JP7255897B2 - Alsのバイオマーカーおよびalsの診断方法 - Google Patents
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Description
ALSでは神経伝達に関わるグルタミン受容体の1つであるAMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid)受容体の異常が運動ニューロン死の原因であることが突き止められている。
具体的には、ALS患者の運動ニューロンでは、AMPA受容体のカルシウム透過性を規定するサブユニットであるGluA2に本来生ずべきRNA編集(DNAがRNAに転写された後、RNA塩基に変化が生じる現象のこと。ALSに関わるRNA編集は、アデノシンがイノシンへ変換される脱アミノ基反応(以下「A-I RNA編集」)である。)が起こらず未編集型GluA2が発現するため、カルシウム透過性が異常に高いAMPA受容体が発現していること、そして、GluA2が未編集型となるのは、RNA編集酵素であるadenosine deaminase acting on RNA 2(ADAR2)酵素の発現低下(ダウンレギュレーション)によることなどが明らかにされた(非特許文献1、非特許文献2および非特許文献3)。
未編集型GluA2には、イオンチャネルポアの内腔に面する部位(Q/R部位)にグルタミン(Q)が存在するが、編集型GluA2では、A-I RNA編集によってアルギニン(R)に変換される。編集型GluA2のQ/R部位は、陽性電荷のRのため、カルシウムイオンの流入を妨げるのに対し、未編集型GluA2ではこの部位が中性電荷のQのため、カルシウム透過性を示す。
さらに、孤発性ALS患者の神経病理的特徴である運動ニューロン中のTDP-43(transactive response DNA-binding protein of 43kDa)の細胞内局在異常(TDP-43病理)が、孤発性ALS患者のADAR2がダウンレギュレートされた運動ニューロンにおいて例外なく確認されている(非特許文献5)。
以上のように、ADAR2のダウンレギュレーションがALS患者の運動ニューロン死と密接に関連していることが明らかにされた。
以上のように、本発明者らは、ADAR2活性依存的にその編集率が変動するA-I RNA編集部位を有する細胞外(すなわち、体液中)のRNAがALSのバイオマーカーとして利用できることを初めて見出し本発明を完成させた。
(1)ALSの病態を診断する方法であって、診断サンプル中に存在するADAR2依存性A-I RNA編集部位のヌクレオチドを同定する工程を含む、前記方法。
(2)ALSの病態を診断する方法であって、以下の(a)~(d)の工程を含むことを特徴とする上記(1)に記載の方法。
(a)診断サンプル中に存在するRNAのADAR2依存性A-I RNA編集部位のヌクレオチドを同定する工程、
(b)工程(a)で同定したヌクレオチドがアデニン(A)またはイノシン(I)である割合を算出する工程、および
(c)工程(b)で算出したAまたはIの割合と、健常者のADAR2依存性A-I RNA編集部位のヌクレオチドがAまたはIである割合とを、各々、比較する工程
(3)前記ADAR2依存性A-I RNA編集部位が、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第178番目の位置、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第191番目の位置、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第192番目の位置、配列番号2で表されるCYFIP2 mRNAの核酸配列中第171番目の位置、配列番号3で表されるGluA2 mRNAの核酸配列中第28番目の位置、配列番号3で表されるGluA2 mRNAの核酸配列中第498番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第202番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第672番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第720番目の位置、配列番号5で表されるTMEM63B mRNAの核酸配列中第157番目の位置および/または配列番号6で表されるcircGRIA2(has_circ_0125620)の核酸配列中第409番目であることを特徴とする上記(1)または(2)に記載の方法。
(4)前記診断サンプルが体液由来であることを特徴とする上記(1)ないし(3)のいずれかに記載の方法。
(5)前記体液が、髄液または血液のいずれかであることを特徴とする上記(4)に記載の方法。
(6)ALSの病態を診断するためのバイオマーカーであって、ADAR2依存性A-I RNA編集部位を有する1または複数のRNA分子からなるバイオマーカー。
