KR101416505B1

KR101416505B1 - 마타이레시놀을 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR101416505B1
Application number: KR1020120026601A
Authority: KR
Inventors: 권호정; 이보람
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2012-03-15
Filing date: 2012-03-15
Publication date: 2014-07-09
Also published as: KR20130104769A

Abstract

본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다:
화학식 1

본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분으로 이용되는 화합물은 저산소-유발 mROS(mitochondrial ROS) 발생을 저해하여 혈관신생을 효과적으로 억제한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 혈관신생-관련 질병 또는 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분으로 이용되는 화합물은 혈관 신생 인자인 HIF-1α 저해를 통해 혈관신생을 효과적으로 저해하여, mROS 발생 저해를 통한 혈관신생 시그널링 경로를 특이적으로 교란시켜 혈관신생을 효과적으로 억제한다.

Description

마타이레시놀을 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Compositions for Inhibiting angiogenesis Comprising Matairesinol}

본 발명은 마타이레시놀을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

혈관신생(Angiogenesis)은 산소와 영양소 농도에 의존하여 새로운 혈관을 형성하는 과정이다[1]. 저-산소 종양 미세환경은 종양 세포 생존 및 전이를 촉진하는 저산소(hypoxia)-유도 종양 혈관신생을 촉발한다. 미토콘드리아 활성산소종(mROS: Mitochondrial reactive oxygen species)은 혈관신생 저산소 시그널 전달에서 핵심 물질 중 하나로 관여한다[2]. 그러나 mROS 발생 및 후속 저산소 시그널 전달의 상세한 메커니즘과 인자들은 설명되어져야 할 문제로 남아있다.

천연물-유도 소분자는 생물학 분야에서 분자 탐침(probes)으로 사용되고, 암을 포함하는 다수의 질병 치료를 위하여 치료학적 제제로 사용되어왔다. 예를 들어, 태평양 주목(Pacific yew)의 유효성분으로, 세포주기 차단을 가져오는 파클리탁셀(paclitaxel)은 미세소관(microtubules)에 결합하고 이를 안정화한다. 이러한 파클리탁셀의 독특한 생물학적 활성 때문에, 상기 화합물은 미세소관 세포골격 조직을 연구하는데 가치있는 탐침으로 사용하여왔다[3]. 또한, 파클리탁셀은 유방암과 폐암 및 카포시 육종(Kaposi’s sarcoma)을 포함하는 다수의 암의 치료를 위한 가장 대중적인 약물 중 하나이다[4,5]. 천연 소분자의 이러한 큰 이점 때문에, 독특한 화학 구조와 생물학적 활성을 갖는 신규한 천연 소분자를 동정하는데 관심이 증가하고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 세포-기반 스크리닝을 사용하여 천연 식물에서 신규한 항-혈관신생제를 발견하기 위한 지속적인 노력의 일환으로, 저산소 하 mROS 발생 저해에 미치는 항-혈관신생의 효과에 대해 천연 네팔 식물 200개의 크루드 추출물을 스크리닝 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 혈관신생에 대한 mROS-매개 시그널을 타겟으로 하는 신규한 항-혈관신생제로서의 천연화합물을 발굴하였으며, 이 항-혈관신생제는 HIF-1α 및 이의 타겟 유전자인 VEGF 발현 레벨을 강력하게 저해하여 혈관신생을 효과적으로 차단하였고, 안전성(safety)이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 혈관신생 억제용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 하기의 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 혈관신생 억제용 조성물을 제공한다:

화학식 1

상기 화학식에서, R₁ 및 R₄는 서로 독립적으로 수소, 할로, C₁-C₅ 알킬, 또는 C₂-C₅ 알케닐이고, R₂ 및 R₃은 서로 독립적으로 수소, 할로 또는 C₁-C₃ 알킬이다.

