WO2012153078A1 - Procede de determination in vitro de la presence d'une sclerose en plaques a forme primitivement progressive - Google Patents

Procede de determination in vitro de la presence d'une sclerose en plaques a forme primitivement progressive Download PDF

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Serge Nataf
Joël Lachuer
Anne WIERINCKX
Géraldine ANDRODIAS-CONDEMINE
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Hospices Civils de Lyon HCL
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Hospices Civils de Lyon HCL
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Definitions

  • the present invention relates to the medical field, and in particular to the diagnosis of multiple sclerosis.
  • MS Multiple sclerosis
  • MS The diagnosis of MS is based on a set of clinical, radiological and biological criteria called "McDonlad criteria" whose last update was in 2010 (Polman CH et al., Ann Neurol 2012, 69: 292-302). In these consensus recommendations, it is recalled that the diagnosis of MS relies mainly on the notion of the spread of lesions in time and space. This dissemination can be optimally demonstrated by nuclear magnetic resonance (MRI) imaging techniques. In addition, the identification of an oligoclonal profile of immunoglobulins in the cerebrospinal fluid (CSF) may be an important element of the diagnosis.
  • MRI nuclear magnetic resonance
  • MS serum marker for MS.
  • diagnosis of MS is based on the combination of clinical (examination and history), radiological (Magnetic Resonance Imaging) and biological (identification of a profile oligoclonal immunoglobulin in the cerebrospinal fluid).
  • radiological Magnetic Resonance Imaging
  • biological identification of a profile oligoclonal immunoglobulin in the cerebrospinal fluid.
  • MS histoneum, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • EDSS Expanded Disability Status Scale
  • a serum marker of scalability would be a useful tool for deciding: (i) the establishment or continuation of background treatments with significant side effects (immunosuppressive treatments in particular), (ii) the frequency with which the clinical and radiological follow-up must be performed.
  • a serum marker of scalability would have a specific interest in the forms initially progressive because the clinical course is most often very slow worsening, difficult to assess by clinical monitoring alone and the radiological activity is low (relative stability over time lesions observed in cerebral MRI) making the MRI not very useful for the progressive follow-up of the disease.
  • any delay in the initial establishment of the diagnosis and / or assessment of the evolution of the disease can be considered as having the consequence of delaying the start of a treatment. potentially effective background.
  • Interferons play a central role in innate and adaptive immune responses. They are grouped into three major families: Type I IFNs, Type II IFNs, and Type III IFNs.
  • Type I IFNs IFN- and IFN- ⁇ are synthesized by various immune cell types (essentially plasmacytoid dendritic cells) or non-immune cells (fibroblasts) in response in particular to any viral infection inducing the stimulation of TLR receptors (Toii-Like). Receptof "). These IFNs cause the synthesis of a set of molecules with antiviral activity among which the molecules IFI44 (interferon-induced protein 44), IRF-1 (interferon responsive factor 1), IRF9 (interferon responsive factor 9) and IFIT3 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3).
  • IFI44 interferon-induced protein 44
  • IRF-1 interferon responsive factor 1
  • IRF9 interferon responsive factor 9
  • IFIT3 interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3
  • IFN type II corresponds to HFN- ⁇ and is mainly synthesized by T-lymphocytes and IMK ⁇ Natural Ki / ief cells) during inflammatory, infectious or neoplastic pathologies.
  • IFN- ⁇ is a potent macrophage activator that induces the synthesis of pro-inflammatory molecules (chemokines, pro-inflammatory cytokines) and surface molecules related to the antigenic presentation (molecules of the major histocompatibility complex, - stimulation).
  • Type III IFNs discovered in the early 2000s, include 3 molecules that are: interferon- ⁇ or IL-29, interferon-2 or IL-28a and interferon-3 or IL-28b (Sheppard et al., 2003, Nat. Immuno., 4: 63-8). These three molecules share a common dimeric structure receptor formed by: i) the IL-10 receptor beta chain (IL-10Rp) and ii) an alpha chain called IL-28R. Like type I IFNs, type III IFNs are primarily synthesized in response to a viral infection and induce the production of anti-viral-like molecules that are similarly induced by type I and type III interferons.
  • type III IFNs and in particular rIL-29, exert a pro-inflammatory activity similar to that of interferon-y (Pekarek et al., 2007, Genes Immun., 8: 177-80. ).
  • the expression of the type III IFN receptor has been demonstrated in various immune or non-immune cell types in mice and humans. Among these, infected neurons, monocytes, macrophages, dendritic cells and epithelial cells can be cited in particular. Despite its important role in the immune response, few studies have investigated the expression of type III IFNs in humans, probably because of the small number of commercial kits currently being developed and their very recent release on the market. available since 2009).
  • the subject of the present invention is a method for determining, in vitro, the presence of a primary progressive multiple sclerosis in a subject, comprising, or even consisting of, the following steps:
  • the detection of a significant variation in the detected level of at least one of the markers of the invention, namely IL-29 or IL-28Ra in the sample to be tested makes it possible to determine the presence of a Primary progressive MS in a subject, and in particular the presence of a progressively progressive MS that is to say, to affirm its evolutionary character, namely the need for the establishment of a background treatment and / or its continuation and / or close monitoring of the clinical and / or radiological evolution.
  • the method of the invention makes it possible to determine the presence of a progressively progressive MS in a subject who is presumed to have this form of MS on the basis of the clinical and / or radiological context.
  • This method therefore makes it particularly possible to confirm a diagnosis that is still uncertain and that has been provisionally established using clinical and / or radiological data, particularly in the case of probable or possible MS with a primitively progressive form.
  • the method of the invention also makes it possible to confirm the presence of a progressively progressive MS (evolutionarily progressive MS), that is to say, a progressively progressive MS that requires the establishment of a background treatment and / or close clinical and / or radiological monitoring.
  • a progressively progressive MS evolutionarily progressive MS
  • the method according to the invention makes it possible to determine the presence of a previously progressive progressive MS in a subject, even if the latter is already under background treatment, such as an immunosuppressive or immunomodulatory treatment.
  • the method according to the invention comprises, or even consists of, the detection of IL-29 in the sample to be tested to determine the presence of a previously progressive MS in a subject, and preferably the presence of a primarily progressive progressive MS.
  • the term “detection” or “detect” means detection in vitro or ex vivo. Moreover, these terms intend to designate both the detection of the presence and / or the quantification of these markers at the nucleic or protein level, but also at the level of the specific activity of these markers. For this purpose, any method of detection and / or quantification well known to those skilled in the art can be used for the implementation of the invention, whether in connection with the determination of the presence and / or expression and / or specific activity of these markers.
  • the detection and / or quantification of these markers is carried out at the nucleic level, and in particular from RNA or cDNA, this can in particular be carried out by PCR analysis, by microarray hybridization or by Northern blot.
  • the detection and / or quantification of these markers is performed at the protein level, standard techniques such as Western blot, ELISA, RIA, IRMA, FIA, CLIA, ECL, flow cytometry or immunocytology can be used.
  • the specific activity of these markers is demonstrated and / or quantified, it may for example be determined by analysis of the capacity of the biological sample tested to inhibit the cytopathic effect exerted by a virus.
  • VSV Vesicular Somatic Virus also called VSV
  • a human cell line sensitive to this virus for example the HEP2 cell line in the case of the VSV virus
  • the detection of the marker (s) is carried out at the protein level, and in particular using the ELISA technique.
  • the present invention relates to the determination of the presence of a progressively progressive MS by means of the process of the invention comprising or even consists of the detection of IL-29 in the sample to be tested, and preferably the detection of IL-29 at the protein level.
  • the present invention relates to a method for the in vitro determination of the presence of a primitively progressive MS in a subject comprising the detection of IL-29 at the protein level in a blood sample, and in particular of serum, or cerebrospinal fluid from said subject.
  • the terms “marker”, “marker of the invention” or “marker of interest” mean any biological material which corresponds to the presence, expression and / or activity of the IL-29 and / or IL-28a.
  • Said biological material may especially consist of proteins, deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA), and especially messenger RNAs.
  • the detection of the marker (s) of interest, IL-29 and / or IL-28Ra is intended to concern the detection of the marker in all its forms of synthesis and / or maturation, which it is variant, precursor, isoform etc, as long as these forms are corresponding marker, that is to say that they can not correspond to another marker.
  • the "marker (s)", “marker (s) of the invention” or “marker (s) of interest” preferably correspond to the reference sequences mentioned below, but also to any sequence which corresponds to another form during the synthesis and / or processing of the marker encoded by these reference sequences, such as variant, precursor, isoform, etc., as long as this sequence is specific to the marker in question.
  • the reference nucleic sequences are the following:
  • IL-29 NCBI reference sequence: NM_172140.1
  • IL-28Ra NCBI reference sequence: NM_170743.2.
  • variant, precursor or isoform are in particular any nucleic sequence which has more than 86% homology with the sequence of which it is homologous, ie the above reference nucleic sequence corresponding to IL-29, and preferably having a homology of at least 90%, at least 95%, at least 98% or at least 99% % with this reference sequence.
  • IL-29 NCBI reference sequence: NP_742152.1
  • -IL-28Ra GenBank reference sequence: ⁇ 01409.1.
  • variant, precursor or isoform are in particular any protein sequence which has more than 95% homology with the sequence of which it is the homologous, ie that is, the above reference protein sequence corresponding to IL-29, and preferably having a homology of at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least minus 99% with this reference sequence.
  • variant, precursor or isoform are in particular any sequence, nucleic or proteinic, which has at least 90% homology with the sequence of which it is homologous, i.e., the respective above-mentioned respective nucleic or protein reference sequences corresponding to IL-28Ra, and preferably having an at least 95% homolog, of at least 97%, of at least at least 98% or at least 99% with these reference sequences.
