WO2012069679A1 - Compuestos marinos antagonistas de los canales de calcio para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares - Google Patents

Compuestos marinos antagonistas de los canales de calcio para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares Download PDF

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Julio DELGADO MARTÍN
Pedro Noheda Marín
Ricardo PÉREZ AFONSO
Mª Luz CANDENAS DE LUJÁN
Francisco Mª PINTO PÉREZ
Mª Luisa JIMENO HERRANZ
Diego Fort Aguerrondo
Natalia PÉREZ HERNÁNDEZ
Daniel Blanco Ania
David Herrero Ruiz
Manuel David Gallardo Castro
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
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    • A61K31/527—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim spiro-condensed
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    • C07D491/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains four or more hetero rings

Definitions

  • the present invention relates to a mixture of crambescidins with a potent antagonistic effect on calcium channels. Furthermore, the present invention relates to a method of extracting an extract of said crambescidines and to the use thereof for the preparation of a medicament as an antagonist of calcium channels.
  • Calcium channel antagonists are medications used in the treatment of cardiovascular diseases such as angina, arrhythmias (irregular rhythms) and hypertension. Calcium is necessary for the contraction of smooth muscle, skeletal and cardiac muscle cells. In the case of the heart muscle, the contraction is caused by the alteration of the movement of calcium through the channels in the heart cells. Calcium channel antagonists help suppress heart rhythm irregularities.
  • Calcium is also important for blood vessels, helping control blood pressure. Calcium channel antagonists cause the relaxation of arterial smooth muscles, being used in the treatment of hypertension. Verapamil, nifedipine and diltiazem are antagonists of calcium channels with similar, but not identical, sites of action. Since the heart muscle depends on the entry of calcium into its cells to function properly, calcium channel antagonists can affect the normal functioning of the heart. Dangerous side effects include suppression of cardiac function, leading to congestive heart failure, low heart rates and decreased blood pressure. Due to the above, it is necessary to be able to obtain new compounds that exert an antagonistic role on calcium channels and that have no negative effects on the functioning of the heart.
  • VDCC modulating calcium channels
  • crambescidins some natural products that are postulated as calcium channel antagonists are crambescidins, mainly from the Crambe crambe sponge.
  • the crambescidin 800 known for its protective effect against oxidative stress in neuronal cells (J. Nat. Med. 2007, 61 (3), 288-295), as an antimylaric agent (J. Antibiot 2006, 59 (9), 583-590) or, like crambescidin 816, as a modulator of calcium channels (J. Nat. Prod. 1993, 56 (7), 1007-1015).
  • the present invention relates to a mixture of crambescidins 800 and 816 in a defined proportion, which shows a surprising effect on the activity that any of them would show separately in the treatment of cardiovascular diseases.
  • the present invention describes an efficient and novel method of isolating crambescidins 800 and 816 as a mixture.
  • the potent effect as an antagonist of the calcium channels shown by this mixture of crambescidins in a defined proportion for the treatment of cardiovascular diseases is demonstrated.
  • a first aspect of the present invention relates to a mixture of crambescidines 800 and 816:
  • a second aspect of the present invention relates to a pharmaceutical or veterinary composition, comprising the mixture of crambescidins 800 and 816 in a 1: 3 ratio, together with one or more pharmaceutical excipients or veterinarily acceptable and at least one pharmaceutically or veterinarily acceptable carrier, adjuvant and / or vehicle.
  • the pharmaceutical or veterinary composition further comprises another active ingredient.
  • the pharmaceutical or veterinary composition is presented in a form adapted to parenteral, oral, sublingual, nasal, intratecal, bronchial, lymphatic, rectal, transdermal or inhaled administration.
  • a third aspect of the present invention relates to the use of the mixture of crambescidins 800 and 816 in a 1: 3 ratio or of the pharmaceutical or veterinary composition for the preparation of a medicament.
  • it refers to the use for the manufacture of a medicament as a calcium channel antagonist.
