WO2012088885A1 - 枳实或枳壳总黄酮提取物及其用途 - Google Patents

Description

枳实或枳壳总黄酮提取物及其用途 狱领域

本发明涉及一种枳实或枳壳总黄酮提取物及其制备方法和用途。 背景狱

功能性消化不良（FD)是一种常见、 多发病。 又称为胃动力不足， 或胃动力 障碍。是一种常见的临床综合症， 国外统计资料表明， 1/3人群患过 FD, 占门诊 人数的 20%〜30%。 国内占消化系门诊患者 50 %左右， 发生于 20 %〜40 %的正 常人群。 另外， 80%以上的肿瘤患者化疗后会引起呕吐， 止呕主要以灭吐灵、枢 复宁等药物为主， 但化药止呕伴有倦怠、头暈、头痛， 甚至有可能出现颈背肌肉 痉挛症状。 目前西医治疗主要以吗叮啉、西沙必利、莫沙必利等为主；但随其大量使用， 发现有明显心脏毒副作用， 不少患者在应用西沙必利后出现 Q-T 间期延长及心 律失常， 特别是尖端扭转型室速等严重不良反应， 甚至导致死亡。 为此， 美国食 品与药品管理局决定于 -2000年 7月 23日起停止使用该药，我国药品监督管理局 也对西沙必利的使用做出了限定， 但仍可在医师指导下应用。

中医治疗以破气消积， 化痰散痞类中药； 治疗积滞内停， 痞满胀痛等， 枳实 为代表药之一。枳实、枳壳为芸香科植物酸橙

awranft'w L. 及其栽培变种 或甜橙 C¾ « m^ Osbeckr的干燥幼果或未成熟果实。枳实、枳壳从《神农本 草经》、 《名医别录》记载： "除胸胁痰癖， 逐停水， 破结实， 消胀满"、 从金代医 学家李东垣《内外伤辨惑论》中首创枳实导滞丸以手工制作， 到目前临床配方应 用及现代中药规模化生产并用于消化道疾病， 前后有近二千年的历史； 枳实、枳 壳主要成分为黄酮等，其水煎液及橙皮苷等能显著增强正常小鼠和阿托品产生小 鼠抑制模型的小肠的推进运动， 具有促胃肠动力的作用。但枳实、枳壳仅少量用 于临床配方及中成药制剂，大量资源没有得到广泛应用，其天然的破气消积作用 可能与现代促进胃动力药的作用类同性没有得到充分挖掘。 发明内容

本发明的目的是提供一种枳实或枳壳总黄酮提取物，用于胃肠运动障碍型功 能性消化不良； 上腹疼痛、 腹胀、 厌食、 嗳气、 恶心、 呕吐及化疗药物或其他原 因引起的呕吐。

本发明提供的枳实或枳壳总黄酮提取物， 通过枳实或枳壳提取得到， 取枳实 或枳壳切成饮片或粉碎， 再用水煎煮提取或乙醇回流提取，

其中水煎煮提取方法是： 加 4~15倍量水， 煎煮 1~3次， 每次煎煮提取 . 1~3 小时，合并煎煮液，滤过，滤液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、.20% 以下的乙醇洗脱除去杂质， 再用 25~%90°/。乙醇、 0.5~2%氢氧化钠洗脱， 洗脱， 收集乙醇洗脱液， 减压浓縮至相对密度约 1.20~1.40 (50°C~70°C ) 的流浸膏， 减 压干燥， 干燥的温度为 60~80°C， 粉碎， 即得； ，

其中乙醇回流提取方法是:加 ₅~₁₆倍体积的 30%~90%乙醇回流提取 1~3次， 每次回流提取 1~3小时， 滤过； 合并滤液， 滤液回收乙醇， 水溶液通过已处理好 的非极性大孔树脂， 依次用水、 20%以下的乙醇洗脱除去杂质， 再用 25%~90% 乙醇、 0.5~2%氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约 L20~1.40 (50°C~70°C ) 的流浸膏， 减压干燥， 干燥的温度为 60~80Ό.， 粉碎， 即得。

优选的， 具体的水煎煮提取方法如下： 取枳实或枳壳， 粉碎， 通过 8目筛， 加水煎煮— 3次， 第一次加 8倍量水煮 2小时， 第二、 三次分别加 6、 4倍量煎煮 1小时， 滤过， 合并滤液， 滤液通过已处理好的 D101大孔树脂柱， 依次用水、 15%乙醇、 45%乙醇、 1%氢氧化钠洗脱， 收集 45%乙醇洗脱液， 减压浓縮至相 对密度约 1.30 (60°C ) 的流浸膏， 减压干燥， 干燥的温度为 75°C， 粉碎， 即得。

优选的， 具体的乙醇回流提取方法如下： 取枳实或枳壳， 切成饮片， 加 7 倍体积的 65%乙醇回流提取 2次， 每次回流提取 2小时， 滤过； 合并滤液， 滤液 回收乙醇，水溶液通过已处理好的 D101大孔树脂柱，依次用水、 15%乙醇、 45% 乙醇、 1%氢氧化钠洗脱， 收集 45%乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.30 (60'C ) 的流浸膏， 减压干燥， 干燥的温度为 75'C , 粉碎， 即得。

优选的，其中 15%乙醇部分洗脱体积为每 1ml树脂用 3ml洗脱， 45%乙醇洗 脱时选择每 1ml树脂用 4ml洗脱。

优选的， 其中提取物总黄酮含量.50%以上。 优选的， 其中提取物总黄酮含量 80%以上。

优选的，其中还包含黄酮类化学成分及其医学上可以接受的酚酸类成分，黄 酮类化学成分含柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、 新柚皮苷、野漆树苷及其苷或苷元 中的一种或多种。

优选的， 其中含柚皮苷含量、 新橙皮苷含量分别达 25%以上。

优选的， 其中大孔树脂上样量按树脂体积 (ml): 生药质量 (_g)为 5:1。

优选的， 其中每 iml树脂的上样流速在 1.25~1.55ml/h之间。

优选的， 其中每 lml树脂的洗脱流速为 1.25〜1.45ml/h之间， 所述非极性大 孔树脂径高比为 1:10， 上样后药液的静态吸附时间为 1小时。

另外，本发明还提供了枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗胃肠运动障碍 型功能性消化不良疾病药物的用途。

另一方面，本发明还提供了枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗化疗药物 或其他原因引起的呕吐疾病药物的用途。

另一方面，本发明还提供了枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗呕吐及化 疗药物或其他原因引起的呕吐疾病药物的用途。

另一方面，本发明还提供了枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗上腹疼痛 疾病药物的用途。

另一方面，本发明还提供了枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗腹胀、厌 食、 嗳气疾病药物的用途。

另一方面，本发明还提供了枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗恶心疾病 药物的用途。

最后，本发明还提供了一种枳实或枳壳总黄酮提取物制剂， 该制剂以所述的 枳实或枳壳总黄酮提取物为主要活性成分。

实验数据证明，本发明水煎煮提取或乙醇回流提取获得的枳实或枳壳总黄酮 提取物， 可用于治疗胃肠运动障碍型功能性消化不良； 上腹疼痛、 腹胀、 厌食、 嗳气、 恶心、 呕吐及化疗药物或其他原因引起的呕吐。

更重要地是，发明水煎煮提取或乙醇回流提取获得的枳实或枳壳总黄酮提取 物除具有显著的促进胃动力作用外，还对顺铂等药物所致的呕吐极其有效， 具有 吗叮啉所没有的效果。 同时又没有西沙必利、莫沙必利的心脏毒副作用， 能彻底 P T/CN2011/078014 避免西沙必利、 莫沙必利导致的心脏安全性风险。

： 而医学和药学研究人员无法预先在不做实验的前提下，预先得知发明水煎煮 提取或乙醇回流提取获得的枳实或枳壳总黄酮提取物具有上述良好的效果。

综上所述，本发明水煎煮提取或乙醇回流提取获得的枳实或枳壳总黄酮提取 物及其用途带来显著的技术效果。 具体^ fe^

实施例 1

制备方法： 取枳实或枳壳， 切成饮片， 加 7倍量水， 煎煮 3次， 每次煎煮提 取 1小时，合并煎煮液， 滤过，滤液通过已处理好的 D101大孔树脂， 依次用水、 18%乙醇洗脱除去杂质， 再用 35%乙醇、 0.5%氢氧化钠洗脱， 收集 35%乙醇洗脱 液， 减压浓缩至相对密度约 1.25 (55'C ) 的流浸膏， 减压干燥 C60V ), 粉碎， 即得。

实施例 2

制备方法： 取枳实或枳壳， 粉碎， 通过 8目筛， 加水煎煮 3次， 第一次加 8 倍量水煮 2:5小时， 第二、 三次分别加 6、 5倍量煎煮 1小时， 滤过， 合并滤液， 滤液通过已处理好的 AB-8大孔树脂柱， 依次用水、 15%乙醇、 45%乙醇、 1%氢 氧化钠洗脱， 收集 45%乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.31 (65°C ) 的流 浸膏， 减压干燥（70'C )， 粉碎， 即得。

实施例 3

制备方法： 取枳实或枳壳， 切成饮片， 加 8倍量水， 煎煮 3次， 每次煎煮提 取 1.5小时， 合并煎煮液， 滤过， 滤液通过已处理好的 D101大孔树脂， 依次用 水、 16%乙醇洗脱除去杂质， 再用 40%乙醇、 0.6%氢氧化钠洗脱， 收集 40%乙醇 洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.20 (50°C ) 的流浸膏， 减压干燥 （65°C )， 粉 碎， 即得。

实施例 4

制备方法： 取枳实或枳壳， 切成饮片， 加 9倍量水， 煎煮 2次， 每次煎煮提 取 2小时， 合并煎煮液， 滤过， 滤液通过已处理好的 D101大孔树脂， 依次用水、 15%乙醇洗脱除去杂质， 再用 45%乙醇、 0.7%氢氧化钠洗脱， 收集 45%乙醇洗脱. 78014 液， 减压浓缩至相对密度约 1.25 (55°C ) 的流浸膏， 减压干燥 （65°C )， 粉碎， 即得。 ' ： ，

实施例 5 ·, · · . . .

制备方法： 取枳实或枳壳， 粉碎， 通过 8目筛， 加水煎煮.2次， 第一次加 8 倍量水煮 2小时， 第二、 三次分别加 7倍量煎煮 1小时， 滤过， 合并滤液， 滤 液通过已处理好的 D101大孔树脂柱， 依次用水、 14%乙醇、 40%乙醇、，0.9%氢. 氧化钠洗脱， 收集 40%乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.32 (70°C ) 的流' 浸膏， 减压干燥 （70°C )， 粉碎， 即得。

实施例 6

制备方法： 取枳实或枳壳， 粉碎， 通过 8目筛， 加水煎煮 3次， 第一次加 8 倍量水煮 2小时， 第二、三次分别加 7、 6倍量煎煮 1.0小时， 滤过， 合并滤液， 滤液通过已处理好的 AB-8大孔树脂柱， 依次用水、 16%乙醇、 45%乙醇、 1.1% 氢氧化钠洗脱， 收集 45%乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.29 (60°C ) 的 流浸膏， 减压千燥 （75°C )， 粉碎， 即得。

实施例 7

制备方法： 取枳实或枳壳， 粉碎， 加 10倍量水， 煎煮 3次， 每次煎煮提取 1小时， 合并煎煮液， 滤过， 滤液通过已处理好的 AB-8大孔树脂， 依次用水、 14%乙醇洗脱除去杂质， 再用 50%乙醇、 ^: 0.8%氢氧化钠洗脱， 收集 50%乙醇洗脱 液， 减压浓缩至相对密度约 1.30 (55°C ) 的流浸膏， 减压干燥 （65°C )， 粉碎， 即得。

实施例 8

制备方法： 取枳实或枳壳， 粉碎， 通过 8目筛， 加水煎煮 3次， 第一次加 8 倍量水煮 1.5小时， 第二、三次分别加 6倍量煎煮 1小时， 滤过， 合并滤液， 滤 液通过已处理好的 D101大孔树脂柱， 依次用水、 12%乙醇、 45%乙醇、 0.8%氢 氧化钠洗脱， 收集 45%乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.30 ( 60°C ) 的流 浸膏， 减压干燥（75°C )， 粉碎， 即得。

实施例 9

制备方法： 取枳实或枳壳， 粉碎， 加 11倍量水， 煎煮 2次， 每次煎煮提取 1.5小时， 合并煎煮液， 滤过， 滤液通过已处理好的 AB-8大孔树脂， 依次用水、 13%乙醇洗脱除去杂质， 再用 55%乙醇、 0.9%氢氧化钠洗脱， 收集 55%乙醇洗脱 液， 减压浓缩至相对密度约 1.30 (60°C ) 的流浸膏， 减压干燥 （70°C )， 粉碎， . 即得。

实施例 10

制备方法： 取枳实或枳壳， 粉碎， 通过 S目筛， 加水煎煮 2次， 第一次加 8 倍量水煮 2小时， 第二、 三次分别加 6、 5倍量煎煮 1.5小时， 滤过， 合并滤液，: 滤液通过已处理好的 D101大孔树脂柱， 依次用水、 15%乙醇、 45%乙醇、 1%氢 氧化钠洗脱， 收集 45%乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.30 ( 60°C ) 的流 浸膏， 减压干燥（75°C ), 粉碎， 即得。 实施例 11

实施例 11

制备方法： 取枳实或枳壳， 粉碎， 通过 8目筛， 加水煎煮 3次， 第一次加 8 倍量水煮 2小时， 第二、 三次分别加 6、 4倍量煎煮 1小时， 滤过， 合并滤液， 滤液通过己处理好的 D101大孔树脂柱， 依次用水、 15%乙醇、 45%乙醇、 1%氢 氧化钠洗脱， 收集 45%乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.30 ( 60°C ) 的流 浸膏， 减压干燥（75°C )， 粉碎， 即得。 .

