ES2873602T3 - Composiciones y métodos de uso del -hidroxi- -metilbutirato (HMB) como un aditivo de alimentos para animales - Google Patents

Abstract

Uso de β-hidroxi-β-metilbutirato (HMB) para prevenir, eliminar y/o reducir el crecimiento microbiano en el alimento para animales o el agua.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos de uso del -hidroxi- -metilbutirato (HMB) como un aditivo de alimentos para animales

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende p-hidroxi-p-metilbutirato para reducir la contaminación microbiana en el alimento para animales.

2. Antecedentes

La Salmonella y otros contaminantes microbianos son un peligro significativo en el alimento para animales y pueden causar enfermedad y muerte tanto en los animales portadores como a través de la transmisión de los animales contaminados o el alimento a los seres humanos. Los reservorios animales comunes de Salmonella incluyen pollos, pavos, cerdos y vacas, aunque docenas de otros animales domésticos y salvajes albergan estos organismos. Los productos animales, como la carne y los huevos, proporcionan un vehículo importante de transmisión a los seres humanos debido, al menos en parte, a la capacidad de la Salmonella para sobrevivir en productos de origen animal como la carne que no estén bien cocidos. Además, la Salmonella provoca pérdidas sustanciales de ganado.

Recientemente, varias retiradas de alimentos para mascotas de alto nivel se han atribuido a la contaminación con Salmonella. Además de los impactos negativos en la salud animal, los alimentos para mascotas y el pienso animal contaminados con Salmonella se han vinculado a la infección en seres humanos. El pienso animal contaminado, incluidos los alimentos para mascotas, supone un riesgo significativo para los seres humanos, ya que los seres humanos entran en contacto directo con estos alimentos. Para ayudar a reducir los riesgos para los seres humanos, la Ley de Modernización de la Seguridad Alimentaria ha establecido una política de tolerancia cero para la Salmonella en alimentos para mascotas. Típicamente, los alimentos para mascotas se extruyen/procesan a altas temperaturas suficientes para destruir las bacterias patógenas. Sin embargo, el potencial de contaminación posterior al procesamiento sigue existiendo, ya que el procesamiento térmico mediante acondicionamiento y extrusión o peletización solo ofrece una mitigación puntual de la contaminación microbiana. El potencial de contaminación posterior al procesamiento puede ocurrir durante el recubrimiento, refrigeración, empaque y almacenamiento del pienso.

Otro método para reducir la Salmonella en el alimento para animales es mediante la adición de aditivos químicos, lo que ofrece el potencial de un potencial de mitigación a más largo plazo contra Salmonella y otros patógenos. Los ácidos grasos de cadena corta se han usado ampliamente como aditivos para piensos para controlar Salmonella en aves de corral, lo que resulta en la disminución de la contaminación con Salmonella en carne y huevos. En la industria de alimento para animales, los aditivos químicos a menudo se derivan de mezclas de ácidos orgánicos o formaldehído comercial. Recientemente, una reducción de la contaminación con Salmonella en los ingredientes de los alimentos de harina de proteínas con la inclusión de una mezcla de ácidos grasos de cadena media, una mezcla de ácidos orgánicos o una mezcla de aceites esenciales. Adicionalmente, se descubrió que el recubrimiento del pienso alimenticio para mascotas con bisulfato de sodio acidulante seco reduce efectivamente el crecimiento de Salmonella inoculada artificialmente al pienso tratado.

En la industria de alimentos para mascotas, la contaminación con Salmonella puede ocurrir cuando los ingredientes para la producción de alimentos para mascotas ya están contaminados al llegar a la instalación de fabricación de alimentos o después de que el alimento ha sido sometido al proceso de extrusión y luego se vuelve a contaminar por microbios presentes en el aire, las máquinas o el ambiente dentro de las instalaciones. Un método para abordar la cuestión de la contaminación con Salmonella consiste en usar una barrera secundaria a la contaminación microbiana formulada directamente en el producto alimenticio. Las barreras comúnmente usadas incluyen compuestos ácidos que reducen el pH para inhibir el crecimiento bacteriano, que incluyen el ácido fosfórico, el ácido clorhídrico u otros ácidos. Estas composiciones ácidas pueden impartir un sabor amargo al pienso, lo que afecta la palatabilidad. Otros métodos para abordar el problema incluyen el uso de ácidos orgánicos como el ácido fórmico, el ácido propiónico y el formiato de sodio como aditivos químicos. Los ácidos butírico, acético y láctico también se han usado como aditivos para piensos para reducir la contaminación microbiana.