  • a preferred embodiment relates to the use for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of diseases of aneurysm, angina pectoris, atherosclerosis, cerebral stroke, cardiac arrhythmia, myocardial infarction, arterial hypertension, congestive heart failure or peripheral vascular disease , cluster headache, migraine, premature delivery, Raynaud's syndrome and tetanus.
  • the medication is presented in a form adapted to parenteral, oral, sublingual, nasal, intratecal, bronchial, lymphatic, rectal, transdermal or inhaled administration.
  • a fourth aspect of the present invention relates to a process for obtaining an extract comprising a mixture of crambescidins 800 and 816 comprising the following steps:
  • the extraction stage comprises at least one extraction stage with an organic solvent.
  • the organic solvent Preferably, 3 types of organic solvent extraction are carried out.
  • each type of extraction is carried out from 1 to 4 times.
  • one of the 3 types of extractions is carried out with acetone.
  • one of the 3 types of extractions is carried out with diethyl ether.
  • one of the 3 types of extractions is carried out with butanol.
  • 3 extractions are carried out.
  • the first extraction is carried out with acetone, the second with butanol and the third with diethyl ether.
  • the extract is suspended with Mili Q water.
  • the sponge is Crambe crambe.
  • the purification step comprises passing the extract obtained from the extraction stage, through at least 1 chromatographic column.
  • the extract from the extraction stage is passed through 3 chromatographic columns.
  • one of the chromatographic columns is of the Sephadex LH-20 type.
  • another of the chromatographic columns is of the XBridge RP 18 type.
  • another of the chromatographic columns is of the ⁇ -Bondapak type.
  • the first column is of the Sephadex LH-20 type
  • the second column through which the extract is passed is of the ⁇ -Bondapak type
  • the third column is of the XBridge RP 18 type.
  • all columns are eluted with at least methanol.
  • a fifth aspect of the present invention relates to the extract, mixture of the 800 and 816 crambescidins, obtainable by the above extraction procedure.
  • said extract comprises a mixture of 800 and 816 crambescidins in 1: 3 proportions.
  • said extract, mixture of crambescidins 800 and 816 in a 1: 3 ratio obtainable by the procedure described above for use as a medicine.
  • a sixth aspect of the present invention relates to a pharmaceutical or veterinary composition, comprising the extract of the mixture of crambescidins 800 and 816 in a 1: 3 ratio obtainable by the method described above, together with one or more pharmaceutical excipients or veterinarily acceptable and at least one pharmaceutically or veterinarily acceptable carrier, adjuvant and / or vehicle.
  • the pharmaceutical or veterinary composition further comprises another active ingredient.
  • the pharmaceutical or veterinary composition is presented in a form adapted to parenteral, oral, sublingual, nasal, intratecal, bronchial, lymphatic, rectal, transdermal or inhaled administration.
  • a seventh aspect of the present invention relates to the use of the extract, mixture of crambescidins 800 and 816 in a 1: 3 ratio obtainable by the procedure described above or the pharmaceutical or veterinary composition comprising it for the preparation of a medicament.
  • a preferred embodiment refers to the use for the manufacture of a medicament as a calcium channel antagonist.
  • Another preferred embodiment relates to the use for the manufacture of a medicament for the treatment or prevention of diseases of aneurysm, angina pectoris, atherosclerosis, cerebral stroke, cardiac arrhythmia, myocardial infarction, arterial hypertension, congestive heart failure or peripheral vascular disease , cluster headache, migraine, premature delivery, Raynaud's syndrome and tetanus.
  • the term "pharmaceutical or veterinary composition” refers to a set of components that is at least formed by the extract of the invention, which has at least one application in improving the physical or physiological or psychological well-being of a subject. , which implies an improvement of the general state of your health, for example a cosmetic application, although it may not imply a physiological effect on the organism but an improvement in the well-being of the subject related to his psychology. Therefore, said Pharmaceutical composition may be a personal hygiene product, a cosmetic product or a product that may form the basis for the preparation of the above products or the basis for the preparation of a medicament.
  • the "personal hygiene product” is defined as the substances or preparations that, without having the legal consideration of medicines, medical devices, cosmetics or biocides, are intended to be applied to the skin, teeth or mucous membranes of the human body for the purpose of hygiene or aesthetic, or to neutralize or eliminate ectoparasites.
