WO2012138246A1 - Фармацевтическая композиция для лечения гиперпролиферативных заболеваний - Google Patents

Фармацевтическая композиция для лечения гиперпролиферативных заболеваний Download PDF

Info

Publication number
WO2012138246A1
WO2012138246A1 PCT/RU2011/000343 RU2011000343W WO2012138246A1 WO 2012138246 A1 WO2012138246 A1 WO 2012138246A1 RU 2011000343 W RU2011000343 W RU 2011000343W WO 2012138246 A1 WO2012138246 A1 WO 2012138246A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
peptide
pharmaceutical composition
peptides
cells
Prior art date
Application number
PCT/RU2011/000343
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Владимир Константинович БОЖЕНКО
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Метамакс"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Метамакс" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Метамакс"
Priority to JP2014503623A priority Critical patent/JP5852731B2/ja
Priority to US14/002,860 priority patent/US8969515B2/en
Priority to EP11863085.4A priority patent/EP2712621B1/en
Publication of WO2012138246A1 publication Critical patent/WO2012138246A1/ru
Priority to US14/599,426 priority patent/US20150174191A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/005—Enzyme inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology and medicine, in particular, to a pharmaceutical composition for the treatment of hyperproliferative diseases, including cancer, with antiproliferative activity, which includes
  • a therapeutically active substance selected from the group comprising 5-fluorouracil, etoposide;
  • the invention also relates to the use of the aforementioned pharmaceutical composition for the treatment of cancer, as well as to a method for treating cancer, which method comprises administering said pharmaceutical composition to a mammal in need of such treatment.
  • the objective of the invention is to develop a drug that effectively penetrates into target cells and has a high cytostatic and cytotoxic effect.
  • cyclin kinases The activity of cyclin kinases is determined by the expression level of the corresponding cyclins and the activity of specific cyclin kinase inhibitors (Kastan M.V., Bartek J., 2004). There are several families of cyclin kinase inhibitors. The most studied and practically important of them are pl6INK4a, p21CIP / KIP, p27 KIP1 (Lowe SW et al., 2004). Mutations or hypermethylation of cyclin kinase inhibitor gene promoters are observed in 40-60% of cases of malignant lymphomas, pancreatic cancer and a number of other malignant neoplasms (Sawyers C, 2004; Ortega S. et al., 2002).
  • cyclin kinase inhibitors were synthesized, some of which are undergoing experimental studies (Ross M.F., Murphy M.R., 2004) and one UCN-1 undergoes the first phase of clinical studies.
  • Another possible direction for creating cyclin kinase inhibitors may be the use of functional sequences from the corresponding intracellular inhibitors (Ziegler A. et al., 2005).
  • Protein p16 INK4a is one of the most interesting candidates for the Cdk inhibitor group (Xu D. et al., 2004; Zhang Y. et al., 2005).
  • Protein pl6INK4a is known to inhibit cyclin-dependent kinases D and thereby the passage of the G1 phase of the cell cycle (Fu G.H. et al., 2005; Ben-Saadon R. et al., 2004). It has been shown that its function is impaired in a wide range of oncological diseases (Li J.Q. et al., 2004). Recently, experimental works have begun to appear that describe the use of the pl6I K4a gene for gene therapy of tumors of various genesis (Lee AWC, Li JH et. Al. 2003; Liu SX, Tang SQ, Liang CY. 2003; Zhang Y., Liu J. et al. 2005).
  • peptides capable of penetrating into the cell without the participation of membrane proteins and capable of carrying out intracellular transport of protein fragments and oligonucleotides associated with them opens a new stage in the development of biology and medicine.
  • One of the effective carriers of large molecules inside cells is the pAntp peptide. Its properties are known, in particular, from the publications of Derossi D. et al .. The third helix of the Antennapedia homeodamain translocates through membranes.// J. Biol. Chem. 269 (1994) 10444-10450 and Morris MC. et al. A peptides carrier for the delivery of biologically active proteins in mammalian cells.// Nat. Biotechnology 19 (2001) 1173-1176.
  • US 6,569,833 Bl discloses peptides that bind to cyclin kinases and include the amino acid residues 84-103 of the p16 full chain protein and can be combined with the penetratin transport protein sequence via a disulfide bond formed between cysteine residues specifically attached to C-terminus of p16 peptide and ⁇ -terminus of Antp peptide.
  • the disadvantage of this approach is the need for selective and multi-stage synthesis of a chimeric molecule, which complicates the scheme for obtaining the target product and increases the overall time spent on synthesis.
  • the cited publications indicate that inhibition of cyclin kinases may be crucial for gene therapy of tumors of various origins.
  • peptide-based therapeutics that bind to cyclin kinases and combine with the transport protein sequence, certain problems are associated with bioavailability and stability. Therefore, there is a need to develop new therapeutic agents with antiproliferative activity against specific oncological diseases.
  • the basis of the present invention was the task of obtaining a pharmaceutical composition having antiproliferative and cytotoxic activity, due to the pronounced synergistic effect when sharing the chimeric peptide with existing chemotherapeutic antitumor drugs, such as taxol, 5-fluorouracil, etoposide.
  • the technical result of the present invention is to improve the biological effect in comparison with solutions known from the prior art, which consists in enhancing the cytotoxic and cytostatic effects of the agent on tumor cells.
  • a pharmaceutical composition having antiproliferative and cytotoxic activity which includes two active substances, where the first active substance is a chimeric peptide containing a functional 20 amino acid sequence from a pl6INK4a cyclin kinase inhibitor protein (SEQ ID NO: 1), or the amino acid sequence from the p21 / CIP / KIP inhibitor protein (SEQ ID NO: 6) and the transport sequence.
  • the first active substance is a chimeric peptide containing a functional 20 amino acid sequence from a pl6INK4a cyclin kinase inhibitor protein (SEQ ID NO: 1), or the amino acid sequence from the p21 / CIP / KIP inhibitor protein (SEQ ID NO: 6) and the transport sequence.
  • a chemotherapeutic antitumor agent selected from the group consisting of taxol, 5-fluorouracil, etoposide is used as a second active substance.
  • the pharmaceutical composition is intended to treat an oncological disease selected from the group consisting of colorectal cancer, kidney cancer, lung cancer, breast cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, uterine cancer, prostate cancer, stomach cancer and ovarian cancer .
  • the pharmaceutical composition can be used to treat colorectal cancer.
  • the present invention relates to the use of said pharmaceutical composition for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.
  • said pharmaceutical composition can be used to treat cancer selected from the group consisting of colorectal cancer, kidney cancer, lung cancer, breast cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, uterine cancer, prostate cancer, stomach cancer, and ovarian cancer.
  • the present invention relates to a method for treating cancer, which comprises administering to a mammal in need of such treatment the above pharmaceutical composition.
  • the cancer is selected from the group consisting of colorectal cancer, kidney cancer, lung cancer, breast cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, uterine cancer, prostate cancer, stomach cancer and ovarian cancer.
  • FIG. 1 Scanning of the A549 cell line incubated for 15 minutes with the peptide using a LeicaTCS SP2 laser scanning microscope (Courtesy of Odessa State Medical University). The figure shows cells in which the chimeric peptide pApr-p16-FITS is visible as luminous dots.
  • FIG. 2 The distribution of pAntp_pl6 protein in A549 cells over time. 1, 15 and 30 minutes after the addition of protein. Laser scanning microscope Leika.
  • FIG. 3 Kinetics of the accumulation of the FITC-labeled peptide pl6_pAntp in peripheral blood lymphocytes in vitro.
  • X axis - time in cu X axis - time in cu
  • FIG. 4 Dynamics of FITC accumulation of the labeled chimeric peptide pAntp_pl6 using the example of the Jurkat cell line.
  • the arrow indicates the time of addition of the chimeric peptide to the flow cytometer cuvette.
  • FIG. 5 The dependence of the intensity of intracellular fluorescence and the concentration of the drug in the medium.
  • the first peak reflects the fluorescence intensity when adding to the Raji cell culture the chimeric peptide Antp_pl6 labeled with FITC, at a concentration of 0.1 ⁇ Mol, incubation with the peptide for 15 minutes in the dark; the second and third peaks are the change in the intensity of intracellular fluorescence when the extracellular concentration of the peptide changes by 1 and 10 ⁇ M, respectively.
  • FIG. 6 Dependence of the intensity of cell fluorescence and extracellular concentration of the chimeric peptide.
  • FIG. 7 An example of DNA histograms obtained by flow cytometry.
  • the X axis is the fluorescence intensity
  • the Y axis is the number of cells. Particles located in the area in front of diploid cells (pre diploid peak) are apoptotic fragments of cells. Their number is proportional to the level of apoptosis in the analyzed cell population.
  • a - control cells A549; B cells treated with pAntp-pl6 (40 ⁇ M). 24 hours incubation.
  • FIG. 8 An example of DNA histograms obtained by flow cytofluorimetry using the ModFit LT 3.0 software
  • the figure shows the phases of the cell cycle G0 / G1, S, G2 / M.
  • the Modfit LT 3.0 program calculates the relative number of cells in the phase.
  • FIG. 9 The dependence of the average values of the phases of the cell cycle on the concentration of peptides.
  • a change in the ratio of the phases of the cell cycle is observed, which significantly differs from the control sample.
  • FIG. 10 The dependence of the average values of the level of apoptosis on the concentration of peptides. When the concentration of the studied chimeric peptides, the level of apoptosis significantly differs from the control.
  • FIG. I Synchronization of cell cultures.
  • Figure A Phase distribution of the cell cycle for an unsynchronized cell culture;
  • B culture synchronized in the OOJ phase by the depleted medium method;
  • C - synchronization in the S - phase using the double thymidine block technique;
  • D - synchronization in the G2 ⁇ M phase by incubation with Taxol.
  • FIG. 12 Exiting synchronization and changing the percentage of cells in different phases of the cell cycle for the HEK293 cell line synchronized in the G0 ⁇ G1 phase.
  • FIG. 13 The effect of chimeric peptides, including the pl6INK4a fragment, on cell cycle progression in a synchronized HEK293 cell culture.
  • A is the change in the number of cells in the G0 ⁇ G1 phase
  • B is the change in the number of cells in the S phase of the cell cycle.
  • X axis - incubation time, hours;
  • axis U the number of cells in a certain phase of the cell cycle,%.
  • FIG. 14 The effect of the chimeric peptide, including the p21 fragment and the internalizable Tat sequence, on the passage of the cell cycle in a synchronized HEK 293 cell culture.
  • A is the change in the number of cells in the S phase of the cell cycle.
  • B change in the number of cells in G2 ⁇ M - phase of the cell cycle.
  • FIG. 15 Phase distribution of the cell cycle for a synchronized HEK293 cell line with the addition of chimeric peptides with active centers p21 and p16.
  • the incubation time is 24 hours.
  • FIG. 16 Average values of apoptosis for a synchronized HEK 293 cell culture in a series of experiments using internalizable peptides with active centers p21 and p16. The incubation time with the peptide was 24 hours. The concentration of peptides is 40 ⁇ mol. Y axis -% of apoptotic particles.
  • FIG. 17 The average values of the level of apoptosis depending on the incubation time for control samples, samples with the pl6INK4a fragment and samples with the p21 fragment.
  • the figure shows a clear maximum in the level of apoptosis in samples with peptides with an active center of p16 after 10 hours of incubation.
  • FIG. 18 The effect of chimeric peptides with the functional group pl6INK4a on the passage of the phases of the cell cycle.
  • the average values of 5 successful experiments for the pAntp_pl6 peptide (A is the change in the G0 / G1 phase during incubation of cells with the chimeric peptide pAntp_pl6, B is the change in phase S, the peptide is taken at a concentration of 40 ⁇ mol) and the average values of 3 successful experiments for the peptide Tat_pl6 (C is a change in the G0 / G1 phase upon incubation of cells with the chimeric peptide Tat_pl6, D — change in phase S, the peptide was taken at a concentration of 40 ⁇ mol)
  • FIG. 19 Phase distribution of the cell cycle for a synchronized HEK HEK 293 cell line with the addition of chimeric peptides with p16 active sites and pAntp peptide vectors (Figure 20A) and Tat ( Figure 20B).
  • Figure 20A Phase distribution of the cell cycle for a synchronized HEK HEK 293 cell line with the addition of chimeric peptides with p16 active sites and pAntp peptide vectors
  • Figure 20B The moments of maximum differences between the control and experimental samples for pAntp_pl6 -10 hours, for Tat_l6 - 12 hours. Averages from six experiments.
  • the concentration of peptides is 40 ⁇ m.
  • FIG. 20 Average values of apoptosis in a synchronized HEK 293 culture with the addition of Tat_l6 and pAntp_pl6 chimeric peptides.
  • the figure shows the apoptosis level, which is recorded after removing the synchronization block in the HEK 293 culture synchronized in the GO / Gl phase, the studied peptides were added at the time of block removal, and the effect was evaluated after 24 hours.
  • FIG. 21 Change in the level of apoptosis in cell cultures depending on time during incubation with Tat_pl6 and pAntp_pl6 peptides.
  • FIG. 22 The effect of pAntp chimeric peptides (cM. FIG. 1) containing the pl6INK4a fragment on the cell cycle.
  • the concentration of peptides is 40 ⁇ m.
  • pAntp and three peptides 1,2,3, where 1 and 2 are synthetic petids, differing in the location of the 20-amino acid fragment of p16 relative to pAntp and 3 is a genetic engineering peptide that includes an insertion of 50 amino acids from Antp protein.
  • FIG. 23 The effect of pAntp chimeric peptides containing the pl6INK4a fragment on the cell cycle.
  • the concentration of peptides is 40 ⁇ m.
  • FIG. 24 The effect of chimeric peptides containing the pl6INK4a fragment on the change in the level of apoptosis in the unsynchronized and synchronized cell line A549, the concentration of peptides is 40 ⁇ m. Y axis -% of apoptotic bodies.
  • FIG. 25 The effect of chimeric peptides containing the pl6INK4a fragment on the change in the level of apoptosis in the unsynchronized and synchronized HEK 293 cell line, the concentration of peptides is 40 ⁇ m. Y axis -% of apoptotic bodies.
  • FIG. 26 Comparisons of the cytotoxic effect of chimeric peptides pAntp_pl6 (l, 2) on HEK 293 cell culture.
  • FIG. 27 Change in the level of fixation of antibodies to underphosphorylated pRB obtained by flow cytometry.
  • A549 cell line synchronized by a depleted medium 4 hours after removal of the synchronization block.
  • A isotypic control;
  • B staining for pRb; the zone of cells in which Rb is in the phosphorylated state is indicated. Control sample.
  • FIG. 28 Percentage of phosphorylated pRb, depending on the incubation time for control samples and samples with pAntp_pl6 peptide (40 ⁇ M).
  • FIG. 29 A study of the synthesis of cyclin B in HEK 293 cell culture with the addition of the Tat_l6 peptide (ZOkMol).
  • Figure 30A shows the change in the level of cyclin B in the control sample and in the sample incubated with the Tat_pl6 chimeric peptide in the HEK 293 cell culture synchronized in the GO / Gl phase after removing the synchronization block.
  • FIG. 30 The combined effect of chemotherapeutic agents of 5-fluorouracil, etoposide, and taxol in concentrations of YuOnMol and the chimeric peptide pAntp_pl6 (2) at a concentration of 40 ⁇ Mol.
  • Figure A the combined action of 5-fluorouracil and a chimeric peptide
  • Figure B combined effect of etoposide and pAntp_pl6 peptide (2)
  • B the combined effect of taxol and a chimeric peptide.
  • FIG. 31 The cytotoxic effect of chemotherapeutic agents Taxol and Etoposide at concentrations of 100 nMol and the chimeric peptide pAntp_pl6 (2) at a concentration of 40 ⁇ Mol, combined effect.
  • FIG. 32 shows photographs of experimental animals at the time of 7 injection of the studied internalizable peptide P16_Antp.
  • a and B are photographs of mice with transplanted A549 cells, A is a mouse from the control group on the 16th day of the experiment, the tumor has a size of 6.0x7.0 mm.
  • Figures C and D are mice with transplanted HCT-116 cells, C is a mouse from the control group on day 18 after inoculation of tumor cells (tumor size 11.5 x 13.5 mm).
  • D - mouse from the experimental group after 7 injections of P16_Antp at a dose of 0.1 mg, tumor size 4.5x4.5 mm
  • FIG. 33 The number of surviving cells (line SBR3-breast cancer) assessment by MTT test. Each point is an average of three holes.
  • the X axis is the concentration of the chemotherapy drug.
  • the top graph is taxol + peptide. Medium - etoposide + peptide. On each graph there are three curves for three concentrations of peptides.
  • the concentration of chemotherapy 1, 10, 30 ⁇ m.
  • Peptide concentrations are 0.1, 1, 10 ⁇ M.
  • FIG. 34 Two-parameter cytogram of breast cells.
  • the X axis shows PI staining
  • the Y axis shows cytokeratin stain.
  • Region - “cytokeratin-positive apoptosis” is indicated by an arrow.
  • the properties of 6 chimeric peptides were studied, including various internalizable sequences and functional groups responsible for the inhibition of cyclin kinases.
  • the following sequences of proteins Antennapedia (pAntp) were used as internalizable vectors — antenna pedia, which performs the morphogenetic function of forming an antenna in the Drosophilia Melanogaster fly; and the internalizable sequence of Tat is a transactivating function in the AIDS virus.
  • a control peptide (Antp_zam) was synthesized containing a similar sequence from pl6INK4a protein (AKP 82-102) with 92 tyrosine replaced by 92 alanine. This substitution was chosen because earlier in the work of Ferouse et al., It was shown that substitutions of 91 or 92 AKOs lead to the loss by this peptide of the inhibitory ability characteristic of the pl6INK4a sequence.
  • Peptides 1–3 consist of the functional part of AMP16 ⁇ 4 Harbor and the internalizable sequence pArrtp and differ in the location of the functional group relative to the ⁇ -, ⁇ -ends of the molecule and in the presence of the insert for peptide 3 (obtained by genetic engineering method).
  • the Antpjzam peptide (4) contains a sequence of protein p16GMK4a (AKP 82-102) with the replacement of 92 tyrosine - 92 with alanine.
  • Peptides 5 and 6 consist of the internalizable Tat sequence and have different functional groups pi 6INK4a and p21 CipKip.
  • FITC fluorescent label fluorescein-isothiocyanate