Por tanto, existe la necesidad de aditivos que reduzcan y/o eliminen la contaminación con Salmonella en el alimento para animales.

Se ha descubierto de forma inesperada y sorprendente que el 3-hidroxi-3-metilbutirato (HMB) tanto en su forma de ácido libre (HMBFA o HMB-ácido) como en su forma de sal de calcio en polvo (CaHMB) tiene propiedades antimicrobianas cuando se usa en piensos y alimentos para animales.

El alfa-cetoisocaproato (KIC) es el primer metabolito principal y activo de la leucina. Un producto menor del metabolismo de KIC es el HMB, también conocido como p-hidroxi-p-metilbutirato. Se descubrió que e1HMB es útil dentro del contexto de una variedad de aplicaciones. Específicamente, en la patente de Estados Unidos núm. 5,360,613 (Nissen), e1HMB se describe como útil para reducir los niveles de colesterol total y colesterol de lipoproteínas de baja densidad en sangre. En la patente de Estados Unidos núm. 5,348,979 (Nissen y otros), el HMB se describe como útil para promover la retención de nitrógeno en humanos. La patente de Estados Unidos núm. 5,028,440 (Nissen) trata la utilidad de1HMB para aumentar el desarrollo de tejido magro en animales. También, en la patente de Estados Unidos núm. 4,992,470 (Nissen), e1HMB se describe como efectivo para potenciar la respuesta inmunitaria de los mamíferos. La patente de Estados Unidos núm.

6,031,000 (Nissen y otros) describe el uso del HMB y al menos un aminoácido para tratar el desgaste asociado a la enfermedad. Se ha descubierto que el HMB, combinado con glutamina y arginina, aumenta la acumulación de colágeno en las heridas y mejora la reparación de las heridas en la piel.

A partir de las observaciones de que la leucina tiene características ahorradoras de proteínas se origina el uso de HMB para suprimir la proteólisis. Para la síntesis de proteínas o la transaminación al a-cetoácido (a-cetoisocaproato, KIC) puede usarse el aminoácido esencial leucina. En una ruta, KIC se puede oxidar a HMB y esto representa aproximadamente el 5 % de la oxidación de la leucina. El HMB es superior a la leucina en cuanto a la mejora de la masa y la resistencia muscular. Los efectos óptimos del HMB se pueden lograr con 3,0 gramos por día cuando se administra como sal de calcio de HMB, o 0,038 g/kg de peso corporal por día, mientras que los de la leucina requieren más de 30,0 gramos por día.

El HMB, una vez producido o ingerido, parece tener dos destinos. El primer destino es la excreción simple en la orina. Después de la administración de HMB, las concentraciones de orina aumentan, lo que resulta en una pérdida de aproximadamente del 20-50 % de HMB en la orina. Otro destino se relaciona con la activación de HMB a HMB-CoA. Una vez convertido en HMB-CoA, puede ocurrir un mayor metabolismo, ya sea deshidratación de HMB-CoA a MC-CoA, o una conversión directa de HMB-CoA en HMG-CoA, que proporciona sustratos para la síntesis de colesterol intracelular. Varios estudios han demostrado que el HMB se incorpora a la ruta de síntesis del colesterol y podría ser una fuente de nuevas membranas celulares que se usan para la regeneración de las membranas celulares dañadas. Los estudios en humanos demuestran que el daño muscular después del ejercicio intenso, medido por la elevación de la CPK (creatina fosfoquinasa) plasmática, se reduce con la administración de suplementos de HMB dentro de las primeras 48 horas. El efecto protector de HMB dura hasta tres semanas con un uso diario continuo. Numerosos estudios han demostrado que una dosis efectiva de HMB es de 3,0 gramos por día como CaHMB (calcio HMB) (~38 mg/kg de peso corporal-día'1). Esta dosificación aumenta la masa muscular y el incremento de resistencia asociado con el entrenamiento de resistencia, mientras que minimiza el daño muscular asociado con el ejercicio vigoroso (34) (4, 23, 26). Se ha analizado la seguridad de1HMB, sin mostrar efectos secundarios en adultos jóvenes o ancianos sanos. También se ha demostrado que e1 HMB en combinación con L-arginina y L-glutamina es seguro cuando se complementa a pacientes con SIDA y cáncer.

Recientemente, se ha desarrollado una nueva forma de suministro de HMB, el ácido libre de HMB (HMBFA o HMB-ácido). Se ha demostrado que esta nueva forma de suministro se absorbe más rápido y tiene una mayor depuración tisular que el CaHMB. La nueva forma de suministro se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos con número de serie 20120053240.

Se ha descubierto de forma inesperada y sorprendente que el uso de HMB como aditivo para el alimento para animales reduce o elimina drásticamente la contaminación con Salmonella en el alimento.

La presente invención comprende el uso de HMB como aditivo para alimento para animales para reducir o eliminar la contaminación microbiana.

Resumen de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar el uso de HMB para prevenir, eliminar y/o reducir el crecimiento microbiano en el alimento para animales o el agua.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar el uso de HMB para prevenir, eliminar y/o reducir un contaminante microbiano de un producto alimenticio o una fuente de agua.

Estos y otros objetos de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica con referencia a la siguiente especificación, dibujos y reivindicaciones.

La presente invención pretende superar las dificultades encontradas hasta ahora.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1A-C es un gráfico que muestra los recuentos de Salmonella en el pienso recubierto.

Descripción detallada de la invención

Se ha descubierto de forma sorprendente e inesperada que el HMB reduce y/o elimina la contaminación con Salmonella en el alimento para animales. La presente invención comprende el uso de HMB para dar como resultado una reducción y/o eliminación de la contaminación microbiana en el alimento para animales. E1HMB también se puede añadir al alimento para animales para prevenir la contaminación con Salmonella.

El uso puede ser para reducir la contaminación microbiana en seres humanos y animales no humanos como ganado y animales de compañía como perros y gatos, así como también aves de corral. En la presente invención animal y sujeto se usan indistintamente.

En una modalidad, el HMB se aplica al alimento para animales como pienso o alimento para ganado o alimento para aves de corral como un aditivo para reducir o eliminar la contaminación con Salmonella.

"Alimento para animales" incluye cualquier producto alimenticio, que incluye productos alimenticios para seres humanos, que incluyen pero sin limitarse a los productos cárnicos; un alimento para animales destinado al ganado, como vacas, caballos o cerdos; un alimento destinado a aves de corral; y alimentos para mascotas o alimentos para animales de compañía destinados a cualquier animal de compañía, que incluye perros, gatos o caballos.

Los "alimentos para mascotas" incluyen piensos, golosinas o masticables (galletas, cuero crudo, orejas de cerdo, etc.).

Los "contaminantes microbianos" incluyen serotipos de Salmonella y otras bacterias gramnegativas como Escherichia, Hafnia, Kiebsiella, Pseudomonas, Shigella y Yersinia.

"Aditivo" incluye aditivos para alimentos que se añaden a la comida de cualquier forma, que incluye mezclados con el alimento o aplicados al alimento como recubrimiento o glaseado.

HMB

El ácido p-hidroxi-p-metilbutírico, o ácido p-hidroxi-isovalérico, se puede representar en su forma de ácido libre como (CH3)2(OH) CCH2C0 OH. El término "HMB" se refiere al compuesto que tiene la fórmula química anterior, tanto en sus formas de ácido libre como de sal, y los derivados de estos. Los derivados incluyen metabolitos, ésteres y lactonas. Aunque puede usarse cualquier forma de HMB dentro del contexto de la presente invención, preferentemente e1HMB se selecciona del grupo que comprende un ácido libre, una sal, un éster y una lactona. Los ésteres de HMB incluyen ésteres metílicos y etílicos. Las lactonas de HMB incluyen isovalaril lactona. Las sales de HMB incluyen sal de sodio, sal de potasio, sal de cromo, sal de calcio, sal de magnesio, sales de metales alcalinos y sales de metales terrestres.

Los métodos para producir el HMB y sus derivados son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, e1 HMB puede sintetizarse por oxidación de diacetona alcohol. Un procedimiento adecuado se describe por Coffman y otros, J. Am. Chem. Soc. 80: 2882-2887 (1958). Como se describe de esta manera en la presente descripción, el h Mb se sintetiza mediante una oxidación alcalina con hipoclorito sódico del alcohol de diacetona. El producto se recupera en forma de ácido libre, que puede convertirse en una sal. Por ejemplo, el HMB se puede preparar como su sal de calcio mediante un procedimiento similar al de Coffman y otros (1958) en el que el ácido libre de HMB se neutraliza con hidróxido de calcio y se recupera por cristalización en una solución acuosa de etanol. La sal de calcio de HMB está disponible comercialmente en Metabolic Technologies, Ames, lowa.

Forma de ácido libre de HMB

En la mayoría de los casos, se utilizó el HMB en forma de sal de calcio en estudios clínicos y se comercializó como ayuda ergogénica. Los avances recientes han permitido que el HMB se fabrique en forma de ácido libre para su uso como suplemento nutricional. Recientemente, se desarrolló una nueva forma de ácido libre de HMB, que se demostró que se absorbe más rápidamente que el CaHMB, lo que resulta en niveles máximos de HMB en suero más rápidos y más altos y una mejor depuración sérica de los tejidos (18).

El propio HMB puede estar presente en cualquier forma; por ejemplo, CaHMB es típicamente un polvo que se puede mezclar con el alimento como un aditivo o se puede aplicar como un recubrimiento en polvo, o se puede mezclar con líquido y rociarse o recubrirse de cualquier otra manera sobre el alimento para animales o mezclado como un líquido en el alimento para animales, mientras que el ácido HMB es típicamente un líquido o gel que también puede rociarse o recubrirse de cualquier otra manera sobre el alimento para animales o mezclarse con el alimento.

Además, el HMB puede usarse como aditivo en el agua de un animal para reducir la contaminación microbiana.

Ejemplos experimentales

Estos ejemplos experimentales no son limitantes. En los ejemplos se incluyó cualquier forma de HMB, que incluye CaHMB y HMBFA. Además, la invención no se limita a las concentraciones de HMB usadas en estos ejemplos; cantidades mayores y menores de HMB están dentro del alcance de la invención. Estos ejemplos aplican HMB como un recubrimiento, pero el HMB también se puede mezclar con el alimento o se puede añadir al agua de un animal.

Para todos los estudios descritos a continuación, se determinó que todos los piensos eran negativos para Salmonella antes de usarlos en el estudio mediante el uso del método FDA bAm (Manual de análisis bacteriológico de la FDA). Para todos los estudios se usó el mismo método para la preparación del inóculo de Salmonella, la inoculación de los piensos y el recuento a lo largo del tiempo. Todas las inoculaciones de Salmonella se realizaron por triplicado a los piensos recubiertos. Para la preparación del inóculo de Salmonella, un cultivo madre de Salmonella entérica subsp. entérica serovar Enteritidis (ATCC 13076) mantenido a -80 °C se transfirió a caldo de tripticasa de soja (TSB; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) y se incubó a 37 °C durante 48 h. Para preparar el cultivo para la inoculación en el pienso recubierto, el cultivo se centrifugó a 5000 RPM durante 10 minutos para sedimentar las células y se eliminó todo menos 3 ml del sobrenadante. Las células sedimentadas se resuspendieron en los 3 ml restantes de TSB y se transfirieron a un aplicador de rociado para su inoculación en el pienso. Se preparó un inóculo separado para cada nivel de inclusión de HMBFA y CaHMB y cada réplica. La inoculación del pienso recubierto se realizó mediante el rociado directo del inóculo preparado sobre el pienso. También se incluyó un control negativo para cada estudio que consistió en TSB estéril inoculado en el pienso sin recubrimiento. Después de la inoculación, el pienso se agitó para distribuir completamente el inóculo. El pienso inoculado se dejó equilibrar a temperatura ambiente durante 2 h antes del submuestreo para los recuentos del día 0. El pienso restante recubierto e inoculado se almacenó a temperatura ambiente para su recuento en los días 1, 2, 7 y 14 después de la inoculación.

