WO2012107614A1 - Vacuna contra el virus de la peste porcina africana basada en virus recombinantes deficientes en replicación - Google Patents

Vacuna contra el virus de la peste porcina africana basada en virus recombinantes deficientes en replicación Download PDF

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recombinant virus
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swine fever
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Javier María RODRÍGUEZ MARTÍNEZ
Linda Kathleen DIXON
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Pirbright Institute
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Definitions

  • the present invention relates to a recombinant virus of the virulent strain BA71 of the African swine fever virus, deficient in replication, to the empty viral particles that are produced in isolated cells after infection with said virus and to the use of said material for the development of a vaccine against the African swine fever virus.
  • the African swine fever virus is a double-stranded DNA virus of the Asfarviridae family that causes a very serious hemorrhagic disease in the domestic pig.
  • This disease produces great economic losses in the African continent, where it is endemic, and from where it has spread since 2007 to countries in the Caucasus region and Russia, which poses a danger of re-entry into Western Europe and, likewise, a threat to China and other Asian countries (Rowlands et al. 2008. Emerg Infect Dis 14: 1870-1874).
  • the development of an effective vaccine is, therefore, essential to control the spread of this disease.
  • viruses derived from the attenuated strain BA71 V (adapted to grow in Vero cells) have been produced but no immunological study has been possible with said viruses or with empty particles derived from these, because they are not pathogenic (Zsak et al. 2001. J Virol 75: 3066-3076). Therefore, it is impossible to use viruses derived from strain BA71 V as components of a vaccine against VPPA that produces an effective immune response in vivo.
  • replication-deficient VPPA strains have been produced by conditional expression of certain viral genes required for morphogenesis and genome encapsidation.
  • the viral genes were placed under the control of an IPTG-inducible promoter ( ⁇ sopropyl-BD-1-thiogalactopyranoside), through the introduction into the viral genome of the lac operon repressor / operator system of Escherichia coli (Garc ⁇ a-Escudero et al. 1998. J Virol 72: 3185-3195).
  • IPTG-inducible promoter ⁇ sopropyl-BD-1-thiogalactopyranoside
  • BA71 V viruses have been constructed with repression of pp220 polyproteins (Andres et al. 2002. J Virol 76: 2654-2666), pp62 (Suárez et al. 2010. J Virol 84: 176-187) and of the pB438L protein (Epifano et al. 2006.
  • viruses that do not express genes available for replication but important for virulence and for inhibiting the host's immune response This is the case of viruses that do not express the thymidine kinase (TK) gene generated by the introduction of a repressor + selection cassette in the locus of this gene (Andrés et al. 2002. J Virol 76: 2654-2666) . By introducing the cassette the expression of the TK is eliminated and the recombinants are selected.
  • TK thymidine kinase
  • This system has been used to generate TK- virus through the introduction into the TK locus of the Lac I gene of the Lac repressor, under the control of the viral promoter pU104 and, as a selection marker, the gusA gene ( ⁇ -glucuronidase gene ) under the control of the p72 viral promoter.
  • Viruses have also been created that do not express the homologous protein of the adhesion receptor CD2, a structural protein present in the external domains of the virus and that acts as an immunosuppressant (hinders the immune response of the infected organism), introducing the LacZ gene through low homologous recombination the control of p72, thus breaking the reading frame of the EP402R gene coding for CD2 (Rodr ⁇ guez et al. 1993. J Virol 67: 5312-5320; Ruiz-Gonzalvo et al. 1996. Virology 218: 285-298). Again, in none of these cases immunological studies could be performed in vivo since these viruses deficient in genes available for replication derived from the non-pathogenic strain BA7 V.
  • the tools for generating them were the following: repression of TK expression by the introduction of the repressor + selection cassette composed of the gene / acl under the control of the viral promoter pU104 and the gusA marker gene under the control of the viral promoter p72 and the replacement of the original promoters of the genes of pp220, pp62 and pB438L by the IPTG-inducible promoter p72.l composed of the late promoter p72.4 and the lac operon operator sequence of E. co /; and in addition to the lacZ marker gene for the selection of recombinants.
  • the attenuated strain BA71 V derived from the pathogenic strain BA71 (the strain used in the invention and which is freely accessible to the public), was generated after adaptation to Vero cells, and its genome is sequenced (Yá ⁇ ez et al. 1995. Virology 208: 249-278). The two strains differ at the ends of the DNA, since BA71 V contains two deletions 2.5 and 7 kb in length in said terminal regions (Blasco et al. 1989. Virology 1 68: 330-338). In addition, significant deletions in the left terminal region (LVR) containing genes of the members of the multigenic families MGF360 and MGF530 have been described in strain BA71 V.
  • LVR left terminal region
  • the present invention relates to replication-deficient recombinant viruses derived from the virulent or pathogenic strain BA71, to the empty particles generated in cultures of isolated cells infected by these recombinant viruses under repression conditions and to the use of both for the preparation of a medicine, preferably a vaccine against the African swine fever virus.
  • This invention offers a novel alternative to current treatments against African swine fever by being able to generate an immune response in the animal capable of inducing effective protection against the virus.
  • the replication-deficient recombinant viruses of the present invention derived from the pathogenic strain BA71 possess certain viral genes located under the control of an inducible promoter that allows their conditional expression. Thus, under repression conditions, defective viruses are generated without DNA, but with all the external domains of the viral particle and which can effectively leave the infected cell. Thus, infection with these inducible viruses mimics a normal infection, synthesizing all viral proteins, except those whose expression is repressed in the recombinant virus, and can therefore induce a strong immune response. In this sense, they have a clear advantage over the use as antigens of individual viral proteins or in certain combinations.
  • these inducible recombinant viruses have greater safety, since the viral particles produced are not infective, and there is only one replication cycle.
  • the system of the invention is compatible with the deletion of other viral genes, such as those involved in the control of the immune response by the virus, in the virulence or DNA repair, which would increase the efficiency and safety of the vaccine.
  • strain BA71 can grow and form lysis plaques in COS cells (ATCC, CRL-1650 TM), a cell line that can be transfected very effectively, which is very useful for the construction of recombinant viruses by homologous recombination.
  • the virus produced in these cells retains its virulence, even after the high number of passes required for the construction and purification of the recombinant virus.
  • a vaccine comprising replication-deficient recombinant viruses derived from the pathogenic strain BA71 capable of infecting in vivo and generating an effective immune response, which is impossible in viruses derived from the attenuated strain.
  • BA71 V replication-deficient recombinant viruses derived from the pathogenic strain BA71 capable of infecting in vivo and generating an effective immune response, which is impossible in viruses derived from the attenuated strain.
  • empty viral particles of said viruses have been generated for use in vaccination against virulent isolates of VPPA which, being derived from the pathogenic virus, mimic the viral antigens of the virus and would be more effective than recombinant protein vaccines previously developed, by including many of the structural proteins of the virus.
  • a first aspect of the invention relates to a recombinant virus characterized in that it is obtained from the virulent strain BA71 of the African swine fever virus and because it is deficient in virus replication (hereinafter, "virus of the invention ").
  • African Swine Fever Virus also called in the literature "VPPA”, “ASFV”, “African Swine Fever Virus”
  • VPPA African swine fever virus isolated in Badajoz in 1971 which is highly virulent and whose DNA contains 178 kbp ⁇ Enjuanes et al. 1976. J Gen Virol 32: 471-477).
  • the BA71 strain is open to the public.
  • viruses of the invention have been generated by modifying the viral genome to allow inducible expression of one or more of the genes encoding the pp220, pp62 or pB438L proteins, respectively.
  • a preferred embodiment of the invention refers to the virus of the invention that has repressed the expression of at least one gene that codes for the protein selected from the list comprising polyprotein pp220, polyprotein pp62 and protein pB438L.
  • the polyprotein pp220 in the present invention refers to the polyprotein encoded by strain BA71 which is homologous to pp220 encoded by strain BA71 V or to functional variations thereof.
  • the pp220 of strain BA71 V refers to SEQ ID NO: 1 (accession number NP_042785.1)
  • the term "homologous protein” refers to that protein that has a similar sequence and exerts the same function in the African swine fever virus, regardless of the virus strain. In the present invention, it refers to proteins of strain BA71 that have an amino acid sequence similar to those of strain BA71 V, where similar sequence refers to a sequence with a similarity greater than 95%, which perform the same function in the virus
  • a more preferred embodiment refers to the viruses of the invention where the repressed gene is the one that codes for pp220 polyprotein.
  • Polyprotein pp62 in the present invention refers to the polyprotein encoded by strain BA71 which is homologous to pp62 encoded by strain BA71 V or to functional variations thereof.
  • the pp62 of strain BA71 V refers to SEQ ID NO: 2 (accession number NP_042787).
  • pB438L protein in the present invention refers to the protein encoded by strain BA71 that is homologous to pB438L encoded by strain BA71 V or to functional variations thereof.
  • PB438L of strain BA71 V refers to SEQ ID NO: 3 (accession number NP_042769.1).
  • another more preferred embodiment relates to the viruses of the invention where the repressed gene is the one that codes for the pB438L protein.
  • the inducible expression of the genes encoding the pp220 or pp62 polyproteins or the pB438L protein has been performed by replacing the original promoter of these genes with the inducible promoter p72.l formed by the late viral promoter p72.4 and the operator sequence Or ? of the Lac de E. coli operon.
  • the inducible promoter ⁇ 74 can also be used. That difference of p74.l in the distance from the operating sequence to the beginning of the transduction of the inducible gene (2 and 8 bases, respectively). Both promoters are inducible by IPTG.
  • the present invention also relates to viruses of the invention where genes are induced by other inducers, for example tetracycline, and which contain promoters inducible by them.
  • an even more preferred embodiment of the invention refers to the virus of the invention where said virus comprises a genetic construct comprising an inducible promoter capable of directing said repression.
  • a genetic construct is understood as a nucleotide sequence comprising the coding sequence of the virus of the invention operably linked with at least one promoter that directs the transcription of said sequence, and with other sequences necessary or appropriate to regulate its transcription, by for example, start and end signals, cut sites, polyadenylation signal, origin of replication, transcriptional activators ⁇ enhancers), transcriptional silencers ⁇ silencers), etc.
  • a promoter is a nucleotide sequence that controls the transcription of a given gene.
  • the term "inducible”, as used in this description, refers to the possibility that the promoter has a control element that allows activating or deactivating (repressing) the transcription of the gene that regulates, in the presence of a factor external to the promoter, for example, the addition of a substance to the culture medium in which the organism containing the virus of the invention grows.
  • An IPTG inducible promoter is one that has the necessary elements for transcription to occur only in the presence of this substance.
  • Recombinant viruses also contain at least one selection gene (lacZ that codes for ⁇ -Galactosidase or another selection gene) under the control of the p72 viral promoter.
  • the viruses of the invention further comprise at least one selection gene.
  • selection gene refers to a gene that encodes a protein that confers a characteristic to the organism in which said gene is expressed and which is not found in said organism of In a natural way, such as surviving the presence of an antibiotic, producing a colored substance in the presence of a specific reagent or emitting light.
  • An antibiotic resistance gene codes for a protein that confers on the cell that expresses it, which would normally be sensitive to the antibiotic, the ability to overcome the antibiotic's effect. This protein is usually an enzyme that inactivates the antibiotic in question.
  • an even more preferred embodiment of the invention relates to the virus of the invention, wherein said virus comprises a genetic construct comprising at least one selection gene.
  • viruses of the invention wherein said virus comprises a genetic construct comprising an inducible promoter capable of directing said repression where the promoter is inducible by IPTG.
