WO2012153078A1 - Method of in vitro determination of the presence of multiple sclerosis of primatively progressive form - Google Patents

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WO2012153078A1
WO2012153078A1 PCT/FR2012/051075 FR2012051075W WO2012153078A1 WO 2012153078 A1 WO2012153078 A1 WO 2012153078A1 FR 2012051075 W FR2012051075 W FR 2012051075W WO 2012153078 A1 WO2012153078 A1 WO 2012153078A1
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progressive
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Serge Nataf
Joël Lachuer
Anne WIERINCKX
Géraldine ANDRODIAS-CONDEMINE
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Universite Claude Bernard Lyon I
Hospices Civils De Lyon
INSERM (Institut National de la Recherche Médicale)
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Definitions

  • the present invention relates to the medical field, and in particular to the diagnosis of multiple sclerosis.
  • MS Multiple sclerosis
  • MS The diagnosis of MS is based on a set of clinical, radiological and biological criteria called "McDonlad criteria" whose last update was in 2010 (Polman CH et al., Ann Neurol 2012, 69: 292-302). In these consensus recommendations, it is recalled that the diagnosis of MS relies mainly on the notion of the spread of lesions in time and space. This dissemination can be optimally demonstrated by nuclear magnetic resonance (MRI) imaging techniques. In addition, the identification of an oligoclonal profile of immunoglobulins in the cerebrospinal fluid (CSF) may be an important element of the diagnosis.
  • MRI nuclear magnetic resonance
  • MS serum marker for MS.
  • diagnosis of MS is based on the combination of clinical (examination and history), radiological (Magnetic Resonance Imaging) and biological (identification of a profile oligoclonal immunoglobulin in the cerebrospinal fluid).
  • radiological Magnetic Resonance Imaging
  • biological identification of a profile oligoclonal immunoglobulin in the cerebrospinal fluid.
  • MS histoneum, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • EDSS Expanded Disability Status Scale
  • a serum marker of scalability would be a useful tool for deciding: (i) the establishment or continuation of background treatments with significant side effects (immunosuppressive treatments in particular), (ii) the frequency with which the clinical and radiological follow-up must be performed.
  • a serum marker of scalability would have a specific interest in the forms initially progressive because the clinical course is most often very slow worsening, difficult to assess by clinical monitoring alone and the radiological activity is low (relative stability over time lesions observed in cerebral MRI) making the MRI not very useful for the progressive follow-up of the disease.
  • any delay in the initial establishment of the diagnosis and / or assessment of the evolution of the disease can be considered as having the consequence of delaying the start of a treatment. potentially effective background.
  • Interferons play a central role in innate and adaptive immune responses. They are grouped into three major families: Type I IFNs, Type II IFNs, and Type III IFNs.
  • Type I IFNs IFN- and IFN- ⁇ are synthesized by various immune cell types (essentially plasmacytoid dendritic cells) or non-immune cells (fibroblasts) in response in particular to any viral infection inducing the stimulation of TLR receptors (Toii-Like). Receptof "). These IFNs cause the synthesis of a set of molecules with antiviral activity among which the molecules IFI44 (interferon-induced protein 44), IRF-1 (interferon responsive factor 1), IRF9 (interferon responsive factor 9) and IFIT3 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3).
  • IFI44 interferon-induced protein 44
  • IRF-1 interferon responsive factor 1
  • IRF9 interferon responsive factor 9
  • IFIT3 interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3
  • IFN type II corresponds to HFN- ⁇ and is mainly synthesized by T-lymphocytes and IMK ⁇ Natural Ki / ief cells) during inflammatory, infectious or neoplastic pathologies.
  • IFN- ⁇ is a potent macrophage activator that induces the synthesis of pro-inflammatory molecules (chemokines, pro-inflammatory cytokines) and surface molecules related to the antigenic presentation (molecules of the major histocompatibility complex, - stimulation).
  • Type III IFNs discovered in the early 2000s, include 3 molecules that are: interferon- ⁇ or IL-29, interferon-2 or IL-28a and interferon-3 or IL-28b (Sheppard et al., 2003, Nat. Immuno., 4: 63-8). These three molecules share a common dimeric structure receptor formed by: i) the IL-10 receptor beta chain (IL-10Rp) and ii) an alpha chain called IL-28R. Like type I IFNs, type III IFNs are primarily synthesized in response to a viral infection and induce the production of anti-viral-like molecules that are similarly induced by type I and type III interferons.
  • type III IFNs and in particular rIL-29, exert a pro-inflammatory activity similar to that of interferon-y (Pekarek et al., 2007, Genes Immun., 8: 177-80. ).
  • the expression of the type III IFN receptor has been demonstrated in various immune or non-immune cell types in mice and humans. Among these, infected neurons, monocytes, macrophages, dendritic cells and epithelial cells can be cited in particular. Despite its important role in the immune response, few studies have investigated the expression of type III IFNs in humans, probably because of the small number of commercial kits currently being developed and their very recent release on the market. available since 2009).
  • the subject of the present invention is a method for determining, in vitro, the presence of a primary progressive multiple sclerosis in a subject, comprising, or even consisting of, the following steps:
  • the detection of a significant variation in the detected level of at least one of the markers of the invention, namely IL-29 or IL-28Ra in the sample to be tested makes it possible to determine the presence of a Primary progressive MS in a subject, and in particular the presence of a progressively progressive MS that is to say, to affirm its evolutionary character, namely the need for the establishment of a background treatment and / or its continuation and / or close monitoring of the clinical and / or radiological evolution.
  • the method of the invention makes it possible to determine the presence of a progressively progressive MS in a subject who is presumed to have this form of MS on the basis of the clinical and / or radiological context.
  • This method therefore makes it particularly possible to confirm a diagnosis that is still uncertain and that has been provisionally established using clinical and / or radiological data, particularly in the case of probable or possible MS with a primitively progressive form.
  • the method of the invention also makes it possible to confirm the presence of a progressively progressive MS (evolutionarily progressive MS), that is to say, a progressively progressive MS that requires the establishment of a background treatment and / or close clinical and / or radiological monitoring.
  • a progressively progressive MS evolutionarily progressive MS
  • the method according to the invention makes it possible to determine the presence of a previously progressive progressive MS in a subject, even if the latter is already under background treatment, such as an immunosuppressive or immunomodulatory treatment.
  • the method according to the invention comprises, or even consists of, the detection of IL-29 in the sample to be tested to determine the presence of a previously progressive MS in a subject, and preferably the presence of a primarily progressive progressive MS.
  • the term “detection” or “detect” means detection in vitro or ex vivo. Moreover, these terms intend to designate both the detection of the presence and / or the quantification of these markers at the nucleic or protein level, but also at the level of the specific activity of these markers. For this purpose, any method of detection and / or quantification well known to those skilled in the art can be used for the implementation of the invention, whether in connection with the determination of the presence and / or expression and / or specific activity of these markers.
  • the detection and / or quantification of these markers is carried out at the nucleic level, and in particular from RNA or cDNA, this can in particular be carried out by PCR analysis, by microarray hybridization or by Northern blot.
  • the detection and / or quantification of these markers is performed at the protein level, standard techniques such as Western blot, ELISA, RIA, IRMA, FIA, CLIA, ECL, flow cytometry or immunocytology can be used.
  • the specific activity of these markers is demonstrated and / or quantified, it may for example be determined by analysis of the capacity of the biological sample tested to inhibit the cytopathic effect exerted by a virus.
  • VSV Vesicular Somatic Virus also called VSV
  • a human cell line sensitive to this virus for example the HEP2 cell line in the case of the VSV virus
  • the detection of the marker (s) is carried out at the protein level, and in particular using the ELISA technique.
  • the present invention relates to the determination of the presence of a progressively progressive MS by means of the process of the invention comprising or even consists of the detection of IL-29 in the sample to be tested, and preferably the detection of IL-29 at the protein level.
  • the present invention relates to a method for the in vitro determination of the presence of a primitively progressive MS in a subject comprising the detection of IL-29 at the protein level in a blood sample, and in particular of serum, or cerebrospinal fluid from said subject.
  • the terms “marker”, “marker of the invention” or “marker of interest” mean any biological material which corresponds to the presence, expression and / or activity of the IL-29 and / or IL-28a.
  • Said biological material may especially consist of proteins, deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA), and especially messenger RNAs.
  • the detection of the marker (s) of interest, IL-29 and / or IL-28Ra is intended to concern the detection of the marker in all its forms of synthesis and / or maturation, which it is variant, precursor, isoform etc, as long as these forms are corresponding marker, that is to say that they can not correspond to another marker.
  • the "marker (s)", “marker (s) of the invention” or “marker (s) of interest” preferably correspond to the reference sequences mentioned below, but also to any sequence which corresponds to another form during the synthesis and / or processing of the marker encoded by these reference sequences, such as variant, precursor, isoform, etc., as long as this sequence is specific to the marker in question.
  • the reference nucleic sequences are the following:
  • IL-29 NCBI reference sequence: NM_172140.1
  • IL-28Ra NCBI reference sequence: NM_170743.2.
  • variant, precursor or isoform are in particular any nucleic sequence which has more than 86% homology with the sequence of which it is homologous, ie the above reference nucleic sequence corresponding to IL-29, and preferably having a homology of at least 90%, at least 95%, at least 98% or at least 99% % with this reference sequence.
  • IL-29 NCBI reference sequence: NP_742152.1
  • -IL-28Ra GenBank reference sequence: ⁇ 01409.1.
  • variant, precursor or isoform are in particular any protein sequence which has more than 95% homology with the sequence of which it is the homologous, ie that is, the above reference protein sequence corresponding to IL-29, and preferably having a homology of at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least minus 99% with this reference sequence.
  • variant, precursor or isoform are in particular any sequence, nucleic or proteinic, which has at least 90% homology with the sequence of which it is homologous, i.e., the respective above-mentioned respective nucleic or protein reference sequences corresponding to IL-28Ra, and preferably having an at least 95% homolog, of at least 97%, of at least at least 98% or at least 99% with these reference sequences.
  • homology refers to the similarity that is calculated by optimal alignment between two sequences.
  • the similarity of a sequence with respect to a reference sequence is assessed as a function of the percentage of residues which are identical or which differ by conservative substitutions, when the two sequences are aligned so as to obtain the maximum of correspondence between them.
  • the percentage of homology can be calculated by those skilled in the art using the methods which are known in the art, and in particular the sequence comparison computer program such as that of the BLAST suite (Altschul et al., Nucleic Acid Research, 1997, 25, 3389-3402).
  • “conservative substitution” is understood to mean any substitution of one base by another which leads to the production of an identical protein in sequence, in particular because of the degeneracy of the genetic code, or any substitution of a residue by another that has similar chemical or physical properties (size, charge, polarity etc.) that generally does not alter the functional properties of the protein.
  • the method of the invention may also include the joint detection of one or more other biomarkers of MS, without this being necessary. to be able to determine the presence of the disease in the context of the invention.
  • the method may include the joint detection of one or more markers of interest according to the invention with one or more other biomarkers of MS known in the art.
  • sample to be tested any biological sample may contain the marker or markers to be detected and from the subject or the patient in whom it is desired to determine the presence of multiple sclerosis.
  • the biological sample to be tested used in the context of the process according to the invention can be of different nature.
  • the biological sample to be tested is chosen from biological fluids such as blood, whole blood (as collected from the venous route, that is to say containing the white and red cells, the platelets and the plasma), serum, plasma, urine, synovial fluid, cerebrospinal fluid, lymph, as well as tissues such as brain tissue or nerve tissue or cells isolated from such tissue, as long as they contain the marker (s) of interest.
  • the biological sample to be tested is selected from blood, and in particular serum, and cerebrospinal fluid.
  • the level of the marker (s) that is detected in the biological sample to be tested is then compared with that detected in a reference sample.
  • the reference sample may be any biological sample derived from a healthy subject or from a pool of healthy subjects, in particular not affected (s) or suspected (s) to be reached ( s) from SEP.
  • the reference sample may also be from the same subject as the one from which the test sample originated but correspond to an earlier stage of the patient's follow-up. For example, performed during a previous sampling as part of the follow-up that is set up for the patient concerned.
  • the reference sample may also consist of any sample, biological or non-biological, which has been previously calibrated to contain an average value of the marker (s) to be detected. is the level that has been detected on a pool of biological samples from healthy subjects or the same subject but corresponding to an earlier stage.
  • the method of the invention may comprise the prior obtaining of this average value, and at which the level that will be detected in the sample to be tested can to be compared in order to determine the presence of a progressively progressive MS according to the invention.
  • the reference sample When it is biological, the reference sample may be of different types and in particular chosen from the biological samples which are mentioned above concerning the sample to be tested (fluid, tissue, cells, etc.).
  • the reference sample which is used according to the invention is a biological sample of the same nature (fluid, tissue, cells, etc.) as that of the biological sample to be tested or of a compatible nature to constitute a reference as to the detection of the markers to be detected.
  • test and reference samples that are compared for the detection of the markers are preferably from persons having the same characteristics or a majority of common characteristics, in particular of the same sex and / or of a similar or identical age, and / or of the same ethnic origin.
  • this sample will obviously be chosen according to the marker (s) tested (s), that is to say that The reference sample will be calibrated for the marker (s) that are to be detected in the sample to be tested.
  • the detection of a significant difference in the detected level of the marker (s) of interest in the sample to be tested compared with that of the reference sample is associated with the presence of a sclerosis. primitively progressive plaques, and thus makes it possible to pose the diagnosis of a certain SEP with primitively progressive form.
  • this difference makes it possible to affirm the evolutionary nature of this form of the disease.
  • the reference sample may also correspond to that of patients with MS considered non-progressive or non-active, and in particular of previously progressive MS considered non-progressive. or non-active on the basis of clinical and / or radiological criteria relevant for this form of the disease.
  • an increase defines both the detection of a significantly higher level in the sample to be tested than that detected in the reference sample or a presence in the sample to be tested by compared to an absence in the reference sample.
  • the observed difference can also be a decrease.
  • a decrease defines both the detection of a significantly lower level in the sample to be tested than that detected in the reference sample or an absence in the sample to be tested by relation to a presence in the reference sample.
  • the detection in the sense of the invention can take both a qualitative and a quantitative aspect.