(7)前記ADAR2依存性A-I RNA編集部位が、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第178番目の位置、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第191番目の位置、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第192番目の位置、配列番号2で表されるCYFIP2 mRNAの核酸配列中第171番目の位置、配列番号3で表されるGluA2 mRNAの核酸配列中第28番目の位置、配列番号3で表されるGluA2 mRNAの核酸配列中第498番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第202番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第672番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第720番目の位置、配列番号5で表されるTMEM63B mRNAの核酸配列中第157番目の位置および/または配列番号6で表されるcircGRIA2(has_circ_0125620)の核酸配列中第409番目であることを特徴とする上記(6)に記載のバイオマーカー。
(8)ADAR2依存性A-I RNA編集部位を有する1または複数のRNA分子のALSバイオマーカーとしての使用。
(9)前記ADAR2依存性A-I RNA編集部位が、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第178番目の位置、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第191番目の位置、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第192番目の位置、配列番号2で表されるCYFIP2 mRNAの核酸配列中第171番目の位置、配列番号3で表されるGluA2 mRNAの核酸配列中第28番目の位置、配列番号3で表されるGluA2 mRNAの核酸配列中第498番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第202番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第672番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第720番目の位置、配列番号5で表されるTMEM63B mRNAの核酸配列中第157番目の位置および/または配列番号6で表されるcircGRIA2(has_circ_0125620)の核酸配列中第409番目であることを特徴とする上記(8)に記載の使用。
(10)ALSの病態を診断するために使用するキットであって、少なくともADAR2依存性A-I RNA編集部位のヌクレオチドを同定するための要素を含むキット。
本発明の第1の実施形態のALSの病態の診断方法(以下「本発明のALS診断方法」とも記載する)は、診断対象者がALSを発症しているかどうかを判断するために使用できることはもちろんのこと、すでにALSを発症した患者の治療経過を判断するためにも使用することができる。従って、本発明の第1の実施形態は、「ALSの病態の診断を補助する方法」でもある。また、本実施形態における「ALS」には、運動ニューロンのADAR2ダウンレギュレーションが原因でALSの病態を発症するものであれば、孤発性ALSのみならず家族性ALSも含まれる。
本発明のALS診断方法は、より具体的には、ALSの病態を診断する方法であって、以下の(a)~(d)の工程を含むことを特徴とする診断方法である。
(a)診断サンプル中に存在するRNAのADAR2依存性A-I RNA編集部位のヌクレオチドを同定する工程、
(b)工程(a)で同定したヌクレオチドがアデニン(A)またはイノシン(I)である割合を算出する工程、および
(c)工程(b)で算出したAまたはIの割合と、健常者のADAR2依存性A-I RNA編集部位のヌクレオチドがAまたはIである割合とを、各々、比較する工程
また、本明細書中の「ADAR2依存性A-I RNA編集」とは、運動ニューロン中において、転写後のRNA中のアデノシン(A)がADAR2酵素活性によりイノシン(I)に変換されることを意味し、「ADAR2依存性A-I RNA編集」とは、ADAR2酵素活性によりIに変換されるAの位置のことをいう。
健常者由来の運動ニューロンのRNA配列とALS患者由来の運動ニューロンのRNA配列を比較し、健常者由来のRNAに比べ、ALS患者由来のRNAでは編集率が低下している部位をADAR2依存性A-I RNA編集部位とすることができる。あるいは、健常な非ヒト動物由来の運動ニューロンのRNA配列とADAR2をノックダウンしたALSモデル非ヒト動物(例えば、AR2マウスなど)由来の運動ニューロンのRNA配列を比較し、健常な非ヒト動物由来のRNAに比べALSモデル非ヒト動物由来のRNAで編集率が低下している部位を検出し、ヒトにおいて相同部位が認められたらADAR2依存性A-I RNA編集部位としてもよい。
健常なヒトまたは非ヒト動物の運動ニューロンから抽出したRNAの配列を決定し、得られた配列情報と当該動物のゲノム配列情報(データバンク等に登録されているゲノム配列情報)とを比較し、ゲノム配列情報ではAであるのに対し運動ニューロン由来のRNA上ではGと検出された位置をADAR2依存性A-I RNA編集集部位の候補部位とする。ADAR2依存性A-I RNA編集部位の候補部位を非ヒト動物において同定した場合は、非ヒト動物の候補部位と相同なヒトゲノム上の位置を、ヒトのADAR2依存性A-I RNA編集部位の候補部位としてもよい。また、ヒト運動ニューロン中のA-I RNA編集部位の検索については、例えば、Picardi et al., Sci Rep. 5:14941 DOI: 10.1038/srep14941 2015などを参照して行ってもよい。