  • the mechanism to achieve this is based on the constitutive repression either of genes involved in virulence (particularly, the thymidine kinase gene), or of genes that participate in immunosuppression (particularly, the EP402R gene that codes for CD2) or of genes involved in DNA repair (such as the 0174L gene that codes for DNA polymerase X). In all of them it has been possible to use the tools described above for the generation of the replication-deficient viruses derived from BA71 V since it is not described that there are significant differences between this strain and the strain of the invention in these genes available for replication.
  • the repressor + selection cassette that contains (i) the Lac I repressor gene of the E. coli Lac operon under the control of the early / late promoter of the U104L gene (pU104) of the VPPA and (ii) the p72GUS marker, which consists of the ⁇ -glucuronidase ( ⁇ -Gus or gusA) gene under the control of the p72 promoter of the p72 protein gene.
  • the present invention also supports the deletion of the expression of genes available for replication by insertion of a selection gene (eg GFP or EGFP, encoding the green fluorescent protein and the enhanced green fluorescent protein) "or" enhanced green fluorescent protein ", respectively) that interrupts the reading frame of the gene available for replication.
  • a selection gene eg GFP or EGFP, encoding the green fluorescent protein and the enhanced green fluorescent protein
  • enhanced green fluorescent protein or enhanced green fluorescent protein ", respectively
  • TK thymidine kinase
  • strain BA71 that is homologous to thymidine kinase encoded by strain BA71 V or to functional variations thereof.
  • Thymidine kinase of strain BA71 V refers to SEQ ID NO: 4 (accession number NP_042744.1).
  • the CD2 (also called “adhesion receptor homologue CD2" or “hemagglutinin”) in the present invention refers to the protein encoded by the EP402R gene by strain BA71 which is homologous to the CD2 encoded by strain BA71 V or to variations Functional of it.
  • the CD2 of strain BA71 V refers to SEQ ID NO: 5 (accession number NP__042752.1).
  • Polymerase X in the present invention refers to the protein encoded by the 0174L gene by strain BA71 which is homologous to pol X encoded by strain BA71 V or to functional variations Of the same.
  • Pol X of strain BA71 V refers to SEQ ID NO: 6 (accession number NP_042790.1).
  • the genes available for repiration comprise at least one gene that is selected from the list comprising: gene that participates in the virulence of the virus, gene that participates in immunosuppression, and gene that participates in DNA repair.
  • the gene available for repiration is selected from the list comprising: the thymidine kinase gene, the EP402R gene and the 0174L gene, or any combination thereof.
  • a more preferred embodiment relates to the virus of the invention where genes available for repiration are repressed because they have varied reading frames and do not express a viable protein.
  • Also part of the invention are genetic DNA constructs that encode sequences of the recombinant virus of the invention.
  • Said genetic construction of DNA would direct the intracellular transcription of the virus sequence or fragment thereof, and comprises at least one of the following types of sequences: a) DNA sequence comprising at least the coding sequence of the virus the invention for its intracellular transcription, b) an expression cassette comprising the DNA sequence defined in a) operably linked to transcription control elements and optionally translation; c) DNA sequence corresponding to a gene expression system or vector comprising the coding sequence of the virus of the invention, operably linked with at least one promoter that directs the transcription of said sequence, and with other sequences to regulate its transcription such as, for example, start and end signals, cut sites, or polyadenylation signal, where preferably the vector is a plasmid.
  • Another aspect of the invention relates to the host cell comprising the nucleic acid, the expression cassette or the vector encoding sequences of the virus of the invention, where the cell is preferably a mammalian cell (not belonging to the group of cells embryonic or germinal human), of insect, yeast or bacteria.
  • the introduction of said gene constructs can be carried out with the methods known in the state of the art. It also refers to the method of production of the virus of the invention comprising culturing said host cells.
  • Another preferred embodiment relates to the use of the viruses of the invention for the preparation of a pharmaceutical composition.
  • composition refers to any substance used for prevention, diagnosis, relief, treatment or cure of diseases. In the context of the present invention it refers to a composition comprising at least the viruses of the invention.
  • a more preferred embodiment relates to the use of the virus of the invention for the preparation of a pharmaceutical composition for the treatment of African swine fever, preferably for the prophylaxis of African swine fever.
  • composition of the invention can be used both alone and in combination with other compositions for the treatment or prevention of African swine fever.
  • Treatment refers to both therapeutic and prophylactic treatment or preventive measures. Those necessary for treatment include those already associated with alterations as well as those in which the alteration is prevented. An “alteration” is any condition that would benefit from treatment with the composition of the invention, as described herein.
  • An even more preferred embodiment of the invention relates to the use of the virus of the invention for the preparation of a pharmaceutical composition for the prophylaxis of African swine fever where said pharmaceutical composition is a vaccine.
  • the term "vaccine” refers to an antigen preparation used to elicit a response of the immune system to the disease caused by an African swine fever virus. It is a preparation of antigens that, once inside the organism, provokes the response of the immune system through the production of antibodies, and generates immunological memory producing permanent or transient immunity.
  • Another aspect of the invention relates to a vaccine against the African swine fever virus comprising a therapeutically effective amount of the virus of the invention.
  • therapeutically effective amount refers to the amount of modulating agents calculated to produce the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of said agents (and constructions) and the therapeutic effect to be achieved.
  • Pharmaceutically acceptable adjuvants and vehicles that can be used in said compositions are the vehicles known to those skilled in the art.
  • the vaccine comprising the virus of the invention further comprises at least one excipient and / or at least one pharmacologically acceptable carrier.
  • excipient refers to a substance that aids in the absorption of the vaccine containing the virus of the invention, stabilizes said vaccine or aids in the preparation of the pharmaceutical composition in the sense of giving it a consistency, form, taste or any other specific functional characteristic.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together such as starches, sugars or cellulose, sweetening function, dye function, drug protection function such as to isolate it from air and / or moisture, function of filling a tablet, capsule or any other form of presentation such as dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • a “pharmacologically acceptable vehicle” refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical forms of administration and includes, but are not limited to, solids, liquids, solvents or surfactants.
  • the carrier can be an inert substance or of analogous action to any of the compounds of the present invention and whose function is to facilitate the incorporation of the drug as well as other compounds, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the composition Pharmaceutical
  • the presentation form is liquid
  • the vehicle is the diluent.
  • pharmaceutically acceptable refers to the compound referred to being allowed and evaluated so as not to cause damage to the organisms to which it is administered.
  • compositions or vaccine provided by this invention can be facilitated by any route of administration, for which said composition will be formulated in the pharmaceutical form appropriate to the route of administration chosen.
  • the vaccine containing the viruses of the invention comprises at least one other active ingredient.
  • the present invention also relates to the use of the vaccine containing the virus of the invention for the manufacture of a pharmaceutical composition for the prophylaxis of mammalian animals, preferably of the Suidae family, for example pigs.
  • the viruses of the invention under repression conditions (that is, in the absence of the promoter inducer under whose control certain viral genes have been placed) the viruses of the invention are capable of infecting the host cell but not producing complete viruses, and the viral particles that leave the cell are empty, since they lack the DNA. Therefore, in an infection in vivo with the viruses of the invention, said empty viral particles naturally occur inside the infected animal as it is a system that lacks the inductor.
  • a preferred embodiment is the process for obtaining empty viral particles (hereafter referred to as "viral particles of the invention") comprising the infection of isolated cells with the recombinant virus of the invention in the absence of the promoter inducing agent which controls the viral genes whose transcription you want to repress.
  • “Infection” in the present invention is understood as that pathology generated by the invasion or colonization of any host tissue by the African swine fever virus. "Infection of isolated cells” is understood to be an in vitro infection in which isolated cells infected by the virus of the invention are deprived of the inducer for the correct generation of empty viral particles.
  • isolated cell is understood herein to be that cell grown in vitro for the production of empty viral particles when they are not cultured with the inducing agent or for the production of the recombinant viruses of the invention when they are cultured with the inducer.
  • the isolated cells are preferably cell lines.
  • An even more preferred embodiment of the invention refers to the empty viral particle generated by infection of the isolated cells with the viruses of the invention, hereinafter "viral particle of the invention”.
  • Another preferred embodiment of the invention relates to the use of the viral particle of the invention that is generated by infection by the virus of the invention for the preparation of a pharmaceutical composition, preferably for the treatment of African swine fever, more preferably for the African swine fever prophylaxis. More preferably said pharmaceutical composition is a vaccine.
  • Said vaccine further comprises a therapeutically effective amount of the viral particles of the invention, and preferably also comprises at least one pharmaceutically acceptable adjuvant, excipient and / or vehicle, where in another even more preferred embodiment the adjuvant is Freund's adjuvant, and that it can also comprise at least one other active ingredient.
  • Another aspect of the invention relates to the use of the vaccine containing the viral particles of the invention against the African swine fever virus for the preparation of a pharmaceutical composition for the prophylaxis of mammalian animals, preferably of the Suidae family, for example pigs
  • polynucleotide and the term “nucleic acid” refer to a polymeric form of nucleotides of any length, both ribonucieotides and deoxyribonucleotides.
  • peptide oligopeptide
  • polypeptide polypeptide
  • polyprotein protein
  • FIG. 1 Virulence assay of strain BA71 grown in COS cells. Virulence of the BA71 strain virus grown in COS cells was tested to verify that its virulence was not affected by its growth in said cell line.
  • A determination of the rectal temperature of pigs infected with different doses (10 4 Dl 50 and 100 Dl 50j being Dl 50 the 50% infectious dose) of BA71 virus before (BA71) and after (BA71 Cos) of 10 proliferation cycles in COS cells.
  • dO day in which the virus was inoculated
  • d1 -10 days post inoculation.
  • B survival test of infected pigs as described in A; "n" is the number of animals in each group.
  • FIG. 1 Construction of the replication-deficient recombinant virus, BA71.v220i.TK-.
  • the BA71 .v220i.TK- virus was constructed that inducibly expresses pp220 polyprotein and is not virulent because it does not express thymidine kinase (TK), using the molecular tools previously described starting from the non-pathogenic strain BA71 V.
  • A scheme of the BA71 .v220i.TK- virus. It is appreciated that the Lac I repressor gene and the ⁇ -glucuronidase (B-gus) marker gene are inserted into the TK locus to generate the intermediate virus BA71 .vGUSREP.TK-.
  • the BA71 .v220i.TK- virus is obtained by placing the pp220 polyprotein gene under the control of the inducible promoter p72.L
  • a marker gene, lac Z, which codes for the B-galactosidase allows the selection of recombinant B, Western blot to detect the expression of pp220 in COS cells after infection with the BA71 .v220i.TK- virus in the presence (+) or absence (-) of the IPTG inducer.
  • the absence of pp220 is shown in two clones of infected and grown COS cells in the absence of IPTG (1 and 2) and how the presence of IPTG in the culture medium results in the expression of pp220.
  • the p72 capsid protein was used as load control.
  • repressor + selection cassette containing the lac I gene under the control of the constitutive promoter pU104 of the virus, the B-gus marker gene under the control of the late viral promoter p72 and the flanking regions of the EP402R (viral CD2) gene for recombination homologous with BA71, where 10T are transcription termination signals.
  • the restriction targets used are indicated: Spe ⁇ and Af B, scheme of the BA71 virus .v220i.CD2-
  • the pp220 polyprotein gene is placed under the control of the inducible promoter p72.i.
  • a marker gene, lac Z which codes for B-galactosidase allows the selection of recombinants.