  • the absence of a marker of interest in one of the samples or the level detected will depend on various factors, including the detection technique used and its sensitivity, the nature of the samples analyzed, the type of detection chosen (protein, nucleic, activity, etc.).
  • a "significantly lower or higher level” may correspond to the absence of detection in the sample tested by comparison with a detectable level in the reference sample or on the contrary with the absence of detection in the reference sample compared to a detectable level in the sample tested.
  • a "significantly lower or higher level” may correspond to a level which is at least a factor 2 lower or higher than the level detected in the reference sample, preferably at least a factor of 3 or less by ratio to the level of expression detected in the reference sample.
  • the demonstration of an increase in the level of IL-29 in the biological sample to be tested relative to the reference sample is associated with the presence of a previously progressively progressive MS. and, preferably, the presence of a progressively progressive MS, particularly for those in whom the diagnosis of certain MS has already been made.
  • the demonstration of a decrease in the level of the IL-28Ra receptor in the biological sample to be tested relative to the reference sample is associated with the presence of a previously progressively progressive MS. and, preferably, the presence of a progressively progressive MS, particularly for those in whom the diagnosis of certain MS has already been made.
  • the method of the invention may be defined as including, or even consisting of, the steps of detecting the presence or increase of the IL-29 level and / or detecting the decrease in the level of IL-29.
  • level of the IL-28Ra receptor or its absence in the biological sample to be tested in relation to the reference sample it being understood that this presence or increase and / or this decrease or absence is (are) associated with the presence of a previously progressive MS, and preferably in the presence of a progressively progressive MS, particularly for those in whom the diagnosis of certain MS is already made.
  • it relates to the use in vitro or ex vivo of a compound or a reagent or a plurality of compounds or reagents capable of specifically detecting a or more than one marker selected from IL-29 and the IL-28R receptor, to determine the presence of a progressively progressive MS, and preferably the presence of a progressively progressive MS, especially for subjects in whom the diagnosis of certain MS is already made.
  • the presence of a previously progressive MS, and preferably the presence of a progressively progressive MS progressively, particularly for subjects in whom the diagnosis of certain MS is already made is determined by the use of in vitro or ex vivo a compound or a reagent or a plurality of compounds or reagents capable (s) specifically detect IL-29.
  • the compounds or reagents capable of specifically detecting one or more of the abovementioned markers particular mention may be made of specific antibodies or fragments or derivatives thereof, for example single chain antibodies Sv, but also peptides. or nucleic acids or fragments thereof such as primers (or primer) or specific pairs of primers which detect and / or amplify the gene corresponding to the chosen marker (s), probes , antisense constructs, RNAi, ribozymes, etc. corresponding to the chosen marker (s).
  • the subject of the present invention is a kit or kit for the in vitro determination of the presence of a primitively progressive multiple sclerosis, and preferably the presence of a progressively progressive MS, especially for subjects with which the diagnosis of certain SEP with primitively progressive form is already posed.
  • This kit includes:
  • one or more compounds or reagents each capable of specifically detecting a marker selected from IL-29 and the IL-2 receptor;
  • the kit of the invention contains at least one compound or reagent capable of specifically detecting IL-29. It may further contain a compound capable of specifically detecting HL-28R.
  • the positive control sample is preferably a biological sample from a patient or pool of patients with initially progressive MS, and preferably with certain MS having a primitively progressive form. It may also correspond to a biological sample derived from one or more patients with a previously progressive progressive MS, and in particular from certain MS with initially progressive form and whose evolutionary character has been confirmed beforehand on the basis of clinical criteria. and / or radiological relevant for this form of the disease.
  • the positive control sample may also consist of any sample, biological or non-biological, which has been previously calibrated to contain an average value of the marker (s) to detect that corresponds to the average level that has been detected on a pool of biological samples from patients with certain MS with initially progressive form or on a pool of biological samples from of patients with certain MS with primitively progressive form and whose evolutionary character was previously confirmed.
  • the negative control sample is in particular a sample which does not contain the chosen marker (s), such as for example a sample of a healthy subject, or a sample, biological or non-biological, for which the detection of the marker (s) (s) chosen is or has been made impossible.
  • the method used to prevent the detection of the marker (s) of interest in the negative control sample will be adapted to the detection method used for the sample to be tested in the process of the invention. .
  • the method used to make it impossible to detect said marker in the negative control sample will be a method to prevent the detection of the protein in question, without however, to prevent the presence of the gene and / or messenger encoding this protein.
  • the method used to make it impossible to detect the activity of this protein in the negative control sample will be a method to render this protein inactive, without preventing the expression of the gene encoding this protein and / or the presence of the protein itself as long as its activity is undetectable.
  • the positive control and negative control samples may be of different natures.
  • the preferred embodiments mentioned above concerning the nature of the test sample and the reference sample are also preferred embodiments for the positive and negative control control samples contained in the kit or kit according to the invention.
  • the kit or kit of the invention is a kit suitable for determining the presence of a previously progressively progressive MS according to the invention.
  • it may further comprise instructions for using the various components of the kit or the kit for determining the presence of a previously progressive MS according to the invention, and preferably a progressively progressive progressive MS.
  • This kit thus makes it possible to determine the presence of a previously progressive MS and preferably the presence of a previously progressive progressive MS, particularly for the subjects in whom the diagnosis of certain MS with a primitively progressive form has already been made.
  • these instructions indicate to what extent the detection of the marker (s) concerned (s) allows to establish the presence of a previously progressive MS according to the invention.
  • these instructions indicate to what extent the detection of a significant difference in the level of the marker (s) detected in the sample to be tested makes it possible to conclude to the presence of a previously progressively progressive MS. preferably in the presence of a progressively progressive MS progressive, especially for those in whom the diagnosis of certain SEP primitively progressive form is already laid, as detailed in particular above concerning the method of the invention.
  • MS patients, n 3
  • MS patients analyzed in this study all have a form considered to be progressive because: i) the immunosuppressive treatment was necessary within 3 years after the sampling; (ii) the worsening rate of disability within 3 years was found to be equal to or greater than that expected for this form of MS, based on known epidemiological data.
  • the cells were then thawed and cultured in the presence of M-CSF (cofony-stimulating macrophage for 7 days.) Then the supernatant cells were removed, thereby obtaining an adherent population of more than 95 cells. % of macrophages (this culture method was validated by immunostaining at least 10 macrophage cultures with the anti-CD11b or anti-CD68 antibodies.) The total mRNAs were then extracted and studied by the technique of "arra gene on the ProfileXpert analysis platform (Molecular Biology Platform of the Federative Institute of Neuroscience of Lyon). The expression level of nearly 30,000 genes could thus be compared between the two groups.
  • M-CSF cofony-stimulating macrophage for 7 days.
  • the comparative analysis of the gene array results obtained in the two groups thus made it possible to identify 194 genes differentially expressed by a factor of at least 2, including 154 genes increased by a factor of at least 2 and 40 decreased genes. by a factor of at least 2 in MS patients compared with controls.
  • IFI44 Interferon-induced protein 44
  • IRF-1 interferon regulatory factor i
  • IFU3 interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats
  • IRF-9 interferon regulatory factor
  • the IL-10 receptor alpha chain is IL-10 receptor-specific and is distinct from the IL-10 receptor beta chain that is shared by several cytokine receptors (receptor). IL-10, type III IFN receptor and IL-22 receptor in particular). Although type I or III IFN genes are increased in MS patients, IFN type I receptors IFNAR1 (interferon alpha, beta and oma receptor 1) and IFNAR2 (interferon alpha, beta and omega receptor 2) are not among the 154 augmented genes.
  • the alpha channel of the IFN receptor III is one of 3 immune genes decreased in MS patients compared to control subjects (Table 1).
  • 3 immune genes are identified: the alpha channel of the IFN receptor type III (IL28Ra), the IL-17E cytokine receptor beta chain (cytokine still called IL-25) and CD61 integrin (Table 1).
  • Ratio> 2 genes whose level of expression is increased by a factor of at least 2)
  • glioblastoma primary malignant brain tumor with an inflammatory reaction
  • MS following a background treatment at the time of collection (Cellcept, Endoxan, Methotrexate, Endoxan, Imurel).
  • LIF a was found to be detectable in 2 out of 10 patients with neuroinflammatory pathology other than MS (11 ⁇ g / ml, 9 ⁇ g / ml), in 3 out of 40 healthy controls (14 ⁇ g / ml, 305 ⁇ g / ml, 21 ⁇ g / ml) and in 2 out of 12 patients with a primitively progressive form, following treatment at the time of sampling (69 ⁇ g / ml, 19 ⁇ g / ml) (Table 2).
  • L1L-29 was found to be detectable in one out of 50 healthy control subjects will be tested (2364 pg / ml), in 3 out of 16 patients with a primitively progressive form of MS, without treatment at the time of collection (290 pg / ml , 396 ⁇ g / ml, 478 ⁇ g / ml) and in 3 out of 12 patients with a primitively progressive form of MS, following a baseline treatment at the time of sampling (349 ⁇ g / ml, 173 ⁇ g / ml, 190 ⁇ g / ml). ml) (Table 3).
  • IL-29 is a serum diagnostic marker for early-stage MS, regardless of whether patients are receiving treatment at the time of collection;
  • IL-28 is not detectable in primitively progressive MS and therefore can not be used as a diagnostic marker for these forms of MS;
  • IIFIMa is detectable in the initially progressive forms of MS but is also detectable in a significant percentage of healthy control subjects (7.5%) or patients with neuroinflammatory diseases other than MS (20%); IFNa can not therefore be used as a diagnostic marker for initially progressive MS;
  • IL-29 can be used as a scalability marker in initially progressive MS patients following DMARD.
  • the measurement of IL-29 in the blood can therefore be used as a diagnostic marker or as a marker of progression of MS in primitively progressive form.

Abstract

The invention relates to a method of in vitro determination of the presence of primitively progressive multiple sclerosis in a subject, comprising the detection of IL-29 and/or of the IL-28Rα receptor in a biological sample to be tested arising from said subject and the comparison of the level detected with that of a reference sample. It also relates to the in vitro or ex vivo use of one or more compound(s) capable of detecting specifically IL-29 and/or the IL-28Rα receptor so as to determine the presence of primitively progressive MS, as well as kits comprising such compound(s).

Description

PROCEDE DE DETERMINATION IN VITRO DE LA PRESENCE D'UNE SCLEROSE EN PLAQUES A FORME PRIMITIVEMENT PROGRESSIVE  METHOD FOR IN VITRO DETERMINATION OF THE PRESENCE OF A PRIMITIVELY PROGRESSIVE SHAPE SCLEROSIS
La présente invention concerne le domaine médical, et notamment le diagnostic de la sclérose en plaques.  The present invention relates to the medical field, and in particular to the diagnosis of multiple sclerosis.
La sclérose en plaques (SEP) est une pathologie inflammatoire démyélinisante du système nerveux central touchant préférentiellement l'adulte jeune. L'étiologie de la SEP reste actuellement inconnue bien que l'existence de mécanismes autoimmuns soit largement admise. L'hypothèse d'une origine virale de la SEP est régulièrement avancée mais aucune preuve formelle n'a pu être apportée dans ce sens. Le plus souvent, cette maladie évolue initialement par poussées partiellement ou totalement régressives : on parle de forme rémittente de la SEP. Toutefois, chez environ un tiers des patients, une évolution lentement progressive fait suite à la phase rémittente et conduit à un handicap neurologique majeur : on parle de forme secondairement progressive. L'évolution bénigne des formes rémittentes de la SEP est possible (une seule poussée sans séquelles puis aucune autre manifestation) alors qu'elle est très rare dans les formes dites secondairement progressives. Par ailleurs, 10 à 15 % des patients développent une forme d'emblée progressive : on parle alors de SEP primitivement progressive.  Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system that affects the young adult. The etiology of MS is currently unknown although the existence of autoimmune mechanisms is widely accepted. The hypothesis of a viral origin of MS is regularly advanced but no formal proof could be provided in this direction. Most often, this disease initially evolves by partially or completely regressive relapses: it is called relapsing form of MS. However, in about one-third of patients, a slowly progressive course follows the relapsing phase and leads to a major neurological handicap: it is called secondarily progressive form. The benign evolution of relapsing forms of MS is possible (a single attack without sequelae and then no other manifestation) whereas it is very rare in so-called secondarily progressive forms. On the other hand, 10 to 15% of patients develop a progressive form at first: this is called initially progressive MS.
Le diagnostic de SEP se base sur un ensemble de critères cliniques, radiologiques et biologiques dits "critères de McDonlad" dont la dernière réactualisation remonte à 2010 (Polman CH. et. al., Ann Neurol 2012, 69 : 292-302). Dans ces recommandations de consensus, on rappelle que le diagnostic de SEP repose principalement sur la notion de dissémination des lésions dans le temps et dans l'espace. Cette dissémination peut être démontrée de manière optimale par les techniques d'imagerie par résonance magnétique nucléaire (IRM). Par ailleurs, la mise en évidence d'un profil oligoclonal des immunoglobulines dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) peut constituer un élément important du diagnostic. Ces recommandations stipulent que la maladie de Devic (neuromyélite optique), longtemps considérée comme une forme particulière de SEP, doit aujourd'hui être reconnue comme une entité distincte de la SEP, diagnostiquée sur la base de critères spécifiques tels que, en particulier, la présence dans le sang d'auto- anticorps anti-Aquaporine 4. The diagnosis of MS is based on a set of clinical, radiological and biological criteria called "McDonlad criteria" whose last update was in 2010 (Polman CH et al., Ann Neurol 2012, 69: 292-302). In these consensus recommendations, it is recalled that the diagnosis of MS relies mainly on the notion of the spread of lesions in time and space. This dissemination can be optimally demonstrated by nuclear magnetic resonance (MRI) imaging techniques. In addition, the identification of an oligoclonal profile of immunoglobulins in the cerebrospinal fluid (CSF) may be an important element of the diagnosis. These recommendations state that the disease Devic (optical neuromyelitis), long regarded as a particular form of MS, must now be recognized as an entity distinct from MS, diagnosed on the basis of specific criteria such as, in particular, the presence in the blood of anti-Aquaporin autoantibody 4.
