WO2014163535A1 - Химерный пептид и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний - Google Patents

Химерный пептид и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний Download PDF

Info

Publication number
WO2014163535A1
WO2014163535A1 PCT/RU2014/000199 RU2014000199W WO2014163535A1 WO 2014163535 A1 WO2014163535 A1 WO 2014163535A1 RU 2014000199 W RU2014000199 W RU 2014000199W WO 2014163535 A1 WO2014163535 A1 WO 2014163535A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cancer
seq
peptide
cells
treatment
Prior art date
Application number
PCT/RU2014/000199
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Владимир Константинович БОЖЕНКО
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Метамакс"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Метамакс" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Метамакс"
Priority to EP14778337.7A priority Critical patent/EP2982682A1/en
Priority to JP2016506285A priority patent/JP2016520547A/ja
Publication of WO2014163535A1 publication Critical patent/WO2014163535A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • the present invention relates to the field of biotechnology and medicine, in particular, to new sequences of a chimeric peptide comprising a functional fragment and a transport sequence, the functional fragment comprising an amino acid sequence selected from the group SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 17, and 60% or more homologous to them; as well as to a functional peptide with antiproliferative activity, represented by an amino acid sequence selected from the group of SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 17, as well as homologous to them in 60% or more sequences.
  • the invention also relates to the use of the aforementioned chimeric peptide for the treatment of cancer, as well as to a pharmaceutical composition having antiproliferative activity and a method for treating cancer, comprising administering said chimeric peptide to a mammal in need of such treatment.
  • the objective of the invention is to develop a drug that effectively penetrates into target cells and has a high cytostatic and cytotoxic effect.
  • cyclin kinases The activity of cyclin kinases is determined by the expression level of the corresponding cyclins and activity of specific cyclin kinase inhibitors (Kastan M.V., Bartek J., 2004). There are several families of cyclin kinase inhibitors. The most studied and practically important of them are pl6INK4a, p21CIP KIP, p27 KIP1 (Lowe SW et al.,
  • cyclin kinase inhibitors were synthesized. Another possible direction for creating cyclin kinase inhibitors may be the use of functional sequences from the corresponding intracellular inhibitors (Ziegler A. et al., 2005). Protein p16 INK4a is one of the most interesting candidates for the Cdk inhibitor group (Xu D. et al., 2004; Zhang Y. et al., 2005). Protein pl6INK4a is known to inhibit cyclin-dependent kinases D and thereby the passage of the G1 phase of the cell cycle (Fu G.H. et al, 2005; Ben-Saadon R. et al., 2004).
  • peptides capable of penetrating into the cell without the participation of membrane proteins and capable of carrying out intracellular transport of protein fragments and oligonucleotides associated with them opens a new stage in the development of biology and medicine.
  • One of the effective carriers of large molecules inside cells is the pAntp peptide. Its properties are known, in particular, from the publications of Derossi D. et al .. The third helix of the Antennapedia homeodamain translocates through membranes.// J. Biol. Chem. 269 (1994) 10444-10450 and Morris MC. et al. A peptides carrier for the delivery of biologically active proteins in mammalian cells.// Nat. Biotechnology 19 (2001) 1173-1176.
  • the closest analogue of the present invention is the patent US 6569833 B1 (Cyclacel Limited, GB).
  • peptides that bind to cyclin kinases cleave and include amino acid residues 84-103 of the full-chain p16 protein and can be combined with the penetratin transport protein sequence through a disulfide bond formed between cysteine residues specifically attached to the C-terminus of the p16 and ⁇ - peptide end of the Antp peptide.
  • the disadvantage of this approach is the need for selective and multi-stage synthesis of a chimeric molecule, which complicates the scheme for obtaining the target product and increases the overall time spent on synthesis.
  • the present invention relates to the field of biotechnology and medicine.
  • the objective of the invention is the creation of a new chimeric peptide that has an increased therapeutic effect and does not require a complex and laborious scheme for its preparation.
  • the technical result of the present invention is an improved biomedical effect, objectively manifested in the pronounced cytotoxic effect of the specified chimeric peptide in comparison with other similar peptides on tumor cells of diseases such as colorectal cancer, kidney cancer, lung cancer, breast cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, uterine cancer, prostate cancer, stomach cancer, ovarian cancer, myeloma, malignant lymphoma, and fibroadenomas of the mammary gland, in addition, simplifying the scheme for producing a chimeric peptide by reducing the total number of stages.
  • the second technical result is the expansion of the arsenal of drugs for the treatment of cancer.
  • the author of the present invention unexpectedly found a pronounced synergistic effect when sharing the above chimeric peptide with existing chemotherapeutic antitumor drugs Hetoposide. taxol and 5-fluorouracil).
  • the technical result is achieved by obtaining a chimeric peptide with antiproliferative activity containing a functional fragment and a transport sequence, while the functional fragment includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17, and also 60% or more homologous to them.
  • the present invention relates to a functional peptide with antiproliferative activity, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17 as well as homologous to them by 60% or more of the sequence.
  • the present invention relates to the use of said chimeric peptide for the manufacture of a medicament for the treatment of cancer.
  • the present invention relates to a chimeric peptide comprising a functional peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4.
  • the present invention relates to a functional peptide represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4.
  • the present invention relates to a chimeric peptide that can be used to treat a malignant tumor selected from the group consisting of colorectal cancer, kidney cancer, lung cancer, breast cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, uterine cancer, prostate cancer, stomach cancer, ovarian cancer, myeloma and malignant lymphoma.
  • the chimeric peptide can be used to treat colorectal cancer.
  • said drug can be used to treat a cancer selected from the group consisting of colorectal cancer, kidney cancer, lung cancer, breast cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, uterine cancer, prostate cancer, stomach cancer, ovarian cancer, myeloma and malignant lymphoma.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition having antiproliferative activity, which comprises, as a therapeutically active substance, the above chimeric peptide or functional peptide in combination with pharmaceutically acceptable carriers.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition having antiproliferative activity, which contains two active substances, where the first active substance is the aforementioned chimeric peptide or functional peptide, and the second active substance can be a chemotherapeutic antitumor agent selected from the group including alkylating drugs, antimetabolites, plant alkaloids, antitumor antibiotics, derivatives platinum derivatives, camptothecin derivatives, altretamine, amsacrine, L-asparaginase, dacarbazine, estramustine, hydroxycarbamide, procarbazine, temozolomide, monoclonal antibodies, hormones, cytokines.
  • chemotherapeutic antitumor agent selected from the group including alkylating drugs, antimetabolites, plant alkaloids, antitumor antibiotics, derivatives platinum derivatives, camptothecin derivatives, altretamine, amsacrine, L-asparaginase, dacarbazine, estramustine
  • a chemotherapeutic antitumor agent selected from the group consisting of etoposide, taxol and 5-fluorouracil may be the second active substance.
  • the present invention relates to a method for treating an oncological disease, which comprises administering to a mammal in need of such treatment the aforementioned chimeric peptide or pharmaceutical composition or drug.
  • the cancer is selected from the group consisting of colorectal cancer, kidney cancer, lung cancer, breast cancer, bladder cancer, pancreatic cancer, uterine cancer, prostate cancer, stomach cancer and ovarian cancer.
  • chimeric peptide includes a peptide having a specific sequence for binding functional and transport fragments in a chimeric peptide molecule to any sequence of any length, including through additional amino acid residues (from 1 to 50) linking the two above fragments while the amino acid transport sequence, as an option, can be attached to the C-end of the specified functional sequence by groups X, where X is an amino acid sequence containing from 1 to 50 amino acid residues.
  • Methods for producing a chimeric peptide include both the solid-phase method, presented in documents RU2297241, 11/22/2004 and RU2435783, 09/29/2010, and the genetic engineering method, presented in documents RU2297241, 11/22/2004 and RU2435783, 09/29/2010. A study of the properties of these chimeric peptides is given in document RU2435783.
  • SERKRGRQTYTRYQTL ELEKEFHFNRYLTRRR RIEIAHALCLTE- Peptides 1-3 consist of the functional part of pl6IN 4a and the internalizable pAntp sequence and differ in the location of the functional group relative to the ⁇ -, C-ends of the molecule and in the presence of an insert for peptide 3 (obtained by genetic engineering method).
  • Peptides pl6_pAntp (1-2) differ in the location of the functional group pl6INK4a: peptide 1 - pl6INK4a is located at the C-terminus of the molecule, peptide 2 - pl6INK4a is located at the applimonymill ⁇ Canal-terminus, and the peptides were obtained by solid-phase synthesis.
  • the functional group pi 6INK4a is located at the emmeinclin ⁇ réelle-end, but there is an insert of 44 AKOs.
  • the term “functional fragment” represents any polypeptide sequence of any size or any structure or molecule to fulfill the functions claimed herein, including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, or SEQ ID NO: 3, or SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15 or SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17 as well as sequences that are 60% or more homologous to them.
  • antiproliferative activity includes the ability of cyclin kinase inhibitors or compositions including cyclin kinase inhibitors to exert a cytostatic and cytotoxic effect on malignant and benign tumor cells.
  • transport sequence includes any transport sequence. Any transport sequence can be used provided that the claimed functional sequence included in any other polypeptide sequence of any size or any other structure or molecule performs the functions specified in this document.
  • Herpes simplex virus VP22 (pAntp) peptide sequences can be used as a transport agent for transferring a cyclin kinase inhibitor into target cells, for example, RQIKIWFQNRRM WKK (SEQ ID NO: 6).
  • Tat is a transactivating protein in the AIDS virus.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may include binders, wetting agents, disintegrants, excipients, solubilizers, dispersing agents, stabilizers, suspending agents, coloring agents and flavoring agents.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may include buffering agents, preservatives, analgesics, solubilizers, isotonic agents and stabilizers.
  • a pharmaceutically acceptable carrier may include bases, excipients, lubricants and preservatives.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention can be obtained in the form of various dosage forms using the above pharmaceutically acceptable carriers. So, for example, for oral administration, the pharmaceutical composition can be obtained in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups or cachets. For drugs, administered by injection, the pharmaceutical composition can be obtained in the form of a single dosage form, such as a bottle containing drugs for repeated administration, or an ampoule for the introduction of a single dose.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in the form of solutions, suspensions, tablets, capsules and sustained release preparations.
  • examples of carriers, excipients and diluents suitable for the manufacture of pharmaceutical preparations are lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum arabic, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oils.
  • pharmaceutical preparations may include fillers, anticoagulants, lubricants, moisturizers, perfumes, emulsifiers and antiseptics.
  • the dose of a drug of the present invention used as a carrier can be determined depending on several factors, including, the type of disease being treated, route of administration, age, gender and weight of the patient, severity of the disease of the patient, and type of drug used as an active ingredient.
  • alkylating agents includes: 1. Alkyl sulfonates (busulfan, threosulfan).
  • Chlorethylamines (bendamustine, chlorambucil, cyclophosphamide, ifosfamide, melphalan, trophosphamide).
  • antimetabolites includes:
  • Purine antagonists cladribine, fludarabine, 6-mercaptopurine, pentostatin,
  • plant alkaloids includes:
  • Podophyllotoxins etoposide, teniposide
  • Taxanes (docetaxel, paclitaxel).
  • Vinca-alkaloids (vincristine, vinblastine, vindesine, vinorelbine).
  • antibiotics includes:
  • Anthracyclines (daunorubicin, doxorubicin, epirubicin, idarubicin, mitoxantrone). 2. Other antitumor antibiotics (bleomycin, dactinomycin, mitomycin, plicamycin).
  • platinum derivatives includes: carboplatin, cisplatin, oxaliplatin.
  • camptothecin derivatives includes: irinotecan, topotecan.
  • the term “monoclonal antibodies” includes: edercolomab, rituximab, trastuzumab.
  • hormones includes:
  • Antiestrogens tamoxifen, toremifene, droloxifene.
  • Aromatase inhibitors (formestane, anastrozole, exemestane).
  • Progestins (medroxyprogesterone acetate, megestrol acetate).
  • LH-RH agonists buserelin, goserelin, leuprolein acetate, triptorelin).
  • Estrogens (phosphestrol, polyestradiol).
  • cytokines includes:
  • Growth factors (filgrastim, lenograstim, molgramostim, erythropoietin, thrombopoietin).
  • Interferons ( ⁇ -interferons, ⁇ -interferons, ⁇ -interferons).
  • Interleukins (interleukin-2, interleukin-3, interleukin-P).
  • cancer includes both malignant and benign tumors.
  • Figure 1 Changes in the level of apoptosis (annexin-positive particles) of blood mononuclear cells when peptides D37K, F26K-1 and W26K-1 are introduced into the cell medium at various concentrations, average values.
  • the incubation time is 24 hours.
  • Figure 2 The change in the number of “live” / intact cells upon incubation of the cells of the mononuclear fraction of the blood of healthy donors with the studied peptide sequences D37K, F26K-1 and W26K-1 in different concentrations.
  • the incubation time is 24 hours.
  • FIG. 3 Change in the level of apoptosis in the culture of HCT-116 cells during incubation with the studied peptide sequences.
  • the incubation time is 24 hours.
  • FIG. 4 Change in the level of apoptosis in MCF-7 cell culture during incubation with the studied peptide sequences.
  • the incubation time is 24 hours.
  • FIG. 5 Change in the number of dead cells, including propidium iodide, culture HCT-116, incubation with the studied peptide sequences for 24 hours. Peptide concentrations 5 ⁇ m, 1 ⁇ m, 20 ⁇ m, 40 ⁇ m
  • FIG. 6 Change in the number of dead cells, including propidium iodide, MCF-7 culture, incubation with the studied peptide sequences for 24 hours.
  • Peptide concentrations are 5 ⁇ m, YumkM, 20 ⁇ m, 40 ⁇ m.
  • FIG. 9 Changes in the number of cells in S and G2 / M phases during 24-hour incubation of actively proliferating cells of the MCF-7 and HCT-1 16 lines with peptide sequences D37K, F26K-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2 concentrations of 10 and 40 ⁇ M.
  • FIG. 10 Change in cell level in the GO / Gl phase of the cell cycle in the HCT-116 culture upon incubation of a synchronized culture with the studied peptide sequences at concentrations of 40 ⁇ M.
  • FIG. 12 Change in cell level in the GO / Gl phase of the cell cycle in A549 culture upon incubation with a synchronized depleted culture medium with the studied peptide sequences at 40 ⁇ M concentrations.
  • FIG. 13 The change in the level of cells in the S-phase of the cell cycle in the A549 culture upon incubation with a synchronized depleted culture medium with the studied peptide sequences at concentrations of 40 ⁇ M.
  • FIG. 14 Differences in the S-phase level in the A549 cell culture, at incubation times of 0, 4, 6 and 8 hours with the peptide sequences F26K-1, W26K-1 and D37K at concentrations of 40 ⁇ M.
  • FIG. 15 The change in the number of cells in the GO / Gl phase of the cell cycle upon incubation of SKOV cells with the studied peptides for 24 hours.
  • Fig.16 Changes in the number of cells in the S + G2 / M phases of the cell cycle upon incubation of SKOV cells with the studied peptides for 24 hours.
  • FIG. 17 Change in the apoptosis level in SKOV cell culture during incubation with the studied peptides for 24 hours, estimated as a hypodiploid peak in DNA histograms. Peptide concentrations were 5 ⁇ M, 10 ⁇ M, 20 ⁇ M, 30 ⁇ M, 40 ⁇ M. The culture was previously synchronized in the G0 / G1 phase by the depleted culture medium.
  • FIG. 18 Changes in the level of Bcl-2 protein in HCT-116 cells during incubation with the sequences D37K, F26K-1, F26K-2, W26K-1 and W26K-2.
  • the incubation time is 24 hours.
  • peptides D37K and W26K-1 have a minimal effect, reducing the level of Bcl-2-positive cells in culture by 5% when incubated for 24 hours and a concentration of peptides of 40 ⁇ m.