  • the "cosmetic product” is defined as any substance or preparation intended to be put in contact with the various surface parts of the human body (epidermis, hair and hair system, nails, lips and external genital organs) or with teeth and oral mucous membranes , with the exclusive or main purpose of cleaning them, perfuming them, modifying their appearance, and / or correcting body odors, and / or protecting them or keeping them in good condition.
  • medicament has a more limited meaning than the meaning of "pharmaceutical composition”, as defined in the present invention, since the medicament necessarily implies a therapeutic effect, that is, a physiological effect on the subject's metabolism.
  • the medicament referred to in the present invention can be for human or veterinary use.
  • the "medicine for human use” is any substance or combination of substances that is presented as having properties for the treatment and / or prophylaxis of diseases in humans or that can be used in humans or administered to humans in order to restore , correct or modify physiological functions by exercising a pharmacological, immunological or metabolic action, or establishing a medical diagnosis.
  • the "veterinary medicinal product” is any substance or combination of substances that is presented as having properties curative and / or preventive with respect to animal diseases or that can be administered to the animal in order to restore, correct or modify its physiological functions by exercising a pharmacological, immunological or metabolic action, or establishing a veterinary diagnosis. "Premixtures for medicated feed” - prepared to be incorporated into a feed will also be considered "veterinary drugs”.
  • excipient refers to a substance that helps the absorption of the extract of the invention, stabilizes said extract or aids in the preparation of the medicine in the sense of giving it consistency or providing flavors that make it more pleasant.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together such as starches, sugars or cellulose, sweetening function, dye function, protection function of the drug such as for example to isolate it from air and / or moisture, function filling a tablet, capsule or any other form of presentation such as calcium phosphate dibasic, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • composition of the invention may further comprise a pharmacologically acceptable carrier.
  • vehicle must be pharmaceutically acceptable.
  • a “pharmaceutically acceptable carrier” refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical forms of administration and includes, but are not limited to, solids, liquids, solvents or surfactants.
  • the vehicle can be an inert substance or action analogous to any of the sequences of the present invention.
  • the function of the vehicle is to facilitate the incorporation of the extract of the invention as well as other compounds, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the pharmaceutical composition.
  • the presentation form is liquid, the vehicle is the diluent.
  • the vehicle Pharmacologically acceptable could be, but not limited to, a nanoparticle, a liposome, a micelle or a microemulsion.
  • the two reactions are typically carried out in solution.
  • the salt can precipitate in solution and can be collected by filtration or solutions of the compound of the invention and the desired acid or base can be recovered, as appropriate.
  • the salt can be precipitated from a solution and collected by filtration or can be recovered by evaporation of the solvent.
  • the degree of ionization in the salt can vary between completely ionized to almost non-ionized.
  • Pharmaceutically acceptable salt by the addition of acids refers to those salts that retain the biological effectiveness and properties of free bases, which are not undesirable neither biologically nor otherwise, and which are formed with inorganic acids such as, but not limited to , hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid and the like, and organic acids such as, but not limited to, acetic acid, 2,2-dichloroacetic acid, adipic acid, alginic acid, ascorbic acid, aspartic acid, benzenosulfonic acid, benzoic acid, 4-acetamidobenzoic acid, canfonic acid, camphor-10-sulfonic acid, capric acid, caproic acid, caprylic acid, carbonic acid, cinnamic acid, citric acid, cyclamic acid, dodecylsulfuric acid, ethane-1 acid, 2-disulfonic acid, ethanesulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid,
  • Pharmaceutically acceptable salt by addition of bases refers to those salts that retain the biological effectiveness and properties of free acids, which are not undesirable either biologically or otherwise. These salts are prepared from the addition of an inorganic base or an organic base to the free acid. Salts derived from inorganic bases include, but are not limited to, sodium, potassium, lithium, ammonium, calcium, magnesium, iron, zinc, copper, manganese, aluminum and the like.