Il n'existe pas actuellement de marqueur sérique de la SEP. Lors des premières manifestations cliniques, et quelle que soit la forme clinique de SEP, le diagnostic de SEP repose donc sur la combinaison d'éléments cliniques (examen et anamnèse), radiologique (Imagerie par Résonance Magnétique) et biologique (identification d'un profil oligoclonal des immunoglobulines dans le liquide céphalo-rachidien). Toutefois, il est relativement fréquent qu'une incertitude diagnostique persiste, notamment dans les cas de SEP primitivement progressive.  There is currently no serum marker for MS. During the first clinical manifestations, and regardless of the clinical form of MS, the diagnosis of MS is based on the combination of clinical (examination and history), radiological (Magnetic Resonance Imaging) and biological (identification of a profile oligoclonal immunoglobulin in the cerebrospinal fluid). However, it is quite common that a diagnostic uncertainty persists, especially in the case of initially progressive MS.
En effet, les formes primitivement progressives présentent un certain nombre de caractéristiques cliniques, radiologiques et biologiques les distinguant des formes rémittentes de SEP (Miller and Leary, 2007, Lancet Neurol., 8 : 903-912) : i) le début clinique de ces formes est généralement insidieux, il est plus tardif, l'évolution clinique est lentement progressive et, le plus souvent, sans poussée surajoutée, ii) le terrain est différent (sujets plus âgés, sex ratio équilibré alors qu'il est déséquilibré en défaveur des femmes dans les formes rémittentes ou secondairement progressives avec deux fois plus de femmes atteintes), iii) les anomalies ou lésions observées en imagerie cérébrale (IRM) sont habituellement peu nombreuses et moins marquées que dans les formes rémittentes ou secondairement progressives, iv) dans le LCR, le profil oligoclonal des immunoglobulines est parfois absent, rendant le diagnostic difficile à établir. Il est donc recommandé que le diagnostic de SEP primitivement progressive repose sur des critères spécifiques. Ceux-ci incluent notamment la constatation que la maladie est cliniquement parlante depuis une période d'au moins un an.  Indeed, primitively progressive forms have a number of clinical, radiological and biological characteristics distinguishing them from remitting forms of MS (Miller and Leary, 2007, Lancet Neurol., 8: 903-912): i) the clinical onset of these forms is generally insidious, it is later, the clinical course is slowly progressive and, most often, without additional thrust, ii) the terrain is different (older subjects, balanced sex ratio while it is unbalanced to the detriment of women in remitting or secondarily progressive forms with twice as many women affected), iii) abnormalities or lesions observed in cerebral imaging (MRI) are usually few and less marked than in remittent or secondarily progressive forms, iv) in the LCR, the oligoclonal profile of immunoglobulins is sometimes absent, making the diagnosis difficult to establish. It is therefore recommended that the diagnosis of initially progressive MS be based on specific criteria. These include the finding that the disease is clinically speaking for a period of at least one year.
Quelle que soit la forme de SEP considérée (rémittente, secondairement progressive ou primitivement progressive), les scores obtenus aux critères cliniques, biologiques et IRM de la SEP permettent de distinguer les SEP certaines, des SEP probables ou des SEP possibles. Le diagnostic de SEP est considéré comme certain si les critères de McDonald sont respectés. Si seulement une partie des critères est respectée on parle de SEP possible ou, pour certains auteurs, de SEP probable. Cette incertitude diagnostique à une incidence importante sur la qualité de la prise en charge thérapeutique des patients à SEP probable ou possible. Whatever the form of MS considered (remittent, secondarily progressive or primitively progressive), the scores Clinical, biological, and MRI criteria for MS allow distinguishing between certain, probable, or possible MS. The diagnosis of MS is considered certain if McDonald's criteria are met. If only a part of the criteria is respected, one speaks of possible SEP or, for some authors, of probable SEP. This diagnostic uncertainty has a significant impact on the quality of the therapeutic management of patients with probable or possible MS.
Outre les potentielles difficultés diagnostiques, le suivi thérapeutique des patients atteints de SEP est rendu difficile par l'absence de marqueur sérique permettant d'apprécier l'évoiutivité ou l'activité de la maladie, à savoir la présence d'une SEP évolutive ou SEP active, c'est-à- dire d'une SEP qui nécessite un traitement de fond et/ou une surveillance étroite de l'évolution clinique et radiologique. En effet, quelle que soit la forme clinique de SEP (rémittente, secondairement progressive ou primitivement progressive), un large spectre d'évolution peut être observé, avec, aux deux extrêmes : i) les SEP peu ou pas évolutives qui sont très peu ou pas invalidantes malgré un temps d'évolution prolongé, ii) les SEP très évolutives qui se caractérisent par un handicap sévère d'installation rapide sur quelques mois ou années. Les critères d'évolutivité les plus souvent utilisés sont les suivants : i) la progression du score clinique EDSS (« Expanded Disability Status Scale ») en dehors des phases de poussées, ii) le nombre élevé de lésions nouvelles observées en IRM par rapport à un examen de référence, iii) le nombre élevé de lésions "actives" observées en IRM après injection de Gadolinium (on parle de lésions « réhaussées » par le Gadolinium).  In addition to the potential diagnostic difficulties, the therapeutic follow-up of patients with MS is made difficult by the absence of a serum marker to assess the evolutivity or activity of the disease, namely the presence of progressive MS or MS. active, that is to say, a MS that requires a background treatment and / or a close monitoring of the clinical and radiological evolution. Indeed, regardless of the clinical form of MS (remittent, secondarily progressive or primitively progressive), a broad spectrum of evolution can be observed, with, at the two extremes: i) little or no progressive MS that are very little or not disabling despite a prolonged period of evolution, ii) highly progressive MS that are characterized by a severe handicap of rapid installation over a few months or years. The most commonly used criteria for scalability are: i) progression of the Expanded Disability Status Scale (EDSS) clinical score outside the relapse phase, and (ii) the high number of new lesions observed in MRI compared with a reference examination, iii) the high number of "active" lesions observed on MRI after gadolinium injection (Gadolinium-enhanced lesions).
En particulier, un marqueur sérique d'évolutivité serait un outil utile pour décider : i) de la mise en place ou de la poursuite de traitements de fonds aux effets secondaires importants (traitements immunosuppresseurs en particulier), ii) de la fréquence à laquelle le suivi clinique et radiologique doit être réalisé. Par ailleurs, un tel marqueur sérique d'évolutivité présenterait un intérêt spécifique dans les formes primitivement progressives car l'évolution clinique y est le plus souvent d'aggravation très lente, difficilement évaluable par le seul suivi clinique et l'activité radiologique y est faible (relative stabilité dans le temps des lésions observées en IRM cérébrale) rendant l'IRM peu utile au suivi évolutif de la maladie. Ainsi, dans les formes primitivement progressives, on peut considérer que tout retard à l'établissement initial du diagnostic et/ou à l'évaluation de l'évolutivité de la maladie peut avoir pour conséquence un retard à la mise en route d'un traitement de fond potentiellement efficace. In particular, a serum marker of scalability would be a useful tool for deciding: (i) the establishment or continuation of background treatments with significant side effects (immunosuppressive treatments in particular), (ii) the frequency with which the clinical and radiological follow-up must be performed. Moreover, such a serum marker of scalability would have a specific interest in the forms initially progressive because the clinical course is most often very slow worsening, difficult to assess by clinical monitoring alone and the radiological activity is low (relative stability over time lesions observed in cerebral MRI) making the MRI not very useful for the progressive follow-up of the disease. Thus, in the initially progressive forms, any delay in the initial establishment of the diagnosis and / or assessment of the evolution of the disease can be considered as having the consequence of delaying the start of a treatment. potentially effective background.
En conséquence, chez les patients à SEP certaine, l'absence de marqueur biologique signant la présence d'une SEP évolutive, limite les possibilités d'ajustement des traitements actuellement disponibles ; le problème se posant de manière particulièrement aiguë pour les SEP à forme primitivement progressive compte tenu de ses particularités clinique et radiologique.  Consequently, in patients with certain MS, the absence of a biological marker signifying the presence of progressive MS, limits the possibilities of adjustment of currently available treatments; the problem is particularly acute for initially progressive MS, given its clinical and radiological features.
Il existe donc un réel besoin clinique de marqueur(s) sérique(s) permettant de déterminer la présence d'une SEP qui, éventuellement associés aux critères existants, permettraient d'établir : i) la présence d'une SEP de manière certaine, notamment chez les patients pour lesquels une SEP probable ou possible a été définie sur la base des critères radiologiques et/ou cliniques existants, et en particulier dans les cas de SEP à forme primitivement progressive (SEP dont le diagnostic est le plus difficile à établir) ii) le caractère évolutif de la SEP chez des patients à SEP certaine, notamment chez les patients présentant une forme primitivement ou secondairement progressive.  There is therefore a real clinical need for serum marker (s) to determine the presence of MS that, if associated with the existing criteria, would establish: i) the presence of MS in a certain way, in particular in patients for whom probable or possible MS has been defined on the basis of existing radiological and / or clinical criteria, and in particular in cases of initially progressive-stage MS (the diagnosis of which is the most difficult to establish) ii) the progressive nature of MS in patients with certain MS, especially in patients with a primitively or secondarily progressive form.
Dans ce contexte, de nombreuses études ont tenté d'analyser la présence d'un ensemble de cytokines dans le sérum de patients SEP et de sujets contrôles présentant des pathologies neurologiques autres que la SEP. Jusqu'alors, aucune de ces études n'a permis d'identifier une cytokine ou un groupe de cytokines dont la présence dans le sang signerait la présence d'une SEP de manière certaine, dès la phase initiale de la maladie, en particulier dans les cas de formes primitivement progressive. In this context, numerous studies have attempted to analyze the presence of a set of cytokines in the serum of MS patients and control subjects with neurological pathologies other than MS. Until now, none of these studies identified a cytokine or a group of cytokines whose presence in the blood would signify the presence of MS in a certain way, from the initial phase. of the disease, especially in cases of primitively progressive forms.
A ce jour, il n'existe donc pas de marqueur biologique sanguin pour déterminer la présence d'une sclérose en plaques de manière certaine, en particulier dans les cas de formes primitivement progressive, ni pour déterminer le caractère évolutif de cette maladie. C'est dans ce contexte que les inventeurs ont découvert ce qui fait l'objet de la présente invention.  To date, there is therefore no blood biomarker to determine the presence of multiple sclerosis in a certain way, especially in cases of primitively progressive forms, or to determine the evolutionary nature of this disease. It is in this context that the inventors have discovered what is the subject of the present invention.
Les Interférons (IFIMs) jouent un rôle central dans les réponses immunes innées et adaptatives. Ils sont regroupés au sein de trois grandes familles : les IFNs de type I, I1FN de type II et les IFNs de types III.  Interferons (IFIMs) play a central role in innate and adaptive immune responses. They are grouped into three major families: Type I IFNs, Type II IFNs, and Type III IFNs.
Les IFNs de type I (IFN- et IFN-β) sont synthétisés par différents types cellulaires immuns (cellules dendritiques plasmacytoïdes essentiellement) ou non immuns (fibroblastes) en réponse notamment à toute infection virale induisant la stimulation de récepteurs TLR {"Toii-Like Receptof"). Ces IFNs provoquent la synthèse d'un ensemble de molécules à activité antivirale parmi lesquelles les molécules IFI44 {interferon- induced protein 44), IRF-1 {interferon responsive factor 1), IRF9 {interferon responsive factor 9) et IFIT3 {interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3).  Type I IFNs (IFN- and IFN-β) are synthesized by various immune cell types (essentially plasmacytoid dendritic cells) or non-immune cells (fibroblasts) in response in particular to any viral infection inducing the stimulation of TLR receptors (Toii-Like). Receptof "). These IFNs cause the synthesis of a set of molecules with antiviral activity among which the molecules IFI44 (interferon-induced protein 44), IRF-1 (interferon responsive factor 1), IRF9 (interferon responsive factor 9) and IFIT3 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3).
L'IFN de type II correspond à HFN-γ et est principalement synthétisé par les lymphocytes-T et les cellules IMK ^Natural Ki/ief) au cours de pathologies inflammatoires, infectieuses ou néoplasiques. L'IFN- y est un puissant activateur macrophagique qui induit la synthèse de molécules pro-inflammatoires (chémokines, cytokines pro-inflammatoires) et de molécules de surface en rapport avec la présentation antigénique (molécules du complexe majeur d'histocompatibilité, molécules de co- stimulation).  IFN type II corresponds to HFN-γ and is mainly synthesized by T-lymphocytes and IMK ^ Natural Ki / ief cells) during inflammatory, infectious or neoplastic pathologies. IFN-γ is a potent macrophage activator that induces the synthesis of pro-inflammatory molecules (chemokines, pro-inflammatory cytokines) and surface molecules related to the antigenic presentation (molecules of the major histocompatibility complex, - stimulation).
