WO2012098282A1 - Aditivos para alimentación animal - Google Patents

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Enrique PABLOS PÉREZ
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Norel, S.A
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Definitions

  • the present invention relates to additives for animal feed based on salts of organic acids combined with active products of plant origin and all coated with fats and / or vegetable oils. Said salts of organic acids are used as promoters or stimulants of animal growth, modulators of the immune response and bactericides. Therefore, the present invention is encompassed within the field of animal production and more specifically within the fields of animal nutrition and health.
  • additives has been a common practice in animal feeding in order to improve productive performance, improve health as well as to achieve a more efficient use of food. Due to the prohibition of the use of antibiotics as growth promoting substances in the European Union (Directive 1831/2003 / EEC), additives have been sought which, in many cases, show a productive improvement over even the antibiotics themselves (Dipeolu et al., 2005). Different studies conducted in recent years have shown that organic acids are a good alternative. Its mode of action lies, on the one hand, in the reduction of pH at the stomach level which limits the development of pathogens and helps in the digestion of proteins and, on the other hand, in the ability that some of these organic acids have to enter in bacteria and block your metabolism.
  • butyric acid also called butanoic acid
  • AAV short chain volatile fatty acids
  • the anion of the acid interferes with the genetic transcription of the bacteria, which prevents them from reproducing and causing an infection.
  • Butyric acid has a better diffusion coefficient than other VFAs, causing it to cross the bacterial wall more easily than other acids.
  • butyric acid has additional effects that make it unique: for example, it stimulates pancreatic secretion (Katoh and Tsudo, 1984; Sano et al, 1995), improves electrolyte absorption, reduces the incidence of diarrhea, increases intestinal regeneration of microvilli, together with an increase in their length (Galfi and Bokori 1990, Lesson et al. 2005), while also increasing the area of intestinal absorption resulting in a higher average weight of the Birds already better feed conversion.
  • pancreatic secretion Keratin and Tsudo, 1984; Sano et al, 1995
  • improves electrolyte absorption reduces the incidence of diarrhea
  • increases intestinal regeneration of microvilli together with an increase in their length
  • Gafi and Bokori 1990, Lesson et al. 2005 while also increasing the area of intestinal absorption resulting in a higher average weight of the Birds already better feed conversion.
  • salts of butyric acid salts of microencapsulated butyric acid and salts of butyric acid in a protected form with a matrix of fats and / or vegetable oils, which protect part of the active ingredient and achieve the slow release of this natural growth promoter, thus ensuring its growth-enhancing and bactericidal action throughout the digestive tract of the animal, while providing the highest possible protected concentration, to include the product in the range of natural growth promoter of slow release.
  • This acid salt in protected form is marketed under the name of Gustor BP-70 (Norel, SA, Spain), from here and throughout the invention we will call it BP-70.
  • BP-70 Gustor BP-70
  • the partial protection of salts of butyric acid with vegetable oils and / or fats allows sodium butyrate to act effectively throughout the digestive tract of the animal, ensuring the arrival of the active substance from the initial sections of the digestive to the sections more distal from said gastrointestinal tract, acting not only as a natural growth promoter, but also as a modulator of the immune response and as a bactericide, reducing the possibility of infection by pathogenic bacteria.
  • Gustor BP-70 The effectiveness of Gustor BP-70 is demonstrated at levels where salts of unprotected butyric acid do not act (blind / feces) and at levels where said salts, in encapsulated form, have not yet been able to act (crop), being a complete product and effective in the fight against bacterial infections, specifically against Salmonella enteriditis, in bird nutrition (Fernández-Rubio C et al, 2009).
  • Clostridium perfringens which as a result of the production of different toxins causes necrotic enteritis, resulting in extensive necrosis of the intestinal mucosa, mainly affecting chickens, turkeys, ducks and wild birds.
  • perfringens naturally inhabits the intestine, proliferating under certain circumstances, such as, for example, excess nutrients not degraded or digestible that appear more frequently in diet changes, especially when the animal receives poorly balanced diets or raw materials of poor quality, poor immune response of the lymphoid tissue associated to the intestine (GALT) due to excessive wear of the intestinal epithelium as a result of the grinding of food, presence of mycotoxins, coccidiosis, etc., imbalances in the intestinal microbial flora, among others.
  • GALT lymphoid tissue associated to the intestine
  • the present invention has developed a new additive for animal feeding comprising salts of organic acids, preferably butyric acid, together with active products of natural origin, preferably essential oils, all partially coated with fats and / or vegetable oils.
  • Said additive is capable of inhibiting bacterial growth, especially of Gram + bacteria and coccidia, in addition to improving the state of the intestinal epithelium and increasing the weight of treated animals.
  • the partial coating of the active ingredients that form said food additive for animals protect these active principles of stomach digestion, but allowing them to be active throughout the entire gastrointestinal tract of animals, since by means of said partial coating of the active ingredients, product phases are achieved with different amounts of fat (0% -50 % of fat) that will be digested and therefore released at different points of the animal's gastrointestinal tract: the part not protected with fat will be released and will exert its effect in the early phases of the gastrointestinal tract, up to the height of the small intestine; on the other hand, the part protected with fat will not be released until it begins to digest due to the action of pancreatic lipases. Given the slow digestion of fat, in-vitro studies have shown that part of the active substance can reach the most distal parts of the gastrointestinal tract, also exerting its action there.
  • the feed additive described in the present invention is also capable of promoting the development of the intestinal epithelium, favoring the growth of intestinal villis, which as a consequence of the induced necrotic enteritis in the animals described in the examples of the present invention, said villis are diminished in number and size.
  • the increase in the development of the intestinal epithelium favors the better absorption of food, thus producing an increase in the growth and fattening of the animals treated with it.
  • the food additive described in the present invention is also able to reduce the incidence of bacterial diseases such as necrotic enteritis or those caused by Salmonella enteriditis, thanks to its modulating action of the immune response and its bactericidal action against pathogens of type C.
  • the combined use of the organic acid salt together with vegetable essential oils and all partially coated with vegetable fats and / or oils is capable of enhancing the physiological promoter effect of butyrate, for example, as previously discussed, in the development of intestinal villis, in addition to enhancing its bactericidal effect.
  • the other preferred active ingredient as an ingredient in the combination with the salts of organic acids are essential oils.
  • the synergies of the essential oils with the salts of organic acids that stand out, are, from the nutritional point of view, their action as stimulators of digestibility, for favoring the balance and control of the microbial flora, also stands out for its action as stimulators of immunity and its antimicrobial and antioxidant properties.
  • the present invention describes the use of the combination of said salts of organic acids together with essential oils both protected with oils and / or fats of animal origin, as an additive for animal feeds acting as a natural growth promoter as well as bactericidal and immunomodulatory, being able to reduce the levels of pathogenic bacteria, specifically C. perfringes A and S. enteric and improve the immune response with which animals are protected from bacterial infections.
  • the present invention describes a new additive for animal feed that acts as a natural promoter of animal growth and which comprises salts of organic acids combined with active products of natural origin, preferably essential oils. Said combination is partially protected from stomach digestion by a partial envelope of fats and / or vegetable oils. Said envelope, being partial, does not prevent the action, throughout the entire intestinal tract, even to the most distal parts thereof, of the active ingredients mentioned. Promoters or growth stimulants are called additives that are an integral part of the animal diet and that fulfill the function of improving the daily weight gain of animals (GDP), as well as the conversion of the ration consumed.
  • growth promoters or stimulants can be administered in different ways, whether injected, in implants or as an additive in animal feed or feed. In the present invention, the effect on growth is measured as weight gain.
  • organic acid refers to compounds that contain in its formula one or more carboxylic groups (-COOH), proton generators, which may also have different functional groups such as hydroxy acids, keto acids, aromatic acids , heterocyclic compounds, as well as amides and lactones.
  • the organic acids used in the present invention are preferably volatile fatty acids, preferably short chain and from which can be selected: butyric acid, propionic acid, formic acid, lactic acid, citric acid, lauric acid, cupric acid, caprylic acid, caproic acid, acetic acid, among others.
  • the salts of the organic acids used in the present invention are preferably sodium salt, cupric salt, potassium salt, calcium salt, among others.
  • the proportions in which the organic acid salt is found in the animal feed additive described in the present invention usually varies between 30 and 70% by weight of the total wet product, the preferred proportion being 60%.
  • the sodium salt of butyric acid is preferably used, although any of the salts of the acids described previously may be used.
  • active ingredient of plant origin refers to any matter of plant origin to which an appropriate activity is attributed capable of exerting a beneficial effect on the organism to which it is applied.
  • the active products of plant origin used in the present invention are preferably essential oils.
  • essential oil refers to a volatile organic substance or substances, belonging to different classes of compounds, for example, hydrocarbons, esters, alcohols, aldehydes, some acids, phenols and their derivatives, lactones, etc.
  • essential oil also applies to similar synthetic substances, prepared from coal tar, and to semi-synthetic substances prepared from essential natural oils.
  • the essential oils used in the present invention can be selected from any of the following: ginger, piperine, oregano, garlic, thymol, carvacrol, cinnamaldehyde, etc.
  • the proportions in which the active ingredients of plant origin are found in the animal feed additive described in the present invention usually vary between 1 and 20% by weight of total wet product, the preferred proportion being 10% in the final product
  • fat and / or vegetable oil refers to an organic compound obtained from seeds or other parts of plants in whose tissues it accumulates as a source of energy.
  • Fats and / or oils, vegetables, used in The present invention for coating the combination of the organic acid salt and the active products of natural origin, preferably essential oils can be selected from among others: palm stearin (more solid part obtained after the fractionation of palm oil) or soap calcium fatty acid palm oil (PFAD) (calcium saponification of fatty acids).
  • PFAD soap calcium fatty acid palm oil
  • the proportions in which said fats and / or vegetable oils are found covering the salt of the organic acid and the essential oils, described in the present invention usually vary between 30-60% of the total wet product weight, the preferred proportion being of 30%.
  • the term bactericidal is defined as any product, agent or substance capable of killing or killing bacteria.
  • the bactericidal effect or action is measured as the macroscopic changes produced in the intestines of animals due to bacterial infection.
  • the modulation of the immune response is measured as the variation of gene expression, with respect to control animals without receiving the additive of the invention in their diet, infected or not, of genes encoding for cytokines, preferably, IL- ⁇ , IL-2, CD38y and TNFSF15.
  • BP-70 sodium butyrate (60% wet weight) protected with vegetable fat (30% wet weight).