  • Salts derived from organic bases include, but are not limited to, salts of primary, secondary and tertiary amines; Substituted amines including natural substituted amines, cyclic amines, substituted guanidines and basic ion exchange resins, such as ammonia, isopropylamine, trimethylamine, diethylamine, triethylamine, tripropylamine, diethanolamine, ethanolamine, deanol, 2-methylaminoethanol, 2-diethylaminoeminamine lysine, arginine, histidine, caffeine, procalna, hydrabamine, choline, betaine, benetamine, benzathine, ethylenediamine, glucosaline, methylglucamine, theobromine, triethanolamine, tromethamine, purines, piperazine, A / -ethylpiperidine, guanidine and similar resins.
  • Substituted amines including
  • Figure 1 Expression of calcium channels in rat uterus.
  • Figure 3 A and B Contractions induced by oxytocin and methacholine.
  • Figure 4 A and B Contractions induced by veratridine.
  • Example 1 Isolation procedure of an extract of the mixture of crambescidins 800 and 816 in a 1: 3 ratio.
  • a sample of Crambe crambe sponge was removed from its medium, and it was placed in a topaz glass bottle containing 750 mL of acetone in which it was macerated for 48 hours at a temperature of 7-8 e C. After that time filtered through glass plate and returned to maceration for another 48 hours with new acetone (750 mL). This maceration procedure was repeated four times. The acetone filtrates were taken to dryness each time. The solid residue of the extracted sponge was allowed to dry at room temperature (1 02 g).
  • the extracted from the sponge was suspended again in 250 mL of Mili Q water (18 Mohms), transferred to a separatory funnel and extracted with n-BuOH (3 x 250 mL). The water was then washed with Et 2 0 (2 250 mL). They met all organic extracts and were taken to dryness forming what constitutes the sponge extract (10.4 g) of a very strong red color.
  • the detection was done by thin layer chromatography developing with the n-BuOH / AcOH / H 2 O mixture (6: 1 .5: 2.5; v / v / v), using as immersion developer the TLC in phosphomolibedic acid solution (30 g) in ethanol (up to 1 L) and subsequent heating of TLC.
  • the fractions from the Sephadex LH20 column were then purified through a ⁇ -Bondapakde Waters column (7.8 ⁇ 300 mm, 10 ⁇ in particle diameter). It was eluted with 0.1 M MeOH / NaCl (9: 1, v / v), at a flow of 1.5 mL / min and UV detection at 230 nm (Waters PDA 996).
  • the fraction to be purified (184 mg) was dissolved in 1.5 mL of MeOH and injected 100 ⁇ each time. It began to be collected at 5 minutes and was done until minute 15, taking fractions every 30 seconds. The product eluted in fractions 8 and 9.
  • the product was then eluted through a Waters XBridge RP 18 column (10 x 250 mm, 5 ⁇ particle diameter). Elution was done with a gradient of 0.1 M MeOH / NaCl (60:40). The flow rate was 5 mL / min and the UV detection at 212 nm (Waters PDA 996). The gradient was 60:40 (0.1 M MeOH / NaCl) to 75:25 ( ⁇ 0.1 M MeOH / NaCl) in 45 minutes and then 60:40 (0.1 M MeOH / NaCl) for 15 minutes to stabilize the spine. The sample (100 mg) was dissolved in 2 mL of MeOH and injected 100 ⁇ each time. The product eluted from minute 26 to minute 35. At the end of the procedure described above, 57.5 mg of the mixture of crambescidins 800 and 816 were obtained in a 1: 3 ratio.
  • Example 2 Biological assays of activity of the mixture extract of crambescidins 800 v 816 in a 1: 3 ratio.
  • the extract of defined composition (mixture of 800 and 816 crambescidins in a 1: 3 ratio, respectively) has biological activity as a partial blocker / agonist of the voltage-dependent calcium channels in rat uterus.
  • Voltage-dependent Ca 2+ channels are proteins located in the cell membrane that play a key role in the regulation of a large number of cellular functions. These are very complex proteins, consisting of a very bulky subunit, called cci, and several auxiliary subunits called ⁇ 2 , ⁇ , ⁇ and ⁇ .