  • Peptides W26K-2 and F26K-1 reduced the level of Bc1-2 more than 15%.
  • FIG. 19 Change in the level of phosphorylated pRb in the MCF-7 culture during incubation with the studied peptide sequences D37K, F26K-1, F26K-2, W26K-1 and W26K-2.
  • the incubation time is 24 hours, the concentration of peptides: A - 10 ⁇ M, B - 40 ⁇ M.
  • FIG. 20 Change in the level of "underphosphorylated" pRb in the cell culture of HCT-1 16 during incubation with the studied peptide sequences.
  • A concentration of peptides 10 ⁇ M;
  • B concentration of peptides — 40 ⁇ M.
  • FIG. 21 Change in the level of "underphosphorylated" pRb in SKOV cell culture upon incubation with the studied peptide sequences.
  • A peptide concentration of 10 ⁇ M
  • B peptide concentration of 40 ⁇ M.
  • FIG. 22 Dependence of the number of dead cells of the HCT-1 16 line on the concentration of drugs (Etoposide, Taxol). The cytotoxic effect was recorded using the MTT test. The incubation time was 24 hours, drugs in concentrations of 1, 10 and 30 ⁇ m.
  • FIG. 23 Dependence of the number of dead cells of the HCT-116 line on the concentration of internalizable sequences (F26K-1, D37K). The cytotoxic effect was recorded using the MTT test. The incubation time was 24 hours, sequences in concentrations of 1, 10 and 30 ⁇ M. The cytotoxic effect was higher for the F26K-1 peptide; there is a concentration dependence.
  • FIG. 24 The combined effect on the NST-116 cells of the D37K and LP sequences (Taxol, Etoposide), concentrations of 1, 10 and 30 ⁇ M, incubation time 24 hours.
  • FIG. 25 The combined effect on the culture of HCT-1 16 sequences F26 -1 at concentrations of 1, 10 and 30 ⁇ m and etoposide in the same concentrations. Incubation time 24 hours, analysis - MTT test.
  • FIG. 26 The combined effect on the culture of HCT-1 16 sequences F26 -1 at concentrations of 1, 10 and 30 ⁇ m and Taxol in the same concentrations. Incubation time 24 hours, analysis - MTT test.
  • FIG. 27 The study of the combined effects of Taxol and sequences D37K (A) and F26K-2 (B) on the culture of MCF-7. Concentrations of drugs 10, 20, 30 ⁇ m, incubation time 24 hours.
  • FIG. 28 Investigation of the combined effects of 5-fluorouracil and the D37K (A) and F26K.-2 (B) sequences on the MCF-7 culture. Concentrations of drugs 10, 20, 30 ⁇ m, incubation time 24 hours.
  • FIG. 29 Change in apoptosis level in H460 culture during incubation of cells with peptide sequences (A) and the combined effect of etoposide and sequences (B). Incubation time 24 hours, PI staining, fixed samples.
  • FIG. 30 Change in the level of apoptosis in the H460 culture during incubation of cells with peptide sequences (A) and the combined effect of etoposide and sequences (B). Incubation time 24 hours, AnnexinV-PI stain.
  • FIG. 31 Change in the level of apoptosis in the H460 culture upon incubation of cells with peptide sequences upon preliminary incubation with etoposide at a concentration of 10 ⁇ M. Peptide incubation time 24 hours, AnnexinV-PI stain.
  • FIG. 32 Change in the level of apoptosis in the H460 culture upon incubation of cells with peptide sequences upon preliminary incubation with etoposide at a concentration of 10 ⁇ M.
  • the incubation time with peptides is 24 hours, PI staining with preliminary fixation of samples.
  • FIG. 33 The distribution of pAntp_ l6 protein in A549 cells over time. 1, 15 and 30 minutes after the addition of protein. Laser scanning microscope Leika.
  • Fig. 34 Changes in the tumor volume of transplanted cells in athymic mice when the chimeric internalized peptide Antp_pl6 was introduced into the tumor.
  • the mice were transplanted with A549 cell culture and the Antp_pl6 peptide was administered at doses of 0.1 and 0.2 mg.
  • Fig. 35 Changes in the tumor volume of transplanted cells in athymic mice with the introduction of the chimeric internalized peptide Antp_l6 into the tumor.
  • the mice had perivitis of HCT-116 cells, the peptide was administered at a dose of 0.1 mg.
  • FIG. 36 Photographs of experimental animals at the time of 7 injection of the studied internalizable peptide P16_Antp.
  • a and B are photographs of mice with transplanted A549 cells, A is a mouse from the control group on day 1 of the experiment, the tumor has a size of 6.0x7.0 mm.
  • Figures C and D are mice with transplanted HCT-116 cells, C is a mouse from the control group on the 18th day after the inoculation of tumor cells (tumor size 1 1.5 x 13.5 mm).
  • Fig. 37 Two-parameter cytogram of breast cells.
  • the X axis shows PI staining
  • the Y axis shows cytokeratin stain.
  • Region - “cytokeratin-positive apoptosis” is indicated by an arrow.
  • Example 1 The study of the effect of peptide sequences D37K, F26K-1, W26K-1 on non-fissile peripheral blood mononuclear cells
  • the studied peptides were added to the cell suspension at concentrations of 10, 20, 30, 40, 50, and 60 ⁇ M; the peptides were dissolved in PBS. Incubation was 24 hours at 37 ° C and 5% C0 2 in RPMI culture medium (10% PBS).
  • Example 2 The study of cytotoxic activity on proliferating cell lines
  • cell cultures were plated in 24-well plates in an amount of 1 * 10 4 cells per well, incubated for 48 hours at 37 ° C and 5% C0 2 , DMEM medium (PanEco, Russia) containing glutamine, gentamicin, 10% FBS. After this incubation, cell cultures formed a loose monolayer.
  • DMEM medium PanEco, Russia
  • the culture medium was replaced by a medium containing the studied peptides in concentrations of 5 ⁇ m, YumkM, 20 ⁇ m, 40 ⁇ m; in control samples, the medium contained 20 ⁇ l DMSO to determine the effect of the solvent (peptides were dissolved in DMSO).
  • the incubation time is 24 hours.
  • the cells were carefully removed from the substrate using trypsin (the cells in the wells with peptides attached more strongly than the control samples), washed from the medium by centrifugation at 3000 vol. within 7 minutes, the supernatant was removed and annexation V / PI double label stained.
  • the analysis was carried out on a flow cytometer, the number of cells including Annexia V — apoptosis, the number of cells including propidium iodide — dead cells, and the number of intact cells — living cells were estimated.
  • the number of dead cells also increases when peptides are introduced into the culture medium and has a concentration dependence ( Figures 5, 6).
  • the number of living cells has an inverse relationship with the concentration of peptide sequences introduced into the medium (Figs. 7, 8).
  • the values at the level of “early” apoptosis were 41.8% for the F26K-1 sequence and 45.2% for the W26K-1 sequence.
  • the level of “early” apoptosis was 37.6%.
  • the number of particles with fragmented DNA in this culture during incubation for 24 hours with sequences F26K-1 and W26K-1 was 42.6% and 44.1%, respectively.
  • the level of fragmented DNA during incubation with the D37K sequence was 31.5%; the level of fragmented DNA in the control samples for both cultures did not exceed 8%.
  • the experiments included the synchronization of cells in the G0 / G1 phase of the cell cycle using a depleted culture medium.
  • Cells in a 24-well plate were kept for 48 hours in a medium containing 0.5% PBS, after which the synchronization block was removed by replacing the medium containing 5% PBS and the studied peptides in various concentrations. They were incubated for 24 hours, and then the cells were removed from the substrate using trypsin, washed in FSB, and fixed in ethanol.
  • Figures 15, 16 show the change in the number of cells in the phases G0 / G1 and S + G2 / M, for all the studied peptides, an increase in the number of cells in the GO / Gl phase and a decrease in proliferating cells (S + G2 / M phases) with increasing peptide concentrations.
  • a slightly lower antiproliferative effect was observed in this case for the sequence W26K-2.
  • the sequences F26K-1, F26K-2, W26K-1 caused a delay in the proliferation of SKOV cell lines without significant differences.
  • the level of apoptosis correlates with the concentration of introduced peptide and increases from 17.8% in the control sample to 31.2% when incubated for 24 hours with F26K-1 peptide at a concentration of 40 ⁇ M, and up to 35, 3 % upon incubation with the W26K-2 peptide (40 ⁇ M) (Figure 17).
  • Example 5 The study of changes in the amount of phosphorylated pRb during incubation of cell cultures with peptide sequences
  • Activation of intrinsic pl6INK4a in the cell leads to inhibition of pRb phosphorylation.
  • the accumulation of underphosphorylated pRb leads to inhibition of E2F1 and a decrease in the expression of cyclins A and B, which is one of the key mechanisms in stopping the cell cycle.
  • By the amount of phosphorylated pRb one can judge the activity of p16.
  • the level of “underphosphorylated” pRb begins to increase and at a certain point (4 or 6 hours of incubation), depending on the cell line, reaches its maximum value and then begins to decrease .
  • the level of "underphosphorylated” pRb begins to increase later and reaches its maximum value after 12-18 hours of incubation, and the delay in reaching the maximum level of pRb depends on the concentration of peptide sequences.
  • the sequences with F26K-2 and W26K-2 had the greatest delay in the formation of “underphosphorylated” pRb.
  • the F26K-1 and F26K-2 sequences had the greatest delay in the formation of “underphosphorylated” pRb; for these sequences, the maximum level of “underphosphorylated” pRb, at a peptide concentration of 10 ⁇ M, was observed after 16 hours of incubation, and at a concentration of 40 ⁇ m after 20 hours.
  • the delay effect was observed to be the same in time, but the level of “underphosphorylated” pRb was lower.
  • FIG. 21 shows the change in the level of “underphosphorylated” pRb in SKOV cell culture when exposed to cells of the D37K, F26K-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2 sequences at concentrations of 10 ⁇ M (A) and 40 ⁇ m (B).
  • the studied peptide sequences D37K, F26K-1, F26K-2, W26K-1 and W26K-2 are able to induce apoptosis in actively proliferating cells and inhibit proliferation processes.
  • the sequences F26K-1 and F26K-2 have the most pronounced cytotoxic and cytostatic effects, upon incubation with which apoptosis has slightly higher values for proliferating cells, proliferation is delayed (an increase in the number of cells in the G0 / G1 phase of the cell cycle) , a decrease in the level of Bc1-2 having a concentration dependence.
  • cytotoxic and cytostatic effects are also observed, but less pronounced.
  • This method is based on the ability of mitochondrial and cytoplasmic dehydrogenases of living metabolically active cells to restore unpainted forms of 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl terrazole (MTT reagent) to a blue crystalline pharmacazane soluble in dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • MTT reagent 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyl terrazole
  • Figure 22 shows the change in the number of dead cells under the influence of drugs on cell culture.
  • the cytotoxic effect of etoposide in this concentration range and for this cell line was minimal. Taxol exerted a pronounced cytotoxic effect at a concentration of 30 ⁇ M.
  • the F26K-1 sequence induces cell death, and the dependence of the number of dead cells on the concentration of the sequence in the culture medium is observed (Figure 23).
  • MCF-7 breast cancer
  • LP 5-fluorouracil and Taxol were investigated (in cytotoxicity studies, this sequence had the most pronounced effect on the MCF-7 culture).
  • Cells were grown on 24-well plates up to 70% of the monolayer, then the medium was replaced with a medium containing the studied sequences and drugs at concentrations of 10, 20, and 30 ⁇ M. The incubation time was 24 hours.
  • the cells that entered into apoptosis were analyzed by staining with annexin-propidium iodide, by flow cytometry.
  • Figure 29A shows the change in apoptosis level in the H460 culture during incubation of cells with peptide sequences without etoposide, incubation time 24 hours, apoptosis was analyzed as a subdiploid peak.
  • Figure 29B an increase in apoptosis during cell incubation with both sequences and etoposide.
  • Figure 30 presents the same samples, but stained with the double AnnexinV-PI label, an increase in early apoptosis, annexin positive cells when exposed to peptide sequences (A) on the culture, and a summation of the effects of the peptide sequences and Etoposide (B).
  • Example 7 The study of the penetration of internalizable peptides.
  • FITC fluorescent label fluorescein-isothiocyanate
  • the most objective data on the accumulation of the peptide inside the cell were obtained using the method of scanning laser microscopy. Protein labeled with fluorescein isothiocyanate was dissolved in 0.9% NaCl. A549, 293 cell lines were grown on sterile glass slides and placed in a special chamber directly under the microscope eyepieces. The medium was replaced with the medium with the studied protein. Protein saturation was observed over time. In addition, a layer-by-layer cell scan was performed to determine the localization of the peptide.
  • Lymphocyte fluorescence was measured under the action of the pl6-pAntp-i> HTLJ protein at pH 7.5 and pH b.O.
  • the principle of the method is based on a lower quantum yield of FITC fluorescence in solutions with a more acidic pH. Since the measurement speed is fast enough, the pH inside the cell cannot change.
  • Lymphocytes were incubated with the peptide for 1-15 minutes, after which a 20-fold volume of phosphate buffer with pH 6.0 and pH 7.5 was immediately added to them. In this case, the difference in fluorescence intensity was estimated. In most measurements, the fluorescence intensities did not significantly differ after 15 minutes of incubation. Thus, it can be assumed that after 15 minutes of incubation, the peptide completely penetrates into the cell. To study the rate of accumulation of the peptide inside the cell, flow cytometry was used. For this, the FITC-labeled peptide was introduced directly into the measuring tube of a flow cytometer, which made it possible to record the dynamics of changes in cell fluorescence.
  • the peptide penetrates into tumor cells at a high speed. The time to reach maximum concentration is less than 1 min.
  • Example 8 The study of the antitumor activity of the peptide D37K in vivo (local administration)
  • nude mice In nude mice (Nude), the antitumor activity of the chimeric internalized peptide D37K was studied.
  • mice were inoculated with tumor cultures of human cells of lines A549 and HCT-1 16 in an amount of about 1 million cells per mouse.
  • A549 cells were inoculated into 39 mice, of which 20 mice made up the control group, they were subsequently given a placebo. 10 mice made up 1 experimental group. After the formation of a palpable tumor (4 days after transplantation of cells), they began to inject the studied peptide at a dose of 0.1 mg directly into the tumor.
  • mice constituted the 2nd experimental group; after the formation of the tumor node, on the 4th day of inoculation, 0.2 mg of the peptide was also introduced into the tumor bed.
  • the peptide in the experimental groups was administered once every two days. The experiment lasted 24 days.
  • mice When the mice were injected with transplantable human culture NST-116, the animals were divided into two groups: control - 10 mice, which were subsequently not administered the studied peptide and the experimental group (10 mice), which were administered the studied chimeric peptide P16_Antp at a dose of 0.1 mg in the region tumor node.
  • the experiment lasted 28 days, 11 injections of the peptide were made in the experimental group, the first injection was made on day 6 after the transplantation of tumor cells. The tumor node from HCT-116 cells was large and ulcerated.
  • the control group on the 28th day of the experiment, the average tumor volume was 679 mm 3 ; 3 mice died during the experiment.
  • a lower tumor growth rate was observed (Fig. 35), on the 28th day of the experiment, the average tumor volume was 225.4 mm 3 , there were 2 dead animals in the experimental group.
  • Example 9 The study of the cytotoxic properties of D37K in short-term cultures of human tumors The antitumor activity of D37K was investigated. 150 mg of D37K peptide were synthesized by solid-phase synthesis. To study the effects on human tumors, the short-term culture method was used.
  • Short-term cultures were obtained from operational material. The site for the preparation of culture was taken, if possible, as soon as possible after the operation and with the participation of the pathologist. A section of tissue was cut out, an average of 1.5 cm 3 . The tissue was mechanically crushed, the cell suspension was placed in RPMI medium containing 5% PBS. After 24 hours of incubation at 37 ° C and 5% C g, the medium was replaced with a medium containing a chimeric peptide (pl 6_Antp at a concentration of 40 ⁇ mol), or for a number of experiments on Taxol at a concentration of 100 nMol or 500 nMol containing both the peptide and Taxol . In control samples, the medium was replaced with fresh. The first point was shot - 0 hours.
  • Apoptosis levels were analyzed 24 and 48 hours after the addition of peptides at a concentration of 40 ⁇ M. Part of the experiments was carried out to study the combined cytotoxic effect of traditional chemotherapeutic drugs and D37K peptide on tumor cells.
  • Example 10 The study of the antitumor activity of the peptide D37K The total results on the cytotoxic activity of the peptide D37K are shown in Table 3.
  • Table 3 The average level of induced apoptosis in short-term tumor cultures when exposed to peptide D37K. (24 hours, 40 kM).
  • Example 11 A study of the cytotoxic effect on breast fibroadenoma cells.
  • the results obtained revealed a spectrum of human tumors sensitive to the D37K peptide. It was found that such localizations as breast cancer, colorectal cancer, stomach cancer, bladder cancer, and kidney cancer are promising objects for further study of the cytotoxic (antitumor) effect of the studied peptide. The results are new, because in the available literature there is no data on the study of the effect of the analyzed peptide on human tumors.