  • homology refers to the similarity that is calculated by optimal alignment between two sequences.
  • the similarity of a sequence with respect to a reference sequence is assessed as a function of the percentage of residues which are identical or which differ by conservative substitutions, when the two sequences are aligned so as to obtain the maximum of correspondence between them.
  • the percentage of homology can be calculated by those skilled in the art using the methods which are known in the art, and in particular the sequence comparison computer program such as that of the BLAST suite (Altschul et al., Nucleic Acid Research, 1997, 25, 3389-3402).
  • “conservative substitution” is understood to mean any substitution of one base by another which leads to the production of an identical protein in sequence, in particular because of the degeneracy of the genetic code, or any substitution of a residue by another that has similar chemical or physical properties (size, charge, polarity etc.) that generally does not alter the functional properties of the protein.
  • the method of the invention may also include the joint detection of one or more other biomarkers of MS, without this being necessary. to be able to determine the presence of the disease in the context of the invention.
  • the method may include the joint detection of one or more markers of interest according to the invention with one or more other biomarkers of MS known in the art.
  • sample to be tested any biological sample may contain the marker or markers to be detected and from the subject or the patient in whom it is desired to determine the presence of multiple sclerosis.
  • the biological sample to be tested used in the context of the process according to the invention can be of different nature.
  • the biological sample to be tested is chosen from biological fluids such as blood, whole blood (as collected from the venous route, that is to say containing the white and red cells, the platelets and the plasma), serum, plasma, urine, synovial fluid, cerebrospinal fluid, lymph, as well as tissues such as brain tissue or nerve tissue or cells isolated from such tissue, as long as they contain the marker (s) of interest.
  • the biological sample to be tested is selected from blood, and in particular serum, and cerebrospinal fluid.
  • the level of the marker (s) that is detected in the biological sample to be tested is then compared with that detected in a reference sample.
  • the reference sample may be any biological sample derived from a healthy subject or from a pool of healthy subjects, in particular not affected (s) or suspected (s) to be reached ( s) from SEP.
  • the reference sample may also be from the same subject as the one from which the test sample originated but correspond to an earlier stage of the patient's follow-up. For example, performed during a previous sampling as part of the follow-up that is set up for the patient concerned.
  • the reference sample may also consist of any sample, biological or non-biological, which has been previously calibrated to contain an average value of the marker (s) to be detected. is the level that has been detected on a pool of biological samples from healthy subjects or the same subject but corresponding to an earlier stage.
  • the method of the invention may comprise the prior obtaining of this average value, and at which the level that will be detected in the sample to be tested can to be compared in order to determine the presence of a progressively progressive MS according to the invention.
  • the reference sample When it is biological, the reference sample may be of different types and in particular chosen from the biological samples which are mentioned above concerning the sample to be tested (fluid, tissue, cells, etc.).
  • the reference sample which is used according to the invention is a biological sample of the same nature (fluid, tissue, cells, etc.) as that of the biological sample to be tested or of a compatible nature to constitute a reference as to the detection of the markers to be detected.
  • test and reference samples that are compared for the detection of the markers are preferably from persons having the same characteristics or a majority of common characteristics, in particular of the same sex and / or of a similar or identical age, and / or of the same ethnic origin.
  • this sample will obviously be chosen according to the marker (s) tested (s), that is to say that The reference sample will be calibrated for the marker (s) that are to be detected in the sample to be tested.
  • the detection of a significant difference in the detected level of the marker (s) of interest in the sample to be tested compared with that of the reference sample is associated with the presence of a sclerosis. primitively progressive plaques, and thus makes it possible to pose the diagnosis of a certain SEP with primitively progressive form.
  • this difference makes it possible to affirm the evolutionary nature of this form of the disease.
  • the reference sample may also correspond to that of patients with MS considered non-progressive or non-active, and in particular of previously progressive MS considered non-progressive. or non-active on the basis of clinical and / or radiological criteria relevant for this form of the disease.
  • an increase defines both the detection of a significantly higher level in the sample to be tested than that detected in the reference sample or a presence in the sample to be tested by compared to an absence in the reference sample.
  • the observed difference can also be a decrease.
  • a decrease defines both the detection of a significantly lower level in the sample to be tested than that detected in the reference sample or an absence in the sample to be tested by relation to a presence in the reference sample.
  • the detection in the sense of the invention can take both a qualitative and a quantitative aspect.
  • the absence of a marker of interest in one of the samples or the level detected will depend on various factors, including the detection technique used and its sensitivity, the nature of the samples analyzed, the type of detection chosen (protein, nucleic, activity, etc.).
  • a "significantly lower or higher level” may correspond to the absence of detection in the sample tested by comparison with a detectable level in the reference sample or on the contrary with the absence of detection in the reference sample compared to a detectable level in the sample tested.
  • a "significantly lower or higher level” may correspond to a level which is at least a factor 2 lower or higher than the level detected in the reference sample, preferably at least a factor of 3 or less by ratio to the level of expression detected in the reference sample.
  • the demonstration of an increase in the level of IL-29 in the biological sample to be tested relative to the reference sample is associated with the presence of a previously progressively progressive MS. and, preferably, the presence of a progressively progressive MS, particularly for those in whom the diagnosis of certain MS has already been made.
  • the demonstration of a decrease in the level of the IL-28Ra receptor in the biological sample to be tested relative to the reference sample is associated with the presence of a previously progressively progressive MS. and, preferably, the presence of a progressively progressive MS, particularly for those in whom the diagnosis of certain MS has already been made.
  • the method of the invention may be defined as including, or even consisting of, the steps of detecting the presence or increase of the IL-29 level and / or detecting the decrease in the level of IL-29.
  • level of the IL-28Ra receptor or its absence in the biological sample to be tested in relation to the reference sample it being understood that this presence or increase and / or this decrease or absence is (are) associated with the presence of a previously progressive MS, and preferably in the presence of a progressively progressive MS, particularly for those in whom the diagnosis of certain MS is already made.
  • it relates to the use in vitro or ex vivo of a compound or a reagent or a plurality of compounds or reagents capable of specifically detecting a or more than one marker selected from IL-29 and the IL-28R receptor, to determine the presence of a progressively progressive MS, and preferably the presence of a progressively progressive MS, especially for subjects in whom the diagnosis of certain MS is already made.
  • the presence of a previously progressive MS, and preferably the presence of a progressively progressive MS progressively, particularly for subjects in whom the diagnosis of certain MS is already made is determined by the use of in vitro or ex vivo a compound or a reagent or a plurality of compounds or reagents capable (s) specifically detect IL-29.
  • the compounds or reagents capable of specifically detecting one or more of the abovementioned markers particular mention may be made of specific antibodies or fragments or derivatives thereof, for example single chain antibodies Sv, but also peptides. or nucleic acids or fragments thereof such as primers (or primer) or specific pairs of primers which detect and / or amplify the gene corresponding to the chosen marker (s), probes , antisense constructs, RNAi, ribozymes, etc. corresponding to the chosen marker (s).
  • the subject of the present invention is a kit or kit for the in vitro determination of the presence of a primitively progressive multiple sclerosis, and preferably the presence of a progressively progressive MS, especially for subjects with which the diagnosis of certain SEP with primitively progressive form is already posed.
  • This kit includes:
  • one or more compounds or reagents each capable of specifically detecting a marker selected from IL-29 and the IL-2 receptor;
  • the kit of the invention contains at least one compound or reagent capable of specifically detecting IL-29. It may further contain a compound capable of specifically detecting HL-28R.
  • the positive control sample is preferably a biological sample from a patient or pool of patients with initially progressive MS, and preferably with certain MS having a primitively progressive form. It may also correspond to a biological sample derived from one or more patients with a previously progressive progressive MS, and in particular from certain MS with initially progressive form and whose evolutionary character has been confirmed beforehand on the basis of clinical criteria. and / or radiological relevant for this form of the disease.
  • the positive control sample may also consist of any sample, biological or non-biological, which has been previously calibrated to contain an average value of the marker (s) to detect that corresponds to the average level that has been detected on a pool of biological samples from patients with certain MS with initially progressive form or on a pool of biological samples from of patients with certain MS with primitively progressive form and whose evolutionary character was previously confirmed.
  • the negative control sample is in particular a sample which does not contain the chosen marker (s), such as for example a sample of a healthy subject, or a sample, biological or non-biological, for which the detection of the marker (s) (s) chosen is or has been made impossible.
  • the method used to prevent the detection of the marker (s) of interest in the negative control sample will be adapted to the detection method used for the sample to be tested in the process of the invention. .
  • the method used to make it impossible to detect said marker in the negative control sample will be a method to prevent the detection of the protein in question, without however, to prevent the presence of the gene and / or messenger encoding this protein.
  • the method used to make it impossible to detect the activity of this protein in the negative control sample will be a method to render this protein inactive, without preventing the expression of the gene encoding this protein and / or the presence of the protein itself as long as its activity is undetectable.
  • the positive control and negative control samples may be of different natures.
  • the preferred embodiments mentioned above concerning the nature of the test sample and the reference sample are also preferred embodiments for the positive and negative control control samples contained in the kit or kit according to the invention.
  • the kit or kit of the invention is a kit suitable for determining the presence of a previously progressively progressive MS according to the invention.
  • it may further comprise instructions for using the various components of the kit or the kit for determining the presence of a previously progressive MS according to the invention, and preferably a progressively progressive progressive MS.
  • This kit thus makes it possible to determine the presence of a previously progressive MS and preferably the presence of a previously progressive progressive MS, particularly for the subjects in whom the diagnosis of certain MS with a primitively progressive form has already been made.
  • these instructions indicate to what extent the detection of the marker (s) concerned (s) allows to establish the presence of a previously progressive MS according to the invention.