본 발명자들은 세포-기반 스크리닝을 사용하여 천연 식물에서 신규한 항-혈관신생제를 발견하기 위한 지속적인 노력의 일환으로, 저산소 하 mROS 발생 저해에 미치는 항-혈관신생의 효과에 대해 천연 네팔 식물 200개의 크루드 추출물을 스크리닝 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 혈관신생에 대한 mROS-매개 시그널을 타겟으로 하는 신규한 항-혈관신생제로서의 천연화합물을 발굴하였으며, 이 항-혈관신생제는 HIF-1α(Hypoxia-inducible factor-1α) 및 이의 타겟 유전자인 VEGF(Vascular endothelial growth factor) 발현 레벨을 강력하게 저해하여 혈관신생을 효과적으로 차단하였고, 안전성(safety)이 있음을 확인하였다.

본 발명의 조성물은 “약제학적 혈관신생 억제용 조성물”로 표현되며, 이는 “혈관신생-관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물” 또는 “비조절 혈관신생-관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물”로 표현될 수도 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분으로 이용되는 화합물은 화학식 1로 표시된다. 본 발명의 화합물은 기본적으로 락톤을 가지며, 벤질기를 갖는다.

본 발명의 유효성분을 정의하는 화학식 1에서, 용어 “할로”는 할로겐족 원소를 나타내며, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포함한다. 용어 “C₁-C₅ 알킬”은 탄소수 1-5의 직쇄 또는 분쇄 포화 탄화수소기를 의미하며, 바람직하게는 “C₁-C₅ 직쇄 또는 가지쇄 알킬”이며, 이는 저가 알킬로서 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸 및 t-펜틸을 포함한다. 용어 “C₁-C₃ 알킬”은 탄소수 1-3의 직쇄 또는 분쇄 포화 탄화수소기를 의미하며, 바람직하게는 “C₁-C₃ 직쇄 또는 가지쇄 알킬”이며, 이는 저가 알킬로서 메틸, 에틸, n-프로필 및 이소프로필을 포함한다. 용어, “알케닐기”는 지정된 탄소수를 갖는 직쇄 또는 분쇄 불포화 탄화수소기를 나타내며, 바람직하게는 “C₂-C₅ 직쇄 또는 가지쇄 알케닐”이고, 이는 최소 하나의 이중 결합을 갖는 탄소수 2-5의 탄화수소기로서, 예컨대, 에테닐, 프로페닐, 이소프로페닐, 부테닐, 이소부테닐, 펜테닐, 이소펜테닐 및 t-펜테닐을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 R₁ 및 R₄는 서로 독립적으로 수소, 할로, C₁-C₅ 알킬 또는 C₂-C₅ 알케닐이고, 보다 바람직하게는, 수소, C₁-C₅ 알킬 또는 C₂-C₅ 알케닐이며, 보다 더 바람직하게는 C₁-C₅ 알킬 또는 C₂-C₅ 알케닐이고, 보다 더욱 더 바람직하게는 C₁-C₅ 알킬이며, 보다 더욱 더 더욱 바람직하게는 C₁-C₂ 알킬이고, 가장 바람직하게는 C₁ 알킬이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 R₂ 및 R₃은 서로 독립적으로 수소, 할로 또는 C₁-C₃ 알킬이고, 보다 바람직하게는 수소 또는 C₁-C₃ 알킬이고, 가장 바람직하게는 수소이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화학식 2의 화합물이다:

화학식 2

상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 마타이레시놀[(αR,βR)-α,β-비스(4-히드록시-3-메톡시벤질)부티로락톤]이다.

본 발명에서 이용되는 유효성분은 화학식 1로 표시되는 화합물뿐만 아니라, 그의 염, 수화물, 용매화물 또는 프로드럭을 포함한다.

용어, “약제학적으로 허용 가능한 염”은 소망하는 약리학적 효과, 즉 혈관 신생을 억제하는 활성을 갖는 상기 화학식 1의 화합물의 염을 나타낸다. 이러한 염은 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드 및 하이드로요오다이드와 같은 무기산, 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔설포네이트, 비설페이트, 설파메이트, 설페이트, 나프틸레이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 2-히드록시에탄설페이트, 락테이트, 말리에이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 토실레이트 및 운데카노에이트와 같은 유기산을 이용하여 형성된다.

