CN102124121A - 利用瞬时农杆菌渗入法在植物主体中制备纤维素酶 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于通过农杆菌渗入法制备蛋白质(如酶)的方法。所述方法包括：制备具有编码纤维素酶的Ti质粒的农杆菌；用农杆菌传染植物细胞；允许纤维素酶表达，并且从所述植物细胞中回收所述纤维素酶。在一个实施方案中，所制备的蛋白质为内切葡聚糖酶。

Description

利用瞬时农杆菌渗入法在植物主体中制备纤维素酶
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求2008年8月19日提交的美国专利申请No.61/090,221的优先权，该专利申请的全文以引用方式并入本文。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
美国政府对本发明具有付费许可权，并且有权在有限的情况下要求专利所有者将本发明许可给善意的他人，如国家科学委员会授予的授权No.0653984的各条款规定的那样。
发明背景
诸如乙醇等生物燃料是由葡萄糖发酵的，并且生物质中的纤维素是这种糖的潜在来源。然而，需要协同的酶群将纤维素降解为葡萄糖。通常，这些酶由真菌细胞培养物产生，这要求较高的资本成本，以及大量的生物反应器。因此，需要更有效的酶产生系统，该系统需要较低的资本成本，消耗更少的能量，并且释放更少的二氧化碳。
发明概述
本发明公开提供通过渗入法制备蛋白质(如纤维素酶)的方法。该方法一般包括首先制备农杆菌(Agrobacterium)，该农杆菌含有编码纤维素酶的修饰Ti质粒。将农杆菌与多个植物细胞混合，以形成混合物，并且允许其传染多个植物细胞中的至少一个植物细胞。在经过足以使植物细胞表达纤维素酶的一段时间之后，从混合物中回收含有纤维素酶的部分。在一个实施方案中，多个植物细胞位于完整的植物中。在另一个实施方案中，多个植物细胞位于分离的植物部分中。在另一个实施方案中，所述一段时间为至少4天。在一个实施方案中，在为至少4天的一段时间之后，表达至少1mg纤维素酶/kg鲜植物细胞重量。在另一个实施方案中，在为至少6天的一段时间后，表达至少2.6mg纤维素酶/kg鲜植物细胞重量。在一个实施方案中，纤维素酶来自于适温性有机体。在另一个实施方案中，纤维素酶为外切葡聚糖酶。在另一个实施方案中，纤维素酶为内切葡聚糖酶。在一个实施方案中，内切葡聚糖酶为来自于嗜酸纤维素分解菌(Acidothermus cellulolyticus)的β-1，4-内切葡聚糖酶E1。在一个实施方案中，纤维素酶在pH为5.5、温度为65℃的条件下的活性为至少40,000nmolMU/分钟/kg鲜植物组织重量。在一个实施方案中，农杆菌为根癌农杆菌(A.tumefaciens)。在一个实施方案中，回收含有纤维素酶的部分包括使多个植物细胞破裂。在另一个实施方案中，纤维素酶在组成型启动子的控制下进行表达。在一个实施方案中，组成型启动子为来自于花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)的35S。在一个实施方案中，将农杆菌与多个植物细胞混合包括真空渗入。在一个实施方案中，纤维素酶为热稳定性的。在一个实施方案中，多个植物细胞来自于本氏烟(Nicotiana benthamiana)。在一个实施方案中，纤维素酶与信号肽相连。
附图简述
图1示出由DNA 2.0公司合成的基因的示意图。RAMY 3D SP编码来自于水稻α淀粉酶的信号肽。E1为来自于嗜酸纤维素菌的β-1，4-内切葡聚糖酶E1。E1-cd编码E1催化区域。E1-link编码E1接头区域。E1-cbd编码E1纤维素结合区域。PFT-6His编码肽融合标签(六多组氨酸标签)。终止密码子和限制性酶部位(Xhol、Pstl、Hindlll和Spel)被添加到两侧的区域。
图2示出β-1，4-内切葡聚糖酶转录产物的预期氨基酸序列。
图3示出pDP0701载体的图谱。
图4示出pDP07.0202a二元载体的图谱。
图5示出在来自于烟草植物(本氏烟)的各种组织样品中产生的内切葡聚糖酶的量。对照#1和#2为用缓冲液(但是不含细菌)渗入的两种不同的烟草植物。试验#1和#2为用悬浮在缓冲液中的农杆菌渗入的两种不同烟草植物。检测试验植物#1的相同叶子的不同区域之间以及不同叶子之间的差异率。检测试验植物#1和#2之间的植物与植物之间的差异率。
图6示出内切葡聚糖酶在烟草植物中的瞬时表达。随着时间的变化监测经渗入的完整植物和存储在不同环境下的收获叶子中的内切葡聚糖酶的量。温热是指最大温度＞30℃。冷却是指最大温度＜30℃。照明是指16小时/8小时亮/暗循环。暗是指24小时的黑暗。
图7示出来自于嗜酸纤维素分解菌的内切葡聚糖酶的修饰基因。来自于花椰菜花叶病毒的35S启动子有利于组成型转录。
图8示出其Ti质粒的特定片段转移到植物细胞内的农杆菌。
图9示出用于水解纤维素链内的β-1，4-葡萄糖苷键的内切葡聚糖酶(箭头)。