  • these instructions indicate to what extent the detection of a significant difference in the level of the marker (s) detected in the sample to be tested makes it possible to conclude to the presence of a previously progressively progressive MS. preferably in the presence of a progressively progressive MS progressive, especially for those in whom the diagnosis of certain SEP primitively progressive form is already laid, as detailed in particular above concerning the method of the invention.
  • MS patients, n 3
  • MS patients analyzed in this study all have a form considered to be progressive because: i) the immunosuppressive treatment was necessary within 3 years after the sampling; (ii) the worsening rate of disability within 3 years was found to be equal to or greater than that expected for this form of MS, based on known epidemiological data.
  • the cells were then thawed and cultured in the presence of M-CSF (cofony-stimulating macrophage for 7 days.) Then the supernatant cells were removed, thereby obtaining an adherent population of more than 95 cells. % of macrophages (this culture method was validated by immunostaining at least 10 macrophage cultures with the anti-CD11b or anti-CD68 antibodies.) The total mRNAs were then extracted and studied by the technique of "arra gene on the ProfileXpert analysis platform (Molecular Biology Platform of the Federative Institute of Neuroscience of Lyon). The expression level of nearly 30,000 genes could thus be compared between the two groups.
  • M-CSF cofony-stimulating macrophage for 7 days.
  • the comparative analysis of the gene array results obtained in the two groups thus made it possible to identify 194 genes differentially expressed by a factor of at least 2, including 154 genes increased by a factor of at least 2 and 40 decreased genes. by a factor of at least 2 in MS patients compared with controls.
  • IFI44 Interferon-induced protein 44
  • IRF-1 interferon regulatory factor i
  • IFU3 interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats
  • IRF-9 interferon regulatory factor
  • the IL-10 receptor alpha chain is IL-10 receptor-specific and is distinct from the IL-10 receptor beta chain that is shared by several cytokine receptors (receptor). IL-10, type III IFN receptor and IL-22 receptor in particular). Although type I or III IFN genes are increased in MS patients, IFN type I receptors IFNAR1 (interferon alpha, beta and oma receptor 1) and IFNAR2 (interferon alpha, beta and omega receptor 2) are not among the 154 augmented genes.
  • the alpha channel of the IFN receptor III is one of 3 immune genes decreased in MS patients compared to control subjects (Table 1).
  • 3 immune genes are identified: the alpha channel of the IFN receptor type III (IL28Ra), the IL-17E cytokine receptor beta chain (cytokine still called IL-25) and CD61 integrin (Table 1).
  • Ratio> 2 genes whose level of expression is increased by a factor of at least 2)
  • glioblastoma primary malignant brain tumor with an inflammatory reaction
  • MS following a background treatment at the time of collection (Cellcept, Endoxan, Methotrexate, Endoxan, Imurel).
  • LIF a was found to be detectable in 2 out of 10 patients with neuroinflammatory pathology other than MS (11 ⁇ g / ml, 9 ⁇ g / ml), in 3 out of 40 healthy controls (14 ⁇ g / ml, 305 ⁇ g / ml, 21 ⁇ g / ml) and in 2 out of 12 patients with a primitively progressive form, following treatment at the time of sampling (69 ⁇ g / ml, 19 ⁇ g / ml) (Table 2).
  • L1L-29 was found to be detectable in one out of 50 healthy control subjects will be tested (2364 pg / ml), in 3 out of 16 patients with a primitively progressive form of MS, without treatment at the time of collection (290 pg / ml , 396 ⁇ g / ml, 478 ⁇ g / ml) and in 3 out of 12 patients with a primitively progressive form of MS, following a baseline treatment at the time of sampling (349 ⁇ g / ml, 173 ⁇ g / ml, 190 ⁇ g / ml). ml) (Table 3).
  • IL-29 is a serum diagnostic marker for early-stage MS, regardless of whether patients are receiving treatment at the time of collection;
  • IL-28 is not detectable in primitively progressive MS and therefore can not be used as a diagnostic marker for these forms of MS;
  • IIFIMa is detectable in the initially progressive forms of MS but is also detectable in a significant percentage of healthy control subjects (7.5%) or patients with neuroinflammatory diseases other than MS (20%); IFNa can not therefore be used as a diagnostic marker for initially progressive MS;
  • IL-29 can be used as a scalability marker in initially progressive MS patients following DMARD.
  • the measurement of IL-29 in the blood can therefore be used as a diagnostic marker or as a marker of progression of MS in primitively progressive form.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de détermination in vitro de la présence d'une sclérose en plaques primitivement progressive chez un sujet, comprenant la détection de I'IL-29 et/ou du récepteur IL-28Rα dans un échantillon biologique à tester issu dudit sujet et la comparaison du niveau détecté avec celui d'un échantillon de référence. Elle concerne également l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un ou de plusieurs composé(s) capable(s) de détecter spécifiquement l'IL-29 et/ou le récepteur IL-28Rα, pour déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive, ainsi que des kits comprenant de tel(s) composé(s).

Description

PROCEDE DE DETERMINATION IN VITRO DE LA PRESENCE D'UNE SCLEROSE EN PLAQUES A FORME PRIMITIVEMENT PROGRESSIVE
La présente invention concerne le domaine médical, et notamment le diagnostic de la sclérose en plaques.
La sclérose en plaques (SEP) est une pathologie inflammatoire démyélinisante du système nerveux central touchant préférentiellement l'adulte jeune. L'étiologie de la SEP reste actuellement inconnue bien que l'existence de mécanismes autoimmuns soit largement admise. L'hypothèse d'une origine virale de la SEP est régulièrement avancée mais aucune preuve formelle n'a pu être apportée dans ce sens. Le plus souvent, cette maladie évolue initialement par poussées partiellement ou totalement régressives : on parle de forme rémittente de la SEP. Toutefois, chez environ un tiers des patients, une évolution lentement progressive fait suite à la phase rémittente et conduit à un handicap neurologique majeur : on parle de forme secondairement progressive. L'évolution bénigne des formes rémittentes de la SEP est possible (une seule poussée sans séquelles puis aucune autre manifestation) alors qu'elle est très rare dans les formes dites secondairement progressives. Par ailleurs, 10 à 15 % des patients développent une forme d'emblée progressive : on parle alors de SEP primitivement progressive.
Le diagnostic de SEP se base sur un ensemble de critères cliniques, radiologiques et biologiques dits "critères de McDonlad" dont la dernière réactualisation remonte à 2010 (Polman CH. et. al., Ann Neurol 2012, 69 : 292-302). Dans ces recommandations de consensus, on rappelle que le diagnostic de SEP repose principalement sur la notion de dissémination des lésions dans le temps et dans l'espace. Cette dissémination peut être démontrée de manière optimale par les techniques d'imagerie par résonance magnétique nucléaire (IRM). Par ailleurs, la mise en évidence d'un profil oligoclonal des immunoglobulines dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) peut constituer un élément important du diagnostic. Ces recommandations stipulent que la maladie de Devic (neuromyélite optique), longtemps considérée comme une forme particulière de SEP, doit aujourd'hui être reconnue comme une entité distincte de la SEP, diagnostiquée sur la base de critères spécifiques tels que, en particulier, la présence dans le sang d'auto- anticorps anti-Aquaporine 4.
Il n'existe pas actuellement de marqueur sérique de la SEP. Lors des premières manifestations cliniques, et quelle que soit la forme clinique de SEP, le diagnostic de SEP repose donc sur la combinaison d'éléments cliniques (examen et anamnèse), radiologique (Imagerie par Résonance Magnétique) et biologique (identification d'un profil oligoclonal des immunoglobulines dans le liquide céphalo-rachidien). Toutefois, il est relativement fréquent qu'une incertitude diagnostique persiste, notamment dans les cas de SEP primitivement progressive.
En effet, les formes primitivement progressives présentent un certain nombre de caractéristiques cliniques, radiologiques et biologiques les distinguant des formes rémittentes de SEP (Miller and Leary, 2007, Lancet Neurol., 8 : 903-912) : i) le début clinique de ces formes est généralement insidieux, il est plus tardif, l'évolution clinique est lentement progressive et, le plus souvent, sans poussée surajoutée, ii) le terrain est différent (sujets plus âgés, sex ratio équilibré alors qu'il est déséquilibré en défaveur des femmes dans les formes rémittentes ou secondairement progressives avec deux fois plus de femmes atteintes), iii) les anomalies ou lésions observées en imagerie cérébrale (IRM) sont habituellement peu nombreuses et moins marquées que dans les formes rémittentes ou secondairement progressives, iv) dans le LCR, le profil oligoclonal des immunoglobulines est parfois absent, rendant le diagnostic difficile à établir. Il est donc recommandé que le diagnostic de SEP primitivement progressive repose sur des critères spécifiques. Ceux-ci incluent notamment la constatation que la maladie est cliniquement parlante depuis une période d'au moins un an.
Quelle que soit la forme de SEP considérée (rémittente, secondairement progressive ou primitivement progressive), les scores obtenus aux critères cliniques, biologiques et IRM de la SEP permettent de distinguer les SEP certaines, des SEP probables ou des SEP possibles. Le diagnostic de SEP est considéré comme certain si les critères de McDonald sont respectés. Si seulement une partie des critères est respectée on parle de SEP possible ou, pour certains auteurs, de SEP probable. Cette incertitude diagnostique à une incidence importante sur la qualité de la prise en charge thérapeutique des patients à SEP probable ou possible.