  • the percentage of ginger and piperine included in the additive is 5% of the product's weight Total wet of each said essential oils, ie 5% ginger and 5% piperine.
  • BP-70 sodium butyrate (60% wet weight) protected with vegetable fat (30% wet weight).
  • the percentage of ginger and piperine included in the additive is 5% of the weight of the total wet product of each such essential oils, ie 5% ginger and 5% piperine.
  • FIG. 3 Comparison of the macroscopic changes in intestine samples suffered by the group of animals treated with the additives ⁇ -70 + Ginger and piperine (Group B) with respect to the macroscopic changes presented by the group of infected but untreated control animals (Group A). On the Y axis the score of the macroscopic changes of each group is indicated. * indicates statistically significant differences from the control group (p ⁇ 0.05).
  • BP-70 sodium butyrate (60% wet weight) protected with vegetable fat (30% wet weight).
  • the percentage of ginger and piperine included in the additive is 10% of the total weight of the wet product, ie 5% ginger and 5% piperine.
  • Figure 4 Relative levels of expression (Y axis) of the genes IL- ⁇ , IL-2, IL-8, IL-10, CD3y8, LITAF and RNFSF 15 in the groups of animals treated with BP-70 or BP - 70 + Ginger and piperine compared to the group of uninfected and untreated animals (Group A).
  • BP-70 sodium butyrate (70% wet weight) protected with vegetable fat (30% wet weight).
  • 70-70 + Ginger + piperine sodium butyrate (60% wet weight) protected with vegetable fat (30% wet weight) + 5% ginger + 5% piperine.
  • the square area of the box covers 50% of all measurements, the horizontal line inside the box represents the median of the sample and the vertical lines represent 50% of the measurements that go outside the values of the box .
  • Asterisks indicate statistical significance with a value of p ⁇ 0.05.
  • the relative expression levels of the genes analyzed indicate the expression in both per 1 of each gene with respect to the expression levels of each gene in Group A.
  • Figure 4A shows the relative levels of expression of the genes indicated in Group C (animals not infected and treated with BP-70) vs Group A (animals not infected and untreated).
  • Figure 4B shows the relative levels of expression of the genes indicated in Group D (animals not infected and treated with ⁇ -70 + Ginger + piperine) vs Group A (uninfected and untreated animals).
  • Figure 4C shows the relative levels of expression of the genes indicated in Group F (animals infected and treated with 70-70 + Ginger + piperine) vs Group A (uninfected and untreated animals).
  • FIG. 1 Relative level of expression (Y axis) of the TNFSF15 gene in the different treatment groups: BP-70 (Groups C and E) or ⁇ -70 + Ginger + piperine (Groups D and F), compared to untreated and uninfected animals (Group A).
  • BP-70 sodium butyrate (70% wet weight) protected with vegetable fat (30% wet weight).
  • BP- 70 + Ginger + piperine sodium butyrate (60%> wet weight) protected with vegetable fat (30%) wet weight) + 5%> ginger + 5%> piperine.
  • Group B infected but untreated animals
  • Group C animals not infected and treated with BP-70
  • Group D non-infected animals treated with ⁇ -70 + Ginger + piperine
  • Group E animals infected and treated with BP-70
  • Group F animals infected and treated with ⁇ -70 + Ginger + piperine.
  • the square area of the box covers 50%> of all measurements, the horizontal line inside the box represents the median of the sample and the vertical lines represent 50%> of the measurements that are outside the values of box.
  • Asterisks indicate statistical significance with a value of p ⁇ 0.05.
  • the relative expression levels of the genes analyzed indicate the expression in as much as 1 of each gene with respect to the expression levels of each gene in Group A.
  • Figure 6 Relative levels of expression (Y axis) of the genes IL- ⁇ , IL-2, IL-8, IL-10, CD3y8, LITAF and RNFSF15 in the group of animals infected and treated with BP-70 + Ginger + piperine (Group F), compared to untreated and infected animals (Group B).
  • 70-70 + Ginger and piperine sodium butyrate (60%> wet weight) protected with vegetable fat (30%> wet weight) + 5%> ginger + 5%> piperine.
  • the square area of the box covers 50%> of all measurements, the horizontal line inside the box represents the median of the sample and the vertical lines represent 50%> of the measurements that are outside the values of box.
  • Asterisks indicate statistical significance with a value of p ⁇ 0.05.
  • the relative expression levels of the genes analyzed indicate the expression in both per 1 of each gene with respect to the expression levels of each gene in Group B.
  • FIG. 7 Relative levels of expression (Y axis) of the TNFSF15 gene in groups of animals infected and treated with BP-70 (Group E) or with ⁇ -70 + Ginger + piperine (Group F), compared to non-animals treated and infected (Group B).
  • BP-70 sodium butyrate (70% wet weight) protected with vegetable fat (30% wet weight).
  • BP- 70 + Ginger + piperine sodium butyrate (60% wet weight) protected with vegetable fat (30%) wet weight) + 5%> ginger + 5%> piperine.
  • the square area of the box covers 50%) of all measurements, the horizontal line inside the box represents the median of the sample and the vertical lines represent 50% of the measurements that are outside the values of the box. Asterisks indicate statistical significance with a value of p ⁇ 0.05.
  • the relative expression levels of the genes analyzed indicate the expression in both per 1 of each gene with respect to the expression levels of each gene in Group B
  • One of the objects of the present invention relates to animal feed additives comprising the combination of salts of organic acids with at least one active ingredient of plant origin, all partially coated with vegetable oils and / or fats.
  • the additives of the invention are characterized in that the organic acids are selected from any of the list: butyric, lactic, citric, lauric, cupric, caprylic, caproic, acetic, among others, butyric acid being preferred.
  • the additives of the invention are characterized in that the salts of organic acids are selected from any of the list: sodium, calcium, cupric or potassium.
  • the proportions in which the organic acid salt is found in the animal feed additive described in the present invention usually varies between 30% and 70%) by wet weight of the final product, a proportion of 60% being more preferable. >.
  • the additives of the invention are characterized in that the preferred salt is the sodium salt and the preferred organic acid is the butyric acid, therefore the sodium salt of the butyric acid being preferred in the additives of the invention.
  • the additives of the invention are characterized in that the organic acid salt is preferably at a concentration of 60%> by wet weight of the final product.
  • the additives of the invention are characterized in that the active ingredients of plant origin are preferably essential oils and can be selected from any of the list: ginger, piperine, oregano, thymol, garlic, carvacrol, cinnamaldehyde and / or any of its combinations, the combination of ginger and piperine essential oil being preferably used.
  • the additives of the invention are characterized in that the plant active ingredients are preferably in a proportion of between 1% and 20% of the wet weight of the final product, the preferred proportion being 10% of the weight wet of the final product.
  • the additives of the invention are characterized in that 5% ginger oil and 5%> piperine oil are preferably used in the combination of ginger and piperine essential oils.
  • the additives of the invention are characterized in that the partial coating of the combination of the salts of organic acids with the active ingredients of vegetable origin, with vegetable oils and / or fats, is approximately between 30-60% ) of the wet weight of the final product, being more preferably a 30% coating.
  • the additives of the invention are characterized in that the oils and / or vegetable fats that partially cover the combination of the salts of organic acids with the active ingredients of plant origin are selected from: palm stearin or calcium soap of palm oil fatty acids (PFAD), palm stearin being preferred.
  • the oils and / or vegetable fats that partially cover the combination of the salts of organic acids with the active ingredients of plant origin are selected from: palm stearin or calcium soap of palm oil fatty acids (PFAD), palm stearin being preferred.
  • the additives of the invention are characterized in that the salt is preferably the sodium salt of the organic butyric acid, the active principle of vegetable origin is preferably formed by the combination of essential oils, these being preferably the ginger essential oil and that of piperine and the cover of vegetable oils and / or fats is preferably formed by palm stearin.
  • the additives of the invention are characterized in that the concentration of sodium butyrate is preferably 60%>, the concentration of the The combination of ginger and piperine essential oils is preferably 10% and the palm stearin shell is preferably 30%>.
  • the combination of ginger and piperine essential oils is preferably formed by 5% ginger oil and 5% piperine oil.
  • Another object described in the present invention relates to the use of the additives described above, for animal feed, as growth promoters of animals, preferably chickens, rabbits and pigs.
  • the modulation of the immune response comprises a variation of the expression of any of the genes that code for any of the following cytokines: increasing the expression of IL- ⁇ , IL-2, CD3y8 and / or decreasing the TNFSF15 expression.
  • Another object described in the present invention relates to the use, in animal feed, in breeding animals fed with the previously described additives, such as bactericides, by inhibiting the growth of both Gram + bacteria, preferably Clostridium bacteria, more preferably C perfringens, Gram-, preferably bacteria of the family Enterobacteriaceae, more preferably of the genera Salmonella, Eschericia and Campylobacter and even protozoa, as is the case of the protozoa of the family of Eimeria and Cryptosporids.
  • Gram + bacteria preferably Clostridium bacteria, more preferably C perfringens, Gram-, preferably bacteria of the family Enterobacteriaceae, more preferably of the genera Salmonella, Eschericia and Campylobacter and even protozoa, as is the case of the protozoa of the family of Eimeria and Cryptosporids.
  • Example 1 Macroscopic and histopathological pathological examination in broilers that are induced necrotic enteritis and treated with different food additives.
  • broilers Conventional broilers (Bábolna, Bábolna, Hungary hybrids) were used that were one day old when they became part of the different treatment groups described in the present invention.
  • food additives that enhance animal growth and natural bactericidal action, described in the present invention can be used in any other type of livestock, such as: pig, cunicultural, sheep, bovine, etc. .
  • Broilers were fed a conventional drug-free and protein-rich diet (25% fishmeal). This food did not have coccidiostats (agents useful in the treatment or prevention of coccidiosis in men and / or animals). The animals had no water restriction and were stored in cages at a density of 30 animals / m 2 . The beds, drinkers and feeders were previously sterilized in autoclave. The ambient temperature was set at 32 ⁇ 4 ° C, decreasing to 24 ⁇ 4 ° C as the animals grew.
  • necrotic enteritis these animals were inoculated with the toxigenic strain A type of C. perfringens (ATCC 13124). This strain was grown in Reinforced Clostridial Medium culture medium (BD, MD, USA) at a temperature of 37 ° C for 24 hours in anaerobiosis using the Anaerocult A system (Merck, Darmstadt, Germany). Subsequently, said bacterial cultures were centrifuged (3000 g, 10 min., 5 ° C, Universal 320R centrifuge, Hettich centrifuges) and the pellet obtained resuspended in a sterile saline phosphate serum solution (PBS). The C.
