WO2012133733A1 - がん細胞増殖抑制剤 - Google Patents

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WO2012133733A1
WO2012133733A1 PCT/JP2012/058514 JP2012058514W WO2012133733A1 WO 2012133733 A1 WO2012133733 A1 WO 2012133733A1 JP 2012058514 W JP2012058514 W JP 2012058514W WO 2012133733 A1 WO2012133733 A1 WO 2012133733A1
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WO
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group
compound
cancer
formula
reaction
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PCT/JP2012/058514
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English (en)
French (fr)
Inventor
博久 矢野
幸子 小笠原
幸吉 鈴木
豊一 平沼
博幸 葛原
Original Assignee
学校法人久留米大学
Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/045—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates
    • A61K31/047—Hydroxy compounds, e.g. alcohols; Salts thereof, e.g. alcoholates having two or more hydroxy groups, e.g. sorbitol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent that suppresses the growth of cancer cells.
  • Liver cancer is a general term for malignant tumors that occur in the liver.
  • Primary liver cancer that originates in the liver and metastatic liver cancer that has metastasized to other livers. Divided.
  • Primary liver cancer is further classified by tissue type, most of which is hepatocellular carcinoma (omaHCC).
  • omaHCC hepatocellular carcinoma
  • This hepatocellular carcinoma is a cancer that arises from hepatocytes, which are the parenchyma of the liver, and is said to account for about 90% of primary liver cancer in Japan.
  • Many of the causes are caused by hepatitis C.
  • hepatitis B, NASH, alcoholic hepatitis, and the cause are unknown.
  • the number of deaths from liver cancer is over 30,000 every year in Japan (Non-Patent Document 1).
  • Non-patent Document 2 Treatment of liver cancer is centered on three therapies: surgery, puncture therapy (percutaneous ethanol injection therapy, radiofrequency ablation therapy, etc.), and hepatic artery embolization.
  • surgery percutaneous ethanol injection therapy, radiofrequency ablation therapy, etc.
  • radiation therapy administration of anticancer drugs.
  • anticancer drugs there are no anticancer drugs whose treatment effects have been clearly demonstrated in pharmacotherapy for liver cancer in Japan, so chemotherapy is often used as an adjunct. From such a medical situation, a new drug that is clinically safe and effective against liver cancer is strongly demanded (Non-patent Document 2).
  • Conventional anti-cancer drugs have been selected as drugs that have a strong effect of killing cancer cells using cytotoxicity as an index. Therefore, the gastrointestinal mucosa and hair root cells, which are highly proliferative tissues in the living body, are greatly damaged, and their therapeutic effects are limited by these side effects.
  • Patent Documents 1 and 2 compounds having an inhibitory action on hepatocyte necrosis and an antiviral action are known as triterpene derivatives (Patent Document 3).
  • the present invention has been made in view of the above-described problems of the prior art, and provides a cancer growth inhibitor that suppresses cell growth with high selectivity for cancer cells, particularly liver cancer cells. Objective.
  • the present inventors have found a specific triterpene derivative having a selective growth inhibitory effect on a liver cancer cell line that retains the properties of primary cancer. Completed the invention.
  • a cancer cell proliferation inhibitor comprising a triterpene derivative represented by the following general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • R 1 represents a carboxyl group or a hydroxymethyl group
  • R 2 represents a benzyl group, a C 1-6 alkyl group, or a C 2-6 alkenyl group optionally substituted with a hydroxymethyl group. Or a C 2-6 alkynyl group.
  • a cancer treatment comprising administering a therapeutically effective amount of the cancer cell growth inhibitor according to [1] to a patient in need of cancer treatment by inhibiting the growth of cancer cells. Method.
  • the cancer cell growth inhibitor of the present invention contains a triterpene derivative represented by the general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. Since these triterpene derivatives can exhibit excellent cancer cell growth inhibition when administered in an effective amount, they exhibit a high therapeutic effect on liver cancer.
  • Examples of the active ingredient in the cancer cell proliferation inhibitor of the present invention include triterpene derivatives represented by the following general formula (I) or pharmaceutically acceptable salts thereof. These triterpene derivatives exhibit an excellent inhibitory effect on cancer cell proliferation by administering an effective amount.
  • R 1 is a carboxyl group and R 2 is a benzyl group optionally substituted with a hydroxymethyl group, a C 1-6 alkyl group, A compound representing a C 2-6 alkenyl group or a C 2-6 alkynyl group.
  • the “benzyl group optionally substituted with a hydroxymethyl group” represented by R 2 may be any position when the benzyl group is substituted, but the 4-position is substituted with a hydroxymethyl group The benzyl group being preferred is preferred.
  • the “C 1-6 alkyl group” represented by R 2 means a linear or branched alkyl group having 1 to 6, preferably 1 to 4 carbon atoms. Specific examples thereof include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-propyl group, n-butyl group, isobutyl group, t-butyl group and the like. Among them, a methyl group and an ethyl group are preferable. More preferably, a methyl group is mentioned.
  • the “C 2-6 alkenyl group” represented by R 2 means a linear or branched alkenyl group having 2 to 6, preferably 2 to 4 carbon atoms.
  • the “C 2-6 alkynyl group” represented by R 2 means a linear or branched alkynyl group having 2 to 6 carbon atoms, preferably 2 to 4 carbon atoms.
  • Specific examples thereof include 2-propynyl group, 1-methyl-2-propynyl group, 2-butynyl group, 3-butynyl group and the like. Of these, a 2-propynyl group is preferable.
  • R 1 is a hydroxymethyl group
  • R 2 is a benzyl group optionally substituted with a hydroxymethyl group, C 1-6
  • the “benzyl group optionally substituted with a hydroxymethyl group” represented by R 2 may be any position when the benzyl group is substituted, but the 4-position is substituted with a hydroxymethyl group The benzyl group being preferred is preferred.
  • the “C 1-6 alkyl group” represented by R 2 means a linear or branched alkyl group having 1 to 6, preferably 1 to 4 carbon atoms. Specific examples thereof include methyl group, ethyl group, propyl group, isopropyl group, n-propyl group, n-butyl group, isobutyl group, t-butyl group and the like. Among them, a methyl group and an ethyl group are preferable. More preferably, a methyl group is mentioned.
  • the “C 2-6 alkenyl group” represented by R 2 means a linear or branched alkenyl group having 2 to 6, preferably 2 to 4 carbon atoms.
  • the “C 2-6 alkynyl group” represented by R 2 means a linear or branched alkynyl group having 2 to 6 carbon atoms, preferably 2 to 4 carbon atoms.
  • Specific examples thereof include 2-propynyl group, 1-methyl-2-propynyl group, 2-butynyl group, 3-butynyl group and the like. Of these, a 2-propynyl group is preferable.
  • triterpene derivative of the formula (I) in the present invention include compounds having combinations of substituents shown in Table 1 (hereinafter also referred to as “compounds 1 to 6”). It is not limited to these compounds.
  • “suppression of cancer cell proliferation” refers to stopping the progression of cancer cell proliferation and shrinking the tumor.
  • the present invention shows a remarkable effect in suppressing the growth of hepatoma cells in the liver, particularly among cancer cells.
  • the growth inhibitory activity of the cancer cell growth inhibitor of the present invention can be confirmed by the following method.
  • the method of the present inventors has been established independently from a plurality of patients with liver cancer, and exhibits growth inhibitory activity using a liver cancer cell line that is strictly maintained so that the initial properties are maintained. It is to confirm.
  • the cell lines established by the present inventors are KIM-1, KYN-1, KYN-2, KYN-3, HAK-1A, HAK-1B, HAK-2, HAK-3, HAK-4, HAK-5 and HAK-6 are both cell lines established and maintained from hepatocellular carcinoma tissue (In Vitro Cell Dev Biol 1986; 22: 637-46, Acta Patho; Jpn 1988; 38: 953-66, Hum Cell 1997; 10: 183-92, Hepatology 1993; 18: 320-327).
  • hepatoma cell lines are morphologically similar to the patient's hepatocellular carcinoma tissue, and functionally mRNA levels of albumin in 9 out of 11 strains, alpha-fetoprotein ( ⁇ -fetoprotein, AFP) ) was observed in all 11 strains, and at the protein level, the expression of cytokeratin (CK) 18, which is a cytoskeleton expressed in hepatocytes, was also confirmed in all cell lines. From these results, it can be said that the above 11 cell lines retain the properties of hepatocellular carcinoma cell lines in form and function.
  • liver stem (progenitor) cell markers or liver cancer cancer stem cell markers (CK7, CK19, CD133, ABCG2, etc.) at the mRNA and protein levels.
  • CK7, CK19, CD133, ABCG2, etc. liver cancer cancer stem cell markers
  • IFN interferon
  • hepatocellular carcinoma cell lines are morphologically similar to the patient's hepatocellular carcinoma tissue and functionally contain albumin and ⁇ -fetoprotein at the mRNA level and cytokeratin (CK) at the protein level.
  • CK cytokeratin
  • IC50 A compound effective for liver cancer can be evaluated by an index such as “50% growth inhibitory concentration”.
  • the poorly differentiated hepatocellular carcinoma line HAK-4 established from cancerous ascites of patients with end-stage cancer expresses CK19, which is said to be a marker indicating poor prognosis of hepatocellular carcinoma.
  • cancer stem cells have recently attracted attention as important treatment targets for overcoming treatment resistance in cancer treatment (Gastroenterology). 2009; 136: 1012-24), the positive cell rate of EpCAM reported as one of the cancer stem cell markers for hepatocellular carcinoma is 79%, which is also high in biological malignancy. It shows.
  • the KYN-2 strain which was established from poorly differentiated hepatocellular carcinoma tissue from surgically resected cancer patients, is a fast-growing and highly tumorigenic strain in nude mice. A high success rate is also achieved with intrahepatic transplantation.
  • the KYN-2 strain is highly metastatic, exhibits high metastasis by intra-hepatic and intra-splenic transplantation, and has a very high production of PIVKA-II, which is widely used as a tumor marker for hepatocellular carcinoma. It is a feature.
  • This strain has moderate sensitivity to IFN growth inhibition (Acta Pathol Jpn. 1988 Aug; 38 (8): 953-66.).
  • the HAK-1B strain established from a poorly differentiated hepatocellular carcinoma tissue within a hepatocellular carcinoma nodule showing a nodule within the nodule surgically excised from a cancer patient, expresses a poor prognostic marker, CK19.