  • the subunit ai that constitutes the channel itself consists of four motifs, each with six transmembrane segments of alpha helices.
  • There is a great structural homology between the different voltage-dependent ion channels, such as Na ⁇ Ca 2+ and K + which speaks of their evolutionary origin, since they all seem to derive from a common ancestral gene that has undergone a series of duplications throughout evolution.
  • the structural diversity of the Ca 2+ channels derives fundamentally from the existence of different cc-i subunits.
  • 10 cc-i subunits are known, each of them encoded by a different gene.
  • the Ca v 1 subfamily consists of four members (Ca v 1 .1, Ca v 1 .2, Ca v 1 .3 and Ca v 1 .4) and includes those classically known as type L channels.
  • the subfamily Ca v 2 It is made up of three members (Ca v 2.1, Ca v 2.2 and Ca v 2.3) and includes those known classically as P / Q, N and R channels.
  • the subfamily Ca v 3 is made up of three members (Ca v 3.1, Ca v 3.2 and Ca v 3.3) and includes those known classically as T-type channels.
  • veratridine 60 ⁇
  • the first phase in which rhythmic contractions of irregular amplitude and frequency are observed and that extends over a period of 40-60 min from the addition of the agonist to the organ bath. In approximately 30% of the segments there is a complete remission of the response.
  • a second phase begins in which veratridine produces rhythmic contractions of increasing amplitude, maintaining a very regular contraction frequency throughout the entire experience.

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Abstract

La presente invención se refiere una mezcla de crambescidinas con un potente efecto antagonista sobre los canales de calcio. Además la presente invención se refiere a un procedimiento de extracción de un extracto de dichas crambescidinas y al uso del mismo para la elaboración de un medicamento como antagonista de los canales de calcio.

Description

COMPUESTOS MARINOS ANTAGONISTAS DE LOS CANALES DE CALCIO PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES.
La presente invención se refiere una mezcla de crambescidinas con un potente efecto antagonista sobre los canales de calcio. Además la presente invención se refiere a un procedimiento de extracción de un extracto de dichas crambescidinas y al uso del mismo para la elaboración de un medicamento como antagonista de los canales de calcio.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Los antagonistas de los canales de calcio son medicamentos usados en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares como angina, arritmias (ritmos irregulares) e hipertensión. El calcio es necesario para la contracción de las células del músculo liso, del músculo esquelético y del músculo cardiaco. En el caso del músculo cardiaco, la contracción se produce por la alteración del movimiento del calcio a través de los canales en las células cardiacas. Los antagonistas de los canales de calcio ayudan a suprimir irregularidades en el ritmo cardiaco.
El calcio es importante también para los vasos sanguíneos, ayudando al control de la presión arterial. Los antagonistas de los canales de calcio provocan la relajación de la musculatura lisa arterial, siendo usados en el tratamiento de la hipertensión. El verapamílo, el nifedipina y el diltiazem son antagonistas de los canales de calcio con similares, aunque no idénticos, sitios de acción. Como el músculo cardíaco depende de la entrada de calcio a sus células para funcionar adecuadamente, los antagonistas de los canales de calcio pueden afectar al funcionamiento normal del corazón. Efectos colaterales peligrosos incluyen supresión de la función cardiaca, llevando a insuficiencia cardiaca congestiva, frecuencias cardiacas bajas y disminución de la tensión arterial. Debido a io anterior, se hace necesario el poder obtener nuevos compuestos que ejerzan un papel antagonista sobre los canales de calcio y que no tengan efectos negativos sobre el funcionamiento del corazón.
Los océanos y los mares son una fuente de un extenso grupo de productos naturales con estructura única, que son principalmente acumulados en invertebrados como las esponjas y los moluscos (Burkhard et al. Drug. Dis. Today 2003, 8(2), 536-544). Varios de estos compuestos muestran una pronunciada actividad farmacológica y son candidatos interesantes para nuevos medicamentos en varias áreas de tratamiento (Newman et al. J. Nat. Prod. 2003, 66, 1022-1037). Las esponjas han provisto más productos naturales que cualquier otro organismo, debido en parte a su propensión a producir metabolítos bíoactívos (Faulkner et al. Nat. Prod. Rep. 2002, 19, 1 -48).
