WO2012085447A1

WO2012085447A1 - Procédé de dosage d'anticorps dirigés contre le facteur viii

Info

Publication number: WO2012085447A1
Application number: PCT/FR2011/053089
Authority: WO
Inventors: Jean-Luc Plantier
Original assignee: Lfb-Biotechnologies
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-20
Publication date: 2012-06-28
Also published as: FR2969761A1

Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé d'identification et de suivi d'un traitement thérapeutique visant à supprimer la réponse immunitaire dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile, comprenant respectivement, le dosage spécifique, dans un échantillon dudit patient, des anticorps inhibiteurs dirigés contre le facteur VIII humain, et le dosage spécifique, dans un échantillon dudit patient, de l'anticorps anti-idiotypique correspondant.

Description

Procédé de dosage d'anticorps dirigés contre le facteur VIII

L'invention concerne un procédé d'identification d'un traitement thérapeutique visant à supprimer la réponse immunitaire dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile. L'invention se rapporte également à un procédé de suivi d'un traitement thérapeutique visant à supprimer la réponse immunitaire dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile.

L'hémophilie est une anomalie constitutionnelle de la coagulation sanguine en rapport avec un déficit d'un des facteurs de la coagulation. Ces défauts sont dus à une déficience d'un des facteurs suivants : XII, XI, IX ou VIII, ou à la présence d'anticoagulants contre l'un de ces facteurs.

Les manifestations cliniques de la maladie sont proportionnelles au déficit du facteur de la coagulation. Elles correspondent aux hémorragies qui peuvent atteindre chaque organe, en particulier les articulations (hémarthroses) et les muscles (hématomes). La maladie peut être sévère avec manifestations dès la première année de vie ou légère avec très peu de manifestations.

Il existe plusieurs types d'hémophilie en rapport avec le facteur de coagulation déficitaire :

• l'hémophilie A (hémophilie classique) correspond à une mutation du gène du facteur VIII

• l'hémophilie B (ou Christmas disease) correspond à une mutation du gène du facteur IX

• l'hémophilie C (ou Maladie de Rosenthal) correspond à une mutation du gène du facteur XI.

En particulier, l'hémophilie A est due à une déficience en facteur VIII du fait de la mutation du gène ou du promoteur correspondant. Le facteur VIII (ou facteur anti-hémophilique A) est présent dans le plasma à l'état de traces, et joue un rôle de cofacteur dans la cascade de la coagulation. L'analyse de la molécule facteur VIII montre qu'elle est constituée de trois domaines distincts A, B, C. Le domaine A de 330 AA est fait de trois exemplaires A1 , A2, A3. Le domaine B de 983 AA est unique. Le domaine C fait de deux segments C1 , C2 de 150 AA chacun. La séquence des différents domaines, de N- en C-terminal, est A1 -A2- B-A3-C1 -C2. Les traitements actuels de l'hémophilie A ne guérissent pas, mais consistent en l'administration par voie intraveineuse de facteur VIII (FV III) humain permettant d'obtenir une activité coagulante suffisante pour arrêter, voire prévenir, l'hémorragie. Cependant, les injections répétées de facteur VIII chez un patient induisent la production d'alloanticorps qui inhibent l'action du facteur VIII, aussi appelés « inhibiteurs de facteur VIII » ou « anticorps inhibiteurs de facteur VIII » (Sahud et al, Haemophilia 2007, 13, 317- 322, ELISA System for détection of immune responses to factor VIII : a study of 246 samples and corrélation with the Bethesda assay). Ces anticorps inhibiteurs de facteur VIII sont actuellement éliminés soit en induisant un protocole de tolérance immune, qui consiste en l'injection de doses massives de facteur VIII durant des périodes longues, soit en épurant le sang du patient par dialyse (Astermark Thromb Res 2010 nov ; Guillet Brit J Haematol 2001 . 1 14 p837). Une telle méthode est très lourde pour le patient, nécessite du temps et est relativement coûteuse.

Il existe donc un besoin de disposer d'une méthode alternative d'élimination des anticorps inhibiteurs de facteur VIII, qui soit efficace, facile à mettre en place, rapide, et moins invasive pour le patient. Par ailleurs, pour qu'un traitement soit efficace, il est judicieux que ce dernier soit adapté au patient.

On sait que les anticorps inhibiteurs de facteur VI II développés par un même patient sont de plusieurs idiotypes (Fulcher, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1985. 82 p7728). Par idiotype, on entend une conformation caractéristique de la partie variable d'une immunoglobuline (Ig), qui est propre à ce clone d'Ig et qui permet la reconnaissance spécifique d'un antigène.

Aussi, il est intéressant de connaître la nature précise du ou des principaux anticorps inhibiteur(s) de facteur VIII chez un patient donné, afin de traiter ce dernier de façon personnalisée, i.e. avec le ou les anticorps anti-idiotypique(s) dirigé(s) contre le principal anticorps inhibiteur ou les principaux anticorps inhibiteurs de facteur VIII. Comme indiqué ci-après, on entend par « principal anticorps inhibiteur de facteur VIII », l'anticorps inhibiteur présent en quantité la plus grande ou qui possède l'affinité et/ou la spécificité la plus forte pour le facteur VIII. C'est pourquoi la Demanderesse s'est attachée à la mise au point d'un nouveau procédé d'identification d'un traitement thérapeutique visant à supprimer la réponse immunitaire dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile. Ce procédé permet d'identifier facilement et rapidement les anticorps inhibiteurs anti-facteur VIII chez un patient selon leur idiotype ; le traitement des patients s'en trouve donc grandement facilité.

