WO2012140894A1 - 医薬用組成物 - Google Patents

Abstract

　黒麹を用いて、特には茶葉として二番茶を用い、３～１０日間の期間、発酵させ、原料茶葉には存在が認められず、発酵により茶葉内に産生した化合物を、血糖値上昇抑制、中性脂肪低減、肝機能の改善、血圧上昇抑制、コレステロールの代謝改善又は腎機能等の改善に用いられる医薬の有効成分として用いる。また、その構造を明らかにしたことにより、該化合物の取得を、発酵させた茶葉からの取得に限らず、化学合成、生合成などにより調製することをも可能にした。

Description

医薬用組成物

　この発明は、アスペルギルス属に属する菌、特には黒麹を用いた茶葉の発酵により産生され、抽出・精製により取得された特定構造の化合物を含有する医薬用組成物に関するものである。
特に、血糖値上昇抑制、中性脂肪低減、血圧上昇抑制、コレステロールの代謝改善、肝・腎機能の改善、さらには脳機能改善、アルツハイマー病の予防と治療に有効な医薬用組成物に関するもので、医薬調製技術に属するものである。
 

　嗜好品としてのお茶は、非常に古くから全世界的に愛用されているが、その多くは、茶葉に湯を注いで、その浸出液を飲むというものである。
その浸出液には、茶葉から抽出された種々の成分が含まれているため、独特の香と味とを有し、特有の機能を有するものである。
そのため、茶葉の成分に関しての研究が幅広く行われており、その成分に関しても、以下のようなことが知られている。

　すなわち、茶の特徴的な成分はカフェインとタンニン系の物質のカテキンで、カフェインは人に興奮作用を与え、苦味を呈し、利尿作用も有する。
このカテキンは、茶の成分としては一番量の多いもので、茶の渋味の成分である。
それら以外にも、テアニンに代表されるアミノ酸、ビタミンＣに代表されるビタミン類、クロロフィル類、カリウムやカルシウムなどの無機成分、ジメチルスルフィド、青葉アルコール、テルペンアルコールなどの香料成分など幅広く知られている。

　これらの成分が、茶葉からの製茶の段階で、変化することも知られている。
例えば、釜炒茶、ほうじ茶ではピラジン、ピロール等の含窒素化合物が多くなり、醗酵茶では、花香をもつテルペンアルコールが非常に多くなることが知られている（平凡社発行：世界大百科事典参照）。

　このように茶葉には、各種の有用な成分が多く含まれているため、その成分を効率よく抽出することや、茶葉を加工して有効成分を多く取得する試みが古くから多くなされておる。
特に、発酵茶に関するものでは、例えば、特開２００２－３７０９９４号公報（特許文献１）には、黒茶、すなわち、黒麹菌等による後発酵法により長期熟成した黒茶から、熱水抽出により血糖値抑制物質が得られたことが報告されている。

　特開２００５－３４１８７６号公報（特許文献２）においては、茶葉に麹菌又は麹を加え、発酵させることによって、マルターゼ阻害効果を有するお茶が得られることが報告されている。

　一方、この出願の発明者らは、先に、酢酸による抽出で、発酵茶葉から肝機能の悪化の防止等が図れる薬効性組成物が得られることを見出して、特許出願を行い、その内容は特開２００７－２３８５８４号公報（特許文献３）に開示されている。

　さらに、発明者らは、先の研究に続いて、発酵茶（後発酵茶）の有する各種成分の特性をより深く追求するとともに、発酵茶の調製条件、原料茶葉による含有成分の変化等について検討した。
さらにまた、幅広く利用されている茶葉をより有効活用するために、茶葉における有効成分やその発酵条件による変化についても検討を行い、その結果についても特許出願を行い、その内容は特開２０１０－２２０４８９号公報（特許文献４）に開示されている。
 

特開２００２－３７０９９４号公報（特許請求の範囲） 特開２００５－３４１８７６号公報（特許請求の範囲） 特開２００７－２３８５８４号公報（特許請求の範囲） 特開２０１０－２２０４８９号公報（特許請求の範囲）

　発明者らは、先の研究においてアスペルギルス属の黒麹を用いた茶葉の発酵により産生することを見出したＸ成分（先には没食子酸起因化合物と推測したが）について、その同定を行うとともに、その有効性について、特に薬理特性についてより深く追求し、茶葉のさらなる活用、特に見出したＸ成分の有効活用を図るべく、検討を行った。