  • the positive cell rate of CD133 reported as one of the cancer stem cell markers of hepatocellular carcinoma is recognized to be about 10%, and it is a cell line with high biological malignancy.
  • the HAK-1B strain grows rapidly and shows almost 100% nude mouse transplantability. However, this strain is relatively sensitive to the anti-proliferative action of IFN and causes apoptosis (Hepatology. 1993; 18: 320-327.).
  • the poorly differentiated type here refers to a state in which there is a large gap from normal cells and tissue construction in the pathological observation of the tissue.
  • a preferred method for producing the triterpene derivative represented by the general formula (I) of the present invention is as follows. In the following production method, it is desirable that a functional group not involved in the reaction is protected, and a known protective group for protecting the functional group can be used. These facts will be apparent to those skilled in the art.
  • a compound of formula (II) (which can be synthesized by the method described in Chem. Pharm. Bull., 36.153 (1988)) and a compound of formula (III) (wherein X and Y Are halogen atoms, which may be the same or different, in the presence of a base to produce a compound of formula (IV).
  • the reaction is carried out in a solvent that does not participate in the reaction (for example, chloroform, dichloromethane, diethyl ether, THF, benzene, toluene, DMF, DMSO or the like alone or in a mixed solvent) at a temperature in the range of ⁇ 78 ° C. to 100 ° C.
  • the base examples include pyridine, triethylamine, 4-dimethylaminopyridine, sodium hydride, potassium hydride, n-butyllithium, NaCH 2 SOCH 3 , tert-BuOK, tert-BuONa, and the like.
  • the base and the compound of the formula (III) are desirably used in the range of 1 to 10 equivalents relative to the compound of the formula (II).
  • the compound of formula (IV) is treated with an appropriate base to perform a halogen-metal exchange reaction, and then reacted with DMF to produce compound (V).
  • the reaction is carried out in a solvent not involved in the reaction (for example, tetrahydrofuran, diethyl ether, 1,4-dioxane, anisole, dimethoxyethane, dichloromethane, toluene or the like alone or in a mixed solvent) at a temperature in the range of ⁇ 78 ° C. to 30 ° C. To be implemented.
  • Examples of the base that can be used include n-butyllithium, sec-butyllithium, tert-butyllithium, ethylmagnesium bromide, isopropylmagnesium bromide and the like.
  • the base and DMF are desirably used in the range of 1 to 10 equivalents relative to the compound of formula (IV).
  • the compound represented by formula (Ia) can be produced by hydrolyzing the compound represented by formula (V) in the presence of an acid.
  • the solvent used in this reaction include methanol, ethanol, propanol, water, dichloromethane, chloroform, and THF alone or a mixed solvent.
  • the acid include mineral acids such as hydrochloric acid and sulfuric acid, or Lewis acids such as BF 3 ⁇ OEt 2 . The reaction is carried out at a temperature ranging from 0 ° C to 100 ° C.
  • Examples of the solvent used in the first step include methanol, ethanol, THF, chloroform, dichloromethane and the like alone or a mixed solvent.
  • the reaction is carried out at a temperature in the range of ⁇ 40 ° C. to 30 ° C.
  • Examples of the reducing agent include lithium aluminum hydride, sodium borohydride, lithium borohydride and the like, and it is desirable to use in the range of 1 to 10 equivalents relative to the compound of formula (V).
  • the second step can be performed according to the method described in the third step of the method (A).
  • a compound of formula (II) and a compound of formula (VI): R 3c Y (wherein R 3c is as defined above and Y is a halogen atom) are present in the presence of a base.
  • the compound of formula (VII) is prepared by reacting under: The reaction is carried out in a solvent that does not participate in the reaction (for example, chloroform, dichloromethane, diethyl ether, THF, benzene, toluene, DMF, DMSO, etc. alone or in a mixed solvent) at a temperature in the range of ⁇ 78 ° C. to 100 ° C.
  • the base examples include pyridine, triethylamine, 4-dimethylaminopyridine, sodium hydride, potassium hydride, n-butyllithium, NaCH 2 SOCH 3 , tert-BuOK, tert-BuONa, and the like.
  • the base and the compound of formula (VI) are desirably used in an amount of 1 to 10 equivalents relative to the compound of formula (II).
  • the second step can be performed according to the method described in the third step of the method (A).
  • a compound of the formula (Id) (wherein R 3d is a C 1-6 alkyl group, a C 2-6 alkenyl group or a C 2-6 alkynyl group, or a benzyl group) can be produced by the following method.
  • a compound of formula (XIII) (which can be synthesized by the method described in the specification of Japanese Patent No. 3279574, the specification of Japanese Patent No. 3727353, or Bioorganic & Medicinal Chemistry, 13, 4900 (2005)). Conversion to the compound of formula (XIV) by oxidation.
  • Usable oxidizing agents are (1) pyridinium chloroformate, (2) pyridinium dichromate, (3) manganese dioxide, (4) tetra-n-propylammonium perruthenate and N-methylmorpholine-N-oxide.
  • DMSO oxidation reagents such as a combination of dimethyl sulfoxide (DMSO) and oxalyl chloride, and the like.
  • the oxidizing agent is preferably used in the range of 2 to 10 equivalents relative to the compound of formula (XIII).
  • the oxidation reaction can be carried out in a solvent that does not participate in the reaction (for example, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, THF, etc.) at a temperature in the range of ⁇ 78 ° C. to 40 ° C.
  • the resulting carboxylic acid is protected with a usual protecting group in the third step, whereby the compound of formula (XV) (wherein PG 1 Represents a normal protecting group for a carboxyl group, where the normal protecting group for a carboxyl group is Protective Groups in Organic Synthesis (Theodora W. Greene, Peter GM Wuts, John Wiley & Sons, Inc.). And is well known to those skilled in the art. More preferably, PG 1 includes methyl, ethyl, benzyl groups, etc.).
  • Examples of the oxidizing agent that can be used for the oxidation reaction in the second step include pyridinium dichromate, Jones reagent, potassium permanganate, sodium chlorite, and the like, and 1 to 30 equivalents of the compound of formula (XIV). It is preferably used in a range.
  • the oxidation reaction is carried out in a solvent that does not participate in the reaction (for example, DMF, tert-butanol, acetone, water or the like alone or in a mixed solvent) at a temperature ranging from 0 ° C to 60 ° C.
  • the conditions for protecting the carboxylic acid in the third step vary depending on the type of protecting group used.
  • PG 1 is a methyl, ethyl, or benzyl group
  • 1 to 10 equivalents of PG 1 Y (where Y is a halogen atom) is used with respect to the compound of formula (XIV), and 1 equivalent
  • a base eg, potassium carbonate, sodium carbonate, cesium carbonate, sodium hydride, etc.
  • a solvent that does not participate in the reaction eg, toluene, benzene, THF, DMF, DMSO, etc.
  • the reaction can be carried out at a temperature in the range of ° C.
  • the formula (XV) is reduced by a normal reduction reaction and converted into a compound of the formula (XVI).
  • the solvent used in the reduction reaction include methanol, ethanol, THF, chloroform, dichloromethane, and the like alone or a mixed solvent.
  • the reaction is carried out at a temperature in the range of ⁇ 78 ° C. to 30 ° C.
  • the reducing agent include lithium aluminum hydride, sodium borohydride, lithium borohydride, diisobutylaluminum hydride and the like, and should be used in the range of 1 to 10 equivalents relative to the compound of formula (XV). Is desirable.
  • PG 1 of the compound of formula (XVI) is removed by the usual deprotection conditions for the protecting group of the carboxyl group to produce the compound of formula (Id).
  • the deprotection conditions for removing the protecting group vary depending on the kind of the protecting group used.
  • a base eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium hydroxide, barium hydroxide, tert-BuOK, etc.
  • a polar solvent for example, methanol, ethanol, propanol, water or the like alone or in a mixed solvent
  • a polar solvent for example, methanol, ethanol, propanol, water or the like alone or in a mixed solvent
  • PG 1 is benzyl
  • it can be carried out by catalytic reduction using 0.1 to 0.5 equivalents of a catalyst (for example, palladium carbon, palladium black, palladium hydroxide, etc.).
  • the reaction can be carried out in a solvent that does not participate in the reaction (for example, methanol, ethanol, THF, dioxane, dichloromethane, chloroform, water) under a hydrogen atmosphere of usually 1 to 4 atm at room temperature.
  • the compound of formula (XVII) is oxidized and converted to the compound of formula (XVIII) by the method described in the first step of method (D).
  • PG 2 represents a normal protecting group for a hydroxyl group.
  • the “ordinary protecting group for a hydroxyl group” is the one described in Protective Groups in Organic Synthesis (Theodora W. Greene, Peter GM Wuts, John Wiley & Sons, Inc.).
  • PG 2 is preferably benzyl.
  • the compound of the formula (XVII) can be synthesized by the method described in the specification of Japanese Patent No. 3279574, the specification of Japanese Patent No. 3727353, or Bioorganic & Medicinal Chemistry, 13, 4900 (2005).
  • the compound is oxidized and converted to the compound of formula (XIX) by the method described in the second step of method (D).
  • the protecting group is removed under the usual conditions for deprotecting the protecting group of the hydroxyl group to produce the compound of formula (Ie).
  • the deprotection conditions for removing the hydroxyl protecting group in the third step vary depending on the type of protecting group used. For example, when PG 2 is benzyl, deprotection can be carried out by catalytic reduction using 0.1 to 0.5 equivalents of a catalyst (eg, palladium carbon, palladium black, palladium hydroxide, etc.). .
  • the reaction can be carried out in a solvent that does not participate in the reaction (for example, methanol, ethanol, THF, dioxane, dichloromethane, chloroform, water) under a hydrogen atmosphere of usually 1 to 4 atm at room temperature.
  • a solvent that does not participate in the reaction for example, methanol, ethanol, THF, dioxane, dichloromethane, chloroform, water
  • the triterpene derivative of the present invention represented by the above (I) can exist as a salt.
  • the triterpene derivative of the present invention can be easily converted into a salt by allowing a pharmaceutically acceptable base to act according to a usual method.
  • a pharmaceutically acceptable base for example, an inorganic base such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, aluminum hydroxide, sodium carbonate, potassium carbonate, or sodium bicarbonate, or an organic base such as piperazine, morpholine, piperidine, ethylamine, or trimethylamine should be used. Can do.