  • Lac I repressor gene and the B-glucuronidase marker gene ⁇ B-gus are inserted into the locus of the CD2 gene under the control of the promoters pU104 and p72, respectively.
  • the BA71 .v220i.CD2-.PolX- virus was constructed using the tools previously described for the replication-deficient recombinant viruses derived from the non-pathogenic strain BA71 V.
  • the intermediate virus BA71 .pp220 was generated with the gene of pp220 under the control of the p72.fy promoter, as a marker gene, lac Z, which codes for ⁇ -galactosidase allowing the selection of recombinants as described above. Subsequently, the Lac I repressor gene and the ⁇ -gus or gusA marker gene are inserted into the locus of the CD2 gene, thus generating the BA71 .v220i.CD2- virus. Starting from said virus, the expression of the pol X gene is deleted by insertion of the EGFP ("enhanced green fluorescent protein") gene under the p72 promoter.
  • EGFP enhanced green fluorescent protein
  • 061R is a gene used in this construct for homologous recombination.
  • Figure 5. Immunological tests with the BA71.v220i.TK- virus.
  • A ELISA showing the levels of anti-VPPA antibodies in pigs vaccinated with 10 5 Dl 50 (P4 to P9), 10 7 Dl 50 ⁇ P10 to P15) of the inducible virus BA71 .v220.TK- or inoculated with PBS (buffer saline phosphate) as a control (P1 to P3), and subsequently infected with 10 3 Dl 50 of virulent parental virus BA71.
  • PBS buffer saline phosphate
  • EXAMPLE 1 The BA71 virus retains virulence after COS cell growth.
  • COS cells (ATCC, CRL-1650 TM) are used for the generation of recombinant viruses and empty viral particles, to verify that the growth in said cells does not attenuate the virulent strain BA71, it was analyzed whether the virulence of the strain BA71 was affected by its proliferation in said cells.
  • BA71 Cos (pigs 7-9) (pigs 10-12)
  • inoculation with strain BA71 virus was very pathogenic, causing severe clinical symptoms, including high fever from day 3 post-innocuation until the end of the experiment, and regardless of the dose used.
  • a dose of 10 4 Dl 50 of the BA71 virus passed by COS (Ba71 Cos)
  • the disease followed the same course as with the BA71 virus without that pass (BA71)
  • lower doses (10 2 Dl 50 ) some pigs they suffered a slight delay in the onset of clinical symptoms, including fever (Fig. 1 A), and in the decrease of their survival (Fig. 1 B).
  • EXAMPLE 2 Obtaining the recombinant viruses that do not express the thymidine kinase gene BA71.v220i.TK-, BA71.v62i.TK- and BA71.vB438Li.TK- and in which the expression of pp220, pp62 and proteins pB438, respectively, is inducible.
  • thymidine kinase negative (TK-) from strain BA71, the molecular tools described above were used and in Andrés et al. 2002. J Virol 76: 2654-2666; Suárez et al. 2010. J Virol 84: 176-187; and Epifano et al. 2006. J Virol 80: 1 1456-1 1466; with some modification that we will detail.
  • a virus of strain BA71 To generate the BA71 .v220i.TK- virus, an attenuated recombinant virus, deficient in replication and in which the expression of pp220 is inducible by IPTG, was started from a virus of strain BA71.
  • the expression of the TK was deleted (Fig. 2A) using a repressor cassette + homologous recombination selection that is inserted into the TK locus.
  • This cassette contained (i) the lactose repressor gene ⁇ Lac I) under the control of the early / late promoter of the VP10 U104L gene (pU104) and (i ⁇ ) the p72GUS marker, which consists of the ⁇ - gene glucuronidase under the control of the late promoter p72 (Fig. 2A).
  • the intermediate virus, BA71 .GUSREP.TK- was purified by successive rounds of proliferation and isolation of lysis plaques in COS cells to complete purity.
  • the inducible BA71.v220i.TK- virus in the pp220 polyprotein gene was constructed from the intermediate virus BA71 .GUSREP.TK-, by introducing the pp220 gene under the control of the IPTG-inducible promoter (Z2./), which consists of the p72 promoter, the E. coli lac operator and the tac Z gene (which encodes ⁇ -galactosidase used as a marker to select recombinant viruses), following the procedure described for the construction of a similar recombinant virus starting from strain BA71 V described in Andrés et al. J Virol 2002. 76: 2654-2666.
  • Z2./ IPTG-inducible promoter
  • the resulting BA71 .v220i.TK- virus was purified by successive rounds of lysis plate isolation in COS cells.
  • the expression of pp220 in COS cells infected with this virus and grown in media with and without IPTG was determined.
  • Expression of pp220 polyprotein was examined by Western blot using specific antibodies (Andrés et al. J Virol 202. 76: 2654-2666). As shown in Fig. 2B, the expression of pp220 only occurs when culturing infected cells in a medium supplemented with IPTG.
  • the BA71 .v62i.TK- and BA71 .vB438Li.TK- viruses were generated with the same tools as for the BA71 .v220i.TK- but the genes that are regulated by the inducible promoter code for pp62 and pB438L, respectively.
  • EXAMPLE 3 Obtaining the inducible virus BA71.v220i.CD2-.
  • a virus was first constructed with the expression of inducible pp220, starting from a virus of strain BA71 and placing the pp220 polyprotein gene under the control of the IPTG-inducible promoter (p72.f) (Fig. 3B).
  • a repressor + selection cassette (essentially identical to that used for the construction of the TK- viruses) was inserted by homologous recombination into the CD2 gene, the EP402R (Fig. 3A), thus deleting his expression.
  • EXAMPLE 4 Obtaining the inducible virus BA71.v220i.CD2- PolX-. To obtain this replication-deficient recombinant virus, with expression of DNA polymerase X and deletioned CD2, and inducible expression of pp220 as explained above, the tools for the elaboration of replication-deficient viruses derived from strain BA71 were used. V described in Garc ⁇ a-Escudero et al. 1998. J Virol 72: 3185-3195; Rodr ⁇ gez et al. 1993. J Virol 67: 5312-5320; and Andrés et al. 2002. J Virol 76: 2654-2666; with some modification that we will detail.
  • TK + and CD2- that did not express the 0174L gene, which codes for the reparative DNA polymerase, pol X ..
  • the methodology used is that described above. The procedures previously described in the present invention were followed starting from the BA71 .v220i.CD2- virus which has the repressor + selection cassette inserted in the CD2 gene.
  • the pol X- virus was generated by introducing the EGFP gene into the pol X gene, which serves as a selection marker, under the control of the p72 promoter, as shown in the scheme of Figure 4.
  • EXAMPLE 5 Immunization and survival assays with the inducible virus BA71.v220i.TK-.
  • groups of pigs were immunized with 10 7 pfu or 10 5 pfu (plaque forming units) of BA71 .v220i.TK- (six pigs per group, twice in an interval of two weeks) and the results were compared with control pigs in which PBS (three animals) were inoculated.
  • PBS three animals
  • Serum and blood samples were collected after each dose of vaccine at different days after infection to study the humoral and cellular response induced by a specific ELISA test to detect VPPA (Fig. 5A) and an ELISPOT test (Fig. 5B).
  • a specific stimulus in the ELISPOT assay 10 5 pfu of BA71 .v220i.TK- per million peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was used in a 20 hr trial.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the survival trial revealed that pigs inoculated with PBS died before day 7 after infection, while 50% of pigs vaccinated with the maximum dose of BA71 .v220i.TK- survived until day 9 after infection (Fig . 5C).
  • EXAMPLE 6 Obtaining empty icosahedral particles and tubular viral structures.
  • empty icosahedral particles are produced that contain the external domains of the virus (internal envelope, capsid and external envelope), but not internal ones (intermediate and nucleoid domain) and therefore They also lack the DNA of the virus.
  • COS cells were infected with 0.1 pfu of the inducible virus BA71 .v220i.TK-, BA71 .v62i.TK- or BA71 .vB438Li.TK- per cell and cultured in the absence of the inducer.
  • Viral particles were purified from the medium by Percoll gradient centrifugation and Sephacryll column chromatography (Carrascosa et al. J Virol 1985. 54: 337-344). Empty viral particles generated by repression of pp220, pp62 and pB438L were obtained, respectively.
  • Preconfluent monolayers of COS cells were infected with BA71 .v220i.TK- virus, BA71 .v62i.TK- virus or BA71 .vB438Li.TK- virus, at a multiplicity of infection of 0.1 pfu per cell
  • the cells were maintained in DMEM medium with 2% fetal calf serum and 1 mM IPTG. After 2 hours of adsorption of the virus at 37 9 C, in an incubator with 5% CO 2 , the inoculum was removed and fresh medium with IPTG was added at the same concentration, incubating as before at 37 S C until it was observed a total cytopathic effect (usually after 48-72 hours).
  • the culture medium containing the extracellular virus produced was collected and centrifuged at low speed (Sorvall GS3 rotor at 2500 rpm for 15 min at 4 Q C) to remove cellular debris and then centrifuged at high speed (rotor Sorvall GS3 at 6500 rpm for 8.5 h at 4 ⁇ C) to sediment the virus.
  • the sediment was resuspended in 1/100 of the initial volume and the virus was purified by centrifugation for 1 h at 4 9 C on a 25% sucrose mattress in PBS, using a Sorvall SW41. T ⁇ rotor at 100,000g.
  • the sediment obtained was resuspended in 1/500 of the initial volume and titrated in COS cells in the presence of it IPTG concentration by the lysis plate formation method (Enjuanes et al. 1976. J Gen V ⁇ rol 32: 471-477).
  • the virus concentration is expressed as plaque forming units (pfu) by me.
  • COS cells infected by BA71 .v220i.TK- were lysed in the presence or absence of the IPTG inducer and the pp220 levels were analyzed by immunoblot or western biot with specific antibodies described in Andrés et al. J Virol 202. 76: 2654-2666.
  • the antibody against p72 was used as a loading control.
  • Each well of a 96-well ELISA plate is upholstered for 12 hours at 4 s with 100 ⁇ of the corresponding protein diluted ⁇ 5 Mg / ml) in carbonate-bicarbonate buffer pH 9.6, and incubated for 12 hours at 4 9 C. After washing the plates 3 times with PBS-Tween 20 0.05% (v / v), they are blocked with 100 ⁇ PBS-1% bovine serum albumin (BSA) for 1 hour at 37 S C Serum samples are added to the appropriate dilutions to each well and incubated for 1 hour at 37 9 C, after which the plates are washed and the peroxidase-conjugated secondary antibody (pig anti-lgG at 1: 20000 is added).
  • BSA bovine serum albumin
  • PBMCs peripheral blood mononucial cells
  • PBMCs were purified from blood collected in the presence of EDTA anticoagulant (2.5 mM), using a density gradient on Histopaque 1077 (Sigma). 20 ml of diluted blood 1: 1 with PBS was deposited on a 4 ml mattress of Histopaque 1077 and, after centrifugation for 30 minutes at 500xg, the interface between the plasma and the Histopaque, containing the PBMCs, was collected and then lys erythrocytes.
  • ELISPOT immunosorbent assay for 30 minutes at 500xg
  • porcine IFN and secretory cells against VPPA was determined by an ELISPOT assay following the method described in Diaz and Mateu. 2005. Vet Immunol Immunopathol 106: 107-12. For this, 96-well plates (Costar 3590, Corning) were upholstered with 50 ⁇ / well of a porcine anti-IFN antibody (BD Pharmingen, clone P2G10) at a 1: 100 dilution in carbonate-bicarbonate buffer pH 9.6, for 14 hours at 4 S C.