Les IFNs de type III, découverts au début des années 2000, regroupent 3 molécules qui sont : l'interféron-λΐ ou IL-29, l'interféron^2 ou IL-28a et l'interféron^3 ou IL-28b (Sheppard et al., 2003, Nat. Immuno., 4 :63-8). Ces trois molécules partagent un récepteur commun de structure dimérique formé par : i) la chaîne beta du récepteur à l'IL-10 (IL-10Rp) et ii) une chaîne alpha nommée IL-28R . Comme les IFNs de type I, les IFNs de type III sont principalement synthétisés en réponse à une infection virale et induisent la production de molécules à propriété anti-virale qui sont similairement induites par les interférons de type I et de type III. Par ailleurs, les IFNs de type III, et en particulier riL-29, exercent une activité pro-inflammatoire présentant des analogies avec celle de l'Interféron-y (Pekarek et al., 2007, Gènes Immun., 8 : 177-80). L'expression du récepteur aux IFNs de type III a été mise en évidence dans différents types cellulaires immuns ou non immuns chez la souris et chez l'homme. Parmi ceux-ci, les neurones infectés, les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques et les cellules épithéliales peuvent notamment être cités. Malgré son rôle important dans la réponse immune, peu de travaux ont étudié l'expression des IFNs de type III chez l'homme, sans doute en raison du faible nombre de kits commerciaux actuellement développés et de leur très récente mise sur le marché (kits disponibles depuis 2009). A la connaissance des inventeurs, l'existence d'une élévation sérique d'un IFN de type III au cours d'une pathologie humaine a été mise en évidence, par exemple dans le cas de l'IL-29, chez les patients présentant une allergie respiratoire (rhinite ou asthme), ou chez des patients souffrants de lupus érythémateux disséminé (LED). Type III IFNs, discovered in the early 2000s, include 3 molecules that are: interferon-λΐ or IL-29, interferon-2 or IL-28a and interferon-3 or IL-28b (Sheppard et al., 2003, Nat. Immuno., 4: 63-8). These three molecules share a common dimeric structure receptor formed by: i) the IL-10 receptor beta chain (IL-10Rp) and ii) an alpha chain called IL-28R. Like type I IFNs, type III IFNs are primarily synthesized in response to a viral infection and induce the production of anti-viral-like molecules that are similarly induced by type I and type III interferons. Furthermore, type III IFNs, and in particular rIL-29, exert a pro-inflammatory activity similar to that of interferon-y (Pekarek et al., 2007, Genes Immun., 8: 177-80. ). The expression of the type III IFN receptor has been demonstrated in various immune or non-immune cell types in mice and humans. Among these, infected neurons, monocytes, macrophages, dendritic cells and epithelial cells can be cited in particular. Despite its important role in the immune response, few studies have investigated the expression of type III IFNs in humans, probably because of the small number of commercial kits currently being developed and their very recent release on the market. available since 2009). To the inventors' knowledge, the existence of a serum elevation of a type III IFN during a human pathology has been demonstrated, for example in the case of IL-29, in patients presenting respiratory allergy (rhinitis or asthma), or in patients with systemic lupus erythematosus (SLE).
Selon un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de détermination in vitro de la présence d'une sclérose en plaques primitivement progressive chez un sujet, comprenant, voire consistant en, les étapes suivantes :  According to a first aspect, the subject of the present invention is a method for determining, in vitro, the presence of a primary progressive multiple sclerosis in a subject, comprising, or even consisting of, the following steps:
a) détection d'un ou de plusieurs marqueur(s) choisi(s) parmi l'IL-29 et le récepteur IL-28Ra, dans un échantillon biologique à tester issu dudit sujet,  a) detecting one or more marker (s) chosen from IL-29 and the IL-28Ra receptor, in a biological sample to be tested from said subject,
b) comparer le niveau détecté avec celui d'un échantillon de référence ; la mise en évidence d'une différence significative de niveau détecté dans l'échantillon à tester par rapport à celui de l'échantillon de référence étant associée à la présence d'une sclérose en plaques primitivement progressive chez ledit sujet. b) compare the detected level with that of a reference sample; the detection of a significant difference in level detected in the test sample relative to that of the reference sample being associated with the presence of a previously progressive multiple sclerosis in said subject.
La mise en évidence d'une variation significative dans le niveau détecté d'au moins un des marqueurs de l'invention, à savoir I1L-29 ou l'IL-28Ra dans l'échantillon à tester permet de déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive chez un sujet, et en particulier la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, c'est-à-dire d'en affirmer le caractère évolutif, à savoir la nécessité de la mise en place d'un traitement de fond et/ou de sa poursuite et/ou d'une surveillance étroite de l'évolution clinique et/ou radiologique.  The detection of a significant variation in the detected level of at least one of the markers of the invention, namely IL-29 or IL-28Ra in the sample to be tested makes it possible to determine the presence of a Primary progressive MS in a subject, and in particular the presence of a progressively progressive MS that is to say, to affirm its evolutionary character, namely the need for the establishment of a background treatment and / or its continuation and / or close monitoring of the clinical and / or radiological evolution.
Le procédé de l'invention permet en particulier de déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive chez un sujet dont on suppose qu'il est atteint de cette forme de SEP sur la base du contexte clinique et/ou radiologique. Ce procédé permet donc tout particulièrement de confirmer un diagnostic encore incertain qui aurait été provisoirement établi en utilisant les données cliniques et/ou radiologiques, notamment dans le cas de SEP probable ou possible à forme primitivement progressive.  In particular, the method of the invention makes it possible to determine the presence of a progressively progressive MS in a subject who is presumed to have this form of MS on the basis of the clinical and / or radiological context. This method therefore makes it particularly possible to confirm a diagnosis that is still uncertain and that has been provisionally established using clinical and / or radiological data, particularly in the case of probable or possible MS with a primitively progressive form.
De plus, dans le cas de sujets ayant déjà eu des symptômes ou signes cliniques de la maladie, le procédé de l'invention permet également de confirmer la présence d'une SEP primitivement progressive à caractère évolutif (SEP primitivement progressive évolutive), c'est-à-dire d'une SEP primitivement progressive qui nécessite la mise en place d'un traitement de fond et/ou d'un suivi clinique et/ou radiologique étroit.  In addition, in the case of subjects having already had symptoms or clinical signs of the disease, the method of the invention also makes it possible to confirm the presence of a progressively progressive MS (evolutionarily progressive MS), that is to say, a progressively progressive MS that requires the establishment of a background treatment and / or close clinical and / or radiological monitoring.
Ainsi, l'expression « déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive ou d'une SEP à forme primitivement progressive» ou « présence d'une SEP primitivement progressive ou d'une SEP à forme primitivement progressive» selon l'invention définit à la fois :  Thus, the expression "to determine the presence of a primitively progressive MS or of a formally progressive MS" or "the presence of a previously progressive MS or a primitively progressive MS" according to the invention defines that time :
i) la mise en évidence d'une SEP primitivement progressive de manière certaine (SEP certaine à forme primitivement progressive), et notamment chez les patients pour lesquels une SEP primitivement progressive probable ou possible a été définie sur la base des critères radiologiques et/ou cliniques existants, et i) the demonstration of initially progressive MS in a certain way (certain MS with a primitive progressive form), and especially in patients for whom a probable or possible early progressive MS has been defined on the basis of existing radiological and / or clinical criteria, and
ii) la mise en évidence du caractère évolutif de la SEP primitivement progressive (SEP primitivement progressive évolutive) chez des patients dont on sait déjà qu'ils sont atteints d'une SEP certaine à forme primitivement progressive.  ii) the evidence of the progressive character of the initially progressive MS (initially progressive progressive MS) in patients already known to have a certain MS with a primitive progressive form.
D'une manière générale, le procédé selon l'invention permet de déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive chez un sujet, même si celui-ci est déjà sous traitement de fond, comme par exemple un traitement immunosuppresseur ou immunomodulateur.  In general, the method according to the invention makes it possible to determine the presence of a previously progressive progressive MS in a subject, even if the latter is already under background treatment, such as an immunosuppressive or immunomodulatory treatment.
De manière préférée, le procédé selon l'invention comprend, voire consiste en, la détection de l'IL-29 dans l'échantillon à tester pour déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive chez un sujet, et de préférence la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive.  Preferably, the method according to the invention comprises, or even consists of, the detection of IL-29 in the sample to be tested to determine the presence of a previously progressive MS in a subject, and preferably the presence of a primarily progressive progressive MS.
Au sens de la présente invention, le terme « détection » ou « détecter» signifie une détection in vitro ou ex-vivo. Par ailleurs, ces termes entendent désigner à la fois la mise en évidence de la présence et/ou la quantification de ces marqueurs au niveau nucléique ou au niveau protéique, mais également au niveau de l'activité spécifique de ces marqueurs. A cet effet, toute méthode de détection et/ou de quantification bien connue de l'homme du métier peut être utilisée pour la mise en œuvre de l'invention, que ce soit en rapport avec la détermination de la présence et/ou de l'expression et/ou de l'activité spécifique de ces marqueurs. En particulier, lorsque la détection et/ou la quantification de ces marqueurs est réalisée au niveau nucléique, et en particulier à partir d'ARN ou d'ADNc, celle-ci peut notamment être réalisée par analyse PCR, par hybridation micro-arrays ou Northern-blot. Lorsque la détection et/ou la quantification de ces marqueurs est réalisée au niveau protéique, les techniques standards telles que le Western-Blot, ELISA, RIA, IRMA, FIA, CLIA, ECL, cytométrie de flux ou immunocytologie peuvent être utilisées. Lorsque c'est l'activité spécifique de ces marqueurs qui est mise en évidence et/ou quantifiée, celle-ci pourra par exemple être déterminée par analyse de la capacité de l'échantillon biologique testé à inhiber l'effet cytopathique exercé par un virus (par exemple le Vesicular Somatic Virus aussi nommé VSV) sur une lignée cellulaire humaine sensible à ce virus (par exemple la lignée cellulaire HEP2 dans le cas du virus VSV) tel que décrit par Olivier et al., 2009, J Immunol Methods, vol. 351, p.41-45. For the purposes of the present invention, the term "detection" or "detect" means detection in vitro or ex vivo. Moreover, these terms intend to designate both the detection of the presence and / or the quantification of these markers at the nucleic or protein level, but also at the level of the specific activity of these markers. For this purpose, any method of detection and / or quantification well known to those skilled in the art can be used for the implementation of the invention, whether in connection with the determination of the presence and / or expression and / or specific activity of these markers. In particular, when the detection and / or quantification of these markers is carried out at the nucleic level, and in particular from RNA or cDNA, this can in particular be carried out by PCR analysis, by microarray hybridization or by Northern blot. When the detection and / or quantification of these markers is performed at the protein level, standard techniques such as Western blot, ELISA, RIA, IRMA, FIA, CLIA, ECL, flow cytometry or immunocytology can be used. When the specific activity of these markers is demonstrated and / or quantified, it may for example be determined by analysis of the capacity of the biological sample tested to inhibit the cytopathic effect exerted by a virus. (for example the Vesicular Somatic Virus also called VSV) on a human cell line sensitive to this virus (for example the HEP2 cell line in the case of the VSV virus) as described by Olivier et al., 2009, J. Immunol Methods, vol. . 351, p.41-45.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la détection du ou des marqueurs est réalisée au niveau protéique, et en particulier à l'aide de la technique ELISA.  According to a preferred embodiment of the invention, the detection of the marker (s) is carried out at the protein level, and in particular using the ELISA technique.
De manière particulièrement avantageuse, la présente invention concerne la détermination de la présence d'une SEP primitivement progressive à l'aide du procédé de l'invention comprenant, voire consiste en, la détection de I1L-29 dans l'échantillon à tester, et de préférence la détection de l'IL-29 au niveau protéique.  Particularly advantageously, the present invention relates to the determination of the presence of a progressively progressive MS by means of the process of the invention comprising or even consists of the detection of IL-29 in the sample to be tested, and preferably the detection of IL-29 at the protein level.
De manière encore plus préférée, la présente invention concerne un procédé de détermination in vitro de la présence d'une SEP primitivement progressive chez un sujet comprenant la détection de l'IL- 29 au niveau protéique dans un échantillon de sang, et en particulier de sérum, ou du liquide céphalo-rachidien issu dudit sujet.  Even more preferably, the present invention relates to a method for the in vitro determination of the presence of a primitively progressive MS in a subject comprising the detection of IL-29 at the protein level in a blood sample, and in particular of serum, or cerebrospinal fluid from said subject.
Au sens de la présente invention, les termes et expressions « marqueur », « marqueur de l'invention » ou « marqueur d'intérêt » désigne tout matériel biologique qui correspond à la présence, l'expression et/ou l'activité de l'IL-29et/ou de l'IL-28 a. Ledit matériel biologique peut notamment consister en des protéines, de l'acide désoxyribonucléique (ADN) ou de l'acide ribonucléique (ARN), et notamment des ARN messagers.  For the purposes of the present invention, the terms "marker", "marker of the invention" or "marker of interest" mean any biological material which corresponds to the presence, expression and / or activity of the IL-29 and / or IL-28a. Said biological material may especially consist of proteins, deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA), and especially messenger RNAs.
Dans le cadre de l'invention, la détection du ou des marqueur(s) d'intérêt, IL-29 et/ou IL-28Ra, entend concerner la détection du marqueur sous toutes ses formes de synthèse et/ou de maturation, que ce soit variant, précurseur, isoforme etc, du moment que ces formes sont spécifiques du marqueur concerné correspondant, c'est-à-dire qu'elles ne peuvent correspondre à un autre marqueur. In the context of the invention, the detection of the marker (s) of interest, IL-29 and / or IL-28Ra, is intended to concern the detection of the marker in all its forms of synthesis and / or maturation, which it is variant, precursor, isoform etc, as long as these forms are corresponding marker, that is to say that they can not correspond to another marker.
Ainsi, pour la présente invention, le ou les « marqueur(s) », « marqueur(s) de l'invention » ou « marqueur(s) d'intérêt » correspondent de préférence aux séquences de référence mentionnées ci- dessous, mais également à toute séquence qui correspond à une autre forme lors de la synthèse etyou de la maturation du marqueur codé par ces séquences de références, telle que variant, précurseur, isoforme etc, tant que cette séquence est spécifique du marqueur en question.  Thus, for the present invention, the "marker (s)", "marker (s) of the invention" or "marker (s) of interest" preferably correspond to the reference sequences mentioned below, but also to any sequence which corresponds to another form during the synthesis and / or processing of the marker encoded by these reference sequences, such as variant, precursor, isoform, etc., as long as this sequence is specific to the marker in question.
Pour les différents marqueurs selon l'invention, les séquences nucléiques de référence sont les suivantes :  For the different markers according to the invention, the reference nucleic sequences are the following:
-IL-29 : séquence de référence NCBI: NM_172140.1, et  IL-29: NCBI reference sequence: NM_172140.1, and
-IL-28Ra : séquence de référence NCBI: NM_170743.2.  IL-28Ra: NCBI reference sequence: NM_170743.2.
S'agissant de I1L-29 en particulier, des exemples de « variant, précurseur ou isoforme » sont notamment toute séquence nucléique qui présente plus de 86 % d'homologie avec la séquence dont elle est l'homologue, c'est-à-dire la séquence nucléique de référence ci-dessus correspondant à l'IL-29, et de préférence qui présente une homologie d'au moins 90 %, d'au moins 95 %, d'au moins 98 % ou d'au moins 99 % avec cette séquence de référence.  As regards IL-29 in particular, examples of "variant, precursor or isoform" are in particular any nucleic sequence which has more than 86% homology with the sequence of which it is homologous, ie the above reference nucleic sequence corresponding to IL-29, and preferably having a homology of at least 90%, at least 95%, at least 98% or at least 99% % with this reference sequence.