得られた候補部位には、ADAR1による編集部位も含まれている。候補部位のうち実際にADAR2による編集を受けている部位であるかどうかは、例えば、ALS患者またはADAR2をノックダウンしたALSモデル非ヒト動物に由来する運動ニューロンにおける候補部位のA-I編集率(AがIに変換される効率。例えば、候補部位のヌクレオチドがAであるRNAとIであるRNAの総和に対するIであるRNAの割合)と健常者または健常動物に由来する候補部位のA-I編集率を比較することで確認できる。あるいは、ADAR2を過剰発現させた細胞株および/またはADAR2をノックダウンした細胞株等に由来する候補部位のA-I編集率とコントロールの細胞株(ADAR2の過剰発現またはノックダウンが行われていない細胞)に由来する候補部位のA-I編集率を比較することで確認できる。以上の確認の結果、ADAR2活性の変化によりA-I編集率が明らかに変動している候補部位を「ADAR2依存性A-I RNA編集」とすることができる。
より具体的には、例えば、ADAR2依存性A-I RNA編集部位が、
配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第178番目の位置、
配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第191番目の位置、
配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第192番目の位置、
配列番号2で表されるCYFIP2 mRNAの核酸配列中第171番目の位置、
配列番号3で表されるGluA2 mRNAの核酸配列中第28番目の位置、
配列番号3で表されるGluA2 mRNAの核酸配列中第498番目の位置、
配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第202番目の位置、
配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第672番目の位置、
配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第720番目の位置、
配列番号5で表されるTMEM63B mRNAの核酸配列中第157番目の位置または、
配列番号6で表されるcircGRIA2(has_circ_0125620)の核酸配列中第409番目である場合には、診断サンプルから抽出したRNAから調製したcDNAを鋳型として、各々、例えば、表1に示すプライマーペアを用いて、表2に示すPCR条件にてこれらのA-I RNA編集部位を含むRNA領域を増幅し、その増幅産物のシークエンスを行うことでA-I RNA編集部位のヌクレオチドが何であるかを確認することができる(なお、配列番号1~6は、各mRNAの配列を示している)。circGRIA2(has_circ_0125620)は環状RNAであるため、図1に未編集の配列とともに、バックスプライシングによる結合位置を示した。
なお、表1に示すプライマーペアおよび表2に示すPCR条件は1例でありこれらの表に示されるプライマーペアおよびPCR条件に限定されるものではない。
工程(c)において、健常者のADAR2依存性A-I RNA編集部位のヌクレオチドがAまたはIである割合は、工程(a)および工程(b)の「診断サンプル」を健常者由来のサンプル(すなわち、ALSを発症していない者に由来する体液(例えば、血液、脳脊髄液など)などの生体サンプル)に置き換えて、各工程を実施することで算出できる。あるいは、健常者のADAR2依存性A-I RNA編集部位のA-I編集率データがすでに存在する場合には、そのデータと比較してもよい。工程(c)における比較の結果、診断サンプル中のADAR2依存性A-I RNA編集部位のA-I編集率(Iに変換される率)が健常者由来のサンプル中の当該A-I編集率よりも有意に低い場合、被験者はALSを発症しているか、または、発症している可能性があると判断することができる。
なお、ALSの診断にあたっては、複数のADAR2依存性A-I RNA編集部位のA-I編集率を求めて総合的に判断してもよい。
第2の実施形態におけるバイオマーカー(以下「本発明のバイオマーカー」とも記載する)は、第1の実施形態で説明した「ADAR2依存性A-I RNA編集部位」を有するRNA分子であれば、直鎖状RNA、環状RNAのいずれであってもよいが、体液中において比較的安定に存在する環状RNAがより好ましい。本発明の第2の実施形態は、「ALSの病態の診断を補助するためのバイオマーカー」でもある。
ADAR2依存性A-I RNA編集部位を有するRNA分子としては、限定はしないが、例えば、配列番号1で表される核酸配列を含むADAR2 pre-mRNA、配列番号2で表される核酸配列を含むCYFIP2 mRNA、配列番号3で表される核酸配列を含むGluA2 mRNA、配列番号4で表される核酸配列を含むSON mRNA、配列番号5で表される核酸配列を含むTMEM63B mRNAおよび配列番号6で表される核酸配列を含む環状のcircGRIA2(has_circ_0125620)を挙げることができる。
