WO2012093704A1 - 抗体の物性を改善させる方法 - Google Patents

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WO2012093704A1
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polypeptide
extracellular matrix
antibody
binding activity
physical properties
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智之 井川
由紀子 西田
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中外製薬株式会社
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    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Definitions

  • a polypeptide When a polypeptide is administered as a drug, its pharmacokinetics such as plasma kinetics vary depending on the physical properties of the polypeptide. Degradation in plasma (degradation of peptide chain site and degradation of sugar chain site), solubility, antigenicity, metabolism in the liver, plasma proteins (such as albumin) as physical properties that determine the pharmacokinetics of polypeptides
  • this is not a limitation.
  • Patent Document 1 Investigating using multiple antibody molecules has revealed that the rate of protease degradation in vitro and the blood half-life in vivo are correlated.
  • Patent Document 1 There are multiple factors that determine the disposition of a polypeptide in addition to protease resistance, and the influence of various factors on the disposition of a polypeptide varies depending on the type and characteristics of the polypeptide. It is important to examine in detail the correlation between different in vitro parameters and pharmacokinetics.
  • Non-patent Document 1 Studies have been made on the blood concentration when VEGF-Trap molecule, which is a fusion protein of VEGF receptor and Fc, is administered subcutaneously.
  • VEGF-Trap molecules with high isoelectric points have low bioavailability due to low plasma concentrations when administered subcutaneously.
  • a modified VEGF-Trap molecule having a lower isoelectric point by amino acid modification has a higher plasma concentration and improved bioavailability.
  • the bioavailability of the VEGF-Trap molecule administered subcutaneously depends on the cell at the subcutaneous site. It has become clear that it depends on the bond strength to the outer matrix.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and the object thereof is a method for improving the physical properties of a polypeptide, particularly a method for improving the plasma kinetics of a polypeptide, a method for reducing immunogenicity, or solubility. It is to provide a method for improving the above.
  • the present inventors have conducted intensive research on methods for improving the physical properties of polypeptides.
  • the present inventors modified the physical properties of the polypeptide, particularly plasma kinetics, immunogenicity, by modifying at least one amino acid residue of the polypeptide so that the binding activity to the extracellular matrix is reduced. And found that the solubility can be improved.
  • the present invention relates to a method for improving the physical properties of a polypeptide, particularly a method for improving plasma kinetics or a method for reducing immunogenicity when a polypeptide is administered as a drug, or a case where a polypeptide is used as a solution formulation. More specifically, a method for improving the solubility, a method for producing these polypeptides, a polypeptide produced by the production method, a method for evaluating the physical properties of the polypeptide, and the like.
  • [1] A method for improving the physical properties of a polypeptide by reducing the binding activity to the extracellular matrix
  • the method according to [1], wherein the improvement of physical properties is at least one selected from improvement of plasma kinetics, reduction of immunogenicity, and improvement of solubility [3] The method according to [1] or [2], wherein reducing the binding activity to the extracellular matrix reduces binding to the extracellular matrix by modifying at least one amino acid residue of the polypeptide, [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the binding activity to the extracellular matrix is measured by an electrochemiluminescence method, [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the polypeptide is a polypeptide having antigen-binding activity.
  • a method for producing a polypeptide with improved physical properties comprising a step of modifying at least one amino acid residue of the polypeptide so that the binding activity to the extracellular matrix is reduced
  • a method for producing a polypeptide having improved physical properties comprising: (a) modifying at least one amino acid residue of the polypeptide; (b) measuring the binding activity of the polypeptide modified in step (a) to the extracellular matrix; and (c) selecting a polypeptide having a reduced binding activity to the extracellular matrix as compared to that before modification; Manufacturing method including [9] Furthermore, (d) obtaining a gene encoding the polypeptide selected in step (c) of [8], and (e) a step of producing a polypeptide using the gene obtained in the step (d), The production method according to [8], [10] Furthermore, (f) modifying at least one amino acid residue of the polypeptide obtained
  • a polypeptide produced by the production method according to any one of [7] to [15], [17] A method for screening a polypeptide having physical properties superior to that of a reference polypeptide, using a polypeptide whose physical properties are known in advance as a reference polypeptide, (a) contacting the reference polypeptide and the test polypeptide or test polypeptide library with an extracellular matrix; (b) measuring the binding activity to the extracellular matrix of the polypeptide contacted in the step (a), and (c) selecting a polypeptide having a lower binding activity to the extracellular matrix than the reference polypeptide from the polypeptides measured in the step (b), Including, method, [18] The screening method according to [17], wherein the improvement in physical properties is at least one selected from improvement in plasma kinetics, reduction in immunogenicity, and improvement in solubility, [19] The screening method according to [17] or [18], wherein the binding activity to the extracellular matrix is measured by an electrochemiluminescence method, [20]
  • the physical properties of the test polypeptide are determined. How to evaluate, [23] The method according to [22], wherein the physical property is at least one selected from plasma kinetics, immunogenicity, and solubility of the polypeptide, [24] The method according to [22] or [23], wherein the measurement of the binding activity to the extracellular matrix is measurement by an electrochemiluminescence method, About.
  • the present invention provides a method for improving the physical properties of a polypeptide or a method for producing a polypeptide with improved physical properties by reducing the binding of a polypeptide having a certain target function to an extracellular matrix.
  • improvement of physical properties of the polypeptide can improve plasma kinetics, reduce immunogenicity, or improve solubility, and can provide a polypeptide suitable for use as a pharmaceutical product. It is also possible to evaluate the physical properties of the test polypeptide by comparing the binding activity of the polypeptide whose physical properties are known in advance to the extracellular matrix and the binding activity of the test polypeptide to the extracellular matrix. .
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between extracellular matrix binding of an antibody (MabA1 to A3) and half-life (d) when it is administered to normal mice. It is the figure which measured the extracellular-matrix coupling
  • FIG. 3 is a graph showing the results (intravenous administration) of the antibody (MabB1 to B3) plasma dynamics in normal mice evaluated by the method shown in Example 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the results (subcutaneous administration) of antibody (MabB1-B3) plasma kinetics in normal mice evaluated by the method described in Example 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between binding of an antibody (MabC7 to MabC9) to the extracellular matrix and half-life (d) when it is administered to a human FcRn transgenic mouse.
  • FIG. 3 is a graph showing extracellular matrix binding of an antibody (MabC1 to MabC6) polypeptide and a T-cell assay reaction rate. It is a figure which shows the relationship between the administration days at the time of administering an antibody (MabB2 and MabB3) and anti-antibody appearance.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between binding of an antibody (MabC7 to MabC9) to the extracellular matrix and half-life (d) when it is administered to a human FcRn transgenic mouse.
  • FIG. 3 is a graph showing extracellular matrix binding of an antibody (MabC1 to MabC6) polypeptide and a T-cell assay reaction rate. It is a figure which shows the relationship between the administration days at the time of administering an antibody
  • 3 is a graph showing the relationship between the binding of antibodies (MabD1 to MabD30) to the extracellular matrix and solubility. It is a figure which shows the extracellular matrix coupling
  • the present invention provides a method for improving the physical properties of a polypeptide. More specifically, a method for improving the physical properties of the polypeptide by reducing the binding activity of the polypeptide to the extracellular matrix is provided. In particular, a method for improving plasma kinetics when a polypeptide is administered in vivo, a method for reducing immunogenicity, or a method for improving solubility when a polypeptide is used as a solution preparation are provided.
  • the present invention provides a method for evaluating the physical properties of the test polypeptide by comparing the binding activity of the polypeptide whose physical properties are known in advance to the extracellular matrix and the binding activity of the test polypeptide to the extracellular matrix.
  • polypeptide that is the subject of the present invention is not particularly limited, but preferably has a specific function when administered into a living body, and is particularly preferably a polypeptide having an effect as a pharmaceutical product.
  • polypeptides include antibodies, hormones, cytokines and the like.
  • An example of a polypeptide having the antigen-binding activity of the present invention is an antibody.
  • a preferred example of the antibody of the present invention is an IgG antibody.
  • an IgG antibody is used as an antibody, the type thereof is not limited, and it is possible to use IgG of an isotype (subclass) such as IgG1, IgG2, IgG3, IgG4.
  • the polypeptide of the present invention may contain an antibody constant region, and amino acid mutations may be introduced into the constant region.
  • the antibody may be an antibody derived from any animal such as a mouse antibody, a human antibody, a rat antibody, a rabbit antibody, a goat antibody, or a camel antibody.
  • a chimeric antibody particularly a modified antibody with a substituted amino acid sequence such as a humanized antibody may be used.
  • it may be a bispecific antibody, a modified antibody obtained by binding various molecules, a polypeptide containing an antibody fragment, and the like.
  • a “chimeric antibody” is an antibody produced by combining sequences derived from different animals. Specific examples of the chimeric antibody include an antibody consisting of a mouse antibody heavy chain and light chain variable (V) region and a human antibody heavy chain and light chain constant (C) region.
  • V mouse antibody heavy chain and light chain variable
  • C human antibody heavy chain and light chain constant
  • Humanized antibody refers to an antibody derived from a mammal other than a human, also referred to as a reshaped human antibody, such as a complementarity determination region (CDR) of a mouse antibody to the CDR of a human antibody. It is transplanted.
  • CDR complementarity determination region
  • Methods for identifying CDRs are known (Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md .; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877) .
  • general gene recombination techniques are also known (see European Patent Application Publication No. EP-125023 and WO96 / 02576).
  • the C region of these antibodies is preferably derived from a human antibody.
  • C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, C ⁇ 4, etc. can be used for the H chain
  • C ⁇ , C ⁇ , etc. can be used for the L chain.
  • amino acid mutations may be introduced into the human antibody C region as necessary in order to improve antibody stability or antibody production.
  • the chimeric antibody in the present invention preferably comprises a variable region of a non-human mammal-derived antibody and a constant region derived from a human antibody.
  • humanized antibodies are preferably composed of CDRs of antibodies derived from mammals other than humans, and FR and C regions derived from human antibodies.
  • the constant region derived from a human antibody preferably contains a human FcRn binding region, and examples of such an antibody include IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4).
  • the constant region used for the humanized antibody in the present invention may be a constant region of an antibody belonging to any isotype.
  • a constant region derived from human IgG1 is used, but is not limited thereto.
  • the FR derived from a human antibody used for a humanized antibody is not particularly limited, and may be an antibody belonging to any isotype.
  • variable region and constant region of the chimeric antibody and humanized antibody in the present invention may be modified by deletion, substitution, insertion and / or addition as long as they show the binding specificity of the original antibody.
  • Bispecific antibody refers to an antibody having variable regions that recognize different epitopes in the same antibody molecule.
  • the bispecific antibody may be an antibody that recognizes two or more different antigens, or may be an antibody that recognizes two or more different epitopes on the same antigen.
  • polypeptides containing antibody fragments include Fab fragments, F (ab ′) 2 fragments, scFv (Nat Biotechnol. 2005 Sep; 23 (9): 1126-36.) Domain antibody (dAb) (WO2004 / 058821, WO2003 / 002609), scFv-Fc (WO2005 / 037989), dAb-Fc, Fc fusion polypeptide and the like.
  • Molecules containing the Fc region can use the Fc region as a human FcRn binding domain. These molecules may be fused with a human FcRn binding domain.
  • the polypeptide in the present invention may be an antibody-like molecule.
  • Antibody-like molecules are molecules that exert their functions by binding to target molecules (Current Opinion in Biotechnology 2006, 17: 653-658, Current Opinion in Biotechnology 2007, 18: 1-10, Current Opinion in Structural Biology 1997, 7: 463-469, Protein Science 2006, 15: 14-27), for example, DARPins (WO2002 / 020565), Affibody (WO1995 / 001937), Avimer (WO2004 / 044011, WO2005 / 040229), Adnectin (WO2002 / 032925) and the like. Even these antibody-like molecules can improve the physical properties of the antibody molecule by reducing the binding activity to the extracellular matrix.
  • the “physical properties” of a polypeptide means plasma kinetics and immunogenicity when the polypeptide is administered in vivo, or solubility when the polypeptide is used as a solution preparation.
  • “improves physical properties” is only required to improve any of these physical properties, and is particularly important when a polypeptide is used as a pharmaceutical product. Plasma kinetics, immunogenicity, and solubility are important. It is preferable that any one of these is improved.
  • the method for measuring “binding to the extracellular matrix” is not particularly limited, but the polypeptide is added to a plate on which the extracellular matrix is immobilized, and a labeled antibody against the polypeptide is added, thereby adding a polypeptide. It can be measured by an ELISA system that detects the binding of peptide and extracellular matrix.
  • a measurement method using an electrochemiluminescence method (ECL (Electrochemiluminescence)) is preferable because it is possible to detect extracellular matrix binding ability with higher sensitivity.
  • a mixture of a polypeptide and a ruthenium antibody is added to a plate on which an extracellular matrix is immobilized, and the binding between the polypeptide and the extracellular matrix is measured by an ECL system that measures the electrochemiluminescence of ruthenium.
  • the addition concentration of the polypeptide can be arbitrarily set, and the addition concentration is preferably higher in order to increase the detection sensitivity for binding to the extracellular matrix.
  • the extracellular matrix used in the present invention may be animal-derived or plant-derived as long as it contains glycoproteins such as collagen, proteoglycan, fibronectin, laminin, entactin, fibrin, perlecan, etc.