La présente invention a donc pour objet un procédé d'identification d'un traitement thérapeutique visant à supprimer la réponse immunitaire dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile (ci-après « procédé d'identification »), comprenant les étapes successives suivantes :

a) le dosage spécifique, dans un échantillon dudit patient, des anticorps inhibiteurs dirigés contre le facteur VIII humain ;

b) l'identification du ou des anticorps inhibiteurs principaux dirigés contre le facteur VIII humain ; et

c) la sélection et/ou la préparation d'au moins un anticorps anti-idiotypique dirigé contre au moins un anticorps inhibiteur principal identifié à l'étape b).

Par « étapes successives », on entend que les étapes a), b) et c) ci-dessus se déroulent dans un ordre chronologique ; cela n'exclut pas l'introduction d'étape(s) supplémentaire(s) intercalaire(s).

La présente invention a également pour objet un procédé de suivi d'un traitement thérapeutique visant à supprimer la réponse immunitaire dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile (ci-après « procédé de suivi »), comprenant une étape de dosage spécifique, dans un échantillon dudit patient, de l'anticorps anti-idiotypique obtenu à l'étape c) ci-dessus.

Par « anticorps dirigé contre le facteur VIII humain », on entend un anticorps qui reconnaît et se fixe spécifiquement à un épitope du facteur VIII humain. Par « épitope du facteur VIII humain », on entend le site de fixation de l'anticorps au facteur VIII humain. L'épitope peut être constitué d'un domaine dudit facteur VIII humain (A1 , A2, A3, B, C1 ou C2), d'au moins un fragment d'un domaine, ou d'au moins un fragment du facteur VIII. Par exemple, l'anticorps dirigé contre le facteur VIII humain peut être un anticorps qui reconnaît et se fixe spécifiquement au domaine A1 du facteur VIII humain. Par « anticorps anti-idiotypique » dans l'ensemble de la présente demande, on entend un anticorps qui reconnaît spécifiquement l'idiotype d'un anticorps donné. Un anticorps anti- idiotypique A est donc un anticorps anti-anticorps qui reconnaît et se fixe de façon spécifique, à un anticorps B au niveau de la conformation caractéristique de sa partie variable, qui lui est propre.

L'échantillon de patient utilisé dans les procédés selon l'invention est de préférence un échantillon sanguin. Il peut être constitué de sang, de plasma, ou de sérum.

Par plasma, on entend le sang débarrassé de ses plaquettes, de ses globules blancs (leucocytes) et de ses érythrocytes.

Par sérum, on entend le plasma débarrassé de la fibrine.

Le procédé d'identification selon l'invention permet de choisir le meilleur traitement thérapeutique possible, en vue de supprimer la réponse immunitaire dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile. Bien évidemment, le procédé selon l'invention est un procédé in vitro. Il comprend une étape a) de dosage spécifique des anticorps inhibiteurs anti-facteur VIII humain. Par « dosage spécifique » des anticorps anti-facteur VIII humain, on entend un dosage qui quantifie précisément et avec une bonne affinité les anticorps inhibiteurs anti-facteur VIII humain.

Ce dosage est de préférence un dosage immunologique (ou immunodosage).

Parmi les dosages immunologiques utilisables, on peut citer les immunodosages classiquement utilisés, avec ou sans compétition, comme décrits par exemple dans « The Immunoassay Handbook », David Wild, 2005.

De préférence, le dosage spécifique de l'étape a) comprend, comme réactifs, des fragments de facteur VIII humain. Les fragments de facteur VIII humain peuvent être choisis parmi les fragments A1 , A2, A3, B, C1 et C2 humains.

Un tel dosage comprend ainsi le mélange des fragments de facteur VIII humain avec l'échantillon du patient - qui comprend les anticorps inhibiteurs anti-facteur VIII humain -, puis la révélation des complexes formés fragments de facteur VIII humain/anticorps inhibiteurs anti-facteur VIII humain. De façon préférée, le dosage spécifique de l'étape a) comprend les étapes suivantes : i) la préparation de fragments de facteur VIII humain, lesdits fragments étant fixés de manière covalente ou par affinité sur une plaque ou sur des billes, telles que des billes de polystyrène ;

ii) l'addition d'un échantillon de patient sur les fragments fixés en i) ;

iii) l'incubation du mélange obtenu en ii) pendant un temps et à une température suffisants pour obtenir des complexes fragments de facteur VIII humain/anticorps inhibiteurs antifacteur VIII humain. De préférence, l'incubation se fait pendant un temps compris entre 30 min et 16h, et à une température comprise entre 4°C et 40°C, de préférence comprise entre 20 ^ et 38^ ;

iv) le lavage des complexes formés en iii) ;

v) la révélation de la quantité de complexes obtenus en iv) par l'addition d'un anticorps secondaire marqué. Le marquage peut se faire à l'aide d'un composé radioactif (radiomarquage), par une enzyme (enzymoimmunoassay ou ELISA), par fluorescence (fluoroimmunoassay), ou par luminescence (luminoimmunoassay). L'anticorps secondaire peut être un anticorps anti-lgG humain, par exemple un anticorps de chèvre anti-lgG humain.