El recuento de Salmonella se realizó mediante la extracción de una submuestra de 25 g de pienso recubierto e inoculado y homogeneización con agua de peptona tamponada (BPW; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) durante 15 s en un Stomacher (Seward Stomacher 400) para los estudios 1 y 2. Para el estudio 3, las submuestras de 25 g se agitaron vigorosamente en lugar de usar un stomacher. A continuación, el homogeneizado se diluyó en serie mediante el uso BPW y se extendió en placa sobre agar xilosa lisina desoxicolato (XLD; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) por duplicado y se incubó a 37 °C durante 24 h. Después de la incubación, las placas se contaron mediante el recuento de las colonias negras, típicas de Salmonella. El número de colonias observadas se multiplicó por el factor de dilución para determinar el recuento total en UFC/g de pienso. Los aislamientos representativos del día 0 se confirmaron como Salmonella Serovar Enteritidis mediante serotipificación para garantizar que los recuentos recuperados representaran el cultivo inoculado. Para los estudios 1 y 2, los aislamientos recolectados se enviaron para la serotipificación al Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios (NVSL, Ames, IA). Para el estudio 3, el Laboratorio Eurofins confirmó los aislados como Salmonella Serovar Enteritidis.

Para evaluar más a fondo la mitigación de la Salmonella las propiedades de HMBFA y CaHMB, las submuestras en el primer punto de tiempo de muestra que resultaron en la recuperación de cero Salmonella durante el recuento se enriquecieron durante la noche para permitir la recuperación de células de Salmonella. A continuación, las muestras enriquecidas se extendieron en placas de XLD, se incubaron a 37 °C durante 24 h y el crecimiento de colonias negras típicas de Salmonella se anotó (resultado de presencia/ausencia, no cuantitativo).

Análisis estadístico. Los resultados se calcularon como UFC/g de pienso y se convirtieron a valores de log-10 para el análisis estadístico. Se usó el procedimiento GLIMMIX en SAS (SAS 9.4, Cary, NC) con la concentración de tratamiento como efecto fijo y el día de recuento como medida repetida. Todos los datos se presentan como la media de las tres repeticiones más/menos el error estándar de la media (SEM). La significación estadística se determinó para P <0,05.

Estudio 1

Resumen del protocolo

El pienso alimenticio para mascotas se recubrió con HMB líquido (forma de ácido libre) a 3 concentraciones diferentes, 0, 0,9 y 1,5 %. Una solución madre de Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (ATCC 13076) se preparó e inoculó sobre el pienso previamente recubierto. Las muestras inoculadas se contaron para determinar el nivel de Salmonella restante en el producto los días 0, 1, 2, 7 y 14 después de la inoculación. Los recuentos de Salmonella del tratamiento y el control positivo se compararon para determinar la eficacia de1HMB para reducir la Salmonella en el pienso.

Materiales y Métodos

Recubrimiento del pienso

Los piensos previamente fabricados en la Universidad Estatal de Kansas se recubrieron con HMB mediante el uso de un mezclador a escala de laboratorio. Se aplicó HMB a los piensos as a niveles de inclusión de 0 %, 0,9 % y 1,5 % (p:p). Para la aplicación, el peso designado de HMB se diluyó con agua destilada estéril hasta un volumen total de 20 ml para los tratamientos al 0,9 y 1,5 %. Para el % de tratamiento (control positivo) los piensos se recubrieron con un total de 20 ml de agua destilada estéril. Una vez terminada la aplicación del líquido, los piensos se mezclaron durante cinco minutos adicionales para garantizar una distribución uniforme de HMBFA. A continuación, los piensos recubiertos se dejaron secar en bandejas durante al menos dos horas, se colocaron en contenedores de plástico y se almacenaron a temperatura ambiente. Al día siguiente del recubrimiento del pienso se realizó la inoculación de Salmonella al pienso recubierto. Se recolectaron submuestras de piensos recubiertos y se enviaron a MTI para su análisis para verificar el nivel de inclusión de HMB.

Exposición del organismo y preparación de la solución madre

La Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (ATCC 13076) se transfirió del cultivo madre mantenido a -80 °C a caldo de tripticasa de soja (TSB; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) y se incubó a 37 °C durante 48 horas. Para preparar el cultivo para la inoculación en el pienso recubierto, el cultivo se centrifugó a 5000 RPM durante 10 minutos para sedimentar las células y el sobrenadante se eliminó hasta un volumen restante de 3 ml. Las células sedimentadas se resuspendieron en el TSB restante y se transfirió a un aparato de aplicación por rociado para su inoculación. Se preparó un inóculo separado para cada nivel de inclusión de HMB y se replicó.