　その結果、発明者らは、黒麹を用いて醗酵させた茶葉内に産生したＸ成分を同定し、このＸ成分が、先の段階では見出し得なかった薬理特性をも有することを見出し、この発明を完成させた。
 

　すなわち、この発明の請求項１に記載の発明は、
　下記式１で示される化合物を含有すること
を特徴とする医薬用組成物である。

　また、この発明の請求項２に記載の発明は、
　請求項１に記載の医薬用組成物において
前記化合物は、
アスペルギルス属菌を用いた茶葉の発酵により産生されたものであること
を特徴とするものである。

　また、この発明の請求項３に記載の発明は、
　請求項２に記載の医薬用組成物において、
前記発酵は、
好気発酵であって、発酵期間が３～１０日間であること
を特徴とするものである。

　また、この発明の請求項４に記載の発明は、
請求項２に記載の医薬用組成物において、
前記茶葉は、
二番茶であること
を特徴とするものである。

　さらに、この発明の請求項５に記載の発明は、
　下記式１で示される化合物を含有し、血糖値上昇抑制、中性脂肪低減、肝機能の改善、血圧上昇抑制、コレステロールの代謝改善又は腎機能の改善、脳機能改善、アルツハイマー病の予防と治療に用いられるものであること
を特徴とする医薬用組成物である。

　この発明にかかる医薬用組成物は、式１で示される特定構造の化合物を含有させることによって、血糖値上昇抑制、中性脂肪低減、肝機能の改善、血圧上昇抑制、コレステロールの代謝改善又は腎機能の改善、脳機能改善、アルツハイマー病の予防と治療に有効なもので、茶葉の更なる活用が図れるだけでなく、構造の解明により、この化合物の化学的な合成も可能とするもので、製薬業界における、薬剤の幅広い調製を可能とするものである。

この発明における化合物は、粉末状態でも、酢酸あるいは水又はエタノール溶液としても使用することができるため、上記のような効果を発現させるために、医薬用として利用する際に、効率的にまた効果的に活用することを可能とするもので、健康食品へも応用され、優れた効果を奏するものである。
 

発酵茶の４．５％酢酸抽出物のＨＰＬＣ分析の結果を示す図である。 図１の各ピークの紫外吸収スペクトルである。 発酵茶の４．５％酢酸抽出物のＢｉｏ－Ｇｅｌカラムによる分画図である。 発酵茶酢酸抽出物からの酢酸エチル抽出物のＢｉｏ－Ｇｅｌカラムによる分画図である。 図４の３画分のＨＰＬＣチャートである。 図４画分５のＳｅｐｈｄｅｘ ＬＨカラム（２×２７ｃｍ）による吸着クロマトの図である。 図４画分５のＸ成分を含む画分のＨＰＬＣチャートである。 ＨＰＬＣで精製したＸ成分のＨＰＬＣチャートである。 ＨＰＬＣで精製したＸ成分の紫外吸収スペクトルである。 Ｘ成分の結晶写真である。 ＳＴＺマウスを用いたインビボでの随時血糖値の推移を示す図である。 ＳＴＺマウスを用いたインビボでのアルカリフォスファターゼの推移を示す図である。 ＳＴＺマウスを用いたインビボでの中性脂肪の推移を示す図である。 ＳＴＺマウスを用いたインビボでの尿素窒素の推移を示す図である。 ＳＴＺマウスを用いたインビボでのカリウムの推移を示す図である。 ＳＴＺマウスを用いたインビボでのクロールの推移を示す図である。 ＫＫ－Ａｙマウスを用いたインビボによる随時血糖値の推移を示す図である。 ＳＨＲマウスを用いたインビボでの随時血圧の推移を示す図である。 ＳＨＲマウスを用いたインビボによるＡＬＴの推移を示す図である。 ＳＨＲマウスを用いたインビボでのＨＤＬ－ｃｈｏ／Ｔ－ｃｈｏの推移を示す図である。 ＳＨＲマウスを用いたインビボでのクロールの推移を示す図である。 ＺＤＦラットを用いたインビボでの平均体重の変化を示す図である。 ＺＤＦラットを用いたインビボでの総摂取量に対する体重変化率を示す図である。