  • an extracellular matrix derived from an animal such as human, mouse, rat, monkey, rabbit, or dog can be used.
  • human-derived natural extracellular matrix is preferred for monitoring the improvement in plasma kinetics in humans.
  • a neutral range around pH 7.4, which is a physiological condition is desirable, but it is not necessarily a neutral range, and an acidic range (pH 6.0). It may be evaluated in the vicinity).
  • the binding of the polypeptide-antigen molecule complex to the extracellular matrix can also be evaluated by coexisting the antigen molecule to which the polypeptide binds. Good.
  • “improving plasma kinetics” means “improving plasma pharmacokinetics”, “improving plasma retention”, “excellent plasma retention”, “prolonging plasma retention”. In other words, these terms are used interchangeably.
  • “improving plasma kinetics” means that the polypeptide of the present invention is administered to animals such as humans, mice, rats, monkeys, rabbits, dogs and the like until it disappears from plasma (for example, intracellularly). This means that the time until the polypeptide of the present invention becomes impossible to return to plasma due to degradation in the reaction time becomes longer.
  • “improving plasma dynamics” means any parameter such as an increase in plasma half-life, an increase in mean plasma residence time, or a decrease in plasma clearance (understanding by pharmacokinetic exercises (Nanzan-do)) It is possible to confirm the improvement of plasma kinetics by measuring.
  • the plasma concentration of the polypeptide is measured, each parameter is calculated, and the plasma half-life is increased.
  • the average plasma residence time is increased, it can be said that the plasma kinetics of the polypeptide has improved.
  • These parameters can be measured by methods known to those skilled in the art, and can be appropriately evaluated by, for example, noncompartmental analysis using the pharmacokinetic analysis software WinNonlin (Pharsight) according to the attached procedure manual.
  • plasma dynamics in humans be improved. If it is difficult to measure plasma dynamics in humans, use mice (eg, normal mice, human antigen-expressing transgenic mice, human FcRn-expressing transgenic mice, etc.) and monkeys (eg, cynomolgus monkeys).
  • mice eg, normal mice, human antigen-expressing transgenic mice, human FcRn-expressing transgenic mice, etc.
  • monkeys eg, cynomolgus monkeys.
  • the plasma kinetics in humans can be predicted based on the plasma kinetics of.
  • “reduction of immunogenicity” means that cell proliferation and production of inflammatory cytokines are suppressed when the polypeptide of the present invention is added to immune cells in vitro, or in vivo. It means a reduction in the appearance frequency and strength of an antibody against the polypeptide when administered.
  • cell growth when a polypeptide is added to PBMC in vitro is a newly synthesized DNA in a cell in which BrdU (bromodeoxyuridine), a blue colored substrate, is actively proliferating. Can be measured by a spectrophotometer (Baker MP, Carr FJ.Curr Drug Saf. 2010, 5 (4): 308-13.).
  • antibodies that appear when a polypeptide is administered in vivo in vivo are detected by methods known to those skilled in the art, such as a Sandwich-ELISA using a polypeptide or an ELISA system using a plate on which the polypeptide is immobilized. Can be measured. Cytokine production can be measured by a method using Sandwich ELISA using an antibody against the cytokine. More specifically, immunogenicity can be measured according to the method as described in Example 4.
  • “improving solubility” means solubility in a buffer in the presence of polyethylene glycol (PEG) (Guiotto, A. et al. (2004) Bioorg. Med. Chem. 12, 5031-5037), and This means that the measured solubility in the buffer is increased.
  • PEG polyethylene glycol
  • the type of buffer for measuring the solubility can be arbitrarily selected. Specifically, for example, the solubility can be measured according to the method as described in Example 6.
  • the amino acid residue modification that reduces the binding of the polypeptide of the present invention to the extracellular matrix is not particularly limited, but in the present invention, the amino acid on the surface of the polypeptide having antigen-binding activity is modified. It is preferable to do.
  • the binding to the extracellular matrix is reduced by modifying at least one amino acid residue of the polypeptide. At that time, it is preferable to consider so as to reduce the influence of the modification on other activities of the polypeptide.
  • the polypeptide of the present invention is an antibody
  • the binding to the extracellular matrix mainly involves residues exposed on the surface of the antibody variable region
  • the surface of the antibody It is preferable to modify the amino acid of the variable region exposed to.
  • the variable region amino acids exposed on the surface of the antibody can be found by methods known to those skilled in the art using an antibody homology model.
  • the modification of amino acid residues can be performed by modifying one or more bases in DNA encoding a polypeptide and expressing the DNA in a host cell as described below.
  • a person skilled in the art can easily determine the number, position, and type of bases to be modified according to the type of amino acid residue after modification.
  • alteration means any one of substitution, deletion, addition, insertion, or a combination thereof.
  • base modification refers to genetic manipulation or mutation that inserts, deletes, or substitutes at least one base in DNA so that the polypeptide encoded by DNA has the target amino acid residue. It means to process. That is, conversion of a codon encoding the original amino acid residue into a codon encoding the target amino acid residue is included.
  • base modification can be carried out by site-directed mutation (for example, see Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488), PCR mutagenesis, cassette mutation, and the like .
  • antibody variants with improved biological properties are 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more (e.g.
  • sequence homology and / or similarity is homologous to the original antibody residues after aligning the sequences and introducing gaps as necessary to maximize sequence homology. Defined as the percentage of amino acid residues that are (same residues) or similar (amino acid residues that are grouped in the same group based on the properties of the side chains of common amino acids).
  • Natural amino acid residues are usually based on their side chain properties (1) hydrophobicity: alanine, isoleucine, valine, methionine and leucine; (2) neutral hydrophilicity: asparagine, glutamine, cysteine, threonine and serine. (3) acidity: aspartic acid and glutamic acid; (4) basicity: arginine, histidine and lysine; (5) residues affecting chain orientation: glycine and proline; and (6) aromaticity: tyrosine, tryptophan. And phenylalanine group.
  • the DNA encoding the polypeptide thus modified is cloned (inserted) into an appropriate vector and introduced into a host cell.
  • the vector is not particularly limited as long as it can stably hold a nucleic acid such as inserted DNA.
  • Escherichia coli is used as a host, a cloning vector may be mentioned.
  • the cloning vector is preferably a pBluescript vector (Stratagene), but various commercially available vectors can be used.
  • an expression vector is particularly useful.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses a polypeptide in a test tube, E. coli, cultured cells, or an individual organism.
  • pBEST vector Promega
  • pET vector Invitrogen
  • pME18S-FL3 vector GenBank ⁇ Accession No. AB009864
  • the pME18S vector is preferred.
  • DNA can be inserted into a vector by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site (Current (protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11.4-11.11).
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells can be used depending on the purpose.
  • Examples of cells for expressing the polypeptide include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus), insect cells (eg, Drosophila S2). Spodoptera SF9), animal cells (eg, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, BowesB melanoma cells) and plant cells.
  • Vector introduction into host cells can be performed by, for example, calcium phosphate precipitation method, electric pulse perforation method (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & SSons.Section 9.1-9.9), lipofection method, micro It can be performed by a known method such as an injection method.
  • an appropriate secretion signal can be incorporated into the polypeptide of interest.
  • These signals may be endogenous to the polypeptide of interest or may be heterologous signals.
  • the expression product is recovered when the polypeptide is secreted into the medium. If the polypeptide is produced intracellularly, the cell is first lysed and then the polypeptide is recovered.
  • ammonium sulfate or ethanol precipitation acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography
  • Known methods including graphy and lectin chromatography can be used.
  • the polypeptide with improved physical properties of the present invention defines a polypeptide as a standard for physical properties, and a polypeptide having an extracellular matrix binding ability lower than the ability of the polypeptide to bind to the extracellular matrix is present in advance.
  • the amino acid modification can be performed according to the above description.
  • the method for evaluating improvement in physical properties can be carried out in accordance with the method described in the examples.
  • the present invention provides a method for producing a polypeptide with improved physical properties. That is, a method for producing a polypeptide having a reduced binding activity to the extracellular matrix is provided.
  • the present invention also provides a method for producing a polypeptide with improved plasma kinetics, reduced immunogenicity, or improved solubility by reducing the binding activity to the extracellular matrix.
  • the present invention provides a method for producing a polypeptide having an antigen binding activity, particularly an antibody, which is particularly useful when used as a pharmaceutical composition.
  • the present invention provides a method for producing a polypeptide comprising the following steps; (a) modifying at least one amino acid residue of the polypeptide; (b) measuring the binding activity of the polypeptide modified in step (a) to the extracellular matrix; and (c) A step of selecting a polypeptide having a reduced binding activity to the extracellular matrix compared to that before modification.
  • steps (a) and (b) may be repeated two or more times. The number of times the steps (a) and (b) are repeated is not particularly limited, but is usually within 10 times.
  • the manufacturing method described above may include the following steps. (d) obtaining a gene encoding the polypeptide selected in step (c), and (e) A step of producing a polypeptide using the gene obtained in the step (d).
  • the above manufacturing method can further include the following steps.
  • (f) A step of modifying at least one amino acid residue of the polypeptide obtained in the step (e) and repeatedly performing the steps (b) to (e). It is repeated in the step (f) (
  • the number of steps b)-(e) is not particularly limited, but is usually within 10 times.
  • the present invention provides a method for producing a polypeptide having better physical properties than the polypeptide, based on a polypeptide whose physical properties are known in advance. That is, using the binding activity of the polypeptide to the extracellular matrix as an index, the plasma kinetics are improved and the immunogenicity is reduced compared to the polypeptide with known plasma kinetics, immunogenicity or solubility. Alternatively, a method for producing a polypeptide with improved solubility is provided. Furthermore, the present invention provides a method for producing a polypeptide having an antigen binding activity, particularly an antibody, which is particularly useful when used as a pharmaceutical composition.
  • the present invention is a method for producing a polypeptide having better physical properties than the reference polypeptide using a polypeptide whose physical properties are known in advance as a reference polypeptide, and comprising the following steps: Providing a manufacturing method; (a) contacting the reference polypeptide and the test polypeptide or test polypeptide library with an extracellular matrix; (b) measuring the binding activity to the extracellular matrix of the polypeptide contacted in the step (a), (c) selecting a polypeptide having a lower binding activity to the extracellular matrix than the reference polypeptide from the polypeptides measured in the step (b), (d) obtaining a gene encoding the polypeptide selected in step (c), and (e) A step of producing a polypeptide using the gene obtained in the step (d).
  • the steps (a) to (c) may be repeated two or more times. The number of times the steps (a) to (c) are repeated is not particularly limited, but is usually within 10 times.
  • the present invention provides a method of screening for a polypeptide having better physical properties than the polypeptide, based on a polypeptide whose physical properties are known in advance. That is, using the binding activity of the polypeptide to the extracellular matrix as an index, the plasma kinetics are improved and the immunogenicity is reduced compared to the polypeptide with known plasma kinetics, immunogenicity or solubility. Or a method of screening for polypeptides with improved solubility. Furthermore, the present invention provides a method for producing a polypeptide having an antigen binding activity, particularly an antibody, which is particularly useful when used as a pharmaceutical composition.
  • the present invention is a method for screening a polypeptide having a physical property superior to that of the reference polypeptide using a polypeptide whose physical properties are known in advance as a reference polypeptide, the polypeptide comprising the following steps: Providing a screening method; (a) contacting the reference polypeptide and the test polypeptide or test polypeptide library with an extracellular matrix; (b) measuring the binding activity to the extracellular matrix of the polypeptide contacted in the step (a), and (c) A step of selecting a polypeptide having a lower binding activity to the extracellular matrix than the reference polypeptide from the polypeptides measured in the step (b).
  • the steps (a) to (c) may be repeated two or more times. The number of times the steps (a) to (c) are repeated is not particularly limited, but is usually within 10 times.
  • Polypeptides used in the production method and screening method of the present invention may be prepared in any way, for example, preexisting antibodies, preexisting libraries (such as phage libraries), immunization to animals It is possible to use antibodies or libraries prepared from hybridomas obtained from B cells from immunized animals or libraries, antibodies or libraries in which amino acids are randomly altered in these antibodies or libraries, and the like.
  • the polypeptide produced by the production method of the present invention or the polypeptide obtained by the screening method of the present invention is improved in plasma kinetics and immunogenicity when administered to animals such as humans, mice and monkeys. It is considered possible to reduce the solubility and improve the solubility when a solution preparation is made. Therefore, the production method of the present invention can be used as a method for producing or screening a polypeptide with improved plasma kinetics, reduced immunogenicity, or improved solubility.
  • these polypeptides produced by the production method of the present invention or the polypeptides obtained by the screening method of the present invention are compared with the plasma before the binding activity to the extracellular matrix is modified. It is considered to be particularly excellent when used as a pharmaceutical because it is a polypeptide with improved medium kinetics, reduced immunogenicity, and improved solubility. Therefore, the production method of the present invention can be used as a method for producing a polypeptide for use as a pharmaceutical composition.
  • the screening method of the present invention can easily select a polypeptide having excellent plasma kinetics, immunogenicity, and solubility by using the binding activity to the extracellular matrix as an index.
  • it can be used for obtaining a polypeptide suitable for a pharmaceutical product.
  • the polypeptide obtained by the production method of the present invention or the DNA encoding the polypeptide obtained by the screening method of the present invention is usually carried (inserted) into an appropriate vector and introduced into a host cell.
  • the vector is not particularly limited as long as it stably retains nucleic acid such as inserted DNA.
  • E. coli is used as a host
  • a pBluescript vector (Stratagene) is preferable as a cloning vector.
  • An expression vector is particularly useful when a vector is used for the purpose of producing the polypeptide of the present invention.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is a vector that expresses a polypeptide in vitro, in E.
  • coli in cultured cells, or in an individual organism.
  • pBEST vector manufactured by Promega
  • E. coli PET vector manufactured by Invitrogen
  • pME18S-FL3 vector GenBank Accession No. AB009864
  • pME18S vector Mol Cell Biol. 8: 466-472 (1988)
  • the DNA of the present invention can be inserted into a vector by a conventional method, for example, by a ligase reaction using a restriction enzyme site (Current ⁇ ⁇ ⁇ protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, Section IV 11.4-11.11.
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells can be used depending on the purpose.
  • Examples of cells for expressing the polypeptide include bacterial cells (eg, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus), insect cells (eg, Drosophila S2). Spodoptera SF9), animal cells (eg, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, BowesB melanoma cells) and plant cells.
  • Vector introduction into host cells can be performed by, for example, calcium phosphate precipitation method, electric pulse perforation method (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & SSons.Section 9.1-9.9), lipofection method, micro It can be performed by a known method such as an injection method.
  • Host cell culture can be performed according to a known method. For example, when animal cells are used as hosts, for example, DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM can be used as a culture solution. At that time, the cells may be cultured by serum-free culture, even if serum supplements such as FBS and fetal calf serum (FCS) are used in combination.
  • the pH during culture is preferably about 6-8.
  • the culture is usually performed at about 30 to 40 ° C. for about 15 to 200 hours, and medium exchange, aeration, and agitation are added as necessary.
  • an appropriate secretion signal can be incorporated into the polypeptide of interest.
  • These signals may be endogenous to the polypeptide of interest or may be heterologous signals.
  • examples of systems that produce polypeptides in vivo include production systems that use animals and production systems that use plants.
  • a DNA encoding a target polypeptide is introduced into these animals or plants, and the polypeptide is produced in the body of the animal or plant and recovered.
  • the “host” in the present invention includes these animals and plants.
  • mammals there are production systems using mammals and insects.
  • mammals goats, pigs, sheep, mice, cows and the like can be used (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)).
  • a transgenic animal can be used.
  • a DNA encoding the polypeptide of the present invention is prepared as a fusion gene with a DNA encoding a polypeptide inherently produced in milk such as goat ⁇ casein.
  • a DNA fragment containing the fusion gene is injected into a goat embryo, and the embryo is transferred to a female goat.
  • the polypeptide of interest can be obtained from the milk produced by a transgenic goat born from a goat that has received the embryo or its offspring.
  • hormones may be administered to the transgenic goat as appropriate (Ebert et al., Bio / Technology (1994) 12: 699-702).
  • the target polypeptide can be obtained from the body fluid of the silkworm by infecting the silkworm with a baculovirus into which a DNA encoding the target polypeptide is inserted.
  • a plant when a plant is used for producing the polypeptide of the present invention, for example, tobacco can be used.
  • tobacco a DNA encoding a desired polypeptide is inserted into a plant expression vector such as pMON 530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens.
  • This bacterium can be infected with tobacco, for example, Nicotiana tabacum, and the desired polypeptide can be obtained from the leaves of this tobacco (Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131). -8).
  • a desired polypeptide can be obtained from a duckweed cell (Cox KM et al. Nat. Biotechnol. 2006 Dec; 24 (12): 1591-1597).
  • polypeptide thus obtained can be isolated from inside or outside the host cell (medium, milk, etc.) and purified as a substantially pure and homogeneous polypeptide. Separation and purification of polypeptides may be carried out using separation and purification methods used in usual polypeptide purification, and are not limited in any way. For example, chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. are appropriately selected, In combination, polypeptides can be separated and purified.
  • chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography, etc. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press). These chromatography can be performed using liquid phase chromatography, for example, liquid phase chromatography such as HPLC and FPLC.
  • Columns used for affinity chromatography include protein A columns and protein G columns. Examples of the column using protein A include Hyper D, POROS, Sepharose F F F (Pharmacia), and the like.
  • an appropriate protein modifying enzyme can be allowed to act before or after purification of the polypeptide to arbitrarily modify it or remove the peptide partially.
  • protein modifying enzymes include trypsin, chymotrypsin, lysyl endopeptidase, protein kinase, glucosidase, and the like.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a polypeptide obtained by the production method or screening method of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention, the polypeptide produced by the production method of the present invention, or the polypeptide obtained by the screening method of the present invention is improved in plasma kinetics and immunogenicity compared to normal antibodies by its administration. It is useful as a pharmaceutical composition because it is considered that the solubility of a solution preparation can be improved.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition usually refers to a drug for treatment or prevention of a disease, or examination / diagnosis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by methods known to those skilled in the art. For example, it can be used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injection of suspension.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative
  • a pharmaceutical preparation by combining with a binder or the like as appropriate and mixing in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice. The amount of the active ingredient in these preparations is set so as to obtain an appropriate volume within the indicated range.
  • a sterile composition for injection can be formulated in accordance with normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • a vehicle such as distilled water for injection.
  • the aqueous solution for injection include isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride).
  • a suitable solubilizing agent such as alcohol (ethanol etc.), polyalcohol (propylene glycol, polyethylene glycol etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80 (TM), HCO-50 etc.) may be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, and benzyl benzoate and / or benzyl alcohol may be used in combination as a solubilizing agent.
  • blend with a buffering agent for example, phosphate buffer and sodium acetate buffer
  • a soothing agent for example, procaine hydrochloride
  • a stabilizer for example, benzyl alcohol and phenol
  • antioxidant for example, benzyl alcohol and phenol
  • composition of the present invention is preferably administered by parenteral administration.
  • the composition can be an injection, nasal, pulmonary, or transdermal composition.
  • it can be administered systemically or locally by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, or the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dosage of the pharmaceutical composition containing the polypeptide of the present invention can be set, for example, in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg body weight. Alternatively, for example, the dose may be 0.001 to 100,000 mg per patient, but the present invention is not necessarily limited to these values.
  • the dose and administration method vary depending on the patient's weight, age, symptoms, etc., but those skilled in the art can set an appropriate dose and administration method in consideration of these conditions.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be a pharmaceutical composition used for improving plasma kinetics, reducing immunogenicity, or improving the solubility in a solution formulation.
  • the present invention also relates to a method for improving plasma kinetics or immunogen by administering to a subject the polypeptide of the present invention, the polypeptide produced by the production method of the present invention, or the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the present invention relates to a method for reducing the property. Administration may be performed either in vivo or in vitro. Examples of administration subjects include non-human animals (such as mice and monkeys) and humans.
  • amino acids contained in the amino acid sequences described in the present invention are modified after translation (for example, modification to pyroglutamic acid by pyroglutamylation of N-terminal glutamine is a modification well known to those skilled in the art). In some cases, even if the amino acid is post-translationally modified as such, it is naturally included in the amino acid sequence described in the present invention.
  • Example 1 Evaluation of association between extracellular matrix binding and pharmacokinetics in normal mouse plasma MabA1, A2, and A3 target blood coagulation factor IX and / or activated blood coagulation factor IX and blood coagulation factor X
  • target blood coagulation factor IX and / or activated blood coagulation factor IX and blood coagulation factor X These are bispecific antibodies that exhibit specific binding as an antigen and exhibit blood coagulation factor VIII-like clotting activity.
  • These antibodies can be used by those skilled in the art using the methods described in WO2005 / 035756 and WO2006 / 109592. It is an IgG antibody obtained by screening using a known antibody obtaining technique using the binding to the target antigen and the coagulation activity as an index, and further adding an amino acid modification that improves blood coagulation factor VIII-like coagulation activity.
  • MabA1, A2, and A3 were administered once to normal mice (C57BL / 6J, Charles River Japan) at 1 mg / kg, and blood was collected in a timely manner. The collected blood was immediately centrifuged at 4 ° C. and 15,000 rpm for 15 minutes to obtain plasma. The separated plasma was stored in a freezer set to ⁇ 20 ° C. or lower until measurement was performed.
  • the mouse plasma concentration was measured by ELISA.
  • Anti-Human IgG ( ⁇ ) was dispensed into a 96-well plate and allowed to stand overnight at 4 ° C. to prepare an Anti-Human IgG ( ⁇ ) -immobilized plate.
  • a calibration curve sample and a mouse plasma measurement sample were prepared, dispensed onto an Anti-Human IgG ( ⁇ ) solid phase plate, and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • Anti-human IgG-AP SIGMA
  • the mouse plasma concentration was calculated from the absorbance of the calibration curve using the analysis software SOFTmax PRO (Molecular Devices).
  • a plot of MabA1, A2, A3 extracellular matrix binding and plasma half-life (T1 / 2) is shown in FIG.
  • T1 / 2 A plot of MabA1, A2, A3 extracellular matrix binding and plasma half-life (T1 / 2) is shown in FIG.
  • T1 / 2 extracellular matrix binding and plasma half-life (T1 / 2) are correlated, and extracellular matrix binding measurement is a suitable method for predicting plasma pharmacokinetics. It was suggested that it is possible to improve the plasma pharmacokinetics (plasma half-life) of the antibody by reducing it.
  • Example 2 Sensitivity of detection of extracellular matrix binding and improvement of plasma retention of MabB1 by amino acid substitution
  • MabB1 is the same method as in Example 1, and blood coagulation factor IX is performed by methods known to those skilled in the art. And / or activated blood coagulation factor IX, and antibodies obtained by performing screening using as an index the binding of both blood coagulation factor X to the target antigen and blood coagulation factor VIII-like coagulation activity, IgG antibody produced by amino acid substitution to improve blood coagulation factor VIII-like coagulation activity.
  • MabB1 has a very short plasma half-life, and a short plasma half-life is a major challenge in developing MabB1 as a pharmaceutical because it leads to increased dose and shorter dose intervals.
  • MabB1 had a high extracellular matrix binding ability
  • various modified MabB1 antibodies in which amino acid substitutions were introduced into residues exposed on the surface of the antibody variable region were prepared for MabB1 by methods known to those skilled in the art, Screening for binding to the extracellular matrix was performed.
  • MabB2 and MabB3 with reduced extracellular matrix binding ability were obtained.
  • FIG. 2 shows the results of measuring the extracellular matrix binding of the antibody by the color development ELISA method described above.
  • MabB1 showed strong binding to extracellular matrix binding, but MabB2 and MabB3 into which amino acid substitution was introduced no longer showed binding to extracellular matrix binding.
  • MSD Read Buffer T (4x) manufactured by MSD was added, and the amount of luminescence was measured with SECTOR PR400.
  • FIG. 2 The result of measuring the extracellular matrix binding of the antibody (MabB2 / MabB3) by the above method is shown in FIG.
  • ELISA MabB2 extracellular matrix binding could not be detected (FIG. 2), but in the high sensitivity system using ECL, MabB2 extracellular matrix binding could be confirmed. That is, by using ECL, it was shown that the extracellular matrix binding of MabB1, MabB2, and MabB3 correlated with their plasma retention.
  • Example 3 Improvement of plasma retention of MabC9 by reducing extracellular matrix binding MabC9 was treated in the same manner as in Example 1 by methods known to those skilled in the art, and blood coagulation factor IX and / or activated blood coagulation. Blood coagulation factor VIII-like coagulation against antibodies obtained by screening with factor IX and the binding of both blood coagulation factor X to the target antigen and blood coagulation factor VIII-like coagulation activity IgG antibody produced by amino acid substitution to improve activity. Since MabC9 was found to have a very short plasma half-life, it was investigated to improve the plasma pharmacokinetics of MabC9. As a result, MabC9 was confirmed to bind strongly to the extracellular matrix, and the short plasma half-life was considered to be caused by nonspecific binding to the extracellular matrix.
  • MabC9 had a high extracellular matrix binding ability
  • various modified MabC9 antibodies in which amino acid substitutions were introduced into residues exposed on the surface of the antibody variable region were prepared in MabC9 by methods known to those skilled in the art, Screening for binding to the extracellular matrix was performed.
  • MabC8 and MabC7 with reduced extracellular matrix binding ability were obtained.
  • MabC9, MabC8, and MabC7 were intravenously administered to human FcRn transgenic mice (B6.mFcRn ⁇ / ⁇ . HFcRn Tg line 276 + / + mice, Jackson Laboratories) at 1 mg / kg to evaluate plasma pharmacokinetics.
  • FIG. 6 it was found that MabC8 and MabC7 with reduced extracellular matrix binding ability significantly increased plasma half-life and improved pharmacokinetics compared to MabC9. .
  • Example 4 Evaluation of association between extracellular matrix binding and immunogenicity MabC1 to C6 were prepared in the same manner as in Example 1, but by methods known to those skilled in the art, blood coagulation factor IX and / or activated blood coagulation factor Blood clotting factor VIII-like clotting activity against antibodies obtained by screening with the binding of both factor IX and blood clotting factor X to target antigen and blood clotting factor VIII-like clotting activity as indicators IgG antibody produced by amino acid substitution to improve As a result of evaluating the binding of MabC1 to C6 to the extracellular matrix by ECL, it was found that the degree of binding of these antibodies to the extracellular matrix varies depending on the antibody.
  • the antibody that binds to the extracellular matrix exhibits non-specific binding to other than the target antigen, it may also bind to antigen-presenting cells. Therefore, it is considered that the antibody that binds to the extracellular matrix is easily taken up by the antigen-presenting cell, thereby easily presenting the antigen, and the immunogenicity may be increased. Immunogenicity is an important issue for protein drugs, and it is desirable that protein drugs have low immunogenicity.
  • CD8 negative CD25 low positive peripheral blood mononuclear cells CD8 - CD25 low PBMCs
  • CD8 - CD25 low PBMCs CD8 negative CD25 low positive peripheral blood mononuclear cells separated from fresh human blood were seeded in a 24-well plate and pre-cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 in a humidified condition for about 2 hours. After pre-culture, the antibody was added, and the cells were cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 wet conditions. Cells collected on the 6th, 7th, and 8th days of culture were seeded in a 96-well plate and Bromodeoxyuridine (BrdU) was added.
  • PrdU Bromodeoxyuridine
  • Helper T cells incorporating BrdU were analyzed by flow cytometry. From the ratio of BrdU positive cells in Helper T cells, the degree of proliferation activity for each antibody was examined. The experiment was performed with a plurality of donors, and it was evaluated how many percent of each antibody exhibited proliferative activity. The higher the proportion of responding donors, the higher the immunogenicity.
  • FIG. 7 shows the reaction rate of donors showing proliferation activity on the horizontal axis and the extracellular matrix binding plotted on the vertical axis.
  • Example 5 Reduction of MabB2 immunogenicity by reducing extracellular matrix binding MabB2 prepared in Example 2 is highly immunogenic because anti-MabB2 mouse antibodies are produced in a short period of time when administered to mice. It has been confirmed. In Example 4, it was suggested that an antibody having a lower extracellular matrix binding ability has a lower immunogenicity, and it is possible to reduce the immunogenicity of the antibody by reducing the extracellular matrix binding ability. In the evaluation of plasma retention in mice of MabB2 and MabB3, anti-MabB2 antibody and anti-MabB3 antibody in mouse plasma were detected by ECL immunoassay.
  • the antibody was converted to Biotin using EZ-Link TM Sulfo-NFS-Biotinylation Kit (PIERCE) and sTag using Sulfo-Tag NHS Ester 150 nmol (MSD).
  • a mouse plasma measurement sample, a biotinylated antibody and an sTag antibody were mixed, and allowed to stand overnight at 4 ° C. This sample was dispensed onto a MULTI-ARRAY® PR SA Plate (manufactured by MSD) and shaken at room temperature for 2 hours. Thereafter, MSD Read Buffer T (4x) (manufactured by MSD) was added, and the luminescence was measured with SECTOR PR (R) 400.
  • FIG. MabB3 A plot of elapsed time (days) on the horizontal axis and antibody titer (ECL signal) on the vertical axis is shown in FIG. MabB3 with reduced extracellular matrix binding ability was confirmed to have a lower antibody titer and reduced immunogenicity compared to MabB2.
  • Example 6 Evaluation of association between extracellular matrix binding and solubility MabD1 to D30 were prepared in the same manner as in Example 1, and by methods known to those skilled in the art, blood coagulation factor IX and / or activated blood coagulation factor IX , And improved blood coagulation factor VIII-like coagulation activity against antibodies obtained by screening using both blood coagulation factor X binding to target antigen and blood coagulation factor VIII-like coagulation activity as indicators IgG antibody prepared by amino acid substitution.
  • ECL As a result of evaluating the binding of MabD1 to D3 to the extracellular matrix by ECL, it was found that the degree of binding of these antibodies to the extracellular matrix varies depending on the antibody.
  • solubility is important for preparing a protein pharmaceutical solution, and it is desirable that the solubility of the protein pharmaceutical is high.
  • the PEG solution monomer peak area and buffer solution monomer area were calculated for each antibody.
  • the solubility of each antibody in the presence of PEG was calculated by the following calculation method.
  • Antibody solution concentration (mg / mL) x PEG solution monomer peak area / buffer solution monomer area
  • FIG. 9 is a plot of the extracellular matrix binding on the horizontal axis and the solubility in the presence of PEG plotted on the vertical axis. It was found that extracellular matrix binding and solubility were highly correlated, with higher extracellular matrix binding having lower solubility. That is, it was shown that an antibody with high solubility can be obtained by screening an antibody with low extracellular matrix binding.
  • Example 7 Improvement of solubility of MabD31 by reducing extracellular matrix binding MabD31 was prepared in the same manner as in Example 1 by methods known to those skilled in the art, and blood coagulation factor IX and / or activated blood coagulation factor IX , And improved blood coagulation factor VIII-like coagulation activity against antibodies obtained by screening using both blood coagulation factor X binding to target antigen and blood coagulation factor VIII-like coagulation activity as indicators It is confirmed that the IgG antibody produced by amino acid substitution is low in solubility. In Example 6, it was shown that an antibody with high solubility can be obtained by screening an antibody with low extracellular matrix binding. Therefore, the surface of the antibody variable region of MabD31 is present on MabD31.
  • MabD31 and MabD32 Various modified MabD31 antibodies with amino acid substitutions introduced into the exposed residues were prepared and screened for binding to the extracellular matrix.
  • MabD32 with reduced extracellular matrix binding was created by introducing amino acid substitutions into the variable region of MabD31.
  • MabD31 and MabD32 solubility was measured under 20 mM Histidine, 150 mM NaCl, pH 6.0 conditions.
  • MabD31 solubility was 5.9 mg / mL, while MabD32 solubility was 150 mg / mL or higher. there were.
  • the extracellular matrix binding and solubility of MabD31 and MabD32 are shown in FIG.
  • solubility of the antibody can be improved by reducing extracellular matrix binding.
  • the present invention provides a method for improving the physical properties of a polypeptide or a method for producing a polypeptide with improved physical properties by reducing the binding of a polypeptide having a certain target function to an extracellular matrix.
  • improvement of physical properties of the polypeptide can improve plasma kinetics, reduce immunogenicity, or improve solubility, and can provide a polypeptide suitable for use as a pharmaceutical product. It is also possible to evaluate the physical properties of the test polypeptide by comparing the binding activity of the polypeptide whose physical properties are known in advance to the extracellular matrix and the binding activity of the test polypeptide to the extracellular matrix. .

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Abstract

本発明者らは、ポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性を低減することで、ポリペプチドの物性を改善させることが可能となることを見出した。

Description

抗体の物性を改善させる方法
　ポリペプチドを薬物として投与した際、その血漿中動態等の体内動態は、ポリペプチドの物性によって様々に変化する。ポリペプチドの体内動態を決定する物性因子として、血漿中での分解性（ペプチド鎖部位の分解、および糖鎖部位の分解）、溶解度、抗原性、肝臓での代謝、血漿タンパク（アルブミン等）への結合性、等が例として挙げられるが、この限りではない。
　ポリペプチドを薬物として使用する際、in vitroで高い活性を示す分子を大規模なスクリーニングで取得してきても、その体内動態が不良である場合は、生体内投与時には高い薬効が期待できない。したがって、その体内動態を改善させることは、薬物の開発において重要な課題である。
　通常、このようなポリペプチドの体内動態を検証する場合、種々の小動物（ラット、マウス）へ投与する手法が試される。しかしながら、このような時間がかかる方法は迅速性が求められる薬剤開発において適切ではない。また多分に労力がかかることから小規模にならざるを得ず、薬物探索に必要な大規模スクリーニングを施行するうえでも不適である。
　そのため安価で効率的に施行でき、ポリペプチドの体内動態を信頼性高く予測できるin vitroの方法があれば、薬物の開発において極めて有用である。
　複数抗体分子を用いた検討により、in vitroにおいてプロテアーゼ分解を受ける速度と、in vivoでの血中半減期が相関することが明らかとなってきた（特許文献1）。ポリペプチドの体内動態を決定する因子は、プロテアーゼ耐性以外にも複数存在すること、また種々の因子がポリペプチドの体内動態に与える影響は、そのポリペプチドの種類、特性によっても異なることから、複数の異なるin vitroパラメータと体内動態との相関を、詳細に検討していくことが重要である。
　VEGF受容体とFcの融合タンパクであるVEGF-Trap分子を皮下投与した場合の血中濃度についての検討がなされている（非特許文献1）。等電点の高いVEGF-Trap分子は皮下投与時の血漿中濃度が低いことから生物学的利用率（bioavailability）が低い。アミノ酸改変により等電点を低くした改変VEGF-Trap分子は、血漿中濃度が高くなり、生物学的利用率を向上させることができている。また、当該生物学的利用率の変化と細胞外マトリックスへの結合強度が相関していることから、VEGF-Trap分子を皮下投与した場合の当該分子の生物学的利用率が、皮下部位の細胞外マトリックスへの結合強度に依存していることが明らかとなってきた。
　このように、ポリペプチドの生物学的利用率とその細胞外マトリックスへの結合強度に関する相関は報告されているものの、ポリペプチドを薬剤とするうえで重要な、血漿中半減期、その他の種々のパラメータ（例えば、血漿中クリアランス、免疫原性、溶解度等）が、ポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合強度とどう相関するかは不明であった。また、これまでのELISAを用いた細胞外マトリックスへの結合強度の評価方法は感度が不十分であった。
　なお、本発明の先行技術文献を以下に示す。
WO2009/128931
Proc. Natl. Acad. Sci., 2002, 99(17), 11393-11398
　本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的はポリペプチドの物性を改善させる方法、特にポリペプチドの血漿中動態を改善させる方法、免疫原性を低減させる方法または溶解度を改善させる方法を提供することにある。
　本発明者らは、ポリペプチドの物性を改善させる方法について鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、細胞外マトリックスへの結合活性が低減されるようにポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を改変することにより、ポリペプチドの物性、特に血漿中動態、免疫原性および溶解度を改善させることができることを見出した。
　すなわち本発明は、ポリペプチドの物性を改善させる方法、特にポリペプチドを薬物として投与する場合に、血漿中動態を改善させる方法または免疫原性を低減させる方法、あるいはポリペプチドを溶液製剤とする場合にその溶解度を改善させる方法、これらポリペプチドを製造する方法、当該製造方法によって製造されたポリペプチド、および、ポリペプチドの物性を評価する方法などに関し、より具体的には、
〔１〕　細胞外マトリックスへの結合活性を低減させることによる、ポリペプチドの物性を改善させる方法、
〔２〕　物性の改善が、血漿中動態の改善、免疫原性の低減および溶解度の改善から選ばれる少なくとも１つである、〔１〕に記載の方法、
〔３〕　細胞外マトリックスへの結合活性の低減が、ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を改変することによって細胞外マトリックスへの結合を低減させる、〔１〕または〔２〕に記載の方法、
〔４〕　細胞外マトリックスへの結合活性が電気化学発光法により測定される、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法、
〔５〕　ポリペプチドが、抗原結合活性を有するポリペプチドである、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法、
〔６〕　抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体である、〔５〕に記載の方法、
〔７〕　物性の改善されたポリペプチドの製造方法であって、細胞外マトリックスへの結合活性が低減されるようにポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を改変する工程を含む製造方法、
〔８〕　物性の改善されたポリペプチドの製造方法であって、該製造方法は、
　(a)　ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を改変する工程、
　(b)　前記工程(a)で改変されたポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性を測定する工程、および、
　(c)　細胞外マトリックスへの結合活性が改変前と比較して低減されたポリペプチドを選択する工程、
を含む製造方法、
〔９〕　さらに、
　(d)　〔８〕の工程(c)で選択されたポリペプチドをコードする遺伝子を得る工程、および、
　(e)　前記工程(d)で得られた遺伝子を用いてポリペプチドを製造する工程、
を含む、〔８〕に記載の製造方法、
〔１０〕　さらに、
　(f)　〔９〕の工程(e)で得られたポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、前記工程(b)～(e)を繰り返し実施する工程、
を含む、〔９〕に記載の製造方法、
〔１１〕　あらかじめ物性のわかっているポリペプチドを基準ポリペプチドとして、基準ポリペプチドより物性の優れたポリペプチドを製造する方法であって、該製造方法は、
　(a)　基準ポリペプチドおよび、被検ポリペプチド又は被検ポリペプチドライブラリーを細胞外マトリックスに接触させる工程、
　(b)　前記工程(a)で接触させたポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性を測定する工程、
　(c)　前記工程(b)で測定されたポリペプチドの中から基準ポリペプチドより細胞外マトリックスへの結合活性が低いポリペプチドを選択する工程、
　(d)　前記工程(c)で選択されたポリペプチドをコードする遺伝子を得る工程、および、
　(e)　前記工程(d)で得られた遺伝子を用いてポリペプチドを製造する工程、
を含む製造方法、
〔１２〕　物性の改善が血漿中動態の改善、免疫原性の低減および溶解度の改善から選ばれる少なくとも１つである、〔７〕～〔１１〕に記載の製造方法、
〔１３〕　細胞外マトリックスへの結合活性が電気化学発光法により測定される、〔７〕～〔１２〕のいずれかに記載の製造方法、
〔１４〕　ポリペプチドが、抗原結合活性を有するポリペプチドである、〔７〕～〔１３〕のいずれかに記載の製造方法、
〔１５〕　抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体である、〔１４〕に記載の製造方法、
〔１６〕　〔７〕～〔１５〕のいずれかに記載の製造方法によって製造されたポリペプチド、
〔１７〕　あらかじめ物性のわかっているポリペプチドを基準ポリペプチドとして、基準ポリペプチドより物性の優れたポリペプチドのスクリーニング方法であって、該方法は、
　(a)　基準ポリペプチドおよび、被検ポリペプチド又は被検ポリペプチドライブラリーを細胞外マトリックスに接触させる工程、
　(b)　前記工程(a)で接触させたポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性を測定する工程、および、
　(c)　前記工程(b)で測定されたポリペプチドの中から基準ポリペプチドより細胞外マトリックスへの結合活性が低いポリペプチドを選択する工程、
を含む、方法、
〔１８〕　物性の改善が血漿中動態の改善、免疫原性の低減および溶解度の改善から選ばれる少なくとも１つである、〔１７〕に記載のスクリーニング方法、
〔１９〕　細胞外マトリックスへの結合活性が電気化学発光法により測定される、〔１７〕または〔１８〕に記載のスクリーニング方法、
〔２０〕　ポリペプチドが、抗原結合活性を有するポリペプチドである、〔１７〕～〔１９〕のいずれかに記載のスクリーニング方法、
〔２１〕　抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体である、〔２０〕に記載のスクリーニング方法、
〔２２〕　被検ポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性を測定し、あらかじめ物性がわかっている他のポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性と比較することにより、被検ポリペプチドの物性を評価する方法、
〔２３〕　物性がポリペプチドの血漿中動態、免疫原性および溶解度から選ばれる少なくとも１つである、〔２２〕に記載の方法、
〔２４〕　細胞外マトリックスへの結合活性の測定が電気化学発光法による測定である、〔２２〕または〔２３〕に記載の方法、
に関する。
　本発明では、ある目的の機能を有するポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合を低減することによって、当該ポリペプチドの物性を改善させる方法あるいは物性の改善されたポリペプチドの製造方法が提供された。特に、当該ポリペプチドの物性の改善として、血漿中動態の改善、免疫原性の低減、あるいは溶解度の改善が可能となり、医薬品としての利用に適したポリペプチドの提供が可能である。また、あらかじめ物性のわかっているポリペプチドの細胞外マトリックスに対する結合活性と被検ポリペプチドの細胞外マトリックスに対する結合活性を比較することで、当該被検ポリペプチドの物性を評価することが可能である。
抗体（MabA1～A3）の細胞外マトリックス結合と、それを正常マウスに投与した際の半減期(d)との関係を示す図である。 抗体（MabB1、MabB2、MabB3）の細胞外マトリックス結合を、ELISAで測定した図である。 抗体（MabB1～B3）の正常マウスでの血漿中動態を実施例１に示した方法で評価した結果（静脈投与）を示す図である。 抗体（MabB1～B3）の正常マウスでの血漿中動態を実施例１に示した方法で評価した結果（皮下投与）を示す図である。 抗体（MabB2およびMabB3）の細胞外マトリックスへの結合を、ECLで測定した図である。 抗体（MabC7～MabC9）の細胞外マトリックスへの結合と、それをヒトFcRnトランスジェニックマウスに投与した際の半減期(d)との関係を示す図である。 抗体(MabC1～MabC6)ポリペプチドの細胞外マトリックス結合と、T-cell assay反応率を示す図である。 抗体(MabB2とMabB3)を投与した際の、投与日数と抗抗体出現の関係を示す図である。 抗体（MabD1～MabD30）の細胞外マトリックスへの結合と、溶解度の関係を示す図である。 抗体（MabD31とMabD32）の細胞外マトリックス結合と、溶解度の関係を示す図である。
　本発明は、ポリペプチドの物性を改善させる方法を提供する。より具体的には、ポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性を低減させることによって、当該ポリペプチドの物性を改善させる方法を提供する。特に、ポリペプチドが生体内に投与された場合の血漿中動態を改善させる方法、免疫原性を低減させる方法、あるいは、ポリペプチドを溶液製剤とする場合の溶解度を改善させる方法を提供する。
　さらに、あらかじめ物性のわかっているポリペプチドの細胞外マトリックスに対する結合活性と被検ポリペプチドの細胞外マトリックスに対する結合活性を比較することで、当該被検ポリペプチドの物性を評価する方法を提供する。
　本発明において対象となる「ポリペプチド」は特に限定されないが、生体内に投与された際に特定の機能を有していることが好ましく、特に医薬品としての効果を有するポリペプチドが好ましい。そのようなポリペプチドとしては例えば、抗体、ホルモン、サイトカイン等が挙げられる。
　本発明の抗原結合活性を有するポリペプチドの例として、抗体を挙げることができる。本発明の抗体の好ましい例として、IgG抗体を挙げることができる。抗体としてIgG抗体を用いる場合、その種類は限定されず、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4などのアイソタイプ（サブクラス）のIgGを用いることが可能である。また、本発明のポリペプチドには抗体の定常領域が含まれていてもよく、定常領域部分にアミノ酸変異を導入しても良い。
　本発明が対象とする「ポリペプチド」が抗体の場合、抗体はマウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体など、どのような動物由来の抗体でもよい。さらに、例えばキメラ抗体、中でもヒト化抗体などのアミノ酸配列を置換した改変抗体でもよい。また、二重特異性抗体、各種分子を結合させた抗体修飾物、抗体断片を含むポリペプチドなどであってもよい。
　「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の配列を組み合わせて作製される抗体である。キメラ抗体の具体的な例としては、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変（V）領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常（C）領域からなる抗体を挙げることができる。
　「ヒト化抗体」とは、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR;complementarity determining region）をヒト抗体のCDRへ移植したものである。CDRを同定するための方法は公知である（Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877）。また、その一般的な遺伝子組換え手法も公知である（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576 号公報参照）。
　本発明におけるポリペプチドがキメラ抗体またはヒト化抗体である場合には、これらの抗体のC領域は、好ましくはヒト抗体由来のものが使用される。例えばH鎖では、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4などを、L鎖ではCκ、Cλなどを使用することができる。また、Fcγレセプターへの結合を増大あるいは低減させるために、抗体の安定性または抗体の産生を改善するために、ヒト抗体C領域を必要に応じアミノ酸変異を導入してもよい。本発明におけるキメラ抗体は、好ましくはヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、好ましくはヒト以外の哺乳動物由来抗体のCDRと、ヒト抗体由来のFRおよびC領域とからなる。ヒト抗体由来の定常領域は、ヒトFcRn結合領域を含んでいることが好ましく、そのような抗体の例として、IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）を挙げることができる。本発明におけるヒト化抗体に用いられる定常領域は、どのアイソタイプに属する抗体の定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトIgG1由来の定常領域が用いられるが、これに限定されるものではない。また、ヒト化抗体に利用されるヒト抗体由来のFRも特に限定されず、どのアイソタイプに属する抗体のものであってもよい。
　本発明におけるキメラ抗体及びヒト化抗体の可変領域及び定常領域は、元の抗体の結合特異性を示す限り、欠失、置換、挿入及び/または付加等により改変されていてもよい。
　二重特異性抗体は、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体をいう。二重特異性抗体は２つ以上の異なる抗原を認識する抗体であってもよいし、同一抗原上の異なる２つ以上のエピトープを認識する抗体であってもよい。
　また、抗体断片を含むポリペプチドとしては、例えば、Fab断片、F(ab')2断片、scFv（Nat Biotechnol. 2005 Sep;23(9):1126-36.）domain antibody(dAb)（WO2004/058821, WO2003/002609）、scFv-Fc（WO2005/037989）、dAb-Fc、Fc融合ポリペプチド等が挙げられる。Fc領域を含んでいる分子はFc領域をヒトFcRn結合ドメインとして用いることができる。また、これらの分子にヒトFcRn結合ドメインを融合させてもよい。
　さらに、本発明におけるポリペプチドは、抗体様分子であってもよい。抗体様分子（scaffold分子、ペプチド分子）とは、ターゲット分子に結合することで機能を発揮するような分子であり（Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:653-658、Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1-10、Current Opinion in Structural Biology 1997, 7:463-469、Protein Science 2006, 15:14-27）、例えば、DARPins（WO2002/020565）、Affibody（WO1995/001937）、Avimer（WO2004/044011, WO2005/040229）、Adnectin（WO2002/032925）等が挙げられる。これら抗体様分子であっても、細胞外マトリックスに対する結合活性を低減することにより、当該抗体分子の物性を改善させることが可能である。
　本発明において、ポリペプチドの「物性」とは、当該ポリペプチドを生体内に投与した際の血漿中動態、免疫原性、あるいは、当該ポリペプチドを溶液製剤とした際の溶解度、を意味する。本発明において「物性を改善させる」とは、これらの物性のいずれかが改善されていればよく、特に、ポリペプチドを医薬品として使用する場合に重要となる、血漿中動態、免疫原性および溶解度のいずれかが改善されることが好ましい。
　また、「細胞外マトリックスへの結合」を測定する方法は特に限定されないが、細胞外マトリックスが固相化されたプレートにポリペプチドを添加し、そのポリペプチドに対する標識抗体を添加することによって、ポリペプチドと細胞外マトリックスの結合を検出するELISA系によって測定することができる。特に細胞外マトリックス結合能をより高感度に検出することが可能となることから電気化学発光法（ECL（Electrochemiluminescence））を用いた測定方法が好ましい。具体的には細胞外マトリックスを固相化したプレートに、ポリペプチドとルテニウム抗体の混合物を添加し、ポリペプチドと細胞外マトリックスとの結合を、ルテニウムの電気化学発光によって測定するECL系によって測定することができる。ポリペプチドの添加濃度は任意に設定することが可能であり、細胞外マトリックスへの結合の検出感度を高くするためには添加濃度は高いほうが好ましい。本発明において用いられる細胞外マトリックスとしては、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、エンタクチン、フィブリン、パールカン等の糖タンパク質を含むものであれば、動物由来でも植物由来でもよいが、本発明においては、動物由来の細胞外マトリックスが好ましく、例えばヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌなどの動物由来の細胞外マトリックスを用いることができる。特に、ヒトにおける血漿中動態の改善をモニターするためにはヒト由来の天然の細胞外マトリックスが好ましい。また、ポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合を評価する条件としては、生理条件下であるpH 7.4付近の中性域が望ましいが、必ずしも中性域である必要はなく、酸性域（pH6.0付近）において評価してもよい。また、ポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合を評価する際に、ポリペプチドが結合する抗原分子を共存させることによって、ポリペプチド－抗原分子の複合体の細胞外マトリックスへの結合を評価してもよい。
　本発明において、「血漿中動態の改善」は、「血漿中薬物動態の改善」、「血漿中滞留性の改善」、「優れた血漿中滞留性」、「血漿中滞留性を長くする」と言い換えることが可能であり、これらの語句は同じ意味で使用される。
　本発明において「血漿中動態の改善」とは、本発明のポリペプチドがヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ、イヌなどの動物に投与されてから、血漿中から消失するまで（例えば、細胞内で分解される等して本発明のポリペプチドが血漿中に戻ることが不可能な状態になるまで）の時間が長くなることを意味する。すなわち、「血漿中動態の改善」とは、血漿中半減期の増加、平均血漿中滞留時間の増加または血漿中クリアランスの低下等のいずれかのパラメータ（ファーマコキネティクス　演習による理解（南山堂））を測定することにより血漿中動態の改善を確認することが可能である。例えば、被験対象のポリペプチドをマウス、ラット、サル、ウサギ、イヌ、ヒトなどに投与した場合、当該ポリペプチドの血漿中濃度を測定し、各パラメータを算出し、血漿中半減期が長くなった又は平均血漿中滞留時間が長くなった場合等には、当該ポリペプチドの血漿中動態が改善したと言える。これらのパラメータは当業者に公知の方法により測定することが可能であり、例えば、薬物動態解析ソフトWinNonlin（Pharsight）を用いて、付属の手順書に従いNoncompartmental解析することによって適宜評価することができる。
　本発明においては、ヒトにおける血漿中動態が向上することが好ましい。ヒトでの血漿中動態を測定することが困難である場合には、マウス（例えば、正常マウス、ヒト抗原発現トランスジェニックマウス、ヒトFcRn発現トランスジェニックマウス、等）やサル（例えば、カニクイザルなど）での血漿中動態をもとに、ヒトでの血漿中動態を予測することができる。
　本発明において、「免疫原性の低減」とは、本発明のポリペプチドがin vitroにおいて免疫細胞に添加されたときの細胞増殖や炎症性サイトカインの産生が抑制されること、あるいは、in vivoに投与されたときの当該ポリペプチドに対する抗体の出現頻度や強度の低減を意味する。具体的には、in vitroにおいてPBMCにポリペプチドを添加したときの細胞増殖は、青色に発色する基質であるBrdU（ブロモデオキシウリジン）が、活発に増殖している細胞において新たに合成されるDNAによく取り込まれることを利用し、分光光度計により測定することができる（Baker MP, Carr FJ.Curr Drug Saf. 2010, 5(4):308-13.）。また、in vivoでポリペプチドを生体内に投与したときに出現する抗体は、ポリペプチドを用いたSandwich-ELISAやポリペプチドを固定化したプレートを用いたELISA系等の当業者公知の方法で検出測定することができる。サイトカイン産生は、サイトカインに対する抗体を用いたSandwich ELISA等を用いる方法で測定することができる。より具体的には、実施例４に記載のような方法に従って免疫原性を測定することができる。
　本発明において、「溶解度の改善」とは、ポリエチレングリコール（PEG）存在下におけるバッファー中の溶解度(Guiotto, A. et al. (2004) Bioorg. Med. Chem. 12, 5031-5037)、および、バッファー中における実測の溶解度が上昇すること、を意味する。溶解度を測定するバッファーの種類は任意に選択することが可能である。具体的には、例えば、実施例６に記載のような方法に従って溶解度を測定することができる。
　本発明のポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合が低減されるようなアミノ酸残基の改変としては、特に限定されないが、本発明においては、抗原結合活性を有するポリペプチドの表面にあるアミノ酸を改変することが好ましい。例えばポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を改変することによって細胞外マトリックスへの結合を低減させる。その際、改変によるポリペプチドの他の活性に対する影響を少なくするよう考慮することが好ましい。
　従って本発明においては、例えば、本発明のポリペプチドが抗体である場合には、細胞外マトリックスへの結合は抗体可変領域部分の表面に露出する残基が主に関与することから、抗体の表面に露出する可変領域のアミノ酸を改変することが好ましい。抗体の表面に露出する可変領域のアミノ酸は抗体のホモロジーモデルを用いて当業者公知の方法で見出すことが可能である。
　アミノ酸残基の改変は、後述のようにポリペプチドをコードするDNAにおいて1又は複数の塩基を改変し、当該DNAを宿主細胞で発現させることによって行うことが出来る。当業者であれば、改変後のアミノ酸残基の種類に応じて、改変すべき塩基の数や位置、種類を容易に決定することが出来る。
　本発明において改変とは、置換、欠損、付加、挿入のいずれか、又はそれらの組み合わせを意味する。
　本発明において「塩基の改変」とは、DNAによってコードされるポリペプチドが目的のアミノ酸残基を有するように、DNAに対して少なくとも1塩基を挿入、欠失又は置換するような遺伝子操作もしくは変異処理を行うことを意味する。即ち、元のアミノ酸残基をコードするコドンを、目的のアミノ酸残基をコードするコドンに変換することが含まれる。このような塩基の改変は、部位特異的突然変異(例えば、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488参照)、PCR変異導入法、カセット変異等の方法により行うことができる。本発明のポリペプチドが抗体である場合、一般に、生物学的特性の改善された抗体変異体は70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上(例えば、91%、92%、93%、94%、95％、96%、97％、98％、99％以上等)のアミノ酸配列の相同性及び/又は類似性を元となった抗体の可変領域のアミノ酸配列に対して有する。本明細書において、配列の相同性及び/又は類似性は、配列相同性が最大の値を取るように必要に応じ配列を整列化、及びギャップ導入した後、元となった抗体残基と相同(同じ残基)又は類似(一般的なアミノ酸の側鎖の特性に基づき同じグループに分類されるアミノ酸残基)するアミノ酸残基の割合として定義される。通常、天然のアミノ酸残基は、その側鎖の性質に基づいて(1)疎水性：アラニン、イソロイシン、バリン、メチオニン及びロイシン；(2)中性親水性：アスパラギン、グルタミン、システイン、スレオニン及びセリン；(3)酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸；(4)塩基性：アルギニン、ヒスチジン及びリジン；(5)鎖の配向に影響する残基：グリシン及びプロリン；ならびに(6)芳香族性：チロシン、トリプトファン及びフェニルアラニンのグループに分類される。
　このように改変されたポリペプチドをコードするDNAは、適当なベクターへクローニング（挿入）され、宿主細胞へ導入される。ベクターとしては、挿入したDNA等の核酸を安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターが挙げられる。クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製）などが好ましいが、市販の種々のベクターを利用することができる。
　本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されない。例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌内発現であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞内発現であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体内での発現であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などが好ましい。ベクターへのDNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4-11.11）。
　上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）及び植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクション法、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
　宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、又は細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。
　発現産物の回収は、ポリペプチドが培地に分泌される場合は、培地を回収する。ポリペプチドが細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。
　組換え細胞培養物からポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
　本発明の物性の改善されたポリペプチドは、物性の基準となるポリペプチドを定め、当該ポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合能よりも低い細胞外マトリックス結合能を有するポリペプチドを、あらかじめ存在している抗体、あらかじめ存在しているライブラリー（ファージライブラリー等）、動物への免疫から得られたハイブリドーマや免疫動物からのB細胞から作製された抗体又はライブラリー、これらの抗体やライブラリーにランダムにアミノ酸を改変した抗体又はライブラリーから選択する、あるいは、基準となるポリペプチドのアミノ酸を改変し、細胞外マトリックス結合能を低減させることによって得ることができる。アミノ酸の改変については上記の記載に従って実施することができる。物性改善を評価する方法は、実施例に記載した方法に沿って実施することができる。
　さらに本発明は、物性の改善されたポリペプチドの製造方法を提供する。すなわち、細胞外マトリックスへの結合活性が低減されたポリペプチドの製造方法を提供する。また、本発明は、細胞外マトリックスへの結合活性を低減させることにより、血漿中動態の改善、免疫原性の低減、あるいは溶解度の改善されたポリペプチドを製造する方法を提供する。さらに、本発明は医薬組成物として用いる際に特に有用である抗原結合活性を有するポリペプチド、特に抗体の製造方法を提供する。
　具体的には、本発明は以下の工程を含むポリペプチドの製造方法を提供する；
　(a)　ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を改変する工程、
　(b)　前記工程(a)で改変されたポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性を測定する工程、および、
　(c)　細胞外マトリックスへの結合活性が改変前と比較して低減されたポリペプチドを選択する工程。
　なお、(a)と(b)の工程は2回以上繰り返されてもよい。(a)と(b)の工程が繰り返される回数は特に限定されないが、通常10回以内である。
　さらに上記の製造方法には下記の工程を含めることができる。
　(d)　前記工程(c)で選択されたポリペプチドをコードする遺伝子を得る工程、および、
　(e)　前記工程(d)で得られた遺伝子を用いてポリペプチドを製造する工程。
　上記の製造方法には更に下記の工程を含めることができる。
　(f)　前記工程(e)で得られたポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、前記工程(b)-(e)を繰り返し実施する工程
　なお、工程(f)において繰り返される(b)-(e)の工程の回数は、特に限定されないが、通常10回以内である。
　さらに本発明はあらかじめ物性のわかっているポリペプチドを基準として、当該ポリペプチドよりも物性の優れたポリペプチドを製造する方法を提供する。すなわち、ポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性を指標として、あらかじめ血漿中動態、免疫原性あるいは溶解度のわかっているポリペプチドよりも、より血漿中動態が改善された、免疫原性が低減された、あるいは溶解度が改善されたポリペプチドを製造する方法を提供する。さらに、本発明は医薬組成物として用いる際に特に有用である抗原結合活性を有するポリペプチド、特に抗体の製造方法を提供する。
　具体的には、本発明はあらかじめ物性のわかっているポリペプチドを基準ポリペプチドとして、当該基準ポリペプチドよりも物性の優れたポリペプチドを製造する方法であって、以下の工程を含むポリペプチドの製造方法を提供する；
　(a)　基準ポリペプチドおよび、被検ポリペプチド又は被検ポリペプチドライブラリーを細胞外マトリックスに接触させる工程、
　(b)　前記工程(a)で接触させたポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性を測定する工程、
　(c)　前記工程(b)で測定されたポリペプチドの中から基準ポリペプチドより細胞外マトリックスへの結合活性が低いポリペプチドを選択する工程、
　(d)　前記工程(c)で選択されたポリペプチドをコードする遺伝子を得る工程、および、
　(e)　前記工程(d)で得られた遺伝子を用いてポリペプチドを製造する工程。
　なお、(a)～(c)の工程は2回以上繰り返されてもよい。(a)～(c)の工程が繰り返される回数は特に限定されないが、通常10回以内である。
　さらに本発明は、あらかじめ物性のわかっているポリペプチドを基準として、当該ポリペプチドよりも物性の優れたポリペプチドをスクリーニングする方法を提供する。すなわち、ポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性を指標として、あらかじめ血漿中動態、免疫原性あるいは溶解度のわかっているポリペプチドよりも、より血漿中動態が改善された、免疫原性が低減された、あるいは溶解度が改善されたポリペプチドをスクリーニングする方法を提供する。さらに、本発明は医薬組成物として用いる際に特に有用である抗原結合活性を有するポリペプチド、特に抗体の製造方法を提供する。
　具体的には、本発明はあらかじめ物性のわかっているポリペプチドを基準ポリペプチドとして、当該基準ポリペプチドよりも物性の優れたポリペプチドをスクリーニングする方法であって、以下の工程を含むポリペプチドのスクリーニング方法を提供する；
　(a)　基準ポリペプチドおよび、被検ポリペプチド又は被検ポリペプチドライブラリーを細胞外マトリックスに接触させる工程、
　(b)　前記工程(a)で接触させたポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性を測定する工程、および、
　(c)　前記工程(b)で測定されたポリペプチドの中から基準ポリペプチドより細胞外マトリックスへの結合活性が低いポリペプチドを選択する工程。
　なお、(a)～(c)の工程は2回以上繰り返されてもよい。(a)～(c)の工程が繰り返される回数は特に限定されないが、通常10回以内である。
　本発明の製造方法やスクリーニング方法で用いられるポリペプチドはどのように調製されてもよく、例えば、あらかじめ存在している抗体、あらかじめ存在しているライブラリー（ファージライブラリー等）、動物への免疫から得られたハイブリドーマや免疫動物からのB細胞から作製された抗体又はライブラリー、これらの抗体やライブラリーにランダムにアミノ酸を改変した抗体又はライブラリーなどを用いることが可能である。
　また、本発明の製造方法により製造されるポリペプチドあるいは本発明のスクリーニング方法により取得されるポリペプチドは、ヒト、マウス、サルなどの動物に投与した際に、血漿中動態の改善、免疫原性の低減、溶液製剤とした際の溶解度の改善が可能であると考えられる。従って、本発明の製造方法は、血漿中動態の改善、免疫原性の低減、あるいは、溶解度の改善されたポリペプチドの製造方法あるいはスクリーニング方法として利用することができる。
　また、本発明の製造方法により製造されるこれらのポリペプチドあるいは本発明のスクリーニング方法により取得されるポリペプチドは、細胞外マトリックスへの結合活性が改変される前のポリペプチドと比較して、血漿中動態の改善、免疫原性の減少、溶解度の改善されたポリペプチドであることから、医薬品として用いる場合に特に優れていると考えられる。従って、本発明の製造方法は、医薬組成物として用いる為のポリペプチドの製造方法として利用することが可能である。
　また、本発明のスクリーニング方法は、細胞外マトリックスへの結合活性を指標とすることにより、容易に血漿中動態、免疫原性、溶解度に優れたポリペプチドを選択することが可能であることから、特に医薬品に適したポリペプチドの取得に利用することが可能である。
　本発明の製造方法において得られたポリペプチドあるいは本発明のスクリーニング方法において得られたポリペプチドをコードするDNAは、通常、適当なベクターへ担持（挿入）され、宿主細胞へ導入される。該ベクターとしては、挿入したDNA等の核酸を安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター（Stratagene社製）などが好ましいが、市販の種々のベクターを利用することができる。本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などが好ましい。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4-11.11）。
　上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクション法、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
　宿主細胞の培養は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、動物細胞を宿主とした場合、培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、FBS、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用しても、無血清培養により細胞を培養してもよい。培養時のpHは、約6～8とするのが好ましい。培養は、通常、約30～40℃で約15～200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
　宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。
　一方、in vivoでポリペプチドを産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするポリペプチドをコードするDNAを導入し、動物又は植物の体内でポリペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
　動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシ等を用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
　例えば、本発明のポリペプチドをコードするDNAを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリペプチドをコードするDNAとの融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のポリペプチドを得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるポリペプチドを含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに投与してもよい（Ebert et al., Bio/Technology (1994) 12: 699-702）。
　また、本発明のポリペプチドを産生させる昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のポリペプチドをコードするDNAを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のポリペプチドを得ることができる。
　さらに、植物を本発明のポリペプチド産生に使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするポリペプチドをコードするDNAを植物発現用ベクター、例えばpMON 530に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-8）。また、同様のバクテリアをウキクサ（Lemna minor）に感染させ、クローン化した後にウキクサの細胞より所望のポリペプチドを得ることができる（Cox KM et al. Nat. Biotechnol. 2006 Dec;24(12):1591-1597）。
　このようにして得られたポリペプチドは、宿主細胞内または細胞外（培地、乳汁など）から単離し、実質的に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせてポリペプチドを分離、精製することができる。
　クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.(1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインAカラム、プロテインGカラムが挙げられる。例えば、プロテインAを用いたカラムとして、Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (Pharmacia製)等が挙げられる。
　必要に応じ、ポリペプチドの精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
　また本発明は、本発明の製造方法あるいはスクリーニング方法により得られたポリペプチドを含む医薬組成物に関する。本発明のポリペプチドまたは本発明の製造方法により製造されたポリペプチドあるいは本発明のスクリーニング方法により取得されたポリペプチドは、その投与により通常の抗体と比較して血漿中動態の改善、免疫原性の低減、溶液製剤とした際の溶解度の改善が可能であると考えられることから医薬組成物として有用である。本発明の医薬組成物は医薬的に許容される担体を含むことができる。
　本発明において医薬組成物とは、通常、疾患の治療もしくは予防、あるいは検査・診断のための薬剤を言う。
　本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定する。
　注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙げられる。適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80（TM）、HCO-50等）を併用してもよい。
　油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル及び／またはベンジルアルコールを併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコール及びフェノール）、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填する。
　本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
　投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。本発明のポリペプチドを含有する医薬組成物の投与量は、例えば、一回につき体重1 kgあたり0.0001 mg～1000 mgの範囲に設定することが可能である。または、例えば、患者あたり0.001～100000 mgの投与量とすることもできるが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量及び投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量及び投与方法を設定することが可能である。本発明の医薬組成物は、血漿中動態を改善させるため、免疫原性を低減させるため、または溶液製剤とした際の溶解度を改善させるために用いられる医薬組成物であることができる。
　また本発明は、本発明のポリぺプチド、本発明の製造方法により製造されたポリペプチドまたは上記本発明の医薬組成物を対象へ投与することによる、血漿中動態を改善する方法、または免疫原性を低減する方法に関する。投与は、in vivoあるいはin vitroのどちらで行われてもよい。投与対象としては、例えば非ヒト動物（マウス、サルなど）、あるいはヒトなどを挙げることができる。
　なお、本発明で記載されているアミノ酸配列に含まれるアミノ酸は翻訳後に修飾（例えば、N末端のグルタミンのピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾は当業者によく知られた修飾である）を受ける場合もあるが、そのようにアミノ酸が翻訳後修飾された場合であっても当然のことながら本発明で記載されているアミノ酸配列に含まれる。
　なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕細胞外マトリックス結合と正常マウス血漿中薬物動態の関連評価
　MabA1、A2、A3は血液凝固第IX因子および/または活性化血液凝固第IX因子、並びに、血液凝固第X因子を標的抗原として特異的な結合を示し、血液凝固第VIII因子様凝固活性を発揮する二重特異性抗体であり、これらの抗体は、WO2005/035756およびWO2006/109592に記載の方法を用いて、当業者公知の抗体取得技術から、当該標的抗原への結合および凝固活性を指標にしたスクリーニングを行い、さらに血液凝固第VIII因子様凝固活性を向上させるアミノ酸改変を加えることによって取得されたIgG抗体である。
　MabA1、A2、A3の血漿中滞留性を比較するために、これら抗体のマウスにおける薬物動態の評価を行った。
　MabA1、A2、A3を正常マウス（C57BL/6J、日本チャールズリバー）に1 mg/kgで単回投与し、適時採血を行った。採取した血液は直ちに4℃、15,000 rpmで15分間遠心分離し、血漿を得た。分離した血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存した。
　マウス血漿中濃度測定はELISA法にて測定した。まずAnti-Human IgG(γ)を96well plateに分注し、4℃でオーバーナイトで静置し、Anti-Human IgG(γ)固相化プレートを作成した。検量線試料とマウス血漿測定試料を調製し、Anti-Human IgG(γ)固相化プレートに分注し室温で1時間静置した。その後Anti-human IgG-AP (SIGMA社製)を反応させ、BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System(Kirkegaard & Perry Laboratories社製)を基質として用い発色反応を行い、マイクロプレートリーダーにて650 nmの吸光度を測定した。マウス血漿中濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO（Molecular Devices社製）を用いて算出した。
　MabA1、A2、A3の正常マウスにおける血漿中半減期はそれぞれ17.1日、6.1日、1.9日と大きく異なることが分った。そこで、この血漿中滞留性（血漿中半減期）の違いの原因として、非特異的な細胞外マトリックスへの結合が考えられた。すなわち細胞外マトリックスに結合性を示す抗体は、血漿中で生体内の細胞外マトリックスに結合することで消失が早くなることが考えられた。
　そこで、MabA1、A2、A3の細胞外マトリックスへの結合性の評価を行った。抗体の細胞外マトリックス結合を、ELISA法により測定した。細胞外マトリックス固定化プレート（マトリゲルマトリックス薄層　96ウェル/BD社製）に、ブロッキング溶液[TBS(TaKaRa), 10% FCS(Low IgG/GIBCO社製), 0.05% NaN3]を分注し、ブロッキングを行った。ブロッキング溶液を除去した細胞膜マトリックス固定化プレートに、各種抗体をブロッキング溶液にて希釈した試料を分注し、室温で1時間静置し、細胞外マトリックスと各種抗体の結合反応を行った。各種抗体試料をプレートから除き、リンスバッファ[Dulbecco's PBS（Nissui）, 0.05% Tween20]によって3回プレートを洗浄し、Goat Anti-human IgG-HRP(Zymed-Invitrogen社製)を室温で1時間反応させた。反応後のプレートを、リンスバッファで5回洗浄し、ABTS Microwell Peroxidase Substrate (2-Component System / KPL社製)を基質として発色反応を行った。1M H2SO4溶液を添加して反応を終了し、マイクロプレートリーダーにて405 nmの吸光度を測定した。
　MabA1、A2、A3の細胞外マトリックス結合及び血漿中半減期（T1/2）をプロットしたものを図１に示した。その結果、細胞外マトリックス結合能が小さい抗体は、血漿中抗体濃度が高く維持され、血漿中半減期が長く、すなわち薬物動態が優れていることが判明した。本結果より、細胞外マトリックス結合及び血漿中半減期（T1/2）は相関を示し、細胞外マトリックス結合測定は血漿中薬物動態を予測するために適した方法であり、細胞外マトリックス結合能を低減させることで抗体の血漿中薬物動態（血漿中半減期）を改善することが可能であることが示唆された。
〔実施例２〕細胞外マトリックス結合検出の高感度化とアミノ酸置換によるMabB1の血漿中滞留性の向上
　MabB1は、実施例１と同様の方法で、当業者公知の方法により、血液凝固第IX因子および/または活性化血液凝固第IX因子、並びに、血液凝固第X因子双方の標的抗原への結合および血液凝固第VIII因子様凝固活性を指標にしたスクリーニングを行うことによって取得した抗体に対して、血液凝固第VIII因子様凝固活性を向上させるアミノ酸置換を行い作製したIgG抗体である。MabB1は血漿中半減期が非常に短く、MabB1を医薬品として開発するうえで短い血漿中半減期は投与量の増大と投与間隔の短縮につながるため大きな課題である。MabB1の細胞外マトリックスに対する結合を評価した結果、MabB1は細胞外マトリックスに強く結合することが確認され、血漿中半減期が短いのは細胞外マトリックスへの非特異的な結合が原因と考えられた。そこで、細胞外マトリックスへの非特異的な結合を低減させることによりMabB1の血漿中薬物動態を改善することを検討した。
　MabB1は高い細胞外マトリックス結合能を有していたため、MabB1に当業者公知の方法で抗体可変領域に存在する表面に露出している残基にアミノ酸置換を導入した各種改変MabB1抗体を作製し、細胞外マトリックスに対する結合のスクリーニングを実施した。各種改変MabB1抗体のうち細胞外マトリックス結合能を低減させたMabB2およびMabB3を取得した。
　抗体の細胞外マトリックス結合を、上記の発色ELISA法で測定した結果を、図２に示した。MabB1においては、強い細胞外マトリックス結合への結合が認められたが、アミノ酸置換を導入したMabB2とMabB3は細胞外マトリックス結合への結合が認められなくなった。
　そこで、各抗体（MabB1～B3）の正常マウスにおける薬物動態を実施例１に示した方法で評価した結果を、図３（静脈内投与）および図４（皮下投与）に示した。その結果、MabB1と比較して、MabB2およびMabB3は静脈内投与と皮下投与の両方において血漿中滞留性が向上し、実際に抗体の細胞外マトリックス結合能を低減させることで、抗体の血漿中滞留性を向上することが可能であることが確認された。しかしながら、MabB2と比較してMabB3のほうが、血漿中滞留性が優れていたことから、MabB2は依然として細胞外マトリックス結合能を有している可能性が示唆された。
　MabB2の細胞外マトリックス結合能はELISA法では認められなかったことから、ELISAによる評価系の検出感度では不足であると考えられた。そこで以下に示すECL（電気化学発光法）を用いて高感度に細胞外マトリックス結合を評価する方法を試みた。抗体の細胞外マトリックス結合能をより高感度に検出するためにECLを用いた評価系を確立した。TBS（Takara）,0.015% Trition-X100溶液を用いて、細胞外マトリックス（BDマトリゲル基底膜マトリックス/ BD社製）を5 mg/mLに希釈した。希釈した細胞外マトリックスをMULTI-ARRAY PR Plate , Uncoated （MSD社製）に分注し、4℃で一晩固定化した。その後、Dulbecco’s PBS（Nissui）, 0.05% Tween20, 0.5% BSA, 0.01% NaN3溶液を分注し、ブロッキングした。Goat anti-human IgG （gamma）（Zymed Laboratories）をSulfo-Tag NHS Ester 150 nmol（MSD社製）を用いてSulfo-Tag化した。各種抗体とSulfo-Tag化Goat anti-human IgGをよく混合し、室温で1時間程度インキュベートした。ブロッキング溶液を除去した細胞外マトリックス固定化プレートにこの試料を分注し、室温で2時間振盪した。その後、MSD Read Buffer T（4x）（MSD社製）を添加し、SECTOR PR400にて発光量を測定した。抗体（MabB2・MabB3）の細胞外マトリックス結合を上記の方法で測定した結果を図５に示した。ELISAでは、MabB2の細胞外マトリックス結合を検出できていなかったが（図２）、ECLを用いた高感度系ではMabB2の細胞外マトリックス結合を確認することができた。すなわち、ECLを用いることで、MabB1、MabB2、MabB3の3者の細胞外マトリックス結合とそれらの血漿中滞留性が相関することが示された。
　これより、抗体にアミノ酸置換等の改変を導入した抗体を、ECLを用いた高感度細胞外マトリックス結合評価系を用いてスクリーニングすることで、血漿中薬物動態が改善された抗体を取得することが可能であることが見出された。
〔実施例３〕細胞外マトリックス結合低減によるMabC9の血漿中滞留性の向上
　MabC9は、実施例１と同様の方法で、当業者公知の方法により、血液凝固第IX因子および/または活性化血液凝固第IX因子、並びに、血液凝固第X因子双方の標的抗原への結合および血液凝固第VIII因子様凝固活性を指標にしたスクリーニングを行うことによって取得した抗体に対して、血液凝固第VIII因子様凝固活性を向上させるアミノ酸置換を行い作製したIgG抗体である。MabC9は血漿中半減期が非常に短いことが分っていたため、MabC9の血漿中薬物動態を改善することを検討した。その結果、MabC9は細胞外マトリックスに強く結合することが確認され、血漿中半減期が短いのは細胞外マトリックスへの非特異的な結合が原因と考えられた。
　MabC9は高い細胞外マトリックス結合能を有していたため、MabC9に当業者公知の方法で抗体可変領域に存在する表面に露出している残基にアミノ酸置換を導入した各種改変MabC9抗体を作製し、細胞外マトリックスに対する結合のスクリーニングを実施した。各種改変MabC9抗体のうち細胞外マトリックス結合能を低減させたMabC8およびMabC7を取得した。MabC9、MabC8、MabC7をヒトFcRnトランスジェニックマウス(B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg line 276 +/+ マウス、Jackson Laboratories)に1 mg/kgで静脈内投与し血漿中薬物動態を評価した。その結果、図６に示したとおり、細胞外マトリックス結合能を低減させたMabC8およびMabC7はMabC9と比較して血漿中半減期が大幅に延長し、薬物動態が改善できていることが分った。
　これより、抗体にアミノ酸置換等の改変を導入して細胞外マトリックス結合能を低減させることで、その抗体の血漿中薬物動態を改善することが可能であることが見出された。
〔実施例４〕細胞外マトリックス結合と免疫原性の関連評価
　MabC1～C6は、実施例１と同様の方法で、当業者公知の方法により、血液凝固第IX因子および/または活性化血液凝固第IX因子、並びに、血液凝固第X因子双方の標的抗原への結合および血液凝固第VIII因子様凝固活性を指標にしたスクリーニングを行うことによって取得した抗体に対して、血液凝固第VIII因子様凝固活性を向上させるアミノ酸置換を行い作製したIgG抗体である。MabC1～C6の細胞外マトリックスへの結合をECLにより評価した結果、これらの抗体の細胞外マトリックスへの結合の程度は抗体によって異なることが分った。細胞外マトリックスに結合する抗体は、標的抗原以外に対して非特異的な結合を示すため、抗原提示細胞に対しても結合する可能性がある。そのため、細胞外マトリックスに結合する抗体は、抗原提示細胞に取り込まれやすく、それにより抗原提示されやすくなると考えられ、免疫原性が高くなる可能性が考えられた。免疫原性はタンパク質医薬品の重要な課題であり、タンパク質医薬品の免疫原性は低いことが望ましい。
　そこで、細胞外マトリックス結合能が異なる各抗体（C1-C6）に対する免疫原性誘導リスクを検証するために、ボランティア新鮮血を用いたin vitro免疫原性リスク評価を実施した。24ウェルプレートにヒト新鮮血液より分離したCD8陰性CD25低陽性末梢血単核球細胞（CD8-CD25lowPBMCs）を播種し、37℃・5％CO2湿潤条件下で約2時間前培養した。前培養後、抗体を添加し、37℃・5％CO2湿潤条件下で培養した。培養6、7、8日目に回収した細胞を96ウェルプレートに撒きなおし、Bromodeoxyuridine (BrdU)を添加した。添加後約30時間にBrdUを取り込んだHelper T細胞についてフローサイトメトリーで解析した。Helper T細胞中のBrdU陽性細胞割合より、各抗体に対する増殖活性の程度を調べた。実験は複数のドナーで行い、各抗体がそれぞれ何％のドナーにおいて増殖活性を示したかを評価した。反応したドナーの割合が高いほど免疫原性が高いと考えられる。横軸に増殖活性を示したドナーの反応率を、縦軸に細胞外マトリックス結合をプロットしたものを図７に示した。
　その結果、各抗体の細胞外マトリックス結合と増殖活性を示したドナーの反応率は正の相関を示し、細胞外マトリックス結合活性が低い抗体ほど免疫原性が低く、細胞外マトリックス結合活性を低減させることで抗体の免疫原性を低減することが可能であることが示唆された。
〔実施例５〕細胞外マトリックス結合低減によるMabB2の免疫原性の低減
　実施例２で作製されたMabB2は、マウスに投与すると抗ＭabB2マウス抗体が短期間に産生されることから免疫原性が高いことが確認されている。実施例４において、細胞外マトリックス結合能が低い抗体ほど免疫原性が低く、細胞外マトリックス結合能を低減させることで抗体の免疫原性を低減することが可能であることが示唆されたことから、MabB2およびMabB3のマウスでの血漿中滞留性評価において、マウス血漿中抗MabB2抗体および抗MabB3抗体をECL免疫測定法にて検出した。まず抗体をEZ-LinkTM Sulfo-NFS-Biotinylation Kit (PIERCE社製) を用いてBiotin化、及びSulfo-Tag NHS Ester 150 nmol (MSD社製)を用いてsTag化した。マウス血漿測定試料、Biotin化抗体及びsTag化抗体を混和後、4℃で一晩静置した。この試料をMULTI-ARRAY(R) PR SA Plate(MSD社製) に分注し、室温で2時間振盪した。その後、MSD Read Buffer T (4x) (MSD社製) を添加し、SECTOR PR(R) 400にて発光量を測定した。横軸に経過時間（日）、縦軸に抗体価（ECL signal）をプロットしたものを図８に示した。細胞外マトリックス結合能を低減させたMabB3はMabB2と比較して抗体価が低く、免疫原性が低減されていることが確認された。
　これまで抗体の免疫原性を低減させる方法として、非ヒト抗体をヒト化する方法やT-cellエピトープを除く方法、および、会合体を低減させる方法が知られていたが、これより、抗体にアミノ酸置換等の改変を導入して細胞外マトリックス結合能を低減させることで、その抗体の免疫原性を低減することが可能であることが見出された。
〔実施例６〕細胞外マトリックス結合と溶解度の関連評価
　MabD1～D30は、実施例１と同様の方法で、当業者公知の方法により、血液凝固第IX因子および/または活性化血液凝固第IX因子、並びに、血液凝固第X因子双方の標的抗原への結合および血液凝固第VIII因子様凝固活性を指標にしたスクリーニングを行うことによって取得した抗体に対して、血液凝固第VIII因子様凝固活性を向上させるアミノ酸置換を行い作製したIgG抗体である。MabD1～D3の細胞外マトリックスへの結合をECLにより評価した結果、これらの抗体の細胞外マトリックスへの結合の程度は抗体によって異なることが分かった。タンパク質医薬品の溶液製剤を調製するためには、十分にそのタンパク質が高い溶解度を有している必要がある。タンパク質同士が自己会合化（凝集）しやすい場合は一般に溶解度が低いと考えられる。細胞外マトリックス結合する抗体は非特異的にタンパク質に結合しやすい性質を有していると考えられることから、溶解度も低くなる可能性が考えられた。溶解度はタンパク質医薬品の溶液製剤化に重要であり、タンパク質医薬品の溶解度は高いことが望ましい。
　そこで、MabD1～D30の細胞外マトリックスへの結合と溶解度の関係性を評価した。一般にタンパク質の溶解度の測定は大量のタンパク質を必要とするが、タンパク質の溶解度はポリエチレングリコール（PEG）存在下で大きく減少するが、一定濃度のPEG存在下におけるバッファー中の溶解度を測定することにより、少量のタンパク質で溶解度を測定することが可能である（Guiotto, A. et al. (2004) Bioorg. Med.Chem. 12, 5031-5037）。そこで、各種抗体（MabD1～MabD30）の溶解度の測定をPEG存在下で実施した。10 mM sodium phosphate, 50 mM NaCl, pH6溶液（バッファー溶液）および10 mM sodium phosphate, 50 mM NaCl, pH6, 10% PEG4000溶液（PEG溶液）95μLにそれぞれ濃度既知の各種抗体溶液5μLを添加し、よく混合した。室温で3時間程度インキュベート後、0.22μmフィルターを通じ、フィルター溶液70μLに50 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH7.0溶液70μLを添加し、2倍希釈した。希釈溶液100μLをゲルろ過クロマトグラフィーにより分析した。ゲルろ過クロマトグラフィーは以下の条件で実施した。
　　カラム：G3000SWxl (TOSOH)
　　移動相：50 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, pH7.0
　　流速：1.0 mL/min
　　検出波長：220 nm
　それぞれの抗体に関して、PEG溶液モノマーピーク面積およびバッファー溶液モノマー面積を算出した。それぞれの抗体のPEG存在下における溶解度を以下の計算方法により算出した。
　抗体溶液濃度（mg/mL）×PEG溶液モノマーピーク面積／バッファー溶液モノマー面積
　細胞外マトリックス結合を横軸にPEG存在下における溶解度を縦軸にプロットしたものを図９に示した。細胞外マトリックス結合と溶解度は高い相関を示し、細胞外マトリックス結合が高いほど溶解度が低いことが見出された。すなわち、細胞外マトリックス結合が低い抗体をスクリーニングすることで溶解度が高い抗体を取得することが出来ることが示された。
〔実施例７〕細胞外マトリックス結合低減によるMabD31の溶解度の改善
　MabD31は、実施例１と同様の方法で、当業者公知の方法により、血液凝固第IX因子および/または活性化血液凝固第IX因子、並びに、血液凝固第X因子双方の標的抗原への結合および血液凝固第VIII因子様凝固活性を指標にしたスクリーニングを行うことによって取得した抗体に対して、血液凝固第VIII因子様凝固活性を向上させるアミノ酸置換を行い作製したIgG抗体であり、溶解度が低いことが確認されている。実施例６において、細胞外マトリックス結合が低い抗体をスクリーニングすることで溶解度が高い抗体を取得することが出来ることが示されたことから、MabD31に対して、MabD31の抗体可変領域に存在する表面に露出している残基にアミノ酸置換を導入した各種改変MabD31抗体を作製し、細胞外マトリックスに対する結合のスクリーニングを実施した。MabD31の可変領域にアミノ酸置換を導入することで細胞外マトリックス結合を低減させたMabD32を作製した。MabD31とMabD32の溶解度を20 mM Histidine, 150 mM NaCl, pH6.0条件下において測定した結果、MabD31の溶解度は5.9 mg/mLであったのに対して、MabD32の溶解度は150 mg/mL以上であった。MabD31とMabD32の細胞外マトリックス結合と溶解度を図１０に示した。
　これより、細胞外マトリックス結合を低減させることで、その抗体の溶解度を改善できることが見出された。
　本発明では、ある目的の機能を有するポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合を低減することによって、当該ポリペプチドの物性を改善させる方法あるいは物性の改善されたポリペプチドの製造方法が提供された。特に、当該ポリペプチドの物性の改善として、血漿中動態の改善、免疫原性の低減、あるいは溶解度の改善が可能となり、医薬品としての利用に適したポリペプチドの提供が可能である。また、あらかじめ物性のわかっているポリペプチドの細胞外マトリックスに対する結合活性と被検ポリペプチドの細胞外マトリックスに対する結合活性を比較することで、当該被検ポリペプチドの物性を評価することが可能である。

Claims (24)

  1. 　細胞外マトリックスへの結合活性を低減させることによる、ポリペプチドの物性を改善させる方法。
  2. 　物性の改善が、血漿中動態の改善、免疫原性の低減および溶解度の改善から選ばれる少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
  3. 　細胞外マトリックスへの結合活性の低減が、ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を改変することによって細胞外マトリックスへの結合を低減させる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　細胞外マトリックスへの結合活性が電気化学発光法により測定される、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　ポリペプチドが、抗原結合活性を有するポリペプチドである、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体である、請求項５に記載の方法。
  7. 　物性の改善されたポリペプチドの製造方法であって、細胞外マトリックスへの結合活性が低減されるようにポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を改変する工程を含む製造方法。
  8. 　物性の改善されたポリペプチドの製造方法であって、該製造方法は、
    　(a)　ポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を改変する工程、
    　(b)　前記工程(a)で改変されたポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性を測定する工程、および、
    　(c)　細胞外マトリックスへの結合活性が改変前と比較して低減されたポリペプチドを選択する工程、
    を含む製造方法。
  9. 　さらに、
    　(d)　請求項８の工程(c)で選択されたポリペプチドをコードする遺伝子を得る工程、および、
    　(e)　前記工程(d)で得られた遺伝子を用いてポリペプチドを製造する工程、
    を含む、請求項８に記載の製造方法。
  10. 　さらに、
    　(f)　請求項９の工程(e)で得られたポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基を改変して、前記工程(b)～(e)を繰り返し実施する工程、
    を含む、請求項９に記載の製造方法。
  11. 　あらかじめ物性のわかっているポリペプチドを基準ポリペプチドとして、基準ポリペプチドより物性の優れたポリペプチドを製造する方法であって、該製造方法は、
    　(a)　基準ポリペプチドおよび、被検ポリペプチド又は被検ポリペプチドライブラリーを細胞外マトリックスに接触させる工程、
    　(b)　前記工程(a)で接触させたポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性を測定する工程、
    　(c)　前記工程(b)で測定されたポリペプチドの中から基準ポリペプチドより細胞外マトリックスへの結合活性が低いポリペプチドを選択する工程、
    　(d)　前記工程(c)で選択されたポリペプチドをコードする遺伝子を得る工程、および、
    　(e)　前記工程(d)で得られた遺伝子を用いてポリペプチドを製造する工程
    を含む製造方法。
  12. 　物性の改善が血漿中動態の改善、免疫原性の低減および溶解度の改善から選ばれる少なくとも１つである、請求項７～１１に記載の製造方法。
  13. 　細胞外マトリックスへの結合活性が電気化学発光法により測定される、請求項７～１２のいずれかに記載の製造方法。
  14. 　ポリペプチドが、抗原結合活性を有するポリペプチドである、請求項７～１３のいずれかに記載の製造方法。
  15. 　抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体である、請求項１４に記載の製造方法。
  16. 　請求項７～１５のいずれかに記載の製造方法によって製造されたポリペプチド。
  17. 　あらかじめ物性のわかっているポリペプチドを基準ポリペプチドとして、基準ポリペプチドより物性の優れたポリペプチドのスクリーニング方法であって、該方法は、
    　(a)　基準ポリペプチドおよび、被検ポリペプチド又は被検ポリペプチドライブラリーを細胞外マトリックスに接触させる工程、
    　(b)　前記工程(a)で接触させたポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性を測定する工程、および、
    　(c)　前記工程(b)で測定されたポリペプチドの中から基準ポリペプチドより細胞外マトリックスへの結合活性が低いポリペプチドを選択する工程
    を含む、方法。
  18. 　物性の改善が血漿中動態の改善、免疫原性の低減および溶解度の改善から選ばれる少なくとも１つである、請求項１７に記載のスクリーニング方法。
  19. 　細胞外マトリックスへの結合活性が電気化学発光法により測定される、請求項１７または１８に記載のスクリーニング方法。
  20. 　ポリペプチドが、抗原結合活性を有するポリペプチドである、請求項１７～１９のいずれかに記載のスクリーニング方法。
  21. 　抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体である、請求項２０に記載のスクリーニング方法。
  22. 　被検ポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性を測定し、あらかじめ物性がわかっている他のポリペプチドの細胞外マトリックスへの結合活性と比較することにより、被検ポリペプチドの物性を評価する方法。
  23. 　物性がポリペプチドの血漿中動態、免疫原性および溶解度から選ばれる少なくとも１つである、請求項２２に記載の方法。
  24. 　細胞外マトリックスへの結合活性の測定が電気化学発光法による測定である、請求項２２または２３に記載の方法。
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