Inoculación y almacenamiento de muestras.

Para cada nivel de inclusión de HMB (0, 0,9 y 1,5 %), los piensos se inocularon con el inóculo de Salmonella preparado (descrito anteriormente). También se incluyó un control negativo que se recubrió con agua destilada estéril pero que no se inoculó con Salmonella. Los piensos recubiertos se inocularon con el inóculo preparado mediante rociado directo sobre las croquetas. Después de la inoculación, el pienso se agitó para distribuir completamente el inóculo. Los piensos inoculados se dejaron equilibrar a temperatura ambiente durante 2 horas antes del submuestreo para los recuentos del día 0. Todos los piensos recubiertos e inoculados restantes se almacenaron a temperatura ambiente para su recuento en los días 1, 2, 7 y 14 después de la inoculación.

Siembra y recuento de muestras

De las muestras recubiertas e inoculadas, se recolectaron submuestras de 25 g luego del número de días de almacenamiento designado. La submuestra de 25 g se mezcló con 225 ml de agua peptona tamponada (BPW; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) y se procesaron en stomacher durante 15 segundos para homogeneizar. El homogeneizado se diluyó en serie mediante el uso de BPW y se extendió en placa por duplicado sobre agar xilosa lisina desoxicolato (XLD; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). Todas las placas de XLD inoculadas se incubaron a 37 °C durante 24 horas.

Después de la incubación, las placas se contaron mediante el recuento de las colonias negras, típicas de Salmonella. El número de colonias observadas se multiplicó por el factor de dilución para determinar el recuento total en UFC/g. Los aislamientos representativos del día 0 se confirmaron como Salmonella mediante serotipificación para garantizar que los recuentos recuperados representen el cultivo inoculado. También se registraron los recuentos de los controles positivos y negativoso Además, en la primera fecha de muestra en la que se recuperaron los recuentos de cero, las submuestras se enriquecieron durante la noche para permitir la recuperación de la Salmonella dañada. Las muestras enriquecidas se extendieron en placas de XLD, se incubaron a 37 °C durante 24 horas y el crecimiento de colonias negras típicas de Salmonella se anotó (resultado de presencia/ausencia, no cuantitativo).

Resultados

Como se describió anteriormente en base a las colonias contadas para cada tratamiento en cada fecha de recuento, se calcularon las UFC/g. Para el análisis estadístico (SAS 9.4), las UFC/g se convirtieron en log-10 de UFC/g. Se promediaron los recuentos de Salmonella de las réplicas para cada tratamiento en cada fecha de recuento, que se muestra en la Tabla 1. Estos resultados se visualizan en la Figura 1Ao Para ambos tratamientos con piensos de h Mb , los recuentos del día 1 estuvieron por debajo del límite de detección de 100 UFC/g. Para el recuento de los días 2, 7 y 14, ambos piensos tratados con HMB estuvieron por debajo del límite de detección de 10 UFC/g.

Tabta SI Niveles de Salmonella ¡isg io UFCVg) en pienso recubierto con

0 (control posilivo). 0,9 o 1,5 % de ácido 0-liidroxi -p-melilbulíneo descrito anteriormente

(HJVtBFA) en el Estudio 1«.

Para el análisis

estadístico

Valer de P (SAS 9.4), las

Tratamiento Día 0 Día 1 Día 2 Día 7 Día 14 frente al UFC/g se

Control convirtieron a

logip UFC/g. los

recuentos de

0 % (control 6.39* 4 ^, 60 ^± 3 , 39 i 2,$0t 3.14 ±

positivo) 0.03 0,07 0.10 0,13 Ü . K Salmonella se

promediaron en

todas las

réplicas para

10 cada

tratamiento en

cada recuento.

Tabla 2. Principales efectos e interacción de factores para evaluar la reducción de Salmonella en el pienso recubierto con HMB

En base a los resultados del recuento en los días 1, 2, 7 y 14, la submuestra se retuvo y se enriqueció para permitir la recuperación de las células dañadas. Las muestras enriquecidas se extendieron en placas de XLD. Los recuentos de colonias enriquecidas se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3. Resultados de muestras enriquecidas de los días 1,2, 7 y 14.