本発明の第3の実施形態にかかるALSバイオマーカーとしての使用には、ADAR2依存性A-I RNA編集部位を有する1または複数のRNA分子をALSの診断を行うための使用(またはALSの診断を補助するための使用)、ALSの病態解明のための使用など、ALSに関連する情報を取得するためのあらゆる使用が含まれる。
第4の実施形態において、「ADAR2依存性A-I RNA編集のヌクレオチドを同定するための要素」とは、サンプル中に存在するADAR2依存性A-I RNA編集部位のヌクレオチドを同定するために必要なもののことで、限定はしないが、例えば、当該A-I RNA編集部位を含むRNAから調製したcDNAを鋳型として、当該A-I RNA編集部位に対応する部位を含むcDNA領域をPCR増幅するためのプライマーペア、当該A-I RNA編集部位付近に認識配列を持つ制限酵素であってA-I編集によってその認識配列が消失または出現する制限酵素などを挙げることができる。当該キットには、さらに、ADAR2依存性A-I RNA編集部位のヌクレオチドを同定するために使用する試薬や、使用説明書(電磁的記録媒体に保存されている場合を含む)などが含まれていてもよい。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、本実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
1-1.動物
実験に使用したマウスは、ホモ接合性コンディショナルADAR2ノックアウトマウス(ADAR2flox/flox/VAChT-Cre.Fast;AR2マウス)で、VAChT(vesicular acetylcholine transporter)プロモーターで発現制御されるCreのターゲットであるfloxed ADARB1アリルを有する(Hideyama et al., J Neurosci, 30, 11917-11925 2010)。コントロールとしてノックアウトマウスと同系統(C57BL/6J mice;Oriental Yeast Co., Ltd.)、同週齢の野生型マウスを使用した。全ての動物実験は、東京大学動物取扱委員会により承認され、日本国文部科学省の動物実験ガイドラインに従って行った。
7週齢のマウス脊髄由来の凍結切片(20 μm)をcryostat(Model CM1850;Leica Microsystems GmbH)で調製し、スライドグラス(MATSUNAMI)に静置した。静置した凍結切片を100 %メタノールで40秒間固定した後、0.05 %のトルイジンブルーで1分間染色し、70 %のエタノールで4回リンスしたのち、完全に乾燥させた。運動ニューロンは、マイクロダイセクションシステム(Laser Micro Dissector 7000;Leica Microsystems GmbH)を用いて前角から切り出し、RNeasy micro Kit(QIAGEN)に添付のRLTバッファー(200 μl)を入れたチューブに回収した。切り出した単一運動ニューロンの数は、1,912~2,214であった。全てのサンプルは、使用時まで-80℃で保存した。
運動ニューロンサンプルから、RNeasy micro Kitを用いてRNA抽出およびDNaseI処理を行った。リボソームRNAを除くために、抽出した総RNAをRiboGone mammalian kit(Takara Bio)で処理した。RNAシークエンス用のcDNAライブラリーは、SMARTer Stranded RNA-Seq Kit(Takara Bio)を使用して総RNAから合成し、Illumina HiSeqTM2000(Illumina, Inc.)を用いてシークエンスを行った。
野生型マウス(n=3)およびAR2マウス(n=3)から調製した運動ニューロン由来のRNAの配列決定を行い、野生型マウス、AR2マウスそれぞれ2匹以上で15リード以上あったRNA配列情報をマウスゲノム配列(NCBI37/mm9)にマッピングした。マッピングの結果、マウスゲノム配列上のAが運動ニューロン由来のRNAの配列決定ではGとなっている部位215箇所を同定し、マウスA-I RNA編集部位とした。次に、マウスで同定した215箇所のA-I RNA編集部位と相同なヒトゲノム配列(GRCh37/hg19)上の部位を、UCSC liftOver tool(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver)(Hinrichs et al., Nucleic Acids Res, 34, D590-598 2006)を用いて同定した。
HeLa細胞およびSH-SY5Y細胞は、10 % FBS(Thermo Fisher Scientific)、100 U/ml ペニシリンおよび100 μg/ml ストレプトマイシン(Thermo Fisher Scientific)を添加したMEM α-培地(WAKO)中、37℃、5 % CO2の条件で培養した。
1-5-1.HeLa細胞内でのヒトADAR2の過剰発現
HeLa細胞は、6-ウェルプレートに1.0×104細胞/cm2の密度で播種した。培養開始から24時間後、Lipofectamine 3000 transfection reagent(lnvitrogen)を用いて、2.5 μgのヒトADAR2ベクター(hADAR2/pCI)(Yamashita et al., Embo Mol. Med., 5 1710-1709 2013)を細胞にトランスフェクションした後、48時間培養を行った。
1-5-2.SH-SY5Y細胞内でのヒトADAR2の過剰発現