  • the most objective data on the accumulation of the peptide inside the cell were obtained using the method of scanning laser microscopy (Fig. 1). Protein labeled with fluorescein isothiocyanate was dissolved in 0.9% NaCl. A549, HEK 293 cell lines were grown on sterile glass slides and placed in a special chamber directly under the eyepieces of the microscope. The medium was replaced with the medium with the studied protein. Protein saturation was observed over time. In addition, a layer-by-layer cell scan was performed to determine the localization of the peptide.
  • Lymphocyte fluorescence was measured under the action of the p16-pAntp-FITC protein at pH 7.5 and pH b. The principle of the method is based on a lower quantum yield of FITC fluorescence in solutions with a more acidic pH. Since the measurement speed is fast enough, the pH inside the cell cannot change.
  • Lymphocytes were incubated with the peptide for 1-15 minutes, after which a 20-fold volume of phosphate buffer with pH 6.0 and pH 7.5 was immediately added to them. In this case, the difference in fluorescence intensity was estimated. In most measurements, the fluorescence intensities did not significantly differ after 15 minutes of incubation. Thus, it can be assumed that after 15 minutes of incubation, the peptide completely penetrates into the cell.
  • FIG. Figure 3 shows only a fragment of the curve reflecting the kinetics of accumulation of the chimeric protein in the cell.
  • FIG. 4 shows the dynamics of accumulation of FITC-labeled peptide in Jurkat cells.
  • the graph shows that the peptide penetrates into tumor cells with high speed. The time to reach maximum concentration is less than 1 min.
  • FIG. 5 and 6 show the change in the fluorescence intensity of cells depending on extracellular concentration.
  • FIG. Figure 6 shows the same data illustrating the fact that the ratio of extra- and intracellular concentration is linear (in the studied concentration range). Because the studied peptides can cross the cell membrane in both directions, it can be assumed that accumulated in the cell
  • REPLACE ITS SHEET RULE 26 peptides can leave it with a decrease in extracellular concentration. Investigation of the processes of exporting peptides from cells can be the subject of separate studies.
  • Example 2 A comparative assessment of the functional activity of peptides including active centers pl6INK4a and p21C1P / K1P
  • the products of the p16 and p21 genes are inhibitors of the formation of cyclin-cyclin-dependent kinase complexes and, accordingly, are regulators of the cell cycle. Therefore, when studying the function of exogenous chimeric peptides with functional groups p16 and p21, the main attention was paid to the study of proliferative activity and the study of apoptosis in cultures during their incubation with internalizable peptides.
  • REPLACE ITS SHEET RULE 26 does not change with increasing concentration of the drug (Fig. 9).
  • the number of living cells does not decrease below 50%.
  • the number of apoptotic particles at a given concentration and incubation time of 24 hours is about 40% and increases to 60% with increasing concentration to 50 ⁇ M (Fig. 10).
  • cell cultures are delayed in the G0 / G1, S or G2 / M phase of the cell cycle (Fig. 11).
  • FIG. 12 shows how in a culture synchronized in the G0 ⁇ G1 phase, the distribution of cells in different phases of the cell cycle changes after removing the synchronization block.
  • time 0 the moment the synchronization block was removed
  • most of the cells were in the OO phase (73%), and in the S and G2 ⁇ M phases they were 15% and 8%, respectively, then we can observe how the OO L phase decreases and S increases simultaneously - phase, after a certain period of time, the percentage of cells in the C2 ⁇ M phase begins to increase.
  • This nature of the exit from the synchronization block is typical for all studied cell cultures; it should also be noted that the doubling time of all the studied cells was approximately 24 hours.
  • FIG. Figure 13 shows that in the control (synchronized cells without the addition of a chimeric peptide), an increase in the S phase is observed 4 hours after the cancellation of the synchronizing factor, and it is also seen that the G0 ⁇ G1 phase decreases.
  • chimeric peptides with an active center of p16 are added, a decrease in G0 ⁇ G1 and an increase in S occur later than in the control, G0 ⁇ G1 begins to decrease after 6 hours of incubation, and a visible increase in the S phase can be observed after 8 hours of incubation.
  • Apoptosis is a genetically controlled process.
  • the connection of cell death into apoptosis with the inability to overcome one of the control points (chiek-point) during the passage of the proliferation phases by the cell has been shown.
  • Example 5 The study of the effect of the structure of the peptide vector on the example of Tat and pAntp
  • REPLACE ITS SHEET RULE 26 cells in the GO / Gl phase begins to decrease already 2 hours after removing the synchronization block, and after 10 hours the smallest number of cells in the GO / Gl phase is recorded.
  • the S-phase in the control samples begins to grow after 4-6 hours of cancellation of the synchronization block and reaches a maximum of 12 hours.
  • samples with chimeric peptides as can be seen from FIG. 18, there is a delay in the GO / Gl phase.
  • the level of the G0 / G1 phase begins to decrease after 6-8 hours of incubation and reaches the lowest level after 14 hours, and the level of the S phase begins to increase after 10 hours of incubation.
  • the Tat_l6 chimeric peptide there are no clear transitions in increasing S and decreasing GO / Gl phases; the G0 / G1 phase begins to decrease with the G0 / G1 phase of the control sample, however, its level decreases more slowly than in the control.
  • the S-phase in the sample with the test Tat_pl6 peptide begins to increase after 12 hours of incubation and has a maximum at 14 hours of incubation with the peptide. In the control samples, the maximum S-phase is recorded 12 hours after removal of the synchronization block.
  • PAntp_pl6 and Tat_pl6 have the same time delay in cell proliferation, the maximum differences in the control and experimental samples correspond to approximately 12 hours of incubation (Fig. 19). This time interval in the control group reflects the Gl - S transition. Thus, it can be assumed that in the case of chimeric peptides with the active center pl6INK4a, the vector structure does not affect the antiproliferative effect of the peptide.
  • the apoptosis level in the samples is higher than during incubation with the Tat_pl6 peptide (Fig. 20).
  • the apoptosis induced by the addition of the test chimeric peptide to the culture depends on the cell line and on apoptosis in the control sample. In the A549 and MCF-7 cell lines, the apoptosis level in the control samples is 5%, and when incubated with the Antp_l6 chimeric peptide, it increases on average to 25%.
  • the apoptosis level is 12%, in samples with a peptide - 35%.
  • Apoptosis in the HEK 293 cell line has the highest level and is about 20%; upon incubation of the HEK 293 cell line with the Antp_pl6 chimeric peptide for 24 hours, apoptosis increases to 60%.
  • the concentration of peptides is 40 ⁇ m.
  • REPLACE ITS SHEET RULE 26 although the level of apoptosis increases with incubation time, the increase in the number of apoptotic particles does not occur evenly. In the study of changes in the level of apoptosis depending on the time of incubation of the samples with peptides, time periods were found for which the enhanced formation of apoptotic bodies is characteristic. So, when incubating a synchronized HEK 293 cell culture with pAntp_pl6 chimeric peptides, points with increased apoptosis are 2 and 10 hours of incubation, and with Tat_pl6 peptide - 6 and 16 hours (Fig. 21).
  • a - HEK 293 cell line synchronized in the GO / Gl phase after removing the synchronization block and adding the studied peptides.
  • Example 6 The study of the influence of the position and size of the peptide vector on the antiproliferative activity of chimeric peptides
  • chimeric peptide containing the active center pl6INK4a and the vector pAntp were used in the work. These chimeric peptides differ in the location of the active center relative to the N-C ends of the molecule and in the presence of an insert of 44 amino acids
  • REPLACE ITS SHEET RULE 26 the phases of the cell cycle practically do not differ in comparison with the control. However, the addition of peptides 2 and 3 leads to a noticeable decrease in S - phase, while the number of cells in G0 / 1 also increases. This is more clearly seen in experiments on synchronized cultures.
  • REPLACE ITS SHEET RULE 26 peptide 2 is almost 2 times higher than the level of apoptosis in the experiment with chimeric peptide 1. A more pronounced cytotoxic effect is observed on a synchronized culture. Thus, it was found that pAntp 1 and 2 chimeric peptides containing the pl6INK4a fragment have pronounced cytotoxic effects in relation to cell cultures.
  • Example 7 The study of changes in the amount of phosphorylated pRb during incubation of cell cultures with chimeric peptides
  • Activation of intrinsic pl6INK4a in the cell leads to inhibition of pRb phosphorylation.
  • the accumulation of underphosphorylated pRb leads to inhibition of E2F1 and a decrease in the expression of cyclins A and B, which is one of the key mechanisms in stopping the cell cycle.
  • By the amount of phosphorylated pRb one can judge the activity of p16.
  • A is the isotypic control necessary to exclude nonspecific fluorescence
  • B is a control sample in which, in some of the pRb cells, it is in an underphosphorylated state.
  • REPLACE ITS SHEET RULE 26 section "Materials and Methods", to determine the amount of "underphosphorylated” pRb.
  • a negative control was also put in the form of samples of synchronized cells, but without the addition of peptides. It was shown that introducing a chimeric peptide into the cell culture causes a delay in pRb phosphorylation and reduces its maximum level in the culture (Fig. 28).
  • the initial level of “underphosphorylated” pRb is approximately the same in the control and in the experimental samples, but after removing the synchronization block in the samples without the addition of chimeric peptides, its level begins to increase at a certain point (4 or 6 hours of incubation), depending on the cell line reaches its maximum value and then begins to decline. In samples with a chimeric peptide, the level of “underphosphorylated” pRb begins to increase later and reaches its maximum value after 8 hours of incubation, and this value is lower than in control samples.
  • Example 8 The study of changes in the level of expression of cyclin B mRNA using the RT-PCR method
  • phosphorylation of rRB is the starting stage for activating the expression of cyclins A and B and the transition of cells from G1 to S phase of the cell cycle.
  • the method of quantitative PCR was used to study the level of mRNA expression for cyclin B when exposed to the Tat_r16 peptide. For this, during an experiment on a synchronized culture, with the addition of the Tat_pl6 chimeric peptide at a concentration of 40 ⁇ Mol, cells were simultaneously taken from samples for RNA excretion, and some of the cells went to determine the phases of the cell cycle. Further processing of the material — isolation of RNA and staging of quantitative PCR reaction (RT-PCR) —was done according to the protocol.
  • FIG. 29 shows the change in the amount of cyclin B mRNA obtained using the quantitative PCR technique, which reflects the change in the expression level of cyclin B, FIG. 29A. And the change in the number of cells in the 02 / M phase of the cell cycle is shown, Figure 29B, obtained using flow cytometry.
  • FIG. 29 shows that the Tat_pl6 chimeric peptide causes a delay in the expression of cyclin B and, accordingly, a delay in the S-G2 transition.
  • Figure 14.B it can be seen that the number of cells in the G2 phase in the control sample has a maximum of 12 hours of incubation, and in the sample with the peptide, the increase in the G2 phase occurs only at 16 hours of incubation.
  • Figure A shows the change in the level of expression of cyclin B, it can be seen that the control also has a maximum of 12 hours
  • REPLACE ITS SHEET RULE 26 which coincides with the maximum of cells in the 02 phase.
  • the expression level increases by 16 hours of incubation.
  • the addition of the peptide leads to a delay in the expression of cyclin B.
  • the observed cytostatic effect is associated with an effect on the phosphorylation of rRB and, as a consequence, on the inhibition of cyclin expression.
  • Example 9 The study of the combined effect of chimeric peptides and chemotherapeutic agents.
  • chemotherapy drugs - cytostatics - are widely used. Their effect is based on the fact that cells under their influence stop at a certain phase of the cell cycle, and the combined administration of a drug with cytotoxic activity at this phase of the cycle allows the death of a large number of cells.
  • the studied chimeric peptides have been shown to have cytostatic and cytotoxic activity. Moreover, the cytostatic activity is specific and is the result of the direct influence of the peptide on the cell genome. However, as was shown above, the effect of the action of a chimeric peptide on cell culture is insufficient to obtain therapeutically significant results. As a result, it was proposed to investigate the combined effect of internalizable peptides and chemotherapeutic agents.
  • Taxol which causes cell retention in the G2 ⁇ M phase
  • 5-fluorouracil - delay in the O0 ⁇ O1 phase of the cell cycle The most informative results with the combined action of chemotherapeutic agents and chimeric peptides were obtained with the use of the pAntp_pl6 (2) peptide (Fig. 3Z).
  • Fig. 3Z the pAntp_pl6 (2) peptide
  • FIG. 30 shows the change in the phases of the cell cycle with the combined action of chemotherapeutic agents and the studied peptides.
  • FIG. Figure 31 shows the results of cytotoxic effects with the combined use of chemotherapeutic agents and the chimeric peptide pAntp_pl6 (2).
  • Example 10 The study of the antitumor activity of the chimeric peptide pl6_Antp in vivo (local administration)
  • nude mice In nude mice (Nude), the antitumor activity of the chimeric internalized peptide P16_Antp was studied.
  • mice were inoculated with tumor cultures of human cells of the A549 and HCT-116 lines in an amount of about 1 million cells per mouse.
  • mice were inoculated into 39 mice, of which 20 mice made up the control group, they were subsequently given a placebo. 10 mice made up 1 experimental group. After the formation of a palpable tumor (4 days after transplantation of cells), they began to inject the studied peptide at a dose of 0.1 mg directly into the tumor. Nine mice constituted the 2nd experimental group; after the formation of the tumor node, on the 4th day of inoculation, 0.2 mg of the peptide was also introduced into the tumor bed. The peptide in the experimental groups was administered once every two days. The experiment lasted 24 days.
  • mice When mice were injected with transplantable human culture NST-116, the animals were divided into two groups: control - 10 mice, which were subsequently not administered the studied peptide and the experimental group (10 mice), which were administered the studied chimeric peptide P16_Antp at a dose of 0.1 mg to tumor node.
  • the experiment lasted 28 days, 11 injections of the peptide were made in the experimental group, the first injection was made on day 6 after the transplantation of tumor cells. The tumor node from HCT-116 cells was large and ulcerated.
  • the average tumor volume was 679 mm 3 ; 3 mice died during the experiment.
  • a lower tumor growth rate was observed (Fig. 32), on the 28th day of the experiment, the average tumor volume was 225.4 mm 3 , there were 2 dead animals in the experimental group.
  • FIG. 32 shows pairs of mice from different groups after 7 injections of the test peptide. A noticeable decrease in the tumor node in the experimental groups is visible.
  • chimeric peptide pl6-Antp leads to significant (more than 50%) inhibition of the growth of experimental models of human tumors (breast cancer, colorectal cancer).
  • Example 11 The study of the cytotoxic properties of chimeric peptides in short-term cultures of human tumors
  • chimeric peptides including the internalized Antp fragment and the functional fragments of cyclin kinase inhibitors pl6INK4a (DAAREGFLDTLVVLHRAGAR-S-RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO.3)).
  • 150 mg of p16-Antp peptide were synthesized by solid-phase synthesis (see methods section). To study the effects on human tumors, the short-term culture method was used.
  • REPLACE ITS SHEET RULE 26 and involving a pathologist.
  • a section of tissue was cut out, an average of 1.5 cm 3 .
  • the tissue was mechanically crushed, the cell suspension was placed in RPMI medium containing 5% PBS.
  • the medium was replaced with medium containing the chimeric peptide (pl6_Antp a concentration of 40 micromolar) or for a number of experiments on Taxol in a concentration of 100 nM or 500 nmol, containing both peptide and Taxol.
  • the medium was replaced with fresh. The first point was shot - 0 hours.
  • Apoptosis levels were analyzed 24 and 48 hours after the addition of peptides at a concentration of 40 ⁇ M. Some experiments were performed to study the combined cytotoxic effect of traditional chemotherapeutic drugs and the pl6_Antp peptide on tumor cells.
  • Example 13 The study of the cytotoxic effect on breast fibroadenoma cells
  • Tissue fibroadenoma tissue samples were examined. In short-term cultures of these cells with a low level of spontaneous apoptosis (maximum up to 20%, average 12.8%), peptide p16 exerted a significant cytotoxic effect and caused pronounced apoptosis after 24 hours with an average level of 38.2% at
  • AMENY SHEET RULE 26 up to 80% maximum. A less pronounced cytotoxic effect was found for breast cells with signs of simple ductal hyperplasia (average level of induced apoptosis 14.5%). These results are consistent with the data obtained by the author on the study of the ratio of proliferation activity and the level of spontaneous apotosis in pathological mammary tissues. It was shown that the ratio of proliferation and spontaneous apoptosis is highest for fibroadenoma tissue, and breast cancer cells are in second place in this indicator, followed by simple ductal hyperplasia and normal breast tissue.
  • the sensitivity of fibroadenoma cells to the p16_Apr peptide is quite logical.
  • the detected sensitivity effect of benign proliferative processes in breast tissue may be promising for their treatment.
  • the results on the local introduction of peptides for the treatment of transplantable solid tumors suggest their effectiveness when introduced locally into the area of benign proliferative processes in the tissues of the mammary gland.
  • the results obtained revealed a spectrum of human tumors sensitive to the pl6_Antp peptide. It was found that such localizations as breast cancer, colorectal cancer, stomach cancer, bladder cancer, and kidney cancer are promising objects for further study of the cytotoxic (antitumor) effect of the studied peptide. The results are new, because in the available literature there is no data on the study of the effect of the analyzed peptide on human tumors.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности, к фармацевтической композиции, обладающей антипролиферативной активностью и способу лечения онкологических заболеваний, включающему введение указанного химерного пептида нуждающемуся в таком лечении млекопитающему. Задачей изобретения является разработка препарата, эффективно проникающего в клетки- мишени и обладающего высоким цитостатическим и цитотоксическим действием.