  • the cancer cell growth inhibitor of the present invention can be orally administered as a dosage form such as a capsule, a microcapsule, a tablet, a granule, a fine granule, or a powder. It can also be administered parenterally (for example, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, intraperitoneal administration, rectal administration, transdermal administration) in the form of a conventional pharmaceutical preparation.
  • a pharmaceutically acceptable carrier can be added to the above dosage form.
  • Examples of pharmaceutically acceptable carriers include excipients, fillers, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, Pharmaceutical additives such as preservatives, flavoring agents, soothing agents and stabilizers can be mentioned.
  • Each dosage form can be manufactured by a conventional method.
  • Specific additives include, for example, lactose, fructose, glucose, starch, gelatin, magnesium carbonate, synthetic magnesium silicate, talc, magnesium stearate, crystalline cellulose, methylcellulose, carboxymethylcellulose or a salt thereof, gum arabic, polyethylene glycol Syrup, petrolatum, glycerin, ethanol, propylene glycol, citric acid, sodium chloride, sodium sulfite, sodium phosphate and the like.
  • the dosage form, administration method, dosage, administration period, administration route, etc. of the cancer cell growth inhibitor of the present invention can be appropriately set depending on, for example, the patient's weight, age, symptom level, and the like.
  • the cancer cell proliferation inhibitor of the present invention is administered orally or parenterally, for example, in an amount of 1 to 1000 mg per day divided into one or more times.
  • the dosage is preferably 5 to 800 mg per day.
  • the triterpene derivative or pharmaceutically acceptable salt described in the general formula (I) is highly cell-selective with respect to cancer cells, particularly hepatoma cells, as shown in Examples below. Proliferation can be suppressed. Therefore, the present invention takes an aspect of a method for using a triterpene derivative or a pharmaceutically acceptable salt described in the general formula (I) for producing a medicament for use in the treatment of cancer by inhibiting the growth of cancer cells. obtain.
  • the dosage form or the pharmaceutically acceptable carrier is appropriately selected to treat cancer.
  • the drug used for the preparation can be produced.
  • the cancer cell proliferation inhibitor of the present invention can inhibit cell proliferation with high action selectivity with respect to cancer cells, particularly hepatoma cells, as shown in Examples described later. Therefore, the present invention provides a cancer treatment comprising administering a therapeutically effective amount of the cancer cell growth inhibitor of the present invention to a patient in need of cancer treatment by inhibiting the growth of cancer cells. A method aspect is also possible.
  • the dosage form, administration method, dose, administration period, administration route, etc. of the cancer cell growth inhibitor are appropriately designed / designed according to, for example, the patient's weight, age, symptom grade, etc. You can choose.
  • the obtained residue was dissolved in 8.5 ml of methylene chloride, 521 mg of molecular sieves, 408 mg of 4-methylmorpholine N-oxide, and 30 mg of tetra-N-propylammonium perruthenate were added and stirred at room temperature for 20 minutes.
  • the obtained residue was dissolved in 450 ml of DMF and heated to 45 ° C. After adding 5.0 g of 60% sodium hydride and stirring for 1 hour, 22 g of benzyl bromide was added and stirred for 16 hours. After cooling to room temperature, 2 L of ethyl acetate and 3 L of water were added and the phases were separated. The organic layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, the inorganic salt was filtered off, and the solvent was concentrated under reduced pressure.
  • Example 6 For compound 1 prepared according to the method described in WO 97/03088 and compounds 2 to 6 obtained in Examples 1 to 5, in vitro and in vivo (In The growth inhibitory effect on hepatocellular carcinoma growth in vivo and the cell growth inhibitory effect on normal cultured cell lines were examined as follows.
  • ⁇ Inhibition of growth inhibition of hepatocellular carcinoma in vitro Eleven hepatocellular carcinoma cell lines established and maintained in the Department of Pathology, Kurume University School of Medicine (KIM-1, KYN-1, KYN-2, KYN-3, HAK-1A, HAK-1B, HAK-2, HAK-3, HAK-4, HAK-5, HAK-6) were used to examine the cancer growth inhibitory effect.
  • Cell culture was performed using DMEM medium containing fetal bovine serum 2.5%, penicillin 100 U / mL and streptomycin 100 ⁇ g / mL.
  • hepatocellular carcinomas (1.5-6.5 ⁇ 10 3 cells / well) was inoculated into a 96-well plate and cultured for 24 hours, and then Compound 1 was administered at various concentrations (0.078125, 0.15625, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5 and 10 ⁇ M) were added to the plate or replaced with non-added medium. Compound 1 was added using a DMSO solution so that the final concentration was 0.1%.
  • Compound 1 exhibits a growth inhibitory effect on liver cancer cells from the culture time of 24 hours (addition time of Compound 1), and its 50% growth inhibitory concentration is around 1 ⁇ M. Met. This effect was the same even when the culture time (compound 1 addition time) was 48 and 72 hours.
  • HAK-1B cells were transplanted subcutaneously into nude mice at 1000 ⁇ 10 4 cells / mouse, and after 7 days, the tumor diameter was measured, then divided into 3 groups (8 mice / group) and administration of Compound 1 was started (0 The growth inhibitory effect of Compound 1 administration was investigated over 15 days.
  • the groups were a control group not administered with Compound 1 (negative control group (compound 1 non-administration group), PEG-IFN ⁇ positive control group (positive control group (PEG-IFN ⁇ administration group)) and compound 1 single administration group.
  • PEG-IFN ⁇ is administered twice a week by 1920 IU / mouse / 100 ⁇ l medium / day subcutaneously, Compound 1 is mixed, and 1 g of mouse food is mixed with 1.5 mg of Compound 1 (0.15 wt%). It was prepared and used for administration, and the tumor diameter was measured after the start of administration of Compound 1. The results obtained are shown in FIG.
  • Compound 1 showed a growth-inhibitory effect on the liver cancer model transplanted subcutaneously in nude mice, and decreased the tumor volume by about 40% in 15 days from the start of administration. It was.
  • ⁇ Cell growth inhibitory effect on normal cell lines Place the cell suspension (approx. 1-5000 cells / 100 ⁇ L) in a 96-well plate, incubate for 24 hours at 37 ° C. under 5% CO 2 , add 100 ⁇ L medium and 2 ⁇ L of Compound 1 solution, and further incubate for 72 hours did.
  • DMSO was used as the solvent for Compound 1, and the final concentration of DMSO was adjusted to 0.1% in all groups.
  • 20 ⁇ L / well of Alamar Blue reagent was added to the cell culture medium, and fluorescence intensity (excitation wavelength: 530 nm, fluorescence wavelength: 590 nm) was measured after 6 hours of incubation.
  • Glioma-derived cells U-87 MG and melanoma-derived cells SK-MEL-5 were cultured using a minimum essential medium containing 10% fetal bovine serum.
  • the ovarian cancer-derived cell OVCAR-3 was cultured using RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2 IU / mL bovine insulin. Further, RPMI 1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum was used for leukemia cells HL-60.
