WO2012074187A1 - 오토파지 관련 질환, 혈관신생질환 또는 멜라닌 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

오토파지 관련 질환, 혈관신생질환 또는 멜라닌 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 Download PDF

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권호정
조윤선
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연세대학교 산학협력단
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Definitions

  • compositions for the prevention or treatment of autophagy-related diseases, angiogenic diseases or melanin-related diseases are provided.
  • compositions for the prevention or treatment of autophagy-related diseases, angiogenic diseases or melanin-related diseases are provided.
  • Autophagy is a cell's self-extinguishing system where cellular components are broken down and recycled into nutrients and energy sources. During cell survival, dysfunctional organs and long-lasting proteins are collected and subjected to autophagy.
  • autophagy When autophagy is activated, an autophagosome membrane structure is formed by atgl2-atg5 complex and LC3 aggregation.
  • the cytosol form of LC3 (LC3-I) is split into membrane-bound form (LC3-II) and the membrane matures into autophago islands surrounding the component to be degraded [1, 2].
  • Autopago islets then fuse with the lysosomes to cause lysosomal degradation of intracellular components.
  • Autophages are associated with a variety of pathological processes such as neurodegenerative diseases, cancer and melanogenesis [4, 5, 6]. Microfibers and amyloid plaques accumulate in Parkinson's or Alzheimer's disease, and induction of autophagy may provide a potential solution for the degradation of these accumulations.
  • autophagy can be associated with various stages [7]. In apoptosis-deficient cancer cells, autophagy can be induced to promote cell death and regulate cell proliferation. In growing tumor cells, oxygen and nutrients are limited, so autophages can be used for survival until the necessary components are provided by angiogenesis. in this case, Autophages should be suppressed to stop tumor cell survival.
  • Some autophagy inducers simultaneously promote autophagy and aptosis, which may be a solution that kills cancer cells and kills addictive cells synergistically.
  • Melanogenesis refers to the formation of melanin, a pigment found in the eyes, skin and hair. Melanin, which is newly produced through melanogenesis, has a different color compared to melanin. During melanogenesis, the distinct lysosomal-associated organ melanosomes carry a functional drop [8]. It is therefore reported that melanosomes are derived from Otto Pago Island [9]. In addition, an increase in autophagosomes was observed in patients with pigment diseases, probably due to the degradation of immature melanosomes [10].
  • Melanin production can lead to pigment diseases (such as blemishes, freckles, and black mushrooms), but if there is an abnormality in controlling melanogenesis, it can lead to melanoma (skin cancer).
  • pigment diseases such as blemishes, freckles, and black mushrooms
  • autophages are closely related to neurodegenerative diseases, cancer and melanogenesis. It can be applied to a variety of diseases and enables autophagy inducers as potential drug candidates.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating autophagy-related diseases, angiogenic diseases or melanin-related diseases, including indtraline or derivatives thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising: a pharmaceutically effective amount of an indtraline derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof represented by Formula 1; And (b) a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of autophagy-related diseases, angiogenic diseases or melanin 'hyperplastic diseases comprising a pharmaceutically acceptable carrier:
  • 3 ⁇ 4 and 3 ⁇ 4 each independently represent hydrogen, hydroxy, d-C 6 alkyl, dC 6 alkenyl, C 3 -C 8 cycloalkyl or d-Cs alkoxy, wherein 3 ⁇ 4 to R 12 are each Independently hydrogen, halogen, hydroxy, alkyl of CrC 6 , alkenyl of C-C 6 , C 3 -C 8 cycloalkyl or dC 6 alkoxy.
  • the present invention is (a) a pharmaceutically effective amount of a compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And (b) administering a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier to a subject, the method for preventing or treating an autophagy-related disease, angiogenic disease, or melanin hyperplasia.
  • the present inventors have made diligent research efforts to develop novel pharmaceutical compositions that can effectively prevent or treat autophagy-related diseases.
  • the indtraline derivative represented by Formula 1 not only effectively induces autophagy, but also inhibits angiogenesis as a mechanism for inhibiting tube formation, invasion and migration, and furthermore, melanogenesis ( 11 13110 1 ⁇ 3) by inhibiting the present invention was completed.
  • alkyl refers to a straight chain or branched, unsubstituted or substituted saturated hydrocarbon group, and includes, for example, methyl, ethyl, propyl, isobutyl, pentyl, nuclear and the like.
  • dC 6 alkyl means an alkyl group having an alkyl unit having 1 to 6 carbon atoms, and when dC 6 alkyl is substituted, the carbon number of the substituent is not included.
  • Ci-C 6 alkyl in R 2 or 3 ⁇ 4 position is preferably alkyl of dC 3 .
  • cycloalkyl refers to a cyclic hydrocarbon radical, which includes cyclopropyl, cyclobutyl and cyclopentyl.
  • C 3 -C 8 cycloalkyl means a cycloalkyl having 3-8 carbon atoms forming a ring structure, and when a cycloalkyl of -3 ⁇ 4 is substituted, the carbon number of the substituent is not included.
  • alkenyl refers to a straight or branched unsubstituted or substituted unsaturated hydrocarbon group having the specified carbon number, e.g., ethenyl, vinyl, propenyl, allyl, isopropenyl, butenyl, isobutenyl, butenyl, ⁇ Pentenyl and “nucleenyl.
  • Alkenyl of dC 6 means an alkenyl group having an alkenyl unit having 1 to 6 carbon atoms, and when the alkenyl of CC 6 is substituted, the carbon number of the substituent is not included.
  • halogen as used to define an indtraline derivative of formula (1) refers to a halogen group element and includes, for example, fluoro, chloro, bromo and iodo.
  • R 2 and 3 ⁇ 4 each independently represent hydrogen or alkyl of dC 3 , wherein 3 ⁇ 4 to R 12 are each independently hydrogen, dC 3 Alkyl or halogen.
  • 3 ⁇ 4 and 3 ⁇ 4 in the above formulas each represent halogen.
  • the compounds of the present invention may have one or more chiral centers and / or geometric isomeric centers, and thus the present invention is directed to all stereoisomers represented by Formula 1 or Formula 2, ie optical isomers, diastereomers and geometries. Isomers are included.
  • Autophagy-related diseases refer to diseases that can be treated by inducing autophagy.
  • autophagy refers to cell organelles such as mitochondria, which inhibit cell growth and differentiation, reduce mutagenesis, or are damaged by semiamorphous oxides. Any disease that can be treated by elimination.
  • autophagy-related diseases include cancer, atherosclerosis, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's disease, spinocerebellar ataxia, and ocular throat.
  • Oculopharyngeal muscular dystrophy prion disease, lethal familial insomnia, alpha-1 antitrypsin deficiency, biliary vertebral hypothalamus, pro frontal lobe dementia, progressive supranuclear palsy X-linked spinobulbar muscular atrophy and neuronal intranuclear hyaline inclusion disease.
  • cancers among autophagy-related diseases include pituitary adenoma, glioma, brain tumor, glandular cancer, laryngeal cancer, thymoma, mesothelioma, breast cancer, lung cancer, gastric cancer, esophageal cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, pancreatic endocrine tumor, and gallbladder cancer.
  • the indtraline derivative of the present invention effectively inhibits angiogenesis as a mechanism for inhibiting tube formation, invasion and migration, and thus is very effective for preventing or treating angiogenic diseases.
  • the angiogenic disease refers to a disease caused by the production of blood vessels, for example, cancer, diabetic retinopathy, prematurity retinopathy, corneal graft rejection, neovascular glaucoma, colorosa, proliferative retinopathy, psoriasis, hemophiliac joints, atherosclerosis Capillary proliferation in hardened plaques, keloids, wound granulation, vascular adhesion, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, autoimmune diseases, Crohn's disease, restenosis, atherosclerosis, enterococcal adhesion, cat scratch disease, ulcers, cirrhosis, glomerulonephritis , Diabetic nephropathy, malignant neurosis, thrombotic microangiopathy
  • cancer among angiogenic diseases include pituitary adenoma, glioma, brain tumor, glandular cancer, laryngeal cancer thymoma, carcinoma, breast cancer, lung cancer, gastric cancer, esophageal cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, pancreatic endocrine tumor, gallbladder cancer, It may be penile cancer, ureter cancer, renal cell cancer, prostate cancer, bladder cancer, non-Hodgkin's lymphoma, myelodysplastic syndrome, multiple myeloma, plasmacytoma, leukemia, childhood cancer, skin cancer, ovarian cancer or cervical cancer. Cervical cancer.
  • Indatraline derivatives of the present invention not only exhibit autophagy of cancer cells or inhibit angiogenesis, thereby exhibiting excellent anticancer activity, but also inhibit the metastasis of cancer by inhibiting angiogenesis, invasion and migration.
  • Indatraline derivatives of the present invention inhibit vascular narrowing.
  • the narrowing of blood vessels is thought to be due to thrombus formation after vascular endothelial injury or new endothelium formation. Specifically, platelets adhere to the vessel wall due to damage to the vascular endothelium, and thrombus is formed or growth factors are generated, resulting in smooth muscle cell migration and proliferation, resulting in the formation of new linings, and vascular narrowing. It is thought.
  • PTCA per cutaneous transluminal coronary angioplasty
  • restenosis after vascular obstruction including but not limited to restenosis after vascular obstruction, unstable angina, acute myocardial infarction, transient cerebral ischemic attack, or chronic arterial obstruction.
  • Unstable angina refers to angina that recurs after an asymptomatic period of more than 6 months and newly developed bare angina within 3 to 4 weeks. In addition, 50% to 80% of them said they transitioned to acute myocardial infarction.
  • a transient cerebral ischemic attack has the same symptoms as a cerebral infarction, but the condition is transient. It is thought that the microembolism which arose in the part of platelet thrombus which generate
  • a representative disease of chronic arterial obstruction is obstructive atherosclerosis (AS0: arteriosclerosis obliterans).
  • AS0 arteriosclerosis obliterans
  • the onset is based on atherosclerosis and ischemic symptoms due to decreased blood flow due to narrowing or occlusion of the arteries.
  • the indtraline derivative of the present invention inhibits melanogenesis (111613110 1 ⁇ 3), it can be effectively used to prevent or treat diseases caused by melanin overproduction.
  • Indatraline or a derivative thereof of the present invention inhibits intracellular uptake by inhibiting transporters of the neurotransmitters dopamine, serotonin, and epinephrine.
  • Epinephrine induces melanogenesis in neurotransmitters has been reported (Hu, DN, et al., Influence of autonomic neurotransmitters on human uveal melanocytes in vitro.Exp Eye Res., 71: 217-224 (2000) )).
  • Autophage inhibitory activity has also been reported as the activity of epinephrine (Seglen, P. 0. et al., Autophagy and other vacuolar protein degradat ion mechanisms. Experientia, 48: 158-172 (1992)).
  • indatraline or derivative compounds thereof are believed to be effective by inhibiting the amount of epinephrine permeated into cells.
  • the indatraline or derivative compounds thereof of the present invention may suggest a new association of such autophages with melanogenesis.
  • Indatraline or a derivative compound thereof of the present invention effectively inhibits melanin production as described above, and thus can be used for preventing or treating melanin hyperplasia.
  • the melanin-excessive diseases include, for example, blemishes, freckles, blotch, blemishes, epidermal melanocytic lesions, milk coffee spots (Cafe's au lait macules), Becker's Nevus, and Nevus Spilus.