Selon un mode de réalisation de l'invention, les fragments préparés à l'étape a) peuvent être porteurs d'une étiquette qui permet de les purifier et de les fixer, notamment sur une plaque ou au fond d'un puits.

Alternativement, le dosage spécifique de l'étape a) comprend, comme réactifs, des anticorps anti-idiotypiques dirigés contre les anticorps inhibiteurs dirigés contre le facteur VIII humain (ou « anticorps anti-facteur VIII humain »), ou des fragments de ces anticorps. En effet, lesdits anticorps anti-idiotypiques peuvent être présents sous forme complète ou sous forme de fragments. Les fragments sont choisis parmi les formats qui comprennent au moins les 6 CDR, tels que les Fab, (Fab')2 et Fv.. Lesdits anticorps anti-idiotypiques peuvent être naturels ou recombinants.

Un tel dosage comprend ainsi le mélange des anticorps anti-idiotypiques, ou leurs fragments, dirigés contre les anticorps anti-facteur VIII humain avec l'échantillon du patient - qui comprend les anticorps anti-facteur VIII humain -, puis la révélation des complexes formés anticorps anti-idiotypiques ou leurs fragments/anticorps anti-facteur VIII humain. De façon préférée, le dosage spécifique de l'étape a) comprend les étapes suivantes : i) la préparation des anticorps anti-idiotypiques, ou leurs fragments, dirigés contre les anticorps anti-facteur VIII humain, lesdits anticorps anti-idiotypiques ou leurs fragments étant fixés de manière covalente ou par affinité sur une plaque ou sur des billes, telles que des billes de polystyrène ;

ii) l'addition d'un échantillon de patient sur les anticorps anti-idiotypiques ou leurs fragments fixés en i) ;

iii) l'incubation du mélange obtenu en ii) pendant un temps et à une température suffisants pour obtenir des complexes anticorps anti-idiotypiques ou leurs fragments/anticorps anti- facteur VIII humain. De préférence, l'incubation se fait pendant un temps compris entre 30 min et 24h, et à une température comprise entre 4°C et 40°C, de préférence comprise entre 20 ^ et 38^ ;

iv) le lavage des complexes formés en iii) ;

v) la révélation de la quantité de complexes obtenus en iv) par l'addition d'un anticorps secondaire marqué. Le marquage peut se faire à l'aide d'un composé radioactif

(radiomarquage), par une enzyme (enzymoimmunoassay ou ELISA), par fluorescence (fluoroimmunoassay), ou par luminescence (luminoimmunoassay). L'anticorps secondaire peut être un anticorps anti-lgG humain, par exemple un anticorps de chèvre anti-lgG humain.

De préférence, le dosage réalisé dans l'étape a) est un dosage ELISA. De préférence, le dosage ELISA utilise comme enzyme de marquage une enzyme choisie parmi la phosphatase alcaline, la péroxydase, la P-galactosidase et la glucose 6-phosphate déshydrogénase.

A la fin de l'étape a), la quantité de chaque anticorps anti-facteur VIII humain est déterminée. On obtient donc un profil, pour chaque patient, des différents anticorps antifacteur VIII. A partir de ce profil, on identifie dans l'étape b) le ou les anticorps dirigé(s) contre le facteur VIII humain dit « principal(aux) ». Le patient peut en effet présenter un seul anticorps principal, ou plusieurs anticorps principaux. Par anticorps principal identifié à l'étape b), on entend un anticorps anti-facteur VIII humain qui est présent en quantité la plus grande dans l'échantillon dudit patient ou qui possède l'affinité et/ou la spécificité la plus forte.

L'affinité d'un anticorps pour un antigène est définie par la constante d'équilibre K, qui est le rapport (concentration des complexes antigène/anticorps) / [(concentration d'anticorps)*(concentration d'antigène)]. La spécificité d'un anticorps pour un antigène correspond à la propriété que possède un anticorps de se lier à cet antigène, en tenant compte de l'éventuelle réactivité croisée dudit anticorps pour d'autres antigènes. Plus la réactivité croisée est faible, plus la spécificité est forte. C'est à partir de cet anticorps principal, dirigé contre le facteur VI II, qu'un anticorps anti- idiotypique va pouvoir être sélectionné

En effet, une fois l'anticorps principal identifié, l'anticorps anti-idiotypique dirigé contre cet anticorps principal est sélectionné. La préparation de l'anticorps anti-idiotypique aura été faite selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier, par exemple par injection chez la souris du domaine Fab de l'anticorps principal en présence d'adjuvants et par génération d'anticorps monoclonaux dirigés contre cet idiotype. Des anti-idiotypes de chacun des domaines du facteur VI I I auront été préalablement sélectionnés sur leur capacité à bloquer les inhibiteurs en nombre et en qualité (Giles et al Blood 2004, 1 03 p2618).