实施例 12

制备方法： 取枳实或枳壳， 切成饮片， 加 10倍体积的 35%乙醇回流提取 3 次， 每次回流提取 1.5小时， 滤过； 合并滤液， 滤液回收乙醇， 水溶液通过已处 理好的 AB-8大孔树脂，依次用水、 18%乙醇洗脱除去杂质，再用 37%乙醇、 0.5% 氢氧化钠洗脱， 收集 37%乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.22 (50°C )的流 浸膏， 减压干燥（63 °C )， 粉碎， 即得。

实施例 13

制备方法： 取枳实或枳壳， 切成饮片， 加 6倍体积的 56%乙醇回流提取 3 次， 每次回流提取 1小时， 滤过； 合并滤液， 滤液回收乙醇， 水溶液通1已处理 好的 D101大孔树脂， 依次用水、 16%乙醇洗脱除去杂质， 再用 35%乙醇、 0.7% 氢氧化钠洗脱， 收集 35%乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.20 (55°C )的流 浸膏， 减压干燥（60°C )， 粉碎， 即得。

实施例 14

制备方法： 取枳实或枳壳， 切成饮片， 加 11倍体积的 40%乙醇回流提取 2 次， 每次回流提取 1小时， 滤过； 合并滤液， 滤液回收乙醇， 水溶液通过已处理 好的 D101大孔树脂， 依次用水、 14%乙醇洗脱除去杂质， 再用 40%乙醇、 0.8% 氢氧化钠洗脱， 收集 40%乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.23 (55°C )的流: 浸膏， 减压干燥 （65°C )， 粉碎， 即得。

实施例 .15

·'· 制备方法:.取枳实或枳壳，.切成饮片， 加 5^:倍体积的 45%乙醇回流提取 3 次， 每次回流提取 1小时， 滤过； 合并滤液， 滤液回收乙醇， 水溶液通过已处理 好的 D101大孔树脂， 依次用水、 15%乙醇洗脱除去杂质， 再用 35%乙醇、 0.6% 氢氧化钠洗脱， 收集 35%乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.20 (60°C )的流 浸膏， 减压干燥 （70Ό ), 粉碎， 即得。

实施例 16

制备方法： 取枳实或枳壳， 切成饮片， 加 12倍体积的 55%乙醇回流提取 .2 次， 每次回流提取 2小时， 滤过； 合并滤液， 滤液回收乙醇， 水溶液通过已处理 好的 AB-8大孔树脂， 依次用水、 10%乙醇洗脱除去杂质， 再用 45%乙醇、 0.8% 氢氧化钠洗脱， 收集 45%乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.22 (58°C )的流 浸膏， 减压干燥（65'C )， 粉碎， 即得。

实施例 17

制备方法： 取枳实或枳壳， 切成饮片， 加 7倍体积的 50%乙醇回流提取 2 次， 每次回流提取 2小时， 滤过； 合并滤液， 滤液回收乙醇， 水溶液通过已处理 好的 D101大孔树脂， 依次用水、 15%乙醇洗脱除去杂质， 再用 45%乙醇、 1.1% 氢氧化钠洗脱， 收集 45%乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.25 ( 55°C )的流 浸膏， 减压干燥（65°C )， 粉碎， 即得。

实施例 18

制备方法： 取枳实或枳壳， 粉碎， 加 8倍体积的 60%乙醇回流提取 .2次， 每 次回流提取 2.5小时， 滤过； 合并滤液， 滤液回收乙醇， 水溶液通过已处理好的 AB-8大孔树脂， 依次用水、 9%乙醇洗脱除去杂质， 再用 42%乙醇、 0.8%氢氧化 钠洗脱， 收集 42%乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.30 (50°C ) 的流浸膏， 减压干燥 （65'C )， 粉碎， 即得。

实施例 19 T N2011/078014 制备方法： 取枳实或枳壳， 粉碎， 加 8倍体积的 60%乙醇回流提取 2次， 每 次回流提取.2.5小时， 滤过； 合并滤液， 滤液回收乙醇， 水溶液通过已处理好的 AB-8大孔树脂， 依次用水、 14%乙醇洗脱除去杂质， 再用 50%乙醇、 0.9%氢氧 化钠洗脱，收集 50%乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约 1.30 (55°C )的流浸膏， 减压千燥 （65°C )， 粉碎， 即得。

实施例 20 · · · ' '- ·

制备方法： 取枳实或枳壳， 粉碎， 加 9倍体积的 70%乙醇回流提取 2次， 每 次回流提取 2小时， 滤过; 合并滤液， 滤液回收乙醇， 水溶液通过已处理好的 AB-8大孔树脂， 依次用水、 8%乙醇洗脱除去杂质， 再用 45%乙醇、 0.9%氢氧化 钠洗脱， 收集 45%乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 l. (55°C ) 的流浸膏， 减压千燥（70°C )， 粉碎， 即得。

实施例 21

制备方法： 取枳实或枳壳， 粉碎， 加 9倍体积的 65%乙醇回流提取 2次， 每 次回流提取 2 小时， 滤过； 合并滤液， 滤液回收乙醇， 水溶液通过已处理好的 AB-8大孔树脂， 依次用水、. 15%乙醇洗脱除去杂质， 再用 45%乙醇、 0.9%氢氧 化钠洗脱，收集 45%乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约 1.30 (60°C )的流浸膏， 减压干燥（70°C )， 粉碎， 即得。

实施例 22

取枳实或枳壳， 切成饮片， 加 7倍体积的 65%乙醇回流提取 3次， 每次回流 提取 1.5小时， 滤过； 合并滤液， 滤液回收乙醇， 水溶液通过已处理好的 D101 大孔树脂柱， 依次用水、 15%乙醇、 40%乙醇、 1%氢氧化钠洗脱， 收集 40%乙醇 洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.30 (60°C ) 的流浸膏， 减压干燥 （75°C ), 粉 碎， 即得。

实施例 23

取枳实或枳壳， 切成饮片，加 7倍体积的 65%乙醇回流提取 2次， 每次回流 提取 2小时， 滤过； 合并滤液， 滤液回收乙醇， 水溶液通过已处理好的 D101大 孔树脂柱， 依次用水、 15%乙醇、 45%乙醇、 1%氢氧化钠洗脱， 收集 45%乙醇洗 脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.30 (60°C ) 的流浸膏， 减压干燥（75°C )， 粉碎， 即得。 水煎煮提取旅的研究与鎌聽

实验数据 1 : 提取工艺优化研究

黄酮苷类化合物一般易溶于热水、 甲醇、 乙醇、 吡啶及稀碱溶液中.， 而难溶 或不溶于苯、 乙醚、 氯仿、石油醚等有机溶剂中。枳实中的主要活性成分是以柚 皮苷和新橙皮苷为代表的二氢黄酮类成分，这些二氢黄酮的极性比一般的黄酮类 成分都大， 可溶于水; 低浓度乙醇中， 易溶于热水或热的稀乙醇溶液。 . 根据药材中所含主要化学成分的理化性质， 参考有关文献， 同时结合预试验 结果， 采用水煎煮， 煎煮液上大孔树脂纯化的方法。

考察指标分别为得膏率、 总黄酮含量和总黄酮的转移率。

1. 提取工艺条件的优选

1.1提取溶剂的选择

将枳实药材粉碎过 8目筛，取 12份，分为 4组，每组平均三份，各自用水、 65%乙醇、 95%乙醇和饱和石灰水煎煮。 结果见表 1。 表 1 提取溶剂的选择

指标 ~~ ' ~ Ι Ι~ ~~ 总黄酮苷含量 ~总黄酮苷转移率 溶剂

水 48.50 34.63 90.40

65%乙醇 53.05 34.05 92.22

95%乙醇 34.82 44.35 83.11

碱水 54.92 29.75 87.94 结论： 由表 1 可知， 乙醇提取总黄酮转移率较低， 水提取总黄酮转移率达 90%以上， 但水低于 65%乙醇提取效果， 综合生产成本， 结合工业化生产实际情 况， 选择水为提取溶剂。

1.2药材粒度的选择

将粉碎好的枳实过筛， 各取饮片、 8目、 20目、 40目、 60目、 120目三份， 共 18份， 分别加水煎煮。 结果见表 2。 表 2药材粒度的选择

, 饮片 34.57 26.02 68.41

8目 53.70 32.49 93.90

20目 48.92 33.38 87.89

40目 45.71 31.17 76.68

60目 48.25 28.31 73.52

120目 52.12 27.40 76.86 结论： 由表 2中有关数据可知， 用水煎煮时， 药材的粒度有很大的差别， 并 不是药材颗粒越细越好， 其中以过 8目筛的得膏率和总黄酮苷的转移率最高，故 选择 8目作为药材最终的粉碎粒度。

1. 3正交试验法优选提取工艺

根据以上的实验结果， 现以煎煮过程中煎煮时间 （A)、 煎煮次数 （B )、 加 水量（C)、 煎煮前浸泡时间 （D ) 四项作为考察因素， 每一因素设三个水平， 按 L9 (3⁴ )正交表进行正交实验设计（表 3、 表 4)， 考察指标为得膏率和总黄酮苷 转移率。 表 3 因素水平表

因子 煎煮时间 (h) 煎煮次数 加水量 （倍〉 浸泡时间 (h) 水平^ A B c D

1 1 1 10 0

2 1.5 2 14 1

3 2 18 2 取枳实药材（8 目） 27份， 每组平均三份， 共九组， 按表 4 L9 ( 34 ) 正交 试验表设计试验。 结果见表 4。 表 4 L9 (3⁴ )正交试验表 总黄酮苷转移

A B C D

(%) 率（％) 得率移膏转率 1 1 1 1 1 42.34 72.94

2 1 2 2 2 47.98 81.44

3 1 3 3 3 50.46 91.18

4 2 1 2 3 42.24 75.85

5 2 2 3 1 49.16 85.86

6 2 1 2 44.14 78.93

7 3 1 3 2 44.37 82.04

8 3 2 1 3 42.45 73.69

9 n 2 1 50.03 85.13 al 140.78 128.95 128.93 141.53

Ka2 135.54 139.59 140.25 136.49

Ka3 136.85 144.63 143.99 135.15

Ra 5.24 15.68 15.06 6.38

Kcl 245.56 230.83 225.56 243.93

Kc2 240.64 240.99 242.42 242,41

Kc3 240.86 255.24 259.08 240.72

Rc 4.92 24.41 33.52 3.21

( 1 ) 直观分析： '

从得膏率 Ra最佳工艺： Bs Cs A! Di (B、 C为主要因素）

总黄酮苷转移率最佳工艺： BsG Ai D, (B、 C为主要因素）

(2 ) 方差分析

结果见表 5。

表 5 以总黄酮苷转移率为指标的方差分析 方差来源 离差平方和 自由度 方差 F值

A 5.15 2 2.57 3.0

B 100.24 2 50.12 58.3 *

C 187.27 2 93.63

误差 e(D) 1.72 2 0.86

l -0.05(2,2) =19.0 =99.0

(3 )结论： 直观分析可知， 煎煮次数（Β )及所用溶剂体积 （C )对煎煮效 果影响较大， 煎煮时间 （Α) 及浸泡时间 （D ) 对煎煮效果影响较小。 以转移率

- u - 为指标进行方差分析，表 5分析结果进一步验证了直观分析结论，即所设因素 C、 B依次对煎煮效果有较大影响。 由于因素 A对煎煮效果影响较小， 而第一煎药 液还没有完全渗入药材组织内部， 根据生产实际情况， 第一煎增加一小时， 由此 初步确定煎煮条件为： 加 18倍量水（与药材重量比）提 3次（8倍、 6倍、 4倍）， 煎煮时间分别为 2h、 lh、 lh' 药材不浸泡。

2. 验证试验

取枳实药材 （过 8目筛） 3份， 按正交试验选取的最佳提取工艺条件进行验 证试验， SP : 18倍量水 （8倍 /2h、 6倍 /lh、 4倍 /lh) 分别煎煮 3次， 药材不浸 泡。 结果见表 6。

验证试验测定结果

^\指标 总黄酮苷含量 总黄酮苷转移率％

得膏率(％)

验证^ (%) 转移率 平均转移率 RSD

1 51.41 34.53 95.54

2 51.84 33.14 92.46

J 52.16 33.17 93.12

结论：由表 6可知，按优选工艺水煎煮 3次，总黄酮苷已有 92%以上被煎出， 且三个样品总黄酮苷转移率较为一致 （RSD为 1.73%)， 结果显示最后确定的最 佳提取工艺是合理、 稳定的。 实验数据 2: 枳实总黄酮提取物的纯化研究