Pour les différents marqueurs selon l'invention, les séquences protéiques de référence sont les suivantes :  For the various markers according to the invention, the reference protein sequences are as follows:
-IL-29 : séquence de référence NCBI: NP_742152.1, et  IL-29: NCBI reference sequence: NP_742152.1, and
-IL-28Ra : séquence de référence GenBank: ΑΑΙ01409.1.  -IL-28Ra: GenBank reference sequence: ΑΑΙ01409.1.
S'agissant de l'IL-29 en particulier, des exemples de « variant, précurseur ou isoforme » sont notamment toute séquence protéique qui présente plus de 95 % d'homologie avec la séquence dont elle est l'homologue, c'est-à-dire la séquence protéique de référence ci-dessus correspondant à l'IL-29, et de préférence qui présente une homologie d'au moins 96 %, d'au moins 97 %, d'au moins 98 % ou d'au moins 99 % avec cette séquence de référence. S'agissant de l'IL-28R en particulier, des exemples de « variant, précurseur ou isoforme » sont notamment toute séquence, nucléique ou protéique, qui présente au moins 90 % d'homologie avec la séquence dont elle est l'homologue, c'est-à-dire les séquences nucléique ou protéique de référence respectives ci-dessus correspondant à l'IL-28Ra, et de préférence qui présente une homologte d'au moins 95 %, d'au moins 97 %, d'au moins 98 % ou d'au moins 99 % avec ces séquences de référence. As regards IL-29 in particular, examples of "variant, precursor or isoform" are in particular any protein sequence which has more than 95% homology with the sequence of which it is the homologous, ie that is, the above reference protein sequence corresponding to IL-29, and preferably having a homology of at least 96%, at least 97%, at least 98% or at least minus 99% with this reference sequence. As regards IL-28R in particular, examples of "variant, precursor or isoform" are in particular any sequence, nucleic or proteinic, which has at least 90% homology with the sequence of which it is homologous, i.e., the respective above-mentioned respective nucleic or protein reference sequences corresponding to IL-28Ra, and preferably having an at least 95% homolog, of at least 97%, of at least at least 98% or at least 99% with these reference sequences.
Le terme « homologie » se réfère à la similarité qui est calculée par alignement optimal entre deux séquences. La similarité d'une séquence par rapport à une séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus qui sont identiques ou qui diffèrent par des substitutions conservatives, lorsque les deux séquences sont alignées de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles.  The term "homology" refers to the similarity that is calculated by optimal alignment between two sequences. The similarity of a sequence with respect to a reference sequence is assessed as a function of the percentage of residues which are identical or which differ by conservative substitutions, when the two sequences are aligned so as to obtain the maximum of correspondence between them.
Le pourcentage d'homologie peut être calculé par l'homme du métier en utilisant les méthodes qui sont connues dans le domaine, et en particulier le programme informatique de comparaison de séquences tel que celui de la suite BLAST (Altschul et al., Nucleic Acid Research, 1997, 25, 3389-3402).  The percentage of homology can be calculated by those skilled in the art using the methods which are known in the art, and in particular the sequence comparison computer program such as that of the BLAST suite (Altschul et al., Nucleic Acid Research, 1997, 25, 3389-3402).
Au sens de la présente invention, on entend par « substitution conservative », toute substitution d'une base par une autre qui conduit à l'obtention d'une protéine identique en séquence, en particulier du fait de la dégénérescence du code génétique, ou toute substitution d'un résidu par un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge, polarité etc) qui généralement ne modifie pas les propriétés fonctionnelles de la protéine.  For the purposes of the present invention, "conservative substitution" is understood to mean any substitution of one base by another which leads to the production of an identical protein in sequence, in particular because of the degeneracy of the genetic code, or any substitution of a residue by another that has similar chemical or physical properties (size, charge, polarity etc.) that generally does not alter the functional properties of the protein.
En plus de la détection d'un ou de plusieurs des marqueurs d'intérêt, le procédé de l'invention peut également comprendre la détection conjointe d'un ou de plusieurs autres marqueurs biologiques de la SEP, sans que cela ne soit pour autant nécessaire pour pouvoir déterminer la présence de la maladie dans le cadre de l'invention. Ainsi, le procédé peut comprendre la détection conjointe d'un ou de plusieurs marqueurs d'intérêt selon l'invention avec un ou plusieurs autres marqueurs biologiques de la SEP connu(s) dans le domaine. In addition to detecting one or more of the markers of interest, the method of the invention may also include the joint detection of one or more other biomarkers of MS, without this being necessary. to be able to determine the presence of the disease in the context of the invention. Thus, the method may include the joint detection of one or more markers of interest according to the invention with one or more other biomarkers of MS known in the art.
Au sens de la présente invention, on entend par « échantillon à tester », tout échantillon biologique susceptible de contenir le ou les marqueurs à détecter et provenant du sujet ou du patient chez qui on souhaite déterminer la présence d'une sclérose en plaques.  For the purposes of the present invention, the term "sample to be tested", any biological sample may contain the marker or markers to be detected and from the subject or the patient in whom it is desired to determine the presence of multiple sclerosis.
Par conséquent, l'échantillon biologique à tester utilisé dans le cadre du procédé selon l'invention peut être de différente nature. En particulier, l'échantillon biologique à tester est choisi parmi les fluides biologiques tels que le sang, le sang total (tel que collecté de la voie veineuse, c'est-à-dire contenant les cellules blanches et rouges, les plaquettes et le plasma), le sérum, le plasma, l'urine, le liquide synovial, le liquide céphalo-rachidien, la lymphe, ainsi que les tissus tels que le tissu cérébral ou le tissu nerveux ou encore des cellules isolées à partir d'un tel tissu, du moment qu'elles contiennent le ou les marqueurs d'intérêt.  Therefore, the biological sample to be tested used in the context of the process according to the invention can be of different nature. In particular, the biological sample to be tested is chosen from biological fluids such as blood, whole blood (as collected from the venous route, that is to say containing the white and red cells, the platelets and the plasma), serum, plasma, urine, synovial fluid, cerebrospinal fluid, lymph, as well as tissues such as brain tissue or nerve tissue or cells isolated from such tissue, as long as they contain the marker (s) of interest.
De préférence, l'échantillon biologique à tester est choisi parmi le sang, et en particulier le sérum, et le liquide céphalo-rachidien.  Preferably, the biological sample to be tested is selected from blood, and in particular serum, and cerebrospinal fluid.
Le niveau du ou des marqueurs qui est détecté dans l'échantillon biologique à tester est alors comparé à celui détecté dans un échantillon de référence.  The level of the marker (s) that is detected in the biological sample to be tested is then compared with that detected in a reference sample.
Dans le cadre de l'invention, l'échantillon de référence peut être tout échantillon biologique issu d'un sujet sain ou d'un pool de sujets sains, en particulier non atteint(s) ou suspecté(s) d'être atteint(s) de SEP. L'échantillon de référence peut également être issu du même sujet que celui dont est issu l'échantillon à tester mais correspondre à un stade antérieur du suivi du patient. Par exemple, effectué lors d'un prélèvement précédent dans le cadre du suivi qui est mis en place pour le patient concerné.  In the context of the invention, the reference sample may be any biological sample derived from a healthy subject or from a pool of healthy subjects, in particular not affected (s) or suspected (s) to be reached ( s) from SEP. The reference sample may also be from the same subject as the one from which the test sample originated but correspond to an earlier stage of the patient's follow-up. For example, performed during a previous sampling as part of the follow-up that is set up for the patient concerned.
L'échantillon de référence peut également être constitué par tout échantillon, biologique ou non biologique, qui a été préalablement calibré pour contenir une valeur moyenne du ou des marqueur(s) à détecter qui correspond au niveau qui a été détecté sur un pool d'échantillons biologiques issus de sujets sains ou du même sujet mais correspondant à un stade antérieur. Ainsi, avant la détection du ou des marqueurs proprement dite dans l'échantillon à tester, le procédé de l'invention peut comprendre l'obtention préalable de cette valeur moyenne, et à laquelle le niveau qui sera détecté dans l'échantillon à tester pourra être comparé afin de déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive selon l'invention. The reference sample may also consist of any sample, biological or non-biological, which has been previously calibrated to contain an average value of the marker (s) to be detected. is the level that has been detected on a pool of biological samples from healthy subjects or the same subject but corresponding to an earlier stage. Thus, before the detection of the markers themselves in the sample to be tested, the method of the invention may comprise the prior obtaining of this average value, and at which the level that will be detected in the sample to be tested can to be compared in order to determine the presence of a progressively progressive MS according to the invention.
Lorsqu'il est biologique, l'échantillon de référence peut être de différentes natures et notamment choisi parmi les échantillons biologiques qui sont mentionnés ci-dessus concernant l'échantillon à tester (fluide, tissu, cellules, etc). De préférence, l'échantillon de référence qui est utilisé selon l'invention est un échantillon biologique de même nature (fluide, tissu, cellules etc) que celui de l'échantillon biologique à tester ou d'une nature compatible pour constituer une référence quant à la détection des marqueurs à détecter.  When it is biological, the reference sample may be of different types and in particular chosen from the biological samples which are mentioned above concerning the sample to be tested (fluid, tissue, cells, etc.). Preferably, the reference sample which is used according to the invention is a biological sample of the same nature (fluid, tissue, cells, etc.) as that of the biological sample to be tested or of a compatible nature to constitute a reference as to the detection of the markers to be detected.
En outre, les échantillons à tester et de référence qui sont comparés pour la détection des marqueurs sont de préférence issus de personnes ayant les mêmes caractéristiques ou une majorité de caractéristiques communes, notamment du même sexe et/ou d'un âge similaire ou identique et/ou de même origine ethnique.  In addition, the test and reference samples that are compared for the detection of the markers are preferably from persons having the same characteristics or a majority of common characteristics, in particular of the same sex and / or of a similar or identical age, and / or of the same ethnic origin.
Dans le cas de l'utilisation d'un échantillon de référence préalablement calibré comme indiqué ci-dessus, cet échantillon sera bien évidemment choisi en fonction du ou des marqueur(s) testé(s), c'est-à- dire que l'échantillon de référence sera calibré pour le ou les marqueur(s) que l'on cherche à détecter dans l'échantillon à tester.  In the case of the use of a reference sample previously calibrated as indicated above, this sample will obviously be chosen according to the marker (s) tested (s), that is to say that The reference sample will be calibrated for the marker (s) that are to be detected in the sample to be tested.
Selon l'invention, la mise en évidence d'une différence significative de niveau détecté du ou des marqueurs d'intérêt dans l'échantillon à tester par rapport à celui de l'échantillon de référence est associée à la présence d'une sclérose en plaques primitivement progressive, et permet ainsi de poser le diagnostic d'une SEP certaine à forme primitivement progressive. De manière préférée, cette différence permet d'affirmer le caractère évolutif de cette forme de la maladie. Dans ce cas particulier, et en plus de ceux mentionnés ci-dessus, l'échantillon de référence peut également correspondre à celui de patients atteints de SEP jugée non- évolutive ou non-active, et en particulier de SEP primitivement progressive jugée non-évolutive ou non-active sur ia base des critères cliniques et/ou radiologiques pertinents pour cette forme de la maladie. According to the invention, the detection of a significant difference in the detected level of the marker (s) of interest in the sample to be tested compared with that of the reference sample is associated with the presence of a sclerosis. primitively progressive plaques, and thus makes it possible to pose the diagnosis of a certain SEP with primitively progressive form. In a preferred manner, this difference makes it possible to affirm the evolutionary nature of this form of the disease. In this particular case, and in addition to those mentioned above, the reference sample may also correspond to that of patients with MS considered non-progressive or non-active, and in particular of previously progressive MS considered non-progressive. or non-active on the basis of clinical and / or radiological criteria relevant for this form of the disease.
La différence observée lors de la mise en œuvre du procédé de l'invention peut être une augmentation. Dans le cadre de l'invention, une augmentation définit à la fois la détection d'un niveau significativement supérieur dans l'échantillon à tester par rapport à celui détecté dans l'échantillon de référence ou bien une présence dans l'échantillon à tester par rapport à une absence dans l'échantillon de référence.  The difference observed during the implementation of the method of the invention may be an increase. In the context of the invention, an increase defines both the detection of a significantly higher level in the sample to be tested than that detected in the reference sample or a presence in the sample to be tested by compared to an absence in the reference sample.
La différence observée peut également être une diminution. Dans le cadre de l'invention, une diminution définit à la fois la détection d'un niveau significativement inférieur dans l'échantillon à tester par rapport à celui détecté dans l'échantillon de référence ou bien une absence dans l'échantillon à tester par rapport à une présence dans l'échantillon de référence.  The observed difference can also be a decrease. In the context of the invention, a decrease defines both the detection of a significantly lower level in the sample to be tested than that detected in the reference sample or an absence in the sample to be tested by relation to a presence in the reference sample.
Ainsi, et comme mentionné ci-dessus, la détection au sens de l'invention peut aussi bien revêtir un aspect qualitatif que quantitatif.  Thus, and as mentioned above, the detection in the sense of the invention can take both a qualitative and a quantitative aspect.
Cependant, il est à noter que l'absence de différence significative du niveau détecté dans l'échantillon à tester par rapport à l'échantillon de référence ne permet pas d'exclure l'existence d'une SEP primitivement progressive, évolutive ou non chez le sujet testé.  However, it should be noted that the absence of a significant difference in the level detected in the test sample compared to the reference sample does not make it possible to exclude the existence of a previously progressive, progressive or non-progressive MS. the tested subject.
Bien évidemment, l'absence d'un marqueur d'intérêt dans un des échantillons ou le niveau détecté dépendra de différents facteurs, et notamment de la technique de détection utilisée et de sa sensibilité, de la nature des échantillons analysés, du type de détection choisi (protéique, nucléique, activité, etc).  Of course, the absence of a marker of interest in one of the samples or the level detected will depend on various factors, including the detection technique used and its sensitivity, the nature of the samples analyzed, the type of detection chosen (protein, nucleic, activity, etc.).