　この発明において使用される前記式１で表される特定の化合物（以下、特定化合物という。）は、従来公知のアスペルギルス属の黒麹を用いた茶葉の発酵により得られた発酵茶（以下、発酵黒茶という。）中に産生されたものであって、発酵黒茶から抽出・分離することにより得られるが、構造を判明させたので、化学合成による調製も可能なものでもある。

この特定化合物を発酵黒茶から取得する際に用いられる、原料としての茶葉としては、玉露、一番茶、二番茶、三番茶、秋冬番茶が挙げられる。
これら茶葉の発酵条件としては、原料黒麹、発酵中の温度（通常３０～４５℃）、発酵中の水分（通常２５～３５％）など、一般に、黒麹を用いて発酵茶を調製する条件に従って行えばよく、それにより、目的とする特定構造の化合物を得ることができる。
また、発酵黒茶からの特定化合物の抽出も、抽出媒体として、希酢酸あるいは水、熱水を用いる通常の抽出方法が適用される。

前記特定化合物を産生させる、発酵黒茶における茶葉の発酵方法自体には、格別新規な条件は存在しないが、特定化合物を産生させ、産生後の含有状態を維持するためには、以下の手段を採用することが望ましい。

発酵黒茶が特定化合物を含有する状態を維持する発酵条件として、一番重要な条件は、発酵期間である。
優れた発酵黒茶の製造には、長い場合には数ヶ月要するとされる。
前記特許文献２においても、好ましくは３週間程度（段落００３０）とされているが、上記条件を満たすための期間として、この発明にとり好ましい発酵期間は３～１０日間である。
また、発酵は、好気発酵が採用される。

かくして得られた特定化合物は、薬剤的に許容できる担体と配合し、希釈剤に溶解もしくは懸濁した薬剤として、経口的に患者に投与できる。

この発明の医薬用組成物は、適当な添加剤、
例えば、乳糖、ショ糖、マンニット、トウモロコシデンプン、合成もしくは天然ガム、結晶セルロース等の賦形剤、デンプン、セルロース誘導体、アラビアゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボシキメチルセルーロースカルシウム、カルボシキメチルセルーロースナトリウム、デンプン、コーンスターチ、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム等の滑沢剤、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム等の充填剤又は希釈剤等と適宜混合して、錠剤、散剤（粉末）、丸剤、および顆粒剤等とすることができる。
また、硬質又は軟質のゼラチンカプセル等を用いてカプセル剤とすることもできる。

さらに、この発明の医薬用組成物は、精製水等の一般的に用いられる不活性希釈剤に溶解させ、必要に応じて、この溶液に浸潤剤、乳化剤、分散助剤、界面活性剤、甘味料、フレーバー、芳香物質等を適宜添加することにより、シロップ剤、エリキシル剤等の液状製剤とすることもできる。
なお、これらの製剤化は従来公知の方法で可能である。

この発明の医薬用組成物を、医薬としてヒトに投与する場合における投与量は、有効成分である特定化合物の投与量により定められる。
その投与量は、剤型や患者の年齢等に依存するが、一日あたり１ｍｇ～１，０００ｍｇの範囲内であって、体重５０ｋｇの成人に対する投与量では、一日あたり１０ｍｇ～５００ｍｇが好ましい。
 

以下、実施例に基づいて、この発明の医薬組成物をより詳細に説明する。
＜発酵黒茶の調製＞
原料茶葉（荒茶）８０ｋｇをドラム式自動製麹装置に投入し、ドラムの回転により攪拌しながら水８０ｋｇを加えて、原料茶葉を膨潤させた後、別途原料茶葉（粉茶）と黒麹により調製した種麹を、黒麹菌の胞子１０^７／ｇになるよう添加し（種麹の量として２３ｋｇ）、設定温度３５℃で６日間発酵させた。
発酵時の温度上昇は、空冷ファンを用いて抑え、設定温度を維持するように努めた。発酵した茶葉は１００℃で蒸煮殺菌、５５℃で乾燥して発酵黒茶とした。