  • toxigenic strain A type of C. perfringens ATCC 13124. This strain was grown in Reinforced Clostridial Medium culture medium (BD, MD, USA) at a temperature of 37 ° C for 24 hours in anaerobiosis using the Anaerocult A system (Merck, Darm
  • perfringens titer was 3-4x10 8 colony forming units (CFU) / ml. Necrotic enteritis shows clinical signs only if predisposition factors are present, therefore these animals were orally infected with coccidia by vaccination with the live attenuated Paracox 5® vaccine (Ceva-Phylaxia) and with C. perfringens A.
  • CFU colony forming units
  • Table 1 shows the infection and vaccination protocol used in the present invention. Briefly, the animals were vaccinated against Gumboro disease or infectious bursitis disease (IBD). It is a highly contagious disease in young chickens caused by the infectious bursitis disease virus (IBDV) and which is characterized by immunosuppression and mortality of animals, usually at the age of 3 to 6 weeks of life.
  • the vaccine against this disease (CEVAC Gumbo L®, Ceva-Phylaxia) was administered in the water on day 16, to produce moderate immunosuppression in animals and be more prone to suffer from necrotic enteritis. Subsequently, the inoculation was carried out, orally through a nasogastric tube, of 2mL of a suspension of C.
  • perfringens (6.8xl0 8 CFU) three times a day (8.00 am, 12.00 am and 16.00 pm) on days 18, 19, 20 and 21. On day 19, they were also given a dose 10 times higher than usual, of the live attenuated Paracox vaccine -5® (Ceva-Phylaxia), to induce coccidia infection and predispose animals to clinical disease.
  • Ceva-Phylaxia the live attenuated Paracox vaccine -5®
  • the Paracox-5® vaccine is a live attenuated vaccine that contains sporulated oocysts derived from early coccidia lines that are pathogenic for chickens: Eimeria acervulina, Eimeria brunetti, Eimeria maxim, Eimeria mitis, Eimeria necatrix, Eimeria praecox and Eimeria tenella. Control animals were also treated with vaccines against Gumboro disease and with the Paracox-5® vaccine.
  • the composition of Norel, SA called BP-70 was used as sodium butyrate, to which ginger (CAS 84696-15-1) (5%> by wet weight) obtained from Ventos SA (Barcelona, was added as essential oils) Spain) and piperine (5%> in wet weight) obtained from the company Sensient Fragances SA (Granada, Spain).
  • the BP-70 is made up of 70%) by wet weight of sodium butyrate and 30%> by wet weight of vegetable fats. 30% or of the vegetable fat protects approximately 43%> of the total sodium butyrate, thus the product BP-70 can be said to be made up of 30%> of protected sodium butyrate and 40%> of unprotected sodium butyrate.
  • the essential oils of ginger and piperine are coated with the same percentages as sodium butyrate. All the feed additives were supplied by Norel, SA, Spain. The body weight of the animals was measured during the experiment on days 1, 4, 7, 10, 14, 18, 21. All animals were sacrificed on day 25. Table 2: Experimental Design.
  • Group A control
  • Group B ⁇ -70 + Ginger + piperine
  • Group C essential oils.
  • liver, spleen and the distal section of the jejunum were immediately immersed in 10% formalin for storage until they were used in subsequent analyzes.
  • Figure 3 shows a comparison of the severity of the macroscopic lesions presented by the group of animals treated with ⁇ -70 + Ginger + piperine (Group B) regarding the group of control animals infected but not treated with any additive.
  • Group B ⁇ -70 + Ginger + piperine
  • the treatment of the food additive described in the present invention sodium butyrate together with essential vegetable oils, ginger and piperine, and all partially coated with vegetable fats, produces a significant increase in weight of the animals that were induced artificial enteric necrosis by inoculation of C. perfringens A and that have been treated with said additive (Group B) with respect to the group of control animals, which also had the infection but have not been treated with said additive (Group A).
  • the present example shows the improvement of lesions, mainly intestinal (caused by infection with C. perfringens A), which present the samples taken from the group of animals treated with the additive of the invention (Group B) with respect to group of control animals not treated with any additive (Group A).
  • Example 2 Determination of the immune response of the lymphoid tissue associated with the intestine (GALT) in broilers that suffer from necrotic enteritis and are treated with different food additives.
  • GALT lymphoid tissue associated with the intestine
  • the basic diet of the animals is the same as that described in Example 1, but supplemented with different feed additives: (i) 1.5 g of ⁇ -70 / Kg. of food (groups C and E), (ii) 1.5 g of BP-70 + Ginger + piperine / kg of food (Groups D and F). All feed additives were supplied by Norel, SA, (Madrid, Spain). Table 3. Experimental Design
  • the chickens were sacrificed on day 22 and intestinal samples approximately 5 cm long were taken from the jejunum between Meckel's diverticulum and the iliac region.
  • the intestinal sections were cut lengthwise, and washed three times with ice cream PBS containing 100 U / ml of penicillin and 100 ⁇ g / ml of streptomycin (Scientific Fischer).
  • the mucosa layer was scraped off with a sterile glass slide and the intestinal tissue was immediately immersed in 1 ml of frozen Trizol (Invitrogen), to subsequently extract the RNA as indicated in the manufacturer's instructions.
  • the samples were homogenized and kept at -80 ° C until processed.
  • cytokines analyzed were: interleukin-1 beta (IL- ⁇ ), interleukin-2 (IL-2), interleukin-8 (IL-8), interleukin-10 (IL-10), CD3y8 receptor, tumor necrosis lipopolysaccharide induced by alpha factor (LITAF) and factor 15 of the tumor necrosis factor superfamily (TNFSF15).
  • IL- ⁇ interleukin-1 beta
  • IL-2 interleukin-2
  • IL-8 interleukin-8
  • IL-10 interleukin-10
  • CD3y8 receptor tumor necrosis lipopolysaccharide induced by alpha factor (LITAF) and factor 15 of the tumor necrosis factor superfamily (TNFSF15).
  • the reference control genes used were: glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (GAPDH) and ⁇ -actin.
  • the primers used for each of the mentioned genes are shown in Table 4.
  • Interleukins-1, 2, 8 and 10 are members of the interleukin family, indispensable in the cellular and humoral immune response.
  • the CD3 receptor Cluster of Differentiation 3
  • LITAF is a cytokine of the TNF family that is released after LPS induction
  • TNFSF15 is present in endothelial cells and also participates in the proliferation, differentiation and apoptosis of the cells of the immune system.
  • CD3y8 SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 14 166 NM_205512.1
  • the groups of animals C and D treated with any of the mentioned additives were compared and that they had no infection with respect to the group of untreated and uninfected control animals (Group A).
  • the groups of animals E and F treated with the additives BP-70 or BP-70 + ginger + piperine were compared, respectively, and which presented necrotic enteritis, with respect to the group of animals infected with C. perfringens but not treated with no additive of those described in the present invention (Group B).
  • Figure 5 shows the level of expression of each of the cytokines analyzed: IL- ⁇ , IL-2, IL-8, IL-10, CD3y8, LITAF and TNFSF15, in each of the groups of animals treated with each of the additives described in the present example and that were or not infected with C. perfringes A (Groups C to F), as well as in the group of control animals infected with C. perfringes A, but not treated with any of these additives (Group B).
  • Figure 6 shows the level of expression of the genes IL- ⁇ , IL-2, IL-8, IL-10, CD3y8, LITAF and TNFSF15 in the group of animals infected with C. perfringes A and that are treated with the food additive described in the present invention, BP-70 + Ginger + piperine (Group F), with respect to the level of expression of said genes presented by the group of control animals infected with C. perfringes A but which has not been fed with the additives used in the present example (Group B). Said analysis is performed in order to analyze the effects of said additives on the evolution of the infection. As can be seen in said Figure 6, there was a significant increase in the expression levels of cytokine IL-2 with respect to the untreated control group (Group B). In addition, said group of animals treated with ⁇ -70 + Ginger + piperine showed a decrease in the expression levels of TNFSF15 compared to the group of untreated control animals (Group B).
  • the treatment with sodium butyrate + essential oils exemplified in the present invention by treatment with ⁇ -70 + Ginger + piperine, was able to show a significant modulating action on the immune response producing an increase in the expression of the genes that code for the cytokines IL- ⁇ , IL-2 and CD3y8 and a decrease in the expression of the gene that codes for the cytokine TNFSF15, giving rise to a protective effect against the artificial infection produced by C. perfringens A.
  • the treatment with the additive described in the present invention is also capable of inducing an increase in the weight gain of the animals subjected to said treatment and decrease the severity of the histological lesions that these animals present as a result of infection with C. perfringens A. BIBLIOGRAPHY

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Abstract

En la presente invención se describe la combinación de sales de ácidos orgánicos con al menos un principio activo de origen vegetal, preferentemente aceites esenciales y parcialmente protegida con grasas y/o aceites vegetales, que evitan que dichos principios activos sean digeridos por las enzimas estomacales en el proceso digestivo. Son preferidas las sales sódicas de un ácido de cadena corta, preferentemente de ácido butírico. Los aceites esenciales preferidos son jengibre, piperina, orégano, ajo, timol, carvacrol, cinamaldehído y/o cualquiera de sus combinaciones. La combinación de las sales de ácidos orgánicos junto con aceites esenciales y protegidas con grasas y/o aceites vegetales son utilizadas como potentes promotores o estimulantes del crecimiento animal, como bactericidas orgánicos frente a bacterias patógenas presentes en dichos animales y como moduladores de su respuesta inmune.

Description

ADITIVOS PARA ALIMENTACIÓN ANIMAL.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a aditivos para la alimentación animal a base de sales de ácidos orgánicos combinadas con productos activos de origen vegetal y todo ello recubierto con grasas y/o aceites vegetales. Dichas sales de ácidos orgánicos son utilizadas como promotores o estimulantes del crecimiento animal, moduladores de la respuesta inmune y bactericidas. Por tanto, la presente invención se engloba dentro del campo de la producción animal y más específicamente dentro de los campos de la alimentación y de la salud animal.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La tendencia en la alimentación animal en Europa en los últimos años es la búsqueda de una dieta que no sólo cubra las necesidades alimenticias de los animales, sino que además refuerce su estado sanitario y reduzca los problemas patológicos sin utilizar medicamentos, para así conseguir mejorar su producción y los rendimientos económicos del ganadero. Una de las vías de control del estado sanitario y de la inmunidad del animal es por medio del control de la flora intestinal.