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности, к новым вариантам последовательностей химерного пептида, включающего функциональный фрагмент и транспортную последовательность, при этом функциональный фрагмент включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: I - SEQ ID NO: 17, а также гомологичным им на 60% и более последовательностям; а также к функциональному пептиду с антипролиферативной активностью, представленного аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: I - SEQ ID NO: 17, а также гомологичным им на 60% и более последовательностям. Изобретение также относится к применению вышеуказанного химерного пептида для лечения онкологических заболеваний, а также к фармацевтической композиции, обладающей антипролиферативной активностью и способу лечения онкологических заболеваний, включающему введение указанного химерного пептида нуждающемуся в таком лечении млекопитающему. Изобретение позволяет создать лекарственный препарат, эффективно проникающий в клетки-мишени и обладающий высоким цитостатическим и цитотоксическим действием в отношении опухолевых клеток.

Description

«Химерный пептид и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний»
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности, к новым последовательностям химерного пептида, включающего функциональный фрагмент и транспортную последовательность, при этом функциональный фрагмент включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 17, a также гомологичным им на 60% и более последовательностям; а также к функциональному пептиду с антипролиферативной активностью, представленному аминокислотной последовательностью, выбранной из группы SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 17, а также гомологичным им на 60% и более последовательностям.
Изобретение также относится к применению вышеуказанного химерного пептида для лечения онкологических заболеваний, а также к фармацевтической композиции, обладающей антипролиферативной активностью и способу лечения онкологических заболеваний, включающему введение указанного химерного пептида нуждающемуся в таком лечении млекопитающему. Задачей изобретения является разработка препарата, эффективно проникающего в клетки-мишени и обладающего высоким цитостатическим и цитотоксическим действием.
Уровень техники
С начала 90-х годов в России ежегодно диагностируют более 400 тысяч случаев злокачественных новообразований (Давыдов М.И., Аксель Е.М. 2008). При этом в Европе ежегодная смертность от онкологических заболеваний за период с 1985 г. по 2002 г. продолжает расти. В структуре причин смертности онкологические заболевания занимают 2-ое место после заболеваний сердечно-сосудистой системы. Поэтому поиск новых лекарственных противоопухолевых препаратов является одной из актуальных задач современной биологии и медицины.
В настоящее время большое количество работ посвящено созданию новых лекарственных противоопухолевых препаратов на основании достижений молекулярной биологии (Richard J.P. et al., 2003; Takeshima К. et al, 2003; Jyotika A. et al., 2005, Копнин Б.П., 2000). Общепринято, что основополагающим признаком неопластической клетки является нарушение регуляции клеточного цикла и апоптоза (Chappuis P.O., Kapusta L., 2005). Известно, что регуляция процессов пролиферации клетки контролируется путем последовательной активации циклинов и соответствующих циклин-зависимых киназ (CDK). Активность циклиновых киназ определяется уровнем экспрессии соответствующих циклинов и активностью специфических ингибиторов циклиновых киназ (Kastan М.В., Bartek J., 2004). Имеется несколько семейств ингибиторов циклиновых киназ. Наиболее изученными и практически важными из них являются - pl6INK4a, p21CIP KIP, р27 KIP1 (Lowe S.W. et al.,
2004) . Мутации или гиперметилирование промоторов генов ингибиторов циклиновых киназах наблюдаются в 40-60% случаев злокачественных лимфом, раке поджелудочной железы и ряде других злокачественных новообразований (Sawyers С, 2004; Ortega S. и др., 2002).
Основываясь на этих результатах был синтезирован ряд низкомолекулярных ингибиторов циклиновых киназ. Другим, возможным направлением, для создания ингибиторов циклиновых киназ может быть использование функциональных последовательностей из соответствующих внутриклеточных ингибиторов (Ziegler A. et al., 2005). Белок р16 INK4a является одним из наиболее интересных кандидатов группы ингибиторов Cdk (Xu D. et al., 2004; Zhang Y. et al., 2005). Известно, что белок pl6INK4a ингибирует циклин-зависимые киназы D и тем самым прохождение G1 фазы клеточного цикла (Fu G.H. et al, 2005; Ben-Saadon R. et al., 2004). Показано, что его функция нарушена при широком спектре онкологических заболеваний (Li J.Q. et al, 2004). В последнее время стали появляться экспериментальные работы, описывающие применение гена pl6INK4a для генной терапии опухолей различного генеза (Lee A.W.C.,Li J-H et. al. 2003; Liu S.X., Tang S.Q., Liang C.Y., 2003; Zhang Y., Liu J. et al.
2005) . Дополнительным мотивом к поиску технологий применения естественных белковых ингибиторов пролиферации стало открытие коротких последовательностей аминокислот (п=15- 30), способных выполнять векторные (транспортные) функции в отношении пептидных последовательностей и соединений другой химической природы (РНК, ДНК) (Fawell S., Seery J. et al., 1994; Vives E., Brodin P., Lebleu B. 1997; Kaplan I.M. et al., 2005; Gupta B. et al., 2005; Fernandez-Carneado J. et al., 2005).
До настоящего времени проблему восстановления нарушенной функции внутриклеточных белков пытались решать на основе методов доставки гена (генная терапия) (Георгиев Г.П. 2000; Wender Р.А. et al., 2000; Барышников А.Ю. 2004). Однако эта технология до настоящего времени не получила широкого выхода в клиническую практику из-за ряда принципиальных проблем.
Альтернативный способ решения этой задачи, основанный на технологии пептидных векторов, обладающих способностью проникать в клетки, не повреждая плазматическую мембрану, является весьма перспективным ввиду слабой иммуногенности таких соединений и способности переносить достаточно крупные молекулы.
Соединение возможности целевой доставки пептидов в клетку и обнаружение коротких функциональных доменов в белках регуляторах различных клеточных функций создали предпосылки для конструирования молекул имеющих патогенетическую направленность (Schutze-Redelmeier М.Р. и др., 2004; Trehin R., Merkle Н.Р., 2004; Cong-Mei Wu и др., 2004). Относительная простота синтеза таких молекул позволяет говорить о принципиальной возможности создания индивидуальных химиопрепаратов на их основе, т.е. влияющих на патологические изменения свойственных данной конкретной опухоли (Регеа S.E. и др., 2004).
Открытие пептидов, способных проникать в клетку без участия мембранных белков и способных осуществлять внутриклеточный транспорт связанных с ними белковых фрагментов и олигонуклеотидов открывает новый этап в развитии биологии и медицины. Одним из эффективных переносчиков крупных молекул внутрь клеток является пептид pAntp. Его свойства известны, в частности, из публикаций Derossi D. et al.. The third helix of the Antennapedia homeodamain translocates through membranes.// J.Biol. Chem. 269 (1994) 10444- 10450 и Morris MC. et al. A peptides carrier for the delivery of biologically active proteins in mammalian cells.// Nat. Biotechnology. 19 (2001) 1173-1176.
По мнению автора, наиболее близким аналогом настоящего изобретения является патент US 6569833 В1 (Cyclacel Limited, GB). В этом документе раскрьшаются пептиды, которые связываются с циклиновыми киназами и включают аминокислотные остатки 84-103 полноцепочечного белка р16 и могут быть объединены с последовательностью транспортного белка пенетратина посредством дисульфидной связи, образующейся между остатками цистеина, специально присоединенными к С-концу пептида р16 и Ν-концу пептида Antp. Недостатком данного подхода является необходимость избирательного и многоступенчатого синтеза химерной молекулы, что усложняет схему получения целевого продукта и увеличивает общие временные затраты на синтез.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины.
Задачей изобретения является создание нового химерного пептида, обладающего повышенным терапевтическим действием и не требующего сложной и трудоемкой схемы его получения.
Техническим результатом настоящего изобретения является улучшенный медико- биологический эффект, объективно проявляющийся в выраженном цитотоксическом действии указанного химерного пептида в сравнении с другими аналогичными пептидами на опухолевые клетки таких заболеваний, как колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка рак яичника, миеломы, злокачественной лимфомы, а также фиброаденомы молочной железы, кроме того упрощение схемы получения химерного пептида за счет уменьшения общего количества стадий. Вторым техническим результатом является расширение арсенала лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний. Кроме того, автор настоящего изобретения неожиданно обнаружил выраженный синергетический эффект при совместном использовании вышеуказанного химерного пептида с уже существующими химиотерапевтическими противоопухолевыми препаратами Гэтопозид. таксол и 5-фторурацил).
Технический результат достигается благодаря получению химерного пептида с антипролиферативной активностью, содержащего функциональный фрагмент и транспортную последовательность, при этом функциональный фрагмент включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 17, а также гомологичные им на 60% и более последовательности.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к функциональному пептиду с антипролиферативной активностью, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 17 а также гомологичные им на 60% и более последовательности.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению указанного химерного пептида для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения онкологических заболеваний.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящее изобретение относится к химерному пептиду, включающему функциональный пептид, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или SEQ ID NO: 4.
В другом из предпочтительных вариантов осуществления настоящее изобретение относится к функциональному пептиду, представленному аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или SEQ ID NO: 4.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящее изобретение относится к химерному пептиду, который может быть использован для лечения злокачественной опухоли, выбранной из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелома и злокачественная лимфома.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления химерный пептид может быть использован для лечения колоректального рака.
В предпочтительном варианте осуществления указанное лекарственное средство может применяться для лечения злокачественной опухоли, выбранной из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелома и злокачественная лимфома.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, обладающей антипролиферативной активностью, которая включает в качестве терапевтически активного вещества вышеуказанный химерный пептид или функциональный пептид в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, обладающей антипролиферативной активностью, которая содержит два активных вещества, где первым активным веществом является вышеуказанный химерный пептид или функциональный пептид, а в качестве второго активного вещества может выступать химиотерапевтическое противоопухолевое средство, выбранное из группы, включающей алкилирующие препараты, антиметаболиты, алкалоиды растительного происхождения, противоопухолевые антибиотики, производные платины, производные камптотецина, альтретамин, амсакрин, L-аспарагиназу, дакарбазин, эстрамустин, гидроксикарбамид, прокарбазин, темозоломид, моноклональные антитела, гормоны, цитокины.
В предпочтительном варианте осуществления в указанной фармацевтической композиции, обладающей антипролиферативной активностью, в качестве второго активного вещества может выступать химиотерапевтическое противоопухолевое средство, выбранное из группы, включающей этопозид, таксол и 5-фторурацил.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения онкологического заболевания, который включает введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, вышеуказанного химерного пептида или фармацевтической композиции, или лекарственного препарата. В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного способа, онкологическое заболевание выбрано из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка и рак яичника.
Используемый в настоящем документе термин «химерный пептид» включает в себя пептид имеющий определенную последовательность связывания функционального и транспортного фрагментов в химерной пептидной молекуле любой последовательностью любой длины, в том числе посредством дополнительных аминокислотных остатков (от 1 до 50), связывающих между собой два вышеуказанных фрагмента, при этом транспортная аминокислотная последовательность, как вариант, может быть присоединена к С-концу указанной функциональной последовательности посредством группы X, где X представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую от 1 до 50 аминокислотных остатков. Методы получения химерного пептида включают в себя как твердофазный метод, представлен в документах RU2297241, 22.11.2004 и RU2435783, 29.09.2010, так и генно-инженерный метод, представлен в документах RU2297241, 22.11.2004 и RU2435783, 29.09.2010. Исследование свойств данных химерных пептидов приведены в документе RU2435783.
Структура исследуемых интернализируемых пептидов. pAntp pl 6I K4a
1.
pl6_pAntp(l)
RQI IWFQNRRMKWKK DAAREGFLDTLVVLHRAGAR
ΝΗ2 · - COOH
2. pl 6I K4a pAntp pl6_pAntp(2) r
NH2 - DAAREGFLDTLVVLHRAGAR-S- RQIKIWFQNRRM WKK ■COOH pl6IN 4a pAntp pl6_pAntp(3) ft ^
NH2 - RGS-DAAREGFLDTLVVLHRAGAR r RQIKIWFQNRRMKWKK - COOH
SERKRGRQTYTRYQTL ELEKEFHFNRYLTRRR RIEIAHALCLTE- Пептиды 1-3 состоят из функциональной части pl6IN 4a и интернализуемой последовательности pAntp и отличаются по местоположению функциональной группы относительно Ν-, С- концов молекулы и по наличию вставки для пептида 3 (получен генноинженерным методом).