2.1分离纯化工艺考察

枳实药材用水提取后提出大量水溶性杂质，必须对水提液迸行进一步纯化处 理， 以提高黄酮类有效成分的含量， 水溶性杂质多为无机盐、 糖类、 果胶及蛋白 质类，而枳实中的活性成分为黄酮类化合物，根据黄酮类化物特性及目前我国常 用的分离纯化方法， 因此选择用大孔树脂来富集纯化该黄酮类成分。

首先通过初步上样量考察实验， 初步确定每 1000ml大孔树脂上样 5000ml 提取液， 即树脂体积： 生药质量为 4:1。

再进一步地，通过上样量考察，最终确定 1000ml的大孔树脂吸附 200g生药 作为最终的上样量 （即 0.2g生药 /ml树脂）。

之后，通过洗脱体积的考察，确定 15%乙醇部分洗脱体积确定为 3000ml (即 每 1 ml树脂用 3ml 15%乙醇洗脱）， 45%乙醇洗脱时选择用 4000ml (即 1ml树脂 用 4ml 45%乙醇洗脱）。

再进一步地， 通过上样流速的考察， 确定上样流速应选择在 1250ml/h~1550ml/h之间较好（即每 1ml树脂的上样流速在 1.25〜1.55ml/h之间）。

2.2正交优选大孔树脂优化工艺

根据以上的实验结果， 现以洗脱流速、 大孔树脂的径高比和上样后药液的 静态吸附时间三项作为考察因素， 每一因素设三个水平， 按 L9 ( 3⁴ ) 正交表进 行正交实验设计（表 7、 表 8 )， 考察指标为得膏率、 总黄酮苷的含量和总黄酮苷 转移率。

表 7 因素水平表

1 1250-1450 1 1 :5

2 1550-1750 3 1 :10

3 1850-2050 ■5 1 :20 取枳实药材 （过 8 目筛） 提取， 提取液均分为 9份， 每份 4000ml (相当于 200g生药） 药液共九份， 按表 8 L9 (3⁴ ) 上预先处理好的大孔树脂 （每根树脂 装 1000ml大孔树脂）， 分别用 4000ml的水、 3000ml 15%的乙醇、 4000ml 45%乙 醇和 3000ml 95%乙醇洗脱。 结果见表 8。

表 8 L9 ( 3⁴)正交试验表

2 1 2 2 2 21.35 85.07

3 1 3 3 21.70 81.87

4 2 1 2 21.01 80.74

5 2 2 j 1 21.02 79.71

6 2 1 2 21.28 80.09

7 3 1 3 2 20.73 79.05

8 3 2 1 20.98 78.25

9 3 3 2 1 20.99 78.66 得 Kal 64.37 63.06 63.58 63.33

膏 Ka2 63.31 63.35 63.35 63.36

率 Ka3 62.7 63.97 63.45 63.69

(^%) Ra 1.67 0.91 0.23 0.36

Kcl 250.74 243.59 242.14 242.17

移 Kc2 240.54 243.03 244.47 244.21

率 Kc3 235.96 240.62 240.63 240.86

(^%) Rc 14.78 2.97 3.84 3.35

( 1 ) 直观分析

根据 R值分析， 得膏率最佳.工艺： AiBsd (Α为主要因素） 根据 R值分 -析， 总黄酮苷转移率最佳工艺： Α,Β,Ο^ (A为主要因素）

(2 ) 方差分析

结果见表 9、 表 10。

表 9 以得膏率为指标的方差分析 方差来源 离差平方和 自由度 方差 F值 显著性

A 0.476 2 0.238 26.85

B 0.144 2 0.072 8.12 误差 (C+D) 0.035 4 0.009 表 10 以总黄酮苷转移率为指标的方差分析 方差来源 离差平方和 自由度 方差 F值 显著性

A 38.163 2 19.081 17.367 Δ

B 1.660 2 0.830 0.756

误差 (C+D) 4.395 4 1.099

F】-0.19(2,2)=9.00 Fl-0.05(2,2) =19.0

( 3 ),结论： 直观分析可知， 树脂的洗脱流速 （A) 为主要因素， 大孔树脂 的径高比 （C ) 和上样后药液的静态吸附时间 （B ) 影响较小。 再以得膏率和总 黄酮苷的转移率为指标进行方差分析，表 9、 10中分析结果进一步验证了直观分 析结论， 即所设因素 A对洗脱效果有较大影响。 由于总黄酮含量为本项目的主 要指标， 因此， 初步确定最佳条件为 A^!Cs即： 洗脱流速为 1250~1450ml/h (即 每 1ml树脂的洗脱流速为 1.25~1.45ml/h之间），径高比为 1 :10， 上样后药液的静 态吸附时间为 1小时。

2.3 验证试验及树脂使用次数试验

取枳实药材（过 8目筛）提取，提取液取为 13份，每份 4000ml (相当于 200g 生药）， 冷藏， 备用。

a. 取 1 份上样于 1000ml大孔树脂 （树脂柱径高比为 1 : 10)， 上样流速为 1400ml/h，静态吸附 1小时。依次用 4000ml的水、 3000ml 15%的乙醇、4000ml 45% 乙醇和 3000ml 95%乙醇洗脱以 1400ml/h的流速洗脱。收集 45%乙醇洗脱液进行 含量测定。 结果见表 11。

b.将 a用后的树脂以水洗至无醇味， 另取一份冰箱冷藏的样品上此树脂，· 按 a的步骤重复处理。 树脂依次进行下次吸附 （以下步骤同 a.b)。

均值 均值 均值

1 21.67 20.78 87.92 86.11 75.38 75.78

2 21.34 86.87 75.62

3 21.14 87.78 76.43

4 20.69 85.71 76.97 5 21.34 86.65 75.44

6 20.82 84.29 75.22

7 19.87 82.07 76.74

8 19.36 78.63 75.46

9 16.61 49.51 55.38

10 15.36 40.87 49.44

结论： 从表 11中可以看出按最佳工艺所进行的验证试验， 重复 8次所得的 样品总黄酮苷含量和总黄酮苷转移率均有所提高。且样品的各项指标均一，稳定， 说明此工艺最佳、 稳定的。 同时在使用 8次以后需要对树脂进行再生处理。

2.4树脂再生后使用试验

将树脂用 10倍量的 5%氢氧化钠溶液浸泡 2小时， 用水洗至中性； 再用 10 倍量的 3%盐酸溶液浸泡 2小时， 用水洗至中性。 再生好的树脂， 按验证试验及 树脂使用次数试验项下方法依次吸附洗脱 3次，计算得膏率，液相检测总黄酮苷 含量和转移率。 结果见表 12。

均值 均值 RSD 均值

1 21.15 84.54 74. 27

2 21.18 21.13 86.36 85.90 1.40 75. 76 75.55

3 21.05 86.81 76. 62

结果显示树脂再生后使用情况良好。

根据上述分离、 纯化研究， 药材提取后合并提取液， 滤过， 滤液通过已处理 好的 D₁₍₎₎大孔树脂柱， 依次用水、 15%乙醇、 45%乙醇、 1%氢氧化钠洗脱， 收 集 45%乙醇洗脱液。 实验数据 3 : 枳实总黄酮提取物干燥方法及干燥温度的研究

取枳实药材 1kg, 共 10份， 照上述确定的提取、 纯化工艺， 经提取、 纯化 后， 收集 45%乙醇洗脱液， 减压回收乙醇并浓缩至相对密度约 1.30 ( 60°C )的浸 膏， 对上述浸膏分别采用烘干法、真空干燥法进行比较研究。烘干法和真空干燥 法分别进行 5种不同温度 （50°C、 65°C、 75Ό、 85°C , 95 Ό )的比较。 考察总黄 酮苷的含量。 结果见表 13和表 14。

表 13 烘干法不同温度的测定结果

烘干温度（°c ) 烘干时间 (h) 得膏率 (％) 总黄酮苷含量 （％)

50 60 21.81 74.30

65 55 21.96 74.94

75 42 22.13 75.23

85 38 21.48 76.65

95 35 21.54 76.58 表 14 真空干燥法不同温度的测定结果 烘干温度 rc ) 烘干时间 （h) 得膏率(％) 总黄酮苷含量 （％)

50 46 23.21 76.52

65 35 76.21

85 24 22.96 74.95

95 20 23.78 73.67 从表 13、 14可知， 烘干法在同一温度水平上较真空干燥所需时间长， 效果 不如真空干燥。烘干法烘千的样品色泽较差， 不易粉碎， 且随着温度的上升， 烘 干法易因局部过热而引起碳化， 从而造成样品颜色发黑， 有效成分丢失。真空千 燥时易拉干成蜂窝状， 有利于粉碎， 且色泽较好， 同时真空干燥的温度控制在

75 °C左右为宜， 省时又不会造成有效成分的丢失。

以下全部选用实施例 11枳实总黄酮苷提取物作为实 ¾m 实验数据 4: 枳实总黄酮苷提取物镇吐作用

4.1枳实总黄酮苷提取物对硫酸铜致家鸽呕吐的影响

家鸽 60只， 体重 280〜350g， 雌雄各半。 随机分为 6组： 对照组、 实施例 11枳实总黄酮苷提取物（20、 40、 80、 160mg，kg— 4个剂量组以及阳性药组（吗 丁琳 40mg，kg— , 每组 10只， $3各半。 各组家鸽禁食不禁水 16小时， 次日一 次给药， 对照组给予蒸馏水灌胃， 其他组灌胃相应药物， l Omhkg^ 1小时后各 组家鸽给予 3.5%的硫酸铜溶液 10mg，kg— ¹灌胃造模。记录各组家鸽呕吐潜伏时间 和 1 小时内呕吐次数， 试验结果显示， 枳实总黄酮苷提取物 （20、 40、 80、 l^Omg-kg ¹ ) —次给药均不能延长硫酸铜所致家鸽的呕吐潜伏时间， 但枳实总黄 酮苷提取物（40、 SOmg-kg-¹ )一次给药能减少硫酸铜所致家鸽的呕吐次数， 见表 15。 枳实总黄酮苷提取物对硫酸铜致家鸽呕吐的影晌 （ ±s )

剂 量 潜伏时间 呕吐次数 组 别

(mg-kg"¹ ) 只数 时间 （S ) 只数 次数 对照组 一 10 13.9±4.48 10 6.70±2.63 黄酮苷提取物组 20 10 14.〗±9.81 10 5.10±3.14

40 10 18.9±10.4 10 2.70±1.34**

80 10 20.4±9.91 10 3.20±2.44*

160 10 14.3±6.36 10 4扉 1.20 吗丁啉组 40 10 14.2±9.87 10 3.60±1.65** 注： 与对照组比较， 叩 <0.05， **P<0.01

4.2积实总黄酮苷提取物对顺铂致家鸽呕吐的影响

家鸽 80只， 体重 280〜350g， 雌雄各半。 随机分为 8组： 对照组、 实施例 11枳实总黄酮苷提取物 （20、 40、 80s 160mg'kg-' ) 4个剂量组以及阳性药 3组 (吗丁琳 80、 160mg'kg— ¹和盐酸昂丹司琼注射液 5ug'kg— 每组 10只， 各半。 各组家鸽禁食不禁水 16小时， 次日一次给药， 对照组给予蒸馏水灌胃， 其他组 给予相应药物， 1小时后腹腔注射给予 B n^kg 的注射用顺铂。 记录各组家鸽 呕吐潜伏时间和 4 小时内呕吐次数， 试验结果显示， 枳实总黄酮苷提取物 SOmg'kg—¹—次给药能延长顺铂所致家鸽的呕吐时间， 但 20、 40和 160mgikg 时 均不能延长顺铂所致家鸽的呕吐时间； 枳实总黄酮苷提取物 （80、 l eOmg-kg ¹ ) 一次给药能减少顺铂所致家鸽的呕吐次数， 见表 16

- is - 枳实总黄酮苷提取物对顺铂致家鸽呕吐的影响 （ 土 S)

剂 量 潜伏时间 呕吐次数 组 别

(mg-kg'¹) 只数 时间 （S) 只数 次数 对照组 一 10 74.7±22.0 10 19.6±6.17

20 10 79.0±18.7 10 21.3±6.43 枳实总黄酮苷 40 10. 84.1±17.S 10 20.1±6.15 提取物组 80 1.0 104.0±33.1* 10 11.2± 94**

160 10 78.5±24.8 10 14.9±6.08* 吗丁啉组 80 10 68.2±14.1 10 20.1±5.13

160 10 71.9±15.2 10 16.7±4.47 昂丹司琼注射液组 9 98.4±32.2 10 6.80±3.79** 注： 与对照组比较， *Ρ<0.05, **Ρ<0.01

4.3积实总黄酮苷提取物对阿朴吗啡致杂种犬呕吐的影响

杂种犬 56只， 体重 8.0〜10.0kg, 雌雄各半。 随机分为 7组： 对照组、 实施 例 11枳实总黄酮苷提取物 （15、 30、 60、 ^Omg-kg¹) 4个剂量组以及阳性药 2 组（吗丁啉 SOmg'kg—¹和盐酸甲氧氯普胺注射液 lmg'kg— 4， 每组 8只， $3各半。 各组杂种犬禁食不禁水 16小时， 次日一次给药， 对照组给予蒸馏水灌胃， 其他 组给予相应药物灌胃， 5 mHig—¹, 1小时后给予 500u_g -kg"¹的阿朴吗啡皮下注射。 记录各组杂种犬呕吐潜伏时间和 1小时内呕吐次数。试验结果显示，枳实总黄酮 苷提取物 （15、 30、 60、 Omg-kg¹) 一次给药均不能减少阿朴吗啡致杂种犬呕 吐次数； 枳实总黄酮苷提取物 （15、 30、 ^Omg-kg¹) 亦不能延长阿朴吗啡致杂 种犬的呕吐潜伏时间， 但枳实总黄酮苷提取物 SOmg'kg-¹时能延长杂种犬的呕吐 潜伏时间， 见表 17。