Outre les potentielles difficultés diagnostiques, le suivi thérapeutique des patients atteints de SEP est rendu difficile par l'absence de marqueur sérique permettant d'apprécier l'évoiutivité ou l'activité de la maladie, à savoir la présence d'une SEP évolutive ou SEP active, c'est-à- dire d'une SEP qui nécessite un traitement de fond et/ou une surveillance étroite de l'évolution clinique et radiologique. En effet, quelle que soit la forme clinique de SEP (rémittente, secondairement progressive ou primitivement progressive), un large spectre d'évolution peut être observé, avec, aux deux extrêmes : i) les SEP peu ou pas évolutives qui sont très peu ou pas invalidantes malgré un temps d'évolution prolongé, ii) les SEP très évolutives qui se caractérisent par un handicap sévère d'installation rapide sur quelques mois ou années. Les critères d'évolutivité les plus souvent utilisés sont les suivants : i) la progression du score clinique EDSS (« Expanded Disability Status Scale ») en dehors des phases de poussées, ii) le nombre élevé de lésions nouvelles observées en IRM par rapport à un examen de référence, iii) le nombre élevé de lésions "actives" observées en IRM après injection de Gadolinium (on parle de lésions « réhaussées » par le Gadolinium).
En particulier, un marqueur sérique d'évolutivité serait un outil utile pour décider : i) de la mise en place ou de la poursuite de traitements de fonds aux effets secondaires importants (traitements immunosuppresseurs en particulier), ii) de la fréquence à laquelle le suivi clinique et radiologique doit être réalisé. Par ailleurs, un tel marqueur sérique d'évolutivité présenterait un intérêt spécifique dans les formes primitivement progressives car l'évolution clinique y est le plus souvent d'aggravation très lente, difficilement évaluable par le seul suivi clinique et l'activité radiologique y est faible (relative stabilité dans le temps des lésions observées en IRM cérébrale) rendant l'IRM peu utile au suivi évolutif de la maladie. Ainsi, dans les formes primitivement progressives, on peut considérer que tout retard à l'établissement initial du diagnostic et/ou à l'évaluation de l'évolutivité de la maladie peut avoir pour conséquence un retard à la mise en route d'un traitement de fond potentiellement efficace.
En conséquence, chez les patients à SEP certaine, l'absence de marqueur biologique signant la présence d'une SEP évolutive, limite les possibilités d'ajustement des traitements actuellement disponibles ; le problème se posant de manière particulièrement aiguë pour les SEP à forme primitivement progressive compte tenu de ses particularités clinique et radiologique.
Il existe donc un réel besoin clinique de marqueur(s) sérique(s) permettant de déterminer la présence d'une SEP qui, éventuellement associés aux critères existants, permettraient d'établir : i) la présence d'une SEP de manière certaine, notamment chez les patients pour lesquels une SEP probable ou possible a été définie sur la base des critères radiologiques et/ou cliniques existants, et en particulier dans les cas de SEP à forme primitivement progressive (SEP dont le diagnostic est le plus difficile à établir) ii) le caractère évolutif de la SEP chez des patients à SEP certaine, notamment chez les patients présentant une forme primitivement ou secondairement progressive.
Dans ce contexte, de nombreuses études ont tenté d'analyser la présence d'un ensemble de cytokines dans le sérum de patients SEP et de sujets contrôles présentant des pathologies neurologiques autres que la SEP. Jusqu'alors, aucune de ces études n'a permis d'identifier une cytokine ou un groupe de cytokines dont la présence dans le sang signerait la présence d'une SEP de manière certaine, dès la phase initiale de la maladie, en particulier dans les cas de formes primitivement progressive.
A ce jour, il n'existe donc pas de marqueur biologique sanguin pour déterminer la présence d'une sclérose en plaques de manière certaine, en particulier dans les cas de formes primitivement progressive, ni pour déterminer le caractère évolutif de cette maladie. C'est dans ce contexte que les inventeurs ont découvert ce qui fait l'objet de la présente invention.
Les Interférons (IFIMs) jouent un rôle central dans les réponses immunes innées et adaptatives. Ils sont regroupés au sein de trois grandes familles : les IFNs de type I, I1FN de type II et les IFNs de types III.
Les IFNs de type I (IFN- et IFN-β) sont synthétisés par différents types cellulaires immuns (cellules dendritiques plasmacytoïdes essentiellement) ou non immuns (fibroblastes) en réponse notamment à toute infection virale induisant la stimulation de récepteurs TLR {"Toii-Like Receptof"). Ces IFNs provoquent la synthèse d'un ensemble de molécules à activité antivirale parmi lesquelles les molécules IFI44 {interferon- induced protein 44), IRF-1 {interferon responsive factor 1), IRF9 {interferon responsive factor 9) et IFIT3 {interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3).
L'IFN de type II correspond à HFN-γ et est principalement synthétisé par les lymphocytes-T et les cellules IMK ^Natural Ki/ief) au cours de pathologies inflammatoires, infectieuses ou néoplasiques. L'IFN- y est un puissant activateur macrophagique qui induit la synthèse de molécules pro-inflammatoires (chémokines, cytokines pro-inflammatoires) et de molécules de surface en rapport avec la présentation antigénique (molécules du complexe majeur d'histocompatibilité, molécules de co- stimulation).
Les IFNs de type III, découverts au début des années 2000, regroupent 3 molécules qui sont : l'interféron-λΐ ou IL-29, l'interféron^2 ou IL-28a et l'interféron^3 ou IL-28b (Sheppard et al., 2003, Nat. Immuno., 4 :63-8). Ces trois molécules partagent un récepteur commun de structure dimérique formé par : i) la chaîne beta du récepteur à l'IL-10 (IL-10Rp) et ii) une chaîne alpha nommée IL-28R . Comme les IFNs de type I, les IFNs de type III sont principalement synthétisés en réponse à une infection virale et induisent la production de molécules à propriété anti-virale qui sont similairement induites par les interférons de type I et de type III. Par ailleurs, les IFNs de type III, et en particulier riL-29, exercent une activité pro-inflammatoire présentant des analogies avec celle de l'Interféron-y (Pekarek et al., 2007, Gènes Immun., 8 : 177-80). L'expression du récepteur aux IFNs de type III a été mise en évidence dans différents types cellulaires immuns ou non immuns chez la souris et chez l'homme. Parmi ceux-ci, les neurones infectés, les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques et les cellules épithéliales peuvent notamment être cités. Malgré son rôle important dans la réponse immune, peu de travaux ont étudié l'expression des IFNs de type III chez l'homme, sans doute en raison du faible nombre de kits commerciaux actuellement développés et de leur très récente mise sur le marché (kits disponibles depuis 2009). A la connaissance des inventeurs, l'existence d'une élévation sérique d'un IFN de type III au cours d'une pathologie humaine a été mise en évidence, par exemple dans le cas de l'IL-29, chez les patients présentant une allergie respiratoire (rhinite ou asthme), ou chez des patients souffrants de lupus érythémateux disséminé (LED).
Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de détermination in vitro de la présence d'une sclérose en plaques primitivement progressive chez un sujet, comprenant, voire consistant en, les étapes suivantes :
a) détection d'un ou de plusieurs marqueur(s) choisi(s) parmi l'IL-29 et le récepteur IL-28Ra, dans un échantillon biologique à tester issu dudit sujet,
b) comparer le niveau détecté avec celui d'un échantillon de référence ; la mise en évidence d'une différence significative de niveau détecté dans l'échantillon à tester par rapport à celui de l'échantillon de référence étant associée à la présence d'une sclérose en plaques primitivement progressive chez ledit sujet.
La mise en évidence d'une variation significative dans le niveau détecté d'au moins un des marqueurs de l'invention, à savoir I1L-29 ou l'IL-28Ra dans l'échantillon à tester permet de déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive chez un sujet, et en particulier la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, c'est-à-dire d'en affirmer le caractère évolutif, à savoir la nécessité de la mise en place d'un traitement de fond et/ou de sa poursuite et/ou d'une surveillance étroite de l'évolution clinique et/ou radiologique.
Le procédé de l'invention permet en particulier de déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive chez un sujet dont on suppose qu'il est atteint de cette forme de SEP sur la base du contexte clinique et/ou radiologique. Ce procédé permet donc tout particulièrement de confirmer un diagnostic encore incertain qui aurait été provisoirement établi en utilisant les données cliniques et/ou radiologiques, notamment dans le cas de SEP probable ou possible à forme primitivement progressive.
De plus, dans le cas de sujets ayant déjà eu des symptômes ou signes cliniques de la maladie, le procédé de l'invention permet également de confirmer la présence d'une SEP primitivement progressive à caractère évolutif (SEP primitivement progressive évolutive), c'est-à-dire d'une SEP primitivement progressive qui nécessite la mise en place d'un traitement de fond et/ou d'un suivi clinique et/ou radiologique étroit.
Ainsi, l'expression « déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive ou d'une SEP à forme primitivement progressive» ou « présence d'une SEP primitivement progressive ou d'une SEP à forme primitivement progressive» selon l'invention définit à la fois :
i) la mise en évidence d'une SEP primitivement progressive de manière certaine (SEP certaine à forme primitivement progressive), et notamment chez les patients pour lesquels une SEP primitivement progressive probable ou possible a été définie sur la base des critères radiologiques et/ou cliniques existants, et
ii) la mise en évidence du caractère évolutif de la SEP primitivement progressive (SEP primitivement progressive évolutive) chez des patients dont on sait déjà qu'ils sont atteints d'une SEP certaine à forme primitivement progressive.
D'une manière générale, le procédé selon l'invention permet de déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive chez un sujet, même si celui-ci est déjà sous traitement de fond, comme par exemple un traitement immunosuppresseur ou immunomodulateur.
De manière préférée, le procédé selon l'invention comprend, voire consiste en, la détection de l'IL-29 dans l'échantillon à tester pour déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive chez un sujet, et de préférence la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive.
