、
    （b）前記被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中の、ANG1およびANG2の発現レベルを定量する工程を含み、当該定量工程においては、
    （b1）ANG1の発現レベルが対照の値と比較して低い
    （b2）ANG2の発現レベルが対照の値と比較して高い、または
    （b3）ANG1およびANG2の発現レベルの比が対照の値と比較して低い
    場合が、当該被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標である、
    前記方法。
  13. 前記（b）工程において、前記被験者の血管新生阻害剤に対する反応性が高いことが予測されており、
    （c）前記被験者の腫瘍組織に由来するサンプル中の、SHC1、IL6、CXCR4、COL4A3、NRP2、MEIS1、ARHGAP22、SCG2、FGF9、PML、FGFR3、FGFR2、FGFR1、FGFR4およびVEGFR1からなる群から選ばれる少なくとも１つの発現レベルを定量する工程をさらに含み、当該定量工程においては、
    （c1）SHC1の発現レベルが、対照の値と比較して低い、
    （c2）NRP2の発現レベルが、対照の値と比較して低い、
    （c3）ARHGAP22の発現レベルが、対照の値と比較して低い、
    （c4）SCG2の発現レベルが、対照の値と比較して低い、
    （c5）PMLの発現レベルが、対照の値と比較して低い、
    （c6）IL6の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    （c7）CXCR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    （c8）COL4A3の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    （c9）MEIS1の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    （c10）FGF9の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    （c11）FGFR3の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    （c12）FGFR2の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    （c13）FGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    （c14）FGFR4の発現レベルが、対照の値と比較して高い、または
    （c15）VEGFR1の発現レベルが、対照の値と比較して高い、
    場合が、当該被験者は血管新生阻害剤に対する反応性が高いことの指標である、請求項１２に記載の方法。
  14. 血管新生阻害剤の投与により腫瘍を罹患する被験者を治療する方法であって、当該被験者は、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法により、当該血管新生阻害剤に対する反応性が高いことが予測されていることを特徴とする、前記方法。
  15. 前記血管新生阻害剤が、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドまたはその薬理学的に許容される塩である、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記血管新生阻害剤が、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドのメシル酸塩である、請求項１５に記載の方法。
  17. 腫瘍を罹患する被験者への投与に使用する医薬を製造するための血管新生阻害剤の使用であって、当該被験者は、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法により、当該血管新生阻害剤に対する反応性が高いことが予測されていることを特徴とする、前記使用。
  18. 前記血管新生阻害剤が、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドまたはその薬理学的に許容される塩である、請求項１７に記載の使用。
  19. 前記血管新生阻害剤が、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドのメシル酸塩である、請求項１７または請求項１８に記載の方法。
  20. 血管新生阻害剤を含む、腫瘍を罹患する被験者の治療用医薬組成物であって、当該被験者は、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法により、当該血管新生阻害剤へ反応する可能性が高いことが予測されていることを特徴とする、前記医薬組成物。
  21. 前記血管新生阻害剤が、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドまたはその薬理学的に許容される塩である、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 前記血管新生阻害剤が、４－（３－クロロ－４－（シクロプロピルアミノカルボニル）アミノフェノキシ）－７－メトキシ－６－キノリンカルボキサミドのメシル酸塩である、請求項２１に記載の方法。
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