La utilización de aditivos ha sido una práctica habitual en la alimentación animal con el fin de mejorar el rendimiento productivo, mejorar la salud así como para lograr un aprovechamiento más eficiente de los alimentos. Debido a la prohibición del uso de antibióticos como sustancias promotoras del crecimiento en la Unión Europea (Directiva 1831/2003/CEE) se han buscado aditivos que, en muchos casos demuestran una mejora productiva respecto incluso a los propios antibióticos (Dipeolu et al., 2005). Diferentes estudios realizados en los últimos años han puesto de manifiesto que los ácidos orgánicos son una buena alternativa. Su modo de acción radica, por un lado, en la reducción de pH a nivel estomacal lo que limita el desarrollo de patógenos y ayuda en la digestión de proteínas y, por otro lado, en la habilidad que algunos de éstos ácidos orgánicos tienen de entrar en las bacterias y bloquear su metabolismo. En este sentido, el ácido butírico, también llamado ácido butanoico, se viene estudiando desde hace varios años, observándose efectos beneficiosos en varias especies: cerdos, aves, rumiantes, etc., incluso en peces. Junto con el ácido acético y el propiónico, el butírico pertenece al grupo de Ácidos Grasos Volátiles (AGV) de cadena corta. Esta demostrado que los AGV de cadena corta pueden inhibir el crecimiento del grupo de bacterias Enterobacteriaceae (Salmonella, Escherichia coli, etc.) (Van Immerseel et al. 2004). Esta inhibición se da gracias a que la forma no disociada de los ácidos grasos volátiles es capaz de atravesar la membrana de las bacterias, interferir en su metabolismo y producirle la muerte. Por otro lado, el anión del ácido interfiere con la transcripción genética de las bacterias, lo que impide que las mismas se puedan reproducir y causar una infección. El ácido butírico tiene mejor coeficiente de difusión que otros AGV, provocando que atraviese la pared bacteriana con mayor facilidad que otros ácidos.
Junto al efecto antibacteriano, el ácido butírico presenta efectos adicionales que lo hacen único: por ejemplo, estimula la secreción pancreática (Katoh y Tsudo, 1984; Sano et al, 1995), mejora la absorción de electrolitos, reduce la incidencia de diarrea, aumenta la regeneración intestinal de las microvellosidades, junto con un aumento en la longitud de las mismas (Galfi y Bokori 1990, Lesson et al. 2005), a la vez que también incrementa el área de absorción intestinal dando lugar a un mayor peso promedio de las aves y a una mejor conversión del alimento. Así, todos estos estudios, ponen de manifiesto que el ácido butírico es beneficioso para el ganado, tanto a nivel nutricional, como a nivel de salubridad.
Cabe destacar que la forma libre del ácido butírico es difícil de manejar por su alta corrosividad y volatilidad. Para solucionar dicho problema se han desarrollado diferentes presentaciones del mismo: sales del ácido butírico, sales del ácido butírico microencapsuladas y sales de ácido butírico en forma protegida con una matriz de grasas y/o aceites vegetales, que protegen parte del ingrediente activo y consiguen la liberación lenta de este promotor natural del crecimiento, asegurándose así su acción potenciadora del crecimiento y bactericida en todo el tracto digestivo del animal, a la vez que proporcionan la mayor concentración protegida posible, para incluir el producto en el rango de promotor natural del crecimiento de liberación lenta. Esta sal de ácido en forma protegida es comercializada con el nombre de Gustor BP-70 (Norel, SA, España), a partir de aquí y a lo largo de toda la invención lo llamaremos BP-70. La protección parcial de las sales del ácido butírico con los aceites y/o grasas vegetales permite que el butirato sódico actúe eficazmente a lo largo de todo el tracto digestivo del animal, asegurándose la llegada del principio activo desde los tramos iniciales del digestivo hasta las secciones más distales de dicho tracto gastrointestinal, actuando no sólo como promotor natural del crecimiento, sino también como modulador de la respuesta inmune y como bactericida, reduciendo la posibilidad de infección por parte de bacterias patógenas. La efectividad de Gustor BP-70 se demuestra a niveles donde las sales del ácido butírico no protegido no actúan (ciego/heces) y a niveles donde dichas sales, en forma encapsulada, aún no han podido actuar (buche), siendo un producto completo y eficaz en la lucha contra infecciones bacterianas, específicamente contra Salmonella enteriditis, en la nutrición de aves (Fernández-Rubio C et al, 2009).
El uso como bactericida del butirato sódico ha sido principalmente utilizado en el tratamiento de Salmonella enteritis, ya que es una de las principales bacterias patógenas que afectan a los animales y al hombre. Dentro de las bacterias patógenas también se encuentra la bacteria Clostridium perfringens, que como consecuencia de la producción de diferentes toxinas causa la enteritis necrótica, resultando en una necrosis extensiva de la mucosa intestinal, afectando principalmente a pollos, pavos, patos y aves silvestres. C. perfringens habita de forma natural en el intestino, proliferando bajo determinadas circunstancias, como por ejemplo, exceso de nutrientes no degradados ni digestibles que aparecen con más frecuencia en los cambios de dieta, especialmente cuando el animal recibe dietas mal balanceadas o con materias primas de mala calidad, mala respuesta inmune del tejido linfoide asociado al intestino (GALT) debido al excesivo desgaste del epitelio intestinal como consecuencia de la molienda de los alimentos, presencia de micotoxinas, coccidiosis, etc, desequilibrios en la flora microbiana intestinal, entre otros. En 1972, con la salida al mercado del coccidiostato Monensina pareció detenerse la aparición de casos por infecciones de C. perfringens pero con la tendencia de la eliminación de los antibióticos como promotores de crecimiento y de coccidiostatos adicionados al pienso, está apareciendo de nuevo una casuística creciente de dicha enfermedad infecciosa. Por tanto, para solventar el creciente problema del incremento de enfermedades infecciosas en animales de engorde, utilizados para alimentación humana, y además potenciar en dichos animales el crecimiento de los mismos, la presente invención ha desarrollado un nuevo aditivo para alimentación animal que comprende sales de ácidos orgánicos, preferentemente, ácido butírico, junto con productos activos de origen natural, preferentemente, aceites esenciales, todo ello parcialmente recubierto con grasas y/o aceites vegetales. Dicho aditivo es capaz de inhibir el crecimiento bacteriano, especialmente de bacterias Gram + y coccidios, además de mejorar el estado del epitelio intestinal e incrementar el peso de los animales tratados. El recubrimiento parcial de los principios activos que forman dicho aditivo alimenticio para animales: la sal de un ácido orgánico y los aceites esenciales; con las grasas y/o aceites de origen vegetal, protege a dichos principios activos de la digestión estomacal, pero permitiéndoles que sean activos a lo largo de todo el tracto gastrointestinal de los animales, ya que mediante dicho recubrimiento parcial de los principios activos, se consiguen fases del producto con diferentes cantidades de grasa (0 %-50 % de grasa) que serán digeridas y por tanto liberadas en diferentes puntos del tracto gastrointestinal del animal: la parte no protegida con la grasa se liberará y ejercerá su efecto en las primeras fases del tracto gastrointestinal, hasta la altura del intestino delgado; en cambio, la parte protegida con la grasa no se liberará hasta que ésta se empiece a digerir por acción de las lipasas pancreáticas. Dada la lenta digestión de la grasa, estudios in-vitro han demostrado que parte del principio activo puede llegar a las partes más distales del tracto gastrointestinal, ejerciendo también allí su acción.
Por otro lado, el aditivo para alimentación descrito en la presente invención, es también capaz de potenciar el desarrollo del epitelio intestinal, favoreciendo el crecimiento de villis intestinales, que como consecuencia de la enteritis necrótica inducida en los animales descritos en los ejemplos de la presente invención, dichas villis están disminuidas en número y tamaño. Además, el incremento del desarrollo del epitelio intestinal favorece la mejor absorción de los alimentos produciendo así un incremento en el crecimiento y engorde de los animales tratados con el mismo. El aditivo para alimentación descrito en la presente invención también es capaz de disminuir la incidencia de enfermedades bacterianas como pueden ser la enteritis necrótica o las causadas por la Salmonella enteriditis, gracias a su acción moduladora de la respuesta inmune y a su acción bactericida frente a los patógenos del tipo C. perfringens y S. entérica, entre otros. El uso conjunto de la sal del ácido orgánico junto con aceites esenciales vegetales y todo ello parcialmente recubierto con grasas y/o aceites vegetales es capaz de potenciar el efecto promotor fisiológico del butirato, por ejemplo, como se ha comentado previamente, en el desarrollo de villis intestinales, además de potenciar su efecto bactericida.
El otro principio activo preferido como ingrediente de la combinación con las sales de ácidos orgánicos son los aceites esenciales. Las sinergias de los aceites esenciales con las sales de ácidos orgánicos que destacan, son, desde el punto de vista nutricional, su acción como estimuladores de la digestibilidad, por favorecer el equilibrio y control de la flora microbiana, también destaca por su acción como estimuladores de la inmunidad y por sus propiedades antimicrobianas y antioxidantes. Además, en la presente invención se describe el uso de la combinación de dichas sales de ácidos orgánicos junto con aceites esenciales ambos protegidos con aceites y/o grasas de origen animal, como aditivo para piensos animales actuando como un promotor natural del crecimiento además de como bactericida e inmunomodulador, siendo capaz de reducir los niveles de bacterias patógenas, específicamente de C. perfringes A y S. entérica y de mejorar la respuesta inmune con la que los animales se protegen de infecciones bacterianas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Breve descripción de la invención
En la presente invención se describe un nuevo aditivo para alimentación animal que actúa como promotor natural del crecimiento animal y que comprende sales de ácidos orgánicos combinadas con productos activos de origen natural, preferentemente aceites esenciales. Dicha combinación está parcialmente protegida de la digestión estomacal mediante una envuelta parcial de grasas y/o aceites vegetales. Dicha envuelta, al ser parcial, no impide la acción, a lo largo de todo el tracto intestinal, incluso hasta las partes más distales del mismo, de los principios activos mencionados. Se denominan promotores o estimulantes del crecimiento a los aditivos que forman parte integral de la dieta animal y que cumplen con la función de mejorar el aumento de peso diario de los animales (GDP), así como la conversión de la ración consumida. En la presente invención, los promotores o estimulantes del crecimiento pueden ser administrados de diferentes maneras, ya sean inyectados, en implantes o como un aditivo en el alimento o piensos de los animales. En la presente invención, el efecto sobre el crecimiento se mide como incremento de peso.