＜特定化合物の抽出・精製＞

　特定化合物（以下、Ｘ成分という。）の抽出・精製を以下の手順で行なった。
　まず、２００ｇの発酵黒茶を用い、抽出媒体として４．５％酢酸を用いて抽出、減圧濃縮・凍結乾燥によって、７２．６ｇの抽出物（収率：３６．３％：以下、黒茶抽出物という）を得た。
　図１に、この黒茶抽出物のＨＰＬＣ分析の結果を、図２に、各ピークの紫外吸収スペクトルを示す。
　図１中ピークａ～ｃは、その溶出位置と吸収スペクトルから、それぞれＥＧＣ、Ｃａｆｆｅｉｎ、ＥＣであり、ピークｄが、Ｘ成分である。

　前記抽出物を、Ｂｉｏ－Ｇｅｌ
Ｐ－１０カラム（２×２８ｃｍ）を用い、１％酢酸水溶液を展開液として分画した結果を、図３および表１に示す。　各画分をＨＰＬＣで分析した結果、Ｘ成分は画分５に、褐色のカテキン重合体と一緒に含まれることがわかった。

　上記分画により得られたＸ成分を含有する画分５について、酢酸エチルによる抽出を行なったところ、Ｘ成分は酢酸エチル層に抽出され、カテキン重合体は水層に残ることが確認された。
前記Ｘ成分含有酢酸エチルを濃縮した後、脱イオン水を加えて希釈した溶液を、Ｂｉｏ－ＧｅｌＰ－１０カラム（３×３０ｃｍ）に供し、１％酢酸水溶液で展開したときの溶出パターンを図４に示す。
その画分４～６についてＨＰＬＣ分析を行った結果、図５に示すように、いずれもＸ成分を含むことがわかった。

　凍結乾燥した画分５にメタノールを加えて攪拌、遠心分離して得られた上清を、予めメタノールで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ
ＬＨカラム（２×２７ｃｍ）に供し、メタノールで展開した。
その溶出パターンを図６に、３００ｎｍに吸収を持つ画分のＨＰＬＣパターンを図７に示す。

　この画分をＴＦＡ－ＭｅＣＮ系のＨＰＬＣで精製したところ、図８に示されるように、精製されたＸ成分が得られた。
　その紫外吸収スペクトルは、図９に示す通りであった。
　また、この画分を減圧乾固し、脱イオン水を加え、暖めて溶解した後、冷却した結果、図１０のような結晶の化合物が得られた。
この化合物は、Ｊ．Ｎａｔ．Mｅｄ．１５　Ｆｅｂ　２０１１に開示された化合物と同一であり、式１で示される構造を有していた。

　得られたＸ成分の薬理性に関する機能の評価結果は以下の通りである。
＜抗毒性効果の評価（ＳＴＺ誘発ラットによるインビボ実験）＞
Ｘ成分の抗毒性効果をインビボ実験で評価するために、７週齢のＷｉｓｔｅｒラットを（株）ＫＢＴオリエンタルより入手し、１週間の予備飼育後下記表２のように、５群に群分けした。
予備飼育後、２～５群にはストレプトゾトシン（ＳＴＺ：Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ）を腹腔内投与し、STZ誘発１型糖尿病モデルラットを作製した。
この内３～５群についてはＸ成分（黒茶抽出物）を含有する固型飼料ＭＦ（オリエンタル酵母製）を屠殺（１２週齢）までの３週間自由摂食させた。
１、２群には固型飼料ＭＦのみを自由摂食させた。
各群の投与試料およびその摂取量等については、下記表２に示したとおりである。
なお、この飼料中のＸ成分の配合量については、ヒト臨床試験での摂取量（６６ｍｇ／ｄａｙ）の等倍，４倍，７倍となるように設定した。
前記ラットは、予備飼育期間および実験期間を通して室温２４±３℃、相対湿度５５±１５％のコンベンショナル飼育室（照明時間７時～１９時）で飼育し、１週間ごとに摂食量，体重を測定するとともに、試料投与前，試料投与後１週目，２週目の経過血糖値を測定した。
３週間の試料投与後の１２週齢時に心臓から採血し、赤血球変形能測定および血液生化学検査（コレステロール、血糖など３５項目）を行った。

採血はＳＴＺ・試料投与前（８週齢）、試料投与１週間後、試料投与２週間後に尾静脈から採取した。
全血を簡易血糖測定器にて測定した。
統計処理は各週齢の２群と３，４，５群間で実施し、その結果を図１１に示した。
図中のマークは有意差があることを示す
（＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１）。