A titre d'anticorps anti-idiotypiques utilisables selon l'invention, on peut citer :

- les anticorps décrits dans la demande WO 2007/051926, qui sont dirigés contre les anticorps inhibiteurs du domaine C2 du facteur VI I I humain. De préférence, on utilise l'anticorps EMAB565, qui est susceptible d'être produit par le clone R565, déposé le 25 octobre 2005 sous le numéro -351 0 à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (GNCM, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 1 5) ;

- les anticorps décrits dans la demande EP 1 749 537, qui sont dirigés contre les anticorps inhibiteurs du domaine A2 du facteur VI II humain. De préférence, on utilise l'anticorps susceptible d'être produit par le clone 30D1 , déposé sous le numéro 1-3450 à la Collection Nationale de Culture des Microorganismes (GNCM, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 1 5} ; ou encore

- les anticorps décrits dans la demande WO 2007/096536, qui sont dirigés contre les anticorps inhibiteurs du domaine C1 du facteur VI I I humain. De préférence, on utilise l'anticorps 18B6, qui est susceptible d'être produit par le clone 18B6, déposé le 24 janvier 2008, sous le numéro 1-3559 à la. Collection Nationale de Culture des croorganismes (CNC , 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15).

Le procédé d'identification selon l'invention permet de sélectionner l'anticorps anti- idiotypique adapté à chaque patient, et ainsi de personnaliser le traitement afin de l'alléger.

La présente invention a également pour objet le procédé de suivi. Ce procédé permet de contrôler la biodisponibilité de l'anticorps anti-idiotypique administré au patient.

L'invention a également pour objet l'utilisation de l'anticorps anti-idiotypique obtenu dans le procédé d'identification pour le traitement de l'hémophilie.

De préférence, le dosage de cet anticorps anti-idiotypique dans le procédé de suivi comprend, comme réactifs, des anticorps entiers anti-facteur VIII humain ou des fragments d'anticorps anti-facteur VIII humain, tels que des Fab dirigés contre le facteur VIII humain. Les fragments d'anticorps anti-facteur VIII humain sont notamment choisis parmi les formats qui comprennent au moins les 6 CDR, tels que les Fab, (Fab')2 et Fv. Lesdits anticorps anti-facteur VIII humain et leurs fragments peuvent être naturels ou recombinants. Ils peuvent comprendre une étiquette qui permet notamment de les purifier. Ils peuvent être produits en système procaryote ou eucaryote.

Par « Fab », on entend un anticorps dont la région constante, y compris la région charnière, a été enzymatiquement clivée, ou qui a été produit sans cette région ; le Fab conserve un des deux sites de liaison à l'antigène. Les fragments Fab consistent en une chaîne légère qui est liée de façon covalente à une portion de la chaîne lourde appelée Fd.

Par « Fab dirigé contre le facteur VIII humain », on entend un Fab qui reconnaît et se fixe spécifiquement à un épitope du facteur VIII humain.

Par « Fv », on entend la portion N-terminale d'un fragment Fab consistant en les domaines variables d'une chaîne lourde et d'une chaîne légère.

Un tel dosage comprend ainsi le mélange des anticorps entiers anti-facteur VIII humain ou des Fab dirigés contre le facteur VIII humain avec l'échantillon du patient sous traitement - qui comprend les anticorps anti-idiotypiques -, puis la révélation des complexes formés anticorps ou Fab anti-facteur VIII humain/anticorps anti-idiotypiques.

De façon préférée, le dosage spécifique des anticorps anti-idiotypiques comprend les étapes suivantes :

i) la préparation des anticorps entiers anti-facteur VIII humain ou des Fab dirigés contre le facteur VIII humain, lesdits anticorps entiers ou Fab étant fixés de manière covalente sur une plaque ou sur des billes, les billes étant de préférence des billes de polystyrène ; ii) l'addition d'un échantillon de patient sur les anticorps entiers ou les Fab fixés en i) ; iii) l'incubation du mélange obtenu en ii) pendant un temps et à une température suffisants pour obtenir des complexes anticorps entiers ou Fab anti-facteur VIII humain/anticorps anti-idiotypiques. De préférence, l'incubation se fait pendant un temps compris entre 30 min et 24h, et à une température comprise entre 4°C et 40°C, de préférence comprise entre 20 ^ et 38^ ;

iv) le lavage des complexes formés en iii) ;

La présente invention est illustrée à l'aide des exemples ci-dessous, qui ne sont nullement limitatifs. Figure 1 : Reconnaissance des fragments du facteur VIII par des plasmas de sujets sains

Les fragments de FVIII (25 ng/puits) ont été fixés sur la nuit dans du CAPS 50 mM pH 9,5. Les puits ont été bloqués par du Tween-20 2% pendant 1 h. Des dilutions (au 5^eme ou au 25^eme) de plasma de sujets sains (N °3-12) sont incubées 2h à température ambiante puis les IgG humaines sont révélées après incubation avec un anticorps anti-lgG humaines couplé à la peroxydase. Figure 2 : Reconnaissance des fragments du facteur VIII par un plasma hémophile avec inhibiteurs (100 UB/ml) reconstitué

Les fragments de FVIII (25 ng/puits) ont été fixés sur la nuit dans du CAPS 50 mM pH 9,5. Les puits ont été bloqués par du Tween-20 2% pendant 1 h. Des dilutions de plasma dépiété en FVIII (Stago) et reconstitué par un anticorps anti-FVIII (100 UB/ml final) sont incubées 2h à température ambiante puis l'ELISA est révélée après incubation avec un anticorps anti-lgG de mouton couplé à la peroxydase.