SH-SY5Y細胞は、10-cmディッシュに7.6×104細胞/cm2の密度で播種した。培養開始から24時間後、2.0 μgのhADAR2/pCIをLipofectamine 3000 transfection reagentを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション後、培地を無血清培地に換えて48時間培養した。
1-5-3.SH-SY5Y細胞のヒトADAR2のノックダウン
SH-SY5Y細胞は、10-cmディッシュに7.6×104細胞/cm2の密度で播種した。培養開始から24時間後、30 nMの各種siRNA(表3)をLipofectamine RNAiMAX transfection reagent(lnvitrogen)を用いて1回目のトランスフェクションを行った。48時間培養したのち、1回目と同様に2回目のトランスフェクションを行った。2回目のトランスフェクション時に、培地を無血清培地に換えて48時間培養した。
HeLa細胞およびSH-SY5Y細胞から、RNA spin Mini Kit (GE Healthcare)を用いてRNA抽出およびDNaseI処理を行った。1μgの総RNAを鋳型にして、oligoDTプライマーおよびrandamプライマーを含んでいるReverTra ACE qPCR-RT Master Mix Kit(TOYOBO)を使用し、cDNAを合成した。
環状RNAの抽出に関しては、20 μgの総RNAを1 U/μgのRNaseR(Epicentre)で2回処理(37℃、15分間)した後、RNeasy micro Kitで精製した。RNaseRで処理した総RNAを鋳型にしてReverTra ACE qPCR-RT Master Mix Kit(TOYOBO)を用いてcDNAを合成した。
FBS中のRNAのコンタミネーションを避けるために、SH-SY5Y細胞を無血清培地で48時間培養した後、10 mlの培地を回収した。この時、細胞は、10-cmディッシュでコンフルエントの状態であった。
直鎖状RNAは4 mlの培養上清から抽出した。細胞成分の混入を防ぐために、培養上清を室温にて15分間(3,000 g)遠心した後、総RNAをTRIzol LS Reagent(Thermo Fisher Scientifics)を用いて抽出した。
環状RNAの抽出に関しては、160 mlから400 mlの培養上清を回収し、細胞成分の混入を防ぐために、3,000 gで15分間、室温で遠心した後、lyophilizer(FZ-2.5CS, LABCONCO, Kansas City, USA)で凍結乾燥し、総RNAをTRIzol LS Reagent (Thermo Fisher Scientifics)用いて抽出した。得られた総RNAをDNaseI(RNase-free DNase Set, QIAGEN)で処理し、RNeasy micro Kitを用いて精製した。総RNAはBioanalyzer 2100(Agilent Technology, Santa Clara, CA)で定量し、これを鋳型にしてReverTra ACE qPCR-RT Master Mix Kitを用いて逆転写を行った。
ADAR2過剰発現およびノックダウンのコントロールとして、各々、pCI(空のベクター)またはランダムsiRNA(siRNAの混合物)(Stealth RNAiTMsiRNA Negative Control, Thermo Fisher Scientifics)をトランスフェクションし、同じ処理を行ったSH-SY5Y細胞の培養上清を使用した。
定量PCR(qPCR)は、Light Cycler System(Roche Diagnostics)を用い、表4に示すqPCRプライマーおよびプローブを用いて、Yamashita et al., Neurosci Res, 73, 42-48 2012に記載されたPCR条件に従って行った。
PCRは、表1に示すプライマーペアを用いて、表2に示す条件で行った。PCR産物は、MiniElute PCR purification Kit(QIAGEN)またはMiniElute Gel Extraction Kit(QIAGEN)を用いて精製した。GluA2mRNAおよびcircGRIA2(hsa_circ_0125620)のQ/R部位、CYFIP2(cytoplasmic fragile X mental retardation interacting protein 2)mRNAのリジン/グルタミン酸(K/E)部位およびTMEM63B(transmembrane protein 63B)mRNAのQ/R部位におけるA-I編集の程度は、PCR産物を制限酵素で処理し、編集依存的な制限酵素による切断を、Bioanalyzer 2100(Agilent Technology)を用いた定量解析で算出した。GluA2 mRNA、CYFIP2 mRNA、TMEM63B mRNAおよびcircGRIA2由来のPCR産物は、各々、Bbvl、Msel、HpaIIおよびHpyCH4V(New England Biolabs)で切断した。編集率は、編集されたRNA(編集RNA)と編集されていないRNA(未編集RNA)に由来するバンドの和に対する、編集RNAのバンドのモル比で示した(表5)。他方、編集RNAと未編集RNAに由来するPCR産物を異なる様式で切断する制限酵素が無い場合、そのPCR産物を3100 Genetic Analyzer sequencer(Applied Biosystems)で配列を決定した後、各A-I RNA編集部位における編集率は、アデノシンのピークとグアノシンのピークの和に対するグアノシンのピークのシグナル強度比をab1 Peak Reporter tool(https://apps.thermofisher.com/ab1peakreporter)(Thermo Fisher Scientifics)を使用して算出した。