Description

«Фармацевтическая композиция для лечения гиперпролиферативных заболеваний»
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности, к фармацевтической композиции для лечения гиперпролиферативных заболеваний, включая онкологические заболевания, обладающей антипролиферативной активностью, которая включает
а) химерный пептид, содержащий функциональную последовательность из белка- ингибитора циклиновых киназ pl6INK4a (SEQ ID NO: 1) или p21/CIP/KIP (SEQ ID NO: 6), и транспортную последовательность, которые соединены между собой посредством группы X, где X представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую от 1 до 50 аминокислотных остатков.
б) терапевтически активное вещество, выбранное из группы, включающей, 5- фторурацил, этопозид;
в) фармацевтически приемлемые носители.
Изобретение также относится к применению вышеуказанной фармацевтической композиции для лечения онкологических заболеваний, а также к способу лечения онкологических заболеваний, включающему введение указанной фармацевтической композиции нуждающемуся в таком лечении млекопитающему. Задачей изобретения является разработка препарата, эффективно проникающего в клетки-мишени и обладающего высоким цитостатическим и цитотоксическим действием.
Уровень техники
С начала 90-х годов в России ежегодно диагностируют более 400 тысяч случаев злокачественных новообразований. При этом в Европе ежегодная смертность от онкологических заболеваний за период с 1985 года по 2002 продолжает расти. В структуре причин смертности онкологические заболевания занимают 2-ое место после заболеваний сердечно-сосудистой системы. Поэтому поиск новых лекарственных противоопухолевых препаратов является одной из актуальных задач современной биологии и медицины.
В настоящее время большое количество работ посвящено созданию новых лекарственных противоопухолевых препаратов на основании достижений молекулярной биологии (Richard J.P. et al., 2003; Takeshima К. et al., 2003; Jyotika A. et al., 2005, опнин Б.П., 2000). Общепринято, что основополагающим признаком неопластической клетки является нарушение регуляции клеточного цикла и апоптоза (Chappuis P.O., Kapusta L., 2005). Известно, что регуляция процессов пролиферации клетки контролируется путем последовательной активации циклинов и соответствующих циклин-зависимых киназ (CDK). Активность циклиновых киназ определяется уровнем экспрессии соответствующих циклинов и активностью специфических ингибиторов циклиновых киназ (Kastan М.В., Bartek J., 2004). Имеется несколько семейств ингибиторов циклиновых киназ. Наиболее изученными и практически важными из них являются - pl6INK4a, p21CIP/KIP, р27 KIP1 (Lowe S.W. et al., 2004). Мутации или гиперметилирование промоторов генов ингибиторов циклиновых киназах наблюдаются в 40-60% случаев злокачественных лимфом, раке поджелудочной железы и ряде других злокачественных новообразований (Sawyers С, 2004; Ortega S. и др., 2002).
Основываясь на этих результатах был синтезирован ряд низкомолекулярных ингибиторов циклиновых киназ, часть из которых проходит их экспериментальное изучение (Ross M.F., Murphy М.Р., 2004) а один UCN-1 проходит первую фазу клинических исследований. Другим, возможным направлением, для создания ингибиторов циклиновых киназ может быть использование функциональных последовательностей из соответствующих внутриклеточных ингибиторов (Ziegler A. et al., 2005). Белок р16 INK4a является одним из наиболее интересных кандидатов группы ингибиторов Cdk (Xu D. et al., 2004; Zhang Y. et al., 2005). Известно, что белок pl6INK4a ингибирует циклин-зависимые киназы D и тем самым прохождение G1 фазы клеточного цикла (Fu G.H. et al., 2005; Ben- Saadon R. et al., 2004). Показано, что его функция нарушена при широком спектре онкологических заболеваний (Li J.Q. et al., 2004). В последнее время стали появляться экспериментальные работы, описывающие применение гена pl6I K4a для генной терапии опухолей различного генеза (Lee A.W.C.,Li J-H et. al. 2003; Liu S.X., Tang S.Q., Liang C.Y.. 2003; Zhang Y., Liu J. et al. 2005). Дополнительным мотивом к поиску технологий применения естественных белковых ингибиторов пролиферации стало открытие коротких последовательностей аминокислот (п=15-30), способных выполнять векторные (транспортные) функции в отношении пептидных последовательностей и соединений другой химической природы (РНК, ДНК) (Fawell S., Seery J. et al., 1994; Vives E., Brodin P., Lebleu B. 1997; Kaplan I.M. et al., 2005; Gupta B. et al, 2005; Feraandez-Carneado J. et al., 2005).
До настоящего времени проблему восстановления нарушенной функции внутриклеточных белков пытались решать на основе методов доставки гена (генная терапия). Однако, эта технология до настоящего времени не получила широкого выхода в клиническую практику из-за ряда принципиальных проблем.
Альтернативный способ решения этой задачи, основанный на технологии пептидных векторов, обладающих способностью проникать в клетки, не повреждая плазматическую мембрану, является весьма перспективным ввиду слабой иммуногенности таких соединений и способности переносить достаточно крупные молекулы.
Соединение возможности целевой доставки пептидов в клетку и обнаружение коротких функциональных доменов в белках регуляторах различных клеточных функций создали предпосылки для конструирования молекул имеющих патогенетическую направленность (Schutze-Redelmeier М.Р. и др., 2004; Trehin R., Merkle Н.Р., 2004; Cong- Mei Wu и др., 2004). Относительная простота синтеза таких молекул позволяет говорить о принципиальной возможности создания индивидуальных химиопрепаратов на их основе, т.е. влияющих на патологические изменения свойственных данной конкретной опухоли (Регеа S.E. и др., 2004).
Открытие пептидов, способных проникать в клетку без участия мембранных белков и способных осуществлять внутриклеточный транспорт связанных с ними белковых фрагментов и олигонуклеотидов открывает новый этап в развитии биологии и медицины. Одним из эффективных переносчиков крупных молекул внутрь клеток является пептид pAntp. Его свойства известны, в частности, из публикаций Derossi D. et al.. The third helix of the Antennapedia homeodamain translocates through membranes.// J.Biol. Chem. 269 (1994) 10444-10450 и Morris MC. et al. A peptides carrier for the delivery of biologically active proteins in mammalian cells.// Nat. Biotechnology. 19 (2001) 1173-1176.
В документе US 6569833 Bl (Cyclacel Limited, GB) раскрываются пептиды, которые связываются с циклиновыми киназами и включают аминокислотные остатки 84- 103 полноцепочечного белка р16 и могут быть объединены с последовательностью транспортного белка пенетратина посредством дисульфидной связи, образующейся между остатками цистеина, специально присоединенными к С-концу пептида р16 и Ν-концу пептида Antp. Недостатком данного подхода является необходимость избирательного и многоступенчатого синтеза химерной молекулы, что усложняет схему получения целевого продукта и увеличивает общие временные затраты на синтез.
Процитированные публикации свидетельствуют о том, что ингибирование циклиновых киназ может иметь решающее значение для генной терапии опухолей различного генеза. В отношении терапевтических средств на основе пептидов, которые связываются с циклиновыми киназами и объединены с последовательностью транспортного белка, характерны определенные проблемы, связанные с биологической доступностью и стабильностью. Поэтому существует необходимость в разработке новых терапевтических средств, обладающих антипролиферативной активностью в отношении конкретных онкологических заболеваний. В основу настоящего изобретения была положена задача получить фармацевтическую композицию, обладающую антипролиферативной и цитотоксической активностью, за счет выраженного синергетического эффекта при совместном использовании химерного пептида с уже существующими химиотерапевтическими противоопухолевыми препаратами, такими, как таксол , 5-фторурацил, этопозид.
Техническим результатом настоящего изобретения является улучшение биологического эффекта в сравнении с известными из уровня техники решениями, который заключается в усилении цитотоксического и цитостатического действия средства на клетки опухолей.
Технический результат достигается благодаря получению фармацевтической композиции, обладающей антипролиферативной и цитотоксической активностью, которая включает два активных вещества, где первым активным веществом является химерный пептид, содержащий функциональную 20-аминокислотную последовательность из белка- ингибитора циклиновых киназ pl6INK4a (SEQ ID NO: 1), или аминокислотную последовательность из белка-ингибитора p21/CIP/KIP (SEQ ID NO: 6) и транспортную последовательность. В качестве второго активного вещества используется химиотерапевтическое противоопухолевое средство, выбранное из группы, включающей таксол, 5-фторурацил, этопозид.
В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция предназначена для лечения онкологического заболевания, выбранного из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка и рак яичника.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция может быть использована для лечения колоректального рака.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению указанной фармацевтической композиции для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения онкологических заболеваний.
В предпочтительном варианте осуществления указанная фармацевтическая композиция может применяться для лечения онкологических заболеваний, выбранных из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка и рак яичника. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения онкологического заболевания, который включает введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, вышеуказанной фармацевтической композиции.
В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного способа, онкологическое заболевание выбрано из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка и рак яичника.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Сканирование клеточной линии А549, инкубированной в течении 15 минут с пептидом с использованием лазерного сканирующего микроскопа LeicaTCS SP2 (Предоставлен Одесским государственным медицинским университетом). На рисунке изображены клетки, в которых химерный пептид рАшр-р16-ФИТС виден как светящиеся точки.
Фиг. 2. Распределение белка pAntp_pl6 в клетках А549 во времени. Через 1, 15 и 30 минут после добавления белка. Лазерный сканирующий микроскоп Leika.
Фиг. 3. Кинетика накопления ФИТЦ- меченого пептида pl6_pAntp в лимфоциты периферической крови in vitro. Ось X - время в у.е., ось Y - интенсивность флуоресценции (у.е.).
Фиг. 4. Динамика накопления ФИТЦ меченного химерного пептида pAntp_pl6 на примере клеточной линии Jurkat. Стрелкой указано время добавления химерного пептида в кювету проточного цитометра
Фиг. 5. Зависимость интенсивности внутриклеточной флуоресценции и концентрации препарата в среде. Первый пик отражает интенсивность флуоресценции при добавлении к клеточной культуре Raji химерного пептида Antp_pl6 меченного ФИТЦ, в концентрации 0,1 мкМоль, инкубация с пептидом 15 минут в темноте; второй и третий пики - изменение интенсивности внутриклеточной флуоресценции при изменении внеклеточной концентрации пептида на 1 и 10 мкМоль, соответственно.
Фиг. 6. Зависимость интенсивности флуоресценции клеток и внеклеточной концентрации химерного пептида.
Фиг. 7. Пример ДНК-гистограмм, полученных методом проточной цитофлуриметрии. По оси X - интенсивность флуоресценции, по оси Y - количество клеток. Частицы, находящиеся в области перед расположением диплоидных клеток (преддиплоидный пик) являются апоптозными фрагментами клеток. Их количество пропорционально уровню апоптоза в анализируемой клеточной популяции.
А - контрольные клетки А549; Б- клетки, обработанные pAntp-pl6 (40мкМ). 24 часа инкубации.
Фиг. 8. Пример ДНК-гистограмм, полученных методом проточной цитофлуриметрии с использованием программы ModFit LT 3.0;
А - контрольные клетки А549, Б - клетки, обработанные pAntp-pl6 (5мкМ). На рисунке указаны фазы клеточного цикла G0/G1, S, G2/M. По площади занимаемого данной фазой пика программа Modfit LT 3.0 высчитывает относительное количество клеток в фазе.
Фиг. 9. Зависимость средних значений фаз клеточного цикла от концентраций пептидов. А - интернализируемые пептиды с активным центром pl6INK4a, Б - интернализируемые пептиды с активным центром р21. При концентрации пептидов 40 мкМоль наблюдается изменение в соотношении фаз клеточного цикла достоверно отличающееся от контрольного образца.
Фиг. 10. Зависимость средних значений уровня апоптоза от концентраций пептидов. При концентрации исследуемых химерных пептидов уровень апоптоза значимо отличается от контроля.
Фиг. И. Синхронизация клеточных культур. Рисунок А -распределение фаз клеточного цикла для несинхронизированной культуры клеток; В - синхронизированная в ООЮЬфазе культура методом обедненной среды; С - синхронизация в S - фазе с помощью методики двойного тимидинового блока; D - синхронизация в G2\M - фазе инкубацией с Taxol.
Фиг. 12. Выход из синхронизации и изменение процентного соотношения клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла для НЕК293 клеточной линии, синхронизированной в G0\G1 - фазе.