図１１の随時血糖値の推移に示されるように、糖尿病対照群（２群）は週齢が上がるにつれ、正常群（１群）と比し有意に血糖値は上昇していく。
これに対し、Ｘ成分を投与した３、５群はＳＴＺ投与１週目の時点で、２群と比し有意に低値を示した。
４群についても試料投与２週目の時点で血糖値の上昇がほぼ頭打ちになっており、２群と比し有意に低値となった。
このことから、試料濃度によって抑制の時期は異なるものの、Ｘ成分が血糖値の上昇を抑制することが示唆された。

＜血液化学検査＞
ＳＴＺ投与３週間後（１２週齢）にイソフルレン（大日本製薬）麻酔下で開腹し、心臓から採血した。
絶食は屠殺の１８時間前からとした。
採血した血液でＣＢＣ測定(Ｓｙｓｍｅｘ)し、得られた血漿(２０００ｒｐｍ、１０分、２５℃ )で生化学検査を行い、その結果を図１２（アルカリフォスファターゼ）、図１３（中性脂肪）、図１４（尿素窒素）、図１５（カリウム）、図１６（クロール）に示した。
統計処理は各週齢の２群と３，４，５群間で実施し、図中のマークは有意差・傾向があることを示す（＃；ｐ＜０．０８、＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１）。

前記図から明らかなように、血液生化学検査においては、アルカリフォスファターゼ、中性脂肪、尿素窒素、カリウム、クロールの５項目について、２群とＸ成分投与群間で有意差もしくは傾向がみられた。
まず、肝機能の指標となるアルカリフォスファターゼについては、１群と比し、２群は有意に高値となっており、ＳＴＺ投与により肝機能の働きは低下する。
これに対し、Ｘ成分を投与した４群は、２群と比し低値の傾向を示した。
他の３、５群についても有意差・傾向は見られなかったが、どちらも２群よりも低値を示している。
このことからＸ成分が肝機能の低下を抑制または改善する傾向があることが示唆された。
中性脂肪については、２群と比し４、５群が有意に低値を示した。
これによって、ＳＴＺ投与による中性脂肪の上昇を、Ｘ成分が抑制する働きが示唆された。
腎機能の指標となる尿素窒素について、２群と比し、３群が低値の傾向を示した。
また、４、５群も有意差・傾向はないものの、２群よりも低い値となっており、試料濃度が高くなるにつれ尿素窒素値は低くなった。
このことから、Ｘ成分が、濃度依存的に腎機能を改善する可能性が示唆された。
尿素窒素以外の腎機能の指標となるカリウム、クロールでも濃度依存的に腎機能を改善もしくはその傾向が示唆された。
腎機能の指標の３つ全てで、濃度依存的な結果がみられた。

＜抗糖尿病効果の評価（ＫＫ－Ａｙマウスによるインビボ実験）＞
Ｘ成分の抗メタボリックシンドローム効果をインビボ実験で評価するためにＫＫ－Ａｙ／Ｔａｊマウス
♂ ３週齢（日本クレア株式会社）を九動（株）より入手し、２週間の予備飼育後表３のように、２群に群分けした。
予備飼育１週目までは滅菌水道水を、２週目は０．０５％アスコルビン酸添加滅菌水道水を与えた。
試料濃度については、昨年度の同モデルを使用して行ったＸ成分（黒茶抽出物）投与実験（摂食による投与）の１日の摂取量から算出した。
なお、この試料中のＸ成分の配合量については、先の治験結果に基づき設定した。
また、投与方法は全て自由摂水とし、飼料には固型飼料ＭＦ（オリエンタル酵母製）を自由摂食させた。
前記マウスは、予備飼育期間および実験期間を通して室温２４±３℃、相対湿度５５±１５％のコンベンショナル飼育室（照明時間７時～１９時）で飼育し、１週間ごとに摂食量、体重を測定した。
さらに、試料投与後４週目、５週目、７週目、屠殺時の経過血糖値を測定した。
７週間の試料投与後（１２週齢時）心臓から、採血し血液生化学検査（コレステロール、血糖など３４項目）を行った。

＜随時血糖値の推移＞
採血は、試料投与後４週目、５週目、７週目、屠殺時に尾静脈から採取した。
採血前５～６時間絶食させ、空腹時血糖とした。
全血を簡易血糖測定器にて測定した結果を図１７に示す。
図中のマークは有意差があることを示す（＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１、＊＊＊；ｐ＜０．００１）。