A los efectos de la presente invención, el término ácido orgánico se refiere a compuestos que contienen en su fórmula uno o más grupos carboxílicos (-COOH), generadores de protones, que pueden tener además diferentes grupos funcionales tales como hidroxiácidos, cetoácidos, ácidos aromáticos, compuestos heterocíclicos, así como amidas y lactonas. Los ácidos orgánicos utilizados en la presente invención son preferentemente ácidos grasos volátiles, preferentemente de cadena corta y entre los que se pueden seleccionar: ácido butírico, ácido propiónico, ácido fórmico, ácido láctico, ácido cítrico, ácido láurico, ácido cúprico, ácido caprílico, ácido caproico, ácido acético, entre otros. Las proporciones en las que se encuentra el ácido orgánico en el aditivo para alimentación animal descrito en la presente invención, suelen variar entre un 30 y un 70% en peso de producto total húmedo, siendo la proporción preferida de un 50%. Las sales de los ácidos orgánicos utilizadas en la presente invención son preferentemente sal sódica, sal cúprica, sal potásica, sal cálcica, entre otras. Las proporciones en las que se encuentra la sal del ácido orgánico en el aditivo para alimentación animal descrito en la presente invención, suele variar entre un 30 y un 70% en peso del producto total húmedo, siendo la proporción preferida de un 60%.
En la presente invención se utiliza preferentemente la sal sódica del ácido butírico (butirato sódico), aunque puede ser utilizada cualquiera de las sales de los ácidos descritos previamente. A los efectos de la presente invención, el término principio activo de origen vegetal se refiere a toda materia de origen vegetal a la que se le atribuye una actividad apropiada capaz de ejercer un efecto beneficioso sobre el organismo al que se le aplica. Los productos activos de origen vegetal utilizados en la presente invención son preferentemente, aceites esenciales. A los efectos de la presente invención, el término aceite esencial se refiere a una sustancia o sustancias orgánicas volátiles, pertenecientes a diferentes clases de compuestos, por ejemplo, hidrocarburos, ésteres, alcoholes, aldehidos, algunos ácidos, fenoles y sus derivados, lactonas, etc. ; todos, productos de largas cadenas, de biosíntesis vegetal, llamados metabolitos secundarios de las plantas. El término aceite esencial se aplica también a las sustancias sintéticas similares, preparadas a partir del alquitrán de hulla, y a las sustancias semi-sintéticas preparadas a partir de los aceites naturales esenciales. Los aceites esenciales utilizados en la presente invención, pueden seleccionarse de entre cualquiera de los de la siguiente lista: jengibre, piperina, orégano, ajo, timol, carvacrol, cinamaldehído, etc. Las proporciones en las que se encuentran los principios activos de origen vegetal en el aditivo para alimentación animal descrito en la presente invención, suelen variar entre el 1 y el 20% en peso de producto total húmedo, siendo la proporción preferida de un 10% en el producto final.
A los efectos de la presente invención, el término grasa y/o aceite vegetal se refiere a un compuesto orgánico obtenido a partir de semillas u otras partes de las plantas en cuyos tejidos se acumula como fuente de energía. Las grasas y/o aceites, vegetales, utilizados en la presente invención para recubrir la combinación de la sal de ácido orgánico y los productos activos de origen natural, preferentemente, aceites esenciales, pueden seleccionarse de entre otros: estearina de palma (parte más sólida obtenida después del fraccionamiento del aceite de palma) o jabón cálcico de ácidos grasos de aceite de palma (PFAD) (saponificación con calcio de los ácidos grasos). Las proporciones en las que se encuentran dichas grasas y/o aceites vegetales recubriendo la sal del ácido orgánico y los aceites esenciales, descritos en la presente invención, suelen variar entre un 30-60% del peso de producto total húmedo, siendo la proporción preferida de un 30%. Además, en la presente invención se describe el uso de dicho aditivo, promotor natural del crecimiento animal, además de para la mejora de los parámetros productivos de los animales (por ejemplo incremento del peso de los mismos), como modulador de la respuesta inmune y como bactericida, siendo capaz de disminuir la incidencia de enfermedades bacterianas en dichos animales, como por ejemplo la enteritis necrótica en aves, aunque puede ser utilizado para otro tipo de enfermedades bacterianas como por ejemplo: Salmonella enteritis, Escherichia coli, Campylobacter spp., etc y en otros animales, como por ejemplo: conejos, cerdos, etc.
A los efectos de la presente invención, se define el término bactericida como cualquier producto, agente o sustancia capaz de eliminar o matar bacterias. A los efectos de la presente invención, el efecto o la acción bactericida se mide como los cambios macroscópicos producidos en el intestino de los animales debidos a la infección bacteriana. También, a los efectos de la presente invención, la modulación de la respuesta inmune se mide como la variación de la expresión génica, con respecto a animales control sin recibir el aditivo de la invención en su alimentación, infectados o no, de genes que codifican para citocinas, preferentemente, IL-Ι β, IL-2, CD38y y TNFSF15.
Descripción de las figuras Figura 1. Peso de los animales de los grupos A=control y B=BP-70+Jengibre y piperina en el día 17 del ensayo experimental. En el eje Y se indica el peso expresado en gramos. En el ej e X se indica el tiempo expresado en días. *indica las diferencias significativas estadísticamente respecto al grupo control infectado pero no tratado (p<0.05). BP-70: butirato de sodio (60% peso húmedo) protegido con grasa vegetal (30% peso húmedo). El porcentaje de jengibre y piperina incluido en el aditivo es un de 5% del peso del producto total húmedo de cada uno dichos aceites esenciales, es decir 5% de jengibre y 5% de piperina.
Figura 2. Peso de los animales de los grupos A=control y B=BP-70+Jengibre y piperina en el día 24 del ensayo experimental. En el eje Y se indica el peso expresado en gramos. En el eje X se indica el tiempo expresado en días. *indica las diferencias significativas estadísticamente respecto al grupo control infectado pero no tratado (p<0.05). BP-70: butirato de sodio (60% peso húmedo) protegido con grasa vegetal (30% peso húmedo). El porcentaje de jengibre y piperina incluido en el aditivo es un de 5% del peso del producto total húmedo de cada uno dichos aceites esenciales, es decir 5% de jengibre y 5% de piperina.
Figura 3. Comparación de los cambios macroscópicos en muestras de intestino sufridos por el grupo de animales tratados con los aditivos ΒΡ-70+Jengibre y piperina (Grupo B) respecto a los cambios macroscópicos que presentaba el grupo de animales control infectados pero no tratados (Grupo A). En el eje Y se indica la puntuación de los cambios macroscópicos de cada grupo. *indica las diferencias significativas estadísticamente respecto al grupo control (p<0.05). BP-70: butirato de sodio (60% peso húmedo) protegido con grasa vegetal (30% peso húmedo). El porcentaje de jengibre y piperina incluido en el aditivo es un de 10% total del peso del producto húmedo, es decir 5% de jengibre y 5% de piperina.
Figura 4. Niveles relativos de la expresión (Eje Y) de los genes IL-Ι β, IL-2, IL-8, IL-10, CD3y8, LITAF y RNFSF 15 en los grupos de animales tratados con BP-70 o BP- 70+Jengibre y piperina respecto al grupo de animales no infectados y no tratados (Grupo A). BP-70: butirato de sodio (70% peso húmedo) protegido con grasa vegetal (30% peso húmedo). ΒΡ-70+Jengibre + piperina: butirato de sodio (60% peso húmedo) protegido con grasa vegetal (30% peso húmedo) + 5% jengibre + 5% piperina. El área cuadrada de la caja abarca el 50% de todas las mediciones, la línea horizontal del interior de la caja representa la mediana de la muestra y las líneas verticales representan el 50% de las mediciones que se salen fuera de los valores de la caja. Los asteriscos indican la significación estadística con un valor de p <0.05. Los niveles de expresión relativos de los genes analizados indican la expresión en tanto por 1 de cada gen con respecto a los niveles de expresión de cada gen en el Grupo A.
La Figura 4A muestra los niveles relativos de expresión de los genes indicados en el Grupo C (animales no infectados y tratados con BP-70) vs Grupo A (animales no infectados y no tratados). La Figura 4B muestra los niveles relativos de expresión de los genes indicados en el Grupo D (animales no infectados y tratados con ΒΡ-70+Jengibre+piperina) vs Grupo A (animales no infectados y no tratados).
La Figura 4C muestra los niveles relativos de expresión de los genes indicados en el Grupo F (animales infectados y tratados con ΒΡ-70+Jengibre+piperina) vs Grupo A (animales no infectados y no tratados).
Figura 5. Nivel relativo de la expresión (Eje Y) del gen TNFSF15 en los diferentes grupos de tratamiento: BP-70 (Grupos C y E) o ΒΡ-70+Jengibre + piperina (Grupos D y F), en comparación con los animales no tratados y no infectados (Grupo A). BP-70: butirato de sodio (70% peso húmedo) protegido con grasa vegetal (30% peso húmedo). BP- 70+Jengibre + piperina: butirato de sodio (60%> peso húmedo) protegido con grasa vegetal (30%) peso húmedo) + 5%> jengibre + 5%> piperina. Grupo B: animales infectados pero no tratados; Grupo C: animales no infectados y tratados con BP-70; Grupo D: animales no infectaos y tratados con ΒΡ-70+Jengibre+piperina; Grupo E: animales infectados y tratados con BP-70; Grupo F: animales infectados y tratados con ΒΡ-70+Jengibre+piperina. El área cuadrada de la caja abarca el 50%> de todas las mediciones, la línea horizontal del interior de la caja representa la mediana de la muestra y las líneas verticales representan el 50%> de las mediciones que se salen fuera de los valores de la caj a. Los asteriscos indican la significación estadística con un valor de p <0.05. Los niveles de expresión relativos de los genes analizados indican la expresión en tanto por 1 de cada gen con respecto a los niveles de expresión de cada gen en el Grupo A.
Figura 6. Niveles relativos de expresión (Eje Y) de los genes IL-Ι β, IL-2, IL-8, IL-10, CD3y8, LITAF y RNFSF15 en el grupo de animales infectados y tratados con BP- 70+Jengibre+piperina (Grupo F), en comparación con los animales no tratados e infectados (Grupo B). ΒΡ-70+Jengibre y piperina: butirato de sodio (60%> peso húmedo) protegido con grasa vegetal (30%> peso húmedo) + 5%> jengibre + 5%> piperina. El área cuadrada de la caja abarca el 50%> de todas las mediciones, la línea horizontal del interior de la caja representa la mediana de la muestra y las líneas verticales representan el 50%> de las mediciones que se salen fuera de los valores de la caja. Los asteriscos indican la significación estadística con un valor de p <0.05. Los niveles de expresión relativos de los genes analizados indican la expresión en tanto por 1 de cada gen con respecto a los niveles de expresión de cada gen en el Grupo B.
Figura 7. Niveles relativos de expresión (Eje Y) del gen TNFSF15 en los grupos de animales infectados y tratados con BP-70 (Grupo E) o con ΒΡ-70+Jengibre + piperina (Grupo F), en comparación con los animales no tratados e infectados (Grupo B). BP-70: butirato de sodio (70% peso húmedo) protegido con grasa vegetal (30% peso húmedo). BP- 70+Jengibre + piperina: butirato de sodio (60% peso húmedo) protegido con grasa vegetal (30%) peso húmedo) + 5%> jengibre + 5%> piperina. El área cuadrada de la caja abarca el 50%) de todas las mediciones, la línea horizontal del interior de la caja representa la mediana de la muestra y las líneas verticales representan el 50% de las mediciones que se salen fuera de los valores de la caja. Los asteriscos indican la significación estadística con un valor de p <0.05. Los niveles de expresión relativos de los genes analizados indican la expresión en tanto por 1 de cada gen con respecto a los niveles de expresión de cada gen en el Grupo B
Descripción detallada de la invención
Uno de los objetos de la presente invención se refiere a aditivos para alimentación animal que comprenden la combinación de sales de ácidos orgánicos con al menos un principio activo de origen vegetal, todo ello parcialmente recubierto con aceites y/o grasas vegetales.
En una realización preferida, los aditivos de la invención se caracterizan porque los ácidos orgánicos se seleccionan de entre cualquiera de la lista: butírico, láctico, cítrico, láurico, cúprico, caprílico, caproico, acético, entre otros, siendo preferido el ácido butírico.
En otra realización preferida, los aditivos de la invención, se caracterizan porque las sales de ácidos orgánicos se seleccionan de entre cualquiera de la lista: sódica, cálcica, cúprica o potásica. Las proporciones en las que se encuentra la sal del ácido orgánico en el aditivo para alimentación animal descrito en la presente invención, suele variar entre un 30% y un 70%) en peso húmedo del producto final, siendo más preferible una proporción del 60%>.
En otra realización preferida, los aditivos de la invención, se caracterizan porque la sal preferida es la sal sódica y el ácido orgánico preferido es el ácido butírico, siendo por tanto, preferida en los aditivos de la invención, la sal sódica del ácido butírico.
En otra realización preferida, los aditivos de la invención, se caracterizan porque la sal del ácido orgánico se encuentra preferentemente a una concentración del 60%> en peso húmedo del producto final. En otra realización preferida, los aditivos de la invención, se caracterizan porque los principios activos de origen vegetal son preferentemente aceites esenciales y pueden seleccionarse de entre cualquiera de la lista: jengibre, piperina, orégano, timol, ajo, carvacrol, cinamaldehído y/o cualquiera de sus combinaciones, siendo preferentemente utilizada la combinación de aceite esencial de jengibre y piperina.
En otra realización preferida, los aditivos de la invención, se caracterizan porque los principios activos vegetales se encuentran preferentemente en una proporción de entre el 1% y el 20% del peso húmedo del producto final, siendo la proporción preferida de un 10% del peso húmedo del producto final.
En otra realización preferida, los aditivos de la invención, se caracterizan porque en la combinación de aceites esenciales de jengibre y piperina se utiliza preferentemente un 5% de aceite de jengibre y un 5%> de aceite de piperina.
En otra realización preferida, los aditivos de la invención, se caracterizan porque el recubrimiento parcial de la combinación de las sales de ácidos orgánicos con los principios activos de origen vegetal, con aceites y/o grasas vegetales, es aproximadamente entre un 30-60%) del peso húmedo del producto final, siendo más preferentemente un recubrimiento de un 30%.
En otra realización preferida, los aditivos de la invención, se caracterizan porque los aceites y/o grasas vegetales que recubren parcialmente la combinación de las sales de ácidos orgánicos con los principios activos de origen vegetal, se seleccionan entre: estearina de palma o jabón cálcico de ácidos grasos de aceite de palma (PFAD), siendo preferida la estearina de palma.
En otra realización preferida, los aditivos de la invención, se caracterizan porque la sal es preferentemente la sal sódica del ácido orgánico butírico, el principio activo de origen vegetal está formado preferentemente por la combinación de aceites esenciales, siendo éstos preferentemente el aceite esencial de jengibre y el de piperina y la cubierta de aceites y/o grasas vegetales está preferentemente formada por estearina de palma.
En otra realización preferida, los aditivos de la invención se caracterizan porque la concentración de butirato sódico es preferentemente de un 60%>, la concentración de la combinación de aceites esenciales de jengibre y piperina es preferentemente de un 10% y la cubierta de estearina de palma es preferentemente de un 30%>.
En otra realización preferida, la combinación de aceites esenciales de jengibre y piperina está formada preferentemente por un 5% de aceite de jengibre y un 5% de aceite de piperina.
Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere al uso de los aditivos descritos anteriormente, para alimentación animal, como promotores del crecimiento de los animales, preferentemente de pollos, conejos y cerdos.
Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere al uso, en alimentación animal en animales de cría alimentados con los aditivos descritos previamente, como moduladores de la respuesta inmune. En una realización preferida, la modulación de la respuesta inmune comprende una variación de la expresión de alguno de los genes que codifican para alguna de las siguientes citocinas: aumentando la expresión de IL-Ι β, IL-2, CD3y8 y/o disminuyendo la expresión de TNFSF15.
Otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere al uso, en alimentación animal, en animales de cría alimentados con los aditivos descritos previamente, como bactericidas, al inhibir el crecimiento tanto de bacterias Gram+, preferentemente bacterias del género Clostridium, más preferentemente C. perfringens, Gram-, preferentemente bacterias de la familia Enterobacteriaceae, más preferentemente de los géneros Salmonella, Eschericia y Campylobacter e incluso protozoos, como es el caso de los protozoos de la familia de Eimeria y Criptosporideos.
Los ejemplos que se describen a continuación tienen como objetivo ilustrar la presente invención, pero sin limitar el alcance de la misma. Ejemplo 1. Examen patológico macroscópico e histopatológico en pollos de engorde a los que se les induce enteritis necrótica y tratados con diferentes aditivos alimenticios.
Se utilizaron pollos de engorde convencionales (híbridos Bábolna, Bábolna, Hungría) que tenían un día de edad cuando entraron a formar parte de los diferentes grupos de tratamiento descritos en la presente invención. Aunque los ejemplos son realizados en pollos de engorde (ganadería avícola), los aditivos alimenticios potenciadores del crecimiento animal y con acción bactericida natural, descritos en la presente invención, pueden ser utilizados en cualquier otro tipo de ganadería, como por ejemplo: porcina, cunícola, ovina, bovina, etc.
Los pollos de engorde fueron alimentados con una dieta convencional libre de medicamentos y rica en proteínas (25% de harina de pescado). Dicho alimento no presentaba coccidiostáticos (agentes útiles en el tratamiento o prevención de la coccidiosis en hombres y/o animales). Los animales no tenían restricción de agua y fueron guardados en jaulas a una densidad de 30 animales/m2. Los lechos, bebederos y comederos fueron esterilizados previamente en autoclave. La temperatura ambiente fue establecida en 32 ± 4°C, disminuyendo hasta 24 ± 4°C a medida que los animales crecían.
Para producirles la enteritis necrótica, dichos animales fueron inoculados con la cepa alfa toxigénica tipo A de C. perfringens (ATCC 13124). Dicha cepa fue crecida en medio de cultivo Reinforced Clostridial Médium (BD, MD, USA) a una temperatura de 37°C durante 24 horas en anaerobiosis haciendo uso del sistema Anaerocult A (Merck, Darmstadt, Alemania). Posteriormente, dichos cultivos bacterianos fueron centrifugados (3000 g, 10 min., 5°C, centrífuga Universal 320R, Hettich centrifugas) y el pellet obtenido resuspendido en una solución de suero fosfato salino (PBS) estéril. El título de C. perfringens fue de 3- 4x108 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml. La enteritis necrótica muestra signos clínicos sólo si están presentes factores de predisposición, por lo tanto dichos animales fueron infectados oralmente con coccidios mediante la vacunación con la vacuna viva atenuada Paracox 5® (Ceva-Phylaxia) y con C. perfringens A.
En la Tabla 1 se muestra el protocolo de infección y vacunación utilizado en la presente invención. Brevemente, los animales fueron vacunados frente a la enfermedad de Gumboro o enfermedad de bursitis infecciosa (IBD, en sus siglas en inglés). Es una enfermedad altamente contagiosa en pollos jóvenes causada por el virus de la enfermedad de bursitis infecciosa (IBDV) y que se caracteriza por la inmunosupresión y la mortalidad de los animales, generalmente a la edad de 3 a 6 semanas de vida. La vacuna frente a dicha enfermedad (CEVAC Gumbo L®, Ceva-Phylaxia) se les administró en el agua el día 16, para producir en los animales una moderada inmunosupresión y ser más propensos a padecer la enteritis necrótica. Posteriormente, se procedió la inoculación, por vía oral a través de sonda nasogástrica, de 2mL de una suspensión de C. perfringens (6.8xl08 UFC) durante tres veces al día (8.00 am, 12.00 am y 16.00 pm) en los días 18, 19, 20 y 21. El día 19, se les administró además, una dosis 10 veces mayor de la habitual, de la vacuna viva atenuada Paracox-5® (Ceva-Phylaxia), para inducirles la infección por coccidios y predisponer a los animales a la enfermedad clínica. La vacuna Paracox-5® es una vacuna viva atenuada que contiene ooquistes esporulados derivados de líneas precoces de coccidios que son patógenas para los pollos: Eimeria acervulina, Eimeria brunetti, Eimeria máxima, Eimeria mitis, Eimeria necatrix, Eimeria praecox y Eimeria tenella. Los animales control también fueron tratados con las vacunas frente a la enfermedad de Gumboro y con la vacuna de Paracox-5®.