Au sens de la présente invention, le terme « détection » ou « détecter» signifie une détection in vitro ou ex-vivo. Par ailleurs, ces termes entendent désigner à la fois la mise en évidence de la présence et/ou la quantification de ces marqueurs au niveau nucléique ou au niveau protéique, mais également au niveau de l'activité spécifique de ces marqueurs. A cet effet, toute méthode de détection et/ou de quantification bien connue de l'homme du métier peut être utilisée pour la mise en œuvre de l'invention, que ce soit en rapport avec la détermination de la présence et/ou de l'expression et/ou de l'activité spécifique de ces marqueurs. En particulier, lorsque la détection et/ou la quantification de ces marqueurs est réalisée au niveau nucléique, et en particulier à partir d'ARN ou d'ADNc, celle-ci peut notamment être réalisée par analyse PCR, par hybridation micro-arrays ou Northern-blot. Lorsque la détection et/ou la quantification de ces marqueurs est réalisée au niveau protéique, les techniques standards telles que le Western-Blot, ELISA, RIA, IRMA, FIA, CLIA, ECL, cytométrie de flux ou immunocytologie peuvent être utilisées. Lorsque c'est l'activité spécifique de ces marqueurs qui est mise en évidence et/ou quantifiée, celle-ci pourra par exemple être déterminée par analyse de la capacité de l'échantillon biologique testé à inhiber l'effet cytopathique exercé par un virus (par exemple le Vesicular Somatic Virus aussi nommé VSV) sur une lignée cellulaire humaine sensible à ce virus (par exemple la lignée cellulaire HEP2 dans le cas du virus VSV) tel que décrit par Olivier et al., 2009, J Immunol Methods, vol. 351, p.41-45.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la détection du ou des marqueurs est réalisée au niveau protéique, et en particulier à l'aide de la technique ELISA.
De manière particulièrement avantageuse, la présente invention concerne la détermination de la présence d'une SEP primitivement progressive à l'aide du procédé de l'invention comprenant, voire consiste en, la détection de I1L-29 dans l'échantillon à tester, et de préférence la détection de l'IL-29 au niveau protéique.
De manière encore plus préférée, la présente invention concerne un procédé de détermination in vitro de la présence d'une SEP primitivement progressive chez un sujet comprenant la détection de l'IL- 29 au niveau protéique dans un échantillon de sang, et en particulier de sérum, ou du liquide céphalo-rachidien issu dudit sujet.
Au sens de la présente invention, les termes et expressions « marqueur », « marqueur de l'invention » ou « marqueur d'intérêt » désigne tout matériel biologique qui correspond à la présence, l'expression et/ou l'activité de l'IL-29et/ou de l'IL-28 a. Ledit matériel biologique peut notamment consister en des protéines, de l'acide désoxyribonucléique (ADN) ou de l'acide ribonucléique (ARN), et notamment des ARN messagers.
Dans le cadre de l'invention, la détection du ou des marqueur(s) d'intérêt, IL-29 et/ou IL-28Ra, entend concerner la détection du marqueur sous toutes ses formes de synthèse et/ou de maturation, que ce soit variant, précurseur, isoforme etc, du moment que ces formes sont spécifiques du marqueur concerné correspondant, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent correspondre à un autre marqueur.
Ainsi, pour la présente invention, le ou les « marqueur(s) », « marqueur(s) de l'invention » ou « marqueur(s) d'intérêt » correspondent de préférence aux séquences de référence mentionnées ci- dessous, mais également à toute séquence qui correspond à une autre forme lors de la synthèse etyou de la maturation du marqueur codé par ces séquences de références, telle que variant, précurseur, isoforme etc, tant que cette séquence est spécifique du marqueur en question.
Pour les différents marqueurs selon l'invention, les séquences nucléiques de référence sont les suivantes :
-IL-29 : séquence de référence NCBI: NM_172140.1, et
-IL-28Ra : séquence de référence NCBI: NM_170743.2.
S'agissant de I1L-29 en particulier, des exemples de « variant, précurseur ou isoforme » sont notamment toute séquence nucléique qui présente plus de 86 % d'homologie avec la séquence dont elle est l'homologue, c'est-à-dire la séquence nucléique de référence ci-dessus correspondant à l'IL-29, et de préférence qui présente une homologie d'au moins 90 %, d'au moins 95 %, d'au moins 98 % ou d'au moins 99 % avec cette séquence de référence.
Pour les différents marqueurs selon l'invention, les séquences protéiques de référence sont les suivantes :
-IL-29 : séquence de référence NCBI: NP_742152.1, et
-IL-28Ra : séquence de référence GenBank: ΑΑΙ01409.1.
S'agissant de l'IL-29 en particulier, des exemples de « variant, précurseur ou isoforme » sont notamment toute séquence protéique qui présente plus de 95 % d'homologie avec la séquence dont elle est l'homologue, c'est-à-dire la séquence protéique de référence ci-dessus correspondant à l'IL-29, et de préférence qui présente une homologie d'au moins 96 %, d'au moins 97 %, d'au moins 98 % ou d'au moins 99 % avec cette séquence de référence. S'agissant de l'IL-28R en particulier, des exemples de « variant, précurseur ou isoforme » sont notamment toute séquence, nucléique ou protéique, qui présente au moins 90 % d'homologie avec la séquence dont elle est l'homologue, c'est-à-dire les séquences nucléique ou protéique de référence respectives ci-dessus correspondant à l'IL-28Ra, et de préférence qui présente une homologte d'au moins 95 %, d'au moins 97 %, d'au moins 98 % ou d'au moins 99 % avec ces séquences de référence.
Le terme « homologie » se réfère à la similarité qui est calculée par alignement optimal entre deux séquences. La similarité d'une séquence par rapport à une séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus qui sont identiques ou qui diffèrent par des substitutions conservatives, lorsque les deux séquences sont alignées de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles.
Le pourcentage d'homologie peut être calculé par l'homme du métier en utilisant les méthodes qui sont connues dans le domaine, et en particulier le programme informatique de comparaison de séquences tel que celui de la suite BLAST (Altschul et al., Nucleic Acid Research, 1997, 25, 3389-3402).
Au sens de la présente invention, on entend par « substitution conservative », toute substitution d'une base par une autre qui conduit à l'obtention d'une protéine identique en séquence, en particulier du fait de la dégénérescence du code génétique, ou toute substitution d'un résidu par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge, polarité etc) qui généralement ne modifie pas les propriétés fonctionnelles de la protéine.
En plus de la détection d'un ou de plusieurs des marqueurs d'intérêt, le procédé de l'invention peut également comprendre la détection conjointe d'un ou de plusieurs autres marqueurs biologiques de la SEP, sans que cela ne soit pour autant nécessaire pour pouvoir déterminer la présence de la maladie dans le cadre de l'invention. Ainsi, le procédé peut comprendre la détection conjointe d'un ou de plusieurs marqueurs d'intérêt selon l'invention avec un ou plusieurs autres marqueurs biologiques de la SEP connu(s) dans le domaine.
Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon à tester », tout échantillon biologique susceptible de contenir le ou les marqueurs à détecter et provenant du sujet ou du patient chez qui on souhaite déterminer la présence d'une sclérose en plaques.
Par conséquent, l'échantillon biologique à tester utilisé dans le cadre du procédé selon l'invention peut être de différente nature. En particulier, l'échantillon biologique à tester est choisi parmi les fluides biologiques tels que le sang, le sang total (tel que collecté de la voie veineuse, c'est-à-dire contenant les cellules blanches et rouges, les plaquettes et le plasma), le sérum, le plasma, l'urine, le liquide synovial, le liquide céphalo-rachidien, la lymphe, ainsi que les tissus tels que le tissu cérébral ou le tissu nerveux ou encore des cellules isolées à partir d'un tel tissu, du moment qu'elles contiennent le ou les marqueurs d'intérêt.
De préférence, l'échantillon biologique à tester est choisi parmi le sang, et en particulier le sérum, et le liquide céphalo-rachidien.
Le niveau du ou des marqueurs qui est détecté dans l'échantillon biologique à tester est alors comparé à celui détecté dans un échantillon de référence.
Dans le cadre de l'invention, l'échantillon de référence peut être tout échantillon biologique issu d'un sujet sain ou d'un pool de sujets sains, en particulier non atteint(s) ou suspecté(s) d'être atteint(s) de SEP. L'échantillon de référence peut également être issu du même sujet que celui dont est issu l'échantillon à tester mais correspondre à un stade antérieur du suivi du patient. Par exemple, effectué lors d'un prélèvement précédent dans le cadre du suivi qui est mis en place pour le patient concerné.
L'échantillon de référence peut également être constitué par tout échantillon, biologique ou non biologique, qui a été préalablement calibré pour contenir une valeur moyenne du ou des marqueur(s) à détecter qui correspond au niveau qui a été détecté sur un pool d'échantillons biologiques issus de sujets sains ou du même sujet mais correspondant à un stade antérieur. Ainsi, avant la détection du ou des marqueurs proprement dite dans l'échantillon à tester, le procédé de l'invention peut comprendre l'obtention préalable de cette valeur moyenne, et à laquelle le niveau qui sera détecté dans l'échantillon à tester pourra être comparé afin de déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive selon l'invention.
Lorsqu'il est biologique, l'échantillon de référence peut être de différentes natures et notamment choisi parmi les échantillons biologiques qui sont mentionnés ci-dessus concernant l'échantillon à tester (fluide, tissu, cellules, etc). De préférence, l'échantillon de référence qui est utilisé selon l'invention est un échantillon biologique de même nature (fluide, tissu, cellules etc) que celui de l'échantillon biologique à tester ou d'une nature compatible pour constituer une référence quant à la détection des marqueurs à détecter.
En outre, les échantillons à tester et de référence qui sont comparés pour la détection des marqueurs sont de préférence issus de personnes ayant les mêmes caractéristiques ou une majorité de caractéristiques communes, notamment du même sexe et/ou d'un âge similaire ou identique et/ou de même origine ethnique.