Figures 3 et 4 : Représentation schématique des 4 plasmides d'expression pCep4 fragment FVIII

Figures 5 et 6 : Reconnaissance des fragments du facteur VIII par des plasmas d'hémophile A avec inhibiteurs (20 et 21 UB/ml)

Les fragments de FVIII (50 ng/puit) ont été fixés sur la nuit dans du CAPS 50 mM pH 9,5. Les puits ont été bloqués par du Tween-20 2% pendant 1 h. Des dilutions de plasma d'hémophile A avec inhibiteurs (20 et 21 UB/ml) sont incubées 2h à température ambiante puis l'ELISA est révélée après incubation avec un anticorps anti-lgG humaines couplé à la peroxydase. Les dilutions d'anticorps sont données en unités Bethesda.

Exemple :

Matériels et Méthodes 1.1. Préparation de fragments recombinants de facteur VIII

1 .1 .1 . Principe

On procède à la construction de vecteurs d'expression pour produire dans la lignée HEK293 FreeStyle (Invitrogen) les différents domaines du FVIII (A1 , A2, A3C1 et C2). Ces vecteurs d'expression seront construits sur une base de vecteur pCEP4 (vecteur de référence pour la lignée HEK293, Invitrogen), voir les figures 3 et 4. Le peptide signal MB7 (WO 201 1/1 14063) est ajouté en amont des séquences codantes pour potentialiser l'expression. Deux étiquettes sont ajoutées en aval des domaines, une pour faciliter la purification (6xHIS) et l'autre pour faciliter notamment la présentation (STREP tag) de chaque domaine du FVIII. Les deux étiquettes sont séparées par un site de clivage protéique TEV.

1 .1 .2. Clonage des fragments

Les séquences codantes des domaines A1 , A2, A3C1 et C2 du facteur VIII humain ont été utilisées (Jacquemin et al. Blood 1998 vol. 92 p496-506). Une série de PCR d'assemblage a été réalisée pour insérer la séquence du peptide signal MB7 et les étiquettes suivant le schéma 1 :

Schéma 1 : Stratégie de clonage des fragments du facteur VIII

Les séquences des amorces utilisées pour obtenir les fragments PCR sont indiquées dans le tableau 1 ci-dessous : Tableau 1 : amorces utilisées pour la PCR

Les domaines A1 , A3C1 et C2 (de séquence protéique SEQ ID NO : 1 , 3 et 4 respectivement ; et de séquence nucléique SEQ ID NO : 5, 7 et 8 respectivement) sont clonés entre les sites Xhol et BamHI . Le domaine A2 (de séquence protéique SEQ ID NO :2, et de séquence nucléique SEQ ID NO : 6) est cloné entre les sites Hindlll et Xhol. Les PCR sont réalisées avec une Taq HiFidelity suivant les indications du fournisseur en 15 cycles maximum et en utilisant 100 ng de plasmide. Pour les vecteurs pCEP4-FVIII- A2 et pCEP4-FVIII-A3C1 , n'arrivant pas à obtenir de clones corrects avec la technique de PCR d'assemblage, les inventeurs ont opté pour la technique Infusion (Clontech ; 40ng PCR FVIII ; 4ng PCR MB7; 4ng PCR TAG; Tampon 5X; Enzyme infusion ; 15 min à 37°C; 15 min à 55 °C puis mise à 4°C et ajout de 40μί H₂0) avant transformation. 1 .1 .3. Génération des vecteurs

Les fragments de PCR (1275 bases pour A1 , 1263 bases pour A2, 1731 bases pour A3C1 , 639 bases pour C2) ont été insérés par ligation dans le vecteur pCEP4 ouvert par les enzymes de restriction correspondantes puis transformés dans des bactéries TOP10 (Invitrogen). Les bactéries ont ensuite été étalées sur des plaques de LB agar contenant de l'ampicilline pour uniquement amplifier les bactéries contenant un vecteur d'expression. Les clones bactériens contenant un insert d'intérêt codant un domaine de FVIII ont été criblés par PCR avec les amorces CMV1/ et T2-MB7 qui amplifient un amplicon de 262pb. Les clones positifs en PCR ont été séquencés au niveau de la séquence d'ADNc codant les domaines. Toutes les séquences retenues été conformes à la séquence théorique à l'exception d'un polymorphisme silencieux qui a été retrouvé dans le domaine A1 .

1 .1 .4. Production des fragments

Les fragments ont été produits dans la lignée HEK293 FreeStyle (InVitrogen). La lignée est maintenue en milieu F17 en présence de 8 mM L-Glutamine (InVitrogen). La veille de la transfection les cellules sont repiquées à 7x10⁵ cellules/ml. Le jour de transfection, les cellules (env. 17x10⁵ cellules/ml) sont transfectées avec du PEI linéaire 25 kD (Sigma) prédilué en milieu Opti-MEM (Gibco). Les complexes vecteurs/PEl en Opti-MEM sont formés par incubation 20-30 min à température ambiante après agitation modérée par vortex Le complexe est ensuite ajouté aux cellules qui sont ensuite incubées sous agitation à 37°C et 8% C0₂. Les surnageants sont récoltés à J+5, centrifugés à 1700 rpm/min et filtrés à 0,2 μηι. Le cas échant ces surnageants filtrés sont concentrés par filtration tangeantielle à l'aide de Millipack (Millipore) avant d'être à nouveau filtrés de façon stérilisante à 0,2μηι.