Фиг. 13. Влияние химерных пептидов, включающих фрагмент pl6INK4a, на прохождение клеточного цикла в синхронизированной культуре клеток НЕК293. А - изменение количества клеток в G0\G1- фазе, В - изменение количества клеток в S - фазе клеточного цикла. Ось X - время инкубации, часы; осьУ - количество клеток, находящихся в определенной фазе клеточного цикла, %.
Фиг. 14. Влияние химерного пептида, включающего фрагмент р21 и интернализуемую последовательность Tat, на прохождение клеточного цикла в синхронизированной культуре клеток НЕК 293. А - изменение количества клеток находящихся в S- фазе клеточного цикла. В - изменение количества клеток находящихся в G2\M - фазе клеточного цикла. Ось X - время инкубации, часы; осьУ - количество клеток, находящихся в определенной фазе клеточного цикла, %.
Фиг. 15. Распределение по фазам клеточного цикла для синхронизированной НЕК293 клеточной линии при добавлении химерных пептидов с активными центрами р21 и р16. Время инкубации 24 часа. Максимальные различия между контрольными и опытными образцами для р21 - 10 - 12 часов, для р16 - 8-10 часов. Средние значения по шести удачным экспериментам.
Фиг. 16. Средние значения апоптоза для синхронизированной культуры клеток НЕК 293 в ряде экспериментов с использованием интернализируемых пептидов с активными центрами р21 и р16. Время инкубации с пептидом составляло 24 часа. Концентрация пептидов - 40 мкМоль. Ось Y - % апоптотических частиц.
Фиг. 17. Средние значения уровня апоптоза в зависимости от времени инкубации для контрольных образцов, образцов с фрагментом pl6INK4a и образцов с фрагментом р21. Ось X - время инкубации, ось Y - процент апоптотических частиц. На рисунке виден четкий максимум в уровне апоптоза в образцах с пептидами с активным центром р16 после 10 часов инкубации.
Фиг. 18. Влияние химерных пептидов с функциональной группой pl6INK4a на прохождение фаз клеточного цикла. Средние значения по 5 удачным экспериментам для пептида pAntp_pl6 (А - изменение фазы G0/G1 при инкубации клеток с химерным пептидом pAntp_pl6, Б - изменение фазы S, пептид взят в концентрации 40мкМоль) и средние значения по 3 удачным экспериментам для пептида Tat_pl6 (С - изменение фазы G0/G1 при инкубации клеток с химерным пептидом Tat_pl6, Д - изменение фазы S, пептид взят в концентрации 40мкМоль).
Фиг. 19. Распределение по фазам клеточного цикла для синхронизированной НЕК НЕК 293 клеточной линии при добавлении химерных пептидов с активными центрами р16 и пептидными векторами pAntp (рисунок 20А) и Tat (рисунок 20Б). Моменты максимальных различий между контрольными и опытными образцами для pAntp_pl6 -10 часов, для Tat_ l6 - 12 часов. Средние значения по шести экспериментам. Концентрация пептидов - 40 мкМ.
Фиг. 20. Средние значения апоптоза в синхронизированной культуре НЕК 293 при добавлении химерных пептидов Tat_ l6 и pAntp_pl6. На рисунке показан уровень апоптоза, который регистрируется после снятия блока синхронизации в синхронизированной в GO/Gl-фазе культуре НЕК 293, в момент снятия блока добавлялись исследуемые пептиды, и эффект оценивали через 24 часа. Фиг. 21. Изменение уровня апоптоза в культурах клеток в зависимости от времени при инкубации с пептидами Tat_pl6 и pAntp_pl6.
Фиг. 22. Влияние химерных пептидов pAntp(cM. фиг.1), содержащих фрагмент pl6INK4a, на клеточный цикл. А - несинхронизированная клеточная линия - НЕК 293, Б - синхронизированная в S-фазе клеточная линия - НЕК 293. Концентрация пептидов - 40мкМ. pAntp и трех пептидов 1,2,3, где 1 и 2 это синтетические петиды, отличающиеся расположением 20-аминокислотного фрагмента р16 относительно pAntp и 3 - это генноинженерный пептид, включающий вставку из 50 аминокислот из белка Antp.
Фиг. 23. Влияние химерных пептидов pAntp, содержащих фрагмент pl6INK4a, на клеточный цикл. А - несинхронизированная клеточная линия - 549, Б - синхронизированная клеточная линия - 549. Концентрация пептидов - 40мкМ. pAntp - pAntp_zam.
Фиг. 24. Влияние химерных пептидов, содержащих фрагмент pl6INK4a, на изменение уровня апоптоза в несинхронизированной и синхронизированной клеточной линии А549, концентрация пептидов - 40мкМ. По оси Y -% апоптозных тел.
Фиг. 25. Влияние химерных пептидов, содержащих фрагмент pl6INK4a, на изменение уровня апоптоза в несинхронизированной и синхронизированной клеточной линии НЕК 293, концентрация пептидов - 40мкМ. По оси Y -% апоптозных тел.
Фиг. 26. Сравнения цитотоксического влияния химерных пептидов pAntp_pl6(l, 2) на НЕК 293 клеточную культуру.
Фиг. 27. Изменение уровня фиксации антител к недофосфорилированному pRB полученных методом проточной цитофлуорометрии. А549 клеточная линия, синхронизированная обедненной средой, через 4 часа после снятия блока синхронизации. А - изотипический контроль, В - окраска на pRb, указана зона клеток, в которых Rb находится в фосфорилированном состоянии. Контрольный образец.
Фиг. 28. Процент фосфорилированного pRb, в зависимости от времени инкубации для контрольных образцов и образцов с пептидом pAntp_pl6 (40 мкМ). А - клеточная линия А549, В - клеточная линия НЕК 293. Ось X - время инкубации (час), ось Y - % клеток с фосфорилированным pRb.
Фиг. 29. Исследование синтеза циклина В в культуре клеток НЕК 293 при добавлении пептида Tat_ l6 (ЗОмкМоль). На рисунке 30 А представлено изменение уровня циклина В в контрольном образце и в образце инкубированном с химерным пептидом Tat_pl6 в синхронизированной в GO/Gl-фазе клеточной культуре НЕК 293 после снятия блока синхронизации. На рисунке ЗОВ. показано изменение количества клеток находящихся в 02/М-фазе клеточного цикла в том же эксперименте. Ось X - время инкубации (час), ось Y - условные единицы.
Фиг. 30. Сочетанное действие химиопрепаратов 5-фторурацила, этопозида и таксола в концентрациях ЮОнМоль и химерного пептида pAntp_pl6 (2) в концентрации 40 мкМоль. Распределение по фазам клеточного цикла культуры клеток А549 через 24 часа инкубации совместно с химиопрепаратом и исследуемым пептидом. Рисунок А - сочетанное действие 5-фторурацила и химерного пептида; рисунок Б - сочетанное действие этопозида и пептида pAntp_pl6 (2); В - сочетанное действие таксола и химерного пептида.
Фиг. 31. Цитотоксическое воздействие химиопрепаратов Таксол и Этопозид в концентрациях 100 нМоль и химерного пептида pAntp_pl6 (2) в концентрации 40 мкМоль, сочетанное воздействие. Ось Y - % частиц.
Фиг. 32. показаны фотографии экспериментальных животных на момент 7 инъекции исследуемого интернализуемого пептида P16_Antp. А и В - фотографии мышей с перевитыми клетками А549, А - мышь из контрольной группы на 16 день эксперимента, опухоль имеет размер 6,0x7,0 мм. В - мышь из опытной группы на 16 день эксперимента при введении P16_Antp в дозе 0,1 мг, опухоль размером 3,0x3,0 мм. Фигуры С и D - мыши с перевитыми клетками НСТ-116, С - мышь из контрольной группы на 18 день после перевивки опухолевых клеток (опухоль размером 11,5x13,5 мм). D - мышь из опытной группы после 7 инъекций P16_Antp в дозе 0,1 мг, опухоль размером 4,5x4,5 мм.
Фиг. 33. Количество выживших клеток (линия SBR3 -рак молочной железы) оценка по МТТ тесту. Каждая точка среднее по трем лункам. По оси X - концентрация химиопрепарата. Верхний график - таксол+пептид. Средний - этопозид+пептид. На каждом графике три кривых - для трех концентраций пептидов. Концентрации химиопрепаратов 1, 10, 30 мкМ. Концентрации пептида - 0.1, 1, 10 мкМ.
Фиг. 34. Двухпараметрическая цитограмма клеток молочной железы. По оси X - окраска PI, по оси Y- окраска цитокератином. Регион - «цитокератин-положительный апоптоз» указан стрелкой. Осуществление изобретения
Исследовали свойства 6 химерных пептидов, включающих различные интернализуемые последовательности и функциональные группы, ответственные за ингибирование циклиновых киназ. В качестве интернализуемых векторов были использованы последовательности из белков Antennapedia (pAntp) - антеннапедия, выполняет морфогенетическую функцию формирования антенны у мухи Drosophilia Melanogaster; и интернализуемая последовательность Tat - белок, выполняющий трансактиваторную функцию у вируса СПИДа. В качестве функциональных групп исследовались последовательность из белка pl6INK4a - ингибитора циклиновых киназ типа D и последовательность PVKRRLDL - имеющая большую степень гомологии с функциональным фрагментом ингибитора циклиновых киназ р21. Большая часть последовательностей была получена методом твердофазного синтеза (таблица 3), одна последовательность получена генноинженерным способом. Данный пептид отличается большей длиной фрагмента, выполняющего транспортную функцию, так как имеет вставку из 44 аминокислот из белка Antennapedia, которая по литературным данным не имеет каких-либо функциональных нагрузок. Необходимость увеличения длины пептидной последовательности является следствием практических ограничений на минимальный размер экспрессируемого белка в E.coli.
Так, как предполагаемым внутриклеточным эффектом исследуемых пептидов является ингибирование циклиновых киназ, был синтезирован контрольный пептид (Antp_zam), содержащий аналогичную последовательность из белка pl6INK4a (АКП 82- 102) с заменой 92 тирозин - на 92 аланин. Данная замена была выбрана потому, что ранее в работе Ferouse et al., было показано, что замены 91 или 92 АКО приводят к утрате этим пептидом ингибирующей способности, свойственной для последовательности pl6INK4a.
Таблица 1. Структура исследуемых ин ернализируемых пешидоа Пептиды 1 -3 состоят из функциональной части р16ЕЧК4а и интернализуемой последовательности pArrtp и отличаются по местоположению функциональной группы относительно Ν-, С- концов молекулы и по наличию вставки для пептида 3 (получен генноинженерным методом). Пептид Antpjzam (4), содержит пошедовательность из белка р16ГМК4а (АКП 82- 102) с заменой 92 тирозин - 92 на аланин. Данная замена была выбрана потому, что ранее в работе Ferouse et al.,98 было показано, что замены 91 или 92 АКО приюдят к утрате этим пептидом ингибирующей способности, сюйственной д ля этой поетедовательности. Пептиды 5 и 6 состоят из интернализуемой последовательности Tat и имеют разные функциональные группы pi 6INK4a и р21 CipKip.
pAntp pl6I K4a
Figure imgf000012_0001
NH2 - RQIKIWFQNRRMKWKK DAAREGFLDTLVVLHRAGAR - соон
2. pl6I K4a pAntp
pAntp_pl6(2) r ^
NH2 - DAAREGFLDTLVVLHRAGAR-S- RQIKIWFQNRRMKWKK - COOH
3. p!6INK4a pAntp
pAntp_p!6(3) r
NH2 - RGS-DAAREGFLDTLVVLHRAGAR RQIKIWFQNRRMKWKK COOH
SERKRGRQTYTRYQTL ELEKEFHFNRYLTRRR RIEIAHALCLTE- pAntp p!6INK4a_zam
pAntp zam
NH2 - RQIKIWFQNRRMKWKK DAAREGFLDALVVLHRAGAR^ - COOH
p!6INK4a Tat
Tat_pl6 r с >
NH2 - DAAREGFLDTLVVLHRAGAR-S- YGRKKRRQRRRG COOH
Tat
p21
Tat_p21 r
NH2 - YGRKKRRQRRRG PVKRRLDL COOH
1 1
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Одна из задач работы заключалась в изучении влияния положения функциональной группы и размера пептида на их биологическую активность, для этого были синтезированы три пептида pAntp_pl6 (1-3) (таблица 1). Пептиды pAntp_pl6 (1-2) отличаются местоположением функциональной группы pl6INK4a: пептид 1 - pl6INK4a расположен на С-конце молекулы, пептид 2 - pl6INK4a расположен на Ν-конце, пептиды получены методом твердофазного синтеза. В случае химерного пептида pAntp_pl6(3), полученного генноинженерным методом, функциональная группа pl6INK4a располагается на Ν-конце, но имеется вставка из 44 АКО.
Кроме того, в исследования были включены как р16+, так и р16- культуры клеток. Экспрессия генов р16 и р53 для используемых в работе клеточных линий приведена в табл. 2. Цитотоксический эффект не зависел от экспрессии р16.
Таблица 2
Figure imgf000013_0001
Пример 1. Изучение проникающей способности интернализуемых пептидов
Для регистрации проникновения пептидов внутрь клетки и исследования динамики накопления использовали идентичные химерные последовательности конъюгированные с флуоресцентной меткой - флоуресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ). Т.к. включение молекул ФИТЦ в готовый полипептидный продукт часто приводит к существенному изменению его физико-химических свойств и потере физиологической активности, поэтому к исходной последовательности на N конце присоединялась молекула лизина, которая и несла одну молекулу ФИТЦ.
Методом световой флуоресцентной микроскопии было показано, что изучаемые пептиды связываются с клетками и проникают в клеточные линии Raji, Jurkatt, А549, НЕК 293 и периферические лимфоциты крови человека. Методом проточной цитофлуорометрии было показано связывание пептида с клетками, и отсутствие эффекта
12
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 тушения флуоресценции трипановым синим. Что свидетельствует о накоплении пептида внутри клетки.
Наиболее объективные данные о накоплении пептида внутри клетки были получены с использованием метода сканирующей лазерной микроскопии (фиг. 1). Белок, меченный флюоресцеин-изотиоцианатом, был растворён в 0,9% NaCl. Клеточные линии А549, НЕК 293 выращивались на предметных стерильных стёклах и помещались в специальной камере непосредственно под окуляры микроскопа. Среда замещалась на среду с исследуемым белком. Насыщение белком наблюдали во времени. Кроме того, производилось послойное сканирование клеток с целью определения локализации пептида.