Dans le cas de l'utilisation d'un échantillon de référence préalablement calibré comme indiqué ci-dessus, cet échantillon sera bien évidemment choisi en fonction du ou des marqueur(s) testé(s), c'est-à- dire que l'échantillon de référence sera calibré pour le ou les marqueur(s) que l'on cherche à détecter dans l'échantillon à tester.
Selon l'invention, la mise en évidence d'une différence significative de niveau détecté du ou des marqueurs d'intérêt dans l'échantillon à tester par rapport à celui de l'échantillon de référence est associée à la présence d'une sclérose en plaques primitivement progressive, et permet ainsi de poser le diagnostic d'une SEP certaine à forme primitivement progressive. De manière préférée, cette différence permet d'affirmer le caractère évolutif de cette forme de la maladie. Dans ce cas particulier, et en plus de ceux mentionnés ci-dessus, l'échantillon de référence peut également correspondre à celui de patients atteints de SEP jugée non- évolutive ou non-active, et en particulier de SEP primitivement progressive jugée non-évolutive ou non-active sur ia base des critères cliniques et/ou radiologiques pertinents pour cette forme de la maladie.
La différence observée lors de la mise en œuvre du procédé de l'invention peut être une augmentation. Dans le cadre de l'invention, une augmentation définit à la fois la détection d'un niveau significativement supérieur dans l'échantillon à tester par rapport à celui détecté dans l'échantillon de référence ou bien une présence dans l'échantillon à tester par rapport à une absence dans l'échantillon de référence.
La différence observée peut également être une diminution. Dans le cadre de l'invention, une diminution définit à la fois la détection d'un niveau significativement inférieur dans l'échantillon à tester par rapport à celui détecté dans l'échantillon de référence ou bien une absence dans l'échantillon à tester par rapport à une présence dans l'échantillon de référence.
Ainsi, et comme mentionné ci-dessus, la détection au sens de l'invention peut aussi bien revêtir un aspect qualitatif que quantitatif.
Cependant, il est à noter que l'absence de différence significative du niveau détecté dans l'échantillon à tester par rapport à l'échantillon de référence ne permet pas d'exclure l'existence d'une SEP primitivement progressive, évolutive ou non chez le sujet testé.
Bien évidemment, l'absence d'un marqueur d'intérêt dans un des échantillons ou le niveau détecté dépendra de différents facteurs, et notamment de la technique de détection utilisée et de sa sensibilité, de la nature des échantillons analysés, du type de détection choisi (protéique, nucléique, activité, etc).
Dans le cadre de l'invention, un « niveau significativement inférieur ou supérieur » peut correspondre à l'absence de détection dans l'échantillon testé par comparaison à un niveau détectable dans l'échantillon de référence ou au contraire à l'absence de détection dans l'échantillon de référence par comparaison à un niveau détectable dans l'échantillon testé. Alternativement, un « niveau significativement inférieur ou supérieur » peut correspondre à un niveau inférieur ou supérieur d'au moins un facteur 2 par rapport au niveau détecté dans l'échantillon de référence, de préférence inférieur ou supérieur d'au moins un facteur 3 par rapport au niveau d'expression détecté dans l'échantillon de référence.
Selon une variante préférée de l'invention, la mise en évidence d'une augmentation du niveau d'IL-29 dans l'échantillon biologique à tester par rapport à l'échantillon de référence est associée à la présence d'une SEP primitivement progressive, et de préférence à la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé.
Selon une autre variante de la présente invention, la mise en évidence d'une diminution du niveau du récepteur IL-28Ra dans l'échantillon biologique à tester par rapport à l'échantillon de référence est associée à la présence d'une SEP primitivement progressive, et de préférence à la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé.
Selon encore une autre variante, le procédé de l'invention peut être défini comme comprenant, voire consistant en, les étapes de détection de la présence ou de l'augmentation du niveau d'IL-29 et/ou de détection de la diminution du niveau du récepteur IL-28Ra ou de son absence dans l'échantillon biologique à tester par rapport à l'échantillon de référence, étant entendu que cette présence ou augmentation et/ou cette diminution ou absence est(sont) associée(s) à la présence d'une SEP primitivement progressive, et de préférence à la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé. Selon un autre aspect de l'invention, celle-ci a pour objet l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un composé ou d'un réactif ou d'une pluralité de composés ou de réactifs capable(s) de détecter spécifiquement un ou plusieurs marqueur(s) choisi(s) parmi l'IL-29 et le récepteur IL-28R , pour déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive, et de préférence la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé.
Selon un mode de réalisation préférée, la présence d'une SEP primitivement progressive, et de préférence la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé, est déterminée par l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un composé ou d'un réactif ou d'une pluralité de composés ou de réactifs capable(s) de détecter spécifiquement l'IL-29.
Parmi les composés ou réactifs capable(s) de détecter spécifiquement un ou plusieurs des marqueurs susmentionnés, on peut notamment citer des anticorps spécifiques ou des fragments ou dérivés de ceux-ci, par exemple des anticorps « single chain » Sv, mais aussi des peptides ou encore des acides nucléiques ou des fragments de ceux-ci tels que des amorces (ou primer) ou couples d'amorces spécifiques qui détectent et/ou amplifient le gène correspondant au(x) marqueurs(s) choisi(s), des sondes, des constructions anti-sens, des ARNi, des ribozymes etc correspondant au(x) marqueurs(s) choisi(s).
Les modes de réalisation préférés qui sont mentionnés ci-dessus concernant le procédé constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant de cette utilisation.
Selon un dernier aspect, la présente invention a pour objet une trousse ou kit pour la détermination in vitro de la présence d'une sclérose en plaques primitivement progressive, et de préférence la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine à forme primitivement progressive est déjà posé.
Cette trousse comprend :
- un ou plusieurs composés ou réactifs capable(s) chacun de détecter spécifiquement un marqueur choisi(s) parmi l'IL-29 et le récepteur IL-
28Ra,
- un échantillon témoin positif, et éventuellement
- un échantillon témoin négatif.
Les modes de réalisation préférés qui sont mentionnés ci-dessus concernant le ou les composés ou réactifs capable(s) de détecter spécifiquement le ou les marqueur(s) d'intérêt constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant de la trousse ou kit selon l'invention.
En particulier, le kit de l'invention contient au moins un composé ou réactif capable de détecter spécifiquement I1L-29. Il peut en outre contenir un composé capable de détecter spécifiquement HL-28R .
L'échantillon témoin positif est de préférence un échantillon biologique issu d'un patient ou d'un pool de patients atteints de SEP primitivement progressive, et de préférence atteints de SEP certaine à forme primitivement progressive. Il peut également correspondre à un échantillon biologique issu d'un ou de plusieurs patients atteints d'une SEP primitivement progressive évolutive, et en particulier de SEP certaine à forme primitivement progressive et dont le caractère évolutif a été préalablement confirmé sur la base des critères cliniques et/ou radiologiques pertinents pour cette forme de la maladie.
De même que pour l'échantillon de référence mentionné ci-dessus, l'échantillon témoin positif peut également être constitué par tout échantillon, biologique ou non biologique, qui a été préalablement calibré pour contenir une valeur moyenne du ou des marqueur(s) à détecter qui correspond au niveau moyen qui a été détecté sur un pool d'échantillons biologiques issus de patients atteints de SEP certaine à forme primitivement progressive ou sur un pool d'échantillons biologiques issus de patients atteints de SEP certaine à forme primitivement progressive et dont le caractère évolutif a été préalablement confirmé.
L'échantillon témoin négatif est en particulier un échantillon qui ne contient pas le ou les marqueurs) choisi(s), comme par exemple un échantillon de sujet sain, ou un échantillon, biologique ou non biologique, pour lequel la détection du ou des marqueur(s) choisi(s) est ou a été rendue impossible. Dans ce cas, la méthode utilisée pour empêcher la détection du ou des marqueur(s) d'intérêt dans l'échantillon témoin négatif sera adaptée à la méthode de détection utilisée pour l'échantillon à tester dans le cadre du procédé de l'invention. Par exemple, si le marqueur d'intérêt est détecté pour sa présence au niveau protéique, la méthode utilisée pour rendre impossible la détection dudit marqueur dans l'échantillon témoin négatif sera une méthode permettant d'empêcher la détection de la protéine en question, sans pour autant empêcher la présence du gène et/ou du messager codant cette protéine. De même, si le marqueur d'intérêt est détecté pour la mise en évidence de l'activité d'une protéine, alors la méthode utilisée pour rendre impossible la détection de l'activité de cette protéine dans l'échantillon témoin négatif sera une méthode permettant de rendre cette protéine inactive, sans pour autant empêcher l'expression du gène codant cette protéine et/ou la présence de la protéine elle-même tant que son activité est indétectable.
Les échantillons témoins positif et témoin négatif peuvent être de différentes natures. Sur ce point, les modes de réalisation préférés qui sont mentionnés ci-dessus concernant la nature de l'échantillon à tester et de l'échantillon de référence constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant des échantillons témoins positif et témoin négatif contenus dans la trousse ou kit selon l'invention.
Le kit ou trousse de l'invention est un kit apte et destiné à la détermination de la présence d'une SEP primitivement progressive selon l'invention. Ainsi, il peut en outre comprendre des instructions d'utilisation des différents constituants du kit ou de la trousse permettant de déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive selon l'invention, et de préférence d'une SEP primitivement progressive évolutive. Cette trousse permet donc de déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive et de préférence la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine à forme primitivement progressive est déjà posé.