Por lo tanto, existe la necesidad de obtener nuevos compuestos capaces de modular los canales de calcio (VDCC), los cuales puedan ser útiles en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.
En este mismo sentido unos productos naturales que se postulan como antagonistas de los canales de calcio son las crambescidinas, procedentes principalmente de la esponja Crambe crambe. Dentro de este tipo de productos naturales está la crambescidína 800, conocida por su efecto protector frente al estrés oxidativo en células neuronales (J. Nat. Med. 2007, 61(3), 288-295), como agente antímaláríco (J. Antibiot. 2006, 59(9), 583-590) o al igual que la crambescidína 816, como modulador de los canales de calcio (J. Nat. Prod. 1993, 56(7), 1007-1015). Sin embargo la extracción de este tipo de productos naturales supone llevar a cabo procedimientos complicados, mediante los cuales no se llegan a obtener grandes rendimientos y en la mayoría de los casos el poder purificar el extracto de dicha esponja se hace complicado. La obtención de las crambescidinas 800 y 816 de fuentes naturales por extracción y purificación es un proceso arduo y largo debido a la complejidad estructural de estos alcaloides y a la mezcla de compuestos similares (p.ej. otras crambescidinas, crambescinas, crambidina y ptilomicalina A) que suelen presentar las esponjas y estrellas de mar que las contienen. Las principales características estructurales que presentan las crambescidinas 800 y 816 son grupos polares (un catión guanidinio, alcoholes y aminas) y, a la vez, una cadena hidrocarbonada apolar larga.
En la actualidad existen procedimientos para el aislamiento y purificación de estos compuestos naturales por separado, como es el caso de US5756734 o US5952332, en los cuales se exponen procedimientos para la obtención de las crambescidinas, ya sean las 800, 816 o por ejemplo la 830, por separado pero nunca como una mezcla de la 800 y 816 con composición definida.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
A tenor de todo lo anteriormente expuesto, la presente invención se refiere a una mezcla de las crambescidinas 800 y 816 en una proporción definida, que muestra un efecto sorprendente frente a la actividad que mostrarían cualquiera de ellas por separado en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.
Además la presente invención describe un método eficaz y novedoso de aislamiento de las crambescidinas 800 y 816 como una mezcla. Finalmente se demuestra el potente efecto como antagonista de los canales de calcio que muestra esta mezcla de crambescidinas en proporción definida, para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.
Por lo tanto un primer aspecto de la presente invención se refiere a una mezcla de las crambescidinas 800 y 816:
Figure imgf000005_0001
Crambescidina 800
Figure imgf000005_0002
Crambescidina 816 en proporción 1 :3.
Según otra realización preferida, dicha mezcla de crambescidinas 800 y 816 en proporción 1 :3 para su uso como medicamento.
Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica o veterinaria, que comprende la mezcla de crambescidinas 800 y 816 en proporción 1 :3, junto con uno o más excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables y al menos un transportador farmacéutica o veterinariamente aceptable, adyuvante y/o vehículo.
De manera preferida, la composición farmacéutica o veterinaria además comprende otro principio activo.
Según otra realización preferida, la composición farmacéutica o veterinaria se presenta en una forma adaptada a la administración parenteral, oral, sublingual, nasal, íntratecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada.
Un tercer aspecto de la presente invención se refiere al uso de la mezcla de crambescidinas 800 y 816 en proporción 1 :3 o de la composición farmacéutica o veterinaria para la elaboración de un medicamento.
Según una realización preferida, se refiere al uso para la fabricación de un medicamento como antagonista de los canales de calcio.
Una realización preferida se refiere al uso para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades de la aneurisma, angina de pecho, ateroesclerosis, ictus cerebral, arritmia cardiaca, infarto de miocardio, hipertensión arterial, insuficiencia cardiaca congestiva o enfermedad vascular periférica, cefalea en racimos, migraña, parto prematuro, síndrome de Raynaud y el tétano.