Анализ полученных изображений при данном увеличении не выявил преимущественного расположения белка pAntp-pl6 в клетке. Очевидно, что белок распределяется в компартментах клетки равномерно. Проникновение белка внутрь клетки происходит достаточно быстро. И уже через 15 минут инкубации можно наблюдать относительно гомогенное распределение его во внутриклеточном пространстве (фиг. 2).
Скорость проникновения пептида в периферические лимфоциты крови человека, а также лимфоциты клеточных линий (Raji, Jurkatt) была оценена с использованием метода проточной цитофлуорометрии. Данный метод позволяет исследовать большие концентрации клеток во времени и удобен для оценки скорости проникновения исследуемого пептида. Измерялась флуоресценция лимфоцитов под действием белка р16- pAntp-ФИТЦ при рН7.5 и рНб.О. Принцип метода основан на меньшем квантовом выходе флуоресценции ФИТЦ в растворах с более кислым рН. Так как скорость измерения происходит достаточно быстро, то значение рН внутри клетки не может измениться. Лимфоциты инкубировались с пептидом в течении 1-15 минут, после этого к ним сразу добавлялся 20 кратный объём фосфатного буфера с рН 6.0 и рН 7.5. При этом оценивалась разность интенсивности флуоресценции. В большинстве измерений интенсивности флуоресценции достоверно не отличались после 15 минут инкубации. Таким образом, можно предположить, что после 15 минут инкубации пептид полностью проникает внутрь клетки.
Для исследования скорости накопления пептида внутри клетки использовали метод проточной цитофлуорометрии. Для этого меченный ФИТЦ пептид вводили непосредственно в измерительную пробирку проточного цитометра, что позволяло регистрировать динамику изменения флуоресценции клеток. Исследовалась
13
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 мононуклеарная фракция лейкоцитов крови здоровых доноров, выделенная на градиенте фиколла.
Видно, что после небольшой лаг-фазы, происходит быстрое накопление пептида в клетках нормальных лимфоцитов. Конечная концентрация достигается за время равное ~ 1мин.
На фиг. 3 показан только фрагмент кривой отражающий кинетику накопления химерного белка в клетке.
Полученная кривая кинетики лучше описывается степенной функцией типа С= constl - const2*t2 + const3, что отражает коэффициент регрессии (=0,79).
Похожая кинетика накопления пептида получена и для клеток злокачественных лимфом. В качестве моделей исследовались линии Jurkat (происходящая из лимфобластного лейкоза и имеющая Т-клеточный фенотип) и Raji -происходящая из В- клеточной лимфомы Беркита. На фиг. 4 показана динамика накопления меченого ФИТЦ пептида в клетках Jurkat.
Приведенный график показывает, что и в опухолевые клетки пептид проникает с большой скоростью. Время достижения максимальной концентрации - менее 1 мин. Кинетика накопления исследовалась при комнатной температуре (t=20 С0). Следует подчеркнуть, что механизм проникновения исследуемого класса пептидов до настоящего времени не известен. Однако показано, что накопление происходит одинаково эффективно даже при температуре +5 С0 и не связано с затратами энергии в клетке, не опосредуется клеточными рецепторами и не использует фаго- и пиноцитозный путь. Мы также подтвердили факт накопления синтезированного нами пептида, содержащего интернализуемый фрагмент, при разных температурах (до +5 С0 ).
Также исследовали зависимость накопившегося в клетках пептида от внеклеточной его концентрации. На фиг. 5 и 6 показано изменение интенсивности флуоресценции клеток в зависимости от внеклеточной концентрации.
На фиг. 6 приведены те же данные, иллюстрирующие тот факт, что соотношение вне- и внутриклеточной концентрации имеет линейный характер (в исследованном диапазоне концентраций). Т.к. исследуемые пептиды могут преодолевать клеточную мембрану в обоих направлениях, можно предположить, что накопленные в клетке
14
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 пептиды могут выходить из нее при снижении внеклеточной концентрации. Исследование процессов экспорта пептидов из клетки могут быть темой отдельных исследований.
Таким образом, в результате проведенных экспериментов было показано, что кинетика накопления химерного пептида, содержащего интернализуемый фрагмент и фрагмент белка р16ГМК4а имеет степенной характер с зависимостью типа С= constl+const2*t2. Показано также, что динамика накопления и внутриклеточного распределения пептида в нормальных и опухолевых клетках не отличается по характеру и по скорости накопления.
Пример 2. Сравнительная оценка функциональной активности пептидов включающих активные центры pl6INK4a и р21С1Р/К1Р
Одним из основных условий при конструировании химерных пептидов на основе белков - ингибиторов циклиновых киназ было наличие доказанных ингибирующих свойств для конкретных пептидных фрагментов. Поэтому в работе сравнивались фрагменты из белков pl6INK4a и р21С1Р/К1Р, у которых такие последовательности описаны.
Продукты генов р16 и р21 являются ингибиторами образования комплексов циклин - циклин-зависимая киназа и, соответственно, являются регуляторами клеточного цикла. Поэтому при исследовании функции экзогенных химерных пептидов с функциональными группами р16 и р21, основное внимание уделялось исследованию пролиферативной активности и исследованию уровня апоптоза в культурах при их инкубации с интернализуемыми пептидами.
В экспериментах с клеточными линиями оценивали распределение клеток по фазам клеточного цикла и рассчитывали индекс пролиферации. Для анализа использовали программу FloMax 2.0 (встроенная опция в проточном цитофлуориметре), а также программу Modfit LT 3.0 (фиг. 7, 8). Также производилась определение доли клеток вступивших в апоптоз по величине «пре-Gl - гиподиплоидного» пика на ДНК гистограмме (фиг. 8(Б)). Эксперименты проводились как на синхронизированных в фазе G1/S, так и не синхронизированных клеточных линиях Raji, Jurkatt, А549, НЕК 293, MCF- 7.
В ряде предварительных экспериментов с участием всех исследуемых пептидных последовательностей бьша установлена оптимальная концентрация пептидов, которая достигает 100 мкМ (фиг.10), что предполагает возможную концентрацию препарата около 400 мг/кг. Однако, уже при концентрации 40 мкМ наблюдается стойкий антипролиферативный эффект на всех исследуемых клеточных линиях, который значимо
15
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 не меняется при увеличении концентрации препарата (фиг. 9). Количество живых клеток не снижается ниже 50%. Количество апоптотических частиц при данной концентрации и времени инкубации 24 часа составляет порядка 40% и увеличивается до 60% при увеличении концентрации до 50 мкМ (фиг. 10).
Из фиг. 10 и 11 видно, что антипролиферативный и цитотоксический эффекты имеют концентрационную зависимость. На малых концентрациях, до 5 мкМ эффект препарата проявляется очень слабо, хотя, как было сказано выше, пептид проникает в клетки при внеклеточной концентрации 0,1 мкМ.
Таким образом, была подобранна концентрация равная 40 мкМоль, которая удовлетворяла приведенным выше требованиям и была адекватна для всех исследуемых пептидов.
Исследование влияния пептидов проводилось на перевивных культурах клеток. Для исследования изменения экспрессии конкретных внутриклеточных регуляторов и большей наглядности экспериментов клетки предварительно синхронизировали.
В зависимости от метода синхронизации культуры клеток задерживаются в G0/G1, S или G2/M - фазе клеточного цикла (фиг. 11).
На фиг. 12 показано, как в синхронизованной в G0\G1 - фазе культуре, меняется распределение клеток в разных фазах клеточного цикла после снятия блока синхронизации. В момент времени 0 (момент снятия блока синхронизации) большинство клеток находилось в ОО фазе (73%), а в фазах S и G2\M - 15% и 8% соответственно, затем можно наблюдать, как происходит снижение ОО Ьфазы и одновременно рост S- фазы, через определенный промежуток времени начинает увеличиваться процент клеток в С2\М-фазе. Данный характер выхода из блока синхронизации типичен для всех исследуемых клеточных культур, также следует отметить, что время удвоения всех исследуемых клеток составляло примерно 24 часа.
Пример 3. Оценка антипролиферативной активности химерных пептидов с разными активными центрами
На первом этапе оценки полученных результатов, было проведено исследование влияния химерных интернализируемых пептидов с разными активными центрами - pl6INK4a и р21С1Р/К1Р. К культуре клеток исследуемый химерный пептид добавлялся в момент снятия блока синхронизации. Анализ клеточного цикла проводился через каждые 2 часа в течение 24 часов после снятия блока.
При исследовании антипролиферативной активности данных пептидов, установили, что пептиды с активным центром pl6INK4a, вызывают задержку клеток в О0\О1-фазе
16
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 клеточного цикла (фиг. 13). Такой эффект более наглядно виден на культуре клеток синхронизированной в GO-фазе с помощью метода синхронизации обедненной средой. И регистрируется только при прохождении первого клеточного деления после снятия блока синхронизации .
Из фиг. 13 видно, что в контроле (синхронизованные клетки без добавления химерного пептида), увеличение S - фазы наблюдается через 4 часа после отмены синхронизирующего фактора, также видно, что уменьшается G0\G1 - фаза. При добавлении химерных пептидов с активным центром р16 снижение G0\G1 и рост S происходят позже, чем в контроле, G0\G1 начинает снижаться после 6 часов инкубации, а видимый рост S - фазы можно наблюдать после 8 часов инкубации.
При исследовании химерного пептида p21Cip/Kip (фиг. 14), было обнаружено, что изменения О0 _т1-фазы в контроле не отличаются от таковых в образце с пептидом, однако, высокий уровень S-фазы в опытном образце (65-70%) остается до 14 часов инкубации, в то время как в контрольном образце уровень S-фазы начинает снижаться уже после 10 часов инкубации и к 14 часам инкубации составляет в среднем 45%. Уровень 02\М-фазы в образце с пептидом достигает максимального значения в среднем после 18- 20 часов инкубации, а в контроле после 10-12 часов. Таким образом можно сделать заключение, что основной антипролиферативный эффект пептида с активным центром p21Cip/Kip - задержка перехода клеток из S в G2\M фазу (фиг. 14).
Как и в случае с химерными пептидами, включающими фрагмент pl6INK4a, для более наглядной иллюстрации эффекта вызываемого пептидом Tat_p21, нами была выбрана синхронизация в GO-фазе с помощью обедненной среды.
Как видно из фиг. 13 и 14, в определенный момент времени можно выявить максимальные различия между фазами клеточного цикла в контрольных и опытных образцах. Для исследуемых пептидов, время максимальных различий составляло 8 - 12 часов с момента снятия блока синхронизации. Если учитывать, что накопление пептида внутри клетки происходит в течение нескольких первых минут после внесения пептида во внеклеточную среду, то можно предположить, что наблюдаемый эффект связан с моментом воздействия активного центра химерного пептида на геном клетки, для пептидов с активным центром р16, максимальные отличия наблюдаются на момент 8 - 10 часов инкубации, а для пептида с активным центром р21 - 10-12 часов (фиг. 15). Возможно, это небольшое отличие связано с тем, что, как уже обсуждалось выше, р16 вызывает задержку перехода Gl - S, а р21 задержку S - G2\M перехода.
17
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 Пример 4. Исследование влияния на уровень апоптоза химерных пептидов включающих функциональные группы р16 К4а и р21С1Р/К1Р
Одной из основных тенденций при разработке противоопухолевых препаратов является поиск лекарственных средств, способных избирательно индуцировать апоптоз в опухолевых клетках. Апоптоз является генетически контролируемым процессом. В большом количестве работ показана связь ухода клетки в апоптоз с невозможностью преодолеть одну из контрольных точек (chiek-point) при прохождении клеткой фаз пролиферации.
Мы показали, что исследуемые химерные пептиды способны активировать апоптоз в различных клеточных линиях (фиг. 16).
При исследовании различий цитотоксического эффекта от структуры активного центра было обнаружено, что химерные пептиды, включающие функциональную последовательность из белка pl6INK4a, обладают более выраженным цитотоксическим эффектом по сравнению с пептидами, включающими последовательность из р21С1Р/К1Р. При сравнении средних величин апоптоза для пептидов Tat_p21 и пептидов pAntp_pl6 совместно с Tat_pl6, было установлено, что достоверных отличий между контрольными и образцами с пептидом Tat_p21 нет (фиг. 16).
Анализируя уровень апоптоза в зависимости от времени инкубации с пептидом, для пептидов с активным центром pl6INK4a, была установлена зависимость уровня апоптоза от времени инкубации. В случае химерного пептида с фрагментом р21, такой зависимости получено не было. Как видно из фиг. 17, уровень апоптоза при исследовании пептидов, включающих фрагмент р16, имеет некий максимум, который расположен на 8- 10 часах инкубации и т.о. совпадает по времени с вызываемой им задержкой перехода G1- S.
Пример 5. Исследование влияния структуры пептидного вектора на примере Tat и pAntp