  • Lentigines Dermal melanocytic lesions, Mongolian spot, Nevus of Ota, Acquired bilateral nevus of Ota- like macules, Ito Nevus of Ito, Blue nevus, Melanocytic nevus, Junction nevus, Complex Nevus (Compound nevus), intradermal nevus, Halo nevus, congenital nevocytic nevus, Spitz nevus, dysplastic nevus, melanoma ), Malignant carcinoma (Lentigo maligna melanoma), superficial spreading melanoma, superficial spread melanoma (Acral lentiginous melanoma), nodular melanoma (pigment basal) cell carcinoma), dermatofibromas, dermoid cysts, pigmented keloids and pigmented keratinocytes (keratoacanthomas), but are not necessarily limited thereto.
  • Indatraline derivatives of the present invention can be included in the compositions of the present invention in the form of the compounds of formula 1 or 2, as well as pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • pharmaceutically acceptable salt means a formulation of a formulation of a compound that does not cause serious irritation to the organism to which the compound is administered and does not impair the biological activity and properties of the compound, for example, ammonium salt, alkali Metal salts, alkaline earth metal salts, transition metal salts, quaternary amine salts or amino acid salts, but are not necessarily limited thereto.
  • pharmaceutical effective amount refers to an amount necessary to adequately induce autophagy, angiogenesis inhibition or melanogenesis to exhibit the pharmacological effect of a therapeutic agent for skin cell hyperproliferative diseases.
  • compositions comprising indatraline derivatives of the invention comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical composition of the present invention are commonly used in the preparation, lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, Gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil Including but not limited to.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like in addition to the above components.
  • lubricants wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like in addition to the above components.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, it may be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, or the like.
  • Appropriate dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age of patient, weight, sex, morbidity, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and reaction response. Can be.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is, for example, 0.001-100 rag / kg.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oil or aqueous media, or may be in the form of axes, powders, powders, granules, tablets or accelerators, and may further comprise dispersants or stabilizers.
  • the present invention provides a cosmetic composition for skin whitening comprising a compound represented by the following formula (1) or a salt thereof:
  • the present invention provides a skin whitening method comprising the step of applying to the skin of the subject a composition comprising a compound represented by the formula (1) or a salt thereof.
  • the cosmetic composition for skin whitening of the present invention uses the compound represented by the formula (1) or a salt thereof, which is an active ingredient of the above-mentioned pharmaceutical composition, in the use of the cosmetic composition for skin whitening, and has the same effective ingredient as the pharmaceutical composition.
  • the common contents in the relationship with the above are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the cosmetic composition of the present invention exhibits skin whitening effect by effectively inhibiting melanogenesis (13110 yo61 ⁇ 3), and the skin whitening effect includes, for example, prevention or improvement of blemishes, freckles, blotch and blemishes, but is not necessarily limited thereto. It is not.
  • the composition of the present invention may include not only the compound represented by the formula (1) or a salt thereof, but also components commonly used in cosmetic compositions, such as antioxidants, Conventional adjuvants such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavorings, and carriers.
  • purified water purified water, monohydric alcohols (ethanol or propyl alcohol), polyhydric alcohols (glycerol, 1,3-butylene glycol or propylene glycol), higher fatty acids (palmitylic acid or linolenic acid), fats and oils (wheat embryo oil, Camellia oil, jojoba oil, eulibrium oil, squalene, sunflower oil, macadamia peanut oil, avocado oil, soybean hydrous lecithin or fatty acid glycerides), and the like. If necessary, surfactants, bactericides, antioxidants, ultraviolet absorbers, anti-inflammatory agents, and refreshing agents may be added.
  • fungicides examples include hinocti, trichromic acid, chloronucleoside gluconate, phenoxytane, resorcin, isopropylmethylphenol, azulene, salicylic acid and zinc pyrithaone.
  • any of butylhydroxyanisole, molten acid, molten acid propyl and erythorbic acid can be used.
  • UV absorber examples include benzophenones such as dihydroxy benzophenone, melanin, ethyl paraaminobenzoate, 2-ethylnucleic acid ester of paradimethylaminobenzoic acid, synoxite, and 2-ethylnuclear ester of parametic phosphate, 2- (2- Hydroxy-5 methylphenyl) benzotriazole, urokanoic acid, metal oxide fine particles and the like can be used.
  • benzophenones such as dihydroxy benzophenone, melanin, ethyl paraaminobenzoate, 2-ethylnucleic acid ester of paradimethylaminobenzoic acid, synoxite, and 2-ethylnuclear ester of parametic phosphate, 2- (2- Hydroxy-5 methylphenyl) benzotriazole, urokanoic acid, metal oxide fine particles and the like can be used.
  • the anti-inflammatory agent examples include dipotassium glytilinate, allantoin, and the like, and a refreshing agent may be red pepper tink or 1-men.
  • the present invention provides a whitening functional cosmetics comprising the cosmetic composition described above.
  • the cosmetics may be, for example, sunscreen cosmetics, cosmetics, emulsions, essences, creams, peeling systems (dermatives), packs, powders, foundations, lipsticks, lipsticks, eye cosmetics, Cleaning cosmetics, sun protection cosmetics, massage creams, body cosmetics and the like, but are not necessarily limited to this, can be prepared in a variety of formulations commonly known in the art.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising (a) a pharmaceutically effective amount of an indtraline derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And (b) provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of autophagy-related diseases, angiogenic diseases or diseases caused by melanin overproduction, including a pharmaceutically acceptable carrier.
  • composition of the present invention Since the composition of the present invention effectively induces autophagy of cells, it exhibits great efficacy in preventing or treating autophage related diseases.
  • the composition of the present invention is a mechanism for suppressing tube formation, invasion and movement Since it inhibits angiogenesis and further inhibits melanogenesis ⁇ ⁇ ⁇ , it can be effectively used for the prevention or treatment of diseases caused by angiogenic disease or melanin.
  • FIG. 1 (A) LC3 conversion test in HeLa and HUVEC cells started from 5 ⁇ . ( ⁇ ) Autophagy inhibitors were pretreated 1 hour prior to indatraline treatment. Bafilomycin A and wortmannin inhibited LC3 conversion at indatraline 5 ⁇ , but only bacilomycin A inhibited LC3 transformation at 10 ⁇ (C: control, R: rapamycin, 3: 3-MA, B: bacillomycin A, P: PD98059, W: wortmannin).
  • Indatraline inhibited cell proliferation in both HeLa and HUVEC.
  • the IC 50 value in (A) HeLa cells is about 3 ⁇ and ( ⁇ ) HUVEC is about 0.5 ⁇ .
  • HeLa Human epithelial cervix adenocarcinoma
  • C0S-7 African green monkey kidney cells
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Lipofectamine 2000 was used to transform C0S7 cells with pEGFP-LC3 according to the Invitrogen protocol to establish a stable C0S7 cell line expressing EGFP-LC3.
  • Stable clones were selected in complete medium containing G418 750 /. Cells were incubated at 37 ° C. in an atmosphere containing pH 7.4 and 5% CO 2 .
  • DMEM and FBS were obtained from Gibco Laboratories (Grand Island, NY). Plasmids and anti-LC3 antibodies encoding EGFP-LC3 were provided by Dr. Tamoku Yoshimori (National Institute for Basic Biology, Okazaki, Japan). 2. Autophagy Detection Using Lysotracker, MDC and Stable EGFP-LC3 Cell Line
  • HeLa cells were incubated to 70% confluency. Then indatralin (Sigma) ol represented by the following formula was treated for 24 hours and lysotracker and MDC were treated for 30 minutes at a concentration of 50 nM and 50 ⁇ M, respectively. Each sample was washed three times with PBS and visualized with a fluorescence microscope. Compounds were stably treated for 24 hours in C0S7 cells expressing EGFP-LC3 and visualized by fluorescence microscopy. Hoechst 33258 and
  • LysoTr acker was purchased from Molecular Probes (Eugene, OR) and MDC from BioChemikaCSigma, Switzerland.
  • SDS lysis complete solution including 50 mM Tris HC1, pH 6.8, 10% glycerol, 2% SDS, 10 mM dithiothreitol and 0.005% bromophenol blue
  • SDS lysis complete solution including 50 mM Tris HC1, pH 6.8, 10% glycerol, 2% SDS, 10 mM dithiothreitol and 0.005% bromophenol blue
  • the same volume of protein was separated by 12.5% SDS-PAGE and transferred to PVDF membrane (Millipore, Bedford, Mass.). The blot was then blocked and immunolabeled overnight at 4 ° C. using anti-LC3 antibody (MBL, Nagoya, Japan). Immunolabels were visualized using an enhanced chemiluminescence (ECL) kit (Amersham Life Science, Inc., Buckinghamshire, UK) according to manufacturer's instructions. Tubing was used as a loading control and was detected using anti-tubulin antibody (Upstate Biotechnology).
  • ECL enhanced chemil
  • MTT 3- (4,5—dimethylthiazol-S-yD- ⁇ S-diphenyltetrazolium bromide) colorimetric assay. He la cells and HUVEC (Lonza, USA) Were inoculated in 96-well plates at a density of 3 ⁇ 10 3 cells / well and incubated for 24 hours. The cells were treated with various concentrations of indtraline.After 3 days of treatment, 2 mg / MTT was added to each well. MTT-formazan in each well was dissolved in 150 ⁇ DMS0 and absorbance was measured at 595 nm with a microplate reader (Bio-Tek Instrument Inc., Winooski, VT). Relative cell growth was measured by calculating the ratio between lean treated wells and control wells.
  • Matrigel (10 mg / m ⁇ ) (BD, USA) was coated on 48-well plates and polymerized at 37 ° C. for 1 hour.
  • HUVEC (6 10 4 cells) were seeded on the Matrigel surface in 48-well plates.
  • Compounds in the presence of VEGF 50 ng / O were added for 4 hours at 37 ° C.
  • Cell morphological changes and formed capillary structures were observed under a microscope (1X71, Olympus) and photographed at ⁇ magnification using a DP70 camera (Olympus). 6. Chemo invasion assay
  • HUVECs Invasion of HUVECs was tested in vitro using a Transwell chamber with 8.0-lm size pore polycarbonate filter inserts.
  • the bottom side of the filter was coated with gelatin (1 mg /) and the top side was coated with Matrigel (3 mg /).
  • HUVEC (7 ⁇ 10 4 cells) was placed in the upper part of the filter and the compound was added to the bottom in the presence of VEGF (50 ng / m ⁇ ). The chamber was then incubated at 37 ° C. for 18 hours. Cells were fixed with 70% methane and stained with hemaroxylin and eosin. Cell invasion was measured by observing the lower surface of the filter with a ⁇ magnification microscope. Cells were photographed with a DP70 camera.
  • indtraline was treated on B16-F10, a skin cancer cell, and melan-a, a normal skin cell, to determine whether autophagy was generated.
  • the amount of melanin produced in each cell line was measured at 5 ⁇ , the concentration at which autophagy occurred strongly.
  • melanin measurement cells were treated with potassium hydroxide ( ⁇ 0 ⁇ ) every day by treatment with drugs for 24, 48 and 72 hours, and melanin pigments were measured at absorbance of 410 nm. Cell proliferation was simultaneously measured using MTT. Inhibition of cell growth was partially reduced, but melanogenesis was markedly decreased over time.