枳实总黄酮苷提取物对阿朴吗啡致杂种犬呕吐的影响 （i(±_S)

齐 ϋ 量 潜伏时间 呕吐次数 组 别

(nig-kg¹) 只数 时间 （S) 只数 次数 对照组 一 8 5.25±2.19 8 4.63±2.56

15 8 4.13±1.46 8 3.13±1.25 枳实总黄酮苷 30 8 5.71±2.14 8 3.88±1.S1 提取物组 60 8 7.71±1.11* 8 3.00±1.51

120 8 4.50±1.07 8 3.50±0.53 吗丁啉组 30 8 8 3.63±1.51 盐酸甲氧氯普

1 8 一 8 0±0 胺注射液组 注： 与对照组比较， *P<0.05

实验数据 5： 枳实总黄酮苷提取物对肠 ίϋί作用

5.1枳实总黄酮苷提取物对多巴胺致肠功能低下小鼠的影响

小鼠 70只， 体重 19〜22g， 随机分为 7组： 对照组、 模型组、 实施例 11枳 实总黄酮苷提取物 （25、 50、 100、 200mg-kg¹ ) 4个剂量组以及阳性药组（吗丁 啉 SOmg'kg'¹), 每组 10只， ？ 各半。 各组小鼠禁食不禁水 16小时， 次日一次 给药， 对照组灌胃蒸馏水， 其他组给予相应药物灌胃。 各小鼠灌胃 30分钟后除 对照组外，其余小鼠给予 lJmg'kg—¹盐酸多巴胺注射液皮下注射造模， 20分钟后 70只小鼠分别灌服 2%的羧甲基纤维素钠碳末混悬液 O ml'lOg'¹ 分钟后小鼠 脱颈处死， 立即取出胃肠， 平铺， 测定碳末前端至幽门的距离和小肠全长， 以两 者之比计算推进百分率。 试验结果显示， 皮下注射 l n^kg—¹的多巴胺可明显抑 制小鼠的肠推进， 枳实总黄酮苷提取物 （25、 50、 lOOmg-kg-¹) 能提高由多巴胺 抑制的小鼠肠推进活动， 见表 18。 枳实总黄酮苷提取物对多巴胺致小鼠肠推进的影晌 （ ±s) 剂 量 推进百分率 组 另 IJ 只 推进距离 小肠全长

(mg · kg"¹) (cm) (cm)

数 (%) 对照组 ― 10 34.3±5.36 50.7±2.09 67.7±11.0 模型组 一 10 27.5±6.28 50.0±2.77 54.8±11.2^Δ

25 10 36.7±6.81 50.8±4.79 72.0土 10.3** 枳实总黄酮苷 50 10 34.4±6.47 52.2 ±4.23 65.6±9.36* 提取物组 100 10 33.9±6.81 51.5±2.33 65.7±11.8*

200 10 32.7±5.40 51.0±2.51 64.3±10.8 吗丁啉组 50 10 36.9±8.53 52.4土 4.89 70.1±12.3* 小鼠 70只， 体重 19〜22g， 随机分为 7组： 对照组、 模型组、 实施例 II枳 实总黄酮苷提取物（25、 50、 100、 200mg-kg'¹) 4个剂量组以及阳性药组（吗丁 啉 50mg，kg— ， 每组 10只， $ 各半。 各组小鼠禁食不禁水 16小时， 次日一次 给药， 对照组灌胃蒸馏水， 其他组给予相应药物灌胃。 各小鼠灌胃 30分钟后除 对照组外， 其余小鼠给予 2.5 mg g—¹的阿托品皮下注射造模， 20分钟后 70只小 鼠分别灌服 2%的羧甲基纤维素钠碳末混悬液 0.2ml， 10^,20分钟后小鼠脱颈处 死， 立即取出胃肠， 平铺， 测定碳末前端至幽门的距离和小肠全长， 以两者之比 计算推进百分率。试验结果显示， 皮下注射 S^mg g'¹的阿托品可明显抑制小鼠 的肠推进，枳实总黄酮苷提取物 50mg'kg-l能提高由阿托品抑制的小鼠肠推进活 动， 见表 19。 枳实总黄酮苷提取物对阿托品致小鼠肠推进的影响 （； ¾±s)

剂 ft 推进距离 小肠全长 推进百分率 组 另 IJ

(mg · kg"') 只数 (cm) (cm) (%) 对照组 ― 10 33.0±4.70 51.6±3.53 64.2±10.2 模型组 —

10 25.2±9.13 50.5±5.84 49.7±15.8厶

25 10 25.2±5.89 49.2±4.62 50.9±9.06

50

枳实总黄酮 10 32.0±6.90 50.5±3.72 63.3±12.7* 苷提取物组 100 10 28.7±6.74 48.1±5.83 59.6±11.0

200 10 28.1±5.96 49.9土 4.37 55.9±8.22 吗丁啉组 50 10 29.4±6.36 49.9 ±4.68 58.5±9.32

注： 与对照组比较， ^ΔΡ<0.05;与模型组比较， 叩 <0.05

5.3枳实总黄酮苷提取物对肾上腺素致肠功能低下小鼠的影响

小鼠 70只， 体重 19〜22g, 随机分为 7组： 对照组、 模型组、 实施例 11枳 实总黄酮苷提取物 （25、 50、 100、 200mg-kg-l) 4 个剂量组以及阳性药组 (吗 丁啉 50_mg'kg-l), 每组 10只， ？3各半。 各组小鼠禁食不禁水 16小时， 次日一 次给药， 对照组灌胃蒸熘水， 其他组给予相应药物灌胃。 各小鼠灌胃 30分钟后 除对照组外，其余小鼠给予 0.5 mg.kg 的盐酸肾上腺素注射液皮下注射造模， 20 分钟后 70只小鼠分别灌服 2%的羧甲基纤维素钠碳末混悬液 0.2mH0_g-l,20分钟 后小鼠脱颈处死，立即取出胃肠，平铺，测定碳末前端至幽门的距离和小肠全长， 以两者之比计算推进百分率。 试验结果显示， 皮下注射 O n^kg'¹的肾上腺素可 明显抑制小鼠的肠推进， 枳实总黄酮苷提取物（25、 50、 100、 lOOmg-kg¹)均不 能改善由肾上腺素抑制的小鼠肠推进活动， 见表 20。 枳实总黄酮苷提取物对肾上腺素致小鼠肠推进的影响 （：¾土 S) 剂 量 推进距离 小肠全长 推进百分率 组 另 ij

(mg · kg"¹) 只数 (cm) (cm) ( %) 对照组 ― ■

10 36.3±4.53 51.3±5.54 70.9±8.16 模型组 一 10 24.9±6.81 54.5±5.27 45.9±12.5^

25 10 21.8±7.46 56.3±5.81 38.3±10.6 枳实 ^黄 50 10 29.9±10.2 54.2±4.09 54.8±16.7 酮苷提取

物组 100 10 22.9±5.52 . 52.1士 4.73 44.1±10.6

200 10 20.4±3.05 51.5±4.47 39.8±5.87 吗丁啉组 50 10 26.1±8.64 50.9±4.96 52.7±19.3 注： 与对照组比较， ^?<0.01 实验数据 6: 枳实总黄酮苷提取物对胃液分泌量、 胃酸和胃蛋白酶的影响

6.1对胃液分泌量、 胃酸的影晌

大鼠 48只， 体重 230〜270g， 随机分为 6组： 对照组、 实施例 11枳实总黄 酮苷提取物(20、40、80、160₀₁^^)4个剂量组以及阳性药组（吗丁啉401^ —¹)， 每组 8只， $ 各半。试验前大鼠禁食不禁水 36小时， 大鼠一次灌胃给药， 对照 组给予蒸馏水， 其他组给予相应药物。 给药同时， 各大鼠在乙醚浅麻醉下， 打幵 腹腔， 结扎幽门， 收集幽门结扎后 5小时的大鼠胃液， 以 3000r/min离心 5min， 去处食物残渣等胃内容物， 用量筒准确称量胃液量。 量取胃液 lml， 置于三角烧 瓶中加入等量蒸馏水， 混合均匀， 加入游离酸指示剂 0.5%对二甲基偶氮苯胺乙 醇溶液和总酸指示剂 0.5%酚酖乙醇溶液各 2滴， 混合胃液中若含有盐酸， 即呈 樱红色。 用滴定管滴加 O.01mol/L的 NaOH, ， 边加边摇动烧瓶， 至红色消失， 开始出现桔黄色为止。 即为游离盐酸的终点。 记下用去 NaOH至红色不再变深 为止的量， 即为总酸度的终点。 记下两次滴定用去 NaOH溶液总量。 计算游离 盐酸和总酸的浓度以及总分泌量。试验结果显示，枳实总黄酮苷提取物（20、 40、 SOmg-kg¹) 对幽门结扎大鼠的胃液分泌量无明显影响， 但枳实总黄酮苷提取物 ^Omg-kg-¹可减少大鼠的胃液分泌量； 枳实总黄酮苷提取物 （80、 ^Omg-kg¹) 可升高幽门结扎大鼠游离盐酸和总酸的浓度，但枳实总黄酮苷提取物各剂量 (20、 40、 80、 leOmg-kg-¹) 对游离盐酸和总酸的分泌量无影响， 见表 21。

表 21 枳实总黄酮苷提取物对大鼠胃液分泌量、 游离盐酸和总酸浓度的影响 （ ±s) 剂 量 胃液分泌量 . 游离盐酸浓度 总酸度 组 另 IJ

(mg · kg"¹) 只数 (ml) (mmol/L) (mmol/L) 对照组 ― 10 7.03±2.95 33.4±11.8 67.3±11.9

^ 3 20 10 7.17±2.00 47.2±21.4 78.5±13.1 枳实总.黄酮苷 ' 40 10 6.08±3.02 45.0±25.8 77.7士 1 9· 提取物组 80 10 5.25±2.72 59.4±26.7* 95.6 ±27.2*

160 10 4.63±0.65* 62.4±13.7** 93.7±11.1** 吗丁啉组 40 10 5.76±1.98 63.9±15.8** 92.4±25.2* 注： 与对照组比较， *P<0.05， **P<0.01

将内径 l〜2mm粗细匀称的毛细玻管洗净烤干，取适量蛋清充分打匀后用纱 布过滤， 将上述毛细玻璃管利用虹吸作用， 灌满蛋清 （管内应无气沲混入）。 然 后放置于 85'C热蒸气中使蛋白质凝固。 待冷却后， 取出石蜡将蛋白管两端封固， 贮冰箱中备用。 实验时取胃液 lml放入 50ml的三角烧瓶中， 加 0.05N盐酸溶液 15ml， 摇匀， 放进约长 2.5cm蛋白管二根。 塞好瓶口， 放于 37'C恒温箱中温孵 24h。用尺测量蛋白管两端透明部分的长度（mm) 以四端之值求其平均值， 用下 列公式计算胃蛋白酶的单位 =平均值 ²xl6。 试验结果显示， 实施例 11枳实总黄 酮苷提取物各剂量 （.20、 40、 80、 ^Omg-kg¹)对幽门结扎大鼠的胃蛋白酶活性 无明显影响， 见表.22。 ' 表 22 枳实总黄酮苷提取物对大鼠游离盐酸、 总酸分泌量和胃蛋白酶活' I生的影晌 （X土 s) 游离盐酸分泌量 总酸分泌量 胃蛋白酶活性 组 另 IJ 只数 (mmol) (mmol) (ll) 对照组 一 10 0.258±0.166 0.470±0.190 644.4±207.3

20 10 0.369±0.234 0.580±0.227 837.0±343.4 枳实总黄酮苷 40 10 0.302±0.282 0.493±0.320 461.6±183.1 提取物组 80 10 0.358±0.301 0.539±0.383 838.3±417.4

160 10 0.295±0.103 0.439±0.112 1075.6±605.9 吗丁啉组 40 10 0.383±0.167 0.562±0.239 580.5±204.0 实验数据 7: 枳实总黄酮苷提取物对平滑肌的影响