Пептиды pl6_pAntp (1-2) отличаются местоположением функциональной группы pl6INK4a: пептид 1 - pl6INK4a расположен на С-конце молекулы, пептид 2 - pl6IN 4a расположен на Ν-конце, пептиды получены методом твердофазного синтеза. В случае химерного пептида pl6_pAntp(3), полученного генноинженерным методом, функциональная группа pi 6INK4a располагается на Ν-конце, но имеется вставка из 44 АКО.
Используемый в настоящем документе термин «функциональный фрагмент» представляет любую полипептидную последовательность любого размера или любую структуру или молекулу для выполнения функций заявленных в данном документе, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13 или SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO: 16 или SEQ ID NO: 17 а также гомологичные им на 60% и более последовательности.
Используемый в настоящем документе термин «антипролиферативная активность» включает в себя способность ингибиторов циклиновых киназ или композиций, включающих ингибиторы циклиновых киназ, оказывать цитостатический и цитотоксический эффект на клетки злокачественной и доброкачественной опухоли.
Используемый в настоящем документе термин «транспортная последовательность» включает в себя любую транспортную последовательность. Любая транспортная последовательность может быть использована при условии, что заявленная функциональная последовательность, включенная в любую другую полипептидную последовательность любого размера или любую другую структуру или молекулу, выполняет функции, указанные в настоящем документе. Может быть использована, в том числе, и последовательности пептида VP22 (pAntp) вируса простого герпеса в качестве транспортного агента для переноса ингибитора циклиновых киназ внутрь целевых клеток, например, RQIKIWFQNRRM WKK (SEQ ID NO: 6). А также последовательности пептида Tat. Tat - белок, выполняющий трансактиваторную функцию у вируса СПИДа.
Используемый в настоящем документе термин «фармацевтическая композиция» включает в себя композицию, содержащую химерный пептид или функциональный пептид, а также может включать фармацевтически приемлемый носитель. Для перорального введения, фармацевтически приемлемый носитель может включать связующие вещества, смачивающие агенты, дезинтеграторы, наполнители, солюбилизаторы, диспергирующие агенты, стабилизаторы, суспендирующие агенты, красители и ароматизаторы. Для инъецируемых препаратов, фармацевтически приемлемый носитель может включать буферные агенты, консерванты, аналгетики, солюбилизаторы, изотонические агенты и стабилизаторы. Для препаратов местного применения, фармацевтически приемлемый носитель может включать основания, наполнители, замасливатели и консерванты. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть получены в виде различных лекарственных форм с использованием вышеуказанных фармацевтически приемлемых носителей. Так, например, для перорального введения, фармацевтическая композиция может быть получена в виде таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов или облаток. Для препаратов, вводимых инъекцией, фармацевтическая композиция может быть получена в виде разовой лекарственной формы, такой как флакон, содержащий лекарственные средства для многократного приема, или ампула для введения одной дозы. Фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде растворов, суспензий, таблеток, капсул и препаратов пролонгированного действия.
С другой стороны, примерами носителей, наполнителей и разбавителей, подходящих для приготовления фармацевтических препаратов, являются лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, ксилит, эритритол, мальтит, крахмал, аравийская камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлоза, метилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, вода, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральные масла. Кроме того, фармацевтические препараты могут включать наполнители, антикоагулянты, замасливатели, увлажнители, отдушки, эмульгаторы и антисептики.
В основном, доза лекарственного средства настоящего изобретения, используемым в качестве носителя, может быть определена в зависимости от нескольких факторов, включая, тип заболевания, подвергаемого лечению, способ введения, возраст, пол и вес пациента, тяжесть заболевания пациента, а также тип лекарственного средства, используемого в качестве активного компонента.
Используемый в настоящем документе термин «алкилирующие препараты» включает в себя: 1.Алкилсульфонаты (бусульфан, треосульфан).
2. Этиленимины (тиотепа).
3. Производные нитрозомочевины (кармустин, ломустин, мюстофоран, нимустин, стрептозотоцин).
4. Хлорэтиламины (бендамустин, хлорамбуцил, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан, трофосфамид).
Используемый в настоящем документе термин «антиметаболиты» включает в себя:
1. Антагонисты фолиевой кислоты (метотрексат, ралитрексед).
2. Антагонисты пурина (кладрибин, флударабин, 6-меркаптопурин, пентостатин,
тиогуанин).
3. Антагонисты пиримидина (цитарабин, 5-фторурацил, капецитабин, гемцитабин).
Используемый в настоящем документе термин «алкалоиды растительного происхождения» включает в себя:
1. Подофиллотоксины (этопозид, тенипозид).
2. Таксаны (доцетаксел, паклитаксел).
3. Винка-алкалоиды (винкристин, винбластин, виндезин, винорельбин).
Используемый в настоящем документе термин «противоопухолевые антибиотики» включает в себя:
1.Антрациклины (даунорубицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, митоксантрон). 2. Другие противоопухолевые антибиотики (блеомицин, дактиномицин, митомицин, пликамицин).
Используемый в настоящем документе термин «производные платины» включает в себя: карбоплатину, цисплатину, оксалиплатину.
Используемый в настоящем документе термин «производные камптотецина» включает в себя: иринотекан, топотекан.
Используемый в настоящем документе термин «моноклональные антитела» включает в себя: эдерколомаб, ритуксимаб, трастузумаб.
Используемый в настоящем документе термин «гормоны» включает в себя:
1.Антиандрогены (бикалутамид, ципротерона ацетат, флутамид).
2. Антиэстрогены (тамоксифен, торемифен, дролоксифен).
3. Ингибиторы ароматазы (форместан, анастрозол, экземестан).
4. Прогестины (медроксипрогестерона ацетат, мегестрола ацетат). 5. Агонисты LH-RH (бусерелин, госерелин, лейпролеина ацетат, трипторелин).
6. Эстрогены (фосфэстрол, полиэстрадиол).
Используемый в настоящем документе термин «цитокины» включает в себя:
1. Факторы роста (филграстим, ленограстим, молграмостим, эритропоэтин, тромбопоэтин).
2. Интерфероны (а-интерфероны, р-интерфероны, у-интерфероны).
3. Интерлейкины (интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-П).
Используемый в настоящем документе термин «онкологическое заболевание» включает в себя как злокачественные, так и доброкачественные опухоли.
Краткое описание чертежей
Фиг.1. Изменение уровня апоптоза (Аннексин-положительных частиц) мононуклеаров крови при внесении в клеточную среду пептидов Д37К, F26K-1 и W26K-1 в различных концентрациях, средние значения. Время инкубации 24 часа.
Фиг.2. Изменение количества «живы »/интактных клеток при инкубации клеток мононуклеарной фракции крови здоровых доноров с исследуемыми пептидными последовательностями Д37К, F26K-1 и W26K-1 в разных концентрациях. Время инкубации 24 часа.
Фиг. 3. Изменение уровня апоптоза в культуре клеток НСТ-116 при инкубации с исследуемыми пептидными последовательностями. Время инкубации 24 часа.
Фиг. 4. Изменение уровня апоптоза в культуре клеток MCF-7 при инкубации с исследуемыми пептидными последовательностями. Время инкубации 24 часа.
Фиг. 5. Изменение количества погибших клеток, включающих йодистый пропидий, культура НСТ-116, инкубация с исследуемыми пептидными последовательностями 24 часа. Концентрации пептидов 5мкМ, 1 ОмкМ, 20мкМ, 40мкМ
Фиг. 6. Изменение количества погибших клеток, включающих йодистый пропидий, культура MCF-7, инкубация с исследуемыми пептидными последовательностями 24 часа. Концентрации пептидов 5мкМ, ЮмкМ, 20мкМ, 40мкМ.
Фиг.7. Изменение относительного количества живых клеток в культуре НСТ-116 при инкубации с исследуемыми пептидными последовательностями 24 часа. За 100% принято количество живых клеток в контрольном образце (20мкл ДМСО), концентрации исследуемых пептидов составляли 5мкМ, ЮмкМ, 20мкМ, 40мкМ. Фиг.8. Изменение количества живых клеток в культуре MCF-7 при инкубации с исследуемыми пептидными последовательностями 24 часа. Концентрации исследуемых пептидов составляли 5мкМ, ЮмкМ, 20мкМ, 40мкМ.
Фиг. 9. Изменение количества клеток в фазах S и G2/M при 24-часовой инкубации активно пролиферирующих клеток линий MCF-7 и НСТ-1 16 с пептидными последовательностями Д37К, F26K-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2 в концентрациях 10 и 40 мкМ.
Фиг. 10. Изменение уровня клеток в GO/Gl-фазе клеточного цикла в культуре НСТ-116 при инкубации синхронизованной культуры с исследуемыми пептидными последовательностями в концентрациях 40 мкМ.
Фиг.11. Изменение уровня клеток в GO/Gl-фазе клеточного цикла в культуре MCF-7 при инкубации синхронизованной обедненной средой культуры с исследуемыми пептидными последовательностями в концентрациях 40 мкМ.
Фиг. 12. Изменение уровня клеток в GO/Gl-фазе клеточного цикла в культуре А549 при инкубации синхронизованной обедненной средой культуры с исследуемыми пептидными последовательностями в концентрациях 40 мкМ.
Фиг. 13. Изменение уровня клеток в S-фазе клеточного цикла в культуре А549 при инкубации синхронизованной обедненной средой культуры с исследуемыми пептидными последовательностями в концентрациях 40 мкМ.
Фиг. 14. Различия в уровне S-фазы в культуре клеток А549, при времени инкубации 0, 4, 6 и 8 часов с пептидными последовательностями F26K-1, W26K-1 и Д37К в концентрациях 40 мкМ.
Фиг. 15. Изменение количества клеток в GO/Gl-фазе клеточного цикла при инкубации клеток линии SKOV с исследуемыми пептидами в течении 24 часов.
Фиг.16. Изменение количества клеток в S+G2/M -фазах клеточного цикла при инкубации клеток линии SKOV с исследуемыми пептидами в течении 24 часов.
Фиг. 17. Изменение уровня апоптоза в культуре клеток SKOV при инкубации с исследуемыми пептидами 24 часа, оцененный как гиподиплоидный пик на ДНК-гистограммах. Концентрации пептидов составляли 5 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 30 мкМ, 40 мкМ. Культура была предварительно синхронизована в G0/G1 - фазе методом обедненной культуральной среды.
Фиг. 18. Изменение уровня белка Вс1-2 в клетках линии НСТ-116 при инкубации с последовательностями Д37К, F26K-1, F26K-2, W26K-1 и W26K-2. Время инкубации 24 часа. При исследовании изменения уровня Вс1-2 было получено, что пептиды Д37К и W26K-1 оказывают минимальный эффект, снижая уровень Bcl-2-положительных клеток в культуре на 5% при инкубации 24 часа и концентрации пептидов 40 мкМ. Пептиды W26K-2 и F26K-1 снижали уровень Вс1-2 более 15%.
Фиг. 19. Изменение уровня фосфорилированного pRb в культуре MCF-7 при инкубации с исследуемыми пептидными последовательностями Д37К, F26K-1, F26K-2, W26K-1 и W26K-2. Время инкубации 24 часа, концентрация пептидов: А - 10 мкМ, В - 40 мкМ.
Фиг. 20. Изменение уровня «недофосфорилированного» pRb в культуре клеток НСТ-1 16 при инкубации с исследуемыми пептидными последовательностями. А - концентрация пептидов 10 мкМ, В - концентрация пептидов— 40 мкМ.
Фиг. 21. Изменение уровня «недофосфорилированного» pRb в культуре клеток SKOV при инкубации с исследуемыми пептидными последовательностями. А - концентрация пептидов 10 мкМ, В - концентрация пептидов - 40 мкМ.
Фиг. 22. Зависимость количества мертвых клеток линии НСТ-1 16 от концентрации лекарственных препаратов (Этопозид, Таксол). Цитотоксический эффект регистрировался с помощью МТТ-теста. Время инкубации составило 24 часа, лекарственные препараты в концентрациях 1, 10 и 30 мкМ.
Фиг. 23. Зависимость количества мертвых клеток линии НСТ-116 от концентрации интернализуемых последовательностей (F26K-1, Д37К). Цитотоксический эффект регистрировался с помощью МТТ-теста. Время инкубации составило 24 часа, последовательности в концентрациях 1, 10 и 30 мкМ. Цитотоксический эффект оказался выше для пептида F26K-1, имеется концентрационная зависимость.
Фиг. 24. Сочетанное воздействие на клетки НСТ-116 последовательности Д37К и ЛП (Таксол, Этопозид), концентрации 1, 10 и 30 мкМ, время инкубации 24 часа.
Фиг. 25. Сочетанное воздействие на культуру НСТ-1 16 последовательности F26 -1 в концентрациях 1, 10 и 30 мкМ и Этопозида в тех же концентрациях. Время инкубации 24 часа, анализ - МТТ-тест.
Фиг. 26. Сочетанное воздействие на культуру НСТ-1 16 последовательности F26 -1 в концентрациях 1, 10 и 30 мкМ и Таксола в тех же концентрациях. Время инкубации 24 часа, анализ - МТТ-тест.
Фиг. 27. Исследование сочетанного воздействия Таксола и последовательностей Д37К (А) и F26K-2 (В) на культуре MCF-7. Концентрации препаратов 10, 20, 30 мкМ, время инкубации 24 часа.
Фиг. 28. Исследование сочетанного воздействия 5-фторурацила и последовательностей Д37К (А) и F26K.-2 (В) на культуре MCF-7. Концентрации препаратов 10, 20, 30 мкМ, время инкубации 24 часа. Фиг. 29. Изменение уровня апоптоза в культуре Н460 при инкубации клеток с пептидными последовательностями (А) и сочетанный эффект этопозида и последовательностей (В). Время инкубации 24 часа, окраска PI, фиксированные образцы.
Фиг. 30. Изменение уровня апоптоза в культуре Н460 при инкубации клеток с пептидными последовательностями (А) и сочетанный эффект этопозида и последовательностей (В). Время инкубации 24 часа, окраска AnnexinV-PI.
Фиг. 31. Изменение уровня апоптоза в культуре Н460 при инкубации клеток с пептидными последовательностями при предварительной инкубации с этопозидом в концентрации 10 мкМ. Время инкубации с пептидами 24 часа, окраска AnnexinV-PI.
Фиг. 32. Изменение уровня апоптоза в культуре Н460 при инкубации клеток с пептидными последовательностями при предварительной инкубации с этопозидом в концентрации 10 мкМ. Время инкубации с пептидами 24 часа, окраска PI с предварительной фиксацией образцов.
Фиг. 33. Распределение белка pAntp_ l6 в клетках А549 во времени. Через 1, 15 и 30 минут после добавления белка. Лазерный сканирующий микроскоп Leika.