Tabla 1. Protocolo de infección y vacunación
Edad de los pollos (días) 1 16 17 18 19 20 21
Vacunación frente a Gumboro
Infección con clostridios
Vacunación con Paracox-5®
(dosis 10 veces mayor que la habitual)
Los pollos de engorde (n=24), incluidos en el presente ejemplo fueron divididos en tres grupos (12 animales/grupo, Tabla 2). Todas las aves fueron tratadas con las vacunas frente a la enfermedad de Gumboro y con la vacuna de Paracox-5® en los días indicados en la Tabla 1. Todos los animales de cada grupo fueron infectados oralmente con C. perfringens A (6-8x108 CFU). El grupo de animales control fue alimentado con la dieta base descrita, sin ningún aditivo. En cambio, al otro grupo de animales se le administró en la dieta una concentración de 1.5 g/Kg de pienso, del aditivo descrito en la presente invención: butirato sódico junto con jengibre y piperina, estando ambos principios recubiertos en un 30% en peso húmedo, con grasas vegetales, específicamente con estearina de palma. Se utilizó como butirato sódico, la composición de Norel, S.A. llamada BP-70 a la que se le añadieron como aceites esenciales el jengibre (CAS 84696-15-1) (5%> en peso húmedo) obtenido de Ventos S.A. (Barcelona, España) y la piperina (5%> en peso húmedo) obtenida de la empresa Sensient Fragances S.A. (Granada, España). El BP-70 está formado por un 70%) en peso húmedo de butirato sódico y un 30%> en peso húmedo de grasas vegetales. El 30%o de la grasa vegetal protege aproximadamente el 43%> del butirato sódico total, así por tanto, el producto BP-70 se puede decir que está formado por un 30%> de butirato sódico protegido y por un 40%> de butirato sódico sin proteger. Los aceites esenciales de jengibre y piperina, quedan recubiertos con los mismos porcentajes que el butirato sódico. Todos los aditivos para piensos fueron suministrados por Norel, SA, España. El peso corporal de los animales se midió durante el experimento en los días 1, 4, 7, 10, 14, 18, 21. Todos los animales fueron sacrificados en el día 25. Tabla 2: Diseño Experimental.
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Grupo A=control, Grupo B= ΒΡ-70+Jengibre+piperina, Group C= aceites esenciales.
En la Figura 1 se muestra que ya en el día 17, justo el día anterior a la infección con C. perfringens A, el grupo de animales tratados con ΒΡ-70+Jengibre+piperina (Grupo B) presentaba un incremento de su masa corporal respecto al grupo control infectado pero no tratado con ningún aditivo alimenticio (Grupo A) (p=0.002). Posteriormente se realizó otro análisis de peso corporal de cada uno de los grupos de animales incluidos en el estudio en el día 24, un día antes del sacrificio de los mismos. Como se observa en la Figura 2 y al igual que sucedió con el análisis de peso realizado en día 17 (Figura 1), dicho análisis puso de manifiesto que el tratamiento con ΒΡ-70+Jengibre+piperina, mostró una tasa de crecimiento corporal significativamente mayor que el grupo de animales control infectados pero no tratados con ningún aditivo alimenticio (p=0.001). A continuación se procedió a la realización de un análisis histopatológico de las muestras recogidas de distintos órganos de cada grupo de animales: hígado, bazo y la sección distal del yeyuno. Las muestras frescas fueron sumergidas inmediatamente en formol al 10% para su conservación hasta que fuesen utilizadas en los análisis posteriores. Las lesiones microscópicas se clasificaron de acuerdo con el método de Gholamiandehkordi et al. (2007), con pequeñas desviaciones: 0=negativo; l=inflamación del intestino; 2=necrosis focal (1.2 cm) o cambios degenerativos en la mucosa (la apariencia grasosa); 3=necrosis irregular (3-4 cm) y 4=necrosis difusa. La presencia de enteritis (por lo general linfo- histiocítica) también se indicó. En la Figura 3 se muestra una comparación de la gravedad de las lesiones macroscópicas que presentaba el grupo de animales tratados con ΒΡ-70+Jengibre+piperina (Grupo B) respecto al grupo de animales control infectados pero no tratados con ningún aditivo. Como se puede observar en dicha Figura 3, el Grupo B (ΒΡ-70+Jengibre+piperina) mostró puntuaciones significativamente más bajas que el grupo control (p=0.001). Por tanto, dichos resultados ponen de manifiesto que el tratamiento con ΒΡ-70+Jengibre+piperina (Grupo B) disminuye significativamente las lesiones macroscópicas que presentaban los pollos de engorde infectados con C. perfringes A respecto al grupo de animales control que presentaban infección pero a los que no se les administró ningún tipo de aditivo (Grupo A).
Así, mediante el presente ejemplo se pone de manifiesto que el tratamiento el aditivo alimenticio descrito en la presente invención, butirato sódico junto con aceites esenciales vegetales, jengibre y piperina, y todo ello parcialmente recubierto con grasas vegetales, produce un incremento significativo en el peso de los animales a los que se les indujo necrosis entérica artificial mediante la inoculación de C. perfringens A y que han sido tratados con dicho aditivo (Grupo B) respecto al grupo de animales control, que también presentaban la infección pero que no han sido tratados con dicho aditivo (Grupo A). También, el presente ejemplo pone de manifiesto la mejora de las lesiones, principalmente intestinales (producidas por la infección con C. perfringens A), que presentan las muestras extraídas del grupo de animales tratado con el aditivo de la invención (Grupo B) respecto al grupo de animales control no tratados con ningún aditivo (Grupo A).
Ejemplo 2. Determinación de la respuesta inmune del tejido linfoide asociado al intestino (GALT) en pollos de engorde que padecen enteritis necrótica y que son tratados con diferentes aditivos alimenticios. Para determinar la respuesta inmune del GALT, se realizó otro ensayo experimental también con pollos de engorde (n=48) que fueron divididos en seis grupos (6 animales/grupo, Tabla 3). Todas las aves, al igual que en el Ejemplo 1, también fueron tratados con vacunas de Gumboro y Paracox-5® en los días indicados en la Tabla 1. Los grupos A, C y D están formados por los pollos de engorde no infectados con C. perfringes A, mientras que los grupos B, E y F están formados por los pollos de engorde infectados por vía oral, con C. perfringens A (6-8x108 CFU). La dieta básica de los animales es la misma que la descrita en el Ejemplo 1 , pero complementada con diferentes aditivos para piensos: (i) 1 , 5 g de ΒΡ-70/Kg. de alimento (grupos C y E), (ii) 1 , 5 g de BP- 70+Jengibre+piperina/kg de alimento (Grupos D y F). Todos los aditivos para piensos fueron suministrados por Norel, SA, (Madrid, España). Tabla 3. Diseño Experimental
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Los pollos fueron sacrificados en el día 22 y se tomaron muestras intestinales de aproximadamente 5 cm de largo del yeyuno entre el divertículo de Meckel y la región ilíaca. Las secciones intestinales fueron cortadas longitudinalmente, y se lavaron tres veces con PBS helado que contenía 100 U/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina (Fischer científico). La capa de la mucosa se raspó con un portaobjetos de vidrio estéril y el tejido intestinal fue sumergió inmediatamente en 1 mi de Trizol helado (Invitrogen), para posteriormente extraer el ARN según se indica en las instrucciones del fabricante. Las muestras fueron homogeneizadas y se mantenidas a -80°C hasta ser procesadas.
Para evaluar la respuesta inflamatoria e inmune después de inducir en los animales la infección con la enteritis necrótica y comparar el efecto de cada uno de los tratamientos con los diferentes aditivos descritos en la Tabla 3, se evaluaron los cambios en los niveles de expresión de diferentes citocinas mediante la técnica de PCR cuantitativa (qRT-PCR). Las citocinas analizadas fueron: interleucina-1 beta (IL-Ι β), interleucina-2 (IL-2), interleucina-8 (IL-8), interleucina-10 (IL-10), receptor CD3y8, lipopolisacárido de necrosis tumoral inducida por el factor alfa (LITAF) y factor 15 de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNFSF15). Los genes control usados de referencia fueron: gliceraldehído-3- fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y β-actina. Los cebadores utilizados para cada uno de los genes mencionados se muestran en la Tabla 4. Las interleucinas-1, 2, 8 y 10 son miembros de la familia de las interleucina, indispensables en la respuesta inmune celular y humoral. El receptor CD3 (Cluster de Diferenciación 3) es un receptor de destino se encuentra en todas las células-T, el LITAF es una citocina de la familia del TNF que se libera después de la inducción LPS y el TNFSF15 está presente en las células endoteliales y también participa en la proliferación, diferenciación y apoptosis de las células del sistema inmune. Para analizar las diferencias significativas que presentaron cada uno de los grupos de tratamiento descritos previamente en el nivel de expresión de los genes analizados se utilizó el test de ANO VA. Tabla 4. Cebadores utilizados en la técnica qRT-PCR
ARN Tamaño N° Acceso al
Cebadores
producto GenBank
Gen Directo Inverso (bp)
GAPDH SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 2 264 NM_204305 β-actina SEQ ID NO. 3 SEQ ID NO. 4 169 NM_205518
IL-Ι β SEQ ID NO. 5 SEQ ID NO. 6 80 NM_204524
IL-2 SEQ ID NO. 7 SEQ ID NO. 8 148 NM_204153
IL-8 SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 10 200 NM_205498
IL-10 SEQ ID NO. 11 SEQ ID NO. 12 94 NM_001004414
CD3y8 SEQ ID NO. 13 SEQ ID NO. 14 166 NM_205512.1
LITAF SEQ ID NO. 15 SEQ ID NO. 16 229 NM_204267
TNFSF15 SEQ ID NO. 17 SEQ ID NO. 18 292 NM_001024578
Para poner de manifiesto los efectos inmunomoduladores que proporcionan los aditivos alimenticios administrados a los diferentes grupos de animales descritos en el presente ejemplo infectados o no con C. perfringens, se compararon los grupos de animales C y D tratados con alguno de los aditivos mencionados y que no presentaban infección respecto al grupo de animales control no tratado y no infectado (Grupo A). Y por otro lado, se compararon los grupos de animales E y F tratados con los aditivos BP-70 o BP- 70+jengibre+piperina, respectivamente y que presentaban enteritis necrótica, respecto al grupo de animales infectado con C. perfringens pero no tratado con ningún aditivo de los descritos en la presente invención (Grupo B).