  • porcine anti-IFN antibody BD Pharmingen, clone P2G10
  • COS cells grown in DMEM medium were infected with 2% fetal calf serum in the absence of the IPTG inducer at a concentration of 0.1 pfu / cell of the BA71 .v220i.TK-, BA71 .v62i.TK- and BA71 viruses.
  • pB438L.TK- The particles Empty virals were purified as described to purify the BA71 .v220i.TK-, BA71 .v62i.TK- and BA71 .vB438Li.TK- viruses.

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Abstract

La presente invención, se refiere una serie de virus de la peste porcina africana (ASFV) recombinantes, caracterizados por que se obtienen a partir de la cepa virulenta BA71 que presentan reprimida la expresión del gen pp220, pp62 o pB438L. En el caso de estar reprimido pp220, tienen suprimido también el gen TK, o el gen CD2 opcionalmente junto con el de la pol X, mientras que las cepas que tienen reprimido pp62 o pB438L presentan suprimida la TK. Además, se refiere a las partículas virales vacías que se generan naturalmente tras la infección con los virus recombinantes deficientes en replicación y a su uso en una vacuna frente a la peste porcina africana.

Description

VACUNA CONTRA EL VIRUS DE LA PESTE PORCINA AFRICANA BASADA EN VIRUS RECOMBINANTES DEFICIENTES EN REPLICACIÓN.
La presente invención se refiere a un virus recombínante de la cepa virulenta BA71 del virus de la peste porcina africana, deficiente en replicación, a las partículas virales vacías que se producen en células aisladas tras la infección con dicho virus y al uso de dicho material para la elaboración de una vacuna contra el virus de la peste porcina africana. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El virus de la peste porcina africana (VPPA) es un virus de DNA de doble cadena de la familia Asfarviridae que provoca una enfermedad hemorrágica muy grave en el cerdo doméstico. Dicha enfermedad produce grandes pérdidas económicas en el continente africano, donde es endémica, y desde donde se ha extendido desde 2007 a países de la región del Cáucaso y a Rusia, lo que supone un peligro de reentrada en Europa occidental y, asimismo, una amenaza para China y otros países asiáticos (Rowlands et al. 2008. Emerg Infect Dis 14:1870-1874). El desarrollo de una vacuna eficaz es, por lo tanto, fundamental para controlar la propagación de esta enfermedad.
A pesar del conocimiento que se tiene actualmente sobre la biología del VPPA, los esfuerzos realizados hasta ahora para conseguir una vacuna eficaz han sido escasos e infructuosos. Se han utilizado preparados inactivados del VPPA que aunque son capaces de inducir una respuesta humoral no protegen frente al virus (Stone y Hess. 1967. Am J Vet Res 28:475-481 ). También se han usado sin éxito cepas atenuadas del VPPA, ya que la inmunización de cerdos con cepas atenuadas del virus induce protección solamente frente al virus virulento homólogo pero no frente al heterólogo (Mebus. 1988. Ad Virus Res 35:251 -269). Por otra parte, también se han utilizado vacunas basadas en proteínas virales, pero la gran complejidad del VPPA, que codifica por más de 150 proteínas, dificulta la selección de los antígenos virales candidatos para el desarrollo de este tipo de vacunas. No obstante, se ha descrito el potencial de protección de tres proteínas estructurales del virus, p54, p30 y pEP402R (también conocida como CD2 o hemaglutinina), expresadas en un sistema de baculovirus y administradas con adyuvante de Freund's, que inducen anticuerpos neutralizantes y una protección parcial (Ruiz-Gonzalvo et al. 1996. Virol 218:285-289; Gómez-Puertas et al. 1998. Virol 243:461 -471 ).
En relación a la producción de virus recombinantes deficientes en replicación, se han producido virus derivados de la cepa atenuada BA71 V (adaptada a crecer en células Vero) pero no se ha podido realizar ningún estudio inmunológico con dichos virus ni con las partículas vacías derivadas de estos, porque no son patogénicos (Zsak et al. 2001 . J Virol 75:3066-3076). Por lo tanto, es imposible la utilización de virus derivados de la cepa BA71 V como componentes de una vacuna frente al VPPA que produzca una respuesta inmune efectiva in vivo. Por otra parte, para la producción de dichos virus derivados de la cepa atenuada BA71 V, se han producido estirpes del VPPA deficientes en replicación mediante la expresión condicional de ciertos genes virales requeridos para la morfogénesis y encapsidación del genoma. Para ello, los genes virales se situaron bajo el control de un promotor inducible por IPTG (ísopropil-B-D-1 -tíogalactopiranósido), medíante la introducción en el genoma viral del sistema represor/operador del operón lac de Escherichia coli (García- Escudero et al. 1998. J Virol 72:3185-3195). De esta manera, se han construido virus atenuados BA71 V con represión de las poliproteínas pp220 (Andrés et al. 2002. J Virol 76:2654-2666), pp62 (Suárez et al. 2010. J Virol 84:176-187) y de la proteína pB438L (Epifano et al. 2006. J Virol 80:1 1456-1 1466). En estos estudios se ha observado que, cuando no se añade IPTG durante el proceso de producción viral, no se expresan las proteínas reguladas por el promotor inducible y se generan partículas virales vacías, en el caso de la represión de pp220 o pp62, de estructura icosaédrica y carentes de los dominios internos del virus y del DNA y, en el caso de la represión de pB438L, estructuras tubulares carentes de DNA. En todos estos casos, las partículas virales aberrantes no son infecciosas al carecer de DNA, pero contienen los dominios externos (envuelta interna y cápsida) y pueden salir eficazmente de la célula infectada.
Otros virus recombinantes construidos utilizando la cepa atenuada y no patogénica BA71 V son virus que no expresan genes dispensables para la replicación pero importantes para la virulencia y para la inhibición de la respuesta inmune del hospedador. Es el caso de los virus que no expresan el gen de la timidina quinasa (TK) generados mediante la introducción de un cassette de represor+selección en el locus de este gen (Andrés et al. 2002. J Virol 76:2654-2666). Mediante la introducción del cassette se elimina la expresión de la TK y se seleccionan los recombinantes. Este sistema se ha utilizado para generar virus TK- mediante la introducción en el locus de TK del gen lac I del represor Lac, bajo el control del promotor viral pU104 y, como marcador de selección, el gen gusA (gen de la β-glucuronidasa) bajo el control del promotor viral p72. También se han creado virus que no expresan la proteína homologa del receptor de adhesión CD2, una proteína estructural presente en los dominios externos del virus y que actúa como inmunosupresor (dificulta la respuesta inmune del organismo infectado), introduciendo el gen LacZ mediante recombinación homologa bajo el control de p72, rompiendo así el marco de lectura del gen EP402R que codifica por la CD2 (Rodríguez et al. 1993. J Virol 67:5312-5320; Ruiz-Gonzalvo et al. 1996. Virology 218:285-298). Nuevamente, en ninguno de estos casos se pudieron realizar estudios inmunológicos in vivo ya que estos virus deficientes en genes dispensables para la replicación derivaban de la cepa no patogénica BA7 V.
La producción de virus recombinantes deficientes en replicación que además no expresan alguno de los genes dispensables para la replicación, como el gen de la TK, se ha realizado hasta la fecha también en virus de la cepa atenuada BA71 V, haciendo imposible su uso en vacunación (Andrés et al. 2002. J Virol 76:2654-2666, Suárez et al. 2010. J Virol 84:176-187 y Epifano et al. 2006. J Virol 80:1 1456-1 1466, respectivamente). Es el caso de virus TK- e índucíbles en el gen de la pp220 (virus BA71 V.v220i.TK-) (Andrés et al. 2002. J Virol 76:2654-2666), en el de la pp62 (virus BA71 V.v62i.TK-) (Suárez et al. 2010. J Vírol 84:176-187) y en el de la pB438L (virus BA71 V.vB438Li.TK-) (Epifano et al. 2006. J Virol 80:1 1456-1 1466). Las herramientas para ia generación de los mismos fueron las siguientes: la represión de la expresión de TK mediante la introducción del cassette de represor+selección compuesto por el gen /acl bajo el control del promotor viral pU104 y el gen marcador gusA bajo el control del promotor viral p72 y la sustitución de los promotores origínales de los genes de pp220, pp62 y pB438L por el promotor inducible por IPTG p72.l compuesto por el promotor tardío p72.4 y la secuencia del operador del operón lac de E. co/ ; y además del gen marcador lacZ para la selección de los recombinantes. En ninguno de los casos se han utilizado los virus o las partículas virales aberrantes que se generan en ausencia de inductor en inmunización para el VPPA. La cepa atenuada BA71 V derivada de la cepa patogénica BA71 (la cepa utilizada en la invención y que es de libre acceso al público), se generó tras su adaptación a células Vero, y su genoma está secuenciado (Yáñez et al. 1995. Virology 208:249-278). Las dos cepas difieren en los extremos del DNA, ya que BA71 V contiene dos deleciones de 2.5 y 7 kb de longitud en dichas regiones terminales (Blasco et al. 1989. Virology 1 68:330-338). Además, en la cepa BA71 V se han descrito deleciones significativas en la región terminal izquierda (LVR) que contiene genes de los miembros de las familias multigénicas MGF360 y de la MGF530. Estos genes son esenciales en la supervivencia de las células infectadas e importantes en la patogénesis y virulencia (Zsak et al. 2001 . J Vírol 75:3066-3076). La comparación de mapas de restricción entre 23 aislados virales de VPPA reveló que el genoma viral se mantiene constante en la zona central (de 125 kb de longitud) mientras que existen dos regiones variables en los extremos, de 38-47 kb en el extremo izquierdo y de 13-16 kb en el extremo derecho (Blasco et al. 1989. Virology 68:330-338). Como se ha señalado anteriormente, los virus recombinantes deficientes en replicación derivados de la cepa atenuada BA71 V no han sido utilizados en vacunación in vivo al no ser virus infectivos. Dado que ninguno de los abordajes que se han utilizado hasta el momento han conseguido generar una vacuna eficaz contra el VPPA, se hace necesario un nuevo enfoque para el desarrollo de una nueva vacuna efectiva. EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a virus recombinantes deficientes en replicación derivados de la cepa virulenta o patogénica BA71 , a las partículas vacías que se generan en cultivos de células aisladas infectadas por estos virus recombinantes en condiciones de represión y al uso de ambas para la elaboración de un medicamento, preferiblemente una vacuna frente al virus de la peste porcina africana. Esta invención ofrece una alternativa novedosa a los tratamientos actuales frente a la peste porcina africana al ser capaz de generar una respuesta inmunológica en el animal capaz de inducir una protección eficaz frente al virus.
Los virus recombinantes de la presente invención deficientes en replicación derivados de la cepa patogénica BA71 poseen ciertos genes vírales situados bajo el control de un promotor inducible que permite su expresión condicional. De este modo, en condiciones de represión, se generan virus defectivos sin DNA, pero con todos los dominios extemos de la partícula viral y que pueden salir eficazmente de la célula infectada. Así, la infección con estos virus inducibles mimetiza una infección normal, sintetizándose todas las proteínas virales, excepto aquellas cuya expresión está reprimida en el virus recombinante, y se puede por tanto inducir una fuerte respuesta inmune. En este sentido, presentan una clara ventaja frente a la utilización como antígenos de proteínas virales individuales o en determinadas combinaciones. Respecto a la utilización de virus atenuados, estos virus recombinantes inducibles presentan mayor seguridad, dado que las partículas vírales producidas no son infectivas, y hay un solo ciclo de replicación. Además, el sistema de la invención es compatible con la deleción de otros genes virales, como aquellos implicados en el control de la respuesta inmune por parte del virus, en la virulencia o en la reparación del DNA, lo que aumentaría la eficiencia y seguridad de la vacuna.