En particulier, ces instructions indiquent dans quelle mesure la détection du ou des marqueur(s) concerné(s) permet d'établir la présence d'une SEP primitivement progressive selon l'invention. De préférence ces instructions indiquent dans quelle mesure la mise en évidence d'une différence significative du niveau du ou des marqueur(s) détecté(s) dans l'échantillon à tester permet de conclure à la présence d'une SEP primitivement progressive, et de préférence à la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine à forme primitivement progressive est déjà posé, comme détaillé notamment ci-dessus concernant le procédé de l'invention.
Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci-dessous qui montrent, à titre d'exemples non limitatifs, des formes de réalisation de l'objet de l'invention.
EXEMPLES
Analyse transcriptomique
Afin d'identifier un marqueur sérique diagnostic de la SEP nous avons développé une approche originale qui consiste en l'analyse transcriptomique large (analyse par "Gene Array*') de macrophages dérivés du sang.
Deux groupes appariés en âge et en sexe ont été étudiés :
- sujets sains (témoins ; n = 3),
- patients atteints de forme primitivement progressive de SEP prélevés au moment du diagnostic et ne suivant pas de traitement (patients SEP ; n =3) D'après le suivi ultérieur des patients après les prélèvements, les patients SEP analysés dans cette étude présentent tous une forme jugée évolutive de la maladie car: i) le recours à un traitement immunosuppresseur a été nécessaire dans les 3 ans qui ont suivis le prélèvement, ii) la pente d'aggravation du handicap dans les 3 ans s'est avérée égale ou supérieure à celle attendue pour cette forme de SEP, sur la base des données épidémiologiques connues.
Les cellules mononucléées des patients et des sujets témoins ont été isolées sur gradient de ficoll et stockées à -80°C dans la collection "NeuroBioTec" du Centre de Ressources Biologiques des Hospices Civils de Lyon. Parmi les dizaines de prélèvements de cette nature stockés à NeuroBioTec, l'analyse rétrospective des dossiers cliniques a ensuite permis de sélectionner 3 patients atteints de formes primitivement progressive et dont l'évolution ultérieure attestait de l'évolutivité au moment du prélèvement.
Les cellules ont été ensuite décongelées et cultivées en présence de M-CSF f macrophage cofony-stimulating factoi") pendant 7 jours. Puis, les cellules surnageantes ont été éliminées, permettant ainsi d'obtenir une population de cellules adhérentes constituée à plus de 95% de macrophages (cette méthode de culture a été validée par immunomarquage d'au moins 10 cultures macrophagiques avec les anticorps anti-CDllb ou anti-CD68). Les ARNm totaux ont ensuite été extraits puis étudiés par la technique de "gene arra sur la plateforme d'analyse ProfileXpert (Plateforme de biologie moléculaire de l'Institut Fédératif des Neurosciences de Lyon). Le niveau d'expression de près de 30 000 gènes a ainsi pu être comparé entre les deux groupes.
Pour chaque comparaison, seuls les gènes exprimés dans l'ensemble des échantillons ont été pris en compte soit un total de près de 15 000 gènes. Une moyenne d'expression a été établie pour chaque gène, puis des comparaisons de moyennes ont été réalisées et seules les variations d'un facteur supérieur ou égal à 2 ont été retenues. Par ailleurs, dans chaque groupe étudié (Témoins vs SEP), les gènes pour lesquelles les valeurs inter-échantillons ont été jugées trop importantes ont été exclus de l'analyse (gènes pour lesquels le rapport de la moyenne des valeurs sur l'écart-type était supérieur ou égal à 2).
L'analyse comparative des résultats de gene array obtenus dans les deux groupes a ainsi permis d'identifier 194 gènes différentiellement exprimés d'un facteur au moins égal à 2 dont 154 gènes augmentés d'un facteur au moins égal à 2 et 40 gènes diminués d'un facteur au moins égal à 2 chez les patients SEP par rapport aux témoins.
Parmi les 154 gènes augmentés d'un facteur au moins égal à 2, 15 sont des gènes immuns (le caractère immun de ces gènes a été établi sur la base de la littérature et du logiciel DAVID). De façon surprenante 4 des 15 gènes immuns surexprimés sont des gènes de réponse aux IFNs de type I ou III (ISG pour « Interferon Stimulated Gènes»). Il s'agit par ordre décroissant d'expression différentielle de : IFI44 (interferon-induced protein 44)(tème position/154, lière position/15 gènes immuns), IRF-1 (interferon regulatory factor i)(9ieme position/154, 2ieme position/15 gènes immuns), IFU3 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats)(17,ème position/154, 4ième position/15 gènes immuns) et IRF-9 (interferon regulatory factor )(148ième position/154, 15ième position/15 gènes immuns) (Tableau 1).
Par ailleurs, parmi les 15 gènes immuns surexprimés, on trouve la présence d'un seul récepteur cytokinique : la chaîne alpha du récepteur à l'IL-10)(15ième position/154, 3ième position/15 gènes immuns). Il faut noter que la chaîne alpha du récepteur à l'IL-10 est spécifique au récepteur à l'IL-10 et est à distinguer de la chaîne beta du récepteur à l'IL-10 qui est partagée par plusieurs récepteurs cytokiniques (récepteur à l'IL-10, récepteur aux IFNs de type III et récepteur à l'IL-22 notamment). Bien que des gènes de réponse aux IFNs de type I ou III soient augmentés chez les patients SEP, les récepteurs aux IFN de type I, IFNAR1 (interferon alpha, beta and om ga receptor 1) et IFNAR2 (interferon alpha, beta and oméga receptor 2) ne figurent pas parmi les 154 gènes augmentés. En revanche, la chaîne alpha du récepteur aux IFN de type III, l'IL28Ra, est l'un des 3 gènes immuns diminués chez les patients SEP par rapport aux sujets témoins (Tableau 1). Ainsi, parmi les 40 gènes diminués d'un facteur au moins égal à 2 chez les patients SEP par rapport aux Témoins, on identifie 3 gènes immuns qui sont : la chaîne alpha du récepteur aux IFN de type III (l'IL28Ra), la chaîne beta du récepteur à la cytokine IL-17E (cytokine encore nommée IL-25) et l'intégrine CD61 (Tableau 1).
Tableau 1
Rapport > 2 {gènes dont le niveau d'expression est augmenté d'un facteur au moins égal à 2)
154 gènes dont 15 gènes immuns incluant, par ordre décroissant d'expression différentielle :
* IFI44 (7*™ position/154, X 3,11)
* IRF-1 (9ième position/154, X 3,03)
* IL-10R alpha (15ième position/154, X 2,81)
* IF1T3 (17ième position/154, X 2,71)
* IRF-9 (148ième position/154, X 2,01)
Rapport < 0,5 {gènes dont le niveau d'expression est diminué d'un facteur au moins égal à 2)
40 gènes dont 3 gènes immuns :
* IL28-R alpha
* IL-17E R
* CD61
Dosages ELISA
Des dosages de l'IL-28, de l'IL-29 et de l'IFN-alpha ont été réalisés sur des prélèvements de sera congelés et conservés au sein de la collection "NeuroBioTec" du Centre de Ressources Biologiques des Hospices Civils de Lyon. Des kits commerciaux vendus par Biolegend (Ozyme) ont été utilisés pour doser l'IL-28a (IFN^2)(Ref kit : 435507) et l'IL-29 (IFN- l)(Ref Kit : 435607). Un kit commercial « Verikine TM human interferon alpha » de chez "PBL Interféron Source" distribué par Tebu Bio a été utilisé pour doser IIFNa (Ref kit : 41105).
Les sera dérivés des populations suivantes ont été analysées :
- 50 sujets témoins sains ;
- 10 patients atteints de glioblastome (tumeur maligne primitive du cerveau s'accompagnant d'une réaction inflammatoire) ;
- 10 patients atteints de pathologies neuro-inflammatoires autres que la SEP (maladie de Devic, vascularite, ADEM (Acute Disseminated EncephaloMyelitis, myélite) ;
- 16 patients atteints d'une forme primitivement progressive de
SEP, sans traitement au moment du prélèvement ;
- 12 patients atteints d'une forme primitivement progressive de
SEP, suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (Cellcept,
Endoxan, Elsep, Imurel) ;
- 21 patients atteints d'une forme rémittente de SEP, sans traitement au moment du prélèvement ;
- 74 patients atteints d'une forme rémittente de SEP, suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (Rebif 44, Avonex, Rebif 22, Betaferon, Tysabri, Copaxone, Cellcept, Imurel) ;
- 26 patients atteints d'une forme secondairement progressive de
SEP, suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (Cellcept, Endoxan, Methotrexate, Endoxan, Imurel).
Les résultats ont montré l'absence d'IL-28 détectable dans l'ensemble des sera testés dérivant de sujets témoins sains (n = 10) ou de patients SEP atteints d'une forme primitivement progressive de SEP, sans traitement au moment du prélèvement (n = 16). Dans le groupe glioblastome, 2 patients présentaient des taux détectables d'IL-28, respectivement à 38,23 pg/ml et 18,25 pg/ml.
L'IFN s'est révélé indétectable dans les seras dérivant des groupes de patients suivants (Tableau 2) :
- patients atteints d'une forme rémittente de SEP, sans traitement au moment du prélèvement (n = 21) - patients atteints d'une forme rémittente de SEP, suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (Rebif 44, Avonex, Rebif 22, Betaferon, Tysabri, Copaxone, Cellcept, Imurel)(n = 74) ;
- patients atteints d'une forme secondairement progressive de SEP, suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (Cellcept,
Endoxan, Methotrexate, Endoxan, Imurel)(n = 26).
En revanche, LIF a s'est révélé détectable chez 2 patients sur 10 atteints d'une pathologie neuro-inflammatoire autre que la SEP (11 pg/ml, 9 pg/ml), chez 3 sujets témoins sains sur 40 testés (14 pg/ml, 305 pg/ml, 21 pg/ml) et chez 2 patients sur 12 atteints d'une forme primitivement progressive, suivant un traitement au moment du prélèvement (69 pg/ml, 19 pg/ml)(Tableau 2).