2-1.野生型マウスおよびAR2マウスの運動ニューロンにおけるA-I RNA編集の比較
3匹の野生型マウスおよび3匹のAR2マウスの脊髄運動ニューロンから抽出したRNAの配列を決定し、その配列をNCBI37/mm9にマッピングして、215カ所のA-I RNA編集部位を同定した。編集率が50%未満のA-I RNA編集部位の数は、野生型マウスよりもAR2マウスの運動ニューロンにおいて多かったことから、AR2マウスと野生型マウス間の各A-I RNA編集部位における編集効率を比較することで、ADAR2依存性A-I RNA編集部位の検出可能であることが示唆された。215カ所のA-I RNA編集部位のうち、102部位おいて、AR2マウスにおける編集効率が野生型マウスにおける編集効率よりも2%低かった。そこで、UCSC liftOver toolを使用して、ヒトゲノム配列(GRCh37/hg19)上で、マウスの215カ所のA-I RNA編集部位と相同部位を検索したところ、ヒトRNAとマウスRNA間で28カ所の相同部位を同定した。
そこで、これら28カ所のA-I RNA編集部位(表6)が、ADAR2活性依存的に編集率が変化する編集部位なのかどうかを、ヒト由来の培養細胞を用いて検討した。
培養細胞中でADAR2を過剰発現させ、上記28の部位における編集率の変化を調べた。HeLa細胞(図2A)およびにSH-SY5Y 細胞(図3A)にADAR2を過剰発現させると、28のうち10の部位(ADAR2 pre-mRNAのintron +10、ADAR2 pre-mRNAのintron +23、ADAR2 pre-mRNAのintron +24、CYFIP2 mRNAのK/E部位、GluA2 mRNAのQ/R部位、GluA2 mRNAのR/G部位、SON mRNAのT/A部位-1、SON mRNAのR/G部位、SON mRNAのL/L部位およびTMEM63B mRNAのQ/R部位)において、編集率が有意に増加した(図2Bおよび図3B)。
次に、SH-SY5Y細胞のADAR2をsiRNAでノックダウンした後、これら10の部位における編集率の変化を調べた。siADAR2-1またはsiADAR2-2をトランフェクションしたSH-SY5Y細胞中のADAR2 mRNAの発現量は、有意に減少していた(図3C)。ADAR2をノックダウンすると、10カ所全ての部位において編集率が減少していたが、その減少の程度が統計的に有意なレベルに達している部位は、4カ所、すなわち、CYFIP2 mRNAのK/E部位、GluA2 mRNAのQ/R部位、GluA2 mRNAのR/G部位およびSON mRNAのR/G部位であった(図3D)。他の6カ所については、ADAR2をノックダウンしない状態の元々の編集率が低いため、ノックダウンによる編集率の変化を検出できなかった可能性が考えられる。
SH-SY5Y細胞でADAR2過剰発現させた場合とADAR2ノックダウンした場合の各A-I RNA編集部位の編集効率の変動は、矛盾するものではなく、上記10カ所のA-I RNA編集部位でADAR2がA-I変換を行っていることが示唆された。なお、上記10の部位のうち、SON mRNAのR/G部位は、これまでにADAR2依存性A-I RNA編集部位であるとの報告はない。
次に、10カ所のADAR2依存性A-I RNA編集部位を持つmRNA(ADAR2、CYFIP2、GluA2、SONおよびTMEM63BのmRNA)が細胞から分泌されるかどうかを調べたところ、SH-SY5Y細胞の培養上清中にこれら5種類全てのmRNAの存在が確認された。そこで、SH-SY5Y細胞の培養上清中に分泌されたmRNAのADAR2依存性A-I RNA編集部位の編集率を調べた。
SH-SY5Y細胞でADAR2を過剰発現させた場合、細胞外RNAの10カ所のADAR2依存性A-I RNA編集部位の編集率は、細胞内RNAの編集率と同じ様に変動する傾向にあった。ADAR2 pre-mRNA のintron position +10、CYFIP2 mRNA のK/E部位、SON mRNAのT/A部位とR/G部位および TMEM63B mRNAのQ/R部位においては、その編集率が有意に増加した(図4A)。ADAR2をノックダウンした細胞では、培地中のRNAのCYFIP2 mRNAのK/E部位およびGluA2 mRNAのQ/R部位における編集率が有意に減少していた(図4B)。