7.1对离体胃肠平滑肌的影响

选用健康成年大鼠， 猛击头部致昏， 迅速取出全胃及十二指肠中段 l-2cm， 沿胃大弯处剪开， 用含 95% 0₂和 5% C0₂的混合气体充分饱和的 pH 7.35-7.45 的 Krebs液（成份： NaCl 117 mmol/L、 KC1 4.8 mmol/L, CaCl₂2.5 mmol/L、 gCl₂ 1.2 mmol/L> NaH₂ )4 1.2 mmol/L、 NaHC0₃ 25 mmol/L、 Glucose 11 mmol/L)反 复冲洗去除内容物， 分别取胃窦和胃底级、 横肌条以及十二指肠中段长约 lcm, 宽约 0.5cm， 底端固定于通气钩， 上端与换能器 （JH-2型肌张力传感器） 相连， 并将其置入盛有氧饱和的 Krebs液（pH 7.35~7.45 ) 20ml的浴管中， 调整前负荷 为 lg， 每隔 20min换液一次， 通过通气钩向浴液内注入氧气， 应用 BL-420E生 物机能实验系统记录其张力及频率。外管经恒流输液泵 [持续、恒温（37±0.5 。C )、 恒速 （3~4 ml/min)] 灌流以保持浴槽内温度。 待标本稳定后， 加入待测药品最 终浓度分别为 0.25 mg/L、 0.4 mg/L、 0.55 mg/L、 0.7 mg/L、 0.85 mg/L和 1.00 mg/L, 记录并观察用药前后频率及张力改变。 离体试验结果显示， 实施例 11枳实总黄 酮苷提取物（O^ mg.mr^ LO mg.mr¹ )可降低胃窦和胃底纵、 横形肌以及十二 指肠平滑肌张力， 抑制胃肠运动， 见表 23〜27。 表 23 枳实总黄酮苷提取物对离体胃窦横行肌张力和频率的影响 （X土 s )

浓度 样本 张力 (g) 频率 (次） s± 力 U

(mg-ηιΓ¹ ) 数 给药前 给药后 给药前 给药后

0.25 9 0.148±0.073 0.124±0.043 2.844±0.783 2.344±0.260 枳实总黄 0.55 9 0.204士0.122 0.119±0.061 * 2.467±0.638 2.422±0.678 酮苷提取 0.70 9 0.228±0.130 0.103±0.037* 2.389±0.704 2.278±0.75 1 物组 0.85 9 0.1 S2±0.078 0.096±0.057** 2.511±0.715 2.367±0.721

1.00 8 0.206±0.147 0.063±0.028* 2.463±0.410 2.213±0.905 注： 与给药前比较， *P<0.05， **P<0.01 表 24 枳实总黄酮苷提取物对离体胃窦纵行肌张力和频率的影响 （ 土 s )

έ曰 51ιΙ 浓度 样本 张力 (g) 频率 (次） stL /J'J

(mg-ml'¹ ) 数 给药前 给药后 给药前 给药后

0.25 9 0.901±0.484 0.671±0.560* 3.244±1.664 2.978±1.551 枳实总黄 0.55 9 0駕 ±0.607 0.396±0.374** 3.200±1.770 4.456±3.037 酮苷提 0.70 9 0.747±0.586 0.303±0.313** 2.878±1.391 3.511±2.489 取物组 0.85 9 0.737±0.608 0.287±0.259* 3.100±1.352 2.844±1.076

1.00 8 0.516±0.412 0.206±0.140* 3.789±2.922 2.267±0.343 注： 与给药前比较， *P<0.05 , **P<0.01 表 25 枳实总黄酮苷提取物对离体胃底横行肌张力和频率的影响 （X±s )

张力 频率 (次） 样本 ·

组 ' 别

数 给药前 给药后 给药前 给药后

0.25 9 0.332±0.165 0.311±0.157 3.689±2.062 3.500±1.909 枳实总 0.55 9 0.341±0.159 0.244±0.161 * 3.989±1.551 3.033±1.023 黄酮苷提 0.70 9 0.307±0.168 0.212±0.121 * 4.033±2.088 2.944+ 1.201 取物组 0.85 9 0.459±0.304 0.177±0.129* 3.622±2.282 2.878±2.052

1.00 8 0.299±0.134 0.118±0.066** 3.463±2.800 1.894±1.S28

.注： 与给药前比较， *P<0.05 , **P<0.01 表 26 枳实总黄酮苷提取物对离体胃底纵行肌张力和频率的影响 （X土 s ) 浓度 张力 （g)

样本 频率 (次） 组 别 ( mg-πιΓ¹

数

) 给药前 给药后 给药前 给药后

0.25 9 0.3S7±0.417 0.286±0.272 2.367±0.524 2.000±0.418 枳实总 0.55 9 0.420±0.377 0.168士 0, 139** 2.367±0.606 1.678±0.650 黄酮苷提 0.70 9 0.楊 ±0.374 0.202±0.267* 2.378±0.622 1.689±0.668** 取物组 0.85 9 0.422±0.450 0.113±0.11 1 * 2.233±0.689 1.522±0.657*

1.00 7 0.360±0.446 0.097±0.074* 2.186±0.254 1.343±0.562** 注： 与给药前比较， *P<0.05 , **P<0.01 表 27 枳实总黄酮苷提取物对离体十二指肠中段张力和频率的影响 （X土 s )

浓度 _t 样.本 张力 （g ) 频率 (次） ―

( mg'mr¹ 数 给药前 给药后 给药前 给药后

0.25 9 1.648±0.758 1.788±0.763 19.93±7.391 21.13±8.131

0.40 9 1.967±0.752 1.569±0.594** 21.11±7.656 20.50±7.487 枳实总

0.55 9 1.754±0.602 1.288±0.549** 22.22±6.760 21.50±5.720 黄酮苷提

0.70 9 1.747±0.749 1.182±0.566** 22.56±3.539 20.40±6.433 取物组

0.85 9 1.818±0.732 1.022±0.607** 23.44±4.475 19.20±7.510

1.00 9 1.727±0.540 0.880±0.491 ** 23.78±4.604 17.90±7.047 注： 与给药前比较， *P<0.05， **P<0.01

7.2 对在体十二指肠平滑肌的影响

大鼠 56只， 体重 180〜230g, 随机分为 7组： 对照组、 模型组、 实施例 11 枳实总黄酮苷提取物 （20、 40、 80、 160mg'kg ) 4个剂量组以及阳性药组 （吗 丁琳 40mg，kg— ' )， 每组 8只， 9 '各半。 大鼠灌胃给药， 对照组和模型组给予蒸 馏水， 其他组给予相应药物。 各组大鼠禁食不禁水 16小时， 次日一次给药， 各 大鼠灌胃 30分钟后除对照组外， 其余大鼠给予 1.5m_g，kg 的盐酸多巴胺注射液 皮下注射造模， 水合氯醛麻醉， 沿腹正中线打开腹腔， 选择十二指肠中段约 2-3cm， 将肠段两端用缝合线固定在肠管固定管两侧的小孔上， 再用一根缝合线 将一端缝在肠段中间的肠壁上， 另一端由肠管固定管中央穿出连在 JH-2型肌张 力传感器上， 并通过 BL-420E生物机能实验系统记录各大鼠十二指肠的张力及 频率。 试验结泉显示， 皮下注射 1.5mg g— ¹的多巴胺可明显抑制在体大鼠十二指 肠的张力和频率， 枳实总黄酮苷提取物 （20 40 80 ^Omg-kg-¹ ) 能提高由多 巴胺抑制的大鼠十二指肠的张力和频率， 见表 28 表 28 枳实总黄酮苷提取物对在体十.二指肠中段张力和频率的影响 （ 土 s)

剂 *

组 别

(mg · kg"¹ ) 只数 张力 (g ) 频率 （次） 对照组 一 8 0. 478± 0. 070 4. 550±0. 663 模型组 ― 8 0. 158± 0. 041^ 2. 638 ± 0. 857^

20 8 0. 468 ±0. 120** 3. 938± 0. 885** 枳实总 40 8 11. 99± 1. 632** 8. 450 ± 1. 619** 黄酮苷提

取物组 80 8 16. 95±0. 958** 8. 400 + 0. 828

160 8 6. 825± 0. 573** 6. 500 + 0. 707** 吗丁啉组 40 8 4. 675 ± 1. 051** 6. 025 ± 1. 066**

注： 与对照组比较， ^ΛΡ<0.05 , ；与模型组比较， *Ρ<0.05 **Ρ<0.01 乙醇回 « ^法的研究与实 «ig

实验数据 1 : 提取工艺优化研究

黄酮苷类化合物一般易溶于热水、 甲醇、 乙醇、 吡啶及稀碱溶液中， 而难溶 或不溶于苯、 乙醚、 氯仿、 石油醚等有机溶剂中。 枳实中的主要活性成分是以柚 皮苷和新橙皮苷为代表的二氢黄酮类成分，这些二氢黄酮的极性比一般的黄酮类 成分都大， 可溶于水及低浓度乙醇中， 易溶于热水或热的稀乙醇溶液。

根据药材中所含主要化学成分的理化性质， 参考有关文献， 同时结合预试验 结果， 采用醇提取， 提取液上大孔树脂纯化的方法。

考察指标分别为得膏率、 总黄酮含量和总黄酮的转移率

1. 提取工艺条件的优选

1.1提取溶剂的选择

将枳实药材粉碎过 S目筛，取 12份，分为 4组，每组平均三份，各自用水、 5%乙醇、 95%乙醇和饱和石灰水提取。 结果见表 29 表 29 提取溶剂的选择

65%乙醇 53.05 34.05 92.22

95%乙醇 34.82 44.35 83.11

碱水 54.92 29.75 87.94 结论： 由表 29可知， 三种提取溶剂以 65%乙醇提取效果最好， 因此以 65% 乙醇为提取溶剂。

1.2药材粒度的选择

将粉碎好的枳实过筛， 各取饮片、 破碎成黄豆大小颗粒、 8 目、 20 目、 40 目三份， 共 15份， 分别加乙醇回流提取。 结果见表 30。 表 30药材粒度的选择

^"""^^^J"旨标 得膏率(％；) 总黄酮苷转移率 总黄酮苷含量 (％)

粉碎度^^ (%)

饮片 58.63 36.72 92.33 黄豆大小颗粒 60.41 38.55 94.37

8目 61.44 37.43 94.22

20目 50.41 36.58 92.84

40目 48.25 37.15 89.22 结论： 由表 30中有关数据可知， 加乙醇回流提取， 药材的粒度有较大的差 别， 并不是药材颗粒越细越好，其中以破碎成黄豆大小颗粒及 8目药材得膏率和 总黄酮苷的转移率最高， 结合生产实际，择黄豆大小颗粒作为药材最终的破碎粒 度。

1. 3正交试验法优选提取工艺

根据以上的实验结果， 现以提取过程中提取时间 （A)、 提取次数 （B )、 加 65%乙醇量（C)、 提取前浸泡时间 （D ) 四项作为考察因素， 每一因素设三个水 平， 按 L9 (3⁴) 正交表进行正交实验设计 （表 31、 表 32)， 考察指标为得膏率 和总黄酮苷转移率。 表 31 因素水平表

因子 提取时间 ( h) 提取次数 加乙醇量（倍） 浸泡时间 （h) 得率移率膏转％％

水平^\ A B C D

1 1 1 10 0

2 1.5 2 14 1

. 3 2 ' 18 2 取枳实药材颗粒 27份， .每组平均三份， 共九组， 按表 32 L9 ( 34 ) 正交试 验表设计试验。 结果见表 32。 表 32 L9 ( 3⁴ ) 正交试验表

得膏率 总黄酮苷转移 (%) 率 （％)

1 1 1 1 1 42.84 74.86

2 1 2 2 2 48.58

3 1 3 3 3 51.08 92.10

4 2 1 2 3 43.51 77.50

5 2 2 3 1 51.27 87.84

6 2 3 1 2 46.24 81.13

7 1 3 2 46.05 83.57

8 2 1 45.75 76.00

9 J 3 2 1 52.37 87.42

Kal 142.5 132.4 134.83 146.48

Ka2 141.02 145.6 144.46 140.87

Ka3 144.17 149.69 148.4 140.34

Ra 3.15 17.29 13.57 6.14

Kcl 249.99 235.93 231.99 250.12

Kc2 246.47 246.87 247.95 247.73

Kc3 246.99 260.65 263.51 245.6

Rc 3.52 24.72 31.52 4.52

( 1 ) 直观分析：

得膏率最佳工艺： Bs As D! (B、 C为主要因素）

总黄酮苷转移率最佳工艺： Bs A! Di (B、 C为主要因素）

(2 ) 方差分析

结果见表 33。 表 33 以总黄酮苷转移率为指标的方差分析 方差来源 离差平方和 自由度 方差 F值 显著性 误差 e ( A) 2.41 2 1.20

B 102.29 2 51.15 42.5 氺

C 165.59 2 82.80 68.8

D 3.41 2 1.70 1.4

*F_1-o.os(W)=19.0 "Fi.o.01 (2， 2) =99.0

(3 )结论： 直观分析可知， 提取次数 （B )及所用溶剂体积 （C )对提取效 果影响较大， 提取时间 （A) 及浸泡时间 （D ) 对提取效果影响较小。 以转移率 为指标进行方差分析， 表 33分析结果进一步验证了直观分析结论， 即所设因素 B、 C对提取效果有较大影响。 由于因素 A对煎煮效果影响较小， 由此初步确定 提取条件为 18倍量 65%乙醇 （与药材重量比） 提 3次 （8倍、 5倍、 5倍）， 每 次提取时间 lh， 药材不浸泡。

2. 验证试验

取枳实药材（黄豆大小颗粒） 3份， 按正交试验选取的最佳提取工艺条件进 行验证试验， 即: 18倍量 65%乙醇 ( 8倍 /lh、 5倍 /lh、 5倍 /lh)分别提取 3次， 药材不浸泡。 结果见表 34。

验证试验测定结果

CO

\^指标 总黄酮苷含量 总黄酮苷转移率°/。

得膏率(％)