Dans le cadre de l'invention, un « niveau significativement inférieur ou supérieur » peut correspondre à l'absence de détection dans l'échantillon testé par comparaison à un niveau détectable dans l'échantillon de référence ou au contraire à l'absence de détection dans l'échantillon de référence par comparaison à un niveau détectable dans l'échantillon testé. Alternativement, un « niveau significativement inférieur ou supérieur » peut correspondre à un niveau inférieur ou supérieur d'au moins un facteur 2 par rapport au niveau détecté dans l'échantillon de référence, de préférence inférieur ou supérieur d'au moins un facteur 3 par rapport au niveau d'expression détecté dans l'échantillon de référence. In the context of the invention, a "significantly lower or higher level" may correspond to the absence of detection in the sample tested by comparison with a detectable level in the reference sample or on the contrary with the absence of detection in the reference sample compared to a detectable level in the sample tested. Alternatively, a "significantly lower or higher level" may correspond to a level which is at least a factor 2 lower or higher than the level detected in the reference sample, preferably at least a factor of 3 or less by ratio to the level of expression detected in the reference sample.
Selon une variante préférée de l'invention, la mise en évidence d'une augmentation du niveau d'IL-29 dans l'échantillon biologique à tester par rapport à l'échantillon de référence est associée à la présence d'une SEP primitivement progressive, et de préférence à la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé.  According to a preferred variant of the invention, the demonstration of an increase in the level of IL-29 in the biological sample to be tested relative to the reference sample is associated with the presence of a previously progressively progressive MS. and, preferably, the presence of a progressively progressive MS, particularly for those in whom the diagnosis of certain MS has already been made.
Selon une autre variante de la présente invention, la mise en évidence d'une diminution du niveau du récepteur IL-28Ra dans l'échantillon biologique à tester par rapport à l'échantillon de référence est associée à la présence d'une SEP primitivement progressive, et de préférence à la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé.  According to another variant of the present invention, the demonstration of a decrease in the level of the IL-28Ra receptor in the biological sample to be tested relative to the reference sample is associated with the presence of a previously progressively progressive MS. and, preferably, the presence of a progressively progressive MS, particularly for those in whom the diagnosis of certain MS has already been made.
Selon encore une autre variante, le procédé de l'invention peut être défini comme comprenant, voire consistant en, les étapes de détection de la présence ou de l'augmentation du niveau d'IL-29 et/ou de détection de la diminution du niveau du récepteur IL-28Ra ou de son absence dans l'échantillon biologique à tester par rapport à l'échantillon de référence, étant entendu que cette présence ou augmentation et/ou cette diminution ou absence est(sont) associée(s) à la présence d'une SEP primitivement progressive, et de préférence à la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé. Selon un autre aspect de l'invention, celle-ci a pour objet l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un composé ou d'un réactif ou d'une pluralité de composés ou de réactifs capable(s) de détecter spécifiquement un ou plusieurs marqueur(s) choisi(s) parmi l'IL-29 et le récepteur IL-28R , pour déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive, et de préférence la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé. According to yet another variant, the method of the invention may be defined as including, or even consisting of, the steps of detecting the presence or increase of the IL-29 level and / or detecting the decrease in the level of IL-29. level of the IL-28Ra receptor or its absence in the biological sample to be tested in relation to the reference sample, it being understood that this presence or increase and / or this decrease or absence is (are) associated with the presence of a previously progressive MS, and preferably in the presence of a progressively progressive MS, particularly for those in whom the diagnosis of certain MS is already made. According to another aspect of the invention, it relates to the use in vitro or ex vivo of a compound or a reagent or a plurality of compounds or reagents capable of specifically detecting a or more than one marker selected from IL-29 and the IL-28R receptor, to determine the presence of a progressively progressive MS, and preferably the presence of a progressively progressive MS, especially for subjects in whom the diagnosis of certain MS is already made.
Selon un mode de réalisation préférée, la présence d'une SEP primitivement progressive, et de préférence la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine est déjà posé, est déterminée par l'utilisation in vitro ou ex vivo d'un composé ou d'un réactif ou d'une pluralité de composés ou de réactifs capable(s) de détecter spécifiquement l'IL-29.  According to a preferred embodiment, the presence of a previously progressive MS, and preferably the presence of a progressively progressive MS progressively, particularly for subjects in whom the diagnosis of certain MS is already made, is determined by the use of in vitro or ex vivo a compound or a reagent or a plurality of compounds or reagents capable (s) specifically detect IL-29.
Parmi les composés ou réactifs capable(s) de détecter spécifiquement un ou plusieurs des marqueurs susmentionnés, on peut notamment citer des anticorps spécifiques ou des fragments ou dérivés de ceux-ci, par exemple des anticorps « single chain » Sv, mais aussi des peptides ou encore des acides nucléiques ou des fragments de ceux-ci tels que des amorces (ou primer) ou couples d'amorces spécifiques qui détectent et/ou amplifient le gène correspondant au(x) marqueurs(s) choisi(s), des sondes, des constructions anti-sens, des ARNi, des ribozymes etc correspondant au(x) marqueurs(s) choisi(s).  Among the compounds or reagents capable of specifically detecting one or more of the abovementioned markers, particular mention may be made of specific antibodies or fragments or derivatives thereof, for example single chain antibodies Sv, but also peptides. or nucleic acids or fragments thereof such as primers (or primer) or specific pairs of primers which detect and / or amplify the gene corresponding to the chosen marker (s), probes , antisense constructs, RNAi, ribozymes, etc. corresponding to the chosen marker (s).
Les modes de réalisation préférés qui sont mentionnés ci-dessus concernant le procédé constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant de cette utilisation.  The above-mentioned preferred embodiments of the method are also preferred embodiments with respect to this use.
Selon un dernier aspect, la présente invention a pour objet une trousse ou kit pour la détermination in vitro de la présence d'une sclérose en plaques primitivement progressive, et de préférence la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine à forme primitivement progressive est déjà posé. According to a last aspect, the subject of the present invention is a kit or kit for the in vitro determination of the presence of a primitively progressive multiple sclerosis, and preferably the presence of a progressively progressive MS, especially for subjects with which the diagnosis of certain SEP with primitively progressive form is already posed.
Cette trousse comprend :  This kit includes:
- un ou plusieurs composés ou réactifs capable(s) chacun de détecter spécifiquement un marqueur choisi(s) parmi l'IL-29 et le récepteur IL- one or more compounds or reagents each capable of specifically detecting a marker selected from IL-29 and the IL-2 receptor;
28Ra, 28Ra,
- un échantillon témoin positif, et éventuellement  - a positive control sample, and possibly
- un échantillon témoin négatif.  - a negative control sample.
Les modes de réalisation préférés qui sont mentionnés ci-dessus concernant le ou les composés ou réactifs capable(s) de détecter spécifiquement le ou les marqueur(s) d'intérêt constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant de la trousse ou kit selon l'invention.  The preferred embodiments which are mentioned above concerning the compound (s) or reagent (s) capable of specifically detecting the marker (s) of interest are also preferred embodiments with respect to the kit or kit. according to the invention.
En particulier, le kit de l'invention contient au moins un composé ou réactif capable de détecter spécifiquement I1L-29. Il peut en outre contenir un composé capable de détecter spécifiquement HL-28R .  In particular, the kit of the invention contains at least one compound or reagent capable of specifically detecting IL-29. It may further contain a compound capable of specifically detecting HL-28R.
L'échantillon témoin positif est de préférence un échantillon biologique issu d'un patient ou d'un pool de patients atteints de SEP primitivement progressive, et de préférence atteints de SEP certaine à forme primitivement progressive. Il peut également correspondre à un échantillon biologique issu d'un ou de plusieurs patients atteints d'une SEP primitivement progressive évolutive, et en particulier de SEP certaine à forme primitivement progressive et dont le caractère évolutif a été préalablement confirmé sur la base des critères cliniques et/ou radiologiques pertinents pour cette forme de la maladie.  The positive control sample is preferably a biological sample from a patient or pool of patients with initially progressive MS, and preferably with certain MS having a primitively progressive form. It may also correspond to a biological sample derived from one or more patients with a previously progressive progressive MS, and in particular from certain MS with initially progressive form and whose evolutionary character has been confirmed beforehand on the basis of clinical criteria. and / or radiological relevant for this form of the disease.
De même que pour l'échantillon de référence mentionné ci-dessus, l'échantillon témoin positif peut également être constitué par tout échantillon, biologique ou non biologique, qui a été préalablement calibré pour contenir une valeur moyenne du ou des marqueur(s) à détecter qui correspond au niveau moyen qui a été détecté sur un pool d'échantillons biologiques issus de patients atteints de SEP certaine à forme primitivement progressive ou sur un pool d'échantillons biologiques issus de patients atteints de SEP certaine à forme primitivement progressive et dont le caractère évolutif a été préalablement confirmé. As for the reference sample mentioned above, the positive control sample may also consist of any sample, biological or non-biological, which has been previously calibrated to contain an average value of the marker (s) to detect that corresponds to the average level that has been detected on a pool of biological samples from patients with certain MS with initially progressive form or on a pool of biological samples from of patients with certain MS with primitively progressive form and whose evolutionary character was previously confirmed.
L'échantillon témoin négatif est en particulier un échantillon qui ne contient pas le ou les marqueurs) choisi(s), comme par exemple un échantillon de sujet sain, ou un échantillon, biologique ou non biologique, pour lequel la détection du ou des marqueur(s) choisi(s) est ou a été rendue impossible. Dans ce cas, la méthode utilisée pour empêcher la détection du ou des marqueur(s) d'intérêt dans l'échantillon témoin négatif sera adaptée à la méthode de détection utilisée pour l'échantillon à tester dans le cadre du procédé de l'invention. Par exemple, si le marqueur d'intérêt est détecté pour sa présence au niveau protéique, la méthode utilisée pour rendre impossible la détection dudit marqueur dans l'échantillon témoin négatif sera une méthode permettant d'empêcher la détection de la protéine en question, sans pour autant empêcher la présence du gène et/ou du messager codant cette protéine. De même, si le marqueur d'intérêt est détecté pour la mise en évidence de l'activité d'une protéine, alors la méthode utilisée pour rendre impossible la détection de l'activité de cette protéine dans l'échantillon témoin négatif sera une méthode permettant de rendre cette protéine inactive, sans pour autant empêcher l'expression du gène codant cette protéine et/ou la présence de la protéine elle-même tant que son activité est indétectable.  The negative control sample is in particular a sample which does not contain the chosen marker (s), such as for example a sample of a healthy subject, or a sample, biological or non-biological, for which the detection of the marker (s) (s) chosen is or has been made impossible. In this case, the method used to prevent the detection of the marker (s) of interest in the negative control sample will be adapted to the detection method used for the sample to be tested in the process of the invention. . For example, if the marker of interest is detected for its presence at the protein level, the method used to make it impossible to detect said marker in the negative control sample will be a method to prevent the detection of the protein in question, without however, to prevent the presence of the gene and / or messenger encoding this protein. Similarly, if the marker of interest is detected for the demonstration of the activity of a protein, then the method used to make it impossible to detect the activity of this protein in the negative control sample will be a method to render this protein inactive, without preventing the expression of the gene encoding this protein and / or the presence of the protein itself as long as its activity is undetectable.
Les échantillons témoins positif et témoin négatif peuvent être de différentes natures. Sur ce point, les modes de réalisation préférés qui sont mentionnés ci-dessus concernant la nature de l'échantillon à tester et de l'échantillon de référence constituent également des modes de réalisation préférés s'agissant des échantillons témoins positif et témoin négatif contenus dans la trousse ou kit selon l'invention.  The positive control and negative control samples may be of different natures. On this point, the preferred embodiments mentioned above concerning the nature of the test sample and the reference sample are also preferred embodiments for the positive and negative control control samples contained in the kit or kit according to the invention.
Le kit ou trousse de l'invention est un kit apte et destiné à la détermination de la présence d'une SEP primitivement progressive selon l'invention. Ainsi, il peut en outre comprendre des instructions d'utilisation des différents constituants du kit ou de la trousse permettant de déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive selon l'invention, et de préférence d'une SEP primitivement progressive évolutive. Cette trousse permet donc de déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive et de préférence la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine à forme primitivement progressive est déjà posé. The kit or kit of the invention is a kit suitable for determining the presence of a previously progressively progressive MS according to the invention. Thus, it may further comprise instructions for using the various components of the kit or the kit for determining the presence of a previously progressive MS according to the invention, and preferably a progressively progressive progressive MS. This kit thus makes it possible to determine the presence of a previously progressive MS and preferably the presence of a previously progressive progressive MS, particularly for the subjects in whom the diagnosis of certain MS with a primitively progressive form has already been made.
En particulier, ces instructions indiquent dans quelle mesure la détection du ou des marqueur(s) concerné(s) permet d'établir la présence d'une SEP primitivement progressive selon l'invention. De préférence ces instructions indiquent dans quelle mesure la mise en évidence d'une différence significative du niveau du ou des marqueur(s) détecté(s) dans l'échantillon à tester permet de conclure à la présence d'une SEP primitivement progressive, et de préférence à la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive, notamment pour les sujets chez lesquels le diagnostic de SEP certaine à forme primitivement progressive est déjà posé, comme détaillé notamment ci-dessus concernant le procédé de l'invention.  In particular, these instructions indicate to what extent the detection of the marker (s) concerned (s) allows to establish the presence of a previously progressive MS according to the invention. Preferably, these instructions indicate to what extent the detection of a significant difference in the level of the marker (s) detected in the sample to be tested makes it possible to conclude to the presence of a previously progressively progressive MS. preferably in the presence of a progressively progressive MS progressive, especially for those in whom the diagnosis of certain SEP primitively progressive form is already laid, as detailed in particular above concerning the method of the invention.
Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci-dessous qui montrent, à titre d'exemples non limitatifs, des formes de réalisation de l'objet de l'invention.  Various other characteristics appear from the description given below which show, by way of non-limiting examples, embodiments of the subject of the invention.