En primer lugar se comparó el nivel de expresión de las citocinas analizadas en el grupo de animales control no tratados y que no han sido infectados con C. perfringens A (Grupo A) respecto a los grupos de animales no infectados con C. perfringens A pero tratados con los aditivos alimentarios BP-70 (Grupo C) y ΒΡ-70+Jengibre+piperina (Grupo D), para analizar los efectos inmunomoduladores naturales de dichos aditivos. La Figura 4 A, B y C muestra el efecto inmunomodulador de los aditivos: BP-70 y BP- 70+Jengibre+piperina, sobre el nivel de expresión de los genes IL-Ι β, IL-2, IL-8, IL-10, CD3y8, LITAF y TNFSF15. Los ratios relativos de expresión de dichos genes en los grupos tratados C y E, se compararon con los animales no tratados (Grupo A). Ninguno de los grupos estaba infectado con C. perfringens A. La Figura 4 A muestra que el tratamiento con BP-70 (Grupo C) no produjo ningún cambio en los niveles de expresión de los genes analizados. Los mayores cambios en el perfil de expresión de las genes analizados se produjeron debido al tratamiento con el aditivo ΒΡ-70+Jengibre+piperina (Grupo D) (Figura 4B). Tres de los genes investigados estaban sobreexpresados en el grupo de animales que tomaban ΒΡ-70+Jengibre+piperina (Grupo D), respecto al grupo de animales control que no lo tomaban (Grupo A). Dichos genes fueron: IL-Ι β (p=0.028), IL-2 (p=0,026) y CD3y8 (p=0.011). Por otro lado, uno de los genes analizados, TNFSF15, mostró una infraexpresión (p=0.004). Esta infraexpresión se reprodujo también (Figura 4C) cuando se comparó el grupo de animales control no infectados y sin tratamiento (Grupo A) con el grupo de animales infectados y tratados con el aditivo descrito en la presente invención ΒΡ+70+Jengibre+piperina (grupo F). La sobreexpresión de los genes IL-Ι β e IL- 2 indica la activación de la cascada de la respuesta inmune, dando lugar a la estimulación de la proliferación y maduración de los linfocitos. Estas observaciones se ven confirmadas por el aumento de la expresión génica de CD3y8 que representa un recuento total elevado de células T.
Por otro lado, en la Figura 5 se muestra el nivel de expresión de cada una de las citocinas analizadas: IL-Ι β, IL-2, IL-8, IL-10, CD3y8, LITAF y TNFSF15, en cada uno de los grupos de animales tratados con cada uno de los aditivos descritos en el presente ejemplo y que estaban o no infectados con C. perfringes A (Grupos C a F), así como en el grupo de animales control infectado con C. perfringes A, pero no tratado con ninguno de dichos aditivos (Grupo B). La Fig. 5 pone de manifiesto que el tratamiento con BP- 70+Jengibre+piperina (Grupo E), produjo una infraexpresión del gen TNFSF15 tanto en el grupo de animales control sin infectar y sin tomar ningún aditivo en su dieta (Grupo A), como en el grupo de animales infectados pero que tampoco tomaban ningún aditivo en su dieta (Grupo B).
En segundo lugar se analizaron los efectos inmunomoduladores que proporcionan los aditivos alimenticios administrados a los animales de los grupos E (BP-70) y F (BP- 70+Jengibre+piperina), tratados con los aditivos mencionados y que presentaban enteritis necrótica, respecto al grupo de animales infectado con C. perfringens pero no tratado con ningún aditivo de los descritos en la presente invención (Grupo B).
En la Figura 6 se muestra el nivel de expresión de los genes IL-Ι β, IL-2, IL-8, IL-10, CD3y8, LITAF y TNFSF15 en el grupo de animales infectados con C. perfringes A y que están tratados con el aditivo alimenticio descrito en la presente invención, BP- 70+Jengibre+piperina (Grupo F), respecto al nivel de expresión de dichos genes que presentaba el grupo de animales control infectado con C. perfringes A pero que no ha sido alimentado con los aditivos utilizados en el presente ejemplo (Grupo B). Dicho análisis se realiza con el fin de analizar los efectos de dichos aditivos en la evolución de la infección. Como se puede observar en dicha Figura 6, se produjo un incremento significativo en los niveles de expresión de la citocina IL-2 respecto al grupo control no tratado (Grupo B). Además, dicho grupo de animales tratado con ΒΡ-70+Jengibre+piperina presentó un descenso en los niveles de expresión de TNFSF15 respecto al grupo de animales control no tratados (Grupo B).
De la misma manera, en la Figura 7, se muestra el nivel de expresión de las citocina TNFSF15 en el grupo de animales infectados y tratados con ΒΡ-70+Jengibre+piperina (Grupo F) respecto al grupo de animales control infectados pero no tratados (Grupo B). El tratamiento con ΒΡ-70+Jengibre+piperina (Grupo F) produjo una infraexpresión de TNFSF15, respecto al grupo control (Grupo B).
De acuerdo con los resultados mostrados en el presente ejemplo, el tratamiento con butirato sódico + aceites esenciales, ejemplificado en la presente invención mediante el tratamiento con ΒΡ-70+Jengibre+piperina, fue capaz de mostrar una acción moduladora significativa en la respuesta inmune produciendo un incremento en la expresión de los genes que codifican para las citocinas IL-Ι β, IL-2 y CD3y8 y un descenso en la expresión del gen que codifica para la citocina TNFSF15, dando lugar a un efecto protector frente a la infección artificial producida por C. perfringens A. Además, como se ha puesto de manifiesto en los resultados mostrados en el Ejemplo 1, el tratamiento con el aditivo descrito en la presente invención, también es capaz de inducir un incremento en la ganancia de peso de los animales sometidos a dicho tratamiento y disminuir la gravedad de las lesiones histológicas que presentan dichos animales como consecuencia de la infección con C. perfringens A. BIBLIOGRAFIA
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Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S
1. - Aditivo para alimentación animal que comprende la combinación de sales de ácidos orgánicos con al menos un principio activo de origen vegetal, parcialmente recubierta dicha combinación con aceites y/o grasas vegetales.
2. - Aditivo para alimentación animal según la reivindicación 1 donde los ácidos orgánicos se seleccionan de entre cualquiera de la lista: butírico, propiónico, fórmico, láctico, cítrico, láurico, cúprico, caprílico, caproico o acético.
3. - Aditivo para alimentación animal según la reivindicación 1 donde las sales de ácidos orgánicos se seleccionan de entre cualquiera de la lista: sódica, cálcica, cúprica o potásica.
4. - Aditivo para alimentación animal según las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque la sal del ácido orgánico es preferentemente la sal sódica del ácido butírico.
5. - Aditivo para alimentación animal según las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque la sal del ácido orgánico se encuentra preferentemente en una proporción de entre un 30- 70% en peso húmedo, siendo más preferible una proporción del 60%>.
6. - Aditivo para alimentación animal según la reivindicación 1 donde los principios activos de origen vegetal son preferentemente aceites esenciales y pueden seleccionarse de entre cualquiera de la lista: jengibre, piperina, orégano, timol, carvacrol, cinamaldehído, ajo y/o cualquiera de sus combinaciones.
7. - Aditivo para alimentación animal según la reivindicación 6 donde el principio activo de origen vegetal es preferentemente una combinación de aceites esenciales de jengibre y de piperina.
8.- Aditivo para alimentación animal según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado porque los principios activos vegetales se encuentran preferentemente a una concentración de entre un 1-20% en peso húmedo, preferentemente a una concentración del 10%.
9.- Aditivo para alimentación animal según las reivindicaciones 7 y 8 caracterizado porque la concentración preferida de jengibre y piperina es del 5% en peso húmedo de jengibre y 5% en peso húmedo de piperina.
10.- Aditivo para alimentación animal según la reivindicación 1 caracterizado porque el recubrimiento parcial de la combinación de las sales de ácidos orgánicos con los principios activos de origen vegetal, con aceites y/o grasas vegetales, es aproximadamente entre un 30-60% en peso húmedo, siendo más preferentemente un recubrimiento de un 30%.
11.- Aditivo para alimentación animal según la reivindicación 10 donde los aceites y/o grasas vegetales que recubren parcialmente la combinación de las sales de ácidos orgánicos con los principios activos de origen vegetal, se seleccionan entre: estearina de palma o jabón cálcico de ácidos grasos de aceite de palma (PFAD).
12.- Aditivo para alimentación animal según las reivindicaciones 1 a 11 caracterizado porque la sal es preferentemente la sal sódica del ácido orgánico butírico, el principio activo de origen vegetal es preferentemente una combinación de aceite esencial de jengibre y piperina y la cubierta de aceites y/o grasas vegetales está preferentemente formada por estearina de palma.
13. - Aditivo para alimentación animal según la reivindicación 12 caracterizado porque la concentración de butirato sódico es preferentemente un 60% peso húmedo, la concentración de la combinación de aceites esenciales de jengibre y piperina es preferentemente un 10% peso húmedo y la cubierta de estearina de palma es preferentemente de un 30% peso húmedo.
14. - Aditivo para alimentación animal según la reivindicación 13 caracterizado porque la concentración de jengibre es del 5% en peso húmedo y la concentración de piperina es del 5% en peso húmedo.
15. - Uso de los aditivos para alimentación animal de las reivindicaciones 1 a 14 como promotores del crecimiento de los animales.
16. - Uso según la reivindicación 15 donde los animales son preferentemente pollos, conejos y cerdos.
17. - Uso de los aditivos para alimentación animal de las reivindicaciones 1 a 14 como moduladores de la respuesta inmune, en animales de cría alimentados con los mismos.
18. - Uso según la reivindicación 17 caracterizado porque la modulación de la respuesta inmune comprende una variación de la expresión de alguno de los genes que codifican para alguna de las siguientes citocinas: aumentando la expresión de IL-Ι β, IL-2 y CD3y8 y/o disminuyendo la expresión de TNFSF15.
19. - Uso de los aditivos para alimentación animal de las reivindicaciones 1 a 14 como bactericidas en animales de cría alimentados con los mismos.
20. - Uso según la reivindicación 19 caracterizado porque la acción bactericida es ejercida sobre bacterias Gram+, Gram -, y protozoos.
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