Para el pienso tratado con 0,9 y 1,5 % de HMB las muestras enriquecidas fueron positivas para el crecimiento de Salmonella en los días 1 y 2, pero negativas en los días 7 y 14. El pienso tratado con 0 % de HMB (control positivo) fue positivo después del enriquecimiento en todos los días.

Conclusión

En base a estos resultados, el recubrimiento de piensos con 0,9 y 1,5 % de HMB fue efectivo para reducir la Salmonella inoculada artificialmente al pienso. Además, el HMB fue capaz de mantener el nivel reducido de Salmonella durante el período de prueba de 14 días. El aumento del nivel de inclusión de HMB no aumentó drásticamente la reducción observada de Salmonella durante el período de 14 días.

Estudio 2

Recubrimiento del pienso

Para el estudio 2, se recolectaron piensos (todas las etapas de la vida) de un fabricante de alimentos para mascotas comerciales antes de la etapa de recubrimiento con grasa. Nuevamente, el pienso se recubrión con HMB líquido como se describió en el estudio 1, pero a niveles de inclusión de 0, 0,1, 0,3 y 0,5 % (p:p), seguido de secado durante 2 horas y almacenamiento en contenedores de plástico a temperatura ambiente. La inoculación del pienso recubierto con Salmonella se realizó de nuevo al día siguiente como se describió en el Estudio 1.

Resultados

Para el estudio 2, los resultados del recuento promedio de Salmonella se muestran en la Tabla 4 y en la Figura 1B.

Tabla 4. Niveles de Salmonella (logio UFC/g) en el pienso recubierto con 0 (control positivo), 0,1, 0,3 o 0,5 % de ácido phidroxi-p-metilbutírico HMBFA en el Estudio 2.a

Los recuentos de Salmonella en el Día 0 fueron 5,84 ± 0,05, 5,61 ± 0,19, 5,62 ± 0,06 y 5,60 ± 0,26 logi0 UFC/g para los niveles de tratamiento de 0 (control positivo), 0,1, 0,3 y 0,5 % de HMBFA, respectivamente. Los recuentos de Salmonella estuvieron por debajo del límite de detección (<10 UFC/g) para el tratamiento con 0,5 % de HMBFA en los días 2, 7 y 14 y el día 14 en todos los tratamientos. Para el día 14, las réplicas de control positivo promediaron 1,00 ± 0,51 log10 UFC/g, una disminución de aproximadamente 5 logaritmos durante el período de estudio. Todas las submuestras enriquecidas de los niveles de tratamiento con HMBFA por debajo del límite de detección en los días de recuento 2, 7 y 14 fueron positivas para el crecimiento de Salmonella. Nuevamente, todos los aislamientos recolectados de los recuentos se confirmaron como Salmonella serovar Enteritidis mediante serotipificación.

Estudio 3

Recubrimiento del pienso

Para el estudio 3, el pienso fabricado comercialmente se usó nuevamente y se recubrió con CaHMB, la forma en polvo de HMB, a niveles de inclusión de 0, 0,1, 0,3, 0,5, 0,9 y 1,5 % (p:p). En resumen, el pienso se mezcló en un mezclador de laboratorio con el polvo de CaHMB hasta que el polvo se adhirió al pienso. Después del recubrimiento con CaHMB, el pienso recubierto se almacenó en contenedores de plástico a temperatura ambiente. La inoculación con Salmonella del pienso recubierto se realizó al día siguiente, que sirvió como día 0.

En el estudio 3, se usó CaHMB para recubrir el pienso y los resultados del recuento promedio de Salmonella se muestran en la Tabla 5 y la Figura 1C.