ADAR2依存性A-I RNA編集部位を有する環状RNAを circBase(Glazar et al., RNA 20, 1666-1670 2014)で検索した結果、Q/R部位を含むGRIA2の転写産物であるcircGRIA2(hsa_circ_0125620、hsa_circ_0125618およびhsa_circ_0125619)を見出した。SH-SY5Y細胞由来の総RNA20μg中、RNaseR耐性RNAの量は、RNaseR処理前の抽出総RNAの約1%程度であり、その割合はこれまでの報告(Jeck et al., RNA 19, 141-157 2013)と一致していた。。RNaseR耐性RNAの中から、circGRIA2(hsa_circ_0125620)を検出するためにdivergent primerを用いてPCRを行ったところ、SH-SY5Y細胞中において、hsa_circ_0125620は再現性をもって検出できたが(図5A)、hsa_circ_0125618とhsa_circ_0125619は検出できなかった。Q/R部位が編集型のhsa_circ_0125620に由来するPCR産物には、2カ所のHpyCH4V認識部位が存在しているのに対し、Q/R部位が未編集型のhsa_circ_0125620に由来するPCR産物には、さらに1カ所(合計3カ所)の認識部位が存在している(図5B)。
SH-SY5Y細胞内では、hsa_circ_0125620のQ/R部位における編集率(平均で95%)は、GluA2 mRNA(直鎖状mRNA)の編集率(平均で87%)よりも高く、ADAR2ノックダウンにより有意に減少した(図5C)
Claims (5)
- ALSの病態の診断を補助する方法であって、
(a)診断サンプル中に存在するRNAのADAR2依存性A-I RNA編集部位のヌクレオチドを同定する工程、
(b)工程(a)で同定したヌクレオチドがアデニン(A)またはイノシン(I)である割合を算出する工程、および
(c)工程(b)で算出したAまたはIの割合と、健常者のADAR2依存性A-I RNA編集部位のヌクレオチドがAまたはIである割合とを、各々、比較する工程、
を含み、
工程(a)のADAR2依存性A-I RNA編集部位が、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第178番目の位置、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第191番目の位置、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第192番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第202番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第672番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第720番目の位置、配列番号5で表されるTMEM63B mRNAの核酸配列中第157番目の位置および/または配列番号6で表されるcircGRIA2(has_circ_0125620)の核酸配列中第409番目であることを特徴とする、前記方法。 - 前記診断サンプルが体液由来であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記体液が、髄液または血液のいずれかであることを特徴とする請求項2に記載の方法。
- ADAR2依存性A-I RNA編集部位を有する1または複数のRNA分子のALSバイオマーカーとしての使用であって、
前記ADAR2依存性A-I RNA編集部位が、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第178番目の位置、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第191番目の位置、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第192番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第202番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第672番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第720番目の位置、配列番号5で表されるTMEM63B mRNAの核酸配列中第157番目の位置および/または配列番号6で表されるcircGRIA2(has_circ_0125620)の核酸配列中第409番目であることを特徴とする、前記使用。 - ALSの病態を診断するために使用するキットであって、少なくともADAR2依存性A-I RNA編集部位のヌクレオチドを同定するための要素を含むキットであって、
前記ADAR2依存性A-I RNA編集部位が、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第178番目の位置、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第191番目の位置、配列番号1で表されるADAR2 pre-mRNAの核酸配列中第192番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第202番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第672番目の位置、配列番号4で表されるSON mRNAの核酸配列中第720番目の位置、配列番号5で表されるTMEM63B mRNAの核酸配列中第157番目の位置および/または配列番号6で表されるcircGRIA2(has_circ_0125620)の核酸配列中第409番目であることを特徴とする、前記キット。
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