Нами были исследованы два типа пептидных переносчиков - Tat и pAntp. В главе обзор литературы обсуждалось структура и особенности данных векторов.
Исследовались химерные пептиды, несущие активный центр pl6INK4a и имеющие разные типы векторов - Tat и pAntp. Исследуя влияние типа вектора на процессы пролиферации клетки, было обнаружено, что исследуемые Tat_ l6 и pAntp_ l6 влияют на одинаковые фазы клеточного цикла, вызывая задержку Gl - S перехода. Как видно из фиг. 18, графики зависимости количества клеток в фазах клеточного цикла близки по виду для обоих типов пептидных векторов, несущих фрагмент р16. В контрольных образцах - синхронизированная культура клеток без добавления исследуемого пептида, количество
18
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 клеток в GO/Gl-фазе начинает снижаться уже через 2 часа после снятия блока синхронизации, а через 10 часов регистрируется наименьшее количество клеток в GO/Gl- фазе. S-фаза в контрольных образцах начинает расти после 4-6 часов отмены блока синхронизации и достигает максимума в 12 часов. В образцах с химерными пептидами, как видно из фиг. 18, наблюдается задержка в GO/Gl-фазе. Так, при инкубации с пептидами pAntp_pl6, уровень фазы G0/G1 начинает снижаться после 6-8 часов инкубации и достигает наименьшего уровня через 14 часов, а уровень S-фазы начинает возрастать после 10 часов инкубации. В случае с химерным пептидом Tat_ l6, четких переходов в возрастании S и убывании GO/Gl-фаз нет, убывать G0/G1 начинает вместе с G0/G1 -фазой контрольного образца, однако, ее уровень снижается более медленно, чем в контроле. S-фаза в образце с исследуемым пептидом Tat_pl6 начинает увеличиваться после 12 часов инкубации и имеет максимум на 14 часах инкубации с пептидом. В контрольных образцах максимум S-фазы регистрируется через 12 часов после снятия блока синхронизации.
PAntp_pl6 и Tat_pl6 оказывают одинаковую по времени задержку пролиферации клетки, максимальные различия в контрольных и опытных образцах соответствуют примерно 12 часам инкубации (фиг. 19). Данный временной интервал в контрольной группе отражает переход Gl - S. Таким образом, можно предположить, что в случае с химерными пептидами с активным центром pl6INK4a, структура вектора не влияет на оказываемый антипролиферативный эффект пептида.
При оценке влияния структуры пептидного вектора на оказываемый цитотоксический эффект, наблюдали, что в случае с химерным пептидом pAntp_pl6, уровень апоптоза в образцах выше, чем при инкубации с пептидом Tat_pl6 (фиг. 20). Индуцируемый добавлением исследуемого химерного пептида к культуре апоптоз зависит от клеточной линии и от апоптоза в контрольном образце. В клеточных линиях А549 и MCF-7 уровень апоптоза в контрольных образцах находится на уровне 5%, а при инкубации с химерным пептидом Antp_ l6 увеличивается в среднем до 25%. В линиях Raji, Jurkat в контрольных образцах уровень апоптоза составляет 12%, в образцах с пептидом - 35%. У клеток линии НЕК 293 апоптоз в контроле имеет самый высокий уровень и составляет около 20%, при инкубации НЕК 293 клеточной линии с химерным пептидом Antp_pl6 в течении 24 часов, апоптоз увеличивается до 60%.
Концентрация пептидов - 40 мкМ. Ось Y - % апоптотических частиц.
Из фиг. 20 и 21 видно, что как pAntp_pl6, так и Tat_pl6, вызывают апоптоз у большего числа клеток, чем в контрольных образцах. Максимальный уровень апоптоза в образцах с пептидами наблюдается после 24 часов инкубации, однако было замечено, что
19
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 хотя уровень апоптоза увеличивается в зависимости от времени инкубации, увеличение количества апоптотических частиц не происходит равномерно. При исследовании изменений уровня апоптоза в зависимости от времени инкубации образцов с пептидами, были обнаружены временные отрезки для которых характерно усиленное образование апоптотических телец. Так, при инкубации синхронизированной культуры клеток НЕК 293 с химерными пептидами pAntp_pl6, точками с увеличенным апоптозом являются 2 и 10 часов инкубации, а с пептидом Tat_pl6 - 6 и 16 часов (фиг. 21). Наличие таких временных отрезков с усилением апоптоза характерно для всех исследованных культур, причем эти «максимумы» апоптоза для исследованных клеточных культур находятся в примерно одинаковых временных интервалах и отличаются по уровню апоптоза (фиг. 21).
А - НЕК 293 клеточная линия синхронизированная в GO/Gl-фазе после снятия блока синхронизации и добавления исследуемых пептидов.
Б - А549 клеточная линия синхронизированная в GO/Gl-фазе после снятия блока синхронизации и добавления исследуемых пептидов.
ось X - время инкубации, ось Y - количество апоптозных частиц, %.
Пример 6. Исследование влияния положения и размера пептидного вектора на антипролиферативную активность химерных пептидов
В работе использовались три варианта химерных пептида содержащих активный центр pl6INK4a и вектор- pAntp. Отличаются данные химерные пептиды по месту расположения активного центра относительно N-C концов молекулы и по наличию вставки из 44 аминокислот
(SERKRGRQTYTRYQTLELEKEFHFNRYLTRRRRIEIAHALCLTE) для пептида 3, полученного генно-инженерным методом (Таблица 1).
При исследовании свойств данных пептидов также исследовались синхронизированные и не синхронизированные клеточные культуры. В синхронизированную культуру пептид добавлялся в момент снятия блока синхронизации, в не синхронизированную - при плотности монослоя (для адгезионных культур) -50%.
Результаты по изменению распределения клеток по фазам клеточного цикла для пептидов pAntp-pl6INK4a (1,2,3) приведены на фиг. 22 и 23. Как видно из фиг. 26, при добавлении контрольного пептида pAntp_zam к синхронизированным и несинхронизированным клеткам, изменения фаз клеточного цикла в опытных образцах не отличается от контроля. Добавление химерного пептида (1) (Таблица 1), содержащего фрагмент pl6INK4a, также не вызывает ожидаемого цитостатического эффекта. Как в случае синхронизированной, так и несинхронизированной культуры распределение клеток
20
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 по фазам клеточного цикла практически не отличается по сравнению с контролем. Однако добавление пептидов 2 и 3 приводит заметному снижению S - фазы, при этом также возрастает количество клеток в G0/1. Более четко это видно в экспериментах на синхронизированных культурах.
Эксперименты, проведенные на клеточной линии А549 (фиг. 23) обнаружили сходные изменения клеточного цикла для всех исследованных пептидов.
Полученные результаты указывают, что химерный пептид pAntp-pl6INK4a (1) не оказывает антипролиферативного действия на клетки. В то время как добавление химерных пептидов pAntp-pl6INK4a (2 и 3), оказывает антипролиферативный эффект на клетки и приводит к увеличению клеток, находящихся в фазе G1.
Отсутствие цитостатического эффекта, при добавлении химерного пептида 1, возможно связано с изменением конформации пептидной молекулы из-за расположением интернализующей последовательности pAntp с N - конца химерного пептида (в случае пептидов 2 и 3, pAntp расположен с С - конца).
На следующем этапе работы проводилась оценка зависимости цитотоксического эффекта, оказываемого исследуемыми химерными пептидами с пептидным вектором pAntp. Эксперимент по определению уровня апоптоза проводили на клеточных линиях А549 (человек, карцинома легкого), НЕК 293 (человек, почка эмбриона) и MCF-7 (человек, аденокарцинома молочной железы). Клетки культивировали по стандартной методике, в среде DMEM содержащей 10% ФСБ. Часть клеток была предварительно синхронизирована, используя методики двойного тимидинового блока и методику синхронизации с помощью обедненной среды (см. «Эксперимент, части»). В культуральную среду добавляли исследуемые химерные пептиды pAntp-pl6 (1и2). В качестве отрицательного контроля использовали клетки обработанные пептидом pAntp_zam (фиг. 24, 25).
Как видно из фиг. 24, 25, на уровень апоптоза не влияет добавление контрольного пептида pAntp_zam, в то время, как добавление pAntp-pl6 (1, 2) заметно увеличивает количество клеток, вошедших в апоптоз. При этом отличий в величине эффекта в зависимости от типа клеток (для линий А549 и НЕК 293) не обнаружено. Сравнение влияния пептидов pAntp-pl6 1 и 2 на уровень апоптоза для клеточной линии НЕК 293 представлено на рисунке 26. На фиг. 26 видно, что зависимость количества апоптозных тел от концентрации pAntp-pl6 имеет степенной характер. Сравнение уровня апоптоза, при добавлении химерных пептидов, показало, что уровень апоптоза в случае добавления
21
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 пептида 2 практически в 2 раза выше уровня апоптоза в эксперименте с химерным пептидом 1. Более выраженный цитотоксический эффект наблюдается на синхронизированной культуре. Таким образом, обнаружено, что химерные пептиды pAntp 1 и 2, содержащие фрагмент pl6INK4a, обладают выраженными цитотоксичеческим действиям по отношению к культурам клеток.
При сравнении цитотоксического и цитостатического действия химерных пептидов pAntp-pl6 1 и 2, можно сделать вывод, что изменение положения интернализуемой последовательности pAntp, в химерном пептиде с С - конца на N - конец, приводит к исчезновению цитостатического эффекта и снижению цитотоксического эффекта.
Пример 7. Исследование изменения количества фосфорилированного pRb при инкубации клеточных культур с химерными пептидами
Одной из задач работы было доказать, что антипролиферативные эффекты исследуемых пептидов связаны со специфическим действием фрагментов ингибиторов циклиновых киназ, входящих в их структуру. Хотя в литературе и описано сохранение игибирующих свойств таких пептидов на фосфорилирующую функцию циклинзависимых киназ, эти подтверждения получены на клеточных экстрактах. Мы провели исследование изменения уровня фосфорилирования pRB - молекулярной мишени циклиновых киназ D типа на фоне действия исследуемых пептидов - включающих ингибирующие последовательность из соответствующих белковых ингибиторе pl6INK4a и р21.
Активация в клетке собственного pl6INK4a приводит к ингибированию фосфорилирования pRb. Накопление недофосфорилированого pRb приводит к ингибированию E2F1 и снижению экспрессии циклинов А и В, что является одним из ключевых механизмов в остановке клеточного цикла. По количеству фосфорилированного pRb, можно судить об активности р16.
Метод проточной цитометрии позволяет визуализировать клетки в которых продукт pRb находится в "недофосфорилированном" («undephosphorylated») состоянии. Меченные флуоресцентной меткой антитела взаимодействуют с "недофосфорилированным" pRb. На фиг. 27, А - изотипитический контроль, нужный для исключения неспецифической флуоресценции, В - контрольный образец в котором в части клеток pRb находится в недофосфорилированном состоянии.
Для определения количества «недофосфорилированного» pRb, был проведен ряд экспериментов, к синхронизированным методом обедненной среды культурам клеток после снятия блока синхронизации добавлялись исследуемые химерные пептиды, затем клетки снимались через каждые два часа. С каждой чашки часть клеток фиксировалась для дальнейшего определения фаз клеточного цикла, а часть по методике, описанной в
22
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 разделе «Материалы и методы», для определения количества «недофосфорилированного» pRb. Также был поставлен отрицательный контроль в виде образцов синхронизированных клеток, но без добавления пептидов. Было показано, что внесение в культуру клеток химерного пептида вызывает задержку фосфорилирования pRb и снижает его максимальный уровень в культуре (фиг. 28).
Как видно из фиг. 28, начальный уровень «недофосфорилированного» pRb примерно одинаковый в контроле и в опытных образцах, но после снятия блока синхронизации в образцах без добавления химерных пептидов, его уровень начинает расти и к определенному моменту (4 или 6 часов инкубации), в зависимости от клеточной линии, достигает максимального значения, а затем начинает снижаться. В образцах с химерным пептидом уровень «недофосфорилированного» pRb начинает увеличиваться позднее и достигает своего максимального значения через 8 часов инкубации, причем это значение ниже, чем в контрольных образцах.
Пример 8. Исследование изменения уровня экспрессии мРНК циклина В с помощью методики RT-PCR
Известно, что фосфорилирование рРВ, является пусковой стадией для активации экспрессии циклинов А и В и перехода клетки из G1 в S фазу клеточного цикла. Методом количественной ПЦР был исследован уровень экспрессии мРНК для циклина В при воздействии пептида Тат_р16. Для этого в ходе эксперимента на синхронизированной культуре при добавлении химерного пептида Tat_pl6 в концентрации 40 мкМоль параллельно производили отбор клеток из образцов для вьщеления РНК, а часть клеток шла на определение фаз клеточного цикла. Дальнейшая обработка материала - выделение РНК и постановка реакции количественной ПЦР (RT-PCR) шла по протоколу.
На фиг. 29 показано, полученное с помощью методики количественной ПЦР, изменение количества мРНК циклина В, которое отражает изменение уровня экспрессии циклина В, фиг. 29А. И приведено изменение количества клеток в 02/М-фазе клеточного цикла, рисунок 29В, полученное с помощью проточной цитофлуориметрии.