용어, “약제학적으로 허용 가능한 수화물”은 소망하는 약리학적 효과를 갖는 상기 화학식 1의 화합물의 수화물을 나타낸다. 용어, “약제학적으로 허용 가능한 용매화물”은 소망하는 약리학적 효과를 갖는 상기 화학식 1의 화합물의 용매화물을 나타낸다. 상기 수화물 및 용매화물도 상기한 산을 이용하여 제조될 수 있다.

용어, “약제학적으로 허용 가능한 프로드럭”은 상기 화학식 1의 화합물의 약리학적 효과를 발휘하기 이전에 생물전환을 하여야 하는 상기 화학식 1의 화합물의 유도체를 나타낸다. 이러한 프로드러그는 화학적 안정성, 환자 수용성, 생물학적 이용성, 기관 선택성 또는 조제의 편의를 개선하기 위하여, 작용 기간의 장기화 및 부작용의 감소를 위하여 제조된다. 본 발명의 프로드러그의 제조는 상기 화학식 1의 화합물을 이용하여 당업계의 통상적인 방법(예: Burger's Medicinal Chemistry and Drug Chemistry, 5^th ed., 1:172-178 and 949-982(1995))에 따라 용이하게 제조될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질병, 질환 또는 상태는 혈관신생과 관련된 다양한 질환을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질환은, 암, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증 또는 신경퇴행성 질환이다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 자가면역질환은 알로페시아 그레아타(alopecia greata), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루우-피부염(celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 면역이상 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증, Churg-Strauss 증후군, 반흔성유천포창, CREST 증후군, 한냉 응집소 질환, 크론씨병, 원판성 낭창, 복태성복합한냉글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스 질환, 귈레인 바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, IgA 신경염, 연소자성 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼합성 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 타입 I 또는 면역-매개 당뇨병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결정성 다발동맥염, 다발연골염, 자가면역성 다선 증후군, 류마티스 다발성근통, 다발성 근염과 피부근염, 일차성 무감마글로불린혈증, 일차성 담증성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증, 강직인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 다가야스 동맥염, 일시적 동맥염, 거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 염증성 질환의 예는, 천식, 엔세필리티스(encephilitis), 염증성 장염, 만성 폐쇄성 폐질환, 알러지, 폐혈병성 쇼크증, 폐섬유증, 미분화 척추관절증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 및 만성 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은 당업계에 공지된 다양한 암을 포함하며, 예를 들어, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 두경부암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 약제학적 조성물은 혈관내피세포의 증식, VEGF-유도 관 형성 및 혈관내피세포의 침투를 억제한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 예컨대 성인 기준으로 0.0001-1000 mg/kg이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 mROS 발생을 저해하고, HIF-1α 및 이의 대상 유전자인 VEGF의 발현 레벨을 저해하여, 혈관신생 과정에서 중요한 단계인 내피세포의 증식 및 이동을 효과적으로 차단함으로써 효과적으로 그리고 인체에 안전한 방식으로 혈관신생을 억제하여, 다양한 혈관신생-관련 질환 또는 질병의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분으로 이용되는 화합물은 저산소-유발 mROS 발생을 저해하여 혈관신생을 효과적으로 억제한다.

(b) 본 발명의 약제학적 조성물은 혈관신생-관련 질병 또는 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

(c) 본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분으로 이용되는 화합물은 혈관 신생 인자인 HIF-1α 저해를 통해 혈관신생을 효과적으로 저해하여, mROS 발생 저해를 통한 혈관신생 시그널링 경로를 특이적으로 교란시켜 혈관신생을 효과적으로 억제한다.