Рис.34. Изменение объема опухоли перевитых клеток у бестимусных мышей при введении в опухоль химерного интернализуемого пептида Antp_pl6. Мышам перививали культуру клеток А549 и вводили пептид Antp_pl6 в дозах 0,1 и 0,2 мг.
Рис.35. Изменение объема опухоли перевитых клеток у бестимусных мышей при введении в опухоль химерного интернализуемого пептида Antp_ l6. Мышам были перивиты клетки НСТ-116, пептид вводился в дозе 0,1 мг.
Рис.36. Фотографии экспериментальных животных на момент 7 инъекции исследуемого интернализуемого пептида P16_Antp. А и В - фотографии мышей с перевитыми клетками А549, А - мышь из контрольной группы на 1 б день эксперимента, опухоль имеет размер 6,0x7,0 мм. В - мышь из опытной группы на 16 день эксперимента при введении P16_Antp в дозе 0,1 мг, опухоль размером 3,0x3,0 мм. Фигуры С и D - мыши с перевитыми клетками НСТ-116, С - мышь из контрольной группы на 18 день после перевивки опухолевых клеток (опухоль размером 1 1,5x13,5 мм). D - мышь из опытной группы после 7 инъекций P16_Antp в дозе 0,1 мг, опухоль размером 4,5x4,5 мм.
Рис.37. Двухпараметрическая цитограмма клеток молочной железы. По оси X - окраска PI, по оси Y- окраска цитокератином. Регион - «цитокератин-положительный апоптоз» указан стрелкой. Осуществление изобретения
Таблица 1. Исследованные пептидные последовательности
Figure imgf000015_0001
Пример 1. Исследование влияния пептидных последовательностей Д37К, F26K-1, W26K-1 на неделящиеся мононуклеары периферической крови
На мононуклеарной фракции лейкоцитов здоровых доноров был поставлен ряд экспериментов для оценки цитотоксического влияния на неделящиеся клетки крови последовательностей Д37 , F26K-1 и W26K-1. Для этого из цельной венозной крови с антикоагулянтом (ЭДТА) на градиенте плотности р= 1,007, была вьщелена мононуклеарная фракция, клетки отмыты в ФСБ и помещены в 24-луночный планшет в количестве 150000 в мл. К суспензии клеток добавлялись исследуемые пептиды в концентрациях 10, 20, 30 40, 50 и 60 мкМ, пептиды были растворены в ФСБ. Инкубация составляла 24 часа при 37°С и 5% С02 в культуральной среде RPMI (10% ФБС).
После инкубации клетки отбирались в микропробирки, отмывалась среда и проводилось окрашивание образцов с помощью антител АннексинУ (Recombinant human Annexin V FITC conjugate, CALTAG Laboratories, U.S.A.) и PI по методике производителя. Результаты были оценены на проточном цитометре Becman Coulter.
Показано, что исследуемые пептидные последовательности способны индуцировать апоптоз (рисунок 1), имеется четко выраженная концентрационная зависимость уровня апоптоза мононуклеаров крови от количества внесенного пептида, значения апоптоза близки для 3 исследованных последовательностей. Количество живых клеток, оцененное как количество интактных/неокрашенных клеток при окраске Аннексии V/ PI, резко падает при инкубации с исследуемыми пептидами, что свидетельствует о выраженной цитотоксической активности (рисунок 2). Причем, эффект более выражен для последовательности Д37К.
Пример 2. Исследование цитотоксической активности на проли ерирующих клеточных линиях
Было исследовано влияние пептидных последовательностей Д37 , F26K-1, F26 -2, W26K- 1, W26K-2 на клетки перививных клеточных культур MCF-7 (рак молочной железы), А549 (аденокарцинома легкого), SKOV (рак яичника) и НСТ116 (аденокарцинома толстой кишки).
При подготовке к экспериментам культуры клеток рассаживали в 24-луночные планшеты в количестве 1 * 104 клеток в лунке, инкубировали 48 часов при 37°С и 5% С02, среда DMEM (ПанЭко, Россия), содержащая глутамин, гентамицин, 10% ФБС. После такой инкубации культуры клеток образовывали рыхлый монослой. Постановка эксперимента: культуральная среда заменялась на среду, содержащую исследуемые пептиды в концентрациях 5мкМ, ЮмкМ, 20мкМ, 40мкМ; в контрольных образцах среда содержала 20 мкл ДМСО для определения влияния растворителя (пептиды растворяли в ДМСО). Время инкубации 24 часа. Затем клетки аккуратно снимали с подложки, используя трипсин (клетки в лунках с пептидами прикреплены сильнее, чем контрольные образцы), отмывали от среды центрифугированием 3000 об. в течение 7 минут, удаляли супернатант и проводили окрашивание по двойной метке Аннексии V/ PI. Анализ проводился на проточном цитометре, оценивали количество клеток, включающих Аннексии V - апоптоз, количество клеток, включающих йодистый пропидий - погибшие клетки, количество интактных клеток - живые клетки.
При исследовании уровня апоптоза показано, что внесение пептидных последовательностей в культуральную среду пролиферирующих клеток приводит к увеличению апоптоза в культуре (рисунки 3, 4), апоптоз увеличивается пропорционально увеличению концентрации пептида.
Было получено, что пептидная последовательность F26K-2 (H-Phe-Leu-Asp-Ala-Ile-Le - Leu-Ile-Ahx) обладает более выраженным проапоптотическим действием на исследуемые клеточные линии. В отношении других исследованных последовательностей достоверных отличий в уровне индуцированного апоптоза не получено.
Количество погибших клеток, включающих йодистый пропидий, также увеличивается при внесении в культуральную среду пептидов и имеет концентрационную зависимость (рисунки 5, 6).
При исследовании количества погибших клеток не было получено достоверных отличий в степени влияния пептидов, однако, уровень мертвых клеток в культуре НСТ-116 выше, чем в культуре MCF-7, что, возможно, объясняется более высоким уровнем спонтанной гибели клеток в культуре НСТ-1 16.
Количество живых клеток имеет обратную зависимость с концентрацией внесенных в среду пептидных последовательностей (рисунки 7, 8).
При исследовании цитотоксического эффекта пептидных последовательностей на культуры А549 и SKOV, было получено, что последовательности F26K-1 и W26K-1 оказывают наиболее сильные эффекты, так для культуры А549 при концентрации последовательностей 40 мкМ уровень клеток, положительных по Аннексину, имел значения 43,5 и 52,1% для последовательностей F26K-1 и W26K-1 ; количество частиц, имеющих субдиплоидную/фрагментированную ДНК - 46,4 и 48,2%. При инкубации с исследуемыми последовательностями в течении 24 часов. При инкубации клеток линии А549 с последовательностью Д37К в концентрации 40мкМ в течении 24 часов количество Аннексин- положительных клеток составляло 33,8%; количество частиц с фрагментированной ДНК - 36,3%. В контрольных образцах уровень аннексии -положительных частиц не превышал 8%, уровень частиц с фрагментированной ДНК не превышал 10%.
Для культуры SKOV значения в уровне «раннего» апоптоза (Аннексин-положительные частицы) составляли 41,8% для последовательности F26K-1 и 45,2% для последовательности W26K-1. Для пептидной последовательности Д37К уровень «раннего» апоптоза составлял 37,6%. Количество частиц с фрагментированной ДНК в данной культуре при инкубации 24 часа с последовательностями F26K-1 и W26K-1 составило 42,6% и 44,1% соответственно. Уровень фрагментированной ДНК при инкубации с последовательностью Д37К составил 31,5%; уровень фрагментированной ДНК в контрольных образцах для обеих культур не превышал 8%.
Различий в изменении количества живых для разных последовательностей получено не было.
Пример З.Исследоеание цитостатического эффекта
На клеточных линиях MCF-7, НСТ-116, А549 (аденокарцинома легкого) и SKOV (рак яичника) было проведено исследование влияния пептидных последовательностей на пролиферативную активность клеток. Постановка экспериментов включала синхронизацию клеток в G0/G1— фазе клеточного цикла с помощью обедненной культуральной среды. Клетки в 24-луночном планшете выдерживали 48 часов в среде, содержащей 0,5% ФБС, после этого проводили снятие блока синхронизации путем замены среды, содержащей 5% ФБС и исследуемые пептиды в различных концентрациях. Инкубировали 24 часа, а затем снимали клетки с подложки с помощью трипсина, отмывали в ФСБ, фиксировали в этаноле. Окраска образцов: отмывка от этанола в ФСБ путем центрифугирования, инкубация с РНКазой, окраска йодистым пропидием. Анализ проводился методом проточной цитометрии, оценивалось распределение клеток по фазам клеточного цикла на ДНК-гистограммах с помощью программы ModFit 3.0.
Для культур клеток MCF-7 и НСТ-116 было исследовано влияние 5 пептидных последовательностей в концентрациях 10 и 40 мкМ. Показано, что исследуемые последовательности способны снижать пролиферативную активность делящихся клеток (рисунок 9).
При исследовании изменений в распределении клеток по фазам клеточного цикла в зависимости от времени инкубации с последовательностями было показано, что наиболее четко антипролиферативный эффект и его концентрационная зависимость прослеживается для последовательностей F26K-2, W26K-1, W26K-2. Для последовательности Д37К антипролиферативный эффект выражен для клеточной линии MCF-7, однако, не прослеживается в отношении клеток линии НСТ-116. Так для культуры НСТ-116 задержка выхода клеток из фазы покоя составляет 8 - 12 часов при воздействии последовательностей F26K-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2, наибольшая задержка наблюдалась при инкубации клеток с последовательностью W26K-2 (12 часов, количество клеток в G0/G1 - фазе 72%) (Рисунок 10).
Для культуры MCF-7 задержка пролиферации (выхода клеток после блока синхронизации) наблюдалась для всех исследуемых пептидных последовательностей, и достоверных отличий между влиянием последовательностей F26K-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2 и Д37К, обнаружено не было.
При оценке изменений уровней фаз клеточного цикла в культуре клеток линии А549, задержки в выходе клеток из фазы G0/G1 получено не было (рисунок 12).
Для линии А549 наблюдался более плавный выход из синхронизации, чем для культур MCF-7 и НСТ-116, клетки в контрольных образцах до 8 часов после инкубации оставались в фазе G0/G1 в количестве превышающем 60%. Влияние исследуемых последовательностей на уровень фазы G0/G1 был минимален. Однако, при анализе изменений уровня S - фазы было получено, что внесение в культуральную среду таких последовательностей, как F26K-1, W26K- 1 и Д37К приводит к задержке «входа» клеток в S-фазу. Если в контрольных образцах уровень S -фазы начинал возрастать сразу после снятия блока синхронизации, то в образцах с последовательностями F26K-1, W26K-1 и Д37К, уровень S-фазы начинал возрастать только через 8 часов после исключения синхронизирующего фактора (Рисунок 13, 14).
Таким образом, для культуры клеток линии А549 была поучена задержка на уровне второй рестрикционной точки, переход S - G2, для последовательностей F26K-1, W26K-1 и Д37К, что, возможно, объясняется особенностями данной клеточной линии. При исследовании влияния пептидных последовательностей на культуру клеток SKOV инкубация проводилась с последовательностями F26 -1, F26K-2, W26K-1, W26K-2. Клетки предварительно синхронизовали обедненной средой, содержащей 0,5% ФБС (фетальная бычья сыворотка), пептиды вносили в культуральную среду вместе со снятием блока синхронизации, заменой питательной среды на среду, содержащую 10% ФБС.
На рисунках 15, 16 представлено изменение количества клеток в фазах G0/G1 и S+G2/M, для всех исследуемых пептидов наблюдается увеличение количества клеток в GO/Gl-фазе и снижение пролиферирующих клеток (S+G2/M - фазы) при увеличении концентраций пептидов. Несколько меньший антипролиферативный эффект наблюдался в данном случае для последовательности W26K-2. Последовательности F26K-1, F26K-2, W26K-1 вызывали задержку пролиферации клеток линии SKOV без достоверных отличий.
Уровень апоптоза, оцененный как гиподиплоидный пик на ДНК-гистограммах, коррелирует с концентрацией внесенного пептида и повышается с 17,8% в контрольном образце до 31,2% при инкубации 24 часа с пептидом F26K-1 в концентрации 40мкМ, и до 35, 3% при инкубации с пептидом W26K-2 (40 мкМ) (рисунок 17).
При попытках поставить эксперименты по изучению цитостатического эффекта пептидных последовательностей с применением других методов синхронизации: использование гидроксимочевины - остановка в GO/Gl-фазе, таксола - остановка в 02-фазе и этопозида - остановка в S-фазе, получить достоверные результаты не удалось. В данных экспериментах при добавлении к клеточным культурам исследуемых последовательностей наблюдалась гибель клеток более 70%, что исключало возможность адекватного анализа распределения клеток по фазам клеточного цикла.
Пример 4. Исследование влияния пептидных последовательностей на изменение уровня Bcl-2
С помощью моноклональных антител Anti Human Bcl-2 (Caltag Laboratories, USA) было оценено изменение уровня Bcl-2 в клетках линии НСТ-116 при инкубации с исследуемыми пептидными последовательностями. Клетки переносились на 24-луночный планшет в количестве 1 *104 в лунке, 48 часов росли при обычных условиях (среда DMEM, 10 %), затем проводилась синхронизация обедненной средой, содержащей 0,5% ФБС, в течение 48 часов. При снятии блока синхронизации к клеткам добавлялась среда, содержащая 10% ФБС и исследуемые пептидные последовательности в концентрациях 10 и 40 мкМ. Инкубация с пептидами составила 24 часа, затем культуру снимали с помощью трипсина, фиксировали в течении часа раствором ФСБ, содержащего 1% формальдегида, далее фиксировали этанолом. Окраску и анализ проводили согласно инструкции производителя антител. Было получено, что исследуемые последовательности способны ингибировать экспрессию белка Вс1-2, наиболее сильно ингибирование происходит под воздействием последовательностей F26K-1, F26K-2, W26K-2, для данных последовательностей также получена зависимость уровня Вс1-2 от концентрации пептида (рисунок 18). Тем самым показано, что индуцируемый внесением в культуральную среду пептидных последовательностей апоптоз объясняется специфическим воздействием пептидов на молекулярные процессы клетки.
При исследовании изменения уровня Вс1-2 было получено, что пептиды Д37К и W26K-1 оказывают минимальный эффект, снижая уровень Bcl-2-положительных клеток в культуре на 5% при инкубации 24 часа и концентрации пептидов 40 мкМ. Пептиды W26K-2 и F26K-1 снижали уровень Вс1-2 более 15%.
Пример 5. Исследование изменения количества фосфорилированного pRb при инкубации клеточных культур с пептидными последовательностями