  • vascular stenosis was observed by treating dimethylsulfoxide (DMS0) with traline, rapamycin and controls. After treatment with rapamycin or indatraline, it was observed that vascular stenosis due to the proliferation of smooth muscle cells in the vascular wall was suppressed. After 7 days, carotid artery tissues were isolated, and smooth muscle cells were stained with hematoxylin and eosin, and vascular stenosis was observed.
  • Indatraline induced autophagy Induction of autophagy by indatraline was measured by lysotracker and MDC staining. The autophagy induction effect of indtraline by HeLa cell treatment by HCS high contents screening was tested and quantified with lysotracker fluorescence intensity (FIG. 1A). Lysotrackers are fluorescent dyes that stain intracellular acidic vacuoles. Induction of autophagy can be clearly observed by increasing fluorescence, and HCS showed that indtraline induces autophagy to a degree similar to rapamycin and 2.87 times stronger than the control at 1 ⁇ M (FIG. 1A).
  • MDC fonodansyl cadaver ine staining was also confirmed.
  • MDC is a specific marker that labels autophagy vacuoles [17].
  • MDC staining after indatraline treatment also showed positively-dependently increasing fluorescence starting from 1 ⁇ (FIG. 1B).
  • LC3 is a microtubule associated with the light chain 3 protein that is converted from cytosolic form to membrane bound form when autophagy is induced.
  • the LC3 cytosol form breaks up into a membrane-bound form and develops into membrane particles to mature Otopago islands.
  • the microvesicles were tested.
  • EGFP-LC3 fluorescence increased positively-dependently in the cytoplasm (FIG. 1C).
  • LC3 conversion was finally confirmed by immunoblotting.
  • Intracellular LC3-I to LC3-II was tested 24 hours after indatraline treatment (FIG. 2A).
  • Autophagy induction was tested starting from 5 ⁇ for both HUVEC and HeLa cells.
  • Known autophagy inhibitors 3-MAC10 mM) [18], bacillomycin AC 100 nM) [19], PD98059 (10 ⁇ ) [20] and wortmannin to investigate which signaling pathways are involved in indtraline (100 nM) [21] was treated with indatraline.
  • Inhibitors were pretreated for 1 hour and treated with 5 ⁇ or 10 ⁇ indatraline.
  • Angiogenesis assays were performed in vitro with indatraline to test autophagy efficacy and potential as anti-angiogenic agents.
  • indatraline weakly inhibited capillary formation, which is an endothelial intercellular network (FIG. 4A).
  • Tubular induction was induced by VEGF [22], and indatraline treatment inhibited mature tubular formation at 1 ⁇ .
  • Chemoinvasive assays were also performed to test the invasive properties of angiogenesis. Invasion in HUVEC was also induced by VEGF, but treatment of 0.5 and 1 ⁇ M indatraline significantly reduced the number of invasive cells (FIG. 4B).
  • indatraline inhibits angiogenesis by inhibiting tube formation, invasion and migration.
  • indtraline has the potential to be an antiangiogenic agent by inhibiting angiogenesis in vitro. 6.
  • Indtraline inhibited melanin production.
  • indatraline induced autophagy was involved in melanogenesis.
  • Melanin production can be caused by melanogenesis to blemishes, freckles, and even skin cancer, and regulation of melanin production can be used to treat whitening and skin cancer.
  • Indtraline treatment was performed on B16-F10, a skin cancer cell, and melan-a, a normal skin cell, to confirm that autophagy occurred.
  • B16-F10 cells showed strong autophagy marker LC3 conversion from 5 ⁇ and melan-a cells showed LC3 transformation from 1 ⁇ (FIG. 5A).
  • the amount of melanin produced in each cell line was measured at a concentration of 5 ⁇ in which autophagy occurred.
  • Melanin was measured for 24, 48 and 72 hours to measure the amount of melanin, and the cells were recovered with potassium hydroxide ( ⁇ 0 ⁇ ) every day and the melanin pigment was measured at an absorbance of 410 nra.
  • Indtraline inhibited melanin formation from 48 hours compared to the control.
  • Melan-a cells inhibited melanin formation at levels of about 8 and 72 hours at 48 hours, and melanin formation at 48 hours and about 59% at 72 hours for B16-F10 cells. was suppressed.
  • the indtraline treatment group was melan-a, and the cell growth was suppressed by 62% at 24 hours compared to the control group and remained 56% inhibited, and for B16-F10 The indtraline treated group remained inhibited to about 54% level after cell growth was suppressed from 553 ⁇ 4> from 24 hours compared to the control group (Fig. 5-B).
  • Indatraline inhibited vascular narrowing in an in vivo model Autophagy inducers are being studied as a treatment for myocardial infarction caused by plaque buildup in blood vessels. According to previous studies, rapamycin (sirolimus), known as autophagy inducer, is a myocardial infarction drug. There is a more active research on this. In the present invention, the effect of inhibiting rat carotid artery vascular narrowing by indtraline as an autophagy inducer was confirmed.
  • Indatraline is a monoamine neurotransmitter inhibitor that effectively inhibits cell proliferation. This study newly reported that indtraline induced autophagy. The relationship between neurotransmitter inhibitors and autophagy is currently being tested, but the specific mechanism of each neurotransmitter inhibitor has not yet been identified. Indatraline-induced autophages were confirmed by fluorescence screening and LC3 transformed immunoblotting. Indatraline also inhibited cell proliferation with HeLa and HUVEC showing IC 50 values of 3 and 0.5 ⁇ , respectively. Prolonged treatment of indatraline (3 days) reduced the cell survival rate as seen in the cell proliferation assay, but did not show toxicity during autophagy screening when indatraline 5 ⁇ was treated with HeLa and HUVEC for 24 hours.
  • indtraline inhibited tube formation, invasion and migration, a sign of angiogenesis.
  • indatraline inhibited HUVEC invasion more effectively compared to tube formation and migration assays.
  • Some angiogenesis inhibitors specifically inhibit invasion or metastasis, so this may be an important property of indatraline.
  • autophagy inducers are potential anticancer drug candidates, and indatraline of the present invention It also showed its potential as an angiogenesis inhibitor. It is not yet clear how autophagy leads to inhibition of angiogenesis.
  • indatraline may reveal the relationship between monoamine neurotransmitter inhibitors, autophages and angiogenesis.
  • Induction of autophages may trigger a signal that inhibits angiogenesis, or inhibition of neurotransmitters may simultaneously stimulate the inhibition of both autophagy and angiogenesis.
  • the exact mechanisms of autophagy and angiogenesis remain unresolved, and a deep understanding of these mechanisms will be the cornerstone of the development of new anti-angiogenic agents based on autophagy.
  • Autophagy in melanogenesis is a mechanism that is naturally induced by the formation of melanosomes.
  • autophagy in melanoma skin cancer
  • Indtralin has the effect of inducing autophagy and inhibiting melanogenesis.
  • autophagy-inducing substances such as indtraline are thought to activate autophagy by a mechanism different from autophagy in naturally occurring melanogenesis.
  • Epinephrine a neurotransmitter, has been reported to induce melanogenesis and inhibit autophagy, respectively.

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Abstract

본본 발명은 (a) 인다트랄린 유도체 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 오토파지 관련 질환, 혈관신생질환(angiogenic disease) 또는 멜라닌 과다성 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 세포의 오토파지(autophagy)를 효과적으로 유도하므로, 오토파지 관련 질환의 예방 또는 치료에 큰 효능을 발휘한다. 또한 본 발명의 조성물은 관 형성, 침습 및 이동을 억제하는 기전으로 혈관신생(angiogenesis)을 억제하고, 더 나아가 멜라닌생성(melanogenesis)을 저해하므로, 혈관신생질환(angiogenic disease) 또는 멜라닌(melanin)으로 인한 질환의 예방 또는 치료에도 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
오토파지 관련 질환， 혈관신생질환 또는 멜라닌 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
【기술 분야】
오토파지 관련 질환, 혈관신생질환 또는 멜라닌 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 【배경 기술】
오토파지란 세포 성분이 분해되어 영양분 및 에너지원으로 재활용되는 세포의 자가 -소화 시스템이다. 세포 생존 기간 동안 기능부전기관 및 장기간 지속된 단백질들이 수집되어 오토파지 대상이 된다. 오토파지가 활성화되면 atgl2-atg5 복합체 및 LC3 결집에 의해 오토파고좀 막구조가 형성된다. LC3 의 사이토졸 형태 (LC3-I)는 막 결합 형태 (LC3- II)로 갈라지고 그 막은 분해 대상 성분을 둘러싸는 오토파고섬으로 성숙되어진다 [1， 2]. 그 다음 오토파고섬은 리소좀과 융합되어 세포내 성분의 리소좀성 분해를 일으킨다. 이러한 시스템은 세포 항상성을 유지하며 또한 세포 생존 또는 세포 사멸을 일으키지만， 언제 세포 생존 또는 사멸을 유도하는지에 관한 특정 기전은 아직 밝혀지지 않았다. 오토파지-유도성 세포 사멸은 제 II 형 세포 사멸로 분류되며 카스파제 의존성 아픕토시스와는 무관하다 [3]·
오토파지는 신경퇴행성 질환， 암 및 멜라닌생성 (melanogenesis)과 같은 다양한 병리학적 과정과 관련이 있다 [4, 5， 6]. 파킨슨병 또는 알츠하이머병에서 미소섬유 및 아밀로이드 플라그가 축적되는데， 오토파지의 유도는 이러한 축적 성분 분해를 위한 가능성 있는 해법을 제공할 수도 있다. 암에서， 오토파지는 오토파지는 다양한 단계와 연관될 수 있다 [7]. 아픕토시스 결함 암 세포에서, 세포 사멸을 촉진하고 세포 증식을 조절하기 위해 오토파지를 유도시킬 수 있다. 자라나는 종양세포에서는 산소 및 영양분이 제한되기 때문에 혈관신생에 의해 필요한 성분이 제공될 때까지 생존을 위해 오토파지를 사용할 수 있다. 이 경우， 오토파지는 종양 세포 생존을 멈추기 위해 억제되어야 한다. 몇몇 오토파지 유도제는 오토파지 및 아픕토시스를 동시에 촉진하는데 이는 상승 효과적으로 암세포를 살해하고 중독성 세포를 사멸시키는 해법일 수 있다. 멜라닌생성 (melanogenesis)이란 눈， 피부 및 모발 내에서 발견되는 색소인 멜라닌의 형성을 의미한다. 멜라노제네시스를 통하여 새롭게 생산된 멜라닌은 일반적으로 존재하는 멜라닌과 비교하여 다른 색상을 보인다. 멜라닌생성 동안， 뚜렷한 리소좀 -관련 기관인 멜라노좀은 기능적 적하를 운반한다 [8]. 따라서 멜라노좀이 오토파고섬으로부터 유래한 것으로 보고된다 [9]. 또한 색소 질환 환자에서 오토파고섬 증가가 관찰되었는데， 이는 아마도 미성숙 멜라노좀의 분해로부터 유래했을 것이다 [10]. 보다 최근 연구는 siRNA-기반 기능적 제노믹스를 통한 멜라닌생성의 신규한 조절자로서 오토파지 요소를 동정하였다 [11]. 베클린 1 또는 LC3-I 의 결여는 색소 축적을 현저하게 약화시켰다. 인 비보 분석에서 베클린 1 이형접합성 결여는 마우스 coat 색소 결함을 야기하였다 [12]. 게다가， 멜라닌은 피부 및 눈에서 보호적 역할을 수행하며 멜라닌의 손실은 연령- 관련 황반변성 (AMD)과 관련이 있다 [13， 14]. 뇌 또한 멜라닌에 의해 보호되며， 이의 손실은 또한 파킨슨병을 일으킨다 [15]. 또한 멜라닌생성은 외부 요인으로는 UV 와 같은 자극에 의해서 활성화된다 [25]. 멜라닌생성에 의해 색소질환 (기미, 주근깨， 검버섯 등)이 생길 수 있으나 멜라닌생성 조절에 이상이 있으면 멜라노마 (피부암)까지 이어질 수 있다. 이와 유사하게 오토파지는 신경퇴행성 질환, 암 및 멜라닌생성과 깊은 관계가 있다. 이는 다양한 질환에 적용될 수 있으며 오토파지 유도제를 잠재적 의약 후보로서 가능하게 한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하고자 하는 과제】 본 발명자들은 오토파지 관련 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 약제학적 조성물의 개발을 위하여 예와 연구 노력하였다. 그 결과 인다트랄린 및 그의 유도체들이 오토파지 (autophagy)를 효과적으로 유도할 뿐만 아니라， 관 형성, 침습 및 이동을 억제하는 기전으로 혈관신생 (angiogenesis)을 억제하고， 더 나아가 멜라닌생성 (melanogenesis)을 억제함을 밝혀냄으로써， 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 인다트랄린 또는 그의 유도체를 포함하는 오토파지 관련 질환， 혈관신생질환 또는 멜라닌 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. 【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 ) 하기 화학식 1 로 표시되는 인다트랄린 유도체 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 오토파지 관련 질환, 혈관신생질환 (angiogenic disease) 또는 멜라닌 '과다성 질환의 예방또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다:
화 1
Figure imgf000005_0001
상기 화학식에서 ¾및 ¾는 각각 독립적으로 수소, 히드록시， d- C6 의 알킬， d-C6 의 알케닐, C3-C8 사이클로알킬 또는 d-Cs 알콕시를 나타내고， 상기 ¾ 내지 R12 는 각각 독립적으로 수소， 할로겐， 히드록시 , CrC6 의 알킬, C -C6 의 알케닐， C3-C8 사이클로알킬 또는 d-C6 알콕시를 나타낸다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 대상 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 오토파지 관련 질환， 혈관신생질환 (angiogenic disease) 또는 멜라닌 과다성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다:
본 발명자들은 오토파지 관련 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 신규한 약제학적 조성물의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 상기 화학식 1 로 표시되는 인다트랄린 유도체가 오토파지 (autophagy)를 효과적으로 유도할 뿐만 아니라， 관 형성， 침습 및 이동을 억제하는 기전으로 혈관신생 (angiogenesis)을 억제하고， 더 나아가 멜라닌생성(11 13110 1 ^3)을 억제함을 밝혀냄으로써， 본 발명을 완성하게 되었다.