도 1a-도 1b는 마타이레시놀의 화학 구조 및 HeLa 세포에서 저산소 상태에서 발생된 미토콘드리아 활성산소종(mROS) 저해 활성을 보여준다. 도 1a는 마타이레시놀의 화학 구조(C₂₀H₂₂O₆, MW 358.39)이다. 도 1b는 저산소 하 mROS 발생에서의 마타이레시놀 효과를 나타낸다.
도 2a 및 도 2b는 인간제대정맥내피세포(HUVECs) 및 HeLa 세포에서의 마타이레시놀 항-증식 활성을 보여준다. 도 2a는 세포 증식에서의 마타이레시놀 효과를 나타낸다. HUVECs 및 HeLa 세포에 3일 동안 마타이레시놀(1-50 μM)을 처리하고, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(MTT) 비색법 분석을 사용하여 세포 성장을 측정하였다. 도 2b는 트리판 블루 분석에 의하여 결정되는 세포 생존도에서의 마타이레시놀 효과를 나타낸다.
도 3a-도 3c는 마타이레시놀의 인 비트로 및 인 비보 항-혈관신생 활성을 보여준다. 혈청-부재 인간제대정맥내피세포(HUVECs)를 마타이레시놀의 존재 또는 부재 하에서 혈관내피세포 성장인자(VEGF)(30 ng/mL)로 자극하였다. 도 3a는 내피 세포 침투에서의 마타이레시놀 억제 활성을 나타낸다. 도 3b는 HUVECs의 관 형성 능력에서의 마타이레시놀 효과를 나타낸다. 화살표는 VEGF-자극 HUVECs에 의해 형성된 깨진 관을 나타낸다. 혈청-부재 배지에서 HUVECs의 침투(도 3a) 및 모세관 형성(도 3b)의 기저 레벨을 100% 정상화하였다. 도 3c는 인 비보에서의 마타이레시놀 항-혈관신생 활성을 나타낸다. EtOH 대조군, 레티노산(RA: retinoic acid)(1 μg/알), 마타이레시놀(1 μg/알) 및 마타이레시놀(2 μg/알)을 융모요막(CAM: Chorioallantoic membrane)에 처리하고, 막을 관찰하였다. 화살표는 CAM의 마타이레시놀-매개 신혈관 형성 억제를 나타낸다. 계산은 테스트된 알의 총 수에 상대적인 양성 알의 비율에 기초하였다.
도 4a-도 4d는 혈관신생 인자 발현에서의 마타이레시놀 영향을 보여준다. 도 4a는 HIF-1α(hypoxia-inducible factor-1α) 및 사이클린 D1(cyclin D1)의 발현 레벨을 웨스턴 블롯에 의해 감지한 것이다. 튜불린(tubulin)의 레벨을 내부 대조군으로 사용하였다. 도 4b는 HeLa 세포에서 혈관내피세포 성장인자(VEGF: vascular endothelial cell growth factor) 단백질의 발현 레벨을 면역분석법으로 결정한 것이다. 도 4c 및 도 4d는 침투(도 4c) 및 관 형성(도 4d)의 종양 조건화 배지-유도 혈관신생을 나타낸다. HUVECs을 상부 챔버에 씨딩하고, HeLa 세포-조건화 배지는 VEGF 없는 하부 챔버에 추가하였다. “Nor”는 산소 정상 상태(Normoxia)를 나타내고, “Hyp”는 저산소 상태(Hypoxia)를 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 실험 방법

실험 재료

마타이레시놀은 Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO)에서 구입하였다. 내피세포 기본배지-2(EBM-2: Endothelial basal media-2)는 Cambrex Bio Science(Walkersville, MD)에서 구입하였다. DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium), 우태혈청(FBS: fetal bovine serum), 적색 미토콘드리아 과산화물 인디케이터(MitoSOX: red mitochondrial superoxide indicator) 및 Hoechst 33342는 Invitrogen(Grand Island, NY)에서 구입하였다. 트랜스웰 플레이트, 재조합 인간 혈관내피세포 성장인자(recombinant human vascular endothelial cell growth factor) 및 매트리젤(Matrigel)은 각각 Corning(Cambridge, MA), KOMA Biotech., Inc.(서울, 한국) 및 BD Biosciences(Bedford, MA)으로부터 구입하였다. 항-HIF-1α(Anti-hypoxia-inducible factor-1α), 항-사이클린D1(anti-cyclinD1) 및 항-튜불린 항체(anti-tubulin antibodies)는 각각 BD Biosciences(Bedford, MA), Cell Signaling (Beverly, MA) 및 Millipore (Billerica, MA)에서 구입하였다.