Одной из задач проведенной работы было доказать, что антипролиферативные эффекты исследуемых пептидов связаны со специфическим действием фрагментов ингибиторов циклиновых киназ, входящих в их структуру. Хотя в литературе и описано сохранение игибирующих свойств таких пептидов на фосфорилирующую функцию циклинзависимых киназ, эти подтверждения получены на клеточных экстрактах. Мы провели исследование изменения уровня фосфорилирования pRB - молекулярной мишени циклиновых киназ D типа на фоне действия исследуемых пептидов - включающих последовательности, имеющие гомологию с pl6INK4a на клеточном уровне с использованием метода проточной цитометрии.
Активация в клетке собственного pl6INK4a приводит к ингибированию фосфорилирования pRb. Накопление недофосфорилированого pRb приводит к ингибированию E2F1 и снижению экспрессии циклинов А и В, что является одним из ключевых механизмов в остановке клеточного цикла. По количеству фосфорилированного pRb, можно судить об активности р16.
Метод проточной цитометрии позволяет визуализировать клетки в которых продукт pRb находится в "недофосфорилированном" («undephosphorylated») состоянии. Меченные флуоресцентной меткой антитела взаимодействуют с "недофосфорилированным" pRb.
Для определения количества «недофосфорилированного» pRb, был проведен ряд экспериментов, к синхронизированным методом обедненной среды культурам клеток (MCF-7, НСТ-116) после снятия блока синхронизации добавлялись исследуемые пептидные последовательности, затем клетки снимались через каждые два часа. С каждой чашки часть клеток фиксировалась для дальнейшего определения фаз клеточного цикла, а часть для определения количества «недофосфорилированного» pRb. Также был поставлен отрицательный контроль в виде образцов синхронизированных клеток, но без добавления пептидов. Было показано, что внесение в культуру клеток пептидных последовательностей вызывает задержку фосфорилирования pRb и снижает его максимальный уровень в культуре (Рисунок 19).
Как видно из рисунка 19, после снятия блока синхронизации в контрольных образцах без добавления пептидов, уровень «недофосфорилированного» pRb начинает расти и к определенному моменту (4 или 6 часов инкубации), в зависимости от клеточной линии, достигает максимального значения, а затем начинает снижаться. В образцах с пептидами уровень «недофосфорилированного» pRb начинает увеличиваться позднее и достигает своего максимального значения через 12-18 часов инкубации, причем, задержка в достижении максимального уровня pRb зависит от концентрации пептидных последовательностей. Для культуры клеток MCF-7 (рисунок 19) наибольшую задержку в образовании «недофосфорилированного» pRb оказывали последовательности F26K-2 и W26K-2. При исследовании изменения уровня «недофосфорилированного» pRb в культуре НСТ-1 16 при инкубации клеток с пептидными последовательностями, наибольший эффект задержки был получен для последовательностей F26K-1 и F26K-2. Для культуры НСТ-116 были поставлены 3 эксперимента по определению уровня «недофосфорилированного» pRb. Клетки синхронизировали методом обедненной среды (48 часов в среде, содержащей 0,5% ФСБ), при смене среды на среду, содержащую 10% ФСБ к культуре добавляли исследуемые последовательности в концентрациях 10 и 40 мкМ. Анализировали уровень «недофосфорилированного» pRb каждые два часа, максимальное время инкубации составило 24 часа.
Как показано на рисунке 20 для культуры НСТ-116 наибольший эффект задержки образования «недофосфорилированного» pRb оказывали последовательности F26K-1 и F26K-2, для этих последовательностей максимальный уровень «недофосфорилированного» pRb, при концентрации пептидов 10 мкМ, наблюдался после 16 часов инкубации, а при концентрации 40 мкМ после 20 часов. Для последовательности Д37К, эффект задержки наблюдался такой же по времени, но уровень «недофосфорилированного» pRb был ниже.
При исследовании уровня «недофосфорилированного» pRb на клетках линии SKOV, эффект задержки образования «недофосфорилированного» pRb был ниже, чем для культур MCF-7 и НСТ-116, хотя на данной клеточной линии ранее был показан эффект задержки пролиферации при инкубации клеток с исследуемыми пептидными последовательностями. На рисунке 21 показано изменение уровня «недофосфорилированного» pRb в культуре клеток SKOV при воздействии на клетки последовательностей Д37К, F26K-1, F26K-2, W26K-1, W26K- 2 в концентрациях 10 мкМ (А) и 40мк (В). Очевиден эффект задержки образования «недофосфорилированного» pRb по сравнению с контрольным образцом, однако, в случае клеточной линии SKOV, эффект несколько ниже, чем для культур MCF-7 и НСТ-116. Последовательность Д37К, в данном случае, оказывает наиболее сильный эффект, но и F26K-2 вызывает задержку в образовании «недофосфорилированного» pRb на 4-10 часов, по сравнению с контролем.
Таким образом, было получено, что исследованные пептидные последовательности Д37К, F26K-1, F26K-2, W26K-1 и W26K-2 способны индуцировать апоптоз в активно пролиферирующих клетках, тормозить процессы пролиферации. Из исследованных последовательностей наиболее ярко выраженными цитотоксическими и цитостатическими эффектами обладают последовательности F26K-1 и F26K-2, при инкубации с которыми апоптоз имеет несколько более высокие значения для пролиферирующих клеток, наблюдается задержка пролиферации (увеличение количества клеток в G0/G1 - фазе клеточного цикла), снижение уровня Вс1-2, имеющее концентрационную зависимость. Для других исследованных последовательностей также наблюдаются цитотоксические и цитостатические эффекты, но менее выраженные.
Пример 6. Исследование сочетанного эффекта интернализуемых последовательностей и лекарственных препаратов
На культуре клеток НСТ-1 16 был поставлен ряд экспериментов по изучению сочетанного воздействия интернализуемых последовательностей F26K-1 и Д37К и лекарственных препаратов, обладающих противоопухолевой активностью (Таксол, Этопозид). Приведенные ниже данные, средние значения по 3 экспериментам. Лекарственные препараты и интернализуемые последовательности вносили в культуральную среду в конечных концентрациях 1, 10 и 30 мкМ, проводили инкубацию 24 часа. Цитотоксический эффект оценивали с помощью МТТ-теста. Данный метод основан на способности митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически активных клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола (МТТ- реагента) до голубого кристаллического фармазана, растворимого в диметилсульфоксиде (ДМСО).
Для проведения МТТ-теста клетки в концентрации 2 * 10б/мл помещали в лунки 96- луночного планшета в объёме среды 100 мкл, инкубировали 24 часа, затем проводили замену среды на среду, содержащую ЛП и интернализуемые последовательности, инкубировали 24 часа, отбирали среду и добавляли 30 мкл чистой «полной» среды, затем добавляли по 170 мкл PBS и по 20 мкл МТТ. Инкубировали при 37°С в течение 30 мин., отбирали супернатант. Добавляли по 200мкл ДМСО (диметилсульфоксиде) и 15 мин инкубировали в темноте при комнатной температуре. Показания оптической плотности считывали на ИФА-ридере (иммуноферментный анализатиор) при 492нм.
На рисунке 22 представлено изменение количества мертвых клеток при воздействии лекарственных препаратов на клеточную культуру. Цитотоксический эффект Этопозид в данном диапазоне концентраций и для данной клеточной линии был минимален, Таксол оказывал выраженный цитотоксический эффект при концентрации 30 мкМ. Для исследуемых последовательностей было показано, что последовательность F26K-1 индуцирует клеточную гибель, и наблюдается зависимость количества мертвых клеток от концентрации последовательности в культуральной среде (рисунок 23).
При исследовании сочетанного эффекта последовательности Д37К и препаратов Таксол, Этопозид, для культуры НСТ-1 16 не было получено эффектов усиления цитотоксического воздействия препаратов (рисунок 24). Количество мертвых клеток такое же, как при воздействии чистых ЛП.
При исследовании сочетанного воздействия последовательности F26K-1 и ЛП была получена суммация цитотоксических эффектов. Наиболее четкий эффект суммации наблюдается при совместной инкубации клеток с последовательностью F26K-1 и Этопозидом (Рисунок 25). При инкубации клеток с последовательностью F26K-1 и Таксолом эффект суммации наблюдается при концентрациях 1 и 10 мкМ F26K-1, но теряется при увеличении концентрации последовательности F26K-1 до 30 мкМ (Рисунок 26). Данный эффект повторялся во всех проведенных экспериментах и объяснить его на данном этапе не удалось, возможно, имеет место механизм перенасыщения, в ответ на гиперактивацию проапоптотических механизмов, включаются пути обратной регуляции, и как следствие, торможение клеточной гибели.
На культуре клеток MCF-7 (рак молочной железы) было исследовано сочетанное воздействие ЛП 5-фторурацил и Таксол и последовательностей Д37К и F26K-2 (в исследованиях по цитотоксичности данная последовательность оказывала наиболее выраженный эффект на культуру MCF-7). Клетки выращивались на 24-луночных планшетах до 70 % монослоя, затем проводилась замена среды на среду, содержащую исследуемые последовательности и ЛП в концентрациях 10, 20 и 30 мкМ. Время инкубации составляло 24 часа. Анализировали клетки, вступившие в апоптоз, с помощью окраски Аннексин-Йодистый пропидий, методом проточной цитофлуор иметрии .
Было показано, что при сочетанном использовании Таксола и последовательности F26K-2 наблюдается суммация цитотоксических эффектов, выражающаяся в увеличении уровня апоптоза пропорционально концентрациям препаратов. Данный эффект несколько снижается при увеличении концентрации последовательности F26 -2 до 30 мкМ (Рисунок 27 В). В случае последовательности Д37К, на концентрации 10 мкМ цитотоксический эффект был минимален, а эффекты концентраций 20 и 30 мкМ были практически одинаковы (Рисунок 27 А).
В случае сочетанного использования 5-фторурацила и интернализуемых последовательностей Д37К и F26K-2 для обеих исследованных последовательностей были получены линейные зависимости усиления цитотоксического эффекта от концентраций. Причем, со сопоставимыми значениями количества апоптотических частиц, и снижение эффекта при увеличении концентрации пептидной последовательности до 30 мкМ (Рисунок 28).
На культуре клеток Н460 (рак легкого) было исследовано сочетанное влияние последовательностей F26K-1, F26 -2, W26K-1, W26K-2, и Этопозида. Для этого клетки инкубировали в 24-луночном планшете до образования 70% монослоя, затем проводили замену среды на среду, содержащую интернализуемые последовательности в концентрациях 5, 10, 20 и 30 мкМ и Этопозид в концентрации 10 мкМ. Время инкубации составило 24 часа. Был исследован уровень апоптоза с помощью окраски на Аннексин-Йодистый пропидий (ранний апоптоз) и уровень апоптоза по количеству частиц с фрагментированной ДНК, субдиплоидный пик при окраске фиксированных клеток йодистым пропидием.
Было показано, что все исследованные последовательности обладают выраженным апоптотическим эффектом относительно данной культуры клеток, причем уровень апоптоза значимо возрастает при сочетанном использовании пептидных интернализуемых последовательностей и Этопозида.
На рисунке 29 А показано изменение уровня апоптоза в культуре Н460 при инкубации клеток с пептидными последовательностями без Этопозида, время инкубации 24 часа, апоптоз анализировался как субдиплоидный пик. На рисунке 29 В, увеличение уровня апоптоза при инкубация клеток и с последовательностями, и с Этопозидом.
На рисунке 30 представлены те же образцы, но окрашенные по двойной метке AnnexinV- PI, отмечается увеличение уровня раннего апоптоза, клетки, положительные по Аннексину, при воздействии на культуру пептидных последовательностей (А), и суммация эффектов пептидных последовательностей и Этопозида (В).
Для культуры Н460 были также поставлены модифицированные эксперименты по изучению сочетанного воздействия Этопозида и пептидных последовательностей. Клетки инкубировали в 24-луночном планшете до образования 70% монослоя, затем проводили замену среды на среду, содержащую Этопозид в концентрации 10 мкМ, инубировали в течении 24 часов. Заменяли среду на содержащую интернализуемые последовательности в концентрациях 5, 10, 20 и 30 мкМ, без Этопозида. Инкубировали 24 часа. Был исследован уровень апоптоза с помощью окраски на Аннексин-Иодистый пропидий (ранний апоптоз) и уровень апоптоза по количеству частиц с фрагментированной ДНК, субдиплоидный пик при окраске фиксированных клеток йодистым пропидием.
Было получено резкое увеличение уровня апоптоза, при концентрациях последовательностей F26K-2 и W26K-1 5 мкМ, уровень апоптоза составил более 80% (рисунок 31).
Уровень клеток с фрагментированной ДНК, что соответствует более поздним апоптотическим процессам, имел другую форму зависимости, но вид зависимости был идентичен для всех исследованных пептидных последовательностей (рисунок 32). При данной постановке эксперимента наблюдалась картина общего возрастания апоптоза по сравнению с экспериментами в которых ЛП вносили в культуральную среду одновременно с инернализуемыми последовательностями. Данный эффект, возможно, объясняется задержкой пролиферации, которую индуцирует этопозид (блок выхода из S-фазы), интернализуемые последовательности, обладая способностями циклин-зависимых киназ, стимулируют запуск процессов апоптоза в клетках, остановленных этопозидом.
Таким образом, в ходе проведенных исследований было показано, что все исследованные пептидные последовательности (Д37К, F26K-1, F26K-2, W26K-1, W26K-2) обладают способностью индуцировать апоптоз, влияют на процессы пролиферации клетки. Уровень эффектов зависит как от последовательности, так и от клеточной культуры. При сравнении пептидных последовательностей было показано, что W26K-1 является наиболее «слабой», остальные же последовательности по цитотоксическим эффектам превосходят исследованную ранее Д37К.
Представлена возможность сочетанного использования интернализуемых последовательностей и лекарственных препаратов, применяемых в медицинской практике. Показано усиление цитотоксических свойств противоопухолевых препаратов.
Пример 7. Изучение проникающей способности интернализуемых пептидов.