  • Colorectal cancer-derived HCT-116 is McCoy's supplemented with 10% fetal bovine serum. Culturing was performed using 5A medium.
  • the cancer growth inhibitor of the present invention is excellent in that it can suppress cell growth with high action selectivity against liver cancer cells, it is particularly useful for the treatment of liver cancer. .

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Abstract

　下記一般式（Ｉ）で示されるトリテルペン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するがん細胞増殖抑制剤。 ［式（Ｉ）中、Ｒ１は、カルボキシル基又はヒドロキシメチル基を表し、Ｒ２は、ヒドロキシメチル基で置換されていてもよいベンジル基、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ２－６アルケニル基又はＣ２－６アルキニル基を表す。］

Description

がん細胞増殖抑制剤
　本発明は、がん細胞の増殖を抑制する治療薬に関する。
　肝がんは、肝臓に発生する悪性腫瘍の総称であり、肝臓が発生元である原発性肝がんと、他臓器で発生したがんが肝臓に転移した転移性肝がんの二つに分けられる。原発性肝がんはさらに組織型によって分類され、その大部分は肝細胞がん(hepatocellular carcinoma; ＨＣＣ)である。この肝細胞がんは肝臓の実質である肝細胞から発生するがんであり、日本では原発性肝がんの約９０％を占めるとされる。その原因の多くがＣ型肝炎によるものであり、以下、Ｂ型肝炎、ＮＡＳＨ、アルコール性肝炎、原因不詳となっている。肝がんでの死亡者数は日本国内で毎年３万人以上となっている（非特許文献１）。
　肝がんの治療は、外科療法、穿刺療法（経皮的エタノール注入療法、ラジオ波焼灼療法など）、肝動脈塞栓術の３療法が中心である。この他に、放射線療法や化学療法（抗がん剤投与）などがある。現状では国内における肝がんに対する薬物療法で、治療効果が明確に証明された抗がん剤はないことから、化学療法は補助的に使用されることが多い。このような医療状況から、肝がんに対して臨床的に安全でかつ有効な新たな薬剤が強く求められている（非特許文献２）。
　従来の抗がん剤は、細胞障害性を指標にがん細胞を死滅させる効果が強い化合物を薬剤として選択してきた。そのため、生体において増殖性の高い組織である胃腸粘膜や毛根細胞などへの障害も大きく、これらの副作用から治療効果が限定されている。
　一方、近年の抗がん剤探索は、がん増殖機構における分子ターゲットを対象とした方法が汎用されてきているが、十分高い有効性と低い副作用を実現した薬剤は限られている（非特許文献３）。
　トリテルペンの骨格を有する化合物については、主に植物から多様な化合物が見出されており、各種の生物活性を有することが報告されている。また、トリテルペンの誘導体として、肝細胞の壊死に対する抑制作用（特許文献１および２）や抗ウイルス作用を有する化合物が知られている（特許文献３）。
　抗がん活性を有するトリテルペンとして、ブメリア属植物から抽出した化合物が抗ガン作用及び免疫増強作用を有することが知られている（特許文献４）。しかし、この化合物では治療効果を示した実験データは、ヒト前骨髄性白血病細胞HL-60に対する増殖抑制作用のみであり、それ以外のがんに効果があるか、何も明らかにしていない。また、マンサク科植物から抽出したトリテルペン化合物は、殺がん細胞活性及び発がんプロモーション抑制活性を有することが開示されている（特許文献５）。しかし、肝臓がんへの効果は明らかにしていない。これらの報告を含めて、トリテルペンおよびその誘導体については、通常の培養細胞株を用いた抗がん活性を評価するに留まっている。
　がんの研究において、株化がん細胞の使用は不可欠であり、通常、専門業者や細胞バンクから株を入手するのが一般的である。しかし、細胞株はその特性として継代培養を繰り返すうちに形態・生物学的性状が樹立当初のものから変化することが多く、従って、同じ名称の細胞株でも決して同じ形態や性状であるとは限らず、同一名称の細胞株を使用したとしても実施施設により実験結果が食い違うことも稀ではない。
　このため株化がん細胞を用いた場合、開発中の化合物について、抗がん活性を正確に評価できているとは言えず、実際の臨床において、抗がん活性の効果を確認できない場合もある。従って、評価化合物の抗がん活性を正確に評価するためには、原発がんの形態・性状を保持した細胞株を用いることが重要である。
　また、従来の抗がん剤では副作用が強すぎて、がん細胞のみならず、正常細胞までも障害を受けるため、結果的に治癒できない場合もある。よって、従来の抗がん剤に代わる、副作用の少ない薬剤の開発が望まれている。
　このように、正常細胞には細胞障害性を示すことなく、対象のがんに特異的な増殖機構に対して作用する薬剤の開発が望まれている。
国際公開第９７／３０８８号 国際公開第９７／３１０１４号 国際公開第２００８／００４６５３号 特開２００４－２３１５５９号公報 特開２００４－３４６０２７号公報
岡上武　編、「肝がん撲滅のために」、社団法人　日本肝臓学会、２００７年１２月１日発行 池田健次、「肝細胞がんの最新治療」、日本臨床、２０１０年、６８巻、１１２９～１１３６ページ 曽根三郎ら、「がん分子標的治療」、日本臨床、２０１０年、６８巻、９９７～１００６ページ
　本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、がん細胞、特に肝がん細胞に対して作用選択性高く細胞増殖を抑制するがん増殖抑制剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、原発がんの性質を保持した肝がん細胞株に対して選択的に増殖抑制効果を有する特定のトリテルペン誘導体を見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、下記発明を提供するものである。
［１］　下記一般式（Ｉ）で示されるトリテルペン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するがん細胞増殖抑制剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
［式（Ｉ）中、Ｒ１は、カルボキシル基又はヒドロキシメチル基を表し、Ｒ２は、ヒドロキシメチル基で置換されていてもよいベンジル基、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ２－６アルケニル基又はＣ２－６アルキニル基を表す。］
［２］　がん細胞の増殖抑制によるがんの治療に用いる薬剤を製造するための前記一般式（Ｉ）で示されるトリテルペン誘導体又は薬学的に許容される塩の使用方法。
［３］　［１］に記載のがん細胞増殖抑制剤を、がん細胞の増殖抑制によるがんの治療が必要な患者に、治療上の有効量を投与することを含む、がんの治療方法。
　本発明のがん細胞増殖抑制剤は、一般式（Ｉ）で示すトリテルペン誘導体または薬学的に許容されるその塩を有効成分とする。これらのトリテルペン誘導体は、有効量で投与することにより、優れたがん細胞増殖抑制を示すことが可能であるため、肝がんに対して、高い治療効果を示す。
化合物１を投与してから２４時間後の１１種類の肝細胞がん細胞株におけるがん増殖抑制効果を示したグラフである。 化合物２を投与してから７２時間後の３種類の肝細胞がん細胞株におけるがん増殖抑制効果を示したグラフである。 化合物３を投与してから７２時間後の３種類の肝細胞がん細胞株におけるがん増殖抑制効果を示したグラフである。 化合物４を投与してから７２時間後の３種類の肝細胞がん細胞株におけるがん増殖抑制効果を示したグラフである。 化合物５を投与してから７２時間後の３種類の肝細胞がん細胞株におけるがん増殖抑制効果を示したグラフである。 化合物６を投与してから７２時間後の３種類の肝細胞がん細胞株におけるがん増殖抑制効果を示したグラフである。 インビボ（In vivo）での化合物１による腫瘍の抑制効果を示したグラフである。
　本発明のがん細胞増殖抑制剤における有効成分としては、下記一般式（Ｉ）で示すトリテルペン誘導体または薬学的に許容されるその塩が挙げられる。これらのトリテルペン誘導体は、有効量を投与することにより、がん細胞増殖に対する優れた抑制効果を示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　本発明のトリテルペン誘導体の好ましい態様は、前記一般式（Ｉ）において、Ｒ１がカルボキシル基であって、Ｒ２がヒドロキシメチル基で置換されていてもよいベンジル基、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ２－６アルケニル基又はＣ２－６アルキニル基を表す化合物である。ここで、Ｒ２が表す「ヒドロキシメチル基で置換されていてもよいベンジル基」は、ベンジル基が置換されている場合、その置換位置はどの位置でもよいが、４位がヒドロキシメチル基で置換されているベンジル基が好ましい。また、Ｒ２が表す「Ｃ１－６アルキル基」とは、直鎖または分岐鎖状の炭素数１～６、好ましくは炭素数１～４のアルキル基を意味する。その具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔ－ブチル基などが挙げられる。その中で、好ましくはメチル基、エチル基が挙げられる。より好ましくはメチル基が挙げられる。また、Ｒ２が表す「Ｃ2－６アルケニル基」とは、直鎖または分岐状の炭素数２～６、好ましくは炭素数２～４のアルケニル基を意味する。その具体例としてはビニル基、アリル基、１－プロペニル基、イソプロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基、２－メチル－１－プロペニル基などが挙げられる。その中でも好ましくはアリル基が挙げられる。またＲ２が表す「Ｃ２－６アルキニル基」とは、直鎖または分岐状の炭素数２～６、好ましくは炭素数２～４のアルキニル基を意味する。その具体例としては、２－プロピニル基、１－メチル－２－プロピニル基、２－ブチニル基、３－ブチニル基などが挙げられる。その中でも、好ましくは２－プロピニル基が挙げられる。
　本発明のトリテルペン誘導体の他の好ましい態様は、前記一般式（Ｉ）において、Ｒ１がヒドロキシメチル基であって、Ｒ２がヒドロキシメチル基で置換されていてもよいベンジル基、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ２－６アルケニル基またはＣ２－６アルキニル基を表す化合物である。ここで、Ｒ２が表す「ヒドロキシメチル基で置換されていてもよいベンジル基」は、ベンジル基が置換されている場合、その置換位置はどの位置でもよいが、４位がヒドロキシメチル基で置換されているベンジル基が好ましい。また、Ｒ２が表す「Ｃ１－６アルキル基」とは、直鎖または分岐鎖状の炭素数１～６、好ましくは炭素数１～４のアルキル基を意味する。その具体例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｔ－ブチル基などが挙げられる。その中で、好ましくはメチル基、エチル基が挙げられる。より好ましくはメチル基が挙げられる。また、Ｒ２が表す「Ｃ2－６アルケニル基」とは、直鎖または分岐状の炭素数２～６、好ましくは炭素数２～４のアルケニル基を意味する。その具体例としてはビニル基、アリル基、１－プロペニル基、イソプロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基、３－ブテニル基、２－メチル－１－プロペニル基などが挙げられる。その中でも好ましくはアリル基が挙げられる。またＲ２が表す「Ｃ２－６アルキニル基」とは、直鎖または分岐状の炭素数２～６、好ましくは炭素数２～４のアルキニル基を意味する。その具体例としては、２－プロピニル基、１－メチル－２－プロピニル基、２－ブチニル基、３－ブチニル基などが挙げられる。その中でも、好ましくは２－プロピニル基が挙げられる。
　さらに、本発明における式（Ｉ）のトリテルペン誘導体の具体例としては、表１に示される置換基の組み合わせを有する化合物（以下、「化合物１～６」とも称する）が挙げられるが、本発明はこれらの化合物に限定されるものではない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明において、「がん細胞増殖抑制」とは、がん細胞の増殖の進行を止め、腫瘍を縮小させることをいう。本発明ではがん細胞のうち、特に肝臓の肝がん細胞の増殖抑制に顕著な効果を示す。
　本発明のがん細胞増殖抑制剤の増殖抑制活性は、次の方法で確認することができる。すなわち、本発明者らの方法は、複数の肝がんの患者から独自に樹立し、初期の性状が維持されるよう厳密に維持管理している肝がん細胞株を用いて増殖抑制活性を確認するものである。本発明者らが樹立した細胞株である、KIM-1, KYN-1, KYN-2, KYN-3, HAK-1A, HAK-1B, HAK-2, HAK-3, HAK-4,
HAK-5, HAK-6については、いずれも肝細胞がん組織から樹立・維持してきた細胞株である（In Vitro
Cell Dev Biol 1986; 22:637-46、Acta Patho; Jpn 1988;
38:953-66、Hum Cell 1997; 10:183-92, Hepatology 1993;
18:320-327）。これらの肝がん細胞株は、形態的に患者の肝細胞がん組織と類似した形態を示し、機能的にもmRNAレベルでアルブミンを11株中9株に、アルファフェトプロテイン（α-fetoprotein、AFP)を11株全株で発現を認め、更に、蛋白レベルでは、肝細胞に発現する細胞骨格であるサイトケラチン（CK）18の発現も全ての細胞株で確認している。この結果より、上記の11の細胞株は形態及び機能的に肝細胞がん細胞株としての性状を保持しているといえる。更に、最近の検討により、11株に、肝臓の幹(前駆)細胞のマーカーあるいは肝癌の癌幹細胞のマーカー（CK7, CK19, CD133, ABCG2など）の多彩な発現もmRNAや蛋白レベルで確認している。種々の肝細胞癌特異的分子の発現に加え、抗腫瘍薬やインターフェロン（IFN）に対する反応性やIFNのレセプターの発現レベルも異なり、肝癌細胞の多様性をこれらの株はまさに反映しており、肝癌に対する薬物の反応を検討するには最適な材料と推察される。
　これらの肝がん細胞株の中で、HAK-4、KYN-2およびHAK-1Bの３つの細胞株については、肝細胞がんとしての性質を保持しつつ、生物学的悪性度が高い細胞株である。これらの肝細胞がん細胞株は、形態的に患者の肝細胞がん組織と類似した形態を示し、機能的にもmRNAレベルでアルブミンやα-fetoproteinなどを、蛋白レベルでサイトケラチン（CK）18などの肝細胞がん特異的分子の発現を確認している。
　これらの肝細胞がん細胞株を用いて、その増殖に対する効果を検討することにより、例えば、培養時に化合物を共存させて細胞数を1/2とするのに必要な化合物濃度である「IC50：50％増殖抑制濃度」等の指標により、肝がんに有効な化合物を評価することができる。
　末期がん患者のがん性腹水から樹立した低分化型肝細胞がん株HAK-4は、肝細胞がんの予後不良を示すマーカーと言われているCK19を発現している。更に、最近、がん治療において治療抵抗性克服のための重要な治療対象としてがん幹細胞（cancer stem cell）が注目されているが（Gastroenterology
2009; 136:1012-24）、肝細胞がんのがん幹細胞のマーカーの一つとして報告されているEpCAMの陽性細胞率が79％と非常に高いことも、その生物学的悪性度の高さを示している。また、肝細胞がんの発生・再発予防に有効で、最近では５－フルオロウラシル（5-fluorouracil）と併用で進行肝がんの治療にも用いられるIFNの増殖抑制作用にも非常に抵抗性で、アポトーシスを生じることはない（J Interferon Cytokine Res 2007; 27:507-16）。
　また、手術切除されたがん患者の低分化型の肝細胞がん組織から樹立されたKYN-2株は、増殖が速く、ヌードマウスにおける造腫瘍性が高い株であり、皮下移植のみならず肝内移植でも高い成功率が得られる。そして、KYN-2株は、高転移性であり、肝内や脾内移植により高転移性を示し、肝細胞がんの腫瘍マーカーとして汎用されているPIVKA-IIの産生が非常に高いことも特徴である。この株のIFNの増殖抑制作用に対する感受性は中程度である（Acta Pathol Jpn. 1988 Aug;38(8):953-66.）。
　さらに、がん患者から手術切除された結節内結節像を示す肝細胞がん結節の内部の低分化型肝細胞がん組織より樹立されたHAK-1B株は、予後不良マーカーのCK19を発現しており、更に肝細胞がんのがん幹細胞のマーカーの一つとして報告されているCD133の陽性細胞率が10％程度に認められ、生物学的悪性度が高い細胞株である。HAK-1B株は、増殖は速く、ほぼ100％のヌードマウス皮下への可移植性を示す。しかし、この株はIFNの増殖抑制作用に対する感受性は比較的高く、アポトーシスを生じる（Hepatology.
1993;18:320-327.）。
　なお、ここでいう低分化型とは、組織の病理観察において、正常の細胞や組織構築との隔たりが大きい状態をいう。
　これらの肝細胞がん株は、厳格な管理が必要であることから、自己寄託として取扱い、本出願人が分譲を担保する。
　本発明の一般式（Ｉ）で表されるトリテルペン誘導体の好ましい製造法は、次の通りである。なお、以下の製造法において、反応に関与しない官能基は保護されていることが望ましく、官能基の保護のための保護基としては公知のものを利用することができる。これら事実は、当業者には明らかである。
　＜方法（Ａ）＞
　一般式（Ｉ）で示されるトリテルペン誘導体のうち、式（Ｉａ）の化合物は、下記の方法により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　まず、第一工程において、式（ＩＩ）の化合物（Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．，３６．１５３（１９８８）に記載の方法により合成可能）と、式（ＩＩＩ）の化合物（式中、ＸおよびＹはハロゲン原子であり、同一または異なっていてもよい)とを、塩基存在下で反応させることにより、式（ＩＶ）の化合物を製造する。反応は、反応に関与しない溶媒（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ベンゼン、トルエン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの単独あるいは混合溶媒）中において、－７８℃～１００℃の範囲の温度で実施される。使用可能な塩基としては、例えばピリジン、トリエチルアミン、４－ジメチルアミノピリジン、水素化ナトリウム、水素化カリウム、ｎ－ブチルリチウム、ＮａＣＨ２ＳＯＣＨ３、ｔｅｒｔ－ＢｕＯＫ、ｔｅｒｔ－ＢｕＯＮａなどが挙げられる。塩基および式（ＩＩＩ）の化合物は、式（ＩＩ）の化合物に対して１～１０当量の範囲で用いられることが望ましい。
　次に、第二工程において、式（ＩＶ）の化合物を適当な塩基で処理しハロゲン－メタル交換反応を行った後に、ＤＭＦと反応させることにより化合物（Ｖ）を製造する。反応は反応に関与しない溶媒（例えば、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、１，４－ジオキサン、アニソール、ジメトキシエタン、ジクロロメタン、トルエンなどの単独あるいは混合溶媒）中において、－７８℃～３０℃の範囲の温度で実施される。使用可能な塩基としては、例えばｎ－ブチルリチウム、ｓｅｃ－ブチルリチウム、ｔｅｒｔ－ブチルリチウム、エチルマグネシウムブロマイド、イソプロピルマグネシウムブロマイドなどが挙げられる。塩基およびＤＭＦは、式（ＩＶ）の化合物に対して１～１０当量の範囲で用いられることが望ましい。
　次に、第三工程において、式（Ｖ）で表される化合物を、酸存在下、加水分解反応することにより式（Ｉａ）で表される化合物を製造することができる。この反応に用いられる溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、水、ジクロロメタン、クロロホルム、またはＴＨＦなどの単独あるいは混合溶媒などが挙げられる。酸としては、例えば、塩酸および硫酸などの鉱酸、またはＢＦ３・ＯＥｔ２などのルイス酸などが挙げられる。反応は、０℃～１００℃の範囲の温度で実施される。
　＜方法（Ｂ）＞
　一般式（Ｉ）で示されるトリテルペン誘導体のうち、式（Ｉｂ）の化合物は、まず、第一工程において、式（Ｖ）の化合物を適当な還元剤と反応させ、次いで、第二工程において、加水分解反応を行うことにより製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　第一工程に用いる溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ＴＨＦ、クロロホルム、ジクロロメタンなどの単独あるいは混合溶媒などが挙げられる。反応は、－４０℃～３０℃の範囲の温度で実施される。また、還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウムなどが挙げられ、式（Ｖ）の化合物に対して１～１０当量の範囲で用いられることが望ましい。第二工程は、上記方法（Ａ）の第三工程に記載の方法に従って行うことができる。
　＜方法（Ｃ）＞
　一般式（Ｉ）で示されるトリテルペン誘導体のうち、式（Ｉｃ）の化合物（式中、Ｒ３ｃはＣ２－６アルキニル基である）は、下記の方法により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　まず、第一工程において、式（ＩＩ）の化合物と、式（ＶＩ）の化合物：Ｒ３ｃＹ（式中、Ｒ３ｃは前記と同義であり、Ｙはハロゲン原子である)とを、塩基存在下で反応させることにより、式（ＶＩＩ）の化合物を製造する。反応は、反応に関与しない溶媒（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、ＴＨＦ，ベンゼン、トルエン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどの単独あるいは混合溶媒）中において、－７８℃～１００℃の範囲の温度で実施される。使用可能な塩基としては、例えば、ピリジン、トリエチルアミン、４－ジメチルアミノピリジン、水素化ナトリウム、水素化カリウム、ｎ－ブチルリチウム、ＮａＣＨ２ＳＯＣＨ３、ｔｅｒｔ－ＢｕＯＫ、ｔｅｒｔ－ＢｕＯＮａなどが挙げられる。塩基および式（ＶＩ）の化合物は、式（ＩＩ）の化合物に対して１～１０当量の範囲で用いられることが望ましい。第二工程は、上記方法（Ａ）の第三工程に記載の方法に従って行うことができる。
　＜方法（Ｄ）＞
　一般式（Ｉ）で示されるトリテルペン誘導体のうち、式（Ｉｄ）の化合物（式中、Ｒ３ｄはＣ１－６アルキル基、Ｃ２－６アルケニル基またはＣ２－６アルキニル基、またはベンジル基である）は、下記の方法により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　まず、第一工程において、式（ＸＩＩＩ）の化合物（特許第３２７９５７４号の明細書、特許第３７２７３５３号の明細書、またはＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３，４９００（２００５）に記載の方法などにより合成可能）を酸化することにより、式（ＸＩＶ）の化合物に変換する。使用可能な酸化剤としては、（１）ピリジニウムクロロメート、（２）ピリジニウムダイクロメート、（３）二酸化マンガン、（４）テトラ－ｎ－プロピルアンモニウムペルルテナートとＮ－メチルモルホリン－Ｎ－オキサイドの組合せ、（５）ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）とオギザリルクロライドの組合せなどのＤＭＳＯ酸化試剤、などが挙げられる。酸化剤は、式（ＸＩＩＩ）の化合物に対して２～１０当量の範囲で用いることが好ましい。酸化反応は、反応に関与しない溶媒（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、ＴＨＦなど）中において、－７８℃～４０℃の範囲の温度で実施できる。
　次いで、第二工程において、式（ＸＩＶ）の化合物を酸化した後、生じたカルボン酸を、第三工程において、通常の保護基で保護することにより、式（ＸＶ）の化合物（ここでＰＧ１は、カルボキシル基の通常の保護基を表す。ここでカルボキシル基の通常の保護基とは、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔｈｅｏｄｏｒａ　Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｅｔｅｒ　Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ著、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．出版）に記載のものを示すものであり当業者においては周知である。さらに好ましくは、ＰＧ１はメチル、エチル、ベンジル基などが挙げられる。）に変換する。第二工程の酸化反応に使用可能な酸化剤としては、ピリジニウムダイクロメート、Ｊｏｎｅｓ試薬、過マンガン酸カリウム、亜塩素酸ナトリウムなどが挙げられ、式（ＸＩＶ）の化合物に対して１～３０当量の範囲で用いられることが好ましい。酸化反応は、反応に関与しない溶媒（例えば、ＤＭＦ、ｔｅｒｔ－ブタノール、アセトン、水などの単独あるいは混合溶媒）中で、０℃～６０℃の範囲の温度で実施される。第三工程のカルボン酸の保護の条件は、用いる保護基の種類によって異なる。保護は、例えば、ＰＧ１がメチル、エチル、ベンジル基の場合、式（ＸＩＶ）の化合物に対して１当量から１０当量のＰＧ１Ｙ（ここでＹはハロゲン原子である）を用い、１当量から過剰量の塩基（例えば、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸セシウム、水素化ナトリウムなど）の存在下、反応に関与しない溶媒（例えば、トルエン、ベンゼン、ＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなど）中で室温～１００℃の範囲の温度で反応させることにより実施できる。また、ＰＧ１がメチルの場合、式（ＸＩＶ）の化合物に対して１当量～１０当量のトリメチルシリルジアゾメタンを用い、非極性溶媒とアルコール溶媒との混合溶媒（例えば、トルエンとメタノール、ベンゼンとメタノールなど）中で０℃～５０℃の範囲の温度で反応させることにより実施できる。
　次いで、第四工程において、式（ＸＶ）を通常の還元反応で還元し、式（ＸＶＩ）の化合物へと変換する。還元反応に用いる溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、ＴＨＦ、クロロホルム、ジクロロメタンなどの単独あるいは混合溶媒などが挙げられる。反応温度としては、－７８℃～３０℃の範囲の温度で実施される。また、還元剤としては、水素化リチウムアルミニウム、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ジイソブチルアルミニウムなどが挙げられ、式（ＸＶ）の化合物に対して１～１０当量の範囲で用いられることが望ましい。
　次いで、第五工程において、式（ＸＶＩ）の化合物のＰＧ１を、通常のカルボキシル基の保護基の脱保護の条件によって除去し、式（Ｉｄ）の化合物を製造する。この際、保護基の除去のための脱保護条件は、用いた保護基の種類によって異なる。脱保護は、例えば、ＰＧ１がメチル、エチル、ベンジルの場合、１当量から過剰量の塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化バリウム、ｔｅｒｔ－ＢｕＯＫなど）を用い、極性溶媒（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、水などの単独あるいは混合溶媒）中で０℃から１００℃の範囲の温度で反応させることにより実施される。また、ＰＧ１がベンジルの場合、０．１～０．５当量の触媒（例えば、パラジウム炭素、パラジウム黒、水酸化パラジウムなど）を用い、接触還元することにより実施することができる。反応は、反応に関与しない溶媒（例えば、メタノール、エタノール、ＴＨＦ、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、水）中において、通常１～４気圧の水素雰囲気下、室温において実施することができる。
　＜方法（Ｅ）＞
　一般式（Ｉ）で示されるトリテルペン誘導体のうち、式（Ｉe）の化合物（式中、Ｒ３ｅはＣ１－６アルキル基、Ｃ２－６アルケニル基またはＣ２－６アルキニル基である）は、下記の方法によっても製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　まず、第一工程において式（ＸＶＩＩ）の化合物を、方法（Ｄ）の第一工程に記載の方法により酸化し、式（ＸＶＩＩＩ）の化合物へと変換する。式（ＸＶＩＩ）の化合物において、ＰＧ２は水酸基の通常の保護基を表す。「水酸基の通常の保護基」とは、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｔｈｅｏｄｏｒａ　Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｅｔｅｒ　Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ著、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．出版）に記載のものを示す。この反応において、ＰＧ２は、好ましくはベンジルである。式（ＸＶＩＩ）の化合物は、特許第３２７９５７４号の明細書、特許第３７２７３５３号の明細書、またはＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３，４９００（２００５）に記載の方法などにより合成可能である。
　次いで、第二工程において、方法（Ｄ）の第二工程に記載の方法により酸化して式（ＸＩＸ）の化合物へと変換する。
　次いで、第三工程において、通常の水酸基の保護基の脱保護の条件によって保護基を除去し、式（Ｉe）の化合物を製造する。第三工程の水酸基の保護基の除去のための脱保護の条件は用いた保護基の種類によって異なる。脱保護は、例えば、ＰＧ２がベンジルの場合、０．１～０．５当量の触媒（例えば、パラジウム炭素、パラジウム黒、水酸化パラジウムなど）を用い、接触還元することにより実施することができる。反応は、反応に関与しない溶媒（例えば、メタノール、エタノール、ＴＨＦ、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、水）中において、通常１～４気圧の水素雰囲気下、室温において実施することができる。
　上記（Ｉ）で表される本発明のトリテルペン誘導体は、塩として存在することができる。本発明のトリテルペン誘導体に対して、通常の方法に従って製薬学的に許容される塩基を作用させることにより、容易に塩とすることができる。塩基としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩基、あるいはピペラジン、モルホリン、ピペリジン、エチルアミン、トリメチルアミンなどの有機塩基を使用することができる。
　本発明のがん細胞増殖抑制剤は、例えば、カプセル剤、マイクロカプセル剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、粉末などの剤形として、経口投与することができる。また、慣用の医薬製剤の形で非経口（例えば、静注、筋注、皮下投与、腹腔内投与、直腸投与、経皮投与）投与することもできる。上記の剤形には、薬学的に許容される担体を添加することができる。薬学的に許容される担体としては、例えば、賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などの医薬品添加剤が挙げられる。各剤形は常法により製造することができる。具体的な添加剤としては、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖、でん粉、ゼラチン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはその塩、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、シロップ、ワセリン、グレセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
　本発明のがん細胞増殖抑制剤の剤形、投与方法、投与量、投与期間、投与経路などは、例えば、患者の体重、年齢、症状の程度などによって適宜設定することができる。本発明のがん細胞増殖抑制剤は、例えば、１日１～１０００ｍｇを１回あるいは複数回に分けて、経口または非経口投与される。投与量は、好ましくは、１日５～８００ｍｇである。
　また、一般式（Ｉ）に記載のトリテルペン誘導体又は薬学的に許容される塩は、後述の実施例において示す通り、がん細胞に対して、特に肝がん細胞に対して作用選択性高く細胞増殖を抑制することができる。したがって、本発明は、がん細胞の増殖抑制によるがんの治療に用いる薬剤を製造するための一般式（Ｉ）に記載のトリテルペン誘導体又は薬学的に許容される塩の使用方法という態様をとり得る。
　なお、かかる一般式（Ｉ）に記載のトリテルペン誘導体又は薬学的に許容される塩の使用の際には、前記剤形や前記薬学的に許容される担体等を適宜選択し、がんの治療に用いる薬剤を製造することができる。
　さらに、本発明のがん細胞増殖抑制剤は、後述の実施例において示す通り、がん細胞に対して、特に肝がん細胞に対して作用選択性高く細胞増殖を抑制することができる。したがって、本発明は、本発明のがん細胞増殖抑制剤を、がん細胞の増殖抑制によるがんの治療が必要な患者に、治療上の有効量を投与することを含む、がんの治療方法という態様もとり得る。
　なお、かかる治療において、がん細胞増殖抑制剤の剤形、投与方法、投与量、投与期間、投与経路などは、前述の通り、例えば、患者の体重、年齢、症状の程度などによって適宜設計・選択することができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。また、前記表１に示した化合物１（２２β－メトキシオレアン－１２－エン－３β，２４（４β）－ジオール）は国際公開第９７／０３０８８号（特許文献１）明細書に記載の化合物２７の製造方法に従って製造した。前記表１に示したその他の化合物（化合物２～６）については、以下に示す方法により、製造した。
　（実施例１）
　２２β－（２－プロピニルオキシ）オレアン－１２－エン－３β，２４－ジオール（化合物２）の製造方法
　（ステップ１）
　２２β－（２－プロピニルオキシ）－３β，２４－イソプロピリデンジオキシオレアン－１２－エンの合成
　２２β－ヒドロキシ－３β，２４－イソプロピリデンジオキシオレアン－１２－エン２０３ｍｇをＤＭＦ４ｍｌに溶解し、６０％水素化ナトリウム１６２ｍｇを加え、室温で１５分間撹拌した。テトラ－Ｎ－ブチルアンモニウムヨージド１５１ｍｇと、プロパルギルブロミド０．３１ｍｌを加え、室温で３日間撹拌した。水で反応を停止し、反応溶液を酢酸エチルで希釈後、セライトを用いて不溶物を濾去した。濾液を飽和塩化アンモニウム水溶液で洗浄し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。無機塩を濾別し、溶媒を減圧濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開系、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝４９：１）で精製し、表題化合物を３１ｍｇ（収率１４％）得た。
　1H-NMR(CDCl3)
0.88(3H,s),0.91(3H,s),0.99(3H,s),1.01(3H,s),1.12(3H,s),1.16(3H,s),1.22(3H,s),1.38(3H,s),1.44(3H,s),0.82-2.19(21H,m),2.35(1H,t,J=2.4Hz),3.18(1H,dd,J=3.2,6.6Hz),
3.23(1H,d,J=11.5Hz),3.46(1H,dd,J=4.4,9.3Hz),4.04(1H,d,J=11.5Hz),4.06(1H,dd,J=2.4,16.1Hz),4.19(1H,dd,J=2.4,16.1Hz),5.24(1H,t-like).
　MS　FAB(m/z):559(M+Na)+。
　（ステップ２）
　２２β－（２－プロピニルオキシ）オレアン－１２－エン－３β，２４－ジオール（化合物２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　２２β－（２－プロピニルオキシ）－３β，２４－イソプロピリデンジオキシオレアン－１２－エン１７９ｍｇをクロロホルム１．８ｍｌとメタノール１．８ｍｌの混液に溶解し、１規定塩酸水溶液９０μｌを加え、室温で２０分撹拌した。反応を飽和重曹水で停止し、反応溶液をクロロホルムで希釈後、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸マグネシウムで乾燥後、無機塩を濾別し、溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開系、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝４：１～７：３）で精製し、化合物２を１２５ｍｇ（収率７５％）得た。
　1H-NMR(CDCl3)
0.87(3H,s),0.89(3H,s),0.90(3H,s),0.94(3H,s),1.00(3H,s),1.11(3H,s),1.25(3H,s),
0.83-1.88(20H,m),2.11(1H,m),2.34(1H,dd,J=4.2,11.0Hz),2.35(1H,t,J=2.4Hz),
2.68(1H,m),3.18(1H,dd,J=3.2,6.8Hz),3.35(1H,m),3.44(1H,m),4.06(1H,dd,J=2.4,15.8Hz),4.17(1H,dd,J=2.4,15.8Hz),4.22(1H,m),5.22(1H,t-like).
　MS　FAB(m/z):519(M+Na)+。
　(実施例２)
　２２β－（４－ヒドロキシメチルベンジルオキシ）オレアン－１２－エン－３β，２４－ジオール（化合物３）の製造方法
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　２２β－（４－ホルミルベンジルオキシ）－３β，２４－イソプロピリデンジオキシオレアン－１２－エン１５２ｍｇをメタノール１．２ｍｌとＴＨＦ２．４ｍｌに溶解し、氷冷下、水素化ほう素ナトリウム９．９ｍｇを加え、１０分間撹拌した。その後、１規定塩酸水溶液１ｍｌを加え、室温まで昇温し、２０分間撹拌した。飽和重曹水で反応を停止後、反応溶液をクロロホルムで希釈し、飽和食塩水で洗浄した。水層をクロロホルムで２回抽出後、併せた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した。無機塩を濾別し、溶媒を減圧濃縮後、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開系、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝３：２～１：１）で精製し、化合物３を１１５ｍｇ（収率８０％）得た。
　1H-NMR(CDCl3)
0.89(6H,s),0.93(3H,s),0.94(3H,s),1.04(3H,s),1.11(3H,s),1.25(3H,s),
0.83-1.88(21H,m),2.15(1H,m),
2.35(1H,dd,J=4.2,11.0Hz),2.69(1H,m),
3.18(1H,dd,J=2.9,6.1Hz),3.35(1H,m),3.47(1H,m),4.20(1H,m),4.30(1H,d,J=11.9Hz),4.61(1H,d,J=11.9Hz),4.68(2H,d,J=6.1Hz),5.22(1H,t-like),7.33(4H,s).
　MS　FAB(m/z):601(M+Na)+。
　（実施例３）
　２２β－ベンジルオキシオレアン－１２－エン－３β－ヒドロキシ－２４―オイックアシッド（化合物４）の製造方法
　（ステップ１）
　２２β－ベンジルオキシ－３－オキソオレアン－１２－エン－２４―オイックアシッド　メチルエステルの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　２２β－ベンジルオキシ－３β，２４－イソプロピリデンジオキシオレアン－１２－エン５０４ｍｇ（特許第３２７９５７４号の明細書に記載の方法により合成）のクロロホルム５ｍｌとメタノール５ｍｌ溶液に１規定塩酸水溶液０．５ｍｌを加え、室温で３０分間撹拌した。飽和重曹水で反応を停止後、反応溶液を飽和食塩水で希釈し、クロロホルムで３回抽出した。併せた有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、無機塩を濾別し、溶媒を減圧濃縮した。
　得られた残渣を塩化メチレン８．５ｍｌで溶解し、モレキュラーシーブス４Å５２１ｍｇと４－メチルモルホリンＮ－オキシド４０８ｍｇと、テトラ－Ｎ－プロピルアンモニウム　ペルルテナート３０ｍｇを加え、室温で２０分間撹拌した。反応溶液をそのままシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開系、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝４９：１）で精製しアルデヒド体を得た。このアルデヒド体はそのまま次の反応に用いた。
　アルデヒドをＴＨＦ４．３ｍｌと２－メチルプロパノール４．３ｍｌに溶解後、２－メチル－２－ブテン０．４５ｍｌを加えた。リン酸二水素ナトリウム・二水和物２１０ｍｇと亜塩素酸ナトリウム１４７ｍｇの水２．１ｍｌ溶液を加え、室温で４０分間撹拌した。さらにリン酸二水素ナトリウム・２水和物１００ｍｇと亜塩素酸ナトリウム７２ｍｇの水１ｍｌ溶液を加え、室温で２０分間撹拌した。反応を飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液で停止後、反応溶液を希塩酸と酢酸エチルで希釈した。分液後、有機層を水と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウム水溶液で乾燥した。無機塩を濾別後、溶媒を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開系、メタノール：クロロホルム＝１：９９～１：４５）で精製し、カルボン酸体を得た。このカルボン酸体はそのまま次の反応に用いた。
　カルボン酸のトルエン８ｍｌとメタノール２ｍｌ溶液にトリメチルシリルジアゾメタン（０．６Ｍ、ヘキサン溶液）２．１ｍｌを加え、室温で１０分間撹拌した。溶媒を減圧濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開系、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝９９：１～９７：３）で精製し表題化合物を３６１ｍｇ（収率７３％、４工程）得た。
　1H-NMR(CDCl3)
0.89(3H,s),0.94(3H,s),1.04(6H,s),1.07(3H,s),1.10(3H,s),1.37(3H,s),
0.89-2.05(18H,m),2.17(1H,m),2.36(1H,m),2.95(1H,ddd,J=6.3,14.6,14.6Hz),
3.08(1H,dd,J=2.7,6.3Hz),3.68(3H,s),4.32(1H,d,J=11.7Hz),4.62(1H,d,J=11.7Hz),5.24(1H,t-like),7.24-7.35(5H,m).
　MS　FAB(m/z):575(M++1)。
　（ステップ２）
２２β－ベンジルオキシオレアン－１２－エン－３β－ヒドロキシ－２４－オイックアシッド　メチルエステルの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　２２β－ベンジルオキシ－３－オキソオレアン－１２－エン－２４－オイックアシッド　メチルエステル２３８ｍｇのＴＨＦ４．１ｍｌとメタノール１ｍｌ溶液を－７８℃に冷却後、水素化ほう素ナトリウム３３ｍｇを加えた。１．５時間かけて０℃まで昇温後、飽和塩化アンモニウム水溶液で反応を停止し、反応溶液を水で希釈した。酢酸エチルで抽出後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。無機塩を濾別後、溶媒を減圧濃縮し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開系、ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１９：１～９：１）で精製し表題化合物を２２８ｍｇ（収率９５％）得た。
　1H-NMR(CDCl3)
0.79(3H,s),0.89(3H,s),0.94(3H,s),0.98(3H,s),1.04(3H,s),1.11(3H,s),1.40(3H,s),
0.83-1.89(19H,m),2.03(1H,m),2.15(1H,m),3.06-3.12(2H,m),
3.35(1H,d,J=12.0Hz),3.68(3H,s),4.32(1H,d,J=12.0Hz),4.62(1H,d,J=12.0Hz),5.24(1H,t-like),7.23-7.35(5H,m).
　MS　FAB(m/z):577(M++1)。
　（ステップ３）
２２β－ベンジルオキシオレアン－１２－エン－３β－ヒドロキシ－２４―オイックアシッド（化合物４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　ｔｅｒｔ－ブトキシカリウム（１．０Ｍ、ＴＨＦ溶液）９．５ｍｌに水４２．４μｌと２２β－ベンジルオキシオレアン－１２－エン－３β－オール－２４－オイックアシッド　メチルエステル２１８ｍｇのＴＨＦ２ｍｌ溶液を順次加え、マイクロウェーブ反応装置を用いて、７５℃で１時間反応させた。室温まで冷却後、水と５規定塩酸水溶液を用いて酸性に調整し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウムで乾燥、無機塩を濾別した。溶媒を減圧濃縮後、得られた残渣をプレパラティブＴＬＣ（展開系、メタノール：クロロホルム＝３：９７）で精製し、化合物４を１１２ｍｇ（収率５２％）得た。
　1H-NMR(CDCl3)
0.90(3H,s),0.91(3H,s),0.94(3H,s),1.00(3H,s),1.04(3H,s),1.11(3H,s),1.48(3H,s),
0.85-1.90(19H,m),2.00(1H,m),2.15(1H,m),3.08(1H,m),3.15(1H,dd,J=4.2,12.1),
4.32(1H,d,J=12.0Hz),4.62(1H,d,J=12.0Hz),5.24(1H,m),7.26-7.35(5H,m).
　MS　ES(m/z):563(M++1)。
　（実施例４）
　２２β－アリルオキシオレアン－１２－エン－３β－ヒドロキシ－２４－オイックアシッド（化合物５）の製造方法
　（ステップ１）
　２２β－アリルオキシ－３－オキソオレアン－１２－エン－２４－オイックアシッド　メチルエステルの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　２２β－アリルオキシ－３β，２４－イソプロピリデンジオキシオレアン－１２－エン８１７ｍｇ（特許第３２７９５７４号の明細書に記載の方法により合成）を用いて、実施例３のステップ１と同様の方法を用いて、表題化合物を５５９ｍｇ（７０％、４工程）得た。
　1H-NMR(CDCl3)
0.89(3H,s),0.90(3H,s),1.01(3H,s),1.04(3H,s),1.07(3H,s),1.10(3H,s),1.37(3H,s),0.86-2.05(18H,m),2.12(1H,m),2.38(1H,ddd,J=2.3,4.6,14.6Hz),2.90-3.00(2H,m),
3.68(3H,s),3.80(1H,m),4.05(1H,m),5.11(1H,m),5.23-5.29(2H,m),5.90(1H,m).
　MS　FAB(m/z):525(M++1)。
　（ステップ２）
　２２β－アリルオキシオレアン－１２－エン－３β－ヒドロキシ－２４－オイックアシッド　メチルエステルの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　２２β－アリルオキシ－３－オキソオレアン－１２－エン－２４－オイックアシッド　メチルエステル５５７ｍｇを用いて、実施例３のステップ２と同様の方法により、表題化合物を５５１ｍｇ（９８％）得た。
1H-NMR(CDCl3)
0.79(3H,s),0.89(6H,s),0.98(3H,s),1.01(3H,s),1.11(3H,s),1.41(3H,s),0.82-1.89(19H,m),1.99(1H,m),2.09(1H,m),2.99(1H,dd,J=2.9,6.8Hz),3.09(1H,dt,4.4,12.0Hz),3.35(1H,d,J=12.0Hz),3.68(3H,s),3.79(1H,m),4.06(1H,m),5.11(1H,m),5.23-5.28(2H,m),5.90(1H,m).
　MS　FAB(m/z):527(M++1)。
　（ステップ３）
　２２β－アリルオキシオレアン－１２－エン－３β－ヒドロキシ－２４－オイックアシッド（化合物５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　２２β－アリルオキシオレアン－１２－エン－３β－オール－２４－オイックアシッド　メチルエステル５５０ｍｇを用いて、実施例３のステップ３と同様の方法により、化合物５を３２１ｍｇ（６０％）得た。
　1H-NMR(CDCl3)
0.89(6H,s),0.90(3H,s),1.00(3H,s),1.01(3H,s),1.12(3H,s),1.48(3H,s),
0.85-1.90(19H,m),2.01(1H,m),2.12(1H,m),2.99(1H,dd,J=2.9,6.8Hz),
3.15(1H,dd,J=4.2,11.7),3.80(1H,dd,J=5.4,13.0Hz),4.06(1H,dd,J=5.1,13.0Hz),5.10(1H,dd,J=1.5,10.5Hz),5.23-5.28(2H,m),5.90(1H,m).
　MS　ES(m/z):535(M+Na)+。
　（実施例５）
　３β－ヒドロキシ－２２β－メトキシオレアン－１２－エン－２４－オイックアシッド（化合物６）の製造方法
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　２２β－メトキシオレアン－１２－エン－３β，２４－ジオール　２０．０ｇ（特許第３２７９５７４号の明細書に記載の方法により合成）をピリジン２００ｍｌに溶解し、トリフェニルメチルクロライド１７．５ｇを加え、７５℃で２４時間攪拌した。室温まで冷却し、溶媒を減圧留去した後、残渣に水と酢酸エチル３５０ｍｌを加え、分液した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、無機塩を濾別し、溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をＤＭＦ４５０ｍｌに溶解し、４５℃に加温した。６０％水素化ナトリウム５．０ｇを加え、１時間攪拌した後にベンジルブロマイド２２ｇを加え１６時間攪拌した。室温まで冷却し、酢酸エチル２Ｌと水３Ｌを加え分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、無機塩を濾別し、溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開系、ベンゼン：ｎ－ヘキサン＝２：３）で精製し、３β－ベンジルオキシ－２２β－メトキシオレアン－２４－トリフェニルメチルオキシ－１２－エンを９．１ｇ得た。３β－ベンジルオキシ－２２β－メトキシオレアン－２４－トリフェニルメチルオキシ－１２－エン９．１ｇをアセトン３２ｍｌとメタノール１９０ｍｌの混液に溶解し、濃塩酸３２ｍｌを加え、２．５時間加熱還流した。反応溶液を冷却し２規定水酸化ナトリウム水溶液で中和後、溶媒を留去した。残渣に酢酸エチル７００ｍｌおよび水を加え分液し、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、無機塩を濾別し、溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開系、ベンゼン：ｎ－ヘキサン＝２０：１）で精製し、３β－ベンジルオキシ－２２β－メトキシオレアン－１２－エン－２４－オールを２．７ｇ得た。
　オギザリルクロライド３．６ｍｌを塩化メチレン８０ｍｌに溶解し、－６５℃に冷却後、１０分間攪拌した。３β－ベンジルオキシ－２２β－メトキシオレアン－１２－エン－２４－オール２．７ｇを塩化メチレン２３ｍｌに溶解した溶液を加え、さらに１．５時間攪拌した。反応溶液にトリエチルアミン１６ｍｌを加え、室温まで昇温させながら攪拌した。水５０ｍｌを加え、塩化メチレン４０ｍｌで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。その後、無機塩を濾別し、溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をｔ－ブタノール１５０ｍｌに溶解し、２－メチル－２－ブテン１６．７ｇを加え、３０℃まで加温した。この反応液にリン酸二水素ナトリウム２．９ｇと亜塩素酸ナトリウム２．７ｇを水１５ｍｌに溶解した溶液を３回に分けて加え、３０℃で２日間攪拌した。ｔ－ブタノールを減圧留去し、酢酸エチルに溶解させた後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。その後、無機塩を濾別し、溶媒を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開系、ヘキサン：酢酸エチル＝７：１）で精製し、３β－ベンジルオキシ－２２β－メトキシオレアン－１２－エン－２４－オイック酸２．７ｇを得た。３β－ベンジルオキシ－２２β－メトキシオレアン－１２－エン－２４－オイック酸２．７ｇを酢酸エチル７０ｍｌとエタノール４５ｍｌの混液に溶解し、水酸化パラジウム/C　０．９０ｇを加え、水素ガス雰囲気下、室温で４時間撹拌した。セライトろ過により触媒を濾別後、溶媒を濃縮し、得られた残渣に酢酸エチルを加えた。析出した固体を濾取し、化合物６を０．８５ｇ（収率４％）得た。
　1H-NMR(CDCl3)
0.86(3H,s),0.90(6H,s),1.00(6H,s),1.11(3H,s),1.31(1H,dd,J=3.0,13.9Hz),1.48(3H,s),0.88-2.12(20H,m),2.82(1H,dd,J=2.8,7.0Hz),3.15(1H,dd,J=4.4,12.4Hz),3.28(3H,s),
5.24(1H,dd,J=3.6,3.6Hz).
　MS　FAB(m/z):509(M++Na)。
　（実施例６）
　国際公開第９７／０３０８８号明細書に記載の方法に従って製造した化合物１及び実施例１～５で得られた化合物２～６について、インビトロ（In vitro）及びインビボ（In
vivo）における肝細胞がん増殖に対する増殖抑制効果、並びに通常の培養細胞株に対する細胞増殖抑制効果を下記の通り調べた。
　＜In vitroにおける肝細胞がん増殖に対する増殖抑制効果＞
　久留米大学医学部病理学教室で樹立・維持している肝細胞がん細胞株11株(KIM-1, KYN-1, KYN-2, KYN-3, HAK-1A,
HAK-1B, HAK-2, HAK-3, HAK-4, HAK-5, HAK-6)を用いて、がん増殖抑制効果を調べた。細胞培養は、ウシ胎児血清2.5%、ペニシリン100U/mLおよびストレプトマイシン100μg/mLを含有するDMEM培地を用いて行った。これらの各肝細胞がん(1.5～6.5×10３cells/well)を96穴プレートに接種し、24時間培養した後、化合物１を種々の濃度( 0.078125, 0.15625,
0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5および10μM)でプレートへ添加、あるいは非添加培地と交換した。なお、化合物１はDMSO溶液を用い、最終濃度が0.1%になるように加えた。24、48および72時間培養後に、３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）細胞増殖アッセイキット（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) Cell
Growth Assay Kits、Chemicom社製)を用い、生細胞数の測定を行った。得られた結果を図１に示す。同様に、化合物２～６の５化合物についても、0.02から20μMの濃度範囲で、72時間培養後の増殖抑制効果を調べた。得られた結果を図２～６に示す。なお、図１～６において、縦軸は各化合物非添加群の細胞数（コントロール）を１００％とした際の値（相対値）を示す。
　図１に示した結果から明らかなように、化合物１は肝がん細胞に対し、24時間の培養時間（化合物１の添加時間）から増殖抑制効果を示し、その50%増殖抑制濃度は1μM前後であった。この作用は培養時間（化合物１の添加時間）が48および72時間でも同様であった。
　また、化合物２～６の５化合物については、KYN-2、HAK-1B、HAK-4の3肝がん細胞株について細胞増殖抑制効果を検討したところ、図２～６に示した結果から明らかなように、いずれの細胞に対しても効果を示した。
　＜In vivoにおけるヌードマウスを用いた肝がん増殖に対する増殖抑制効果＞
　HAK-1B細胞を1000×10４cells/mouseでヌードマウスの皮下に移植し、7日後に腫瘍径を計測した後、3群（8匹/群）に分け、化合物１の投与を開始（0日）し、化合物１の投与による増殖抑制効果を15日に渡り、調べた。群としては、化合物１を投与しない対照群（陰性対照群（化合物１非投与群）、PEG-IFNαの陽性対照群（陽性対照群（PEG-IFNα投与群）および化合物１単独投与群とした。PEG-IFNαは1920 IU/mouse/100μl medium/day 皮下投与で週2回投与し、化合物１は混餌投与とし、1gのマウス用餌に1.5mgの化合物１（0.15重量%)を混和した餌を調製して投与に用いた。化合物１の投与開始から経過観察を行い、腫瘍径を計測した。得られた結果を図７に示す。
　図７に示した結果から明らかなように、化合物１はヌードマウスの皮下へ移植した肝がんモデルに対して、増殖抑制効果を示し、腫瘍体積を投与開始から15日で約40%減少させた。
　＜通常の培養細胞株に対する細胞増殖抑制効果＞
　細胞懸濁液（約1-5000細胞/100μL）を96穴プレートに入れ、37℃、5%CO２下で24時間培養後に100μLの培地と化合物１の溶液2μLを加えて、さらに72時間培養した。化合物１の溶媒としてはDMSOを用い、すべての群でDMSOの最終濃度が0.1%になるように調製した。細胞数の指標として、細胞培養液に20μL/wellのアラマーブルー（Alamar Blue）試薬を入れ、6時間インキュベーション後に蛍光強度（励起波長530nm、蛍光波長590nm）を測定した。そして、化合物１を添加した直後の測定値を基準（0％）に、対照群における72時間培養後の細胞数を100％とし、化合物１添加72時間時点の測定値を比較することにより、相対的な細胞数を算出した。化合物1を1μMまたは10μM作用させたときの結果を表２に示す。なお、試験に用いた各細胞とその細胞の培養に用いた培地および血清等の組成を以下に示す。
　グリオーマ由来細胞U－87 MG、メラノーマ由来細胞SK－MEL－5は、10%のウシ胎児血清含有の最小必須培地（Minimum Essential Medium）を用いて培養した。また、卵巣がん由来細胞OVCAR-3は、10%のウシ胎児血清および0.2 I.U/mLのウシインスリンを添加したRPMI 1640培地を用いて培養した。さらに、白血病細胞HL-60は、10%のウシ胎児血清を添加したRPMI 1640培地を用いた。そして、大腸がん由来HCT－116は、10％ウシ胎児血清を添加したMcCoy’s
5A 培地を用いて培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　表２に示した結果から明らかなように、今回検討したいずれの５種類の細胞株に対しても、化合物１は細胞増殖抑制効果は示さなかった。なお図表には示さないが、陽性対照の化合物として同時に評価したマイトマイシンについては、いずれの細胞株に対してもIC50濃度が0.2μM以下と、強い増殖阻害活性を示した。
　以上説明したように、本発明によれば、がん細胞の増殖を抑制することが可能となる。したがって、本発明のがん増殖抑制剤は、肝がん細胞に対して作用選択性高く細胞増殖を抑制することができるという点において優れているため、特に肝がんの治療等に有用である。

Claims (3)

  1. 　下記一般式（Ｉ）で示されるトリテルペン誘導体又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するがん細胞増殖抑制剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式（Ｉ）中、Ｒ１は、カルボキシル基又はヒドロキシメチル基を表し、Ｒ２は、ヒドロキシメチル基で置換されていてもよいベンジル基、Ｃ１－６アルキル基、Ｃ２－６アルケニル基又はＣ２－６アルキニル基を表す。］
  2. 　がん細胞の増殖抑制によるがんの治療に用いる薬剤を製造するための前記一般式（Ｉ）で示されるトリテルペン誘導体又は薬学的に許容される塩の使用方法。
  3. 　請求項１に記載のがん細胞増殖抑制剤を、がん細胞の増殖抑制によるがんの治療が必要な患者に、治療上の有効量を投与することを含む、がんの治療方法。
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