세포 배양 및 저산소 조건

인간제대혈관내피세포(HUVECs: Human umbilical vascular endothelial cells)를 10% FBS가 보충된 EBM-2 배지에서 4-10 패시지 동안 배양 하였다. HeLa(human cervical carcinoma) 세포를 10% FBS 및 1% 항생제가 포함된 DMEM에서 배양하였다. 두 세포주를 5% CO₂ 인큐베이터의 습윤 조건 하 37℃로 유지하였다. 저산소 조건을 위하여, 세포를 혐기성 챔버(Forma)에서 N₂로 균형이 맞춰진 5% CO₂ 및 1% O₂에서 배양하였다.

세포 배양 및 생존도 분석

HUVECs을 96-웰 플레이트에 씨딩하고, 24시간 동안 배양하였으며, 72 시간 동안 다양한 농도의 화합물을 처리하였다. MTT[3-(4,5-dimehylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide; Sigma-Aldrich) 비색법 분석을 사용하여 세포배양 정도를 측정하였고, 생존도 분석(viability assay)을 트리판(trypan) 블루 염색법으로 평가하였다[8]. 100x 배율에서 올림푸스 IX70 현미경(Olympus America, Inc., Melville, NY)으로 세포 형태를 관찰하였다.

mROS 레벨 측정

mROS 레벨을 MitoSOX로 분석하였다. MitoSOX(5 μM) 및 Hoechst 33342에서 10분 동안 배양한 후, 세포를 세척 완충액으로 한 번 세척하고 4% 포름알데히드로 고정하였다. ArrayScan V^TI HCS Reader(Cellomics, Inc., Pittsburgh, PA)을 사용하여 자동으로 세포 이미지 및 데이터를 획득하였다[9]. 본 실험에서, BioApplication의 구분 분석을 실시함으로써, Hoechst-표지된 핵과 각 세포에 대한 자동-분석된 MitoSOX 형광 세기 변화에 의해 개별 세포를 동정하였다.

인 비트로 모세관 형성 분석

매트리젤(10 mg/mL)을 48-웰 플레이트에 코팅하고 37℃에서 2시간 동안 중합 하였다. HUVECs(7 x 10⁴세포/웰)을 매트리젤 표면에 씨딩하고 VEGF(30 mg/mL)를 처리하였다[10,11]. 소분자를 37℃에서 3-16시간 동안 추가하였다. 세포의 형태학적 변화 및 관 형성을 현미경(IX71, Olympus)에서 관찰한 후 촬영하였다(DP70, Olympus).

인 비트로 화학침투( chemoinvasion ) 분석

8.0-μM-포어(pore)-크기의 폴리카보네이트 필터가 포함된 트랜스웰 챔버 시스템을 이용하여 인 비트로에서 HUVEC의 침투성을 조사하였다[12]. 상기 필터의 하부를 10 ㎕ 젤라틴(1 mg/mL)으로 코팅하고, 필터의 상부를 10 ㎕ 마트리겔(3 mg/mL)로 코팅하였다. VEGF(30 ng/mL)가 존재하는 하부 챔버에 마트리겔을 추가하고, 필터의 상부에 HUVECs(7 x 10⁵세포/웰)을 위치시켰다. 상기 챔버를 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 상기 세포를 70% 메탄올로 고정시키고, 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색한 후, Olympus IX70 현미경으로 100x 배율에서 하부 필터의 총 세포 수를 측정하여 침투성을 결정하였다.

융모요막 ( CAM : Chorioallantoic membrane ) 분석

공지된 문헌에 기재된 바와 같이, 인 비보 항-혈관신생 활성을 CAM 분석을 이용하여 실시하였다[13]. 닭의 수정란을 3일 동안 37℃ 항습 인큐베이터에서 유지시켰다. 상기 CAM 및 난황을 껍질막으로부터 떨어지게 한 후 알 알부민 약 4-5 mL을 피하 바늘로 제거하였다. 5 일째, 껍질막이 벗겨지고 화합물을 로드한 Thermanox coverslip(NUNC, Rochester, NY)을 CAM 표면에 적용하였다. 이틀 후, 인트라리포제(Intralipose)((주) 한국 Greencross) 1 mL을 CAM 하부에 주입하고, 막을 현미경으로 관찰하였다. 항-혈관신생 화합물로 잘 알려진 레티노산(RA: retinoic acid)을 양성 대조군으로 사용하였다.