Tabla 5. Niveles de Salmonella (log10 UFC/g) en el pienso recubierto con 0 (control positivo), 0,1, 0,3, 0,5, 0,9 o 1,5 % de p-hidroxi-p-metilbutirato de calcio (CaHMB) en el Estudio 3.a

Los recuentos de Salmonella en el Día 0 fueron 7,25 ± 0,05, 7,19 ± 0,04, 7,17 ± 0,07, 7,09 ± 0,04, 7,08 ± 0,12 y 7,04 ± 0,13 log10 UFC/g para niveles de tratamiento de 0 (control), 0,1, 0,3, 0,5, 0,9 y 1,5 % de CaHMB, respectivamente. Los recuentos del día 7 mostraron que el pienso recubierto con 0,5, 0,9 y 1,5 % de CaHMB tenía recuentos por debajo del límite de detección, y para el día 14 todos los piensos tratados con CaHMB tenían recuentos por debajo del límite de detección (<10 UFC/g). Para el día 14, las réplicas del control positivo promediaron 3,08 ± 0,18 log10 UFC/g, una disminución de aproximadamente 4 logaritmos durante el período de estudio. Todas las submuestras enriquecidas, los días 7 y 14 para el 0,5, 0,9 y 1,5 % y el día 14 para los piensos tratados con 0,1 y 0,3 % de CaHMB no mostraron crecimiento de Salmonella. Nuevamente, todos los aislamientos recolectados de los recuentos se confirmaron como Salmonella serovar Enteritidis mediante serotipificación.

En cada uno de los tres estudios también se procesaron y analizaron controles negativos (no inoculados). No se detectó Salmonella en los controles negativos durante cualquiera de los estudios realizados (datos no mostrados).

Discusión de los Estudios 1-3

Estos estudios se realizaron para probar la efectividad del HMB como recubrimiento antimicrobiano de piensos mediante el uso de un modelo de contaminación posterior al procesamiento con Salmonella. Recientemente, e1HMB ha estado disponible en forma de ácido libre líquido, que tiene características ácidas similares a las de otros ácidos orgánicos pequeños que previamente demostraron ser efectivos para reducir Salmonella en el modelo utilizado en estos estudios. El primer estudio realizado con HMBFA a niveles de 0,9 y 1,5 % (p:p) recubierto en los piensos eliminó la Salmonella inoculada en el pienso dentro de las 24 horas. El segundo estudio se llevó a cabo para determinar una tasa de recubrimiento mínimamente aceptable con actividad contra Salmonella. Se determinó que un nivel de recubrimiento tan bajo como alrededor de 0,1 % (p:p) fue efectivo para eliminar el inóculo de Salmonella para el día 14 del estudio. Dado que en algunos sistemas de fabricación se prefieren los recubrimientos secos en polvo, se realizó un tercer estudio para probar la eficacia del HMB en forma de polvo, CaHMB. La forma en polvo también fue muy efectiva para atenuar la Salmonella donde los niveles inferiores eliminaron la Salmonella después de 14 días, mientras que los niveles más altos eliminaron la Salmonella durante la primera semana después de la inoculación.

Cuando se comparó la efectividad de los tratamientos con HMB con otros tratamientos posteriores al procesamiento aplicados a alimentos y piensos para animales, el HMB en forma de ácido libre supera con creces la efectividad de otros ácidos orgánicos. El CaHMB también fue tan efectivo como los otros ácidos orgánicos estudiados en los alimentos, y en niveles más bajos en el modelo de recubrimiento superficial e inoculación usado en los estudios actuales.

Si bien estos estudios examinaron la efectividad de CaHMB y HMBFA en el uso como recubrimiento de superficie antimicrobiano, la presente invención también abarca el uso de HMB como antimicrobiano cuando se mezcla con el alimento.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Uso de p-hidroxi-p-metilbutirato (HMB) para prevenir, eliminar y/o reducir el crecimiento microbiano en el alimento para animales o el agua.

2. Uso de p-hidroxi-p-metilbutirato (HMB) para prevenir, eliminar y/o reducir una contaminación microbiana de un producto alimenticio o una fuente de agua.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde e1HMB se selecciona del grupo que consiste en su forma de ácido libre, su sal, su éster y su lactona.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha sal se selecciona del grupo que consiste en una sal de sodio, una sal de potasio, una sal de magnesio, una sal de cromo y una sal de calcio.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el alimento para animales es alimento para mascotas, alimento para ganado o alimento para aves de corral.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el producto alimenticio es alimento para animales domésticos, alimento para ganado o alimento para aves de corral.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el HMB se recubre sobre el producto alimenticio.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el HMB se mezcla con el producto alimenticio o la fuente de agua.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el contaminante microbiano es Salmonella