1 .2. Purification des fragments

Les protéines sont purifiées sur AKTA (GE-Healthcare). Un volume de tampon 5X de mise en solution de l'échantillon (tampon phosphate 100 mM, NaCI 2,47 M, KCI 27 mM, imidazole 150 mM, pH 7,4) est ajouté pour 4 volumes de surnageant de culture concentré-filtré. Cette solution est déposée sur une colonne HiTrap-Chelating HP (GE- Healtcare) de 1 ml puis la colonne est lavée avec du tampon d'équilibration (tampon phosphate 20 mM, NaCI 495 mM, KCI 5 mM, imidazole 30 mM, pH 7,4) jusqu'au retour de la ligne de base en densité optique (environ 15 volumes de colonne). Les protéines fixées sont ensuite éluées par le tampon d'élution (tampon phosphate 20 mM, NaCI 495 mM, KCI 5 mM, imidazole 500 mM, pH 7,4). Afin de déterminer les fractions contenant les fragments purifiés, ces dernières sont analysées en ELISA et par migration en SDS- PAGE. Un aliquot des fractions est dilué en tampon CAPS 50 mM pH 9,5 puis incubé sur la nuit à 4^<C. Les fractions contenant les fragments sont révélées en ELISA grâce à un anticorps polyclonal de mouton anti-facteur VIII établi chez le mouton (Cedarlane). Les fractions contenant les fragments sont visualisées en SDS-PAGE et coloration en Page-Blue (Thermo Scientific). Un mélange des fractions les plus concentrées en fragment de facteur VIII est réalisé avant stockage à -80 °C.

2. Caractérisation des fragments 2.1 . Immunoblotting

Les échantillons sont chauffés avec 5μΙ de tampon de charge Laemmli (4X) dans un volume maximal de 25 μΙ à l OO 'C durant 5 min. Les échantillons sont déposés sur des gels précoulés en gradient d'acrylamide à 4-12 % (NuPage Bis-Tris gel, InVitrogen) puis mis à migrer en tampon MOPS à 200V. Après migration, le gel est coloré en Page-Blue ou transféré sur membrane de nitrocellulose (Hybond C extra, GE Healthcare) à 42 mA par membrane durant 120 min. Les membranes sont ensuite immunoblottées après blocage une nuit en tampon PBT (PBS-BSA 1 %-Tween 20 0,05%). Les anticorps sont ensuite ajoutés aux dilutions optimales en PBT. Le blot est révélé en chimioluminescence avec un kit Super Signal West Pico (Pierce).

2.2. ELISA de caractérisation des fragments

Les fragments sont fixés à 25 ng/puits en tampon CAPS 50 mM pH 9,5 sur la nuit à 4°C. Le puits est saturé en PBS-Tween-20 2% durant 1 h à 37^<C. Les anticorps monoclonaux (GMA012 (Abcam) ; ESH4 (American Diagnostica)) ou polyclonaux (Anti-FVIII de mouton ; Cedarlane) sont dilués en PBS-Tween-20 0,05 % et incubés durant 2h à température ambiante. L'anticorps secondaire couplé à la peroxydase est incubé durant 1 h30 à température ambiante. Le signal est révélé par ajout du TMB (Pierce) et arrêté par du H₂S0₄ 2M. La lecture est réalisée à 450 nm sur un lecteur de plaque Tecan. 2.3. Quantification des protéines étiquetées 6xHis par ELISA

Le kit commercial de dosage des protéines marquées au 6xHis fourni par Cell Biolabs est utilisé suivant les indications du fournisseur.

3. Validation du test : ELISA sur fragments Un protocole identique à l'ELISA de caractérisation des fragments est utilisé pour valider la réponse des plasmas sur les fragments recombinants. Les plasmas sont utilisés à des concentrations variées.

Résultats

1. Obtention des fragments recombinants

Différents fragments PCR, codant pour les domaines du facteur VIII, ont été obtenus par amplification enzymatique et recombinés entre eux en suivant le protocole décrit au schéma 1 . Les séquences codantes des fragments ont été insérées dans le vecteur d'expression pCEP4 par clonage directionnel. Les séquences codantes pour les 4 fragments de facteur VIII avec le peptide signal MB7 et portant les deux étiquettes (StrepTag et 6XHis) en 3' de la construction ont été obtenues et validées par leur séquençage complet. Seule la séquence du domaine A1 a été retrouvée porteuse d'un polymorphisme silencieux (T/A), déjà décrit dans les bases de données publiques.

Les vecteurs ont ensuite été transfectés dans la lignée suspensive HEK293 Freestyle. Le taux de transfection transitoire a été suivi par la transfection du vecteur rapporteur contrôle pmax-GFP (Kit AMAXA, Lonza). Au moment de la transfection, la viabilité cellulaire était supérieure à 95% pour tous les essais. Les taux de transfection dans des conditions normales s'établissent autour de 24-29%. La transfection des fragments du FVIII n'induit pas d'augmentation significative de la mortalité cellulaire puisque le contrôle sans plasmide montre une viabilité à 95.2% à J+5 alors que les cellules exprimant les fragments sont dans une proportion comprise entre 91 et 93%.

Les productions des fragments étiquetés dans les surnageants de culture sont réalisées et rapportées dans le tableau 2.