Tableau 2
Figure imgf000025_0001
* SEP rémittentes sans traitement de fond au moment du prélèvement (n = 21) ou suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (n = 74).
** SEP secondairement progressives suivant un traitement de fond au moment du prélèvement.
*** SEP primitivement progressives suivant un traitement de fond au moment du prélèvement.
L'IL-29 s'est révélée indétectable chez 49 des 50 sujets témoins sains et les seras dérivant des groupes de patients suivants (Tableau 3) : - patients atteints d'une forme rémittente de SEP, sans traitement au moment du prélèvement (n = 21) ;
- patients atteints d'une forme rémittente de SEP, suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (Rebif 44, Avonex, Rebif 22, Betaferon, Tysabri, Copaxone, Cellcept, Imurel)(n = 74) ;
- patients atteints d'une forme secondairement progressive de SEP, suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (Cellcept, Endoxan, Methotrexate, Endoxan, Imurel)(n = 26) ;
- patients atteints de pathologies neuro-inflammatoires autres que la SEP (maladie de Devic, vascularite, ADEM {Acute Disseminated
EncephaioMyelitis, myélite), et
- patients atteints de glioblastome (n = 10).
L1L-29 s'est révélée détectable chez un sujet témoin sain sur 50 sera testés (2364 pg/ml), chez 3 patients sur 16 atteints d'une forme primitivement progressive de SEP, sans traitement au moment du prélèvement (290 pg/ml, 396 pg/ml, 478 pg/ml) et chez 3 patients sur 12 atteints d'une forme primitivement progressive de SEP, suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (349 pg/ml, 173 pg/ml, 190 pg/ml)(Tableau 3).
Tableau 3
Détection
sérique dlL-29
SEP rémittente* (n = 95) 0
SEP secondairement 0
progressive** (n = 26)
SEP primitivement 6 (21,4%)
progressive*** (n = 28)
Pathologies neuro-inflammatoires 0
autres que la SEP (n = 10)
Gliome (n = 10) 0
Témoins sains (n = 50) 1 (2%) * SEP rémittentes sans traitement de fond au moment du prélèvement (n = 21) ou suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (n = 74).
** SEP secondairement progressives suivant un traitement de fond au moment du prélèvement.
*** SEP primitivement progressives sans traitement de fond au moment du prélèvement (n = 16) ou suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (n = 12).
Par conséquent, ces résultats démontrent que :
i) l'IL-29 est un marqueur sérique diagnostique de la SEP à forme primitivement progressive, que les patients suivent ou non un traitement au moment du prélèvement ;
ii) l'IL-28 n'est pas détectable dans les SEP à forme primitivement progressive et ne peut donc servir de marqueur diagnostique pour ces formes de SEP ;
iii) IIFIMa est détectable dans les formes primitivement progressive de SEP mais l'est également dans un pourcentage non négligeable de sujets témoins sains (7,5 %) ou de patients atteints de pathologies neuro-inflammatoires autres que la SEP (20 %) ; l'IFNa ne peut donc servir de marqueur diagnostique pour les SEP à forme primitivement progressive ;
iv) l'IL-29 peut servir de marqueur d'évolutivité chez les patients SEP à forme primitivement progressive suivant un traitement de fond.
En conclusion, le dosage d'IL-29 dans le sang peut donc être utilisé comme marqueur diagnostique ou comme marqueur d'évolutivité de la SEP à forme primitivement progressive.
L'invention n'est pas limitée aux exemples décrits et représentés car diverses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détermination in vitro de la présence d'une sclérose en plaques primitivement progressive chez un sujet, comprenant, voire consistant en, les étapes suivantes :
a) détection d'un ou de plusieurs marqueur(s) choisi(s) parmi l'IL-29 et le récepteur IL-28Ra, dans un échantillon biologique à tester issu dudit sujet,
b) comparer le niveau détecté avec celui d'un échantillon de référence ;
la mise en évidence d'une différence significative de niveau détecté dans l'échantillon à tester par rapport à celui de l'échantillon de référence étant associée à la présence d'une sclérose en plaques primitivement progressive chez ledit sujet.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mise en évidence d'une augmentation du niveau d'IL-29 dans l'échantillon biologique à tester par rapport à l'échantillon de référence est associée à la présence d'une SEP primitivement progressive.
3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la mise en évidence d'une diminution du niveau du récepteur IL-28Ra dans l'échantillon biologique à tester par rapport à l'échantillon de référence est associée à la présence d'une SEP primitivement progressive,
4. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend, voire consiste en, la détection de l'IL-29 dans l'échantillon à tester.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mise en évidence d'une différence significative de niveau détecté dans l'échantillon à tester par rapport à celui de l'échantillon de référence est associée à la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive chez ledit sujet.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon biologique à tester est choisi parmi le sang et le liquide céphalo-rachidien.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon de référence est un échantillon biologique issu d'un sujet sain ou d'un pool de sujets sains.
8. Utilisation in vitro ou ex vivo d'un composé ou d'un réactif ou d'une pluralité de composés ou de réactifs capable(s) de détecter spécifiquement un ou plusieurs marqueur(s) choisi(s) parmi I1L-29 et le récepteur IL-28Ra, pour déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive.
9. Utilisation selon la revendication 8, pour déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive.
10. Utilisation selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisée en ce que ledit composé ou réactif ou ladite pluralité de composés ou de réactifs est(sont) capable(s) de détecter spécifiquement I1L-29.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que ledit ou lesdits composé(s) ou réactif(s) est(sont) choisi(s) parmi des anticorps spécifiques ou des fragments ou dérivés de ceux-ci, des peptides ou des acides nucléiques ou des fragments de ceux- ci.
12. Trousse ou kit pour la détermination in vitro de la présence d'une sclérose en plaques primitivement progressive, comprenant :
- un ou plusieurs composés ou réactifs capable(s) chacun de détecter spécifiquement un marqueur choisi(s) parmi l'IL-29 et te récepteur IL- 28Ra,
- un échantillon témoin positif, et éventuellement
- un échantillon témoin négatif.
13. Trousse ou kit selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'échantillon témoin positif est un échantillon biologique issu d'un patient ou d'un pool de patients atteints de SEP primitivement progressive ou d'une SEP primitivement progressive évolutive.
14. Trousse ou kit selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des instructions d'utilisation des différents constituants du kit ou de la trousse permettant de déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive, et de préférence d'une SEP primitivement progressive évolutive.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12486320B1 (en) * 2018-01-15 2025-12-02 Washington University Compositions and methods for treatment of central nervous system (CNS) autoimmune associated diseases or disorders

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002002627A2 (fr) * 2000-06-30 2002-01-10 Zymogenetics, Inc. Proteine zcyto21de type interferon
WO2002086087A2 (fr) * 2001-04-20 2002-10-31 Zymogenetics, Inc. Famille proteique de cytokine
WO2003066002A2 (fr) * 2002-02-08 2003-08-14 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Mecanisme de protection antivirale independant de ifn-$g(a)/$g(b) par une nouvelle paire ligand-recepteur: des ligands ifn-l se lient a un nouveau recepteur ifn-lr1 (crf2-12) et il-10r2 (crf2-4) pour signaler et induire des activites biologiques
WO2005023862A2 (fr) * 2003-08-07 2005-03-17 Zymogenetics, Inc. Preparations homogenes d'il-28 et d'il-29
US20070020227A1 (en) * 2005-07-20 2007-01-25 Sheppard Paul O Use of truncated cysteine IL28 and IL29 mutants to treat cancers and autoimmune disorders
US20100316608A1 (en) * 2009-06-15 2010-12-16 Vijayaprakash Suppiah Method of Determining A Response To Treatment With Immunomodulatory Composition

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002002627A2 (fr) * 2000-06-30 2002-01-10 Zymogenetics, Inc. Proteine zcyto21de type interferon
WO2002086087A2 (fr) * 2001-04-20 2002-10-31 Zymogenetics, Inc. Famille proteique de cytokine
WO2003066002A2 (fr) * 2002-02-08 2003-08-14 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Mecanisme de protection antivirale independant de ifn-$g(a)/$g(b) par une nouvelle paire ligand-recepteur: des ligands ifn-l se lient a un nouveau recepteur ifn-lr1 (crf2-12) et il-10r2 (crf2-4) pour signaler et induire des activites biologiques
WO2005023862A2 (fr) * 2003-08-07 2005-03-17 Zymogenetics, Inc. Preparations homogenes d'il-28 et d'il-29
US20070020227A1 (en) * 2005-07-20 2007-01-25 Sheppard Paul O Use of truncated cysteine IL28 and IL29 mutants to treat cancers and autoimmune disorders
US20100316608A1 (en) * 2009-06-15 2010-12-16 Vijayaprakash Suppiah Method of Determining A Response To Treatment With Immunomodulatory Composition

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALTSCHUL ET AL., NUCLEIC ACID RESEARCH, vol. 25, 1997, pages 3389 - 3402
MILLER; LEARY, LANCET NEUROL., vol. 8, 2007, pages 903 - 912
OLIVIER ET AL., J IMMUNOL METHODS, vol. 351, 2009, pages 41 - 45
PEKAREK ET AL., GENES IMMUN, vol. 8, 2007, pages 177 - 80
POLMAN C.H., ANN NEUROL, vol. 69, 2012, pages 292 - 302
SHEPPARD ET AL., NAT. IMMUNO., vol. 4, 2003, pages 63 - 8

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12486320B1 (en) * 2018-01-15 2025-12-02 Washington University Compositions and methods for treatment of central nervous system (CNS) autoimmune associated diseases or disorders

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