본 명세서에서 용어 "알킬" 은 직쇄 또는 분쇄의 비치환 또는 치환된 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어， 메틸， 에틸， 프로필, 이소부틸, 펜틸 및 핵실 등을 포함한다. d-C6 알킬은 탄소수 1 내지 6 의 알킬 유니트를 가지는 알킬기를 의미하며， d-C6 알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. 화학식 1 에서， R2 또는 ¾ 위치의 Ci-C6알킬은 바람직하게는 d-C3의 알킬이다.
용어 "사이클로알킬" 은 사이클릭 탄화수소 라디칼을 의미하며， 이는 사이클로프로필， 사이클로부틸 및 사이클로펜틸을 포함한다. C3-C8의 사이클로알킬은 링 구조를 형성하는 탄소수가 3-8 인 사이클로알킬을 의미하며, -¾의 사이클로알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
용어 "알케닐" 은 지정된 탄소수를 가지는 직쇄 또는 분쇄의 비치환 또는 치환된 불포화 탄화수소기를 나타내며， 예컨대, 에테닐， 비닐, 프로페닐, 알릴， 이소프로페닐， 부테닐， 이소부테닐, 부테닐， ^펜테닐 및 "핵세닐을 포함한다. d-C6의 알케닐은 탄소수 1 내지 6 의 알케닐 유니트를 가지는 알케닐기를 의미하며， C-C6 의 알케닐이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다. 본 명세서에서， 화학식 1 의 인다트랄린 유도체를 정의하기 위하여 사용되는 용어 "할로겐" 은 할로겐족 원소를 나타내며， 예컨대, 플루오로， 클로로， 브로모 및 요오도를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상기 화학식 1 의 인다트랄린 유도체에서 상기 , R2및 ¾는 각각 독립적으로 수소 또는 d-C3의 알킬을 나타내고， 상기 ¾ 내지 R12는 각각 독립적으로 수소， d-C3의 알킬 또는 할로겐을 나타낸다.
" 보다 바람직하게는， 본 발명의 인다트랄린 유도체는 다음 화학식 2로 표시된다:
화학식 2
Figure imgf000007_0001
상기 화학식에서 ¾및 ¾는 각각 할로겐을 나타낸다.
보다 더 바람직하게는， 상기 화학식 2 에서 상기 및 ¾ 는 염소원자 (C1)이다.
본 발명의 화합물들은 하나 또는 그 이상의 키랄 센터 및 /또는 기하 이성질 센터를 가질 수 있으며， 이에 본 발명은 상기 화학식 1 또는 화학식 2 로 표시되는 모든 입체이성질체， 즉, 광학이성질체， 부분입체이성질체 및 기하 이성질체를 포함한다.
본 발명의 인다트랄린 유도체는 오토파지 관련 질환을 예방하거나 치료하는 데 매우 유효하다. 오토파지 관련 질환이란 오토파지를 유도함으로써 치료될 수 있는 질병들을 말하며， 구체적으로 오토파지가 세포 성장 및 분화를 억제하거나， 돌연변이 생성을 감소시키거나 또는 반웅성 산화물에 의해 손상된 미토콘드리아 등의 세포 소기관을 제거함으로써 치료될 수 있는 모든 질병을 말한다. 오토파지 관련 질환을 예시하면 암， 아테름성 동맥 경화증， 알츠하이머병， 파킨슨병， 근위측성측삭 경화증 ( amyotrophic lateral sclerosis) , 헌팅톤병， 척수소뇌성 운동실조 (spinocerebellar ataxia), 안 인후증 이영양증 (oculopharyngeal muscular dystrophy), 프라이온병， 치명적 가족성 불면증， 알파 -1 안티트립신 결핍증， 담창구 시상하부 위측증 (dentatorubral pal 1 idoluysian atrophy), 전측두엽 치매， 전진성 상핵 마비 (progressive supranuclear palsy) , 척추 인경 근위축증 (x— linked spinobulbar muscular atrophy) 및 신경 핵내 유리질 봉입증 (neunmal intranuclear hyaline inclusion disease) 등이 있다.
오토파지 관련 질환 중 상기 암을 구체적으로 예시하면， 뇌하수체선종， 신경교종， 뇌종양, 상인두암, 후두암， 흉선종, 중피종， 유방암, 폐암, 위암， 식도암， 대장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암， 신세포암, 전립선암, 방광암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군， 다발성골수종, 형질세포성종양， 백혈병， 소아암， 피부암， 난소암 또는 자궁경부암일 수 있으며， 바람직하게는 자궁경부암이다.
또한, 본 발명의 인다트랄린 유도체는 관 형성, 침습 및 이동을 억제하는 기전으로 혈관신생 (angiogenesis)을 효과적으로 억제하므로， 혈관신생질환을 예방하거나 치료하는 데 매우 유효하다. 상기 혈관신생질환이란 혈관의 생성으로 야기되는 질환을 의미하며, 예컨대 암， 당뇨병성 망막증， 미숙아 망막증， 각막 이식 거부， 신생혈관 녹내장， 흥색증， 증식성 망막증, 건선， 혈우병성 관절， 아테름성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드， 상처 과립화， 혈관 접착， 류마티스 관절염， 골관절염， 자가면역 질환， 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화， 장관 접착， 캣 스크래치 질환， 궤양, 간경병증， 사구체신염, 당뇨병성 신장병증， 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부， 신사구체병증, 당뇨병， 염증 또는 신경퇴행성 질환 등이 있으나， 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
혈관신생질환 중 상기 암을 구체적으로 예시하면， 뇌하수체선종， 신경교종， 뇌종양， 상인두암， 후두암 흉선종, 증피종， 유방암， 폐암， 위암， 식도암， 대장암， 간암， 췌장암， 췌내분비종양， 담낭암， 음경암, 요관암, 신세포암， 전립선암， 방광암， 비호지킨성림프종， 골수이형성증후군， 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병， 소아암， 피부암， 난소암 또는 자궁경부암일 수 있으며, 바람직하게는 자궁경부암이다. 본 발명의 인다트랄린 유도체는 암세포의 오토파지를 유도하거나, 또는 혈관신생을 억제하여 뛰어난 항암효능을 나타낼 뿐만 아니라， 혈관 형성， 침습 및 이동을 억제하여 암의 전이를 억제하는 효능 또한 갖는다. 본 발명의 인다트랄린 유도체는 혈관 협착을 억제한다. 혈관의 협착은 혈관 내피 상해후의 혈전 형성， 혹은 새로운 내막 형성에 따른다고 생각되고 있다. 상세하게는 혈관 내피의 손상에 의해 혈소판이 혈관벽에 점착하여， 혈전이 형성되는 것이나 성장 인자가 생성되어 평활근 세포의 유주 (遊走)와 증식이 일어나며, 새로운 내막이 형성되는 결과， 혈관이 협착되는 것으로 생각되고 있다.
협착성 혈관의 병변에 기초한 질환으로는 경피적 경관 동맥 형성술
(PTCA: per cutaneous transluminal coronary angioplasty)에 의한 혈관 장해 후의 재협착, 불안정 협심증， 급성심근경색, 일과성 뇌허혈 발작, 또는 만성 동맥 폐색증을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
협심증의 대부분은 관상동맥의 아테름 경화증에 기초하고 있고, 심근에서의 산소 요구와 공급량이 불균형하게 되고, 국소적으로 허혈 상태가 되어 발생한다. 그 발작 양식에 따라 안정성 협심증과 불안정 협심증으로 나누어지며， 불안정 협심증이란 6 개월 이상 무증상 기간 후에 재발한 협심증， 3~4 주 이내에 신규로 발증한 노작성 협심증을 의미한다. 또한, 이들의 50~80%는 급성심근경색으로 이행한다고 말하고 있다.
급성심근경색은 협심증의 병상이 더욱 진행하여 혈관 내강이 막혀 혈류가 끊어져 산소나 영양이 심근에 닿지 않게 되어， 그 일부가 괴사를 일으키는 상태이다.
일과성 뇌허혈 발작은 뇌경색과 동일한 증상을 보이지만， 그 상태가 일과성인 것이다. 그 중 내경동맥 영역에 발생하는 것은 아테롬 경화 부분에 생긴 혈소판 혈전의 일부가 박리되어 생긴 미소 색전이 원인이라고 생각되고 있다.
만성 동맥 폐색증의 대표적인 질환으로서, 폐색성 동맥경화증 (AS0: arteriosclerosis obliterans)이 있다. 이 발증은 동맥경화에 기초하고 있고， 동맥의 협착이나 폐색에 의한 혈류 감소에 따라 허혈 증상을 보인다. 또한， 본 발명의 인다트랄린 유도체는 멜라닌생성(111613110 1 ^3)를 저해하므로， 멜라닌 과다 생성으로 인한 질환을 예방 또는 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
지금까지 보고된 오토파지와 멜라닌생성의 관계는 멜라닌생성이 멜라노좀 형성에 의해 오토파지가 증가하고 또한 멜라노사이트 (melanocyte)에서는 세포의 생존올 위해 오토파지가 일어난다는 주장이다. 하지만 본 발명의 인다트랄린 또는 그의 유도체의 경우 오토파지를 유도하는 동시에 멜라닌생성을 억제하는 효과를 보이므로 오토파지와 멜라닌생성과의 새로운 관계를 제시하고 있다. 즉 멜라닌생성에서 자연적으로 발생하는 오토파지가 아닌 인다트랄린 또는 그의 유도체의 약제 효과로 인한 멜라노사이트에서의 오토파지 유도는 세포 생존이 아닌 세포 성장의 저해를 보여 멜라닌생성 억제를 야기한다. 이러한 오토파지 기작은 인다트랄린 또는 그의 유도체의 활성기전인 신경전달물질 (neurotransmitter) 재흡수 (reuptake) 저해제로서의 효과로 인해 나타날 수 있다.
본 발명의 인다트랄린 또는 그의 유도체는 신경전달물질인 도파민， 세로토닌， 에피네프린의 수송체 (transporter)를 저해함로써 이들의 세포내 uptake 을 억제한다. 신경전달물질 중 에피네프린이 멜라닌생성을 유도하는 사실은 이미 보고된 바 있다 (Hu, D-N, et al., Influence of autonomic neurotransmitters on human uveal melanocytes in vitro. Exp Eye Res., 71： 217-224(2000)). 에피네프린의 활성으로서 오토파지를 저해하는 활성 또한 이미 보고된 바 있다 (Seglen, P. 0. et al . , Autophagy and other vacuolar protein degradat ion mechanisms. Experientia, 48:158-172(1992)). 즉, 인다트랄린 또는 그의 유도체 화합물의 오토파지 유도 및 멜라닌생성 억제 효과는 epinephrine 의 세포내 투과되는 양을 저해하므로써 효과를 보이는 것으로 추정된다. 따라서 본 발명의 인다트랄린 또는 그의 유도체 화합물은 이러한 오토파지와 멜라닌생성의 새로운 연관성을 제시할 수 있다.
본 발명의 인다트랄린 또는 그의 유도체 화합물은 상술한 바와 같이 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하므로, 멜라닌 과다성 질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
상기 멜라닌 과다성 질환은 예컨대 기미， 주근깨， 검버섯， 잡티， 표피 멜라닌세포성 병변 (Epidermal melanocytic lesion), 밀크커피 반점 (Cafe's au lait macules), 베커 모반 (Becker's Nevus), 반문상 모반 (Nevus Spilus), 혹자 (Lentigines), 진피 멜라닌세포성 병변 (Dermal melanocytic lesions) , 몽고반 (Mongolian spot), 오타 모반 (Nevus of Ota) , 후천성 양측성 오타 모반양 반 (Acquired bilateral nevus of Ota- like macules), 이토 모반 (Nevus of Ito), 청색 모반 (Blue nevus), 멜라닌 세포성 모반 (Melanocytic nevus), 경계 모반 (Junctional nevus), 복합 모반 (Compound nevus), 진피내 모반 (Intradermal nevus), 운륜모반 (Halo nevus), 선천성 멜라닌세포성 모반 (Congenital nevocytic nevus), 스피츠 모반 (Spitz nevus), 이형성 모반 (Dysplastic nevus), 혹색종 (Melanoma)， 악성 혹자 혹색종 (Lentigo maligna melanoma), 표재 확장성 흑색종 (Superficial spreading melanoma), 선단 흑자성 흑색종 (Acral lentiginous melanoma) , 결절성 폭생종 (Nodular melanoma) , 색소성 기저세포암 (pigment basal cell carcinoma) , 색소성 피부섬유종 (dermatofibromas), 색소성 피부낭종 (dermoid cyst), 색소성 켈로이드 (keloid) 및 색소성 각질극세포종 (keratoacanthomas) 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 인다트랄린 유도체는 화학식 1 또는 2 의 화합물 그 자체뿐만 아니라， 약제학적으로 허용되는 그것의 염의 형태로서 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은， 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는， 화합물의 제형을 제형을 의미하며， 예컨대， 암모니움 염， 알칼리 금속염， 알칼리 토금속염, 전이금속염, 4 차 아민 염 또는 아미노산 염 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 용어 "약제학적 유효량" 은 오토파지， 혈관신생억제 또는 멜라닌생성을 적절히 유도하여 피부세포 과증식성 질환 치료제의 약리학적 효과를 나타내는 데 필요한 양을 의미한다 .
본 발명의 인다트랄린 유도체를 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다 . 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스， 덱스트로스， 수크로스， 솔비를， 만니를， 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘， 알기네이트 , 젤라틴 , 규산 칼슘, 미세결정성 셀를로스， 폴리비닐피를리돈， 셀를로스, 물, 시럽, 메틸 셀를로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제， 감미제， 향미제， 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed. , 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입， 피하 주입， 근육 주입， 복강 주입， 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령， 체중， 성， 병적 상태， 음식， 투여 시간， 투여 경로， 배설 속도 및 반웅 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.001-100 rag/kg이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액， 현탁액， 시럽제 또는 유화액 형태이거나 액스제, 산제， 분말제， 과립제， 정제 또는 갑셀제 형태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 하기 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다:
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상기 화학식에서 ¾및 ¾는 각각 독립적으로 수소， 히드록시 , d- C6 의 알킬, d-Ce 의 알케닐， C3-C8 사이클로알킬 또는 C厂 C6 알콕시를 나타내고， 상기 R4 내지 R12 는 각각 독립적으로 수소, 할로겐， 히드록시， Ci-C6 의 알킬， CrCs 의 알케닐, C3-C8 사이클로알킬 또는 d-C6 알콕시를 나타낸다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상기 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물을 대상 (subject)의 피부에 도포하는 단계를 포함하는 피부 미백 방법을 제공한다.
본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 상술한 약제학적 조성물의 유효성분인 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 피부 미백용 화장료 조성물 용도에 이용한 것으로서 그 유효성분을 공통으로 하기 때문에， 상기 약제학적 조성물과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 화장품 조성물은 멜라닌생성( 13110요61 ^3)을 효과적으로 억제하여 피부 미백 효과를 나타내며， 상기 피부 미백 효과는 예컨대 기미， 주근깨, 검버섯 및 잡티 등의 예방 또는 개선 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우， 본 발명의 조성물은 상기 유효성분인 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 그의 염뿐 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며， 예컨대 항산화제， 안정화제， 용해화제， 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제， 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 담체로서， 정제수, 일가 알코을류 (에탄올 또는 프로필 알코올)， 다가 알코올류 (글리세롤， 1，3-부티렌글리콜 또는 프로필렌글리콜)， 고급 지방산류 (팔미틸산 또는 리놀렌산)， 유지류 (소맥 배아유， 동백기름， 호호바유, 을리브유, 스쿠알렌， 해바라기유， 마카데미아땅콩유, 아보가드유， 대두 수첨가 레시틴 또는 지방산 글리세라이드) 등을 사용할 수 있으나， 이에 한정되지는 않는다. 또한 필요에 따라 계면활성제, 살균제， 산화방지제, 자외선 흡수제, 소염제 및 청량제를 첨가할 수 있다.
계면활성제로는 플리옥시에틸렌， 경화 피마자유， 폴리옥시에틸렌, 을레'일에테르, 모노을레인산폴리옥시에틸렌, 폴리옥시에틸렌, 글리세릴모노스테아레이트 , 모노스테아린산소르비탄， 모노을레인산폴리옥시에틸렌， 소르비탄， 자당지방산에스테르 , 모노라우린산헥사글리세린， 폴리옥시에틸렌 환원라놀린， P0E, 글리세릴피로글루타민산 이소스테아린산, 디에스테르, N-아세틸글루타민 및 이소스테아릴에스테르 등을사용할 수 있다. 살균제로는 히녹티을， 트리크로산， 크를핵시딘글루콘산염， 페녹시에탄을， 레조르신， 이소프로필메틸페놀, 아즐렌 (azulene), 살리실산 및 징크피리타온 등을 사용할 수 있다.
산화방지제로는 부틸히드록시아니솔, 몰식자산， 몰식자산프로필 및 에리소르빈산 중에서 어떠한 것도 사용가능하다.
자외선 흡수제로는 디히드록시벤조페논 등의 벤조페논류， 멜라닌， 파라아미노벤조산에틸， 파라디메틸아미노벤조산 2-에틸핵실에스테르， 시녹사이트, 파라메특시계피산 2-에틸핵실에스테르, 2-(2-히드록시 -5- 메틸페닐) 벤조트리아졸， 우로카닌산 및 금속산화물 미립자 등을 사용할 수 있다.
소염제로는 글리틸리틴산디칼륨 또는 알란토인 등을 사용할 수 있고， 청량제로는 고추틴크 또는 1-멘를 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상술한 화장료 조성물을 포함하는 미백 기능성 화장품을 제공한다.
상기 화장품은 예컨대 선스크린 (sun screen) 화장품류， 화장수류, 유액류， 에센스류, 크림류, 필링계 (박피제)류, 팩류， 백분류， 화운데이션류， 립스틱류， 연지류， 눈화장재료류, 세정 화장품류， 햇빛올 막는 화장품류， 마사지크림류, 바디 화장품류 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니며， 당업계에서 통상적으로 알려진 다양한 제형으로 제조될 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
( i ) 본 발명은 (a) 인다트랄린 유도체 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 오토파지 관련 질환， 혈관신생질환 (angiogenic disease) 또는 멜라닌 과다 생성으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
(ii) 본 발명의 조성물은 세포의 오토파지 (autophagy)를 효과적으로 유도하므로， 오토파지 관련 질환의 예방 또는 치료에 큰 효능을 발휘한다. 또한 본 발명의 조성물은 관 형성， 침습 및 이동을 억제하는 기전으로 혈관신생 (angiogenesis)을 억제하고, 더 나아가 멜라닌생성^^ ^^^ ^을 저해하므로， 혈관신생질환 (angiogenic disease) 또는 멜라닌 (melanin)으로 인한 질환의 예방 또는 치료에도 효과적으로 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1. (A) 인다트랄린-유도성 오토파지는 HCS 를 사용하여 라이소트래커 형광으로 정량화하였다. 이미지는 라이소트래커 형광의 pseudo color 를 나타낸다 (C: 대조군， R: 라파마이신， I： 인다트랄린). 인다트랄린은 대조군과 비교하여 형광을 2.5배로 현저히 증가시켰다. (B) MDC 염색 실험은 인다트랄린 처리 세포에서 양 -의존적으로 형광이 증가되는 것을 나타내었다. (C) 안정된 EGFP-LC3 세포주 또한 인다트랄린 처리에 따른 세포질 내 EGFP-LC3 포함 액포수의 증가를 확인시켜준다. 눈금 막대는 20 zm를 나타낸다.
도 2. (A) HeLa 및 HUVEC 세포에서의 LC3 변환 시험은 5 μΜ 로부터 시작하였다.. (Β) 오토파지 억제제를 인다트랄린 처리 1 시간 전에 선처리하였다. 인다트랄린 5 μΜ 에서는 바필로마이신 Α 및 워트마닌이 LC3 변환을 억제하였지만, 10 μΜ 에서는 오직 바필로마이신 Α 만이 LC3 변환을 억제하였다 (C: 대조군, R: 라파마이신， 3: 3-MA, B: 바필로마이신 A, P: PD98059, W: 워트마닌).
도 3. 인다트랄린은 HeLa 및 HUVEC 모두에서 세포 증식을 억제하였다. (A) HeLa 세포에서의 IC50 값은 약 3 μΜ 이고 (Β) HUVEC에서는 약 0.5 μΜ이다.
도 4. (A) VEGF-유도성 관 형성은 1 μΜ 의 인다트랄린에 의해 억제되었다 (화살표는 관 형성을 나타낸다). (Β) 인다트랄린은 0.5 μΜ 으로부터 시작하여 VEGF-유도성 침습을 효과적으로 억제하였다. (C) HUVEC의 이동은 인다트랄린 5 μΜ로부터 억제되었다.
도 5. (Α) 인다트랄린에 의한 B16-F10 및 melan-a 세포에서의 LC3 변환이 유도되었다. (B) 인다트랄린은 melan-a 세포의 멜라닌 생성을 약 74%까지 억제하고 세포 성장은 56%까지 억제하였다. B16-F10 세포에서의 멜라닌 생성은 인다트랄린에 의해 59%까지 억제되었다. 또한 인다트랄린은 세포 증식을 억제 하였고， 약 54% 수준으로 억제된 상태가 계속 유지되었다.
도 6. 혈관 협착 억제효과를 보이는 인다트랄린과 라파마이신을 쥐의 경동맥에 상처를 낸 후 캐시터를 이용하여 디메틸설폭사이드 (DMS0), 라파마이신 및 인다트랄린을 처리 한 후 내막면적 (intima area)에 플라크가 쌓이는 것을 관찰하였다. 7 일 후 내막에 쌓인 플라크 /중막면적을 비교한 결과 대조군보다 인다트랄린 처리군의 평활근세포 (smooth muscle cell)성장이 약 20% 더 줄었다 (평균 구조적 방정식 모델링 기법. ? = 4, * 0.05, **m.ooi).
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서， 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 실시예 실험재료 및 방법
1. 세포 배양
HeLa( human epithelial cervix adenocarcinoma)세포와 C0S-7( African green monkey kidney cells)세포 (한국세포주은행)를 10% FBS( fetal bovine serum)를 포함하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 배양 및 유지시켰다. 제조사 (Invitrogen) 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000 을 사용하여 C0S7 세포를 pEGFP-LC3 로 형질전환시켜 EGFP-LC3 를 발현하는 안정된 C0S7 세포주를 수립하였다. G418 750 / 를 포함하는 완전 배지에서 안정된 클론을 선별하였다. pH 7.4 및 5% C02 를 포함하는 대기 내 37° C 조건에서 세포를 배양하였다. DMEM 및 FBS 는 Gibco Laboratories (Grand Island, NY)로부터 취득하였다. EGFP-LC3 를 인코딩하는 플라스미드 및 항 -LC3 항체는 타모츄 요시모리 (National Institute for Basic Biology, Okazaki , Japan) 박사가 제공해주었다. 2. 라이소트래커, MDC및 안정된 EGFP-LC3세포주를사용한오토파지 탐지
HeLa 세포를 70%의 컨플루언시까지 배양하였다. 그 다음 하기 화학식으로 표시되는 인다트랄린 (Sigma)올 24 시간 동안 처리하고 라이소트래커 및 MDC를 각각 50 nM 및 50 μΜ의 농도로 30분간 처리하였다. 각각의 샘플을 PBS 로 3 회 세척하고 형광 현미경으로 시각화하였다. 안정적으로 EGFP-LC3 를 발현하는 C0S7 세포에 화합물을 24 시간 동안 처리하고 형광 현미경으로 시각화하였다. Hoechst 33258 및
LysoTr acker 는 Molecular Probes (Eugene, OR)로부터， MDC 는 BioChemikaCSigma, Switzerland)로부터 구입하였다.
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3. LC3 면역블롯팅
인다트랄린을 처리한 HeLa 세포로부터 SDS 용해 완층액 (50 mM 트리스 HC1, pH 6.8， 10% 글리세를, 2% SDS, 10 mM 디치오쓰레이를 (dithiothreitol) 및 0.005% 브로모페놀 블루 포함)으로 가용성 단백질을 수확하였다. 단백질의 동일 부피를 12.5% SDS-PAGE 로 분리하고 PVDF 막 (Millipore, Bedford, MA)으로 이전시켰다. 그 다음 블롯을 블록킹하고 항 -LC3 항체 (MBL, Nagoya, Japan)를 사용하여 4°C에서 밤새 면역표지하였다. 면역표지는 제조사 지시에 따라 증진된 화학발광 (ECL) 키트 (Amersham Life Science, Inc. , Buckinghamshire, UK)를 사용하여 시각화하였다. 로딩 대조군으로는 튜블린을 사용하였고 항- 튜블린 항체 (Upstate Biotechnology)를 사용하여 탐지하였다.
4. 세포증식 분석 세포증식은 MTT(3-(4,5— dimethylthiazol-S-yD-^S- diphenyltetrazol ium bromide) 비색정량분석법 (cokr imetr ic assay)을 사용하여 측정하였다. He la 세포 및 HUVEC(Lonza, USA)을 3 x 103 세포 /웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 접종하고 24 시간 동안 배양하였다. 세포를 다양한 농도의 인다트랄린으로 처리하였다. 처리 3 일 후， 2 mg/ 의 MTT를 각각의 웰에 첨가하고 4시간 동안 배양하였다. 각각의 웰 내 MTT-포마잔을 150 ≠ DMS0 에 용해하고 595 nm 에서 마이크로플레이트 리더 (Bio-Tek Instrument Inc. , Winooski , VT)로 흡광도를 측정하였다. 인다트랄린 처리 웰 및 대조군 웰 사이의 비율을 계산하여 상대적인 세포 성장을 측정하였다.
5. 모세관형성 분석
마트리겔 (10 mg/m^)(BD, USA) 48-웰 플레이트에 코팅하고 37°C에서 1 시간 동안 중합시켰다. HUVEC(6 104 cells)를 48-웰 플레이트 내 마트리겔 표면에 접종하였다. VEGF(50 ng/ O 존재 하 화합물을 37°C에서 4 시간 동안 첨가하였다. 세포 형태학상 변화 및 형성된 모세관 구조를 현미경 (1X71， Olympus)으로 관찰하고 DP70 카메라 (Olympus)를 사용하여 ΙΟΟχ 배율로 촬영하였다. 6. 화학침습분석 (Chemo invasion assay)
8.0-lm사이즈 기공 폴리카보네이트 필터 삽입물을 구비한 Transwell 챔버를 사용하여 인 비트로에서 HUVEC의 침습을 시험하였다. 간단히 말해， 필터의 하부면은 젤라틴 (1 mg/ )으로 코팅하고, 상부면은 마트리겔 (3 mg/ )으로 코팅하였다. HUVEC(7 x 104 세포)을 필터 상층 부분에 놓고， VEGF(50 ng/m^) 존재 하 화합물을 하부에 가하였다. 그 다음 챔버를 37°C에서 18 시간 동안 배양하였다. 세포를 70% 메탄을로 고정하고 헤마록실린 및 에오신으로 염색하였다. 세포의 침습도는 ΙΟΟχ 배율 현미경으로 필터의 하부면을 관찰하여 측정하였다. DP70 카메라로 세포를 촬영하였다.
7. 이동 분석 HUVEC 의 이동은 12 웰 플레이트 내 100% 컨플루언시까지 배양하여 측정하였다. 그 다음 200 μί 팁으로 웰을 통과시켜 상처를 내었다. 인다트랄린을 처리하고 세포의 이동을 매 3 시간 마다 관찰하였다. 9 시간 시점에 상처는 거의 80%까지 회복되었다. DP70 카메라를 사용하여 40χ 배율로 이미지를 촬영하였다.
8. 멜라닌 생성 양측정
인다트랄린이 오토파지를 유도하며 멜라닌 생성에 관여하는지 여부를 확인하기 위하여， 피부암 세포인 B16-F10 및 정상 피부 세포인 melan-a 세포에 인다트랄린을 처리하여 오토파지 생성 여부를 확인했다. 오토파지가 강하게 일어난 농도인 5 μΜ에서 각 세포주의 멜라닌 생성 양을 측정하였다. 멜라닌 양 측정을 위해서는 24， 48 및 72 시간 동안 약제 처리하여 매일마다 세포를 수산화칼륨 (Κ0Η)으로 회수하여 멜라닌 피그멘트 (pigment)를 흡광도 410 nm 에서 측정하였다. 세포증식은 MTT 를 이용하여 동시에 측정하였다. 세포성장 저해는 부분적으로 감소하였으나， 멜라닌 생성 양은 시간이 경과함에 따라 현저히 감소하였다.
9. 혈관 협착 억제능 측정
오토파지 유도물질로 인다트랄린에 의한 쥐의 경동맥 (rat carotid artery) 혈관 협착을 억제하는 효과를 확인하기 위하여， 쥐의 왼쪽 경동맥에 풍선혈관 손상 (balloon injury)을 낸 후 캐시터를 이용하여 인다트랄린, 라파마이신 및 대조군로 디메틸설폭사이드 (DMS0)를 처리하여 혈관의 협착을 관찰하였다. 라파마이신 또는 인다트랄린을 처리한 후 혈관내벽에 평활근세포 (smooth muscle cell)의 증식으로 인한 혈관 협착이 억제되는 것을 관찰하였다. 7 일 후 경동맥 조직을 분리하여 평활근세포를 헤마토자일린 (hematoxylin) 및 에오신 (eiosin)으로 염색한 후 혈관협착 정도를 관찰하였다. 실험결과
1. 인다트랄린은오토파지를 유도하였다. 인다트랄린에 의한 오토파지의 유도는 라이소트래커 및 MDC 염색으로 측정하였다. HCS high contents screening)에 의하여 인다트랄린의 HeLa 세포처리에 따른 오토파지 유도 효능을 라이소트래커 형광 강도로 시험 및 정량화하였다 (도 1A). 라이소트래커는 세포내 산성 액포를 염색하는 형광염료이다. 오토파지의 유도는 형광 증가에 의해 명백하게 관찰할 수 있으며, HCS 는 인다트랄린이 라파마이신과 유사한 정도로, 그리고 1 μΜ에서 대조군에 비해 2.87 배 강하게 오토파지를 유도함을 나타내었다 (도 1A). 오토파지 유도는 또한 MDC fonodansyl cadaver ine) 염색으로 확인하였다. MDC 는 오토파지성 액포를 표지하는 특이적 마커이다 [17]. 인다트랄린 처리 후 MDC 염색 또한 1 μΜ 로부터 시작하여 양 -의존적으로 증가하는 형광을 나타내었다 (도 1B).
2. 안정된 EGFP-LC3 세포주 내 인다트랄린 유도성 오토파지를 관찰하였다.
오토파지의 직접적 요소를 측정하기 위해， 안정된 COS-7 EGFP-LC3 세포주 내에서 인다트랄린-유도성 오토파지를 추가적으로 확인하였다. LC3 는 오토파지가 유도되는 경우 사이토졸 형태로부터 막 결합 형태로 변환되는 경쇄 3 단백질과 관련된 미세소관이다. Atg5-12 복합체 도입에 의하여 LC3 사이토졸 형태는 막 결합 형태로 갈라지면서 막 입자로 발전하여 오토파고섬을 성숙시킨다. 인다트랄린을 24 시간 처리한 후， 소액포를 시험하였다. EGFP-LC3 형광은 세포질 내 양 -의존적으로 증가하였다 (도 1C).
3. LC3 면역블로팅을 통하여 인다트랄린 유도성 오토파지의 신호 경로에 관여하는 물질을 발견 하였다.
LC3 변환은 최종적으로 면역블롯팅으로 확인하였다. 인다트랄린을 처리한 24시간후 세포 내 LC3-I 로부터 LC3-II 로의 변환을 시험하였다 (도 2A). 오토파지 유도는 HUVEC 및 HeLa 세포 모두에 대해 5 μΜ 로부터 시작하여 시험하였다. 어떠한 신호 경로에 인다트랄린이 관련되어 있는지를 조사하기 위하여 알려진 오토파지 억제제인 3-MAC10 mM)[18], 바필로마이신 AC 100 nM)[19], PD98059(10 μΜ)[20] 및 워트마닌 (100 nM)[21]을 인다트랄린과 함께 처리하였다. 억제제들을 1 시간동안 선처리하고， 5 μΜ 또는 10 μΜ 의 인다트랄린을 처리하였다. 5 μΜ 처리 시 LC3 변환은 오직 바필로마이신 Α 및 워트마닌 처리 샘플 내에서만 억제되었다 (도 2B). 그러나， 인다트랄린 10 μΜ 처리 시에는 바필로마이신 Α 만을 제외하고는 오토파지 억제제들이 LC3 변환을 막을 수 없었다. 따라서， 인다트랄린-유도성 오토파지 신호 경로에는 PI3K 억제제인 워트마닌이 직접적으로 관여한다는 것을 발견할 수 있었다.
4. 인다트랄린은세포 증식올 억제하였다.
HeLa 세포 내에서 세포 증식 또한 시험하였는데, 3 일 후 세포 성장에 있어 현저한 감소를 야기하였다. HeLa 세포 내 인다트랄린의 IC50값은 약 3 μΜ 로 측정되었다 (도 3Α). 인다트랄린 처리에 의한 세포 증식 억제는 HUVEC 에 대해 더욱 민감하였다 (도 3Β). HUVEC 내 인다트랄린의 IC50 값은 0.5 μΜ 이었다. 인다트랄린이 HUVEC 성장을 억제하기 때문에, 인다트랄린의 항-혈관신생 효능을 시험하였다.
5. 인다트랄린은 혈관신생을 억제하였다.
오토파지 효능 및 항 -혈관신생제로서의 잠재력을 시험하기 위하여 인다트랄린을 가지고 인 비트로 혈관신생 분석법을 수행하였다. 첫째로， 인다트랄린은 내피세포 간 네트워크가 되는 모세관 형성을 약하게 억제하였다 (도 4A). VEGF에 의해 관형성이 유도되었는데 [22], 인다트랄린 처리는 1 μΜ 에서 성숙한 관 형성을 억제하였다. 혈관신생의 침습적 성질을 시험하기 위하여 화학침습 분석법 또한 수행하였다. 역시 VEGF 에 의해 HUVEC 내 침습이 유도되었지만, 0.5 및 1 μΜ 의 인다트랄린을 처리하자 침습 세포 수가 현저하게 감소하였다 (도 4Β). 또한 최근에 인다트랄린에 대하여 전이의 징표인 이동 분석법을 수행하였다. 9시간 후, HUVEC 의 이동은 거의 100% 컨플루언시를 나타내었다. 이 시점에 인다트랄린 처리는 5 μΜ 로부터 시작하여 HUVEC 의 이동을 억제하였다 (도 4C). 종합적으로 인다트랄린은 관 형성， 침습 및 이동을 억제하여 혈관신생을 억제한다. 따라서, 인다트랄린은 인 비트로 혈관신생을 억제하여 항혈관신생제가 될 수 있는 잠재력을 갖는다. 6. 인다트랄린은 멜라닌 생성을 억제하였다.
인다트랄린이 오토파지를 유도하며 멜라닌 생성에 관여하는지 여부를 확인하였다. 앞서 기술한 바와 같이 오토파지 및 멜라닌 생성의 연관성에 관해서는 계속 연구 되고 있다. 멜라닌 생성은 멜라노제네시스에 의해 기미， 주근깨 및 심하면 피부암까지 발병할 수 있으며， 멜라닌 생성의 조절은 미백 및 피부암 치료에 사용될 수 있다. 피부암 세포인 B16-F10 및 정상 피부 세포인 melan-a 세포에 인다트랄린을 처리한 결과 오토파지가 일어나는 것을 확인했다. B16-F10 세포는 5 μΜ부터 오토파지 마커인 LC3 변환이 강하게 일어났으며 melan-a 세포는 1 μΜ 부터 LC3 변환이 관찰되었다 (도 5 Α).
오토파지가 확실하게 일어난 농도 5 μΜ 에서 각 세포주의 멜라닌 생성 양을 측정하였다. 멜라닌 양 측정을 위해서 24， 48 및 72 시간 동안 약제 처리를 하고， 매일마다 세포를 수산화칼륨 (Κ0Η)으로 회수하여 멜라닌 피그멘트 (pigment)를 흡광도 410 nra 에서 측정하였다. 인다트랄린은 48 시간부터 대조군에 비해 멜라닌 형성을 억제하였다. Melan-a 세포의 경우는 48 시간에서 약 8 ， 72 시간에서 약 74% 의 수준으로 멜라닌 형성을 억제하였다, B16-F10세포의 경우는 48 시간에서 ΊΊ , 72 시간에서 약 59% 수준으로 멜라닌 형성을 억제하였다. 멜라닌 측정과 동시에 세포 성장을 관찰한 결과， melan-a 의 경우 인다트랄린 처리군이 대조군에 비해 세포 성장이 24 시간에서 62% 억제된 후 56% 억제된 상태로 유지되었으며, B16-F10 의 경우는 인다트랄린 처리군이 대조군에 비해 세포 성장이 24 시간부터 55¾>로 억제된 후 계속 약 54% 수준으로 억제된 상태가 유지되었다 (도 5-B).
7. 인다트랄린은 인 비보 (in vivo)모델에서 혈관 협착을 억제하였다. 오토파지 유도물질은 혈관 내부에 플라크가 쌓여서 생기는 심근경색의 치료제로 연구가 진행되고 있고， 이전의 연구 내용에 의하면 오토파지 유도물질로 알려진 라파마이신 [Rapamycin (상품명: sirolimus)]은 심근경색 치료제로써의 효과를 나타내어 이에 더욱 활발한 연구가 진행되고 있다. 본 발명에서는 오토파지 유도물질로 인다트랄린에 의한 쥐의 경동맥 (rat carotid artery) 혈관 협착을 억제하는 효과를 확인하였다. 쥐의 경동맥에 풍선혈관 손상 (balloon injury)을 낸 후 캐시터를 이용하여 인다트랄린， 라파마이신 및 대조군로 디메틸설폭사이드 (DMS0)를 처리하여 혈관의 협착을 관찰하였다. 혈관 협착은 혈관 내부에 플라크가 쌓여가는 현상을 말하는데, 라파마이신 또는 인다트랄린을 처리한 후 평활근세포 (smooth muscle cell)의 증식이 억제되었고， 그 결과로 혈관 협착이 유효하게 억제되는 것을 확인 할 수 있었다 (도 6). 협착된 조직을 관찰하여 내막면적 (intima area) 및 중막면적 (media area)의 비율을 비교한 결과 대조군은 내막면적이 약 80% 비중을 차지했지만, 인다트랄린을 처리한 군에선 내막면적이 60% 이하로 줄었다. 인다트랄린은 라파마이신과 같이 평활근세포의 협착을 억제하는 것을 관찰할 수 있었다. 추가논의
인다트랄린은 세포 증식을 효과적으로 억제하는 모노아민 신경전달물질 억제제이다. 본 연구는 인다트랄린이 오토파지를 유도함을 새로이 보고하였다. 신경전달물질 억제제 및 오토파지의 관계는 현재 시험 중에 있으나， 각각의 신경전달물질 억제제의 특이적 기전은 아직 밝혀지지 않았다. 인다트랄린 유도성 오토파지는 형광 스크리닝 및 LC3 변환 면역블롯팅에 의해 확인되었다. 인다트랄린은 또한 HeLa 및 HUVEC 에서 각각 3 및 0.5 μΜ 의 IC50 값을 나타내면서 세포 증식을 억제하였다. 인다트랄린의 연장된 처리 (3 일)는 세포 증식 분석법에서 볼 수 있듯이 세포 생존 비율을 감소시켰으나, 인다트랄린 5 μΜ 을 HeLa 및 HUVEC에 24시간 처리시는 오토파지 스크리닝 동안 독성을 나타내지 않았다. 오토파지 유도제 및 세포 성장 억제제로서의 인다트랄린에 대해 그 혈관신생억제 효능 또한 시험하였다. 인 비트로 분석에서， 인다트랄린은 혈관신생의 징표인 관 형성， 침습 및 이동을 억제하였다. 인다트랄린은 관 형성 및 이동 분석과 비교하여 HUVEC 의 침습을 보다 효과적으로 억제하였다. 몇몇 혈관신생 억제제는 침습 또는 전이를 특이적으로 억제하므로 이는 인다트랄린의 중요한 특성일 수 있다. 종합적으로 오토파지 유도제는 잠재적인 항암제 후보제이고, 본 발명의 인다트랄린 또한 혈관신생 억제제로의 가능성을 보였다. 오토파지가 유도가 어떻게 혈관신생 억제로 이어지는지는 아직 명확히 이해되지 않았다. 인다트랄린에 대한 추가 연구로, 모노아민 신경전달물질 억제제 , 오토파지 및 혈관신생의 관계가 밝혀질 수 있을 것이다. 오토파지의 유도가 혈관신생을 억제하는 신호를 촉발하거나， 또는 신경전달물질의 억제가 오토파지 및 혈관신생 모두의 억제를 동시에 자극할 수도 있다. 오토파지 및 혈관신생의 정확한 기전은 아직 풀리지 않은 채 남아있으며, 상기 기전에 대한 깊은 이해는 오토파지에 기초한 신규한 항 -혈관신생제 개발의 초석이 될 것이다.
멜라닌생성에서의 오토파지는 멜라노좀의 형성으로 인해 자연스럽게 유도되는 기작이다. 더불어 멜라노마 (피부암)에서 오토파지는 세포생존을 위해 활발하게 유도된다. 하지만 인다트랄린의 경우 오토파지를 유도하며 동시에 멜라닌생성을 억제하는 효능을 가지고 있다. 즉 인다트랄린과 같은 오토파지 유도 물질은 자연적으로 생기는 멜라닌생성에서의 오토파지와는 다른 기작으로 오토파지를 활성화시키는 것으로 추정된다. 신경전달물질인 에피네프린은 멜라닌생성을 유도하고 오토파지를 저해하는 활성이 이미 각각 보고되어 있다. 기존의 연구 결과들을 토대로 멜라닌생성과 오토파지의 저해 활성을 연결시키면, 모노아민 신경전달물질 저해제인 인다트랄린을 활용하여 멜라닌생성과 오토파지의 관계를 새롭게 밝힐 수 있을 것이며 이를 토대로 멜라닌생성 조절제 개발이 가능할 것이다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하는 바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 참고문헌
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Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
(a) 하기 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 오토파지 관련 질환， 혈관신생질환 (angiogenic disease) 또는 멜라닌 과다성 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
1
Figure imgf000028_0001
상기 화학식에서 , ¾및 ¾는 각각 독립적으로 수소, 히드록시 , - c6 의 알킬， c-c6 의 알케닐, c3-c8 사이클로알킬 또는 d-C6 알콕시를 나타내고， 상기 내지 R12 는 각각 독립적으로 수소, 할로겐， 히드록시， Ci-Ce 의 알킬， d-C6 의 알케닐， C3-C8 사이클로알킬 또는 d-C6 알콕시를 나타낸다.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 ¾ 및 ¾는 각각 독립적으로 수소 또는 C Cs 의 알킬을 나타내고， 상기 R4 내지 R12는 각각 독립적으로 수소， - C3의 알킬 또는 할로겐을 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서, 상기 화학식 1 의 화합물은 하기 화학식 2 로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물:
화학식 2
Figure imgf000029_0001
상기 화학식에서 ¾및 ¾는 각각 할로겐을 나타낸다.
【청구항 4]
제 3 항에 있어서 , 상기 ¾및 ¾는 염소원자 (C1)인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 5】
제 1 항에 있어서， 상기 오토파지 관련 질환은 암， 아테롬성 동맥 경화증， 알츠하이머병， 파킨슨병， 근위측성측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅톤병， 척수소뇌성 운동실조 (spinocerebel lar ataxia) , 안 인후증 이영양증 (oculopharyngeal muscular dystrophy) , 프라이온병， 치명적 가족성 불면증， 알파— 1 안티트립신 결핍증， 담창구 시상하부 위측증 (dentatorubral pal 1 idoluysian atrophy), 전측두엽 치매， 전진성 상핵 마비 (progressive supranuclear palsy) , 척주 인경 근위축증 (x_linked spinobulbar muscular atrophy) 및 신경 핵내 유리질 봉입증 (neumnal intranuclear hyaline inclusion disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 6】
제 1 항에 있어서, 상기 혈관신생질환은 암, 협착증, 재발협착증， 당뇨병성 망막증， 미숙아 망막증， 각막 이식 거부， 신생혈관 녹내장， 흥색증, 증식성 망막증, 건선， 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드， 상처 과립화， 혈관 접착, 류마티스 관절염， 골관절염， 자가면역 질환, 크론씨병， 아테름성 동맥경화, 장관 접착， 캣 스크래치 질환, 궤양， 간경병증, 사구체신염， 당뇨병성 신장병증， 악성 신경화증， 혈전성 미소혈관증， 기관 이식 거부， 신사구체병증, 당뇨병， 염증 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 7】
제 6 항에 있어서， 상기 혈관신생질환은 암, 협착증 또는 재발협착증인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 8】
제 1 항에 있어서， 상기 멜라닌 과다성 질환은 기미， 주근깨, 검버섯, 잡티， 표피 멜라닌세포성 병변 (Epidermal melanocytic lesion), 밀크커피 반점 (Cafe's au lait macules), 베커 모반 (Becker's Nevus), 반문상 모반 (Nevus Spilus), 혹자 (Lentigines) , 진피 멜라닌세포성 병변 (Dermal melanocytic lesions) , 몽고반 (Mongol ian spot), 오타 모반 (Nevus of Ota) , 후천성 양측성 오타 모반양 반 (Acquired bilateral nevus of Ota-like macules), 이토 모반 (Nevus of Ito), 청색 모반 (Blue nevus), 멜라닌 세포성 모반 (Melanocytic nevus), 경계 모반 (Junctional nevus) , 복합 모반 (Compound nevus), 진피내 모반 (Intradermal nevus), 운륜모반 (Halo nevus), 선천성 멜라닌세포성 모반 (Congenital nevocy t i c nevus) , 스피츠 모반 (Spitz nevus), 이형성 모반 (Dysplastic nevus), 혹색종 (Melanoma)， 악성 혹자 혹색종 (Lentigo maligna melanoma), 표재 확장성 혹색종 (Superficial spreading melanoma), 선단 혹자성 혹색종 (Acral ；' lent igi nous melanoma) , 결절성 폭생종 (Nodular melanoma) , 색소성 기저세포암 (pigment basal cell carcinoma) , 색소성 피부섬유종 (dermatofibromas), 색소성 피부낭종 (dermoid cyst), 색소성 켈로이드 (keloid) 및 색소성 각질극세포종 (keratoacanthomas)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 9】
제 1 항에 있어， 상기 조성물은 멜라닌생성(11 131108∞6^3)을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 10]
하기 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물:
화학식 1
Figure imgf000031_0001
상기 화학식에서 , ¾및 ¾는 각각 독립적으로 수소， 히드록시 , d- c6 의 알킬， c-c6 의 알케닐， c3-c8 사이클로알킬 또는 d-C6 알콕시를 나타내고， 상기 R4 내지 R12 는 각각 독립적으로 수소， 할로겐， 히드록시， CrC6 의 알킬， C-C6 의 알케닐, C3-C8 사이클로알킬 또는 d— C6 알콕시를 나타낸다.
【청구항 11】
(a) 하기 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 그와 약제학적으로 허용 가능한 염의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 대상 (subject)에 투여하는 단계를 포함하는 오토파지 관련 질환， 혈관신생질환 (angiogenic disease) 또는 멜라닌 과다성 질환의 예방 또는 치료방법 :
1
Figure imgf000031_0002
상기 화학식에서 , R2및 ¾는 각각 독립적으로 수소， 히드록시， d-
C6 의 알킬， d-C6 의 알케닐, C3-C8 사이클로알킬 또는 d-C6 알콕시를 나타내고， 상기 R4 내지 R12 는 각각 독립적으로 수소， 할로겐, 히드록시, Ci-C6 의 알킬， C-Cs 의 알케닐， C3-C8 사이클로알킬 또는 C厂 C6 알콕시를 나타낸다.
【청구항 12]
제 11 항에 있어서， 상기 Ri, ¾및 ¾는 각각 독립적으로 수소 또는 Ci-C3의 알킬을 나타내고, 상기 ¾ 내지 Ri2는 각각 독립적으로 수소， C厂 C3의 알킬 또는 할로겐을 나타내는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 13】
제 11 항에 있어서， 상기 화학식 1 의 화합물은 하기 화학식 2 로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
화학식 2
Figure imgf000032_0001
상기 화학식에서 ¾및 ¾는 각각 할로겐을 나타낸다 .
【청구항 14]
제 13 항에 있어서, 상기 ¾및 ¾는 염소원자 (C1)인 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 15】
제 11 항에 있어서， 상기 오토파지 관련 질환은 암， 아테롬성 동맥 경화증， 알츠하이머병， 파킨슨병, 근위측성측삭 경화증 (amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅톤병, 척수소뇌성 운동실조 (spinocerebel lar ataxia) , 안 인후증 이영양증 (oculopharyngeal muscular dystrophy) , 프라이온병， 치명적 가족성 불면증， 알파 -1 안티트립신 결핍증， 담창구 시상하부 위측증 (dentatorubral pal 1 idoluysian atrophy), 전측두엽 치매, 전진성 상핵 마비 (progressive supranuclear palsy) , 척주 인경 근위축증 (x-linked spinobulbar muscular atrophy) 및 신경 핵내 유리질 봉입증 (neuronal intranuclear hyaline inclusion disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 16】
제 11 항에 있어서, 상기 혈관신생질환은 암， 협착증， 재발협착증, 당뇨병성 망막증， 미숙아 망막증， 각막 이식 거부， 신생혈관 녹내장, 흥색증， 증식성 망막증， 건선, 혈우병성 관절， 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식， 켈로이드， 상처 과립화， 혈관 접착， 류마티스 관절염， 골관절염， 자가면역 질환， 크론씨병， 아테름성 동맥경화， 장관 접착， 켓 스크래치 질환， 궤양， 간경병증， 사구체신염， 당뇨병성 신장병증， 악성 신경화증， 혈전성 미소혈관증， 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법 ·
【청구항 17】
제 16 항에 있어서, 상기 혈관신생질환은 암, 협착증 또는 재발협착증인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 18】
제 11 항에 있어서, 상기 멜라닌 과다성 질환은 기미, 주근깨, 검버섯, 잡티， 표피 멜라닌세포성 병변 (Epidermal melanocytic lesion), 밀크커피 반점 (Cafe's au lait macules), 베커 모반 (Becker's Nevus), 반문상 모반 (Nevus Spilus), 혹자 (Lentigines)， 진피 멜라닌세포성 병변 (Dermal melanocytic lesions) , 몽고반 (Mongol i an spot), 오타 모반 (Nevus of Ota), 후천성 양측성 오타 모반양 반 (Acquired bilateral nevus of Ota-like macules), 이토 모반 (Nevus of Ito), 청색 모반 (Blue nevus), 멜라닌 세포성 모반 (Melanocytic nevus), 경계 모반 (Junctional nevus), 복합 모반 (Compound nevus) , 진피내 모반 (Intradermal nevus), 운륜모반 (Halo nevus), 선천성 멜라닌세포성 모반 (Congenital nevocytic nevus) , 스피츠 모반 (Spitz nevus), 이형성 모반 (Dysplast ic nevus) , 혹색종 (Melanoma), 악성 혹자 혹색종 (Lentigo maligna melanoma), 표재 확장성 혹색종 (Superficial spreading melanoma) , 선단 폭자성 혹색종 (Acral lent igi nous melanoma) , 결절성 혹생종 (Nodular melanoma) , 색소성 기저세포암 (pigment basal cell carcinoma), 색소성 피부섬유종 (dermatofibromas), 색소성 피부낭종 (dermoid cyst), 색소성 켈로이드 (keloid) 및 색소성 각질극세포종 (keratoacanthomas)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 19】
제 11 항에 있어， 상기 조성물은 멜라닌생성(11 1^0요6^^3)을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법. 【청구항 20】
하기 화학식 1 로 표시되는 화합물 또는 그의 염을 포함하는 조성물올 대상 (subject)의 피부에 도포하는 단계를 포함하는 피부 미백 방법：
1
Figure imgf000034_0001
상기 화학식에서 R2및 ¾는 각각 독립적으로 수소, 히드록시， d_ c6 의 알킬， c厂 c6 의 알케닐， c3-c8 사이클로알킬 또는 d-C6 알콕시를 나타내고, 상기 R4 내지 R12 는 각각 독립적으로 수소, 할로겐， 히드록시, Ci-C6 의 알킬， d-C6 의 알케닐， C3-C8 사이클로알킬 또는 d-Cs 알콕시를 나타낸다.
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