Dado que la cepa virulenta BA71 presenta con respecto a la no patogénica BA71 V diferencias en los extremos del DNA, pero no hay diferencias en las zonas necesarias para la generación de los virus recombinantes, se han podido utilizar las mismas herramientas descritas en la generación de virus deficientes en replicación derivados de BA71 V descritas anteriormente. Así, se han podido construir virus patogénicos que pueden crecerse en células aisladas en presencia del inductor (IPTG), pero que, una vez han infectado al hospedador, al no haber inductor son defectivos en su replicación, únicamente generan partículas virales vacías, siendo por lo tanto muy seguros como vacunas potenciales. Una ventaja adicional de la cepa BA71 es que puede crecer y formar placas de lisis en células COS (ATCC, CRL-1650™), una línea celular que puede ser transfectada muy eficazmente, lo que es muy útil para la construcción de los virus recombinantes por recombínación homologa. Además, el virus producido en estas células conserva su virulencia, incluso después del alto número de pases que se requieren para la construcción y purificación del virus recombinante. De este modo, se ha conseguido generar con éxito una vacuna que comprende virus recombinantes deficientes en replicación derivados de la cepa patogénica BA71 capaces de infectar in vivo y de generar una respuesta inmune efectiva, lo que es imposible en los virus derivados de la cepa atenuada BA71 V. Además, se han generado partículas virales vacías de dichos virus para su uso en vacunación frente a aislados virulentos del VPPA que, al ser derivadas del virus patogénico, mimetizan los antígenos virales de éste y serían más efectivas que las vacunas de proteínas recombinantes desarrolladas previamente, al incluir muchas de las proteínas estructurales del virus.
Los virus recombinantes de la presente invención expresan de modo inducible uno o varios de los genes pp220, pp62 y pB438L y además tienen reprimida la expresión de genes implicados en el control de la respuesta inmune por parte del virus o en la virulencia, tales como el gen de la timidina quinasa (TK), y/o el homólogo del receptor de adhesión CD2 (CD2); y/o el gen de reparación de la DNA polimerasa X (pol X) para conferirles mayor seguridad. Así, un primer aspecto de la invención se refiere a un virus recombínante caracterizado porque se obtiene a partir de la cepa virulenta BA71 del virus de la peste porcina africana y porque es deficiente en la replicación del virus (en adelante, "virus de la invención"). El término "Virus de la Peste Porcina Africana", también llamado en la literatura "VPPA", "ASFV", "African Swine Fever Virus", se refiere a un virus de DNA de cadena doble con envoltura de la familia Asfarvirídae que infecta, entre otros, a animales de la familia Suidae. La cepa BA71 se refiere al virus de la peste porcina africana aislada en Badajoz en 1971 que es altamente virulenta y cuyo DNA contiene 178 kpb {Enjuanes et al. 1976. J Gen Virol 32: 471 -477). Actualmente, la secuencia del genoma de la cepa BA71 no está publicada. La cepa BA71 es de acceso libre al público.
Los virus de la invención se han generado mediante la modificación del genoma viral para permitir la expresión inducible de uno o varios de los genes que codifican las proteínas pp220, pp62 o pB438L, respectivamente. Por lo que una realización preferida de la invención se refiere al virus de la invención que tiene reprimida la expresión de al menos un gen que codifica para la proteína seleccionada de la lista que comprende la poliproteína pp220, la poliproteína pp62 y la proteína pB438L.
La poliproteína pp220 en la presente invención se refiere a la poliproteína codificada por la cepa BA71 que es homologa a la pp220 codificada por la cepa BA71 V o a variaciones funcionales de la misma. La pp220 de la cepa BA71 V se refiere a la SEQ ID NO: 1 (número de acceso NP_042785.1 ) El término "proteína homologa" se refiere a aquella proteína que tiene una secuencia similar y que ejerce igual función en el virus de la peste porcina africana, independientemente de la cepa del virus. En la presente invención, se refiere a las proteínas de la cepa BA71 que tienen una secuencia de aminoácidos similar a las de la cepa BA71 V, donde secuencia similar se refiere a una secuencia con una similitud superior al 95%, que realizan la misma función en el virus.
Así, una realización más preferida se refiere a los virus de la invención donde el gen reprimido es el que codifica para la poliproteína pp220.
La poliproteína pp62 en la presente invención se refiere a la poliproteína codificada por la cepa BA71 que es homologa a la pp62 codificada por la cepa BA71 V o a variaciones funcionales de la misma. La pp62 de la cepa BA71 V se refiere a la SEQ ID NO: 2 (número de acceso NP_042787).
Así, otra realización más preferida de la invención se refiere a los virus de la invención donde el gen reprimido es el que codifica para la poliproteína pp62. La proteína pB438L en la presente invención se refiere a la proteína codificada por la cepa BA71 que es homologa a la pB438L codificada por la cepa BA71 V o a variaciones funcionales de la misma. La pB438L de la cepa BA71 V se refiere a la SEQ ID NO: 3 (número de acceso NP_042769.1 ). Así, otra realización más preferida se refiere a los virus de la invención donde el gen reprimido es el que codifica para la proteína pB438L.
La expresión inducible de los genes que codifican las poliproteínas pp220 o pp62 o la proteína pB438L se ha realizado mediante la sustitución del promotor original de estos genes por el promotor inducible p72.l formado por el promotor viral tardío p72.4 y la secuencia del operador O? del operón Lac de E. coli. En esta invención también se puede utilizar el promotor inducible ρ74. que se diferencia del p74.l en la distancia desde la secuencia operadora hasta el inicio de la transcripción del gen índucíble (2 y 8 bases, respectivamente). Ambos promotores son inducibles por IPTG. La presente invención también se refiere a virus de la invención donde los genes son inducidos por otros inductores, por ejemplo tetraciclina, y que contienen promotores inducibles por los mismos.
Por lo que una realización aún más preferida de la invención se refiere al virus de la invención donde dicho virus comprende una construcción genética que comprende un promotor inducible capaz de dirigir dicha represión.
Una construcción genética se entiende como una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia codificante del virus de la invención operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para regular su transcripción, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilacíón, origen de replicación, activadores transcripcionales {enhancers), silenciadores transcripcionales {silencers), etc.
Un promotor es una secuencia de nucleótidos que controla la transcripción de un gen dado. El término "índucíble", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a la posibilidad de que el promotor tenga un elemento de control que permita activar o desactivar (reprimir) la transcripción del gen que regula, en presencia de un factor externo al promotor, como por ejemplo, la adición de una sustancia al medio de cultivo en el que crece el organismo que contiene el virus de la invención. Un promotor inducible por IPTG es aquel que presenta los elementos necesarios para que la transcripción se produzca únicamente en presencia de esta sustancia.
Los virus recombínantes contienen asimismo al menos un gen de selección (lacZ que codifica para la β-Galactosidasa u otro gen de selección) bajo el control del promotor viral p72. Así, en otra realización aún más preferida los virus de la invención además comprenden al menos un gen de selección. El término "gen de selección", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a un gen que codifica para una proteína que confiere una característica al organismo en el que se expresa dicho gen y que no se encuentra en dicho organismo de forma natural, como puede ser que sobreviva a la presencia de un antibiótico, que produzca una sustancia coloreada en presencia de un reactivo determinado o que emita luz. Un gen de resistencia a antibiótico codifica para una proteína que confiere a la célula que la expresa, que normalmente sería sensible al antibiótico, la capacidad de superar el efecto del antibiótico. Dicha proteína suele ser un enzima que inactiva el antibiótico en cuestión.
Por lo que otra realización aún más preferida de la invención se refiere al virus de la invención donde dicho virus comprende una construcción genética que comprende al menos un gen de selección.
Otra realización aún más preferida se refiere a los virus de la invención donde dicho virus comprende una construcción genética que comprende un promotor inducible capaz de dirigir dicha represión donde el promotor es inducible por IPTG.
Para aumentar la segundad de los virus de la invención, se ha dispuesto de mecanismos de protección frente a una posible modificación genética (reversión) que los pudiera convertir en virus capaces de replicar. El mecanismo para lograrlo se basa en la represión constitutiva bien de genes implicados en la virulencia (particularmente, el gen de la timidina quínasa), bien de genes que participan en inmunosupresion (particularmente, el gen EP402R que codifica para la CD2) o de genes que participan en la reparación del DNA (como el gen 0174L que codifica para la DNA polimerasa X). En todos ellos ha sido posible utilizar las herramientas descritas anteriormente para la generación de los virus deficientes en replicación derivados de BA71 V ya que no está descrito que existan diferencias significativas entre esta cepa y la cepa de la invención en estos genes dispensables para la replicación. Por recombinación homologa se ha introducido en los genes cuya expresión se quiere reprimir constitutivamente el cassette represor+selección que contiene (i) el gen del represor Lac I del operón Lac de E. coli bajo el control del promotor temprano/tardío del gen U104L (pU104) del VPPA y (íi) el marcador p72GUS, que consiste en el gen de la β-glucuronidasa (β-Gus o gusA) bajo el control del promotor p72 del gen de la proteína p72. Además, la presente invención también admite la deleción de la expresión de genes dispensables para la replicación mediante inserción de un gen de selección (por ejemplo GFP o EGFP, que codifican por la proteína fluorescente verde y la proteína fluorescente verde mejorada ("green fluorescent protein" o "enhanced green fluorescent protein", respectivamente) que interrumpa el marco de lectura del gen dispensable para la replicación. De este modo se han generado virus atenuados (los virus TK-), virus sin inmunosupresores, y que por tanto favorecen la respuesta inmune del hospedador (los virus CD2-) y virus que tienen alterado el sistema de reparación del DNA (los virus pol X-).
La timidina quinasa (TK) en la presente invención se refiere a la proteína codificada por la cepa BA71 que es homologa a la timidina quinasa codificada por la cepa BA71 V o a variaciones funcionales de la misma. La timidina quinasa de la cepa BA71 V se refiere a la SEQ ID NO: 4 (número de acceso NP_042744.1 ).
La CD2 (también llamado "homólogo del receptor de adhesión CD2" o "hemaglutinina") en la presente invención se refiere a la proteína codificada por el gen EP402R por la cepa BA71 que es homologa a la CD2 codificada por la cepa BA71 V o a variaciones funcionales de la misma. La CD2 de la cepa BA71 V se refiere a la SEQ ID NO: 5 (número de acceso NP__042752.1 ).
La polimerasa X (pol X, "DNA polimerase beta-like protein") en la presente invención se refiere a la proteína codificada por el gen 0174L por la cepa BA71 que es homologa a la pol X codificada por la cepa BA71 V o a variaciones funcionales de la misma. La pol X de la cepa BA71 V se refiere a la SEQ ID NO: 6 (número de acceso NP_042790.1 ). Por todo esto, un aspecto de la invención se refiere a un virus de la invención que además no expresa al menos un gen dispensable para la repiicación. Preferentemente, los genes dispensables para ia repiicación comprenden al menos un gen que se selecciona de la lista que comprende: gen que participa en la virulencia del virus, gen que participa en inmunosupresíón, y gen que participa en la reparación del DNA. Más preferentemente el gen dispensable para ia repiicación se selecciona de ia lista que comprende: el gen de la timidina quinasa, el gen EP402R y el gen 0174L, o cualquiera de sus combinaciones. Una realización más preferida se refiere al virus de la invención donde los genes dispensables para la repiicación están reprimidos porque tienen variado su marco de lectura y no expresan una proteína viable.