图10示出内切葡聚糖酶活性的最优条件。
图11示出真空渗入法是如何将农杆菌与植物细胞整合在一起的。叶子组织被浸入到农杆菌的悬浮液中，并且在室内抽真空。气泡由叶子组织中逸出，并且升到表面上。解除真空，并且含有农杆菌的液体淹没组织，从而使细菌与植物细胞紧密接触。
图12示出用于渗入完整植物(左侧)或分离叶子(右侧)的试验室规模的真空室。
图13示出用农杆菌渗入4天(左侧)、6天(中部)和9天(右侧)之后的分离的叶子。
发明详述
以下的描述阐述了各种示例性的构造、参数等。然而，应当认识到，这种描述无意于限制本发明的范围，相反，其只是对示例性的实施方案进行描述。
1.初始目标酶和分泌信号肽的选择
嗜酸纤维素分解菌是生活在酸性环境中的适温性细菌。β-1，4-内切葡聚糖酶E1酶选自于该有机体，因为其水解纤维素的能力在环境温度下受到抑制，由此植物内(in planta)该基因的表达不会改变植物的表现型。此外，内切葡聚糖酶在pH为5.5(其大致为植物细胞非原质体的pH)的条件下具有最优的活性。而且，几个其它的研究小组已经成功地在稳定的转基因植物内表达了该酶。E1的序列得自于NIH Entrez跨数据库检索(登录号P54583)。成熟蛋白(不含天然的分泌信号肽)由521个氨基酸构成，其中据估计，该蛋白的分子量为56,477Da。该蛋白由催化区域(E1-cd，～40.3kDa)和纤维素连接区域(E1-cbd，～10.8kDa)构成，这两个区域通过接头区域(E1-link，～5.4kDa)相连。41氨基酸天然信号肽用来自水稻α-淀粉酶的25氨基酸信号肽置换，以有利于蛋白从植物细胞中分泌到非原质体内。
2.密码子优化、基因合成
将嗜酸纤维素分解菌的β-1，4-内切葡聚糖酶E1的基因进行密码子优化，以利用得自KEGG数据库的该植物的密码子用表在本氏烟中进行表达。将多组氨酸标签添加到蛋白的C-末端，以允许通过金属亲和色谱快速进行纯化。添加合适的限制性酶位点，以允许插入到我们的表达盒内。由外部的公司化学合成1,566bp的整个DNA片段(DNA 2.0公司，Menlo Park，CA)(图1)。
3.克隆入二元表达载体内
编码来自嗜酸纤维素分解菌的β-1，4-内切葡聚糖酶的化学合成的E1基因由DNA 2.0公司提供到载体pJ210：11772内。图2所示的552aa蛋白的编码区域含有融合在N末端的25aa Ramy3D信号肽和C-末端的6aa组氨酸-标签。
4.克隆入35S表达载体内(以进行组成型表达)
用限制性内切酶Xhol和HindIII分别在位置1198和2872消化含有E1的载体pJ210：11772，以产生定向克隆入穿梭载体pDE00.0113的1674bp片段，从而产生质粒pDP0701。将E1编码区域由35S启动子在下游进行克隆，并且由ocs3的调节序列在上游进行克隆，从而产生E1 35S表达盒。将pDP0701中的E1表达盒(图3)用内切酶AscI通过消化进行切除，并且插入到二元载体pDU97.1005内，从而产生标记为pDP07.0202a的载体(图4)。
5.产生含有35S表达盒的重组农杆菌菌株
将二元质粒pDP07.0202a电穿孔入下述的两种农杆菌菌株(EHA105pCH32和C58C1)内，从而产生两种重组农杆菌(根癌农杆菌)菌株，该菌株可用于在植物系统中瞬时表达E1蛋白。
6.利用在本氏烟中进行的瞬时农杆菌渗入法产生重组纤维素酶
在瞬时表达研究中，采用具有重组CaMV 35S启动子的重组EHA105pCH32农杆菌菌株。在该表达系统中，在强效35S组成型启动子的控制下产生E1转录。将该细菌的菌株在实验室内培养，并且将其用于传染四周龄的烟草植物(本氏烟)。传染可以在基因静默抑制基因的存在或不存在下进行。对4周龄的本氏烟植物的叶子进行真空渗入。在4天后，收获植物组织，匀浆，进行提取并且测试酶活性。将结果总结在图5中。4天后表达的酶的最小量为约1mg纤维素酶/kg鲜植物细胞重量。对应于图5所示的酶量的活性在pH 5.5和65℃的条件下为40,000至52,000nmolMU/分钟/kg鲜植物组织重量。
该试验表明了本氏烟可用于在植物组织中瞬时(并且快速)产生功能性内切葡聚糖酶的原则性证据。观察不同组织和不同植物之间的差异性，但是其产率一般为1mg酶/kg鲜植物重量。在利用该方法使用组成型启动子产生不同的蛋白(人AAT)时也产生了相似的结果(Sudarshana等.Plant Biotech J.4：551-559(2006))。然而，采用病毒扩增表达系统表达AAT时，使得产率增加70倍，因此预期在使用病毒扩增子表达时可以观察到产率的实质性提高。此外，采用活性分析表明，根癌农杆菌本身并不产生酶，而是植物组织产生酶。还表明，C末端的组氨酸标记的rE1并不会消除活性。因此，本发明的一个实施方案是通过瞬时农杆菌渗入法在植物组织中功能性产生rE1。