通常ＫＫ－Ａｙマウスは７、８週齢から高血糖を発症する。
試料投与４週後（９週齢時）では１、２群に有意差は見られないが、試料投与５週後（１０週齢時）以降は全て２群の方が有意に低値となった。
これよって、Ｘ成分が糖尿病モデルマウスにおける血糖値上昇を著明に抑制する効果が示唆された。
また、今回は遺伝的に２型糖尿病を発症するモデルでの効果を証明できたことから、Ｘ成分による２型糖尿病遺伝子素因を有するヒト（青・少年）での糖尿病発症予防が期待される。

＜抗高血圧効果の評価（ＳＨＲラットによるインビボ実験）＞
Ｘ成分（黒茶抽出物）の抗高血圧効果をインビボ実験で評価するため、７週齢の高血圧自然発症ラット（ＳＨＲラット）を（株）ＫＢＴオリエンタルより入手した。
１週間の予備飼育ののち、平均血圧が同等となるように表４に示すように群分けを行った。予備飼育後の９週齢から試料投与を開始した。
１群には固型飼料ＭＦ（オリエンタル酵母製）を、２群にはＸ成分を含有する固型飼料ＭＦを４週間自由摂食させた。
２群の摂取量等については表３に示したとおりである。
なお、この飼料中のＸ成分（黒茶抽出物）の配合量については、事前治験の結果に基づき、ヒト臨床試験での摂取量（６６ｍｇ/ｄａｙ）の７倍となるように設定した。
前記ラットは、予備飼育期間および実験期間を通して室温２４±３℃、相対湿度５５±１５％のコンベンショナル飼育室（照明時間７時～１９時）で飼育し、１週間ごとに摂食量、ラット体重を測定した。
また、試料投与前、試料投与後１週目、２週目、３週目、４週目（屠殺前）の経過血圧を測定した。
４週間の試料投与後の１３週齢時に腹大動脈から採血し、血液生化学検査（コレステロール、血糖など３４項目）を行った。

＜随時血圧の推移＞
　血圧は、試料投与前、試料投与後１週目、２週目、３週目、４週目（屠殺前）の計５回の収縮期血圧（ＳＢＰ；ｓｙｓｔｏｌｉｃ　ｂｌｏｏｄ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を測定した。
測定には、非観血式血圧測定装置（（株）ソフトロン）を用いて行った。
測定は最低３回行い、その内の３回の平均値をもって、その個体の血圧とし、その結果を図１８に示した。
図中のマークは有意差・傾向があることを示す（＃；ｐ＜０．０８、＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１）。

　図に示されるように、試料非投与群（１群）では、週齢があがるとともに血圧は上昇している。
一方、試料投与群（２群）では上昇はするものの、高血圧の発症スピードは１群と比し緩やかである。
試料投与２週目では、１群と比し２群が低値の傾向を示し、３、４週目は有意に低値となった。
このことから、Ｘ成分（黒茶抽出物）が血圧上昇を著明に抑制することが示された。

＜血液生化学検査＞
試料投与４週間後（１３週齢）にイソフルレン（大日本製薬）麻酔下で開腹し、腹大動脈より採血した。
絶食は屠殺の１８時間前からとした。
採血した血液でＣＢＣ測定（Ｓｙｓｍｅｘ）し、得られた血漿（２０００ｒｐｍ、１０分、２５℃）で生化学検査を行った結果を、図１９～図２１に示した。
図中のマークは有意差・傾向があることを示す（＃；ｐ＜０．０８、＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１）。

　血液生化学検査においては、ＡＬＴ、ＨＤＬ－ｃｈｏ／Ｔ－ｃｈｏ、クロールの３項目について有意差もしくは傾向がみられた。
まず、肝機能の指標となるＡＬＴで１群と比し２群が低値の傾向を示した。
これよって、Ｘ成分（黒茶抽出物）が、肝機能の低下を抑制もしくは改善する可能性が示唆された。
つぎに、ＨＤＬ－ｃｈｏ／Ｔ－ｃｈｏの項目で、１群と比して２群が有意に高値を示した。
よって黒茶抽出物がコレステロールの代謝低下を抑制もしくは改善することが示唆された。
腎機能の指標となるクロール（Ｃｌ）についても２群が有意に高値を示した。
これにより、Ｘ成分が腎機能においても機能低下抑制効果もしくは改善効果があることがいえる。