효소-결합 면역 분석에 의한 VEGF 측정

제조업체의 지침에 따라 VEGF 면역분석 키트(VEGF Immunoassay kit)(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 이용하여 마타이레시놀-처리 세포의 배지 내 VEGF 농도를 결정하였다. 각 웰에서 VEGF 총 양에 상대적인 VEGF의 농도로 실험결과를 표현하였다[14].

웨스턴 블롯 분석

세포 용해물을 10 % 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 구분하고, 표준 일렉트로블롯팅(electroblotting) 절차를 사용하여 폴리비닐리덴 플로라이드 막(Millipore, Bedford, MA)으로 옮겼다. 그 후 블롯을 차단하고 이를 항-HIF-1α, 항-사이클린D1 및 항-튜불린 항체를 포함하는 1차 항체로 4℃에서 하루 밤 동안 면역표지 하였다. 제조업체의 지침에 따른 향상된 화학발광 키트(chemiluminescence kit)(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)에 의하여 면역 표지를 탐지하였다.

통계 분석

실험결과는 평균±표준오차로 표현되어 있다. Student's T-테스트를 대조군과 실험군 간의 통계적 유의성을 결정하기 위해 사용하였다. 0.05 이하의 P-값을 통계적으로 유의성 있는 것으로 간주하였다.

결과 및 토론

마타이레시놀은 mROS 발생을 저해한다

도 1b에서 보이는바와 같이 마타이레시놀은 저산소 조건에서 생성되는 mROS발생을 처리량-의존 방식으로 저해하였다. 본 실험을 통해 mROS를 저해하는 신규한 천연 소분자인 마타이레시놀을 동정하였다.

마타이레시놀은 강력하게 HUVEC 증식을 억제한다

본 발명자들은 다음으로 HUVEC 및 HeLa 세포 증식에서의 마타이레시놀 효과를 조사하였다. 이 세포들에 다양한 농도의 마타이레시놀을 3일 동안 처리하고, 세포 성장을 MTT 비색법(colorimetric) 분석에 의해 평가하였다. 특히, 마타이레시놀은 HeLa 세포(IC₅₀, 200 μM) 보다 HUVECs(IC₅₀, 75 μM)에서 더 강력하게 세포 성장을 억제하였다(도 2a). 세포 독성 부작용을 일으키지 않는 마타이레시놀의 적정 처리량 결정을 위해 다양한 농도의 마타이레시놀(1-50 μM)을 HUVECs에 처리하고, 세포 생존도를 트리판 블루 배제 방법(trypan blue exclusion method)을 이용하여 결정하였다. 3일 동안 최대 50 μM까지의 처리량에서 마타이레시놀은 HUVEC 세포 독성을 일으키지 않았다. 따라서, 이하의 연구를 5-20 μM의 농도 범위에서 실시하였다(도 2b).

마타이레시놀은 인 비트로 및 인 비보에서 혈관 생성을 억제한다

다음으로, 본 발명자들은 화학침투 및 튜브 형성을 포함하는 HUVEC 혈관신생 표현형에서의 마타이레시놀 효과를 조사하였다. 마타이레시놀 존재 또는 부재 하 VEGF(vascular endothelial cell growth factor)에 의해 혈청-부재 HUVECs을 모의실험 하였다. 도 3a에서 보이는 바와 같이, 마타이레시놀은 세포 독성 효과 없이 처리량-의존 방식으로 VEGF-유발 HUVEC의 침투성을 억제하였다. 또한, 본 발명자들은 HUVEC 튜브 형성 활성에 대한 마타이레시놀의 효과를 조사하였다. 마타이레시놀은 처리량-의존 방식으로 VEGF-유발 HUVEC 관 형성을 억제하였다(도 3b). 이러한 데이터는 마타이레시놀이 인 비트로에서 VEGF-유발 혈관신생을 효과적으로 억제함을 나타낸다.

또한, 인 비보에서 닭 배아 CAM 분석을 이용하여 상기 마타이레시놀의 항-혈관신생 활성을 측정하였다. 정상적으로 발달된 CAM은 모세혈관의 광범위한 네트워크를 형성하는 반면, 마타이레시놀-처리 CAM은 어떠한 혈전증 또는 출혈 증상 없이 모세혈관 형성을 농도의존적으로 저해하였다(도 3c). 이러한 실험결과는 마타이레시놀이 인 비트로 및 인 비보 모두에서 세포 독성 효과 없이 혈관신생을 강력하게 억제함을 보여준다.

마타이레시놀은 HIF -1α 안정화, 그의 타겟 유전자 VEGF 를 저해하고, 인 비트로에서 종양 조건화 배지-유도 혈관신생을 억제한다

HIF-1α는 VEGF, 혈소판-유도 성장인자 BB(platelet-derived growth factor BB) 및 엔지오포에틴 2(angiopoietin 2)을 포함하는 혈관신생 인자의 발현을 조절함으로써 종양 혈관신생에서 주도적 역할을 한다[15, 16]. 더욱이, 증가된 mROS 생성은 저산소 상태 기간 동안 HIF-1α 안정화를 촉발한다[17]. 따라서, 저산소 조건에서 HIF-1α 발현 레벨에 대한 마타이레시놀의 효과를 조사하였다. 마타이레시놀은 세포골격(튜불린) 또는 세포 주기(사이클린 D1) 단백질의 합성에 영향을 미침이 없이 처리량-의존적으로 HIF-1α 단백질의 저산소-유발 축적을 감소시켰다(도 4a). mROS 발생을 차단하고 HIF-1α 발현을 약화시키는 것으로 알려진 테르페스타신(terpestacin)을 양성 대조군으로 사용하였다[10]. 마타이레시놀 처리는 감소된 HIF-1α 발현의 다운스트림인, HIF-1α 타겟 유전자 VEGF의 저산소-유도 발현을 처리량-의존 방식으로 억제하였다(도 4b). 더욱이, 마타이레시놀은 종양 조건화 배지-유도 침투(도 4c) 및 HUVEC 관 형성(도 4d)을 처리량-의존 방식으로 억제하였다. 이러한 실험결과는 마타이레시놀이 어떠한 세포 독성 효과 없이, 혈관신생 인자인 HIF-1α 억제를 통해 종양 조건화 배지-유도 혈관신생을 강력하게 저해한다는 것을 보여준다.

본 발명의 결과는 마타이레시놀이 저산소-유발 mROS 발생을 저해하고 인 비트로 및 인 비보 모두에서 항-혈관신생 활성을 보임을 명확하게 설명한다. 마타이레시놀은 HUVECs에서, HIF-1α 및 이의 대상 유전자인 VEGF의 발현 레벨을 처리량-의존적으로 저해하였다. 또한, 마타이레시놀은 처리량-의존 방법으로 종양 조건화 배지-유도 침투 및 HUVEC 관 형성을 저해하였다. 이를 종합해볼 때, 이러한 결과는 상기 화합물이 고유 활성 모드(mode)를 갖는 항-혈관신생 제제의 개발을 위한 기반을 제공할 수 있음을 제시한다. HUVEC 성장 억제에 필요한 양보다 낮은 처리량으로 마타이레시놀이 저산소-유도 혈관신생 및 VEGF-유도 혈관신생을 효과적으로 저해하는 점을 주목할 만하고, 이로부터 상기 화합물이 mROS 발생 저해를 통한 혈관신생 시그널링 경로를 특이적으로 억제시킬 수 있음을 추론할 수 있다. 향후 화합물의 타겟 단백질 동정, 검증 및 이의 미토콘드리아에서의 효과에 대한 추가적인 연구는 상기 화합물의 흥미로운 생물학적 활성을 명료하게 할 것이다. 결론적으로 마타이레시놀은 mROS-매개 시그널을 타겟으로 하는 신규한 항-혈관신생 치료법 개발의 기반을 제공할 수 있는 신규한 혈관신생 억제제이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고 문헌

[1] E.J. Battegay, Angiogenesis: mechanistic insights, neovascular diseases, and therapeutic prospects, J Mol Med (Berl) 73 (1995) 333-346.

[2] R.B. Hamanaka, N.S. Chandel, Mitochondrial reactive oxygen species regulate hypoxic signaling, Curr Opin Cell Biol 21 (2009) 894-899.

[3] E.K. Rowinsky, Clinical pharmacology of Taxol, J Natl Cancer Inst Monogr (1993) 25-37.

[4] M.W. Saville, J. Lietzau, J.M. Pluda, I. Feuerstein, J. Odom, W.H. Wilson, R.W. Humphrey, E. Feigal, S.M. Steinberg, S. Broder, et al., Treatment of HIV-associated Kaposi's sarcoma with paclitaxel, Lancet 346 (1995) 26-28.

[5] E.A. Perez, Paclitaxel in Breast Cancer, Oncologist 3 (1998) 373-389.

[6] H. Adlercreutz, Phyto-oestrogens and cancer, Lancet Oncol 3 (2002) 364-373.

[7] A.K. Tiwari, P.V. Srinivas, S.P. Kumar, J.M. Rao, Free radical scavenging active components from Cedrus deodara, J Agric Food Chem 49 (2001) 4642-4645.

[8] N.H. Kim, N.B. Pham, R.J. Quinn, H.J. Kwon, R-(-)-beta-O-methylsynephrine, a natural product, inhibits VEGF-induced angiogenesis in vitro and in vivo, Biochem Biophys Res Commun 399 (2010) 20-23.

[9] K.H. Kim, J.Y. Park, H.J. Jung, H.J. Kwon, Identification and biological activities of a new antiangiogenic small molecule that suppresses mitochondrial reactive oxygen species, Biochem Biophys Res Commun 404 (2011) 541-545.

[10] H.J. Jung, J.S. Shim, J. Lee, Y.M. Song, K.C. Park, S.H. Choi, N.D. Kim, J.H. Yoon, P.T. Mungai, P.T. Schumacker, H.J. Kwon, Terpestacin inhibits tumor angiogenesis by targeting UQCRB of mitochondrial complex III and suppressing hypoxia-induced reactive oxygen species production and cellular oxygen sensing, J Biol Chem 285 (2010) 11584-11595.

[11] Y. Kim, H.J. Jung, H.J. Kwon, A natural small molecule voacangine inhibits angiogenesis both in vitro and in vivo, Biochem Biophys Res Commun 417 (2012) 330-334.

[12] A. Albini, Y. Iwamoto, H.K. Kleinman, G.R. Martin, S.A. Aaronson, J.M. Kozlowski, R.N. McEwan, A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells, Cancer Res 47 (1987) 3239-3245.

[13] J.S. Shim, J.H. Kim, H.Y. Cho, Y.N. Yum, S.H. Kim, H.J. Park, B.S. Shim, S.H. Choi, H.J. Kwon, Irreversible inhibition of CD13/aminopeptidase N by the antiangiogenic agent curcumin, Chem Biol 10 (2003) 695-704.

[14] H.J. Jung, J.H. Kim, J.S. Shim, H.J. Kwon, A novel Ca2+/calmodulin antagonist HBC inhibits angiogenesis and down-regulates hypoxia-inducible factor, J Biol Chem 285 (2010) 25867-25874.

[15] P. Carmeliet, R.K. Jain, Angiogenesis in cancer and other diseases, Nature 407 (2000) 249-257.

[16] M.C. Brahimi-Horn, J. Chiche, J. Pouyssegur, Hypoxia and cancer, J Mol Med 85 (2007) 1301-1307.

[17] R.D. Guzy, B. Hoyos, E. Robin, H. Chen, L. Liu, K.D. Mansfield, M.C. Simon, U. Hammerling, P.T. Schumacker, Mitochondrial complex III is required for hypoxia-induced ROS production and cellular oxygen sensing, Cell Metab 1 (2005) 401-408.

Claims

하기의 화학식 2로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물로서, 상기 약제학적 조성물은 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증 또는 신경퇴행성 질환의 비조절성 혈관신생-관련 질병 또는 질환의 예방 또는 치료에 이용되는 것인 혈관신생 억제용 조성물:
화학식 2
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제 1 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 혈관내피세포의 증식, VEGF(Vascular endothelial growth factor)-유도 관 형성 및 혈관내피세포의 침투를 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.