También forman parte de la invención las construcciones genéticas de DNA que codifican secuencias del virus recombinante de la invención. Dicha construcción genética de DNA dirigiría la transcripción intracelular de la secuencia del virus o fragmento del mismo, y comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a) secuencia de DNA que comprende, al menos, la secuencia codificante del virus de la invención para su transcripción intracelular, b) un cassette de expresión que comprende la secuencia de DNA definida en a) unido operativamente a elementos de control de la transcripción y opcionalmente de traducción; c) secuencia de DNA correspondiente a un sistema o vector de expresión géníca que comprende la secuencia codificante del virus de la invención, operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia, y con otras secuencias para regular su transcripción tales como, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, o señal de poliadenilación, donde preferentemente el vector es un plásmido.
Otro aspecto de la invención se refiere a la célula hospedadora que comprende el ácido nucleico, el cassette de expresión o el vector que codifican secuencias del virus de la invención, donde la célula preferentemente es una célula de mamífero (no perteneciente al grupo de las células embrionarias o germinales humanas), de insecto, de levadura o bacteria. La introducción de dichas construcciones génicas se puede realizar con los métodos conocidos en el estado de la técnica. También se refiere al método de producción del virus de la invención que comprende cultivar dichas células hospedadoras.
Otra realización preferida se refiere al uso de los virus de la invención para la elaboración de una composición farmacéutica.
El término "composición farmacéutica" en esta memoria hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades. En el contexto de la presente invención se refiere a una composición que comprenda al menos los virus de la invención.
Una realización más preferida se refiere al uso del virus de la invención para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de la peste porcina africana, preferiblemente para la profilaxis de la peste porcina africana.
La composición farmacéutica de la invención puede utilizarse tanto sola como en combinación con otras composiciones para el tratamiento o prevención de la peste porcina africana.
"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como al profiláctico o medidas preventivas. Aquellas necesarias de tratamiento incluyen las ya asociadas con alteraciones así como en aquellas en las que se previene la alteración. Una "alteración" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con la composición de la invención, tal y como se describe en el presente documento.
Una realización aún más preferida de la invención se refiere al uso del virus de la invención para la elaboración de una composición farmacéutica para la profilaxis de la peste porcina africana donde dicha composición farmacéutica es una vacuna. En el contexto de la presente invención el término "vacuna" se refiere a una preparación antigénica empleada para provocar una respuesta del sistema inmune a la enfermedad causada por un virus de la peste porcina africana. Es un preparado de antígenos que, una vez dentro del organismo, provoca la respuesta del sistema inmunitarío medíante la producción de anticuerpos, y genera memoria inmunológica produciendo inmunidad permanente o transitoria.
Otro aspecto de la invención se refiere a una vacuna frente al virus de la peste porcina africana que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del virus de la invención.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de agentes moduladores calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos agentes (y construcciones) y el efecto terapéutico a conseguir. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia.
En una realización aún más preferida, la vacuna que comprende el virus de la invención además comprende, al menos, un excipiente y/o al menos, un vehículo farmacológicamente aceptables. El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de la vacuna que contiene el virus de la invención, estabiliza dicha vacuna o ayuda a la preparación de la composición farmacéutica en el sentido de darle una consistencia, forma, sabor o cualquier otra característica funcional específica. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
Un "vehículo farmacológicamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensíoactivos. El vehículo puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los compuestos de la presente invención y cuya función es facilitar la incorporación del fármaco así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente. El término "farmacológicamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que hace referencia esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.
Así, la composición farmacéutica o vacuna proporcionada por esta invención puede ser facilitada por cualquier vía de administración, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida.
En una realización más preferida de la invención, la vacuna que contiene los virus de la invención comprende al menos otro principio activo.
La presente invención también se refiere al uso de la vacuna que contiene el virus de la invención para la fabricación de una composición farmacéutica para la profilaxis de animales mamíferos, preferentemente de la familia Suidae, por ejemplo cerdos. Como se ha explicado anteriormente, en condiciones de represión (es decir, en ausencia del inductor del promotor bajo cuyo control se han colocado ciertos genes virales) los virus de la invención son capaces de infectar la célula huésped pero no de producir virus completos, y las partículas virales que salen de la célula están vacías, ya que carecen del DNA. Por lo tanto en una infección in vivo con los virus de la invención se producen de forma natural dichas partículas virales vacías en el interior del animal infectado al tratarse éste de un sistema que carece del inductor. Como estas partículas virales vacías poseen todos los dominios externos (envuelta interna, cápsída y envuelta extema) podrían participar en la generación de la respuesta inmune observada frente al VPPA en el animal infectado por los virus de la invención. De esta manera podrían constituir una herramienta alternativa y/o complementaría para el tratamiento de la peste porcina africana. Así, una realización preferida es el procedimiento para la obtención de partículas virales vacías (de ahora en adelante, "partículas virales de la invención") que comprende la infección de células aisladas con el virus recombinante de la invención en ausencia del agente inductor del promotor que controla los genes virales cuya transcripción se desea reprimir.
Se entiende por "infección" en la presente invención aquella patología generada por la invasión o colonización de cualquier tejido de un hospedador por parte del virus de la peste porcina africana. La "infección de células aisladas" se entiende que es una infección in vitro en la que la células aisladas infectadas por el virus de la invención son deprivadas del inductor para la correcta generación de las partículas virales vacías.
Se entiende en esta memoria el término "célula aislada" aquella célula cultivada in vitro para la producción de las partículas vírales vacías cuando no son cultivadas con el agente inductor o para la producción de los virus recombinantes de la invención cuando son cultivadas con el inductor. Las células aisladas son preferentemente líneas celulares. Una realización aún más preferida de la invención, se refiere a la partícula viral vacía generada por infección de las células aisladas con los virus de la invención, en adelante "partícula viral de la invención". Otra realización preferida de la invención se refiere al uso de la partícula viral de la invención que se genera por infección por el virus de la invención para la elaboración de una composición farmacéutica, preferiblemente para el tratamiento de la peste porcina africana, más preferiblemente para la profilaxis de la peste porcina africana. Más preferiblemente dicha composición farmacéutica es una vacuna. Dicha vacuna comprende además una cantidad terapéuticamente efectiva de las partículas virales de la invención, y preferiblemente comprende también al menos un adyuvante, un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptables, donde en otra realización aún más preferida el adyuvante es el adyuvante de Freund's, y que además puede comprender al menos otro principio activo.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la vacuna que contiene las partículas virales de la invención frente al virus de la peste porcina africana para la elaboración de una composición farmacéutica para la profilaxis de anímales mamíferos, preferiblemente de la familia Suidae, por ejemplo cerdos.
Los términos "polinucleótido" y el término "ácido nucleico" se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucieótidos como desoxirribonucleótidos. Los términos "péptido", "oligopéptido", "polipéptido", "poliproteína" y el término "proteína" se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, cuya secuencia les permite ejercer una función biológícaT
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCION DE LAS FIGURAS
Figura 1. Ensayo de virulencia de la cepa BA71 crecida en células COS. Se ensayó la virulencia de virus de la cepa BA71 crecido en células COS para comprobar que su virulencia no se veía afectada por su crecimiento en dicha línea celular. A, determinación de la temperatura rectal de cerdos infectados con distintas dosis (104 Dl50 y 100 Dl50j siendo Dl50 la dosis infecciosa 50%) de virus BA71 antes (BA71 ) y después (BA71 Cos) de 10 ciclos de proliferación en células COS. dO, día en el que se realizó la inoculación con el virus; d1 -10, días post inoculación. B, ensayo de supervivencia de los cerdos infectados según se ha descrito en A; "n" es el número de anímales en cada grupo.
Figura 2. Construcción del virus recombinante deficiente en replicación, BA71.v220i.TK-. Se construyó el virus BA71 .v220i.TK- que expresa induciblemente la poliproteína pp220 y no es virulento al no expresar la tímidina quinasa (TK), utilizando las herramientas moleculares descritas previamente partiendo de la cepa no patogénica BA71 V. A, esquema del virus BA71 .v220i.TK-. Se aprecia que el gen del represor Lac I y el gen marcador de la β-glucuronidasa (B-gus) se insertan en el locus de la TK para generar el virus intermedio BA71 .vGUSREP.TK-. A partir de éste, se obtiene el virus BA71 .v220i.TK- situando el gen de la poliproteína pp220 bajo el control del promotor inducible p72.L Un gen marcador, lac Z, que codifica para la B- galactosidasa permite la selección de los recombinantes. B, Western blot para detectar la expresión de pp220 en células COS tras infección con el virus BA71 .v220i.TK- en presencia (+) o en ausencia (-) del inductor IPTG. Se muestra la ausencia de pp220 en dos clones de células COS infectadas y crecidas en ausencia de IPTG (1 y 2) y como la presencia de IPTG en el medio de cultivo resulta en la expresión de pp220. Como control de carga se utilizó la proteína de la cápsida p72. NI, células no infectadas. Figura 3 Construcción dei virus recombinante deficiente en repiicación BA71.v220i.CD2-. Se construyó el virus BA71 .v220i.CD2- que expresa induciblemente pp220 y no expresa la proteína CD2, utilizando las herramientas moleculares descritas previamente partiendo de la cepa no patogénica BA71 V. A, Vector de transferencia para la construcción de los virus CD2- que contiene el cassette represor+selección que contiene el gen lac I bajo el control del promotor constitutivo pU104 del virus, el gen marcador B-gus bajo el control del promotor viral tardío p72 y las regiones flanqueantes del gen EP402R (CD2 viral) para la recombinación homologa con BA71 , donde 10T son señales de terminación de la transcripción. Se señalan las dianas de restricción utilizadas: Spe\ y Af B, esquema del virus BA71 .v220i.CD2- El gen de la poliproteína pp220 se sitúa bajo el control del promotor inducible p72.i. Un gen marcador, lac Z, que codifica para la B-galactosídasa permite la selección de los recombinantes. Se aprecia que el gen del represor Lac I y el gen marcador de la B-glucuronidasa { B-gus) se insertan en el locus del gen de CD2 bajo el control de los promotores pU104 y p72, respectivamente. Figura 4. Construcción del virus recombinante deficiente en replicación BA71.v220i.CD2-.PolX-. Se construyó el virus BA71 .v220i.CD2-.PolX- utilizando las herramientas descritas previamente para los virus recombinantes deficientes en replicación derivados de la cepa no patogénica BA71 V. En una primera fase se generó el virus intermedio BA71 .pp220 con el gen de pp220 bajo el control del promotor p72.f y, como gen marcador, lac Z, que codifica para la β-galactosidasa permitiendo la selección de los recombinantes según se ha descrito anteriormente. Posteriormente se insertan el gen del represor Lac I y el gen marcador β-gus o gusA en el locus del gen de la CD2, generándose así el virus BA71 .v220i.CD2-. Partiendo de dicho virus, se deleciona la expresión del gen pol X mediante inserción del gen EGFP {"enhanced green fluorescent protein") bajo el promotor p72. 061R es un gen utilizado en esta construcción para la recombinación homologa. Figura 5. Ensayos inmunológicos con el virus BA71.v220i.TK-. A, ELISA que muestra los niveles de anticuerpos anti-VPPA en cerdos vacunados con 105 Dl50 (P4 a P9), 107 Dl50 {P10 a P15) del virus inducible BA71 .v220.TK- o inoculados con PBS (tampón fosfato salino) como control (P1 a P3), e infectados posteriormente con 103 Dl50 del virus parental virulento BA71 . El análisis se realizó con muestras obtenidas antes de la inmunización (preinm), tras la primera inmunización (1 st-inmun), tras la segunda inmunización (2nd- inmun) y en los días 3, 5 y 7 después de la segunda inmunización, (d3pí, d5pi y d7pí, respectivamente). La flecha indica que el día en el que se realizó la segunda inmunización también se infectó con 103 Dl50 del virus parental virulento BA71 . B, ELISPOT que muestra la producción de INF-γ por parte de células T específicas en respuesta a la estimulación in vitro con el virus BA71 .v220.TK- inducible (BA71 índ). Las barras blancas corresponden a la primera vacunación (1 st vac) y las negras a la segunda (2nd vac). C, Ensayo de supervivencia de cerdos vacunados con el virus BA71 .v220i.TK- (BA71 índ) a las mismas concentraciones que en A, o con PBS; "n" es el número de animales en cada grupo. EJEMPLOS DE REALIZACION DE LA INVENCIÓN
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.