验证 (%) 转移率 平均转移率 RSD

1 52.55 36.33 96.04

2 53.04 35.84 96.41

3 52.87 36.37 95.10

结论： 由表 34可知， 按优选工艺 65%乙醇提取 3次， 总黄酮苷已有 95%以 上被提出， 且三个样品总黄酮苷转移率较为一致 （RSD为 1.88%)， 结果显示最 后确定的最佳提取工艺是合理、 稳定的。 实验数据 2: 枳实总黄酮提取物的纯化研究

2.1分离纯化工艺考察

枳实药材用 65%乙醇提取后提出大量水溶性杂质， 必须对 65%乙醇提液进 行进一歩纯化处理， 以提高黄酮类有效成分的含量， 水溶性杂质多为无机盐、糖 类、果胶及蛋白质类， 而枳实中的活性成分为黄酮类化合物， 根据黄酮类化物特 性及目前我国常用的分离纯化方法，因此选择用大孔树脂来富集纯化该黄酮类成 分。

通过上样量考察，最终确定 1000ml的大孔树脂吸附 200g生药作为最终的上 样量 （即 0.2g生药 /ml树脂）。 ·

之后，通过洗脱体积的考察，确定 15%乙醇部分洗脱体积确定为 3000ml (即 每 1ml树脂用 3ml 15%乙醇洗脱）， 45%乙醇洗脱时选择用 4000ml (即 1ml树脂 用 4ml 45%乙醇洗脱）。

再进一步地， 通过上样流速的考察， 确定上样流速应选择在 1250ml/h~1550ml/h之间较好（即每 1ml树脂的上样流速在 1.25〜1.55ml/h之间）。

2.2正交优选大孔树脂优化工艺

根据以上的实验结果， 现以洗脱流速、 大孔树脂的径高比和上样后药液的 静态吸附时间三项作为考察因素， 每一因素设三个水平， 按 L 9 (3⁴ ) 正交表进 行正交实验设计（表 35、 表 36)， 考察指标为得膏率、 总黄酮苷的含量和总黄酮 苷转移率。

表 35 因素水平表

1 1250-1450 1 1 :5

2 1550-1750 3 1 :10

3 1850-2050 5 1 :20 取相当于生药 200g水溶液 9份， 按表 36 L9 (3⁴) 上预先处理好的大孔树 脂 （每根树脂装 1000ml大孔树脂）， 分别用 4000ml的水、 3000ml 15%的乙醇、 4000ml 45%乙醇和 3000ml 95%乙醇洗脱。 结果见表 36。

表 36 L9 (3⁴)正交试验表 转移率得率膏

1 1 1 1 22.15 85.48

1 2 2 2 21 .75 84.13

1 J 3 . 3 22.31 84.10

2 1 2 21.51 80.56

2 2 3 1 21 .62 80.20

2 3 1 2 21.64 79.64

3 1 3 2 21.03 77.16

3 2 1 20.67 75.07

3 3 2 1 20.43 73.60

Kal 66.21 64.69 64.46 64.20

Ka2 64.77 64.04 63.69 64.42

Ka3 62.13 64.38 64.96 64.49

Ra 4.08 0.65 1.27 0.29

Kcl

253.71 243.20 240.19 239.28

Kc2 240.40 239.40 238.29 240.93

Kc3 225.83 237.34 241.46 239.73

Rc

27.88 5.86 3.17 1.65

( 1 ) 直观分析

根据 R值分析， 得膏率最佳工艺： AiB i Cs ( A为主要因素〉 根据 R值分析， 总黄酮苷转移率最佳工艺： ^ B^s ( A为主要因素）

( 2 ) 方差分析

结果见表 37、 表 38。

表 37 以得膏率为指标的方差分析 方差来源 离差平方和 自由度 方差 F值 显著性

A 2.85 2 1.43 187.0

B 0.07 2 0.04 4.6

C 0.27 2 0.14 17.9

误差 (D) O02 2 0 1 表 38 以总黄酮苷转移率为指标的方差分析 方差来源 离差平方和 自由度 方差 F值 显著性 A 129.64 2 64.82 267.3

B 5.89 2 2.95 12.1

C 1.70 2 0.85 3.5

误差 (D) 0.49 2 0.24

( 3 ) 结论： 直观分析可知， 树脂的洗脱流速 （A) 为主要因素， 大孔树脂 的径高比 （C) 和上样后药液的静态吸附时间 （B ) 影响较小。 以得膏率和总黄 酮苷的转移率为指标进行方差分析， 表 37、 38中分析结果进一步验证了直观分 析结论， 即所设因素 A对洗脱效果有较大影响。 由于总黄酮含量为本项目的主 要指标， 结合柱层析柱径比工业化生产实际， 初步确定最佳条件为 AtBt^即- 洗脱流速为 1250~1450ml/h (即每 1ml树脂的洗脱流速为 1.25~1.45ml/h之间）， 径高比为 1 :10， 上样后药液的静态吸附时间为 1小时。

2.3验证试验及树脂使用次数试验

取枳实药材（黄豆大小颗粒）加乙醇回流提取， 回收乙醇， 水溶液为 13份， 每份相当于 200g生药， 备用。

a. 取 1 份上样于 1000ml大孔树脂 （树脂柱径高比为 1 :10)， 上样流速为 1400ml/h，静态吸附 1小时。依次用 4000ml的水、 3000ml 15%的乙醇、4000ml 45% 乙醇和 3000ml 95%乙醇洗脱以 1400ml/h的流速洗脱。收集 45%乙醇洗脱液进行 含量测定。 结果见表 39。

b. 将 a用后的树脂以水洗至无醇味， 另取一份冰箱冷藏的样品上此树脂， 按 a的步骤重复处理。 树脂依次进行下次吸附 （以下步骤同 a.b)。

均值 均值 均值

1 22.15 21.00 89.86 84.99 75.38 75.78

2 22.07 89.82 75.62

3 21.78 88.59 76.43

4 21.35 88.45 76.97

5 21.86 88.76 75.44

6 20.17 81.66 75.22 7 19.57 79.79 75.74

8 19.06 77.41 75.46

9 16.77 50.97 56.47

10 15.76 41.87 49.37

结论： 从表 39中可以看出按最佳工艺所进行的验证试验， 重复 8次所得的 样品总黄酮苷含量和总黄酮苷转移率均有所提高。且样品的各项指标均一，稳定， 说 此工艺最佳、 稳定的。 同时在使用 8次以后需要对树脂进行再生处理。

2. 树脂再生后使用试验

将树脂用 10倍量的 5%氢氧化钠溶液浸泡 2小时， 用水洗至中性； 再用 10 倍量的 3%盐酸溶液浸泡 2小时， 用水洗至中性。 再生好的树脂， 按验证试验及 脂使用次数试验项下方法依次吸附洗脱 3次， 计算得膏率，液相检测总黄酮苷 含量和转移率。 结果见表 40。

均值 均值 均值

】 22.53 92.79 76. 52

2 22.08 21.19 90.17 91.28 75. 88 76.45

3 21.95 90.92 76. 96

结果显示树脂再生后使用情况良好。

根据上述分离、 纯化研究， 药材提取后合并提取液， 滤过， 滤液通过已处理 好的 D 101大孔树脂柱， 依次用水、 15%乙醇、 45%乙醇、 1%氢氧化钠洗脱， 收 集 45%乙醇洗脱液。 实验数据 3 : 枳实总黄酮提取物干燥方法及干燥温度的研究

取枳实药材 lkg， 共 10份， 照上述确定的提取、 纯化工艺， 经提取、 纯化 后， 收集 45%乙醇洗脱液， 减压回收乙醇并浓缩至相对密度约 1.30 ( 60°C )的浸 膏， 对上述浸膏分别采用烘干法、真空千燥法进行比较研究。烘千法和真空干燥 法分别进行 5种不同温度（50°C、 65 V、 75 °C、 85 °C、 95 °C ) 的比较。 考察总黄 酮苷的含量。 结果见表 41和表 42。 表 41 烘干法不同温度的测定结果 烘干温度 rc) 烘干时间 (h) 总黄酮苷含量 （％)

50 60 23.01 76.38

65 . . 55 22.96 75.94

75 42 23.13 76.35

85 38 22.48 75.38

95 35 , 22.54 74.98 表 42 真空干燥法不同温度的测定结果 烘干温度 rc) 烘千时间 (h) 得膏率(％) 总黄酮苷含量 （％)

50 46 23.21 74.52

65 35 23.65 75.21

75 26 22.86 76.07

85 24 22.96 76.05

95 20 22.78 74.67 从表 41、 42可知， 烘干法在同一温度水平上较真空千燥所需时间长， 效果 不如真空千燥。烘干法烘干的样品色泽较差， 不易粉碎， 且随着温度的上升， 烘 干法易因局部过热而引起碳化， 从而造成样品颜色发黑， 有效成分丢失。真空干 燥时易拉干成蜂窝状， 有利于粉碎， 且色泽较好， 同时真空干燥的温度控制在

75°C左右为宜， 省时又不会造成有效成分的丢失。

以下全部选用实施例 23枳实总黄酮苷提取物作为实 实验数据 4: 枳实总黄酮苷提取物镇吐作用

4.1枳实总黄酮苷提取物对硫酸铜致家鸽呕吐的影响 家鸽 60只， 体重 280〜350g， 雌雄各半。 随机分为 6组： 对照组、 实施例 12枳实总黄酮苷提取物（20、 40、 80、 160mg_kg— 4个剂量组以及阳性药组（吗 丁琳 40n^kg— 每组 10只， ？ 各半。 各组家鸽禁食不禁水 16小时， 次日一 次给药， 对照组给予蒸馏水灌胃， 其他组灌胃相应药物， 10ml，kg— '。 1小时后各 组家鸽给予 3.5%的硫酸铜溶液 lOmg g 灌胃造模。记录各组家鸽呕吐潜伏时间 和 2 小时内呕吐次数， 试验结果显示， 枳实总黄酮苷提取物 （20、 40、 80、 ^Omg-kg-¹ ) 一次给药均不能延长硫酸铜所致家鸽的呕吐潜伏时间， 但枳实总黄 酮苷提取物（40、 SOmg-kg ¹ )一次给药能减少硫酸铜所致家鸽的呕吐次数， 见表 43。 枳实总黄酮苷提取物对硫酸铜致家鸽呕吐的影响 土 s)

剂 量 潜伏时间 呕吐次数 组 另 ij

(mg-kg"¹ ) 只数 时间 （S ) 只数 次数 对照组 一 10 13.9±4.48 10 6.70±2.63 黄酮苷提取物组 20 10 14.5±9.63 10 5.14±3.35

40 10 19.1±9.94 10 2.69±1.27**

80 10 21.2±10.01 10 3.18±2.34*

160 10 15.1±7.06 10 4.78±2.09 吗丁啉组 40 10 14.2±9.87 10 3.60±1.65** 注： 与对照组比较， *P<0.05， **P<0.01

4.2枳实总黄酮苷提取物对顺铂致家鸽呕吐的影响

家鸽 80只， 体重 280〜350g, 雌雄各半。 随机分为 8组： 对照组、 实施例 12枳实总黄酮苷提取物 （20、 40、 80、 160mg-kg-' ) 4个剂量组以及阳性药 3组 (吗丁琳 80、 Omg'kg—¹和盐酸昂丹司琼注射液 Sug'kg—¹ )每组 10只， 各半。 各组家鸽禁食不禁水 16小时， 次日一次给药， 对照组给予蒸馏水灌胃， 其他组 给予相应药物， 1小时后腹腔注射给予 13 mg-kg ¹的注射用顺铂。 记录各组家鸽 呕吐潜伏时间和 4 小时内呕吐次数， 试验结果显示， 枳实总黄酮苷提取物 80mg.k^—次给药能延长顺铂所致家鸽的呕吐时间， 但 20、 40和 160mg'kg— ¹时 均不能延长顺铂所致家鸽的呕吐时间； 枳实总黄酮苷提取物 （80、 leOmg-kg ¹ ) 一次给药能减少顺铂所致家鸽的呕吐次数， 见表 44 表 44 枳实总黄酮苷提取物对顺铂致家鸽呕吐的影响 （ 土 s)

剂 量 潜伏时间 呕吐次数

( mg-kg" ) 只数 时间 （S ) 只数 次数 对照组 ― 10 74.7±22.0 10 19.6±6.17 枳实总黄酮苷 20 10 80.0±19.2 10 21.7±6.56 提取物组 40 10 85.3±18.1 10 20.3±6.27

80 10 106.0±35.1 * 10 11.5±3.87**

160 10 77.9±25.6 10 14.2±6.13* 吗丁啉组 80 10 68.2±14.1 10 20.1±5.13

160 10 71.9±15.2 10 16.7±4.47 昂丹司琼注射液组 5 ug-kg ¹ 9 98.4±32.2 10 6.80±3.79** 注： 与对照组比较， 叩<0.05， **P<0.01