还表明，即使在稍微较高的表达水平下，也能在收获的本氏烟叶子中产生功能性重组E1(图6)。在这些瞬时表达研究中，EHA105pCH32农杆菌菌株与重组型CaMV 35S启动子一起使用。在试验室中培养细菌菌株，并且用于传染四周龄的烟草(本氏烟)植物。将4周龄的本氏烟植物的叶子进行真空渗入。在4天之后，收获植物组织，匀浆，进行提取并且测试酶活性。在各种条件下储存经渗入的植物和叶子，以确定其对酶产率的影响。在热温室(每日的高温＞30℃，14小时照明/天)中存储完整植物。为了保持收获的叶子成活，将它们存储在恒温为22℃并且遮光的湿度容器内。为了对植物和叶子进行有效的比较，将其中一些以彼此相邻的方式存储在～25℃的室内，其中每天照明16小时。将叶子存储在具有透明盖子的湿度容器内，以允许照明。在温育4天和6天之后，测试完整的植物和收获的叶子的酶活性。6天之后表达的酶的平均量大致为2.6mg纤维素酶/kg鲜植物细胞重量。基于所报道的天然E1的特定活性，将活性分析结果转化为表达水平E1(mg E1/kg鲜植物组织重量)。
在另一个实施方案中，纤维素酶在植物内的活化允许纤维素在叶子组织内原位降解。
虽然该E1实施方案包括使用组成型表达系统(CaMV 35S启动子)在本氏烟中瞬时渗入rE1的具体例子，但是所述方法可用于产生任何纤维素降解酶，包括(而不限于)：其它内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖酶和木聚糖酶，以及利用共渗入法在相同的宿主植物、不同的宿主植物和不同的启动子、质粒和表达系统制备多种酶。
Figure IPA00001314572600011
Figure IPA00001314572600021

Claims (20)

1.一种通过瞬时农杆菌渗入法制备纤维素酶的方法，该方法包括：
-提供农杆菌，该农杆菌包含编码所述纤维素酶的修饰Ti质粒；
-将所述农杆菌与多个植物细胞混合，以形成混合物，并且允许所述多个植物细胞中的至少一个植物细胞传染；并且
-在经过足以使得所述至少一个植物细胞表达所述纤维素酶的一段时间之后，从所述混合物中回收含有纤维素酶的部分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个植物细胞位于完整植物内。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个植物细胞位于分离的植物部分中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述一段时间为至少4天。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在为至少4天的所述一段时间之后，表达至少1mg纤维素酶/kg鲜植物细胞重量。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在为至少6天的所述一段时间之后，表达至少2.6mg纤维素酶/kg鲜植物细胞重量。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素酶来自于适温性有机体。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素酶为外切葡聚糖酶。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素酶为内切葡聚糖酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述内切葡聚糖酶为来自嗜酸纤维素分解菌的β-1，4-内切葡聚糖酶E1。
11.根据权利要求1所述的方法，其中在pH为5.5、温度为65℃的条件下，所述纤维素酶的活性为至少40,000nmol MU/分钟/kg鲜植物组织重量。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述农杆菌为根癌农杆菌。
13.根据权利要求1所述的方法，其中回收所述含有纤维素酶的部分包括使所述多个植物细胞破裂。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素酶的表达处于组成型启动子的控制之下。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述组成型启动子为来自花椰菜花叶病毒的35S。
16.根据权利要求1所述的方法，其中将所述农杆菌与所述多个植物细胞混合包括压力渗入。
17.根据权利要求1所述的方法，其中将所述农杆菌与所述多个植物细胞混合包括真空渗入。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素酶为热稳定性的。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个植物细胞来自本氏烟。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素酶与信号肽相连。
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