EJEMPLO 1 : El virus BA71 conserva la virulencia tras crecimiento células COS.
Dado que para la generación de los virus recombínantes y las partículas virales vacías se utilizan las células COS (ATCC, CRL-1650™), para comprobar que el crecimiento en dichas células no atenúa la cepa virulenta BA71 , se analizó si la virulencia de la cepa BA71 se veía afectada por su proliferación en dichas células.
Para ello, se inocularon 12 cerdos machos de la raza Duroc x Landrace, de tres meses e ínmunológicamente maduros. La inoculación se llevó a cabo después de 5 días de adaptación, utilizando 3 cerdos por dosis y aislado de virus, como se índica en la Tabla 1 . Los cerdos se inocularon intramuscularmente con 2 mi de PBS conteniendo 102 ó 104 Dl50 (dosis infecciosa 50%) del aislado virulento BA71 antes (BA71 ) y después (BA71 Cos) de 10 ciclos de proliferación en células COS. Se recogió suero a los 3, 5, 7 y 9 días post-inoculación para titular el virus y se determinó la temperatura rectal (Fig. 1 A) y la supervivencia (Fig. 1 B).
Tabla 1 . Composición de los grupos de inmunización con BA71
102 Dl50 104 Dl50
BA71 (cerdos 1 -3) (cerdos 4-6)
BA71 Cos (cerdos 7-9) (cerdos 10-12) Como se esperaba, la inoculación con virus de la cepa BA71 fue muy patogénica, causando síntomas clínicos severos, incluyendo fiebre alta desde el día 3 post-inocuiación hasta el final del experimento, e independientemente de la dosis utilizada. Con una dosis de 104 Dl50 del virus BA71 pasado por COS (Ba71 Cos), la enfermedad seguía el mismo curso que con el virus BA71 sin ese pase (BA71 ), aunque con dosis más bajas (102 Dl50) algunos cerdos sufrían un ligero retraso en la aparición de los síntomas clínicos, incluyendo la fiebre (Fig. 1 A), y en la disminución de su supervivencia (Fig. 1 B). EJEMPLO 2: Obtención de los virus recombinantes que no expresan ei gen de la timidina quinasa BA71.v220i.TK-, BA71.v62i.TK- y BA71.vB438Li.TK- y en los que la expresión de las proteínas pp220, pp62 y pB438, respectivamente, es inducible. Para obtener estos virus recombinantes deficientes en replicación, timidina quinasa negativos (TK-) a partir de la cepa BA71 se utilizaron las herramientas moleculares descritas anteriormente y en Andrés et al. 2002. J Virol 76:2654- 2666; Suárez et al. 2010. J Virol 84:176-187; y Epifano et al. 2006. J Virol 80:1 1456-1 1466; con alguna modificación que pasamos a detallar.
Para generar el virus BA71 .v220i.TK-, un virus recombinante atenuado, deficiente en replicación y en el que la expresión de la pp220 es inducible por IPTG, se partió de un virus de la cepa BA71 . Primero se delecionó la expresión de la TK (Fíg.2A) utilizando un cassette represor+selección de recombinacíón homologa que se inserta en el locus de la TK. Este cassette contenía (i) el gen del represor de la lactosa {Lac I) bajo el control del promotor temprano/tardío del gen U104L del VPPA (pU104) y (ií) el marcador p72GUS, que consiste en el gen de la β-glucuronidasa bajo el control del promotor tardío p72 (Fig. 2A). El virus intermedio, BA71 .GUSREP.TK- se purificó mediante rondas sucesivas de proliferación y aislamiento de placas de lisis en células COS hasta su completa pureza. En una segunda fase, se construyó el virus BA71.v220i.TK- inducible en el gen de la poliproteína pp220 a partir del virus intermedio BA71 .GUSREP.TK-, mediante la introducción del gen de pp220 bajo el control del promotor inducible por IPTG ( Z2./), que consiste en el promotor p72, el operador lac de E. coli y el gen tac Z (que codifica la β-galactosidasa utilizada como marcador para seleccionar los virus recombinantes), siguiendo el procedimiento descrito para la construcción de un virus recombínante similar partiendo de la cepa BA71 V descrito en Andrés et al. J Virol 2002. 76:2654- 2666. El virus BA71 .v220i.TK- resultante se purificó mediante rondas sucesivas de aislamiento de placas de lisis en células COS. Para validar la construcción vírica BA71 .v220i.TK-, se determinó la expresión de pp220 en células COS infectadas con este virus y crecidas en medios con y sin IPTG. La expresión de la poliproteína pp220 se examinó por Western blot utilizando anticuerpos específicos (Andrés et al. J Virol 202. 76:2654-2666). Como se muestra en la Fig. 2B, la expresión de pp220 sólo se produce al cultivar las células infectadas en un medio suplementado con IPTG.
Los virus BA71 .v62i.TK- y BA71 .vB438Li.TK- se generaron con las mismas herramientas que para el BA71 .v220i.TK- pero los genes que se regulan por el promotor inducible codifican para la pp62 y la pB438L, respectivamente.
EJEMPLO 3: Obtención del virus inducible BA71.v220i.CD2-.
Para obtener este virus deficiente en replícacíón y que no expresa la proteína CD2 (implicada en la respuesta inmune del hospedador) y en el que la expresión de la pp220 es inducible se utilizaron las herramientas para la elaboración de virus deficientes en replicación aplicadas a la cepa BA71 V descritas en García-Escudero et al. 1998. J Virol 72:3185-3195; Rodrígez et al. 1993. J Virol 67:5312-5320; y Andrés et al. 2002. J Virol 76:2654-2666; con alguna modificación que pasamos a detallar.
Para generar el virus recombínante deficiente en replicación que carezca de algún gen implicado en la respuesta inmune, primero se construyó un virus con la expresión de la pp220 inducible, partiendo de un virus de la cepa BA71 y colocando el gen de la poliproteína pp220 bajo el control del promotor inducible por IPTG (p72.f) (Fig. 3B). En el virus intermedio BA71 .pp220, se insertó, por recombinación homologa un cassette represor+selección (esencialmente idéntico al empleado para la construcción de los virus TK-) en el gen de la CD2, el EP402R (Fig. 3A), delecionando así su expresión.
EJEMPLO 4: Obtención del virus inducible BA71.v220i.CD2- PolX-. Para obtener este virus recombinante deficiente en replicacion, con expresión de ia DNA polimerasa X y la CD2 delecíonada, y expresión inducible de la pp220 como se ha explicado anteriormente, se utilizaron las herramientas para la elaboración de virus deficientes en replicacion derivados de la cepa BA71 V descritas en García-Escudero et al. 1998. J Virol 72:3185-3195; Rodrígez et al. 1993. J Virol 67:5312-5320; y Andrés et al. 2002. J Virol 76:2654-2666; con alguna modificación que pasamos a detallar.
Para generar una vacuna contra el virus VPPA basada en virus recombinantes deficientes en replicacion que carezcan de un gen implicado en el sistema de reparación del DNA, se construyó otro virus que era TK+ y CD2- y que no expresaba el gen 0174L, que codifica para la DNA polimerasa reparativa, pol X.. La metodología utilizada es la descrita anteriormente. Se siguieron los procedimientos que se han descrito previamente en la presente invención partiendo del virus BA71 .v220i.CD2- que tiene el cassette represor+selección insertado en el gen de la CD2. El virus pol X- se generó introduciendo en el gen de la pol X el gen EGFP, que sirve como marcador de selección, bajo el control del promotor p72, como se muestra en el esquema de la Figura 4.
EJEMPLO 5: Ensayos de inmunización y supervivencia con el virus inducible BA71.v220i.TK-. Para evaluar la actividad de los virus recombinantes deficientes en replicación como vacunas frente a la peste porcina africana, se inmunizaron grupos de cerdos con 107 ufp o 105 ufp (unidades formadoras de placas) de BA71 .v220i.TK- (seis cerdos por grupo, dos veces en un intervalo de dos semanas) y se compararon los resultados con cerdos control a los que se les inoculó PBS (tres animales). Al mismo tiempo que se inmunizó la segunda vez con el virus BA71 .v220i.TK-, todos los cerdos se infectaron con 103 Dl50 de virus parental virulento BA71 . Se recogieron muestras de suero y sangre después de cada dosis de vacuna a distintos días después de la infección para estudiar la respuesta humoral y celular inducida mediante un ensayo de ELISA específico para detectar VPPA (Fig. 5A) y un ensayo de ELISPOT (Fig. 5B). Como estímulo específico en el ensayo ELISPOT, se utilizó 105 ufp de BA71 .v220i.TK- por millón de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) en un ensayo de 20 h.
Se observó una respuesta humoral significativa en la mayoría de los once cerdos vacunados (9 de 12) a partir del día 7 tras la inoculación con cualquiera de las dos dosis de virus (Fig. 5A). Un animal (P5) presentó respuesta significativa en el segundo día post-inoculación con la dosis más baja. Además, también se observó aumento en el número de células T específicas capaces de secretar interferón-gamma (INF-γ) en respuesta a la estimulación in vitro con el virus BA71 .v220i.TK- (Fig. 5B).
El ensayo de supervivencia reveló que los cerdos inoculados con PBS morían antes del día 7 tras la infección, mientras que el 50% de los cerdos vacunados con la dosis máxima de BA71 .v220i.TK- sobrevivían hasta el día 9 tras la infección (Fig. 5C).
EJEMPLO 6: Obtención de partículas icosaédricas vacías y estructuras virales tubulares. Como ya se ha mencionado, en condiciones represoras (ausencia del inductor IPTG) se producen partículas icosaédricas vacías que contienen los dominios externos del virus (envuelta interna, cápsida y envuelta externa), pero no los internos (dominio intermedio y nucleoide) y por lo tanto carecen también del DNA del virus. Para producir estas partículas virales vacías se infectaron células COS con 0,1 ufp del virus inducible BA71 .v220i.TK-, BA71 .v62i.TK- o BA71 .vB438Li.TK- por célula y se cultivaron en ausencia del inductor. Las partículas virales se purificaron del medio por centrifugación en gradiente de Percoll y cromatografía en columnas de Sephacryll (Carrascosa et al. J Virol 1985. 54:337-344). Se obtuvieron partículas virales vacías generadas por represión de pp220, pp62 y pB438L, respectivamente.