＜抗加齢効効果の評価（ＺＤＦラットによるインビボ実験＞）
　Ｘ成分（黒茶抽出物）の抗加齢効果をインビボ実験で評価するために、９週齢の肥満２型糖尿病モデルラットＺＤＦに、黒茶抽出物０．６５％を含有する固型飼料ＭＦ（オリエンタル酵母製）を４週間自由摂食させた。
対照群には固型飼料ＭＦのみを自由摂食させた。
なお、この飼料による発酵茶抽出物の平均摂取量は、ヒト臨床試験での摂取量（６６ｍｇ／ｄａｙ）の約１０倍量に相当する。
前記ラットは、予備飼育期間および実験期間を通して室温２４±３℃、相対湿度５５±１５％のコンベンショナル飼育室（照明時間７時～１９時）で飼育し、１週間ごとに摂食量、ラット体重を測定した。

１２週間飼育後の平均体重を図２２に、総摂取量に対する体重変化率を図２３に示す。
これらの図から明らかなように、Ｘ成分（黒茶抽出物）を含む試料の方が、それを含まぬコントロール試料に比較して、同じカロリー相当量を摂取しても、体重が増加しにくい特性を持っていると云え、Ｘ成分（黒茶抽出物）がラットの体重増加を抑制し、メタボリックシンドロームの予防に有効であることを強く示唆している。

＜急性経口毒性試験（
動物安全性試験）＞
　Ｘ成分についてラットによる急性経口毒性試験を（財）日本食品分析センターに依頼した。
試験群には１５０ｍｇ／ｋｇの用量の検体を、対照群には溶媒対照として注射用水を雌雄ラットに単回経口投与し、１４日間の観察を行った。
その結果、観察期間中に異常及び死亡例は認められなかった。
このことから、検体のラットにおける単回経口投与によるＬＤ５０値は、雌雄ともに１５０ｍｇ／ｋｇ以上であるものと考えられた。

＜復帰突然変異試験＞
Ｘ成分を含有する黒茶抽出物について、復帰突然変異試験を（財）日本食品分析センターに依頼した。
　試験方法は、「医薬品の遺伝毒性試験に関するガイドラインについて」（平成１１年１１月１日　医薬審第１６０４号）の別添「遺伝毒性試験ガイドライン」に従い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ　ＷＰ２ｕｖｒＡ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　ＴＡ系４菌株を用いて行われた。
検体の用量は、３１３～５０００μｇ／プレートであった。
その結果、復帰変異コロニー数の増加は認められなかった。以上のことから、本試験条件下における検体の復帰突然変異誘起性は、陰性と結論した。

　前記式１で特定されるこの発明の化合物は、血糖値上昇抑制、中性脂肪低減、肝機能の改善、血圧上昇抑制、コレステロールの代謝改善又は腎機能の改善、脳機能改善、アルツハイマー病の予防と治療に有効なもので、茶葉の更なる活用が図れるだけでなく、構造の解明により、この化合物の化学的な合成も可能とするものである。
 

　この発明にかかる特定の化合物を含有する医薬用組成物は、優れた薬理性を有し、この特定の化合物は、粉末ないし水、酢酸又はエタノールの無毒の溶媒溶液として供給可能なものであるため、この特定の化合物の供給可能な製茶業界や、医薬品製造業界で広く利用される可能性の高いものである。
 

Claims (5)

1. 　下記式１で示される化合物を含有すること
   を特徴とする医薬用組成物。
   

   
2. 前記化合物は、
   アスペルギルス属菌を用いた茶葉の発酵により産生されたものであること
   を特徴とする請求項１に記載の医薬用組成物。
3. 前記発酵は、
   好気発酵であって、発酵期間が３～１０日間であること
   を特徴とする請求項２に記載の医薬用組成物。
4. 前記茶葉は、
   二番茶であること
   を特徴とする請求項３に記載の医薬用組成物。
5. 　下記式１で示される化合物を含有し、血糖値上昇抑制、中性脂肪低減、肝機能の改善、血圧上昇抑制、コレステロールの代謝改善又は腎機能の改善、脳機能改善、アルツハイマー病の予防と治療に用いられるものであること
   を特徴とする医薬用組成物。
   

   

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