Для регистрации проникновения пептидов внутрь клетки и исследования динамики накопления использовали идентичные химерные последовательности конъюгированные с флуоресцентной меткой - флоуресцеин-изотиоцианатом (ФИТЦ). Т.к. включение молекул ФИТЦ в готовый полипептидный продукт часто приводит к существенному изменению его физико-химических свойств и потере физиологической активности, поэтому к исходной последовательности на N конце присоединялась молекула лизина, которая и несла одну молекулу ФИТЦ.
Методом световой флуоресцентной микроскопии было показано, что изучаемые пептиды связываются с клетками и проникают в клеточные линии Raji, Jurkatt, А549, 293 и периферические лимфоциты крови человека. Методом проточной цитофлуорометрии было показано связывание пептида с клетками, и отсутствие эффекта тушения флуоресценции трипановым синим, что свидетельствует о накоплении пептида внутри клетки.
Наиболее объективные данные о накоплении пептида внутри клетки были получены с использованием метода сканирующей лазерной микроскопии. Белок, меченный флюоресцеин- изотиоцианатом, был растворён в 0,9% NaCl. Клеточные линии А549, 293 выращивались на предметных стерильных стёклах и помещались в специальной камере непосредственно под окуляры микроскопа. Среда замещалась на среду с исследуемым белком. Насыщение белком наблюдали во времени. Кроме того, производилось послойное сканирование клеток с целью определения локализации пептида.
Анализ полученных изображений при данном увеличении не выявил преимущественного расположения белка pl6_pAntp в клетке. Очевидно, что белок распределяется в компартментах клетки равномерно. Проникновение белка внутрь клетки происходит достаточно быстро. И уже через 15 минут инкубации можно наблюдать относительно гомогенное распределение его во внутриклеточном пространстве (рис. 33).
Скорость проникновения пептида в периферические лимфоциты крови человека, а также лимфоциты клеточных линий (Raji, Jurkatt) была оценена с использованием метода проточной цитофлуорометрии. Данный метод позволяет исследовать большие концентрации клеток во времени и удобен для оценки скорости проникновения исследуемого пептида. Измерялась флуоресценция лимфоцитов под действием белка pl6-pAntp-i>HTLJ при рН7.5 и рНб.О. Принцип метода основан на меньшем квантовом выходе флуоресценции ФИТЦ в растворах с более кислым рН. Так как скорость измерения происходит достаточно быстро, то значение рН внутри клетки не может измениться. Лимфоциты инкубировались с пептидом в течении 1-15 минут, после этого к ним сразу добавлялся 20 кратный объём фосфатного буфера с рН 6.0 и рН 7.5. При этом оценивалась разность интенсивности флуоресценции. В большинстве измерений интенсивности флуоресценции достоверно не отличались после 15 минут инкубации. Таким образом, можно предположить, что после 15 минут инкубации пептид полностью проникает внутрь клетки. Для исследования скорости накопления пептида внутри клетки использовали метод проточной цитофлуорометрии. Для этого меченный ФИТЦ пептид вводили непосредственно в измерительную пробирку проточного цитометра, что позволяло регистрировать динамику изменения флуоресценции клеток. Исследовалась мононуклеарная фракция лейкоцитов крови здоровых доноров, выделенная на градиенте фиколла. После небольшой лаг-фазы, происходит быстрое накопление пептида в клетках нормальных лимфоцитов. Конечная концентрация достигается за время равное - 1 мин.
Похожая кинетика накопления пептида получена и для клеток злокачественных лимфом. В качестве моделей исследовались линии Jurkat (происходящая из лимфобластного лейкоза и имеющая Т-клеточный фенотип) и Raji -происходящая из В-клеточной лимфомы Беркита.
В опухолевые клетки пептид проникает с большой скоростью. Время достижения максимальной концентрации - менее 1 мин. Кинетика накопления исследовалась при комнатной температуре (t=20 С0). Следует подчеркнуть, что механизм проникновения исследуемого класса пептидов до настоящего времени не известен. Однако показано, что накопление происходит одинаково эффективно даже при температуре +5 С0 и не связано с затратами энергии в клетке, не опосредуется клеточными рецепторами и не использует фаго- и пиноцитозный путь. Авторы также подтвердили факт накопления синтезированного пептида, содержащего интернализуемый фрагмент, при разных температурах (до +5 С0 ).
Т.к. исследуемые пептиды могут преодолевать клеточную мембрану в обоих направлениях, можно предположить, что накопленные в клетке пептиды могут выходить из нее при снижении внеклеточной концентрации. Исследование процессов экспорта пептидов из клетки могут быть темой отдельных исследований.
Таким образом, в результате проведенных экспериментов было показано, что кинетика накопления химерного пептида, содержащего интернализуемый фрагмент и фрагмент белка pl6INK4a имеет степенной характер с зависимостью типа С= constl+const2*t2. Показано также, что динамика накопления и внутриклеточного распределения пептида в нормальных и опухолевых клетках не отличается по характеру и по скорости накопления.
Пример 8. Исследование противоопухолевой активности пептида Д37К in vivo (местное введение)
На бестимусных мышах (Nude) исследовалась противоопухолевая активность химерного интернализуемого пептида Д37К.
Мышам были перевиты опухолевые культуры клеток человека линий А549 и НСТ-1 16 в количестве около 1 млн. клеток на мышь. 39 мышам были привиты клетки А549, из них 20 мышей составили контрольную группу, им в дальнейшем вводили плацебо. 10 мышей составили 1 опытную группу. Им после образования пальпируемой опухоли (через 4 дня после перевивки клеток) стали вводить непосредственно в опухоль исследуемый пептид в дозе 0,1 мг. 9 мышей составили 2 опытную группу, им также после образования опухолевого узла на 4 день перевивки стали вводить в ложе опухоли по 0,2 мг пептида. Пептид в опытных группах вводили один раз в два дня. Эксперимент продолжался 24 дня.
В опытных группах наблюдали снижение темпов роста опухолей и на 6 день после начала введения пептида можно наблюдать заметное снижение объема опухолей в опытных группах по сравнению с контрольной (рис. 34). Эксперимент продолжался 24 дня. За это время в опытных группах было проведено 10 инъекций химерного пептида. В контрольной группе на 24 день эксперимента средний объем опухолей у мышей составил 95,24 мм3, одна мышь погибла. В первой опытной группе (доза вводимого пептида - 0,1 мг) средний объем опухолей составил 39,29 мм3, одна мышь погибла. Во второй опытной группе (доза вводимого пептида - 0,2 мг) средний объем опухолей составил 57,51 мм3, но погибших животных не было.
При введении мышам перевивной культуры человека НСТ-116, животных разделили на две группы: контрольная - 10 мышей, которым в последующем не вводили исследуемый пептид и опытная группа (10 мышей), которым вводили исследуемый химерный пептид P16_Antp в дозе 0,1 мг в область опухолевого узла. Эксперимент продолжался 28 дней, было сделано в опытной группе 11 инъекций пептида, первая инъекция была сделана на 6 день после перевивки опухолевых клеток. Опухолевый узел из клеток НСТ-116 отличался большими размерами и наличием изъязвлений. В контрольной группе на 28 день эксперимента средний объем опухолей составил 679 мм3, за время эксперимента погибло 3 мыши. В опытной группе отмечался более низкий темп роста опухоли (рис. 35), на 28 день эксперимента средний объем опухолей составил 225,4 мм3, погибших животных в опытной группе было 2.
На рис. 36 представлены пары мышей из разных групп после 7 проведенных инъекций исследуемого пептида. Видно заметное уменьшение опухолевого узла в опытных группах.
Местное введение химерного пептида pl6-Antp приводит к достоверному (более 50%) торможению роста экспериментальных моделей опухолей человека (рак молочной железы, колоректальный рак).
Пример 9. Исследование цитотоксических свойств Д37К на краткосрочных культурах опухолей человека Исследовалась противоопухолевая активность Д37К . Были синтезированы 150 мг пептида Д37К методом твердофазного синтеза. Для исследования эффектов на опухолях человека использовали метод краткосрочных культур.
Методика получения краткосрочных культур опухолей из операционного материала.
Краткосрочные культуры получали из операционного материала. Забор участка для приготовления культуры проводился по-возможности в кратчайшие сроки после операции и с участием патологоанатома. Вырезался участок ткани, в среднем 1 ,5 см3. Ткань механически размельчалась, суспензия клеток помещалась в среду RPMI, содержащую 5% ФБС. Через 24 часа инкубации при 37°С и 5% С г, среда заменялась на среду, содержащую химерный пептид (pl 6_Antp в концентрации 40 мкМоль), либо для ряда экспериментов на Таксол в концентрации 100 нМоль или 500 нМоль, содержащую и пептид и Таксол. В контрольных образцах среда заменялась на свежую. Снималась первая точка - 0 часов.
Инкубация проходила при 37°С и 5% С02 24 часа, для ряда экспериментов 24 и 48 часов. Оценивали результаты методом проточной цитофлуориметрии (описание метода см. методы ин витро) с использованием двойной окраски образцов AnnexinV-PI и окраски фиксированного материала PL Оценивали уровень частиц, положительных по AnnexinV (ранний апоптоз), уровень частиц, положительных по двойной метке AnnexinV-PI (поздний апоптоз), количество частиц в нефиксированных образцах, способных включать PI (некроз); распределение клеток по фазам клеточного цикла, уровень субдиплоидного пика (количество частиц с фрагментированной ДНК, апоптоз). Для выявления апоптоза эпителиальных клеток использовали двойную окраску антитела к цитокератину-ФИТЦ - PL (рис.37).
Всего проанализировано 126 образца ткани: из них 63 - образца патологических тканей (и 63 образца нормальных тканей в качестве контролей) Из 63 патологических образцов было исследовано опухолей злокачественного генеза 47 (10 - рак молочной железы, 15 - рака почки, 6 рака матки, 4 рака предстательной железы, 3 рака яичника и рака легкого и по 2 случая рака желудка, рака поджелудочной железы, мочевого пузыря.) Кроме того исследовались образцы ткани фиброаденом (N=9), а также 7 образцов ткани молочной железы при простой протоковой гиперплазии.
Уровень апоптоза анализировали через 24 и 48 часов после добавления пептидов в концентрации 40 мкМ. Часть экспериментов провели для изучения сочетанного цитотоксического действия на клетки опухоли традиционных химиотерапевтических препаратов и пептида Д37К.
Пример 10. Исследование противоопухолевой активности пептидаД37К Суммарные результаты по цитотоксической активности пептид Д37К приведены в Таблице 3.
Таблица 3. Средний уровень индуцированного апоптоза в краткосрочных культурах опухолей при воздействии пептида Д37К. (24 час, 40 кМ).
Figure imgf000030_0001
Анализ полученных результатов показывает, что наиболее чувствительными формами рака для цитотоксического действия пептида Д37К являются: рак почки, молочной железы, желудка, мочевого пузыря. Следует отметить, что для краткосрочных культур рака мочевого пузыря характерен очень высокий уровень спонтанного апоптоза (до 60-70%). Несмотря на то, что добавление пептида повышает этот уровень незначительно, на этом фоне полученные результаты могут иметь нерепрезентативный характер.
Пример 11. Исследование цитотоксического действия на клетки фиброаденомы молочной железы.
Интересные результаты были получены при исследовании образцов тканей фиброаденомы молочной железы. В краткосрочных культурах этих клеток при невысоком уровне спонтанного апоптоза (максимальный до 20 %, средний 12,8%) пептид р16 оказывал существенное цитотоксическое действие и вызывал выраженный апоптоз через 24 часа со средним уровнем 38,2 % при максимально до 80%. Менее выраженное цитотоксическое действие было обнаружено для клеток молочной железы имеющих признаки простой протоковой гиперплазии (средний уровень индуцированного апоптоза 14,5%). Эти результаты согласуются с полученными автором данными по изучению соотношения активности пролиферации и уровня спонтанного апотоза в патологических тканях молочной железы. Было показано, что соотношение пролиферации и спонтанного апоптоза наиболее высоко для ткани фиброаденомы, а клетки рака молочной железы по этому показателю находятся на втором месте, далее следует простая протоковая гиперплазия и ткань нормальной молочной железы. Если одним из факторов, определяющих чувствительность клеток к цитотоксическому действию пептидов, содержащих ингибиторы пролиферации является активность клеточного деления, то чувствительность клеток фиброаденомы к пептиду Д37К является вполне логичной. Обнаруженный эффект чувствительности доброкачественных пролиферативных процессов в ткани молочной железы может оказаться перспективным для их лечения. Результаты по локальному введению пептидов для лечения перевивных солидных опухолей позволяют предположить эффективность их при локальном введении в область доброкачественных пролиферативных процессов в тканях молочной железы.
Полученный результаты позволили выявить спектр чувствительных к пептиду Д37К опухолей человека. Обнаружено, что такие локализации как рак молочной железы, колоректальный рак, рак желудка, рак мочевого пузыря, рак почки являются перспективными объектами для дальнейшего изучения цитотоксического (противоопухолевого) действия изучаемого пептида. Полученные результаты являются новыми, т.к. в доступной литературе нет данных по изучению влияния анализируемого пептида на опухоли человека.
Специалист в данной области согласится с взаимозаменяемостью некоторых элементов различных вариантов исполнения изобретения. Аналогичным образом, некоторые вышеуказанные элементы и действия, а также другие известные эквиваленты для каждого элемента, действия и метода, могут быть совмещены или заменены одним из обычных компонентов, в соответствии с вышеуказанными принципами, с целью образования соединения. Несмотря на то, что информация была представлена в контексте определенных вариантов исполнения изобретения и примеров, специалисты в данной области согласятся с тем, что данная информация охватывает более широкую сферу применения, чем применение в рамках вышеуказанных вариантов исполнения изобретения, и/или на ее основе могут быть использованы возможные модификации и эквиваленты. Таким образом, информация не органичена применением исключительно в рамках представленных вариантов исполнения изобретения.