Tableau 2 : Expression transitoire des fragments du facteur VIII

Les cellules HEK293 sont transfectées par du PEI 25kD comme décrit dans le matériel et méthodes. Au jour 5, les cellules vivantes sont comptées et leur viabilité est calculée. La concentration des fragments dans le surnageant de culture est mesurée par ELISA anti- 6xHis. Les données sont représentatives de 3 expériences différentes. Les taux de production des fragments restent cependant variables entre les différentes productions mais dans un rapport proche.

2. Purification des fragments recombinants

Afin de purifier les fragments exprimés, les surnageants de culture sont passés sur une colonne Ni-NTA suivant le protocole décrit dans le matériel et méthodes. Les fractions éluées sont analysées en ELISA (non montré) puis les fractions positives sont séparées par SDS-PAGE et colorées au bleu de Coomassie. Les purifications des domaines A2, A3C1 et C2 font apparaître une bande majoritaire au poids moléculaire attendu (données non montrées). En revanche, le fragment A1 a été retrouvé dans de nombreuses fractions, y compris dans les fractions de lavage de la colonne. Le fragment A1 a donc été dilué pour rétablir les conditions de la charge puis repassé sur colonne. Il a été lavé avec une concentration de 25 mM d'imidazole puis avec le tampon d'élution classique contenant 500 mM d'imidazole. Le domaine A1 est retrouvé dans ces deux fractions (25 mM et 500 mM imidazole). Ces deux fractions seront utilisées pour la caractérisation du domaine A1 mais seule la fraction éluée à forte concentration d'imidazole sera utilisée en présence de plasma.

Les concentrations des fragments sont mesurées par lecture de la densité optique directe à 280 nm. Les valeurs obtenues sont présentées dans le tableau 3 et correspondent aux intensités des produits visualisés sur gels.

Les volumes de milieu de culture utilisés pour les purifications des fragments sont indiqués (sgt=surnageant) ainsi que le volume de tampon (tp) rajouté. Les densités optiques des éluats sont indiquées ainsi que les volumes des différents pools. Les concentrations des fragments dans les pools sont indiquées suite à la mesure de DO ainsi que la quantité totale de fragment obtenue.

^* : la concentration du domaine A 1 en densité optique mesure aussi les taux importants de contaminant d'où cette valeur élevée. 3. Caractérisation des fragments recombinants

Afin de confirmer que les produits observés correspondent bien à des fragments de FVIII, les pools de fragments sont séparés à nouveau par SDS-PAGE puis immunoblottés soit avec un anticorps polyclonal anti-FVIII (Anticorps de mouton ; Cedarlane) soit avec deux anticorps monoclonaux anti-domaine A2 (GMA-012 ; Abcam) ou anti-domaine C2 (ESH4, American Diagnostica) (données non montrées).

L'anticorps polyclonal reconnaît tous les fragments mais il reconnaît préférentiellement le domaine A3C1 . Il est à noter que les protéines contaminantes du domaine A1 ne sont pas révélées, ce qui démontre la spécificité de l'anticorps polyclonal. Les deux anticorps monoclonaux reconnaissent préférentiellement le domaine contre lequel ils sont dirigés mais donnent cependant un bruit de fond sur d'autres domaines du FVIII. Ainsi l'anti-A2 reconnaît partiellement le domaine C2, et l'anti-domaine C2, le domaine A1 . Les fragments générés et purifiés correspondent donc bien aux fragments de FVIII attendu. Ils sont reconnus par des anticorps anti-FVIII et migrent aux poids moléculaires attendus.

Les produits contaminants du domaine A1 ne sont pas reconnus par l'anticorps polyclonal.

4. Validation de l'essai

4.1 . Détermination du bruit de fond de l'essai

Le but du présent ELISA est (i) de pouvoir identifier dans le plasma la présence d'anticorps inhibiteurs du VIII, (ii) de caractériser les domaines du FVIII contre lesquels ils sont dirigés, et (iii) de quantifier la présence de ces anticorps.

Dans un premier temps, afin d'évaluer le bruit de fond d'un tel ELISA, un panel de 10 plasmas de sujets sains a été incubé à différentes dilutions (5^eme ou 25^eme) sur les fragments de FVIII immobilisés (« coating » en figure 1 ). Les anticorps ont ensuite été révélés avec un anticorps secondaire anti-lgG humaine couplé à la peroxydase. Les résultats sont présentés figure 1 . Ils démontrent un bruit de fond limité lors de l'utilisation des plasmas humains sains sur les fragments du FVIII et un effet dose-réponse sur les dilutions de plasma utilisées.

La majorité des plasmas permet d'obtenir un signal modéré aux deux dilutions utilisées, indiquant que ce réactif pourrait être utilisé sur les fragments de facteur VIII fixés au fond des puits. De plus aucun signal spécifique ne semble émerger vis-à-vis des différents fragments. Certains plasmas (N °4&N °5) donnent toutefois un signal plus fort (UDO=0,4- 0,55) que la moyenne visible en dilution au 5ème. Il est toutefois décrit dans la littérature que des anticorps reconnaissant le FVIII circulant y compris chez des sujets sains peuvent être retrouvés à une fréquence assez élevée (Moreau A et al. Blood. 2000 95(1 1 ): p3435-41 ). 4.2. Validation de l'essai par des plasmas avec inhibiteurs reconstitués ou par des plasmas d'hémophile A avec inhibiteurs

Un plasma dépiété en FVIII (Stago) est reconstitué avec une dose d'anticorps polyclonal de mouton anti-FVIII (Cedarlane) possédant une activité finale de 100 Unité Bethesda/ml. L'activité inhibitrice fonctionnelle est préalablement validée et quantifiée (données non montrées). Des dilutions en cascade de ce plasma reconstitué sont ensuite incubées sur les fragments recombinants de FVIII (25 ng/puit) et révélées avec un anticorps anti-lgG de mouton couplé à la peroxydase.