4.3枳实总黄酮苷提取物对阿朴吗啡致杂种犬呕吐的影响

杂种犬 56只， 体重 8.0〜10.0 k_g, 雌雄各半。 随机分为 7组： 对照组、 实施 例 12枳实总黄酮苷提取物 （15、 30、 60、 UOmg-kg-¹ ) 4个剂量组以及阳性药 2 组（吗丁啉 30mg'kg— ¹和盐酸甲氧氯普胺注射液 lmg'kg—¹ ) , 每组 8只， ？3各半。 各组杂种犬禁食不禁水 16小时， 次日一次给药， 对照组给予蒸馏水灌胃， 其他 组给予相应药物灌胃， S mhkg^ 1小时后给予 500_Ug _kg_'的阿朴吗啡皮下注射。 记录各组杂种犬呕吐潜伏时间和 1小时内呕吐次数。试验结果显示，枳实总黄酮 苷提取物 （15、 30、 60、 nOmg-kg-¹ ) 一次给药均不能减少阿朴吗啡致杂种犬呕 吐次数； 枳实总黄酮苷提取物 （15、 30、 HOmg-kg'¹ ) 亦不能延长阿朴吗啡致杂 种犬的呕吐潜伏时间， 但枳实总黄酮苷提取物 60mg g— ¹时能延长杂种犬的呕吐 潜伏时间， 见表 45。

枳实总黄酮苷提取物对阿朴吗啡致杂种犬呕吐的影响 （ +s )

剂 量 潜伏时间 呕吐次数 组 另 IJ

(mg'kg"¹ ) 只数 时间 （S ) 只数 次数 对照组 ― 8 5.25±2.19 8 4.63±2.56

15 8 4.57±1.51 8 3.47+1.34 枳实总黄酮苷 30 8 5.67±2.0S 8 4.05± 1.94 提取物组 60 8 7.86±1.24* 8 3.25±1.63

120 8 4.58±1.13 8 3.58±1.04 吗丁啉组 30 8 5.13±1.55 8 3.63±1.51 盐酸甲氧氯普

1 8 8 0±0 胺注射液组

注： 与对照组比较， *P<0.05

实验数据 5: 枳实总黄酮苷提取物对肠赚作用

5.1枳实总黄酮苷提取物对多巴胺致肠功能低下小鼠的影响

小鼠 70只， 体重 19〜22g， 随机分为 7组： 对照组、 模型组、 实施例 12枳 实总黄酮苷提取物（25、 50、 100、 200mg-kg-¹ ) 4个剂量组以及阳性药组（吗丁 啉 SOmg'kg—¹), 每组 10只， $3各半。 各组小鼠禁食不禁水 16小时， 次日一次 给药， 对照组灌胃蒸馏水， 其他组给予相应药物灌胃。 各小鼠灌胃 30分钟后除 对照组外，其余小鼠给予 lJmg'kg—¹盐酸多巴胺注射液皮下注射造模， 20分钟后 70只小鼠分别灌服 2%的羧甲基纤维素钠碳末混悬液 0.2mH0g— '， 20分钟后小. 鼠脱颈处死， 立即取出胃肠， 平铺， 测定碳末前端至幽门的距离和小肠全长， 以 两者之比计算推进百分率。 试验结果显示， 皮下注射 l/Zmg g—¹的多巴胺可明显 抑制小鼠的肠推进， 枳实总黄酮苷提取物 （25、 50、 lOOmg-kg-¹) 能提高由多巴 胺抑制的小鼠肠推进活动， 见表 46。

枳实总黄酮苷提取物对多巴胺致小鼠肠推进的影响 （ ±s)

剂 量

组 另 1J 只 推进距离 小肠全长 推进百分率

(mg · kg—¹ ) (cm) (cm)

数 (%) 对照组 一 10 34.3士 5.36 50.7±2.09 67.7±11.0 模型组 ― 10 27.5土 6.28 50.0±2.77 54.8±11.2^Λ

25 10 37.2±6.77 51.2±4.53 72.2 ±9.78**

50

枳实总黄酮苷 10 35.1±6.28 51.9±4.61 66.3±9.56* 提取物组 100 10 34.3±6.69 51.2±2.19 65.0±10.9*

200 10 33.2±5.38 51.8±2.66 64.5 ±9.98 吗丁啉组 50 10 36.9±8.53 52.4±4.89 70.1±12.3* 注： 与对照组比较， ^ΔΡ<0.05， 与模型组比较， *Ρ<0.05, **Ρ<0.01

5.2枳实总黄酮苷提取物对阿托品致肠功能低下小鼠的影响

小鼠 70只， 体重 19〜22g, 随机分为 7组： 对照组、 模型组、 实施例 12枳 实总黄酮苷提取物 (25、 50、 100、 200mg-kg-¹ ) 4个剂量组以及阳性药组 （吗丁 啉 50mg'kg— ， 每组 10只， $3各半。 各组小鼠禁食不禁水 16小时， 次日一次 给药， 对照组灌胃蒸馏水， 其他组给予相应药物灌胃。 各小鼠灌胃 30分钟后除 对照组外， 其余小鼠给予 2.5 mg'kg—¹的阿托品皮下注射造模， 20分钟后 70只小 鼠分别灌服 2%的羧甲基纤维素钠碳末混悬液 0.2ιη1·10^,20分钟后小鼠脱颈处 死， 立即取出胃肠， 平铺， 测定碳末前端至幽门的距离和小肠全长， 以两者之比 计算推进百分率。试验结果显示， 皮下注射 2.5m kg— ¹的阿托品可明显抑制小鼠 的肠推进， 枳实总黄酮苷提取物 50mg，k^能提高由阿托品抑制的小鼠肠推进活 动， 见表 47。 表 47 枳实总黄酮苷提取物对阿托品致小鼠肠推进的影响 （X土 s) 剂 量 推进距离 小肠全长 推进百分率 组 另 IJ 只

(mg · kg—¹) 数 (cm) (cm) (%) 对照组 ― 10 33.0±4.70 51.6±3.53 64.2±10.2 模型组 —

10 25.2±9.13 50.5±5.84 49.7±15.8^Δ

25 10 25.5±5.73 50.6±4.80 50.5±9.12

50

枳实总黄酮 10 33.5±7, 08 50.2±3.99 63.8±11.5* 苷提取物组 100

10 29.1±6.66 48.8±5.17 58.4±10.7

200 10 28.4±6.14 49.5±4.53 56.8±9.34 吗丁啉组 50

10 29.4±6.36 49.9±4.68 58.5±9.32 注： 与对照组比较， ^ΔΡ<0.05;与槟型组比较， *Ρ<0.05

5.3枳实总黄酮苷提取物对肾上腺素致肠功能低下小鼠的影响

小鼠 70只， 体重 19〜22g， 随机分为 7组： 对照组、 模型组、 实施例 12枳 实总黄酮苷提取物 （25、 50、 100、 200mg-kg-l ) 4 个剂量组以及阳性药组 （吗 丁啉 50mg'kg-l), 每组 10只， $ 各半。 各组小鼠禁食不禁水 16小时， 次日一 次给药， 对照组灌胃蒸馏水， 其他组给予相应药物灌胃。 各小鼠灌胃 30分钟后 除对照组外，其余小鼠给予 0.5 m kg—¹的盐酸肾上腺素注射液皮下注射造模， 20 分钟后 70只小鼠分别灌服 2%的羧甲基纤维素钠碳末混悬液 0.2mH0g-l,20分钟 后小鼠脱颈处死，立即取出胃肠，平铺，测定碳末前端至幽门的距离和小肠全长， 以两者之比计算推进百分率。 试验结果显示， 皮下注射 O^n^kg-¹的肾上腺素可 明显抑制小鼠的肠推进， 枳实总黄酮苷提取物（25、 50、 100、 200mg-kg-¹)均不 能改善由肾上腺素抑制的小鼠肠推进活动， 见表 48。

表 48 枳实总黄酮苷提取物对肾上腺素致小鼠肠推进的影响 （?(土 s) 剂 量 推进距离 小肠全长 推进百分率 组 别

(mg · kg"¹) 只数 (cm) (cm) (%) 对照组 一 10 36.3土 4.53 , 51.3±5.54 70.9±8.16 模型组 — - 10 24.9±6.81 54.5 ±5.27 45.9±12.5^

25 . . 10 23.5 ±8.04 55.9±5.24 39.7 + 9.15 枳实总黄 ' 50· 10 28.7±9.58 55.1±4.54 53.2±15.9 酮苷提取

. 物组 100. 10 23.4±5.76 52.8±4.62 45.3±11·.4' .

. 200 10 22.1±3.48 52.1±4.54 40.5 + 5.33 吗丁啉组 ' 50' 10 26.1±8.64 50.9±4.96 52.7±19.3 注： 与对照组比较， p<o.oi 实验数据 6: 枳实总黄酮苷提取物对胃液分泌量、 胃酸和胃蛋白酶的影响

6.1对胃液分泌量、 胃酸的影响

大鼠 48只， 体重 230~270g， 随机分为 6组： 对照组、 实施例 1.2枳实总黄 酮苷提取物 (20、40、 80、 WOmg'kg—¹ ) 个剂量组以及阳性药组（吗丁啉 mg'kg )， 每组 8只， $ 各半。试验前大鼠禁食不禁水 36小时， 大鼠一次灌胃给药， 对照 组给予蒸馏水， 其他组给予相应药物。给药同时， 各大鼠在乙醚钱麻醉下， 打开 腹腔， 结扎幽门， 收集幽门结扎后 5小时的大鼠胃液， 以 3000r/irin离心 5min， 去处食物残渣等胃内容物， 用量筒准确称量胃液量。 量取胃液 linl， 置于三角烧 瓶中加入等量蒸馏水， 混合均匀， 加入游离酸指示剂 0.5%对二甲基偶氮苯胺乙 醇溶液和总酸指示剂 0.5%酚酞乙醇溶液各 2滴， 混合胃液中若含有盐酸， 即呈 樱红色。 用滴定管滴加 O.Olmol/L的 NaOH, ， 边加边摇动烧瓶， 至红色消失， 开始出现桔黄色为止。 即为游离盐酸的终点。 记下用去 NaOH至红色不再变深 为止的量， 即为总酸度的终点。 记下两次滴定用去 NaOH溶液总量。 计算游离 盐酸和总酸的浓度以及总分泌量。试验结果显示，枳实总黄酮苷提取物（20、 40、 SOmg-kg"¹)对幽门结扎大鼠的胃液分泌量无明显影响， 但枳实总黄酮苷提取物 ^Omg-kg-¹可减少大鼠的胃液分泌量； 枳实总黄酮苷提取物（80、 ^Omg-kg¹) 可升高幽门结扎大鼠游离盐酸和总酸的浓度，但枳实总黄酮苷提取物各剂量 (20、 40、 80、 ^Omg-kg¹) 对游离盐酸和总酸的分泌量无影响， 见表 49。 78014 表 49枳实总黄酮苷提取物对大鼠胃液分泌量、 游离盐酸和总酸浓度的影响 （X土 s) 剂 量， 胃液分泌量 游离盐酸浓度 ■ 总酸度 组 别 (mg · kg"¹) 只数 (ml) (謹 ol/L) (mmol/L) 对照组 ― 10. ■ 7.03士 2.95 33.4±11.8 67.3±li.9^:

20 10 . 6.55±2.64 46.4±22.2 77.6±14.2 枳实总黄酮苷 40 10 6.25±3.47 45.8±23.4 76.9±16.3 提取物组 80 10 5.47±2.41 59.9±25.3* ' 94.7±23.5*

160 ^剩 10 4.55±1.05*. 62.9±11.2** 95.2±15.4** 吗丁啉组 40 10 5.76±1, 98 63.9±15.8** 92.4 ±25.2* 注： 与对照组比较， *P<0.05, **P<0.01 6.2对胃蛋白酶的影响

将内径 l〜2mm粗细匀称的毛细玻管洗净烤干，取适量蛋清充分打匀后用纱 布过滤， 将上述毛细玻璃管利用虹吸作用， 灌满蛋清 （管内应无气泡混入）。 然 后放置于 85°C热蒸气中使蛋白质凝固。 待冷却后， 取出石蜡将蛋白管两端封固， 贮冰箱中备用。 实验时取胃液 1ml放入 50ml的三角烧瓶中， 加 0.05N盐酸溶液 15ml, 摇匀， 放进约长 2.5cm蛋白管二根。 塞好瓶口， 放于 37°C恒温箱中温孵 24ho用尺测量蛋白管两端透明部分的长度（mm) 以四端之值求其平均值， 用下 列公式计算胃蛋白酶的单位 =平均值 ²χ16。 试验结果显示， 枳实总黄酮苷提取 物各剂量 （20、 40、 80、 leOmg-kg¹) 对幽门结扎大鼠的胃蛋白酶活性无明显影 响， 见表 50。 表 50枳实总黄酮苷提取物对大鼠游离盐酸、 总酸分泌量和胃蛋白酶活性的影响 （i±s) 游离盐酸分泌量 总酸分泌量 胃蛋白酶活性 组 另 1J 只数 (mmol) (mmol) (U) 对照组 一 10 0.258±0.166 0.470±0.190 644.4±207.3

20 10 0.345±0.265 0.514±0.321 756.0±253.0 枳实总黄酮 40 10 0.318±0.246 0.518±0.357 527.5±233.8 苷

提取物组 80 10 0.279±0.251 0.499±0.352 808.5±434.1

160 10 0.315±0.207 0.539±0.252 975.6±6245.3 吗丁啉组 40 10 0.383±0.167 0.562±0.239 580.5±204.0 实验数据 7： 枳实总黄酮苷提取物对平滑肌的影响 7.1对离体胃肠平滑肌的影响