EXEMPLES EXAMPLES
Analyse transcriptomique  Transcriptomic analysis
Afin d'identifier un marqueur sérique diagnostic de la SEP nous avons développé une approche originale qui consiste en l'analyse transcriptomique large (analyse par "Gene Array*') de macrophages dérivés du sang.  In order to identify a serum diagnostic marker for MS we have developed an original approach that consists of broad transcriptomic analysis ("Gene Array *" analysis) of macrophages derived from blood.
Deux groupes appariés en âge et en sexe ont été étudiés :  Two groups matched in age and sex were studied:
- sujets sains (témoins ; n = 3),  - healthy subjects (witnesses, n = 3),
- patients atteints de forme primitivement progressive de SEP prélevés au moment du diagnostic et ne suivant pas de traitement (patients SEP ; n =3) D'après le suivi ultérieur des patients après les prélèvements, les patients SEP analysés dans cette étude présentent tous une forme jugée évolutive de la maladie car: i) le recours à un traitement immunosuppresseur a été nécessaire dans les 3 ans qui ont suivis le prélèvement, ii) la pente d'aggravation du handicap dans les 3 ans s'est avérée égale ou supérieure à celle attendue pour cette forme de SEP, sur la base des données épidémiologiques connues. - patients with initially progressive MS at the time of diagnosis and not on treatment (MS patients, n = 3) Based on the subsequent follow-up of the patients after the specimens, the MS patients analyzed in this study all have a form considered to be progressive because: i) the immunosuppressive treatment was necessary within 3 years after the sampling; (ii) the worsening rate of disability within 3 years was found to be equal to or greater than that expected for this form of MS, based on known epidemiological data.
Les cellules mononucléées des patients et des sujets témoins ont été isolées sur gradient de ficoll et stockées à -80°C dans la collection "NeuroBioTec" du Centre de Ressources Biologiques des Hospices Civils de Lyon. Parmi les dizaines de prélèvements de cette nature stockés à NeuroBioTec, l'analyse rétrospective des dossiers cliniques a ensuite permis de sélectionner 3 patients atteints de formes primitivement progressive et dont l'évolution ultérieure attestait de l'évolutivité au moment du prélèvement.  The mononuclear cells of the patients and control subjects were isolated on ficoll gradient and stored at -80 ° C in the "NeuroBioTec" collection of the Biological Resources Center of the Hospices Civils de Lyon. Among the dozens of samples of this nature stored at NeuroBioTec, the retrospective analysis of the clinical records then made it possible to select 3 patients with primitively progressive forms and whose subsequent evolution evidenced the evolution at the time of sampling.
Les cellules ont été ensuite décongelées et cultivées en présence de M-CSF f macrophage cofony-stimulating factoi") pendant 7 jours. Puis, les cellules surnageantes ont été éliminées, permettant ainsi d'obtenir une population de cellules adhérentes constituée à plus de 95% de macrophages (cette méthode de culture a été validée par immunomarquage d'au moins 10 cultures macrophagiques avec les anticorps anti-CDllb ou anti-CD68). Les ARNm totaux ont ensuite été extraits puis étudiés par la technique de "gene arra sur la plateforme d'analyse ProfileXpert (Plateforme de biologie moléculaire de l'Institut Fédératif des Neurosciences de Lyon). Le niveau d'expression de près de 30 000 gènes a ainsi pu être comparé entre les deux groupes.  The cells were then thawed and cultured in the presence of M-CSF (cofony-stimulating macrophage for 7 days.) Then the supernatant cells were removed, thereby obtaining an adherent population of more than 95 cells. % of macrophages (this culture method was validated by immunostaining at least 10 macrophage cultures with the anti-CD11b or anti-CD68 antibodies.) The total mRNAs were then extracted and studied by the technique of "arra gene on the ProfileXpert analysis platform (Molecular Biology Platform of the Federative Institute of Neuroscience of Lyon). The expression level of nearly 30,000 genes could thus be compared between the two groups.
Pour chaque comparaison, seuls les gènes exprimés dans l'ensemble des échantillons ont été pris en compte soit un total de près de 15 000 gènes. Une moyenne d'expression a été établie pour chaque gène, puis des comparaisons de moyennes ont été réalisées et seules les variations d'un facteur supérieur ou égal à 2 ont été retenues. Par ailleurs, dans chaque groupe étudié (Témoins vs SEP), les gènes pour lesquelles les valeurs inter-échantillons ont été jugées trop importantes ont été exclus de l'analyse (gènes pour lesquels le rapport de la moyenne des valeurs sur l'écart-type était supérieur ou égal à 2). For each comparison, only the genes expressed in the set of samples were taken into account, ie a total of nearly 15,000 genes. An average expression was established for each gene, then comparisons of averages were made and only the variations of a factor greater than or equal to 2 were retained. Moreover, in each group studied (controls vs SEP), genes for which inter-sample values were considered too important were excluded from the analysis (genes for which the ratio of the mean of the values to the standard deviation was greater than or equal to 2).
L'analyse comparative des résultats de gene array obtenus dans les deux groupes a ainsi permis d'identifier 194 gènes différentiellement exprimés d'un facteur au moins égal à 2 dont 154 gènes augmentés d'un facteur au moins égal à 2 et 40 gènes diminués d'un facteur au moins égal à 2 chez les patients SEP par rapport aux témoins.  The comparative analysis of the gene array results obtained in the two groups thus made it possible to identify 194 genes differentially expressed by a factor of at least 2, including 154 genes increased by a factor of at least 2 and 40 decreased genes. by a factor of at least 2 in MS patients compared with controls.
Parmi les 154 gènes augmentés d'un facteur au moins égal à 2, 15 sont des gènes immuns (le caractère immun de ces gènes a été établi sur la base de la littérature et du logiciel DAVID). De façon surprenante 4 des 15 gènes immuns surexprimés sont des gènes de réponse aux IFNs de type I ou III (ISG pour « Interferon Stimulated Gènes»). Il s'agit par ordre décroissant d'expression différentielle de : IFI44 (interferon-induced protein 44)(tème position/154, lière position/15 gènes immuns), IRF-1 (interferon regulatory factor i)(9ieme position/154, 2ieme position/15 gènes immuns), IFU3 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats)(17,ème position/154, 4ième position/15 gènes immuns) et IRF-9 (interferon regulatory factor )(148ième position/154, 15ième position/15 gènes immuns) (Tableau 1). Of the 154 genes increased by a factor of at least 2, 15 are immune genes (the immunity of these genes was established on the basis of literature and DAVID software). Surprisingly 4 of the 15 overexpressed immune genes are type I or III IFNs (ISGs for "Interferon Stimulated Genes") response genes. This is in descending order of differential expression of: IFI44 (Interferon-induced protein 44) (t th position / 154, the position st / 15 immune genes), IRF-1 (interferon regulatory factor i) (9 th position / 154, 2 nd position / 15 immune genes) IFU3 (interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats) (17 th position / 154, 4 th position / 15 immune genes) and IRF-9 (interferon regulatory factor) (148 th position / 154, 15 th position / 15 immune genes) (Table 1).
Par ailleurs, parmi les 15 gènes immuns surexprimés, on trouve la présence d'un seul récepteur cytokinique : la chaîne alpha du récepteur à l'IL-10)(15ième position/154, 3ième position/15 gènes immuns). Il faut noter que la chaîne alpha du récepteur à l'IL-10 est spécifique au récepteur à l'IL-10 et est à distinguer de la chaîne beta du récepteur à l'IL-10 qui est partagée par plusieurs récepteurs cytokiniques (récepteur à l'IL-10, récepteur aux IFNs de type III et récepteur à l'IL-22 notamment). Bien que des gènes de réponse aux IFNs de type I ou III soient augmentés chez les patients SEP, les récepteurs aux IFN de type I, IFNAR1 (interferon alpha, beta and om ga receptor 1) et IFNAR2 (interferon alpha, beta and oméga receptor 2) ne figurent pas parmi les 154 gènes augmentés. En revanche, la chaîne alpha du récepteur aux IFN de type III, l'IL28Ra, est l'un des 3 gènes immuns diminués chez les patients SEP par rapport aux sujets témoins (Tableau 1). Ainsi, parmi les 40 gènes diminués d'un facteur au moins égal à 2 chez les patients SEP par rapport aux Témoins, on identifie 3 gènes immuns qui sont : la chaîne alpha du récepteur aux IFN de type III (l'IL28Ra), la chaîne beta du récepteur à la cytokine IL-17E (cytokine encore nommée IL-25) et l'intégrine CD61 (Tableau 1). Moreover, among the 15 overexpressed immune genes, there is the presence of a single cytokine receptor: the IL-10 receptor alpha chain (15 th position / 154, 3 th position / 15 immune genes). It should be noted that the IL-10 receptor alpha chain is IL-10 receptor-specific and is distinct from the IL-10 receptor beta chain that is shared by several cytokine receptors (receptor). IL-10, type III IFN receptor and IL-22 receptor in particular). Although type I or III IFN genes are increased in MS patients, IFN type I receptors IFNAR1 (interferon alpha, beta and oma receptor 1) and IFNAR2 (interferon alpha, beta and omega receptor 2) are not among the 154 augmented genes. In contrast, the alpha channel of the IFN receptor III, IL28Ra, is one of 3 immune genes decreased in MS patients compared to control subjects (Table 1). Thus, among the 40 genes decreased by a factor of at least 2 in MS patients compared to controls, 3 immune genes are identified: the alpha channel of the IFN receptor type III (IL28Ra), the IL-17E cytokine receptor beta chain (cytokine still called IL-25) and CD61 integrin (Table 1).
Tableau 1 Table 1
Rapport > 2 {gènes dont le niveau d'expression est augmenté d'un facteur au moins égal à 2)  Ratio> 2 {genes whose level of expression is increased by a factor of at least 2)
154 gènes dont 15 gènes immuns incluant, par ordre décroissant d'expression différentielle :  154 genes including 15 immune genes including, in descending order of differential expression:
* IFI44 (7*™ position/154, X 3,11)  * IFI44 (7 * ™ position / 154, X 3,11)
* IRF-1 (9ième position/154, X 3,03) * IRF-1 (9-th position / 154 X 3.03)
* IL-10R alpha (15ième position/154, X 2,81) * IL-10R alpha (15-th position / 154 X 2.81)
* IF1T3 (17ième position/154, X 2,71) * IF1T3 (17-th position / 154 X 2.71)
* IRF-9 (148ième position/154, X 2,01) * IRF-9 ( 148th position / 154, X 2.01)
Rapport < 0,5 {gènes dont le niveau d'expression est diminué d'un facteur au moins égal à 2)  Ratio <0.5 {genes whose level of expression is decreased by a factor of at least 2)
40 gènes dont 3 gènes immuns :  40 genes including 3 immune genes:
* IL28-R alpha  * IL28-R alpha
* IL-17E R  * IL-17E R
* CD61  * CD61
Dosages ELISA ELISA assays
Des dosages de l'IL-28, de l'IL-29 et de l'IFN-alpha ont été réalisés sur des prélèvements de sera congelés et conservés au sein de la collection "NeuroBioTec" du Centre de Ressources Biologiques des Hospices Civils de Lyon. Des kits commerciaux vendus par Biolegend (Ozyme) ont été utilisés pour doser l'IL-28a (IFN^2)(Ref kit : 435507) et l'IL-29 (IFN- l)(Ref Kit : 435607). Un kit commercial « Verikine TM human interferon alpha » de chez "PBL Interféron Source" distribué par Tebu Bio a été utilisé pour doser IIFNa (Ref kit : 41105). Assays of IL-28, IL-29 and IFN-alpha were performed on samples of sera frozen and preserved in the "NeuroBioTec" collection of the Biological Resources Center of the Civil Hospices of Lyon. Commercial kits sold by Biolegend (Ozyme) were used to assay IL-28a (IFN-2) (Ref kit: 435507) and IL-29 (IFN-1) (Ref Kit: 435607). A commercial kit «Verikine TM human interferon alpha "from" PBL Interferon Source "distributed by Tebu Bio was used to assay IIFNa (Ref kit: 41105).
Les sera dérivés des populations suivantes ont été analysées : The will be derived from the following populations were analyzed:
- 50 sujets témoins sains ; - 50 healthy control subjects;
- 10 patients atteints de glioblastome (tumeur maligne primitive du cerveau s'accompagnant d'une réaction inflammatoire) ;  - 10 patients with glioblastoma (primary malignant brain tumor with an inflammatory reaction);
- 10 patients atteints de pathologies neuro-inflammatoires autres que la SEP (maladie de Devic, vascularite, ADEM (Acute Disseminated EncephaloMyelitis, myélite) ;  - 10 patients with neuroinflammatory diseases other than MS (Devic's disease, vasculitis, ADEM (Acute Disseminated EncephaloMyelitis, myelitis);
- 16 patients atteints d'une forme primitivement progressive de - 16 patients with a primitively progressive form of
SEP, sans traitement au moment du prélèvement ; MS, no treatment at the time of collection;
- 12 patients atteints d'une forme primitivement progressive de - 12 patients with a primitively progressive form of
SEP, suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (Cellcept,MS, following a background treatment at the time of collection (Cellcept,
Endoxan, Elsep, Imurel) ; Endoxan, Elsep, Imurel);
- 21 patients atteints d'une forme rémittente de SEP, sans traitement au moment du prélèvement ;  - 21 patients with relapsing MS, without treatment at the time of collection;
- 74 patients atteints d'une forme rémittente de SEP, suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (Rebif 44, Avonex, Rebif 22, Betaferon, Tysabri, Copaxone, Cellcept, Imurel) ;  - 74 patients with relapsing MS, following a baseline treatment at the time of sampling (Rebif 44, Avonex, Rebif 22, Betaferon, Tysabri, Copaxone, Cellcept, Imurel);
- 26 patients atteints d'une forme secondairement progressive de - 26 patients with a secondarily progressive form of
SEP, suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (Cellcept, Endoxan, Methotrexate, Endoxan, Imurel). MS, following a background treatment at the time of collection (Cellcept, Endoxan, Methotrexate, Endoxan, Imurel).