Les résultats sont présentés figure 2. Le plasma reconstitué avec l'anticorps polyclonal reconnaît tous les fragments du FVIII avec un signal beaucoup plus fort pour le domaine A3C1 . Les trois autres domaines sont reconnus de manière identique par l'anticorps polyclonal. Ces données confirment les résultats obtenus en immunoblot avec ce même anticorps et démontrent la faisabilité du test envisagé.

Afin de poursuivre la validation de cet essai, deux plasmas (plasma 1 et plasma 2) distincts d'hémophiles A avec inhibiteurs ont été achetés (Cryopep). Les plasmas ont une activité inhibitrice de 20 (plasmas 1 ) et 21 unités Bethesda/ml (plasma 2), respectivement. Les plasmas ont été dilués puis déposés sur les différents fragments préalablement fixés au fond d'une plaque 96 puits. Les anticorps humains fixés ont ensuite été détectés avec une IgG anti-lgG humaine couplée à la peroxydase (figures 5 et 6). Alors que les deux plasmas reconnaissent le FVIII recombinant purifié (Helixate, CSL-Behring) de manière identique, deux profils distincts sont obtenus sur les fragments recombinants de FVIII. Ainsi le plasma 1 reconnaît modestement les fragments A3C1 et A1 alors que les fragments A2, et C2 donnent un signal similaire à l'albumine, non spécifique.

En revanche, le plasma 2 reconnaît très distinctement les domaines A3C1 , A1 et C2. Le domaine A2 n'est lui pas mieux reconnu que l'albumine.

Ces données montrent :

(i) qu'il est possible de distinguer différents plasmas d'hémophiles A avec inhibiteurs, et que

(ii) les domaines préférentiellement reconnus par les plasmas peuvent être identifiés.

Cet essai montre qu'il est possible d'identifier les sites du facteur VIII reconnus par les inhibiteurs et d'orienter le traitement des hémophiles A notamment sur la pertinence à débuter un protocole de tolérance immune.

Claims

REVENDICATIONS

1 . Procédé d'identification d'un traitement thérapeutique visant à supprimer la réponse immunitaire dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile, comprenant les étapes successives suivantes :

b) l'identification des anticorps inhibiteurs principaux dirigés contre le facteur VIII humain ; et

2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le dosage spécifique de l'étape a) est un dosage immunologique.

3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le dosage spécifique de l'étape a) comprend, comme réactifs, des fragments de facteur VIII humain.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le dosage spécifique de l'étape a) comprend les étapes suivantes :

i) la préparation de fragments de facteur VIII humain, lesdits fragments étant fixés de manière covalente ou par affinité sur une plaque ou sur des billes, telles que des billes de polystyrène ;

ii) l'addition d'un échantillon de patient sur les fragments fixés en i) ;

iii) l'incubation du mélange obtenu en ii) pendant un temps et à une température suffisants pour obtenir des complexes fragments de facteur VIII humain/anticorps inhibiteurs dirigés contre le facteur VIII humain ;

iv) le lavage des complexes formés en iii) ;

v) la révélation de la quantité de complexes obtenus en iv) par l'addition d'un anticorps secondaire marqué.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le dosage spécifique de l'étape a) comprend, comme réactifs, des anticorps anti-idiotypiques dirigés contre les anticorps inhibiteurs dirigés contre le facteur VIII humain ou des fragments de ces anticorps.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 , 2 ou 5, caractérisé en ce que le dosage spécifique de l'étape a) comprend les étapes suivantes :

i) la préparation des anticorps anti-idiotypiques, ou leurs fragments, dirigés contre les anticorps inhibiteurs dirigés contre le facteur VIII humain, lesdits anticorps anti- idiotypiques ou leurs fragments étant fixés de manière covalente ou par affinité sur une plaque ou sur des billes, telles que des billes de polystyrène ;

iii) l'incubation du mélange obtenu en ii) pendant un temps et à une température suffisants pour obtenir des complexes anticorps anti-idiotypiques ou leurs fragments /anticorps inhibiteurs dirigés contre le facteur VIII humain ;

iv) le lavage des complexes formés en iii) ;

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'anticorps principal de l'étape b) est l'anticorps inhibiteur dirigé contre le facteur VIII humain présent en quantité la plus grande dans l'échantillon dudit patient ou qui possède l'affinité et/ou la spécificité la plus forte.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le dosage spécifique de l'étape a) est un ELISA.

9. Procédé de suivi d'un traitement thérapeutique visant à supprimer la réponse immunitaire dirigée contre le facteur VIII humain chez un patient hémophile, comprenant une étape de dosage spécifique, dans un échantillon dudit patient, de l'anticorps anti- idiotypique obtenu à l'étape c) selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.

10. Anticorps anti-idiotypique obtenu à l'étape c) selon l'une quelconque des revendications 1 à 8 pour son utilisation pour le traitement de l'hémophilie.