Из фиг. 29 видно, химерный пептид Tat_pl6 вызывает задержку экспрессии циклина В и, соответственно, задержку перехода S-G2. Из результатов, приведенных на рисунке 14.В видно, что количество клеток в G2 - фазе в контрольном образце имеет максимум на 12 часах инкубации, а в образце с пептидом увеличение G2 - фазы происходит только к 16 часам инкубации. На рисунке А показано изменение уровня экспрессии циклина В, видно, что в контроле также имеется максимум на 12 часах,
23
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 который совпадает с максимумом клеток в 02-фазе. В образце с пептидом Tat_pl6 уровень экспрессии возрастает к 16 часам инкубации. Добавление пептида приводит к задержке экспрессии циклина В. Таким образом было подтверждено, что наблюдаемый цитостатический эффект, связан с влиянием на процесс фосфорилирования рРВ и, как следствие, на торможение экспрессии циклинов.
Пример 9. Исследование сочетанного действия химерных пептидов и химиопрепаратов.
В медицинской практике при лечении злокачественных новообразований широко используются химиопрепараты - цитостатики. Их эффект основан на том, что клетки под их воздействием останавливаются на определенной фазе клеточного цикла, а сочетанное введение препарата, обладающего цитотоксической активностью на этой фазе цикла, позволяет добиться гибели большого числа клеток.
Исследуемые химерные пептиды обладают, как было показано, цитостатической и цитотоксической активностью. Причем, цитостатическая активность специфична и является результатом непосредственного влияния пептида на геном клетки. Однако, как было показано выше, эффект воздействия химерного пептида на культуру клеток недостаточен для получения терапевтически значимых результатов. Вследствие этого было предложено исследовать сочетанное действие интернализируемых пептидов и химиопрепаратов.
Были исследованы следующие химиопрепараты, применяемые в медицинской практике и влияющие на клеточный цикл: Таксол, вызывающий задержку клеток в фазе G2\M, Этопозид - задержка в S-фазе и 5-фторурацил - задержка в О0\О1-фазе клеточного цикла. Наиболее информативные результаты при сочетанном действии химиопрепаратов и химерных пептидов были получены при применении пептида pAntp_pl6 (2) (Фиг.ЗЗ). В предварительных экспериментах на клеточных линиях НЕК 293 и А549 получили ожидаемые эффекты задержки клеточного цикла на фазах, характерных для каждого исследуемого препарата и подобрали оптимальную концентрацию, которая позволяет наблюдать эффект не вызывая тотальную гибель клеток. Данная концентрация для всех препаратов составила 100 нМоль.
При исследовании сочетанного воздействия химиопрепаратов и химерного пептида pAntp_pl6 (2) наблюдали усиление цитостатического действия для препаратов 5- фторурацил и Этопозид - увеличение G0\G1 (фиг. 30А) и S (фиг. ЗОБ) - фаз соответственно. При совместной инкубации клеток с pAntp_pl6 и Таксол ом - снижение 02\М-фазы по сравнению с образцами с Таксолом, увеличение СКМН-фазы (фиг. ЗОВ), и
24
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 усиление цитотоксического влияния. На фиг. 30 показано изменение фаз клеточного цикла при сочетанном действии химиопрепаратов и исследуемых пептидов.
Также было показано, что при сочетанном применении химиопрепаратов и исследуемых химерных пептидов происходит усиление цитотоксического эффекта. При инкубации клеток с химиопрепаратом и химерным пептидом происходит увеличение уровня апоптоза относительно уровня апоптоза в образцах только с химиопрепаратом. Также бьш определен уровень погибших клеток, который высчитывался по количеству живых клеток в образцах с помощью камеры Горяева. Уровень мертвых (погибших) клеток возрастает в образцах, инкубированных с химиопрепаратом и с исследуемым пептидом.
На фиг. 31 приведены результаты цитотоксических эффектов при сочетанном применении химиопрепаратов и химерного пептида pAntp_pl6 (2).
При исследовании сочетанного воздействия химиопрепаратов и исследуемых пептидов pAntp_pl6, было установлено, что происходит значительное усиление цитотоксической активности исследуемых химиопрепаратов. Цитотоксический сочетанный эффект напрямую зависит от характера цитотоксического эффекта химиопрепарата.
Пример 10. Исследование противоопухолевой активности химерного пептида pl6_Antp in vivo (местное введение)
На бестимусных мышах (Nude) исследовалась противоопухолевая активность химерного интернализуемого пептида P16_Antp.
Мышам были перевиты опухолевые культуры клеток человека линий А549 и НСТ- 116 в количестве около 1 млн. клеток на мышь.
39 мышам были привиты клетки А549, из них 20 мышей составили контрольную группу, им в дальнейшем вводили плацебо. 10 мышей составили 1 опытную группу. Им после образования пальпируемой опухоли (через 4 дня после перевивки клеток) стали вводить непосредственно в опухоль исследуемый пептид в дозе 0,1 мг. 9 мышей составили 2 опытную группу, им также после образования опухолевого узла на 4 день перевивки стали вводить в ложе опухоли по 0,2 мг пептида. Пептид в опытных группах вводили один раз в два дня. Эксперимент продолжался 24 дня.
В опытных группах наблюдали снижение темпов роста опухолей и на 6 день после начала введения пептида можно наблюдать заметное снижение объема опухолей в опытных группах по сравнению с контрольной (фиг. 32). Эксперимент продолжался 24
25
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 дня. За это время в опытных группах было проведено 10 инъекций химерного пептида. В контрольной группе на 24 день эксперимента средний объем опухолей у мышей составил 95,24 мм , одна мышь погибла. В первой опытной группе (доза вводимого пептида - 0,1 мг) средний объем опухолей составил 39,29 мм , одна мышь погибла. Во второй опытной группе (доза вводимого пептида - 0,2 мг) средний объем опухолей составил 57,51 мм3, но погибших животных не было.
При введении мышам перевивной культуры человека НСТ-116, животных разделили на две группы: контрольная - 10 мышей, которым в последующем не вводили исследуемый пептид и опытная группа (10 мышей), которым вводили исследуемый химерный пептид P16_Antp в дозе 0,1 мг в область опухолевого узла. Эксперимент продолжался 28 дней, было сделано в опытной группе 11 инъекций пептида, первая инъекция была сделана на 6 день после перевивки опухолевых клеток. Опухолевый узел из клеток НСТ-116 отличался большими размерами и наличием изъязвлений. В контрольной группе на 28 день эксперимента средний объем опухолей составил 679 мм3, за время эксперимента погибло 3 мыши. В опытной группе отмечался более низкий темп роста опухоли (фиг. 32), на 28 день эксперимента средний объем опухолей составил 225,4 мм3, погибших животных в опытной группе было 2.
На фиг. 32 представлены пары мышей из разных групп после 7 проведенных инъекций исследуемого пептида. Видно заметное уменьшение опухолевого узла в опытных группах.
Таким образом, местное введение химерного пептида pl6-Antp приводит к достоверному (более 50%) торможению роста экспериментальных моделей опухолей человека (рак молочной железы, колоректальный рак).
Пример 11. Исследование цитотоксических свойств химерных пептидов на краткосрочных культурах опухолей человека
Исследовалась противоопухолевая активность химерных пептидов, включающих интернализуемый фрагмент Antp и функциональные фрагменты ингибиторов циклиновых киназ pl6INK4a (DAAREGFLDTLVVLHRAGAR-S-RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO.3)). Были синтезированы 150 мг пептида р 16- Antp методом твердофазного синтеза (см. раздел методы). Для исследования эффектов на опухолях человека использовали метод краткосрочных культур.
Методика получения краткосрочных культур опухолей из операционного материала.
Краткосрочные культуры получали из операционного материала. Забор участка для приготовления культуры проводился по-возможности в кратчайшие сроки после операции
26
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 и с участием патологоанатома. Вырезался участок ткани, в среднем 1,5 см3. Ткань механически размельчалась, суспензия клеток помещалась в среду RPMI, содержащую 5% ФБС. Через 24 часа инкубации при 37°С и 5% С02, среда заменялась на среду, содержащую химерный пептид (pl6_Antp в концентрации 40 мкМоль), либо для ряда экспериментов на Таксол в концентрации 100 нМоль или 500 нМоль, содержащую и пептид и Таксол. В контрольных образцах среда заменялась на свежую. Снималась первая точка - 0 часов.
Инкубация проходила при 37°С и 5% С02 24 часа, для ряда экспериментов 24 и 48 часов.
Оценивали результаты методом проточной цитофлуориметрии с использованием двойной окраски образцов AnnexinV-PI и окраски фиксированного материала PI. Оценивали уровень частиц, положительных по AnnexinV (ранний апоптоз), уровень частиц, положительных по двойной метке AnnexinV-PI (поздний апоптоз), количество частиц в нефиксированных образцах, способных включать PI (некроз); распределение клеток по фазам клеточного цикла, уровень субдиплоидного пика (количество частиц с фрагментированной ДНК, апоптоз). Для выявления апоптоза эпителиальных клеток использовали двойную окраску антитела к цитокератину-ФИТЦ - PL (Фигура 35).
Всего проанализировано 126 образца ткани: из них 63 - образца патологических тканей (и 63 образца нормальных тканей в качестве контролей) Из 63 патологических образцов было исследовано опухолей злокачественного генеза 47 (10 - рак молочной железы, 15 - рака почки, 6 рака матки, 4 рака предстательной железы, 3 рака яичника и рака легкого и по 2 случая рака желудка, рака поджелудочной железы, мочевого пузыря.) Кроме того исследовались образцы ткани фиброаденом (N=9), а также 7 образцов ткани молочной железы при простой протоковой гиперплазии.
Уровень апоптоза анализировали через 24 и 48 часов после добавления пептидов в концентрации 40 мкМ. Часть экспериментов провели для изучения сочетанного цитотоксического действия на клетки опухоли традиционных химиотерапевтических препаратов и пептида pl6_Antp.
Пример 12. Исследование противоопухолевой активности пептида pl6_Antp
Суммарные результаты по цитотоксической активности пептида pl6_Antp приведены в Таблице 3.
27
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 Таблица 3. Средний уровень индуцированного апоптоза в краткосрочных культурах опухолей при воздействии пептида pl6_Antp. (24 час, 40 мкМ)
Figure imgf000029_0001
Анализ полученных результатов показывает, что наиболее чувствительными формами рака для цитотоксического действия пептида pl6_Antp являются: рак почки, молочной железы, желудка, мочевого пузыря. Следует отметить, что для краткосрочных культур рака мочевого пузыря характерен очень высокий уровень спонтанного апоптоза (до 60-70%). Несмотря на то, что добавление пептида повышает этот уровень незначительно, на этом фоне полученные результаты могут иметь нерепрезентативный характер.
Пример 13. Исследование цитотоксического действия на клетки фиброаденомы молочной железы
Исследовали образцы тканей фиброаденомы молочной железы. В краткосрочных культурах этих клеток при невысоком уровне спонтанного апоптоза (максимальный до 20 %, средний 12,8%) пептид р16 оказывал существенное цитотоксическое действие и вызывал выраженный апоптоз через 24 часа со средним уровнем 38,2 % при
28
АМЕНЯ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26 максимально до 80%. Менее выраженное цитотоксическое действие было обнаружено для клеток молочной железы имеющих признаки простой протоковой гиперплазии (средний уровень индуцированного апоптоза 14,5%). Эти результаты согласуются с полученными автором данными по изучению соотношения активности пролиферации и уровня спонтанного апотоза в патологических тканях молочной железы. Было показано, что соотношение пролиферации и спонтанного апоптоза наиболее высоко для ткани фиброаденомы, а клетки рака молочной железы по этому показателю находятся на втором месте, далее следует простая протоковая гиперплазия и ткань нормальной молочной железы. Если одним из факторов, определяющих чувствительность клеток к цитотоксическому действию пептидов, содержащих ингибиторы пролиферации является активность клеточного деления, то чувствительность клеток фиброаденомы к пептиду р16_Ашр является вполне логичной. Обнаруженный эффект чувствительности доброкачественных пролиферативных процессов в ткани молочной железы может оказаться перспективным для их лечения. Результаты по локальному введению пептидов для лечения перевивных солидных опухолей позволяют предположить эффективность их при локальном введении в область доброкачественных пролиферативных процессов в тканях молочной железы.
Полученный результаты позволили выявить спектр чувствительных к пептиду pl6_Antp опухолей человека. Обнаружено, что такие локализации как рак молочной железы, колоректальный рак, рак желудка, рак мочевого пузыря, рак почки являются перспективными объектами для дальнейшего изучения цитотоксического (противоопухолевого) действия изучаемого пептида. Полученные результаты являются новыми, т.к. в доступной литературе нет данных по изучению влияния анализируемого пептида на опухоли человека.
29
ЗАМЕНЯЮ ИЙ ЛИСТ ПРАВИЛО 26