Además también de manera preferida, el medicamento se presenta en una forma adaptada a la administración parenteral, oral, sublingual, nasal, íntratecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada.
Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de un extracto que comprende una mezcla de crambescidinas 800 y 816 que comprende las siguientes etapas:
a. extracción a partir de la una esponja; y b. purificación.
Según una realización preferida, la etapa de extracción comprende al menos una etapa de extracción con un disolvente orgánico. De manera preferida, se llevan a cabo 3 tipos de extracción con disolvente orgánico.
Según una realización preferida, cada tipo de extracción se lleva a cabo desde 1 a 4 veces.
Según otra realización preferida, uno de los 3 tipos de extracciones se lleva a cabo con acetona.
Según otra realización preferida, uno de los 3 tipos de extracciones se lleva a cabo con dietil éter.
Según otra realización preferida, uno de los 3 tipos de extracciones se lleva a cabo con butanol.
Según otra realización preferida, se llevan a cabo 3 extracciones. De manera preferida, la primera extracción se realiza con acetona, la segunda con butanol y la tercera con dietil éter.
Según otra realización preferida entre la extracción con acetona y la extracción con butanol se suspende el extracto con agua Mili Q.
Según otra realización preferida, la esponja es Crambe crambe.
Según una realización preferida, la etapa de purificación comprende hacer pasar el extracto obtenido de la etapa de extracción, por al menos 1 columna cromatográfica. De manera preferida se hace pasar al extracto procedente de la etapa de extracción por 3 columnas cromatográfícas. Según otra realización preferida, una de las columnas cromatográficas es de tipo Sephadex LH-20.
Según otra realización preferida, otra de las columnas cromatográficas es de tipo XBridge RP 18.
Según otra realización preferida, otra de las columnas cromatográficas es de tipo μ-Bondapak.
Según otra realización preferida, la primera columna es de tipo Sephadex LH- 20, la segunda columna por la que se hace pasar el extracto es de tipo μ- Bondapak y la tercera es de tipo XBridge RP 18.
Según otra realización preferida, en todas las columnas se eluye con al menos metanol.
Un quinto aspecto de la presente invención se refiere al extracto, mezcla de las crambescídínas 800 y 816, obtenible mediante el procedimiento de extracción anterior.
Según una realización preferida, dicho extracto comprende una mezcla de crambescídínas 800 y 816 en proporciones 1 :3.
Según otra realización preferida, dicho extracto, mezcla de crambescídínas 800 y 816 en proporción 1 :3 obtenible por el procedimiento anteriormente descrito para su uso como medicamento.
Un sexto aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica o veterinaria, que comprende el extracto de la mezcla de crambescídínas 800 y 816 en proporción 1 :3 obtenible por el procedimiento anteriormente descrito, junto con uno o más excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables y al menos un transportador farmacéutica o veterinariamente aceptable, adyuvante y/o vehículo.
De manera preferida, la composición farmacéutica o veterinaria además comprende otro principio activo.
Según otra realización preferida, la composición farmacéutica o veterinaria se presenta en una forma adaptada a la administración parenteral, oral, sublingual, nasal, íntratecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada.
Un séptimo aspecto de la presente invención se refiere al uso del extracto, mezcla de crambescidinas 800 y 816 en proporción 1 :3 obtenible por ei procedimiento descrito anteriormente o de la composición farmacéutica o veterinaria que lo comprende para la elaboración de un medicamento.
Una realización preferida se refiere al uso para la fabricación de un medicamento como antagonista de los canales de calcio.
Otra realización preferida se refiere al uso para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades de la aneurisma, angina de pecho, ateroesclerosis, ictus cerebral, arritmia cardiaca, infarto de miocardio, hipertensión arterial, insuficiencia cardiaca congestiva o enfermedad vascular periférica, cefalea en racimos, migraña, parto prematuro, síndrome de Raynaud y el tétano.