选用健康成年大鼠， 猛击头部致昏， 迅速取出全胃及十二指肠中段 l-2cm， 沿胃大弯处剪开， 用含 95% 0₂和 5% 00₂的混合气体充分饱和的 pH 7.35-7.45 的 Krebs液 (成份： NaCl 117 mmo.l/L KC1.4.8 mmol/L CaCl₂ 2.5 mmol/L. MgCl₂ 1.2 mmol/L、 Na¾P0₄ 1.2 mmol/L、 NaHC0₃ 25 mmol/L、 Glucose 11 mmol/L)反 复冲洗去除内容物， 分别取胃窦和胃底纵、 横肌条以及十二指肠中段长约 lcm， 宽约 0.5cm， 底端固定于通气钩， 上端与换能器 （JH-2型肌张力传感器） 相连， 并将其置入盛有氧饱和的 Krebs液（pH 7.35~7.45 ) 20ml的浴管中， 调整前负荷 为 lg, 每隔 20min换液一次， 通过通气钩向浴液内注入氧气， 应用 BL-420E生 物机能实验系统记录其张力及频率。外管经恒流输液泵 [持续、恒温（37±0.5 °C )、 恒速 （3~4 ml/min)] 灌流以保持浴槽内温度。 待标本稳定后， 加入待测药品最 终浓度分别为 0.25 mg/L、 0.4 mg/L、 0.55 mg L、 0.7 mg L.0.85 mg/L和 1.00 mg/L, 记录并观察用药前后频率及张力改变。 离体试验结果显示, 实施例 12枳实总黄 酮苷提取物（O^ mg.m l.O mg.mr¹ )可降低胃窦和胃底纵、 横形肌以及十二 指肠平滑肌张力， 抑制胃肠运动， 见表 51〜55。 表 51 枳实总黄酮苷提取物对离体胃窦横行肌张力和频率的影响 （X土 s)

日 ¾!1 浓度 样本 ： 张力 ' (S) 频率 (次）

(mgml"¹) 数 给药前 给药后 给药前 给药后

0.25 9 0.157±0.133 0.120±0.057 2.759±0.684 2.473±0.356 枳实总黄 0.55 9 0.218±0.131 0.114±0.075* 2.637±0.607 2.352±0.428 酮苷提取 0.70 9 0.230±0.147 0.117±0.062* 2.權 ±0.594 2.208±0.734 | 物组 0.85 9 0.194±0.108 0.089±0.070** 2.487±0.652 2.287±0.643

1.00 8 0.217±0.135 0.069±0.032* 2.635±0.547 2.384±0.876 注： 与给药前比较， *P<0.05， **Ρ<0.01

表 52 枳实总黄酮苷提取物对离体胃窦纵行肌张力和频率的影响 （i±s ) έ日 ¾| 浓度 样本 张力 （g) 频率 (次）

¾1 J

(mg-ιπΓ¹) 数 给药前 给药后 给药前 给药后

0.25 9 0.897±0.476 0.658±0.570* 3.189±1.564 3.012±1.601 1 枳实总黄 0.55 9 0.862±0.577 0.376±0.353** 3.175±1.631 4.507±3.100 酮苷提 0.70 9 0.707±0.537 0.317±0.309** 2.925±1.428 3.423±2.189 取物组 0.85 9 0.728±0.614 0.295±0.279* 3.078±1.428 2.955±1.143

1.00 8 0.538±0.455 0.228±0.167* 3.645±2.832 2.324±0.865 注： 与给药前比较， *P<0.05， **P<0.01 表 53 枳实总黄酮苷提取物对离体胃底横行肌张力和频率的影响（X±s ) 浓度 率 (次）

样本 · 张力 频

组 别 (mg'mr¹

数

) 给药前 给药后 给药前 给药后

0.25 9 0.356±0.142 0.328±0.127 3.587±1.952 3.523±1.928 枳实总 0.55 9 0.347±0.115 0.239±0.177* 3.745±1.854 3.124±1.328 黄酮苷提 0- 4 27 o 58.7 o o o 5 550 9 0.315±0.147 0.208±0.117* 4.109±1.985 3.108±1.456 取物组 0.85 9 0.447±0.304 0.164±0.121** 3.725±2.014 2.978±2.142

1.00 8 0.297±0.125 0.110±0.078** 3.573±2.530 1.974±1.898 注： 与给药前比较， ·*Ρ<0.05， **Ρ<0.01 表 54 枳实总黉酮苷提取物对离体胃底纵行肌张力和频率的影响 （X±s )

浓度 张力 （g) 频率 (：次）

样本

组 别 (mg-m ¹

数

) 给药前 给药后 给药前 给药后

0.25 9 0.412±0.425 0.296±0.257 2.426±0.578 2.048±0.452 枳实总 0.55 9 0.434±0.428 0.159±0.183** 2.355±0:516 1.871±0.531 黄酮苷提 0.70 9 0.438±0.374 0.215±0.315* 2.418±0.564 1.579±0.732** 取物组 0.85 9 0.419±0.432 0.154±0.189* 2.147±0.675 1.478±0.637*

1.00 7 0.376±0.396 0.124±0.105* 2.133±0.224 1.345±0.482** 注： 与给药前比较， *P<0.05， **P<0.01 表 55 枳实总黄酮苷提取物对离体十二指肠中段张力和频率的影响 （X土 s)

~~浓度 i 样本 张力 （g) 频率 (次） ―

I (m -mr¹ 数 给药前 给药后 给药前 给药后

9 1.852±0.698 1.698±0.664 20.55±7.321 20.89±8.005

9 1.954±0.674 1.467±0.534** 22.18±7.324 21.89±7.357 枳实总

9 1.854±0.678 1.310±0.507** 21.89±5.983 20.73±6.642 黄酮苷提

9 1.786±0.712 1.127±0.486** 22.18±4.489 21.08±7.078 取物组

9 1.798±0.562 1.079±0.543** 23.08±4.354 19.78±7.547

9 1.807±0.607 0.992士 0.487** 23.58±4.324 18.89±7.527 注： 与给药前比较， *P<0.05, **P<0.01 7.2 对在体十二指肠平滑肌的影响

大鼠 56只， 体重 180~230g, 随机分为 7组： 对照组、 模型组、 实施例 12 枳实总黄酮苷提取物 (20、 40、 80、 WOmg-kg-¹ ) 4个剂量组以及阳性药组 （吗 rm ^mg-kg ¹ ), 每组 8只， ？ 各半。 大鼠灌胃给药， 对照组和模型组给予蒸 馏水， 其他组给予相应药物。 各组大鼠禁食不禁水 16小时， 次日一次给药， 各 大鼠灌胃 30分钟后除对照组外， 其余大鼠给予 1.5mg'kg— ¹的盐酸多巴胺注射液 皮下注射造模， 水合氯醛麻醉， 沿腹正中线打开腹腔， 选择十二指肠中段约 N2011/078014

2-3cm, 将肠段两端用缝合线固定在肠管固定管两侧的小孔上， 再用一根缝合线 将一端缝在肠段中间的肠壁上， 另一端由肠管固定管中央穿出连在 JH-2型肌张 力传感器上， 并通过 .BL-420E 生物机能实验系统记录各大鼠十二指肠的.张力及 频率。 试验结果显示， 皮下注射 1.Smg-kg-¹的多巴胺可明显抑制在体大鼠十二指 · 肠的张力和频率， 枳实总黄酮苷提取物 （20、 40、 80、 ^Omg-kg¹) 能提高由多 巴胺抑制的大鼠十二指肠的张力和频率， 见表 56。 表 56 枳实总黄酮苷提取物对在体十二指肠中段张力和频率的影响 （ ±s)

组 另 IJ 只数 张力 (g) 频率 （次）

对照组 一 . 8 0.478±0.070 4.550±0.663 模型组 一 8 0.158±0.04 2.638±0.857^

20 8 0.539±0.278** 4.354 ±0.756** 枳实总 40 8 12.07 ±1.289** 7.948±1.531** 黄酮苷提

取物组 80 15.46± 1.282**

8 9.235±1.132**

160 8 8.378±0.642** 7.004土 0.647** 吗丁啉组 40 8 5.887±1.157** 6.895 ±1.103**

注： 与对照组比较， ^ΔΡ<0.05, ；与模型组比较， *Ρ<0.05， **Ρ<0.01

Claims

权利要求书

1、 一种枳实或枳壳总黄酮提取物， 通过枳实或枳壳提取得到，其特征在于取枳 实或枳壳切成饮片或 ¾3碎， 再用水煎煮提取或乙醇回流提取，

其中水煎煮提取方法是： 加 4~15倍量水， 煎煮 1~3次， 每次煎煮提取 1~3 小时，合并煎煮液，滤过，滤液通过已处理好的非极性大孔树脂，依次用水、 20% 以下的乙醇洗脱除去杂质， 再用 25~%90%乙醇、 0.5〜2%氢氧化钠洗脱， 洗脱， 收集乙醇洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.20~1.40 (50°C~70°C ) 的流浸膏， 减 压干燥， 干燥的温度为 60~80°C , 粉碎， 即得；

其中乙醇回流提取方法是:加 5~16倍体积的 30%~90%乙醇回流提取 1~3次， 每次回流提取 1~3小时， 滤过； 合并滤液， 滤液回收乙醇， 水溶液通过已处理好 的非极性大孔树脂， 依次用水、 20%以下的乙醇洗脱除去杂质， 再用 25%~90% 乙醇、 0.5~2%氢氧化钠洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约 1.20~1.40 ( 50°C~70°C ) 的流浸膏， 减压干燥， 干燥的温度为 60~80°C， 粉碎， 即得。

2、 如权利要求 1 所述的枳实或枳壳总黄酮提取物， 具体的水煎煮提取方法如 下： 取枳实或枳壳， 粉碎， 通过 8目筛， 加水煎煮 3次， 第一次加 8倍量水煮 2 小时， 第二、 三次分别加 6、 4倍量煎煮 1小时， 滤过， 合并滤液， 滤液通过已 处理好的 D101大孔树脂柱， 依次用水、 15%乙醇、 45%乙醇、 1%氢氧化钠洗脱， 收集 45%乙醇洗脱液，减压浓缩至相对密度约 1.30 (60°C )的流浸膏，减压干燥， 干燥的温度为 75'C， 粉碎， 即得。

3、 如权利要求 1所述的枳实或枳壳总黄酮提取物，具体的乙醇回流提取方法如 下- 取枳实或枳壳， 切成饮片， 加 7倍体积的 65%乙醇回流提取 2次， 每次回流 提取 2小时， 滤过； 合并滤液， 滤液回收乙醇， 水溶液通过己处理好的 D101大 孔树脂柱， 依次用水、 15%乙醇、 45%乙醇、 1%氢氧化钠洗脱， 收集 45%乙醇 洗脱液， 减压浓缩至相对密度约 1.30 (60°C )的流浸膏， 减压干燥， 干燥的温度 为 75°C， 粉碎， 即得。

4、 如权利要求 2或 3所述的枳实或枳壳总黄酮提取物，其中 15%乙醇部分洗脱 体积为每 1ml树脂用 3ml洗脱， 45%乙醇洗脱时选择每 ltnl树脂用 4ml洗脱。

5、 如权利要求 1〜4任一项所述的枳实或枳壳总黄酮提取物，其中提取物总黄酮 含量 50%以上。

6、 如权利要求 5所述的枳实或枳壳总黄酮提取物， 其中提取物总黄酮含量 80 %以上。

7、 如权利要求 1~6任一项所述的枳实或枳壳总黄酮提取物，其中还包含黄酮类 化学成分及其医学上可以接受的酚酸类成分，黄酮类化学成分含柚皮苷、新橙皮 苷、 橙皮苷、 新柚皮苷、 野漆树苷及其苷或苷元中的一种或多种。

8、 如权利要求 7所述的枳实或枳壳总黄酮提取物，其中含柚皮苷含量、新橙皮 苷含量分别达 25%以上。

9、 如权利要求 1~8任一项所述的枳实或枳壳总黄酮提取物，其中大孔树脂上样 量按树脂体积 (ml): 生药质量 (g)为 5:1。

10、 如权利要求 1~9任一项所述的枳实或枳壳总黄酮提取物， 其中每 lml树脂 的上样流速在 1.25~1.55ml/h之间。

11、 如权利要求 1-10任一项所述的枳实或枳壳总黄酮提取物， 其中每 1ml树脂 的洗脱流速为 1.25~1.45ml/ 之间， 所述非极性大孔树脂径高比为 1 :10， 上样后 药液的静态吸附时间为 1小时。

12、 权利要求 1~11 任一项所述的枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗胃肠 运动障碍型功能性消化不良疾病药物的用途。

13、 权利要求 1~11 任一项所述的枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗化疗 药物或其他原因引起的呕吐疾病药物的用途。

14、 权利要求 1~11 任一项所述的枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗呕吐 及化疗药物或其他原因引起的呕吐疾病药物的用途。

15、 权利要求 1~11 任一项所述的枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗上腹 疼痛疾病药物的用途。

16、 权利要求 1~11任一项所述的枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗腹胀、 厌食、 嗳气疾病药物的用途。

17、 权利要求 1~11 任一项所述的枳实或枳壳总黄酮提取物用于制备治疗恶心 疾病药物的用途。

18、 一种枳实或枳壳总黄酮提取物制剂，该制剂以权利要求 1~11任一项所述的 枳实或枳壳总黄酮提取物为主要活性成分。