MATERIAL Y MÉTODOS EMPLEADOS. Obtención de los virus BA71.v220i.TK-, BA71.v62i.TK- y BA71.vB438Li.TK-
Se infectaron monocapas preconfluentes de células COS (25 placas P150) con el virus BA71 .v220i.TK-, el virus BA71 .v62i.TK- o el virus BA71 .vB438Li.TK-, a una multiplicidad de infección de 0, 1 ufp por célula. Las células se mantenían en medio DMEM con suero fetal de ternera al 2% e IPTG al 1 mM. Después de 2 horas de adsorción del virus a 379C, en un incubador con CO2 al 5%, se retiró el inoculo y se añadió medio fresco con IPTG a la misma concentración, incubándose como antes a 37SC hasta que se observó un efecto cítopático total (generalmente después de 48-72 horas). Se recogió el medio de cultivo que contenía el virus extracelular producido y se centrifugó a baja velocidad (rotor Sorvall GS3 a 2500 rpm durante 15 min a 4Q C) para eliminar restos celulares y, a continuación, se centrifugó a alta velocidad (rotor Sorvall GS3 a 6500 rpm durante 8.5 h a 4δ C) para sedimentar el virus. El sedimento se resuspendió en 1 /100 del volumen inicial y se purificó el virus por centrifugación durante 1 h a 49 C sobre un colchón de sacarosa al 25 % en PBS, usando un rotor Sorvall SW41 .TÍ a 100.000g. El sedimento obtenido se resuspendió en 1 /500 del volumen inicial y se tituló en células COS en presencia de la misma concentración de IPTG por el método de formación de placas de lisis (Enjuanes et al. 1976. J Gen Vírol 32:471 -477). La concentración del virus se expresa como unidades formadoras de placa (ufp) por mi. Análisis por western bíot
Se lísaron células COS infectadas por BA71 .v220i.TK- en presencia o ausencia del inductor IPTG y se analizaron los niveles de pp220 mediante inmunoblot o western bíot con anticuerpos específicos descritos en Andrés et al. J Virol 202. 76:2654-2666. Se utilizó el anticuerpo frente a p72 como control de carga.
Ensayos de protección y supervivencia tras inmunización con ei virus BA71.v220i.TK-. Se utilizaron cerdos inmunológicamente maduros de la estirpe Duroc x Landrace. Se inmunizaron dos grupos de 6 cerdos dos veces (en un intervalo de dos semanas) con 105 y con 107 ufp del virus BA71 .v220i.TK-, respectivamente y otros 3 cerdos se inmunizaron con PBS como control del ensayo. Quince días después de la segunda inmunización, todos los cerdos se inocularon por vía intramuscular con 103 ID50 de virus BA71 . A distintos días después de la inoculación, se obtuvieron muestras de suero y sangre para estudiar la respuesta humoral y celular utilizando un ensayo de ELISA específico de VPPA y un ensayo IFN-y-ELISPOT, respectivamente. Para el ensayo de supervivencia, se comparó la supervivencia de los tres grupos de anímales. Además, también se monítorizó en dichos animales la viremia y los síntomas clínicos de la enfermedad tales como fiebre anorexia, letargía y temblores.
Determinación de anticuerpos frente ai VPPA en ei suero de cerdos vacunados mediante ELISA La determinación de la presencia de anticuerpos específicos frente al VPPA en el suero de cerdos vacunados se realizó como se describe en Díaz y Mateu. 2005. Vet Immunol lmmunopathol.106:107-12, utilizando antígeno soluble obtenido a partir de células infectadas con VPPA (Escribano et al. 1989. Am J Vet Res 50:1 1 18-1 122).
Cada pocilio de una placa de ELISA de 96 pocilios se tapiza durante 12 horas a 4s C con 100 μΙ de la proteína correspondiente diluida {5 Mg/ml) en tampón carbonato-bicarbonato pH 9,6, y se incuba durante 12 horas a 49C. Tras lavar 3 veces las placas con PBS-Tween 20 al 0,05% (v/v), éstas se bloquean con 100 μΙ de PBS-1 % albúmina sérica bovina (BSA) durante 1 hora a 37SC. Se añaden las muestras de suero a las diluciones pertinentes a cada pocilio y se incuban 1 hora a 379C, tras lo cual se lavan las placas y se añade el anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa (anti-lgG de cerdo a 1 :20000; Sigma), y se incuban 1 hora a 37QC. Tras los últimos lavados, las placas fueron reveladas utilizando TMB soluble (Calbiochem) como sustrato, parando la reacción con ácido sulfúrico 3N. Los resultados obtenidos para cada reacción se representan como la absorbancia de la solución de cada pocilio a una longitud de onda de 405nm.
Obtención de PBMCs (células mononucieares de sangre periférica) para el ensayo de ELISPOT
Las PBMCs se purificaron a partir de sangre recogida en presencia del anticoagulante EDTA (2,5 mM), utilizando un gradiente de densidad sobre Histopaque 1077 (Sigma). Se depositaron 20 mi de sangre diluida 1 :1 con PBS sobre un colchón de 4 mi de Histopaque 1077 y, tras su centrifugación durante 30 minutos a 500xg, se recogió la interfase entre el plasma y el Histopaque, que contiene las PBMCs y a continuación se lisaron los eritrocitos. ELISPOT
La cantidad de células secretoras de IFNy porcino específicas frente al VPPA se determinó mediante un ensayo de ELISPOT siguiendo el método descrito en Díaz and Mateu. 2005. Vet Immunol Immunopathol 106:107-12. Para ello, se tapizaron placas de 96 pocilios (Costar 3590, Corning) con 50 μΙ/pocillo de un anticuerpo anti-IFNy porcino (BD Pharmingen, clon P2G10) a una dilución 1 :100 en tampón carbonato-bicarbonato pH 9,6, durante 14 horas a 4SC. Tras lavar 3 veces con PBS-1 % Tween 20 y bloquear las placas con medio RPMI completo durante 1 hora a 37eC, se añadieron 5 x 105 PBMCs en cada pocilio en ausencia o presencia de los estímulos correspondientes y en un volumen total de 200 μΙ de medio por pocilio. Como estímulo específico se utilizó 105 ufp del virus BA71 .v220i.TK- por millón de PBMCs. Como control positivo de estimulación, se utilizó fitohemaglutinina (10 Mg/ml). Tras 20 horas de estimulación a 37eC las células se retiraron y tras extensos lavados, se procedió a realizar la inmuno-tinción. Para ello, se utilizaron 50μΙ/ροοϊΙΙο de un anticuerpo anti-IFNy porcino biotinilado {BD Pharmingen) diluido 1 :1000 en PBS, y, tras 1 hora de incubación a 37SC, se añadió estreptavidina-peroxidasa (Biosource) diluida a 0,5 Mg/ml, como anticuerpo secundario. Finalmente, la reacción fue revelada utilizando como sustrato TMB insoluble (Calbiochem). Los resultados obtenidos con el ELISPOT se representan como el número de células secretoras de IFNy por cada millón de PBMCs, una vez sustraídos los valores obtenidos a partir de los pocilios control sin estimulo (medio solo). En todos los caso, los experimentos con los estímulos se hicieron por triplicado.
Producción, expansión y purificación de ias partículas virales vacías BA71.v220i.TK-, BA71.v62i.TK- y BA71.pB438L.TK- en células COS
Se infectaron células COS crecidas en medio DMEM con suero fetal de ternera al 2% en ausencia del inductor IPTG a una concentración de 0, 1 ufp/célula de los virus BA71 .v220i.TK-, BA71 .v62i.TK- y BA71 .pB438L.TK-. Las partículas virales vacías se purificaron según se ha descrito para purificar los virus BA71 .v220i.TK-, BA71 .v62i.TK- y BA71 .vB438Li.TK-.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Virus recombinante caracterizado porque se obtiene a partir de la cepa virulenta BA71 del virus de la peste porcina africana y porque es deficiente en su replicación.
2. Virus recombinante según la reivindicación 1 , donde dicho virus tiene reprimida la expresión de al menos un gen que codifica para la proteína seleccionada de la lista que comprende políproteína pp220, poliproteína pp62 o proteína pB438L
3. Virus recombinante según la reivindicación 2, donde el gen reprimido es el que codifica para la políproteína pp220.
4. Virus recombinante según la reivindicación 2, donde el gen reprimido es el que codifica para la poliproteína pp62.
5. Virus recombinante según la reivindicación 2, donde el gen reprimido es el que codifica para la proteína pB438L
6. Virus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, donde dicho virus comprende una construcción genética que comprende un promotor inducible capaz de dirigir dicha represión.
7. Virus recombinante según la reivindicación 6, donde la construcción genética comprende además al menos un gen marcador de selección.
8. Virus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, donde el promotor se induce por IPTG.
9. Virus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que además no expresa al menos un gen dispensable para la replicación.
10. Virus recombinante según la reivindicación 9 donde los genes dispensables para la replicación comprenden al menos un gen que se selecciona de la lista que comprende: gen que participa en la virulencia del virus, gen que participa en inmunosupresión, o gen que participa en la reparación del DNA.
1 1 . Virus recombinante según la reivindicación 10, donde el gen o genes dispensables para la replicación se selecciona de la lista que comprende: el gen de la timidina quinasa, el gen de la CD2 o el gen de la pol X.
12. Ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para el virus recombinante descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 .
13. Cassette de expresión que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 12, unido operativamente a elementos de control de la transcripción.
14. Vector recombinante que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 12.
15. Vector según la reivindicación 14, donde dicho vector es un plásmido.
16. Célula hospedadora que comprende el ácido nucléíco según la reivindicación 12, o el cassette de expresión según la reivindicación 13 o el vector recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15.
17. Célula hospedadora según la reivindicación 16 donde la célula es una célula de mamífero, de insecto, levadura o bacteria.
18. Proceso para producir el virus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , que comprende cultivar una línea celular según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17.
19. Uso del virus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 para la elaboración de una composición farmacéutica.
20. Uso según la reivindicación 19, en el que la composición farmacéutica se aplica para la profilaxis de la peste porcina africana.
21 . Uso según la reivindicación 20 donde dicha composición farmacéutica es una vacuna.
22. Vacuna frente al virus de la peste porcina africana que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del virus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 .
23. Vacuna según la reivindicación 22 que además comprende al menos un excipiente y/o al menos un vehículo, ambos farmacéuticamente aceptables.
24. Vacuna según la reivindicación 23 que además comprende al menos otro principio activo.
25. Uso de la vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24 para la fabricación de una composición farmacéutica para la profilaxis de la peste porcina africana de animales mamíferos, preferiblemente de la familia Suidae.
26. Procedimiento para la obtención de partículas virales vacías que comprende la infección de células aisladas con el virus recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 .
27. Partícula viral vacía generada por infección de células aisladas con el virus según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 .
28. Uso de la partícula viral vacía según la reivindicación 27 para la elaboración de una composición farmacéutica.
29. Uso de las partículas virales vacías según la reivindicación 28, en el que la composición farmacéutica se aplica para la profilaxis de la peste porcina africana.
30. Uso de las partículas virales vacías según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 29 donde dicha composición farmacéutica es una vacuna.
31 . Vacuna frente al virus de la peste porcina africana que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de las partículas virales vacías según la reivindicación 27.
32. Vacuna según la reivindicación 31 que además comprende al menos un elemento de la lista formada por: adyuvantes, excipientes o vehículos, en todos los casos farmacéuticamente aceptables.
33. Vacuna según la reivindicación 32 que se caracteriza porque el adyuvante es el adyuvante de Freund's.
34. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33 que además comprende al menos otro principio activo 35. Uso de la vacuna frente al virus de la peste porcina africana según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, para la elaboración de una composición farmacéutica para la profilaxis de animales mamíferos, preferiblemente de la familia Suidae.
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