Les résultats ont montré l'absence d'IL-28 détectable dans l'ensemble des sera testés dérivant de sujets témoins sains (n = 10) ou de patients SEP atteints d'une forme primitivement progressive de SEP, sans traitement au moment du prélèvement (n = 16). Dans le groupe glioblastome, 2 patients présentaient des taux détectables d'IL-28, respectivement à 38,23 pg/ml et 18,25 pg/ml.  The results showed no detectable IL-28 in all sera will be tested derived from healthy control subjects (n = 10) or MS patients with a primitively progressive form of MS, without treatment at the time of sampling (n = 16). In the glioblastoma group, 2 patients had detectable levels of IL-28 at 38.23 pg / ml and 18.25 pg / ml, respectively.
L'IFN s'est révélé indétectable dans les seras dérivant des groupes de patients suivants (Tableau 2) :  IFN was undetectable in sera derived from the following groups of patients (Table 2):
- patients atteints d'une forme rémittente de SEP, sans traitement au moment du prélèvement (n = 21) - patients atteints d'une forme rémittente de SEP, suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (Rebif 44, Avonex, Rebif 22, Betaferon, Tysabri, Copaxone, Cellcept, Imurel)(n = 74) ; - patients with relapsing MS, without treatment at the time of collection (n = 21) - patients with relapsing MS, undergoing baseline treatment at the time of sampling (Rebif 44, Avonex, Rebif 22, Betaferon, Tysabri, Copaxone, Cellcept, Imurel) (n = 74);
- patients atteints d'une forme secondairement progressive de SEP, suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (Cellcept, - Patients with secondarily progressive MS, following baseline treatment at the time of collection (Cellcept,
Endoxan, Methotrexate, Endoxan, Imurel)(n = 26). Endoxan, Methotrexate, Endoxan, Imurel) (n = 26).
En revanche, LIF a s'est révélé détectable chez 2 patients sur 10 atteints d'une pathologie neuro-inflammatoire autre que la SEP (11 pg/ml, 9 pg/ml), chez 3 sujets témoins sains sur 40 testés (14 pg/ml, 305 pg/ml, 21 pg/ml) et chez 2 patients sur 12 atteints d'une forme primitivement progressive, suivant un traitement au moment du prélèvement (69 pg/ml, 19 pg/ml)(Tableau 2).  In contrast, LIF a was found to be detectable in 2 out of 10 patients with neuroinflammatory pathology other than MS (11 μg / ml, 9 μg / ml), in 3 out of 40 healthy controls (14 μg / ml, 305 μg / ml, 21 μg / ml) and in 2 out of 12 patients with a primitively progressive form, following treatment at the time of sampling (69 μg / ml, 19 μg / ml) (Table 2).
Tableau 2 Table 2
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* SEP rémittentes sans traitement de fond au moment du prélèvement (n = 21) ou suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (n = 74). * MS remitting without basal treatment at the time of collection (n = 21) or following a background treatment at the time of collection (n = 74).
** SEP secondairement progressives suivant un traitement de fond au moment du prélèvement. ** SEP secondarily progressive following a background treatment at the time of sampling.
*** SEP primitivement progressives suivant un traitement de fond au moment du prélèvement.  *** SEP originally progressive following a background treatment at the time of sampling.
L'IL-29 s'est révélée indétectable chez 49 des 50 sujets témoins sains et les seras dérivant des groupes de patients suivants (Tableau 3) : - patients atteints d'une forme rémittente de SEP, sans traitement au moment du prélèvement (n = 21) ; IL-29 was undetectable in 49 of 50 healthy control subjects and sera derived from the following groups of patients (Table 3): - patients with relapsing MS, without treatment at the time of collection (n = 21);
- patients atteints d'une forme rémittente de SEP, suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (Rebif 44, Avonex, Rebif 22, Betaferon, Tysabri, Copaxone, Cellcept, Imurel)(n = 74) ;  - patients with relapsing MS, undergoing baseline treatment at the time of sampling (Rebif 44, Avonex, Rebif 22, Betaferon, Tysabri, Copaxone, Cellcept, Imurel) (n = 74);
- patients atteints d'une forme secondairement progressive de SEP, suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (Cellcept, Endoxan, Methotrexate, Endoxan, Imurel)(n = 26) ;  - Patients with secondarily progressive MS, following baseline treatment at the time of collection (Cellcept, Endoxan, Methotrexate, Endoxan, Imurel) (n = 26);
- patients atteints de pathologies neuro-inflammatoires autres que la SEP (maladie de Devic, vascularite, ADEM {Acute Disseminated - patients with neuroinflammatory diseases other than MS (Devic's disease, vasculitis, ADEM {Acute Disseminated
EncephaioMyelitis, myélite), et EncephaioMyelitis, myelitis), and
- patients atteints de glioblastome (n = 10).  - patients with glioblastoma (n = 10).
L1L-29 s'est révélée détectable chez un sujet témoin sain sur 50 sera testés (2364 pg/ml), chez 3 patients sur 16 atteints d'une forme primitivement progressive de SEP, sans traitement au moment du prélèvement (290 pg/ml, 396 pg/ml, 478 pg/ml) et chez 3 patients sur 12 atteints d'une forme primitivement progressive de SEP, suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (349 pg/ml, 173 pg/ml, 190 pg/ml)(Tableau 3).  L1L-29 was found to be detectable in one out of 50 healthy control subjects will be tested (2364 pg / ml), in 3 out of 16 patients with a primitively progressive form of MS, without treatment at the time of collection (290 pg / ml , 396 μg / ml, 478 μg / ml) and in 3 out of 12 patients with a primitively progressive form of MS, following a baseline treatment at the time of sampling (349 μg / ml, 173 μg / ml, 190 μg / ml). ml) (Table 3).
Tableau 3 Table 3
Détection  Detection
sérique dlL-29  serum dlL-29
SEP rémittente* (n = 95) 0  MS remitting * (n = 95) 0
SEP secondairement 0  SEP secondarily 0
progressive** (n = 26)  progressive ** (n = 26)
SEP primitivement 6 (21,4%)  SEP originally 6 (21.4%)
progressive*** (n = 28)  progressive *** (n = 28)
Pathologies neuro-inflammatoires 0  Neuroinflammatory diseases 0
autres que la SEP (n = 10)  other than MS (n = 10)
Gliome (n = 10) 0  Glioma (n = 10) 0
Témoins sains (n = 50) 1 (2%) * SEP rémittentes sans traitement de fond au moment du prélèvement (n = 21) ou suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (n = 74). Healthy Witnesses (n = 50) 1 (2%) * MS remitting without basal treatment at the time of collection (n = 21) or following a background treatment at the time of collection (n = 74).
** SEP secondairement progressives suivant un traitement de fond au moment du prélèvement. ** SEP secondarily progressive following a background treatment at the time of sampling.
*** SEP primitivement progressives sans traitement de fond au moment du prélèvement (n = 16) ou suivant un traitement de fond au moment du prélèvement (n = 12).  *** SEP originally progressive without basal treatment at the time of sampling (n = 16) or following a background treatment at the time of sampling (n = 12).
Par conséquent, ces résultats démontrent que :  Therefore, these results demonstrate that:
i) l'IL-29 est un marqueur sérique diagnostique de la SEP à forme primitivement progressive, que les patients suivent ou non un traitement au moment du prélèvement ;  i) IL-29 is a serum diagnostic marker for early-stage MS, regardless of whether patients are receiving treatment at the time of collection;
ii) l'IL-28 n'est pas détectable dans les SEP à forme primitivement progressive et ne peut donc servir de marqueur diagnostique pour ces formes de SEP ;  ii) IL-28 is not detectable in primitively progressive MS and therefore can not be used as a diagnostic marker for these forms of MS;
iii) IIFIMa est détectable dans les formes primitivement progressive de SEP mais l'est également dans un pourcentage non négligeable de sujets témoins sains (7,5 %) ou de patients atteints de pathologies neuro-inflammatoires autres que la SEP (20 %) ; l'IFNa ne peut donc servir de marqueur diagnostique pour les SEP à forme primitivement progressive ;  iii) IIFIMa is detectable in the initially progressive forms of MS but is also detectable in a significant percentage of healthy control subjects (7.5%) or patients with neuroinflammatory diseases other than MS (20%); IFNa can not therefore be used as a diagnostic marker for initially progressive MS;
iv) l'IL-29 peut servir de marqueur d'évolutivité chez les patients SEP à forme primitivement progressive suivant un traitement de fond.  iv) IL-29 can be used as a scalability marker in initially progressive MS patients following DMARD.
En conclusion, le dosage d'IL-29 dans le sang peut donc être utilisé comme marqueur diagnostique ou comme marqueur d'évolutivité de la SEP à forme primitivement progressive.  In conclusion, the measurement of IL-29 in the blood can therefore be used as a diagnostic marker or as a marker of progression of MS in primitively progressive form.
L'invention n'est pas limitée aux exemples décrits et représentés car diverses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre.  The invention is not limited to the examples described and shown since various modifications can be made without departing from its scope.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détermination in vitro de la présence d'une sclérose en plaques primitivement progressive chez un sujet, comprenant, voire consistant en, les étapes suivantes :  A method for in vitro determination of the presence of a primitively progressive multiple sclerosis in a subject, comprising, or even consisting of, the following steps:
a) détection d'un ou de plusieurs marqueur(s) choisi(s) parmi l'IL-29 et le récepteur IL-28Ra, dans un échantillon biologique à tester issu dudit sujet,  a) detecting one or more marker (s) chosen from IL-29 and the IL-28Ra receptor, in a biological sample to be tested from said subject,
b) comparer le niveau détecté avec celui d'un échantillon de référence ;  b) compare the detected level with that of a reference sample;
la mise en évidence d'une différence significative de niveau détecté dans l'échantillon à tester par rapport à celui de l'échantillon de référence étant associée à la présence d'une sclérose en plaques primitivement progressive chez ledit sujet. the detection of a significant difference in level detected in the test sample relative to that of the reference sample being associated with the presence of a previously progressive multiple sclerosis in said subject.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la mise en évidence d'une augmentation du niveau d'IL-29 dans l'échantillon biologique à tester par rapport à l'échantillon de référence est associée à la présence d'une SEP primitivement progressive.  2. Method according to claim 1, characterized in that the demonstration of an increase in the level of IL-29 in the biological sample to be tested relative to the reference sample is associated with the presence of a SEP originally progressive.
3. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que la mise en évidence d'une diminution du niveau du récepteur IL-28Ra dans l'échantillon biologique à tester par rapport à l'échantillon de référence est associée à la présence d'une SEP primitivement progressive,  3. Method according to claim 1 or claim 2, characterized in that the demonstration of a decrease in the level of the IL-28Ra receptor in the biological sample to be tested relative to the reference sample is associated with the presence of a predominantly progressive MS
4. Procédé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend, voire consiste en, la détection de l'IL-29 dans l'échantillon à tester.  4. Method according to claim 1 or claim 2, characterized in that it comprises, or even consists of, the detection of IL-29 in the sample to be tested.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la mise en évidence d'une différence significative de niveau détecté dans l'échantillon à tester par rapport à celui de l'échantillon de référence est associée à la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive chez ledit sujet. 5. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the detection of a significant difference in level detected in the test sample compared to that of the reference sample is associated with the presence of a previously progressive progressive MS in the subject.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon biologique à tester est choisi parmi le sang et le liquide céphalo-rachidien. 6. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the biological sample to be tested is selected from blood and cerebrospinal fluid.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'échantillon de référence est un échantillon biologique issu d'un sujet sain ou d'un pool de sujets sains.  7. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the reference sample is a biological sample from a healthy subject or a pool of healthy subjects.
8. Utilisation in vitro ou ex vivo d'un composé ou d'un réactif ou d'une pluralité de composés ou de réactifs capable(s) de détecter spécifiquement un ou plusieurs marqueur(s) choisi(s) parmi I1L-29 et le récepteur IL-28Ra, pour déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive.  8. In vitro or ex vivo use of a compound or a reagent or a plurality of compounds or reagents capable of specifically detecting one or more selectable marker (s) from IL-29 and the IL-28Ra receptor, to determine the presence of a primitively progressive MS.
9. Utilisation selon la revendication 8, pour déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive évolutive.  9. Use according to claim 8 for determining the presence of a progressively progressive progressive MS.
10. Utilisation selon la revendication 8 ou la revendication 9, caractérisée en ce que ledit composé ou réactif ou ladite pluralité de composés ou de réactifs est(sont) capable(s) de détecter spécifiquement I1L-29.  10. Use according to claim 8 or claim 9, characterized in that said compound or reagent or said plurality of compounds or reagents is (are) capable of specifically detecting IL-29.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 8 à 10, caractérisée en ce que ledit ou lesdits composé(s) ou réactif(s) est(sont) choisi(s) parmi des anticorps spécifiques ou des fragments ou dérivés de ceux-ci, des peptides ou des acides nucléiques ou des fragments de ceux- ci.  11. Use according to any one of claims 8 to 10, characterized in that said compound (s) or reagent (s) is (are) chosen from specific antibodies or fragments or derivatives thereof. ci, peptides or nucleic acids or fragments thereof.
12. Trousse ou kit pour la détermination in vitro de la présence d'une sclérose en plaques primitivement progressive, comprenant :  12. Kit or kit for the in vitro determination of the presence of a primary progressive multiple sclerosis, comprising:
- un ou plusieurs composés ou réactifs capable(s) chacun de détecter spécifiquement un marqueur choisi(s) parmi l'IL-29 et te récepteur IL- 28Ra,  one or more compounds or reagents each capable of specifically detecting a marker chosen from IL-29 and the IL-28Ra receptor,
- un échantillon témoin positif, et éventuellement  - a positive control sample, and possibly
- un échantillon témoin négatif.  - a negative control sample.
13. Trousse ou kit selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'échantillon témoin positif est un échantillon biologique issu d'un patient ou d'un pool de patients atteints de SEP primitivement progressive ou d'une SEP primitivement progressive évolutive. Kit or kit according to claim 12, characterized in that the positive control sample is a biological sample from a patient or a pool of patients with primarily progressive MS or previously progressive progressive MS.
14. Trousse ou kit selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend en outre des instructions d'utilisation des différents constituants du kit ou de la trousse permettant de déterminer la présence d'une SEP primitivement progressive, et de préférence d'une SEP primitivement progressive évolutive.  14. Kit or kit according to claim 12 or claim 13, characterized in that it further comprises instructions for using the various components of the kit or kit for determining the presence of a previously progressive MS, and preferably a progressively progressive MS.
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