Claims

Формула
1. Химерный пептид с антипролиферативной активностью, включающий функциональный фрагмент и транспортную последовательность, при этом функциональный фрагмент включает аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 60% идентичную последовательности аминокислот, выбранной из группы SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 17.
2. Химерный пептид с антипролиферативной активностью, включающий функциональный фрагмент и транспортную последовательность, при этом функциональный фрагмент включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 17.
3. Химерный пептид по п. 1, отличающийся тем, что функциональный фрагмент представлен пептидом, включающим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2, или SEQ ID NO: 3, или SEQ ID NO: 4.
4. Функциональный пептид с антипролиферативной активностью, включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 60% идентичную последовательности аминокислот, выбранной из группы SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 17.
5. Функциональный пептид с антипролиферативной активностью, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 17.
6. Химерный пептид по п. 1, отличающийся тем, что транспортная последовательность из белка Antp или Tat.
7. Химерный пептид по п.1 для лечения злокачественной опухоли.
8. Химерный пептид по п.1 для лечения доброкачественной опухоли.
9. Функциональный пептид по п.4 для лечения злокачественной опухоли-.
10. Функциональный пептид по п.4 для лечения доброкачественной опухоли.
11. Химерный пептид по п.9, отличающийся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелома и злокачественная лимфома.
12. Функциональный пептид по п. 9, отличающийся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелома и злокачественная лимфома.
13. Лекарственное средство на основе химерного пептида по п.1 для лечения злокачественной опухоли.
14. Лекарственное средство на основе химерного пептида по п.1 для лечения доброкачественной опухоли.
15. Лекарственное средство по п.13, отличающееся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелома, злокачественная лимфома.
16. Лекарственное средство на основе функционального пептида по п.4 для лечения злокачественной опухоли.
17. Лекарственное средство на основе функционального пептида по п.4 для лечения доброкачественной опухоли.
18. Лекарственное средство по п. 16, отличающееся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелома и злокачественная лимфома.
19. Фармацевтическая композиция с антипролиферативной активностью, включающая в качестве терапевтически активного вещества химерный пептид по п.1 или функциональный пептид по п.4, а также фармацевтическиприемлемые носители.
20. Фармацевтическая композиция по п. 19, включающая дополнительное фармацевтически активное вещество, выбранное из группы, включающей алкилирующие препараты, антиметаболиты, алкалоиды растительного происхождения, противоопухолевые антибиотики, производные платины, производные камптотецина, альтретамин, амсакрин, L-аспарагиназу, дакарбазин, эстрамустин, гидроксикарбамид, прокарбазин, темозоломид, моноклональные антитела, гормоны, цитокины.
21. Лекарственное средство на основе фармацевтической композиции по п.19 для лечения злокачественной опухоли.
22. Лекарственное средство на основе фармацевтической композиции по п.19 для лечения доброкачественной опухоли.
23. Лекарственное средство по п. 21, отличающееся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелома и злокачественная лимфома.
24. Лекарственное средство на основе фармацевтической композиции по п.20 для лечения злокачественной опухоли.
25. Лекарственное средство на основе фармацевтической композиции по п.20 для лечения доброкачественной опухоли.
26. Лекарственное средство по п. 24, отличающееся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелома и злокачественная лимфома.
27. Способ лечения злокачественной опухоли, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, химерного пепетида по п. 1 или функционального пепетида по п. 4 в терапевтически приемлемой дозе.
28. Способ лечения доброкачественной опухоли, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, химерного пепетида по п. 1 или функционального пепетида по п. 4 в терапевтически приемлемой дозе.
29. Способ лечения по п. 27,. отличающийся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелома и злокачественная лимфома.
30. Способ лечения злокачественной опухоли, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции по п.19 в терапевтически приемлемой дозе.
31. Способ лечения доброкачественной опухоли, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции по п.19 в терапевтически приемлемой дозе.
32. Способ лечения по п. 30,. отличающийся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелома и злокачественная лимфома.
33. Способ лечения злокачественной опухоли, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции по п.20 в терапевтически приемлемой дозе.
34. Способ лечения доброкачественной опухоли, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтической композиции по п.20 в терапевтически приемлемой дозе.
35. Способ лечения по п. 33,. отличающийся тем, что злокачественная опухоль выбрана из группы, включающей колоректальный рак, рак почек, рак легкого, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак желудка, рак яичника, миелома и злокачественная лимфома.
PCT/RU2014/000199 2013-04-03 2014-03-27 Химерный пептид и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний WO2014163535A1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14778337.7A EP2982682A1 (en) 2013-04-03 2014-03-27 Chimeric peptide and pharmaceutical composition for treating oncological diseases
JP2016506285A JP2016520547A (ja) 2013-04-03 2014-03-27 腫瘍性疾患を治療するためのキメラペプチド及び医薬組成物

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201300313 2013-04-03
EA201300313A EA028151B1 (ru) 2013-04-03 2013-04-03 Химерный пептид и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014163535A1 true WO2014163535A1 (ru) 2014-10-09

Family

ID=51658707

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2014/000199 WO2014163535A1 (ru) 2013-04-03 2014-03-27 Химерный пептид и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP2982682A1 (ru)
JP (1) JP2016520547A (ru)
EA (1) EA028151B1 (ru)
WO (1) WO2014163535A1 (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6569833B1 (en) 1995-09-21 2003-05-27 Cyclacel Limited Cyclin dependent kinase binding peptides
RU2297241C2 (ru) 2004-11-22 2007-04-20 Государственное учреждение Российский научный центр рентгенорадиологии Министерства здравоохранения и социального развития Химерный белок для лечения злокачественных лимфом
RU2435783C1 (ru) 2010-09-29 2011-12-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Метамакс" Химерный пептид и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний
EA017179B1 (ru) * 2011-04-06 2012-10-30 Ооо "Метамакс" Фармацевтическая композиция для лечения гиперпролиферативных заболеваний и её применение

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6569833B1 (en) 1995-09-21 2003-05-27 Cyclacel Limited Cyclin dependent kinase binding peptides
RU2297241C2 (ru) 2004-11-22 2007-04-20 Государственное учреждение Российский научный центр рентгенорадиологии Министерства здравоохранения и социального развития Химерный белок для лечения злокачественных лимфом
RU2435783C1 (ru) 2010-09-29 2011-12-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Метамакс" Химерный пептид и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний
EA017179B1 (ru) * 2011-04-06 2012-10-30 Ооо "Метамакс" Фармацевтическая композиция для лечения гиперпролиферативных заболеваний и её применение

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEROSSI D. ET AL.: "The third helix of the Antennapedia homeodamain translocates through membranes", J.BIOL. CHEM., vol. 269, 1994, pages 10444 - 10450
MORRIS MC ET AL.: "A peptides carrier for the delivery of biologically active proteins in mammalian cells", NAT. BIOTECHNOLOGY, vol. 19, 2001, pages 1173 - 1176

Also Published As

Publication number Publication date
EA201300313A1 (ru) 2014-10-30
EP2982682A1 (en) 2016-02-10
EA028151B1 (ru) 2017-10-31
JP2016520547A (ja) 2016-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kumar et al. Intra-tumoral metabolic zonation and resultant phenotypic diversification are dictated by blood vessel proximity
CN107271675B (zh) 抗人adrb3单克隆抗体及其在疾病诊断和治疗中的应用
Yamamura et al. IGF-I differentially regulates Bcl-xL and Bax and confers myocardial protection in the rat heart
Mello et al. Adenosine uptake is the major effector of extracellular ATP toxicity in human cervical cancer cells
JP6113850B2 (ja) がん性組織の治療およびがん性腫瘍の再発および転移を予防するための医薬組成物の調製のためのヘモグロビン系酸素運搬体の使用方法
BR112012029975B1 (pt) peptídeo e composição farmacêutica como medicamento
US20220389060A1 (en) Synthetic peptide sp2 and application thereof
Cannavo et al. Prothymosin alpha protects cardiomyocytes against ischemia-induced apoptosis via preservation of Akt activation
Vismara et al. Platelet-derived extracellular vesicles regulate cell cycle progression and cell migration in breast cancer cells
CN108103026A (zh) 用于肿瘤免疫治疗的γδ-T细胞外泌体及其制备方法
Shi et al. Kaji-ichigoside F1 and rosamultin protect vascular endothelial cells against hypoxia-induced apoptosis via the PI3K/AKT or ERK1/2 signaling pathway
Pia Pescarolo et al. A retro‐inverso peptide homologous to helix 1 of c‐Myc is a potent and specific inhibitor of proliferation in different cellular systems
Gao et al. Mitochondrion-targeted supramolecular “nano-boat” simultaneously inhibiting dual energy metabolism for tumor selective and synergistic chemo-radiotherapy
RU2435783C1 (ru) Химерный пептид и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний
CN107602670A (zh) 一种可拮抗ewsr1蛋白rna结合活性的多肽eip‑22及其应用
CN114605501B (zh) 一种可拮抗fus蛋白rna结合活性的多肽fip-21及其应用
WO2014163535A1 (ru) Химерный пептид и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний
US20230372529A1 (en) Mitochondria comprising anticancer drug and use thereof
JP5852731B2 (ja) 高増殖性疾患治療のための医薬組成物
CN113521080A (zh) Cx-5461在制备phf6突变的急性髓系白血病的药物中的应用
RU2369402C1 (ru) Химерный пептид для лечения эпителиальных и мезенхимальных злокачественных новообразований
RU2728870C2 (ru) Полипептиды для лечения онкологических заболеваний
Mohr KCa channels in breast cancer development, progression and response to endocrine and radiation therapy
WO2017024372A1 (pt) Processo para a produção de células tronco embrionárias símile de carrapatos (acari: ixodidae), composição, seus usos e método de diagnóstico
Abouleisa et al. Transient Cell Cycle Induction in Cardiomyocytes to Treat Ischemic Heart Failure

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14778337

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2016506285

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014778337

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014778337

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP