WO2012115102A1 - タンパク質の植物細胞内への蓄積方法 - Google Patents

タンパク質の植物細胞内への蓄積方法 Download PDF

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いくこ 西村
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    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon

Definitions

  • the present invention relates to a method for accumulating a protein in a specific organelle in a plant cell, and a transformed plant produced by the method.
  • Non-Patent Document 1 It can be transferred and accumulated in a place called an organelle or an extracellular region (apoplast) (see Non-Patent Document 1).
  • apoplast extracellular region
  • Non-Patent Document 2 there is a technique in which a gene encoding a target protein is introduced into the chloroplast genome itself to perform gene expression to protein accumulation in the chloroplast (see Non-Patent Document 2).
  • protein bodies, ER bodies, and the like are known as intracellular organelles that specifically accumulate proteins (see Non-Patent Document 3).
  • the protein body is localized only in the seeds of the plant, and the ER body is localized only in the seedlings of the scorpionae plant including Brassicaceae.
  • the ER body dysplasia mutant has a dysfunctional mutation in the nai2 gene, and the ER body is formed by introducing a wild-type nai2 gene into the mutant.
  • protein bodies and ER bodies are not suitable as storage organs for mass production of proteins, because the plant species, timing, and organs in which they are formed are limited.
  • An object of the present invention is to provide a method for stably accumulating a target protein in plant cells and plants, and a transformed plant in which the protein is accumulated.
  • the present inventors have been able to form an ER body by introducing the nai2 gene into plants other than the Lepidoptera Brassicaceae, It was found that the protein can be accumulated in the ER body by expressing a protein added with an intracellular membrane transition signal peptide and an ER retention signal peptide in the formed plant, thereby completing the present invention.
  • the present invention (1) A method for accumulating proteins in plant cells, A gene encoding a protein having an ER body-forming function and a gene encoding a target protein having an intracellular translocation signal peptide at the N-terminus and an ER retention signal peptide at the C-terminus are co-located in the plant cell.
  • a method for accumulating a protein in a plant cell wherein the target protein or a protein lacking the N-terminal region of the target protein is accumulated in an ER body formed in the plant cell by expressing the protein; (2) The method for accumulating the protein according to (1) above in a plant cell, wherein the protein having the ER body-forming function is a polypeptide selected from any of the following (a) to (d): (A) a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, (B) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an ER body-forming function; (C) a polypeptide having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an ER body-forming function, (D) a polypeptide having 80% or more homology with the amino acid sequence consisting of amino acids 473 to 772 in the amino acid sequence represented by SEQ
  • the target protein can be accumulated in plant cells while sufficiently reducing the influence of overexpression on plant cells and plant individuals.
  • the transformed plant of the present invention can accumulate foreign proteins in the ER body relatively stably.
  • Example 1 and 2 it is the figure which showed typically each produced expression cassette.
  • Example 1 it is the observation image of the fluorescence microscope of the cell into which each expression vector was introduce
  • Example 2 it is the observation image of the fluorescence microscope of the cell into which each expression vector was introduce
  • the method for accumulating a protein of the present invention in a plant cell is characterized by accumulating a protein of interest that is also expressed by transformation in an intracellular organelle newly formed by transformation. Specifically, by introducing a gene encoding a protein having an ER body forming function into a plant cell, an ER body is formed in the plant cell, and the target protein is accumulated in the ER body. To date, no technology has been reported for producing a new organelle specialized for protein accumulation.
  • the method for accumulating a protein of the present invention in a plant cell is a method of accumulating a protein in a plant cell, wherein a gene encoding a protein having an ER body-forming function (ER body formation-related gene), N An ER formed in the plant cell by co-expressing in the plant cell a gene encoding a target protein having an intracellular membrane transition signal peptide at the terminal and an ER retention signal peptide at the C-terminal.
  • the target protein or a protein lacking the N-terminal region of the target protein is accumulated in the body.
  • a gene encoding a protein having an ER body-forming function a new ER body is formed in the cell.
  • a gene encoding a target protein having an intracellular membrane transition signal peptide at the N-terminus and an ER retention signal peptide at the C-terminus is expressed in a plant cell in which an ER body is formed, it is expressed. Protein can be accumulated inside the ER body.
  • a gene includes a nucleotide sequence that encodes a protein, and the nucleic acid or derivative thereof that is synthesized by a transcription / translation mechanism of the cell when the encoded protein is introduced into the cell. Means.
  • the gene includes not only a natural gene possessed by an organism but also a gene artificially designed and synthesized using a gene recombination technique.
  • proteins having an ER body-forming function include Arabidopsis nai2 (SEQ ID NO: 1), proteins encoded by TSK-associating protein1 (TSA1) / At1g52410, At3g15960, and homologous proteins of these proteins.
  • nai2 in order from the N-terminal, is an intracellular translocation signal peptide (1st to 24th region of SEQ ID NO: 1), 10 EFE repeats (98th to 472th region), and nai2 domain (473 to 772). Second region). Similar to nai2, TSA1 has an intracellular membrane transition signal peptide, 10 EFE repeats, and nai2 domain, and has 80% homology in amino acid sequence. It is a finding that the present inventors have found for the first time that ER bodies can be formed in plants other than Lepidoptera, including Brassicaceae, by expressing nai2 and homologous proteins thereof.
  • the protein having an ER body forming function used in the method for accumulating the protein of the present invention in plant cells is preferably a polypeptide selected from any of the following (a) to (d).
  • B A polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and having an ER body forming function.
  • C A polypeptide having a homology of 80% or more, more preferably 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and having an ER body forming function.
  • the homology on the amino acid sequence with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 can be determined using a known program such as Blast.
  • D It has 80% or more, more preferably 90% or more homology with the amino acid sequence consisting of amino acids 473 to 772 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and has an ER body-forming function. Having a polypeptide.
  • a protein (polypeptide) having an ER body-forming function is a protein that forms an ER body by expressing the protein in plant cells. Whether a certain polypeptide has an ER body-forming function is determined by, for example, introducing an expression vector incorporating a DNA encoding the polypeptide into a plant cell by a known gene transfer method such as electroporation, and the like. Whether or not an ER body is formed on the plant cell can be determined by observing with a microscope or the like.
  • an intracellular membrane transition signal peptide at the N-terminal causes the protein synthesized by the ribosome to migrate into the ER.
  • the presence of the ER retention signal peptide at the C-terminus allows the protein to remain inside the ER. That is, in order to accumulate the expressed protein inside the ER body, it is necessary that the N-terminal of the protein has an intracellular translocation signal peptide and the C-terminal has an ER retention signal peptide.
  • the intracellular membrane transition signal peptide provided in the target protein is particularly limited as long as it is a peptide having the ability to migrate to the inner membrane including ER (hereinafter also referred to as ER migration ability). It can be used by appropriately selecting from signal peptides present at the N-terminus of secreted proteins. Further, it may be a peptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added to a known intracellular membrane transition signal peptide without impairing the ER translocation ability.
  • Specific examples of the intracellular membrane system signal peptide include cells possessed by the tobacco mosaic virus Pr1a protein (see Non-Patent Document 10) and Arabidopsis Pyk10 (SEQ ID NO: 2). Examples thereof include an inner membrane transition signal peptide (first to 24th amino acids), an intracellular membrane transition signal peptide (first to 24th amino acids) of nai2 (SEQ ID NO: 1) of Arabidopsis thaliana, and the like.
  • the ER retention signal peptide provided in the target protein is not particularly limited as long as it is a peptide having ER retention ability.
  • the signal peptides present at the C-terminus of the protein retained in the ER Can be appropriately selected and used.
  • Specific examples of the ER retention signal peptide include KDEL, HDEL and the like in terms of amino acid one letter.
  • the proteins retained in the ER there is a protein in which at least a part of the N-terminal intracellular membrane transition signal peptide is cleaved by an enzyme in the ER.
  • an enzyme in the ER depending on the type of intracellular membrane transition signal peptide included in the target protein, not the target protein but a protein lacking the N-terminal region of the target protein is accumulated inside the formed ER body.
  • the cleavage site by the enzyme inside the ER differs depending on the type of target protein, particularly the amino acid sequence of the polypeptide linked to the intracellular membrane transition signal peptide. In many cases, only the intracellular membrane transition signal peptide is deleted by cleavage. However, when a wider N-terminal region including the intracellular membrane transition signal peptide is deleted, In some cases, only the part is missing.
  • the gene encoding the protein is co-expressed with a gene related to ER body formation.
  • the protein or the protein lacking the N-terminal region of the protein can be accumulated in the ER body.
  • an intracellular membrane transition signal peptide is added to the N terminus of the protein, C
  • the target protein or a protein lacking the N-terminal region of the protein can be accumulated inside the ER body.
  • a target protein a protein obtained by adding an ER retention signal peptide to a target protein to be accumulated in a cell directly at the C terminus of a protein originally having an intracellular membrane transition signal peptide at the N-terminus
  • it may be a chimeric protein fused via an appropriate spacer.
  • a protein in which another polypeptide is fused to the C-terminus of Pyk10 can be used as the target protein.
  • the method of co-expressing a protein having an ER body-forming function and a target protein in plant cells is not particularly limited, and any method known in the technical field may be used.
  • an expression vector having a base sequence encoding a protein having an ER body-forming function and an expression vector having a base sequence encoding a target protein into a plant cell, the protein having the ER body-forming function and the target
  • a transformed cell co-expressed with a protein can be prepared.
  • An expression vector having both a base sequence encoding a protein having an ER body forming function and a base sequence encoding a target protein may be introduced.
  • the plant cell that co-expresses the ER body formation-related gene and the gene encoding the target protein may be a cell in a plant individual or a cell collected from a plant individual, such as a dedifferentiation treatment It may be a treated cell or a cultured cell.
  • a plant individual having accumulated cells can be obtained.
  • the type of plant cell that co-expresses the ER body formation-related gene and the gene encoding the target protein is not particularly limited as long as it is a plant, but no ER body is formed in the wild type. It is preferably a plant species cell. Especially, it is preferable that it is a monocotyledonous plant, and it is more preferable that they are a lily family plant or a gramineous plant. Examples of liliaceae plants include onions. Examples of the grass family include rice, corn, sorghum, wheat, barley, rye, barnyard millet, Elianthus, sugar cane, switchgrass, Miscanthus, and Napiergrass.
  • An expression vector having a base sequence encoding a protein having a function of forming an ER body or a target protein is prepared by incorporating a DNA having a base sequence encoding these proteins into the expression vector using a well-known gene recombination technique. can do.
  • a commercially available expression vector preparation kit may be used.
  • an expression vector having a promoter sequence that can be transcribed in plant cells and a terminator sequence including a polyadenylation site, which is a polypeptide encoded by an incorporated polynucleotide when introduced into a plant cell.
  • the vector is not particularly limited as long as the vector can be expressed. Any expression vector usually used for production of transformed plant cells and transformed plants can be used.
  • a promoter sequence is used so that both proteins are independently expressed in cells.
  • An expression cassette comprising DNA having a base sequence encoding a protein having a ER body forming function, DNA having a terminator sequence, DNA having a promoter sequence, DNA having a base sequence encoding a target protein, terminator sequence It is necessary to have an expression cassette made of DNA having
  • expression vectors include a MultiRound Gateway (see Non-Patent Document 11) entry vector, binary vectors such as pIG121 and pIG121Hm, and the like.
  • promoters that can be used include nopaline synthase gene promoter, cauliflower mosaic virus 35S promoter, and maize ubi1 promoter.
  • usable terminators include nopaline synthase gene terminators.
  • promoters specific to tissues and organs may be used. For example, as a leaf-specific expression promoter, a rice rbcS promoter and the like can be mentioned. By using such a tissue or organ-specific promoter, the target protein can be expressed only in a specific tissue or organ, not in the whole plant.
  • a transformed plant when a transformed plant is produced by introducing an expression vector having a base sequence encoding a protein having an ER body-forming function and an expression vector having a base sequence encoding a target protein into an edible plant, the transformation The target protein can be expressed only in the non-edible part of the plant.
  • the expression vector is preferably an expression vector into which not only a protein having an ER body-forming function and a DNA having a base sequence encoding a target protein but also a drug resistance gene and the like are incorporated. This is because it is possible to easily select a plant transformed with an expression vector and a plant not transformed.
  • the drug resistance gene include a kanamycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, and a bialaphos resistance gene.
  • a method for producing a transformed plant using an expression vector is not particularly limited, and can be carried out by a method usually used for producing a transformed plant cell or a transformed plant.
  • the method include an Agrobacterium method, a particle gun method, an electroporation method, and a PEG (polyethylene glycol) method.
  • Agrobacterium method it is preferable to carry out by the Agrobacterium method.
  • Transformed plant cells and transformed plants can be selected using drug resistance or the like as an index.
  • a plant cultured cell may be used as a host, and a plant organ or a plant tissue may be used.
  • a transformed plant By using a well-known plant tissue culture method or the like, a transformed plant can be obtained from transformed plant cells or callus.
  • a transformed plant cell can be obtained by culturing a transformed plant cell using a hormone-free regeneration medium or the like, and transplanting and cultivating the obtained rooted young plant body to soil or the like. it can.
  • rice transformed to co-express a gene encoding ER body formation and a gene encoding a target protein encodes an expression vector having a base sequence encoding a protein having an ER body forming function and the target protein It can be prepared by transforming an expression vector having a base sequence by a conventional method such as the method of Nishimura et al. (See Non-Patent Document 12).
  • callus obtained by culturing mature seeds whose surfaces have been sterilized after removing the hull an expression vector having a base sequence encoding a protein having an ER body-forming function, and a base encoding a target protein It is infected by dipping in a solution of Agrobacterium transformed with an expression vector having the sequence. Thereafter, callus transformed with antibiotics or the like is selected. Thereby, the rice which is the transformed plant of this invention can be obtained.
  • the transformed plant of the present invention thus obtained can be cultivated in the same manner as the plant individual before transformation, can be cut, or can be obtained as a progeny individual by crossing or the like.
  • a clone individual can also be obtained by a known cloning technique.
  • the target protein or the protein lacking the N-terminal region of the target protein is accumulated in the ER body newly formed as a protein accumulation organ.
  • target protein etc. can be protected from proteolytic enzyme etc. which exist in a vacuole, for example, and can accumulate stably.
  • the adverse effects of the target protein and the like on other intracellular organelles, and thus on the growth of plants, can be sufficiently reduced.
  • the target protein accumulated in the newly formed ER body or the protein lacking the N-terminal region of the target protein can be recovered.
  • the method for recovering the target protein and the like from the transformed plant of the present invention is not particularly limited, and is appropriately selected from methods usually used for extracting and purifying recombinant proteins from cells and living tissues. You can choose to do it. Examples of the method include the method of Kawazu et al. (See Non-Patent Document 13) and the method of Kimura et al. (See Non-Patent Document 14).
  • Acidothermus cellulolyticus-derived endoglucanase E1 gene catalytic region (E1-cat) (see Non-Patent Document 15) and Pyrococcus furiosus-derived ⁇ -glucosidase CelB gene
  • E1-cat Acidothermus cellulolyticus-derived endoglucanase E1 gene catalytic region
  • CelB Pyrococcus furiosus-derived ⁇ -glucosidase CelB gene
  • the saccharifying enzyme is accumulated in the ER body in the transformed plant, so that it can be cultivated in the same manner as the plant that became the host at the time of transformation.
  • the saccharification enzyme accumulated from the ER body is released as a result of being subjected to pretreatment for bioethanol production. Cellulose is easily decomposed.
  • the target protein was accumulated in the newly formed ER body by causing the onion epidermal cells to co-express the gene encoding the nai2 gene and the target protein.
  • the reporter Aequorea fluorescens protein (GFP) gene alone, or glycation enzyme Acidothermus cellulolyticus-derived endoglucanase E1 gene catalytic region (E1-cat) (see Non-Patent Document 15) or Pyrococcus furiosus-derived ⁇ -glucosidase CelB gene As a fusion protein with (see Non-Patent Document 16), a corn ubi1 promoter and an Agrobacterium nos terminator were linked by the PCR method to prepare a gene expression cassette.
  • a tobacco mosaic virus Pr1a protein signal peptide (see Non-Patent Document 10) is added to the 5 ′ end of the coding region of each gene, and an amino acid 4 residue (HDEL), which is an ER retention signal peptide, is added to the 3 ′ end of the coding region.
  • HDEL amino acid 4 residue
  • the corn ubi1 promoter, the GFP gene, and the Agrobacterium nos terminator were ligated by the PCR method to produce a gene expression cassette (GFP expression cassette) that did not contain any of the intracellular membrane transition signal peptide and ER retention signal peptide.
  • an expression cassette (nai2 expression cassette) of nai2 gene which is an Arabidopsis thaliana ER body formation-related gene, was similarly prepared.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing each of the produced expression cassettes.
  • Pubi1 is the maize ubi1 promoter
  • Tnos is the Agrobacterium nos terminator
  • HDEL is the ER retention signal peptide
  • SP is the tobacco mosaic virus Pr1a protein signal peptide
  • GFP Indicates GFP
  • E1 indicates E1-cat
  • CelB indicates CelB.
  • the cells into which the expression vector was introduced were observed with a fluorescent stereomicroscope and a confocal laser microscope. Specifically, the localization of GFP or GFP fusion protein expressed in the cells was observed by detecting the fluorescence of GFP.
  • a fluorescent stereoscopic microscope image is shown in FIG. In FIG. 2, the upper row (without nai2 co-expression) is an image of a cell into which the expression vector containing the nai2 expression cassette was not introduced at the same time, and the lower row (with nai2 co-expression) is the same with the expression vector containing the nai2 expression cassette. It is an image of the introduced cell.
  • each GFP or GFP fusion protein was dispersed and localized throughout the ER.
  • an intracellular organelle that was elliptical and showed strong fluorescence intensity.
  • This intracellular organelle is an ER body, and by co-expressing nai2, an intracellular membrane transition signal peptide and a protein comprising an ER retention signal peptide, an ER body is newly formed, and an intracellular membrane transition signal is formed. It has been shown that proteins comprising a peptide and an ER retention signal peptide can be accumulated in the ER body. [Example 2]
  • the target protein is accumulated by forming an ER body in an onion epidermis cell by the method of accumulating the protein of the present invention in a plant cell. It was.
  • a fusion protein in which GFP was linked to the C-terminus of Pyk10 it was linked to the maize ubi1 promoter and Agrobacterium nos terminator by the PCR method to prepare a gene expression cassette.
  • FIG. 1 A schematic diagram of the prepared expression cassette (Pyk10 :: GFP-HDEL fusion expression cassette) is shown in FIG.
  • the Pyk10 :: GFP-HDEL fusion expression cassette was inserted into a MultiRound Gateway (see Non-Patent Document 11) entry vector using an In-Fusion Advantage PCR cloning kit (Clontech) to prepare an expression vector.
  • the upper row (without nai2 co-expression) is an image of a cell into which the expression vector containing the nai2 expression cassette was not introduced at the same time
  • the lower row (with nai2 co-expression) is the expression vector containing the nai2 expression cassette simultaneously. It is an image of the introduced cell.
  • the present invention can provide a method of stably accumulating a target protein in plant cells and plants, and a transformed plant in which the protein is accumulated. Since the protein of the present invention can be accumulated in plant cells while sufficiently reducing the influence on the plant cells and plant individuals due to overexpression by the method for accumulating the proteins in plant cells, the method, The transformed plant of the present invention obtained thereby can be used in fields such as mass production of proteins and modification of plant traits.

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Abstract

　タンパク質を植物細胞内に蓄積させる方法であって、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子と、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつＣ末端にＥＲ保留シグナルペプチドを有する標的タンパク質をコードする遺伝子とを植物細胞内に共発現させることにより、前記植物細胞内に形成されたＥＲボディの内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質を蓄積させる、タンパク質の植物細胞内への蓄積方法。

Description

タンパク質の植物細胞内への蓄積方法
　本発明は、タンパク質を植物細胞内の特定の細胞内小器官に蓄積させる方法、及び、前記方法により作製された形質転換植物に関する。
　本願は、２０１１年２月２２日に、日本に出願された特願２０１１－０３５５５８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　遺伝子組換技術の進歩により、培養細胞や植物個体中の細胞に、目的のタンパク質をコードする遺伝子を導入し、前記タンパク質を細胞内に発現させることができるようになった。一般的には、植物の核ゲノムに遺伝子を導入してタンパク質を発現させる際に、目的タンパク質をコードする遺伝子領域のみを細胞内に導入した場合には、発現したタンパク質は細胞質に蓄積する。また、目的タンパク質のＮ末端にシグナルペプチドと呼ばれる数アミノ酸を付加したタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより、発現させたタンパク質を、ＥＲ（小胞体）、液胞、葉緑体などの細胞内小器官と呼ばれる箇所あるいは細胞外領域（アポプラスト）に移行・蓄積させることができる（非特許文献１参照。）。
その他、目的タンパク質をコードする遺伝子を、葉緑体のゲノムそのものに導入し、葉緑体内で遺伝子発現からタンパク質蓄積までを行う技術もある（非特許文献２参照。）。
　また、タンパク質を特異的に蓄積する細胞内小器官として、プロテインボディやＥＲボディなどが知られている（非特許文献３参照。）。プロテインボディは植物の種子にのみ局在しており、ＥＲボディはアブラナ科などを含むフウチョウソウ目植物の幼苗にのみ局在している。フウチョウソウ目アブラナ科に属するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）において、ＥＲボディ形成不全変異体では、ｎａｉ２遺伝子に機能不全変異が生じており、この変異体に野生型のｎａｉ２遺伝子を導入することによってＥＲボディが形成されること、ＥＲボディにはβ－グルコシダーゼであるＰｙｋ１０が蓄積されているが、ＥＲボディ形成不全変異体では、Ｐｙｋ１０はＥＲ全体に分散して局在していることなどが報告されている（非特許文献４～８参照。）。
　一方で、タンパク質を既存の細胞内小器官に蓄積する従来の技術においては、タンパク質の種類によっては、蓄積した細胞内小器官及びその細胞の機能、ひいては植物体の生育に悪影響を及ぼす場合がある。例えば、植物細胞壁由来のセルロースを糖に加水分解する糖化酵素を発現・蓄積した植物は、バイオエタノール生産に好適な原料と成り得ることが期待される。しかしながら、このような糖化酵素を人工的に発現・蓄積させたイネでは、さまざまな生理的・形態的異常を生じることが報告されている（非特許文献９参照。）。
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　大量の目的のタンパク質を植物体に安定して蓄積させるためには、前記タンパク質が蓄積することによって、植物体に生育異常等の障害が生じないことが重要である。例えば、過剰発現させたタンパク質をプロテインボディやＥＲボディに蓄積させることにより、前記タンパク質による植物体自体に対する影響を十分に低減させつつ、高濃度のタンパク質を植物体に蓄積させられることが期待できる。しかしながら、プロテインボディやＥＲボディは、それらが形成される植物種、時期、器官が限定されているため、タンパク質大量生産のための蓄積器官としては適しているとはいえない。
　本発明は、目的のタンパク質を、植物細胞や植物体に安定して蓄積させる方法、及び、タンパク質を蓄積させた形質転換植物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、フウチョウソウ目アブラナ科植物以外の植物に対しても、ｎａｉ２遺伝子を導入することによりＥＲボディを形成し得ること、ＥＲボディを新たに形成した植物に、細胞内膜系移行シグナルペプチドとＥＲ保留シグナルペプチドを付加したタンパク質を発現させることにより、前記タンパク質をＥＲボディに蓄積させられることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、
（１）　タンパク質を植物細胞内に蓄積させる方法であって、
ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする遺伝子と、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつＣ末端にＥＲ保留シグナルペプチドを有する標的タンパク質をコードする遺伝子とを植物細胞内に共発現させることにより、前記植物細胞内に形成されたＥＲボディの内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質を蓄積させる、タンパク質の植物細胞内への蓄積方法、
（２）　前記ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質が、下記（ａ）～（ｄ）のいずれかから選択されるポリペプチドである前記（１）に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法； 
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の４７３番目から７７２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド、
（３）　前記標的タンパク質が、Ｐｙｋ１０タンパク質のＣ末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質である前記（１）又は（２）に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法、
（４）　前記植物細胞が、植物個体中の細胞である前記（１）～（３）のいずれか一つに記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法、
（５）　ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクター、又は、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列と標的タンパク質をコードする塩基配列とを共に有する発現ベクターが導入されており、
前記標的タンパク質は、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつＣ末端にＥＲ保留シグナルペプチドを有しており、
植物体中の少なくとも１の細胞において、前記細胞内に形成されたＥＲボディの内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質が蓄積されている形質転換植物、
（６）　前記ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質が、下記（ａ）～（ｄ）のいずれかから選択されるポリペプチドである前記（５）に記載の形質転換植物；
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド、
（ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の４７３番目から７７２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド、
（７）　前記標的タンパク質が、Ｐｙｋ１０タンパク質のＣ末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質である前記（５）又は（６）に記載の形質転換植物、
（８）　単子葉植物である前記（５）～（７）のいずれか一つに記載の形質転換植物、
（９）　ユリ科植物又はイネ科植物である前記（５）～（７）のいずれか一つに記載の形質転換植物、
（１０）　イネである前記（５）～（７）のいずれか一つに記載の形質転換植物、
（１１）　前記（５）～（１０）のいずれか一つに記載の形質転換植物の後代個体又はクローン個体である植物、
を、提供する。
　本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法により、過剰発現による植物細胞や植物個体に対する影響を充分に低減させつつ、目的のタンパク質を植物細胞内に蓄積させることができる。
　また、本発明の形質転換植物は、外来タンパク質をＥＲボディに比較的安定して蓄積させることができる。
実施例１及び２において、作製された各発現カセットを模式的に示した図である。 実施例１において、各発現ベクターが導入された細胞の蛍光顕微鏡の観察像である。 実施例２において、各発現ベクターが導入された細胞の蛍光顕微鏡の観察像である。
　以下、本発明の好ましい例を説明するが、本発明はこれらの例に限定されることはない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。
　本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法は、形質転換によって新たに形成させた細胞内小器官内に、同じく形質転換によって発現させた目的のタンパク質を蓄積させることを特徴とする。具体的には、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を植物細胞に導入することにより、ＥＲボディを前記植物細胞内に形成させ、このＥＲボディ内に目的のタンパク質を蓄積させる。このようなタンパク質蓄積に特化した新たな細胞内小器官を作製する技術は、現在までに報告されていない。
　すなわち、本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法は、タンパク質を植物細胞内に蓄積させる方法であって、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする遺伝子（ＥＲボディ形成関連遺伝子）と、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつＣ末端にＥＲ保留シグナルペプチドを有する標的タンパク質をコードする遺伝子とを植物細胞内に共発現させることにより、前記植物細胞内に形成されたＥＲボディの内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質を蓄積させることを特徴とする。ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現させることにより、細胞内に新たにＥＲボディが形成される。また、ＥＲボディが形成された植物細胞内に、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつＣ末端にＥＲ保留シグナルペプチドを有する標的タンパク質をコードする遺伝子を発現させると、発現されたタンパク質をＥＲボディ内部に蓄積させることができる。
　本発明及び本願明細書において、遺伝子とは、タンパク質をコードする塩基配列を含み、細胞に導入されることにより、コードされたタンパク質が、細胞が備える転写・翻訳機構によって合成される核酸またはその誘導体を意味する。遺伝子は、生物が有する天然の遺伝子のみならず、遺伝子組換技術を用いて人工的に設計・合成された遺伝子も含まれる。
　ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質としては、シロイヌナズナのｎａｉ２（配列番号１）や、ＴＳＫ－ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ１（ＴＳＡ１）／Ａｔ１ｇ５２４１０、Ａｔ３ｇ１５９６０にコードされるタンパク質、及びこれらのタンパク質のホモログタンパク質等が挙げられる。ｎａｉ２は、Ｎ末端から順に、細胞内膜系移行シグナルペプチド（配列番号１の１～２４番目の領域）と、１０個のＥＦＥリピート（９８～４７２番目の領域）と、ｎａｉ２ドメイン（４７３～７７２番目の領域）とを有している。ＴＳＡ１は、ｎａｉ２と同様に、細胞内膜系移行シグナルペプチドと、１０個のＥＦＥリピートと、ｎａｉ２ドメインとを有しており、アミノ酸配列で８０％の相同性を有している。ｎａｉ２やそのホモログタンパク質等を発現させることにより、アブラナ科などを含むフウチョウソウ目以外の植物にもＥＲボディを形成させられることは、本発明者らにより初めて見出された知見である。
　本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法に用いられるＥＲボディ形成機能を有するタンパク質としては、下記（ａ）～（ｄ）のいずれかから選択されるポリペプチドであることが好ましい。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド。
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド。
　なお、配列番号１で表されるアミノ酸配列とのアミノ酸配列上の相同性は、Ｂｌａｓｔ等の公知のプログラムを用いて求めることができる。
（ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の４７３番目から７７２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド。
　ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質（ポリペプチド）とは、植物細胞内において、前記タンパク質が発現されることにより、ＥＲボディが形成されるタンパク質である。あるポリペプチドがＥＲボディ形成機能を有するか否かは、例えば、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ発現ベクターを、植物細胞に電気穿孔法等の公知の遺伝子導入法によって導入した後、前記植物細胞にＥＲボディが形成されたか否かを顕微鏡等で観察することにより判断することができる。
　Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドがあることにより、リボソームで合成されたタンパク質は、ＥＲ内部へ移行する。また、Ｃ末端にＥＲ保留シグナルペプチドがあることにより、タンパク質がＥＲ内部に留まることができる。すなわち、発現させたタンパク質をＥＲボディの内部に蓄積させるためには、前記タンパク質のＮ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドがあり、かつＣ末端にＥＲ保留シグナルペプチドがあることを要する。
　本発明において、標的タンパク質が備える細胞内膜系移行シグナルペプチドとしては、ＥＲをはじめとする細胞内膜への移行能（以下、ＥＲ移行能ともいう）を有するペプチドであれば、特に限定されるものではなく、分泌タンパク質のＮ末端に存在するシグナルペプチドの中から適宜選択して用いることができる。また、公知の細胞内膜系移行シグナルペプチドに対して、ＥＲ移行能を損なうことなく、１若しくは数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加したペプチドであってもよい。細胞内膜系移行シグナルペプチドとしては、具体的には、タバコモザイクウイルスのＰｒ１ａタンパク質が有する細胞内膜系移行シグナルペプチド（非特許文献１０参照。）、シロイヌナズナのＰｙｋ１０（配列番号２）が有する細胞内膜系移行シグナルペプチド（１番目から２４番目のアミノ酸）、シロイヌナズナのｎａｉ２（配列番号１）が有する細胞内膜系移行シグナルペプチド（１番目から２４番目のアミノ酸）等が挙げられる。
　本発明において、標的タンパク質が備えるＥＲ保留シグナルペプチドとしては、ＥＲ保留能を有するペプチドであれば、特に限定されるものではなく、ＥＲ内部に保留されるタンパク質のＣ末端に存在するシグナルペプチドの中から適宜選択して用いることができる。ＥＲ保留シグナルペプチドとしては、具体的には、アミノ酸一文字表記でＫＤＥＬやＨＤＥＬ等が挙げられる。
　ＥＲ内部に保留されるタンパク質の中には、Ｎ末端の細胞内膜系移行シグナルペプチドの少なくとも一部がＥＲ内部の酵素によって切断されるものがある。本発明においても、標的タンパク質が備える細胞内膜系移行シグナルペプチドの種類によっては、標的タンパク質ではなく、標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質が、形成されたＥＲボディ内部に蓄積される。ＥＲ内部の酵素による切断部位は、標的タンパク質の種類、特に、細胞内膜系移行シグナルペプチドに連結させたポリペプチドのアミノ酸配列等により異なる。多くの場合では、細胞内膜系移行シグナルペプチドのみが切断により欠損されるが、細胞内膜系移行シグナルペプチドを含むより広いＮ末端領域が欠損する場合や、細胞内膜系移行シグナルペプチドの一部のみが欠損する場合もある。
　細胞内に蓄積させたい目的のタンパク質が、細胞内膜系移行シグナルペプチドやＥＲ保留シグナルペプチドを元々備えている場合には、前記タンパク質をコードする遺伝子をＥＲボディ形成関連遺伝子と共発現させることにより、前記タンパク質又は前記タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質をＥＲボディ内部に蓄積させることができる。一方で、細胞内に蓄積させたい目的のタンパク質が、細胞内膜系移行シグナルペプチドやＥＲ保留シグナルペプチドを備えていない場合には、前記タンパク質のＮ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを、Ｃ末端にＥＲ保留シグナルペプチドをそれぞれ付加したタンパク質を標的タンパク質とすることにより、前記標的タンパク質又は前記タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質をＥＲボディ内部に蓄積させることができる。
　本発明においては、標的タンパク質として、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを元々備えるタンパク質のＣ末端に、細胞内に蓄積させたい目的のタンパク質にＥＲ保留シグナルペプチドを付加させたタンパク質を、直接又は適当なスペーサーを介して融合させたキメラタンパク質であってもよい。例えば、Ｐｙｋ１０のＣ末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質を標的タンパク質とすることができる。
　植物細胞にＥＲボディ形成機能を有するタンパク質と標的タンパク質とを共発現させる方法は、特に限定されるものではなく、前記技術分野において公知のいずれの方法で行ってもよい。例えば、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターとを、植物細胞に導入することにより、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質と標的タンパク質とを共発現させた形質転換細胞を作製することができる。ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列と標的タンパク質をコードする塩基配列とを共に有する発現ベクターを導入してもよい。
　ＥＲボディ形成関連遺伝子と標的タンパク質をコードする遺伝子とを共発現させる植物細胞は、植物個体中の細胞であってもよく、植物個体から採取された細胞であってもよく、脱分化処理等の処理が施された細胞であってもよく、培養細胞であってもよい。脱分化処理により得られたカルスに、ＥＲボディ形成関連遺伝子と標的タンパク質をコードする遺伝子とを導入することにより、形成されたＥＲボディの内部に標的タンパク質又は標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質が蓄積された細胞を有する植物個体を得ることができる。
　本発明において、ＥＲボディ形成関連遺伝子と標的タンパク質をコードする遺伝子とを共発現させる植物細胞の種類は、植物であれば特に限定されるものではないが、野生型ではＥＲボディが形成されていない植物種の細胞であることが好ましい。中でも、単子葉植物であることが好ましく、ユリ科植物又はイネ科植物であることがより好ましい。ユリ科の植物として、例えば、タマネギ等が挙げられる。また、イネ科の植物として、例えば、イネ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、エリアンサス、サトウキビ、スイッチグラス、ミスカンサス、ネピアグラス等が挙げられる。
　ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質や標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターは、これらのタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡを、周知の遺伝子組換技術を用いて発現ベクターに組み込むことにより作製することができる。市販の発現ベクター作製キットを用いてもよい。
　発現ベクターとしては、植物細胞において転写が可能なプロモーター配列と、ポリアデニレーション部位を含むターミネーター配列を有する発現ベクターであって、植物細胞に導入した場合に、組み込まれたポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されるものではない。形質転換植物細胞や形質転換植物の作製のために通常用いられる任意の発現ベクターを用いることができる。ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列と標的タンパク質をコードする塩基配列とを一の発現ベクターに組み込む場合には、両タンパク質が独立して細胞内に発現されるように、プロモーター配列を有するＤＮＡ、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現用カセットと、プロモーター配列を有するＤＮＡ、標的タンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ、ターミネーター配列を有するＤＮＡからなる発現用カセットとを備えていることが必要である。
　発現ベクターとしては、例えば、ＭｕｌｔｉＲｏｕｎｄ　Ｇａｔｅｗａｙ（非特許文献１１参照。）エントリーベクターや、ｐＩＧ１２１、ｐＩＧ１２１Ｈｍ等のバイナリーベクター等がある。使用可能なプロモーターとして、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓのプロモーター、トウモロコシｕｂｉ１のプロモーター等がある。また、使用可能なターミネーターとして、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター等がある。その他、組織や器官に特異的なプロモーターを用いてもよい。例えば、葉特異的な発現プロモーターとして、イネｒｂｃＳのプロモーター等が挙げられる。このような組織又は器官特異的プロモーターを用いることにより、植物全体ではなく、特定の組織や器官にのみ標的タンパク質を発現させることができる。
例えば、食用植物にＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターとを導入して形質転換植物を作製した場合に、前記形質転換植物の非食用部分にのみ標的タンパク質を発現させることができる。
　前記発現ベクターは、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質や標的タンパク質をコードする塩基配列を有するＤＮＡのみならず、薬剤耐性遺伝子等も組み込まれた発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターにより形質転換された植物と形質転換されていない植物の選抜を容易に行うことができるためである。前記薬剤耐性遺伝子として、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等がある。
　本発明において、発現ベクターを用いて形質転換植物を作製する方法は、特に限定されるものではなく、形質転換植物細胞や形質転換植物を作製する場合に通常用いられている方法により行うことができる。前記方法として、例えば、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）法等がある。このうち、アグロバクテリウム法で行うことが好ましい。形質転換植物細胞や形質転換植物は、薬剤耐性等を指標として選抜することができる。また、宿主として、植物培養細胞を用いてもよく、植物器官や植物組織を用いてもよい。
　周知の植物組織培養法等を用いることにより、形質転換された植物細胞やカルス等から形質転換植物を得ることができる。例えば、形質転換植物細胞を、ホルモンフリーの再分化培地等を用いて培養して、得られた発根した幼植物体を土壌等に移植して栽培することにより、形質転換植物を得ることができる。
　例えば、ＥＲボディ形成関連遺伝子と標的タンパク質をコードする遺伝子とを共発現させるように形質転換させたイネは、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターとを、Nishimuraらの方法（非特許文献１２参照。）等の常法により形質転換することにより作成することができる。 具体的には、例えば、外皮を除去した後表面殺菌した完熟種子を培養して得られたカルスを、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターとにより形質転換されたアグロバクテリウムの溶液に浸漬して感染させる。その後、抗生物質等を用いて形質転換されたカルスを選抜する。これにより、本発明の形質転換植物であるイネを得ることができる。
　このようにして得られた本発明の形質転換植物は、形質転換前の植物個体と同様に栽培したり、挿し木をしたり、交配等により後代個体を得ることができる。また、公知のクローニング技術によりクローン個体を得ることもできる。
　本発明の形質転換植物では、タンパク質蓄積器官として新たに形成されたＥＲボディ内に標的タンパク質又は標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質が蓄積されている。このため、標的タンパク質等を、例えば液胞に存在するタンパク質分解酵素などから保護し、安定的に蓄積することができる。同時に、標的タンパク質等が他の細胞内小器官、ひいては植物の成長に与える悪影響を十分に低減させることができる。
　本発明の形質転換植物からは、新たに形成されたＥＲボディ内に蓄積されている標的タンパク質又は標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質を回収することができる。本発明の形質転換植物から標的タンパク質等を回収する方法としては、特に限定されるものではなく、細胞や生体組織から組換えタンパク質を抽出・精製する場合に通常用いられている方法の中から適宜選択して行うことができる。前記方法として、例えば、Kawazuらの方法（非特許文献１３参照。）や、Kimuraらの方法（非特許文献１４参照。）等がある。
　また、本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法における標的タンパク質として、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来エンドグルカナーゼＥ１遺伝子触媒領域（Ｅ１－ｃａｔ）（非特許文献１５参照。）やＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来β－グルコシダーゼＣｅｌＢ遺伝子（非特許文献１６参照。）等の超好熱性グルカナーゼのような、植物細胞壁由来のセルロースを糖に加水分解する糖化酵素を用いることにより、バイオエタノール生産に好適なバイオマス原料となる形質転換植物を作製することができる。得られた形質転換植物において、糖化酵素は形質転換植物内のＥＲボディに蓄積されているため、形質転換の際に宿主となった植物と同様に栽培することができる。その上、前記形質転換植物をバイオマス原料とする場合には、バイオエタノール生産のための前処理に供することにより、ＥＲボディから蓄積されている糖化酵素が放出される結果、前記形質転換植物中のセルロースが分解されやすくなる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　タマネギ表皮細胞に、ｎａｉ２遺伝子と標的タンパク質をコードする遺伝子を一過性に共発現させることにより、新たに形成されたＥＲボディに標的タンパク質を蓄積させた。
＜遺伝子発現ベクターの作製＞
　レポーターであるオワンクラゲ蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を、単独、若しくは糖化酵素であるＡｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ由来エンドグルカナーゼＥ１遺伝子触媒領域（Ｅ１－ｃａｔ）（非特許文献１５参照。）又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来β－グルコシダーゼＣｅｌＢ遺伝子（非特許文献１６参照。）との融合タンパク質として、トウモロコシｕｂｉ1プロモーター及びアグロバクテリムｎｏｓターミネーターとＰＣＲ法により連結し、遺伝子発現カセットを作製した。
各遺伝子のコード領域５’末端にはタバコモザイクウイルスＰｒ１ａタンパク質シグナルペプチド（非特許文献１０参照。）を付加し、コード領域３’末端にはＥＲ保留シグナルペプチドであるアミノ酸４残基（ＨＤＥＬ）を付加した。また、トウモロコシｕｂｉ1プロモーター、ＧＦＰ遺伝子、及びアグロバクテリムｎｏｓターミネーターをＰＣＲ法により連結し、細胞内膜系移行シグナルペプチドとＥＲ保留シグナルペプチドのいずれも含まない遺伝子発現カセット（ＧＦＰ発現カセット）を作製した。さらに、シロイヌナズナＥＲボディ形成関連遺伝子であるｎａｉ２遺伝子の発現カセット（ｎａｉ２発現カセット）を同様に作製した。
　図１は、作製された各発現カセットを模式的に示した図である。図１中、「Ｐｕｂｉ1」はトウモロコシｕｂｉ1プロモーターを、「Ｔｎｏｓ」はアグロバクテリムｎｏｓターミネーターを、「ＨＤＥＬ」はＥＲ保留シグナルペプチドを、「ＳＰ」はタバコモザイクウイルスＰｒ１ａタンパク質シグナルペプチドを、「ＧＦＰ」はＧＦＰを、「Ｅ１」はＥ１－ｃａｔを、「ＣｅｌＢ」はＣｅｌＢを、それぞれ示す。
　これらの発現カセットを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキット（クロンテック社製）を用いてＭｕｌｔｉＲｏｕｎｄ　Ｇａｔｅｗａｙ（非特許文献１１参照。）エントリーベクターに挿入し、発現ベクターを作製した。
＜パーティクルガン法による遺伝子導入＞
　作製した発現ベクターを、遺伝子組み換え装置（パーティクルガン）（製品名：ＰＤＳ－１０００／Ｈｅ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）を用いて、インストラクションマニュアルに従ってタマネギ鱗茎に導入した。
＜発現ベクターを導入した細胞の観察＞
　発現ベクターを導入した細胞は、蛍光実体顕微鏡及び共焦点レーザー顕微鏡により観察した。具体的には、ＧＦＰの蛍光を検出することにより、細胞中に発現しているＧＦＰ又はＧＦＰ融合タンパク質の局在を観察した。蛍光実体顕微鏡画像を図２に示す。図２中、上段（ｎａｉ２共発現なし）は、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入しなかった細胞の画像であり、下段（ｎａｉ２共発現あり）は、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入した細胞の画像である。
　この結果、細胞内膜系移行シグナルペプチドとＥＲ保留シグナルペプチドのいずれも含まないＧＦＰ発現カセットを含む発現ベクターを導入した細胞では、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入したか否かにかかわらず、ＧＦＰは細胞質全体に局在していた（図示せず。）。これに対して、細胞内膜系移行シグナルペプチドとＥＲ保留シグナルペプチドをいずれも備えているＳＰ－ＧＦＰ－ＨＤＥＬ発現カセット、ＳＰ－Ｅ１：：ＧＦＰ－ＨＤＥＬ融合発現カセット、及びＳＰ－ＣｅｌＢ：：ＧＦＰ－ＨＤＥＬ融合発現カセットを含む発現ベクターを導入した細胞では、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入しなかった場合には、各ＧＦＰ又はＧＦＰ融合タンパク質はＥＲ全体に分散して局在していたが、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入した細胞では、楕円状で強い蛍光強度を示す細胞内小器官に局在していた。この細胞内小器官はＥＲボディであり、ｎａｉ２と細胞内膜系移行シグナルペプチドとＥＲ保留シグナルペプチドを備えるタンパク質とを共発現させることにより、新たにＥＲボディが形成し、細胞内膜系移行シグナルペプチドとＥＲ保留シグナルペプチドを備えるタンパク質をＥＲボディに蓄積させられることが示された。
［実施例２］
　Ｐｙｋ１０タンパク質のＣ末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質を標的タンパク質として、本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法により、タマネギ表皮細胞に、ＥＲボディを形成させて標的タンパク質を蓄積させた。
＜遺伝子発現ベクターの作製＞
　Ｐｙｋ１０のＣ末端にＧＦＰを連結させた融合タンパク質として、トウモロコシｕｂｉ1プロモーター及びアグロバクテリムｎｏｓターミネーターとＰＣＲ法により連結し、遺伝子発現カセットを作製した。前記遺伝子のコード領域３’末端にはＥＲ保留シグナルペプチドであるアミノ酸４残基（ＨＤＥＬ）を付加した。なお、前述のとおり、Ｐｙｋ１０のＮ末端には細胞内膜系移行シグナルペプチドが元々備わっている。作製された発現カセット（Ｐｙｋ１０：：ＧＦＰ－ＨＤＥＬ融合発現カセット）の模式図を図１に示す。
　Ｐｙｋ１０：：ＧＦＰ－ＨＤＥＬ融合発現カセットを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ａｄｖａｎｔａｇｅ　ＰＣＲクローニングキット（クロンテック社製）を用いてＭｕｌｔｉＲｏｕｎｄ　Ｇａｔｅｗａｙ（非特許文献１１参照。）エントリーベクターに挿入し、発現ベクターを作製した。
＜パーティクルガン法による遺伝子導入及び発現ベクターを導入した細胞の観察＞
　実施例1と同様にして、Ｐｙｋ１０：：ＧＦＰ－ＨＤＥＬ融合発現カセットを含む発現ベクター、実施例１で用いたＳＰ－ＧＦＰ－ＨＤＥＬ発現カセットを含む発現ベクター、又は、細胞内膜系移行シグナルペプチドとＥＲ保留シグナルペプチドのいずれも含まないＧＦＰ発現カセットを含む発現ベクター、並びにｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを、それぞれタマネギ鱗茎に導入した。さらに、実施例1と同様にして、発現ベクターを導入した細胞は、蛍光実体顕微鏡及び共焦点レーザー顕微鏡により観察した。蛍光実体顕微鏡画像を図３に示す。図３中、上段（ｎａｉ２共発現なし）は、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入しなかった細胞の画像であり、下段（ｎａｉ２共発現あり）は、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入した細胞の画像である。
　この結果、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入しなかった場合には、ＳＰ－ＧＦＰ－ＨＤＥＬ発現カセットを含む発現ベクターを導入した細胞とＰｙｋ１０：：ＧＦＰ－ＨＤＥＬ融合発現カセットを含む発現ベクターを導入した細胞のいずれも、ＧＦＰ蛍光はＥＲ全体に観察された。これに対して、ＳＰ－ＧＦＰ－ＨＤＥＬ発現カセットを含む発現ベクターとｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入させた場合には、ＧＦＰ蛍光が認められた細胞、すなわち遺伝子が導入された細胞の約半数でＥＲボディの形成が認められた。一方、Ｐｙｋ１０：：ＧＦＰ－ＨＤＥＬ融合発現カセットを含む発現ベクターとｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入させた場合には、ＧＦＰ蛍光が認められた細胞のほぼ全てでＥＲボディの形成が認められた。細胞内膜系移行シグナルペプチドとＥＲ保留シグナルペプチドのいずれも含まないＧＦＰ発現カセットを含む発現ベクターを導入した細胞では、実施例１と同様、ｎａｉ２発現カセットを含む発現ベクターを同時に導入したか否かにかかわらず、ＧＦＰは細胞質全体に局在していた。以上の結果から、目的タンパク質をＰｙｋ１０と融合して発現させると共に、ｎａｉ２を同時に発現させる事により、高頻度で細胞内にＥＲボディを形成させることが可能であることが示された。
　本発明は、目的のタンパク質を、植物細胞や植物体に安定して蓄積させる方法、及び、タンパク質を蓄積させた形質転換植物を提供することができる。本発明のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法により、過剰発現による植物細胞や植物個体に対する影響を充分に低減させつつ、目的のタンパク質を植物細胞内に蓄積させることができるため、前記方法や、それにより得られる本発明の形質転換植物は、例えばタンパク質の大量生産や植物の形質改変等の分野において利用が可能である。

Claims (11)

  1. 　タンパク質を植物細胞内に蓄積させる方法であって、
    ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする遺伝子と、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつＣ末端にＥＲ保留シグナルペプチドを有する標的タンパク質をコードする遺伝子とを植物細胞内に共発現させることにより、前記植物細胞内に形成されたＥＲボディの内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質を蓄積させる、タンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
  2. 　前記ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質が、下記（ａ）～（ｄ）のいずれかから選択されるポリペプチドである請求項１に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
    （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド。
    （ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド。
    （ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の４７３番目から７７２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド。
  3. 　前記標的タンパク質が、Ｐｙｋ１０タンパク質のＣ末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質である請求項１又は２に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
  4. 　前記植物細胞が、植物個体中の細胞である請求項１～３のいずれか一項に記載のタンパク質の植物細胞内への蓄積方法。
  5. 　ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクターと標的タンパク質をコードする塩基配列を有する発現ベクター、又は、ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質をコードする塩基配列と標的タンパク質をコードする塩基配列とを共に有する発現ベクターが導入されており、
    前記標的タンパク質は、Ｎ末端に細胞内膜系移行シグナルペプチドを有し、かつＣ末端にＥＲ保留シグナルペプチドを有しており、
    植物体中の少なくとも１の細胞において、前記細胞内に形成されたＥＲボディの内部に、前記標的タンパク質又は前記標的タンパク質のＮ末端領域が欠損したタンパク質が蓄積されている形質転換植物。
  6. 　前記ＥＲボディ形成機能を有するタンパク質が、下記（ａ）～（ｄ）のいずれかから選択されるポリペプチドである請求項５に記載の形質転換植物。
    （ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
    （ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド。
    （ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド。
    （ｄ）配列番号１で表されるアミノ酸配列中の４７３番目から７７２番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、ＥＲボディ形成機能を有するポリペプチド。
  7. 　前記標的タンパク質が、Ｐｙｋ１０タンパク質のＣ末端に他のポリペプチドを融合させたタンパク質である請求項５又は６に記載の形質転換植物。
  8. 　単子葉植物である請求項５～７のいずれか一項に記載の形質転換植物。
  9. 　ユリ科植物又はイネ科植物である請求項５～７のいずれか一項に記載の形質転換植物。
  10. 　イネである請求項５～７のいずれか一項に記載の形質転換植物。
  11. 　請求項５～１０のいずれか一項に記載の形質転換植物の後代個体又はクローン個体である植物。
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