Claims

Формула изобретения
1. Фармацевтическая композиция для лечения гиперпролиферативных заболеваний, включая онкологические заболевания, обладающая антипролиферативной и цитотоксической активностью, включающая:
а) химерный пептид, содержащий функциональную последовательность из белка- ингибитора циклиновых киназ pl6INK4a (SEQ ID NO: 1) или p21/CIP/KIP (SEQ ID NO: 6), и транспортную последовательность, которые соединены между собой посредством группы X, где X представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую от 1 до 50 аминокислотных остатков;
б) терапевтически активное вещество, выбранное из группы, включающей 5- фторурацил, этопозид;
в) фармацевтически приемлемые носители.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что онкологическое заболевание выбрано из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка и рак яичника.
3. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что входящий в ее состав химерный пептид содержит функциональную 20-аминокислотную последовательность из белка-ингибитора циклиновых киназ pl6INK4a, SEQ ID NO: 1, и транспортную 16-аминокислотную последовательность из белка Antp, SEQ ID NO: 2.
4. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что входящий в ее состав химерный пептид содержит функциональную 20-аминокислотную последовательность из белка-ингибитора циклиновых киназ pl6INK4a, SEQ ID NO: 1, и транспортную 11 -аминокислотную последовательность из белка Tat, SEQ ID NO: 5.
5. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что входящий в ее состав химерный пептид содержит функциональную 8-аминокислотную последовательность из белка-ингибитора р21/ CIP/KIP, SEQ ID NO: 6, и транспортную 11- аминокислотную последовательность из белка Tat, SEQ ID NO: 5.
6. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что входящий в ее состав химерный пептид имеет аминокислотную последовательность, SEQ ID NO: 3.
30
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
7. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что входящий в ее состав химерный пептид имеет аминокислотную последовательность, SEQ ID NO: 4.
8. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что входящий в ее состав химерный пептид имеет аминокислотную последовательность, SEQ ID NO: 7.
9. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что композиция содержит химерный пептид в количестве до 400 мг/кг.
10. Применение фармацевтической композиции по п. 1 для получения лекарственного средства для лечения онкологических заболеваний.
11. Применение по п. 11, при котором онкологическое заболевание выбрано из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка и рак яичника.
12. Способ лечения онкологического заболевания, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции по п.1 в терапевтически приемлемой дозе.
13. Способ по п. 13, в котором онкологическое заболевание выбрано из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка и рак яичника.
31
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2011/000343 2011-04-06 2011-05-20 Фармацевтическая композиция для лечения гиперпролиферативных заболеваний WO2012138246A1 (ru)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014503623A JP5852731B2 (ja) 2011-04-06 2011-05-20 高増殖性疾患治療のための医薬組成物
US14/002,860 US8969515B2 (en) 2011-04-06 2011-05-20 Pharmaceutical composition for treating hyperproliferative diseases
EP11863085.4A EP2712621B1 (en) 2011-04-06 2011-05-20 Pharmaceutical composition for treating hyperproliferative diseases
US14/599,426 US20150174191A1 (en) 2011-04-06 2015-01-16 Pharmaceutical composition for treating hyperproliferative diseases

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201100464A EA201100464A1 (ru) 2011-04-06 2011-04-06 Фармацевтическая композиция для лечения гиперпролиферативных заболеваний и её применение
EA201100464 2011-04-06

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/002,860 A-371-Of-International US8969515B2 (en) 2011-04-06 2011-05-20 Pharmaceutical composition for treating hyperproliferative diseases
US14/599,426 Division US20150174191A1 (en) 2011-04-06 2015-01-16 Pharmaceutical composition for treating hyperproliferative diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012138246A1 true WO2012138246A1 (ru) 2012-10-11

Family

ID=46969422

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2011/000343 WO2012138246A1 (ru) 2011-04-06 2011-05-20 Фармацевтическая композиция для лечения гиперпролиферативных заболеваний

Country Status (5)

Country Link
US (2) US8969515B2 (ru)
EP (1) EP2712621B1 (ru)
JP (1) JP5852731B2 (ru)
EA (1) EA201100464A1 (ru)
WO (1) WO2012138246A1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA028151B1 (ru) * 2013-04-03 2017-10-31 ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ "МетаМакс" (ООО "МетаМакс") Химерный пептид и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6569833B1 (en) 1995-09-21 2003-05-27 Cyclacel Limited Cyclin dependent kinase binding peptides

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1076561E (pt) * 1998-05-15 2005-08-31 Aphton Corp Terapia de combinacao para o tratamento de tumores
BR0116330A (pt) * 2000-12-20 2004-02-25 Novartis Ag Inibidores da interação e2f-1/ciclina para terapia de câncer
RU2297241C2 (ru) * 2004-11-22 2007-04-20 Государственное учреждение Российский научный центр рентгенорадиологии Министерства здравоохранения и социального развития Химерный белок для лечения злокачественных лимфом
WO2007139820A2 (en) * 2006-05-24 2007-12-06 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Inhibition of skp2-cyclin a interaction
AU2008229483A1 (en) * 2007-03-16 2008-09-25 University Of Florida Research Foundation, Inc. Kinase protein binding inhibitors
JP2010532385A (ja) * 2007-07-02 2010-10-07 ユ，ミン 複合的癌治療の方法、組成物および標的
RU2369402C1 (ru) * 2008-04-17 2009-10-10 Федеральное Государственное Учреждение "Российский научный центр рентгенорадиологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи" Химерный пептид для лечения эпителиальных и мезенхимальных злокачественных новообразований

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6569833B1 (en) 1995-09-21 2003-05-27 Cyclacel Limited Cyclin dependent kinase binding peptides

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GENBANK [online] 13 February 2003 (2003-02-13), XP055134906, Database accession no. 1 H24_E *
DATABASE GENBANK [online] 3 August 2009 (2009-08-03), "Homeobox protein Hox-A7, putative [Pediculus humanus corporis]", XP055134908, Database accession no. XP_002426644 *
DATABASE GENBANK [online] 5 May 2008 (2008-05-05), XP055134907, Database accession no. ACC97479.1 *
DEROSSI D. ET AL.: "The third helix of the Antennapedia homeodamain translocates through membranes", J.BIOL. CHEM., vol. 269, 1994, pages 10444 - 10450
KHARCHENKO V.P. ET AL.: "Ispolzovanie tekhnologii intarnalizuemykh peptidov dlya sozdaniya novykh protivoopukholevykh preparatov", VESTNIK RNTSRR MZ RF N3, M., 2004, pages 1 - 4, XP008171977, Retrieved from the Internet <URL:http://vestnik.rncrr.ru> [retrieved on 20111202] *
KULINICH T.M.: "Issledovanie antiproliferativnoi aktivnosti intarnalizuemykh peptidov, soderzhaschikh fragmenty ingibitorov tsiklinovykh kinaz p161 NK4a i p21 CIP/KIP", DISSERTATSIYA NA SOISKANIE UCHENOI STEPENI KAND. MED. NAUK, M., 2006, pages 123, XP008171643, Retrieved from the Internet <URL:http://www.dissercat.com/images/1> [retrieved on 20111202] *
MITSUNO MAYUMI ET AL.: "Aberrant methylation of p 16 predicts candidates for 5-fluorouracil- based adjuvant therapy in gastric cancer patients", J. GASTROENTEROL, vol. 42, 2007, pages 866 - 873, XP019564791 *
MORRIS MC ET AL.: "A peptides carrier for the delivery of biologically active proteins in mammalian cells", NAT. BIOTECHNOLOGY, vol. 19, 2001, pages 1173 - 1176

Also Published As

Publication number Publication date
EA017179B1 (ru) 2012-10-30
EA201100464A1 (ru) 2012-10-30
JP5852731B2 (ja) 2016-02-03
JP2014510135A (ja) 2014-04-24
EP2712621A4 (en) 2014-10-29
US20140051644A1 (en) 2014-02-20
EP2712621A1 (en) 2014-04-02
US20150174191A1 (en) 2015-06-25
EP2712621B1 (en) 2018-08-08
US8969515B2 (en) 2015-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. AT-533, a novel Hsp90 inhibitor, inhibits breast cancer growth and HIF-1α/VEGF/VEGFR-2-mediated angiogenesis in vitro and in vivo
Kim et al. Tumor-suppressive effect of a telomerase-derived peptide by inhibiting hypoxia-induced HIF-1α-VEGF signaling axis
Lindström et al. Characterization of gamma-tubulin filaments in mammalian cells
CN112533640A (zh) 利用基于蜂毒肽的细胞凋亡诱导肽的m2型肿瘤相关巨噬细胞的靶向
CN108883147A (zh) 用于治疗异常Wnt信号传送的稳定化BCL9肽
CN106794216A (zh) 阻断异粘蛋白‑snd1相互作用的肽作为癌症治疗的用途
CN111303300A (zh) 一种降解crept多肽抑制剂及其在抑制胰腺癌细胞增殖与肿瘤发生过程中的应用
Pia Pescarolo et al. A retro‐inverso peptide homologous to helix 1 of c‐Myc is a potent and specific inhibitor of proliferation in different cellular systems
CN107602670B (zh) 一种可拮抗ewsr1蛋白rna结合活性的多肽eip-22及其应用
CA3175477A1 (en) Methods and compositions
RU2435783C1 (ru) Химерный пептид и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний
WO2012138246A1 (ru) Фармацевтическая композиция для лечения гиперпролиферативных заболеваний
CN114605501B (zh) 一种可拮抗fus蛋白rna结合活性的多肽fip-21及其应用
EP4233882A1 (en) Mitochondria comprising anticancer drug and use thereof
CN113521080A (zh) Cx-5461在制备phf6突变的急性髓系白血病的药物中的应用
US8906860B2 (en) Methods and compositions inhibiting tumor cell proliferation
KR101323669B1 (ko) 암세포 특이적 세포괴사 유도 및 암 소멸 효과를 나타내는 세포사 유도 융합 펩타이드
WO2014163535A1 (ru) Химерный пептид и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний
CN114605499B (zh) 一种可拮抗rbsm1蛋白rna结合活性的多肽rip-18及其应用
WO2013056255A1 (en) Methods and compositions for inhibiting tumor cell proliferation
RU2728870C2 (ru) Полипептиды для лечения онкологических заболеваний
KR20140039279A (ko) 스캐폴드-키나아제 상호작용 봉쇄제 및 암을 치료하는데 있어서의 그 사용법
Mohr KCa channels in breast cancer development, progression and response to endocrine and radiation therapy
Nachar Decreased replication potency and extended S phase, due to shortened G1 and replication origin under-licensing, are a common feature of cancer cells
US20100113557A1 (en) Method for prevention of tumor

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11863085

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14002860

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014503623

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011863085

Country of ref document: EP