En la presente invención el término "composición farmacéutica o veterinaria" se refiere a un conjunto de componentes que está formada ai menos por el extracto de la invención, que tiene al menos una aplicación en la mejora del bienestar físico o fisiológico o psicológico de un sujeto, que implique una mejora del estado general de su salud, por ejemplo una aplicación cosmética, aunque puede no implicar un efecto fisiológico en el organismo sino una mejora en el bienestar del sujeto relacionada con su psicología. Por tanto, dicha composición farmacéutica puede ser un producto de higiene personal, un producto cosmético o un producto que puede constituir la base para la elaboración de los productos anteriores o la base para la elaboración de un medicamento.
El "producto de higiene personal" se define como las sustancias o preparados que, sin tener la consideración legal de medicamentos, productos sanitarios, cosméticos o biocidas, están destinados a ser aplicados sobre la piel, dientes o mucosas del cuerpo humano con finalidad de higiene o de estética, o para neutralizar o eliminar ectoparásitos.
El "producto cosmético" se define como toda sustancia o preparado destinado a ser puesto en contacto con las diversas partes superficiales del cuerpo humano (epidermis, sistema piloso y capilar, uñas, labios y órganos genitales externos) o con los dientes y las mucosas bucales, con el fin exclusivo o principal de limpiarlos, perfumarlos, modificar su aspecto, y/o corregir los olores corporales, y/o protegerlos o mantenerlos en buen estado.
El término "medicamento" tiene un significado más limitado que el significado de "composición farmacéutica", tal como se define en la presente invención, ya que el medicamento implica necesariamente un efecto terapéutico es decir, un efecto fisiológico en el metabolismo del sujeto.
El medicamento al que se refiere la presente invención puede ser de uso humano o veterinario. El "medicamento de uso humano" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades en seres humanos o que puedan usarse en seres humanos o administrarse a seres humanos con el fin de restaurar, corregir o modificar las funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico médico. El "medicamento de uso veterinario" es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas y/o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse al animal con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico veterinario. También se considerarán "medicamentos veterinarios" las "premezclas para piensos medicamentosos" -elaboradas para ser incorporadas a un pienso.
El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción del extracto de la invención, estabiliza dicho extracto o ayuda a la preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que lo hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásíco, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
La composición de la invención puede comprender además un vehículo farmacológicamente aceptable. Además, el vehículo debe ser farmacéuticamente aceptable. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. El vehículo puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de las secuencias de la presente invención. La función del vehículo es facilitar la incorporación del extracto de la invención así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente. El vehículo farmacológicamente aceptable podría ser, pero sin limitarse, una nanopartícula, un liposoma, una micela o una microemulsión.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención se puede preparar mediante uno o más de estos procedimientos:
(i) hacer reaccionar el compuesto de la invención con el ácido deseado
(íi) convertir una sal del compuesto de la invención en otro, mediante reacción con un ácido apropiado o mediante una columna de intercambio iónico adecuada.
Las dos reacciones se llevan a cabo típicamente en solución. La sal puede precipitar en solución y se puede recoger mediante filtración o se puede recuperar soluciones del compuesto de la invención y el ácido o base deseado, según sea apropiado. La sal puede precipitar de una solución y recogerse mediante filtración o se puede recuperar mediante evaporación del disolvente. El grado de ionización en la sal puede variar entre completamente ionizado a casi no ionizado.
Sal farmacéuticamente aceptable por adición de ácidos, se refiere a aquellas sales que retienen la efectividad biológica y las propiedades de las bases libres, que no son indeseables ni biológicamente ni de otra manera, y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, pero sin limitación, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, acido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como, pero sin limitación, ácido acético, ácido 2,2- dicloroacético, ácido adípico, ácido algínico, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido benzenosulfónico, ácido benzoico, ácido 4-acetamidobenzoico, ácido canfónico, ácido alcanfor-10-sulfónico,ácído cáprico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido carbónico, ácido cinámico, ácido cítrico, ácido ciclámico, ácido dodecilsulfúrico, ácido etano-1 ,2-disulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2- hidroxietanosulfónico, ácido fumárico, ácidogalactárico, ácido gentísico, ácido glucoheptónico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido glutámico, ácido 2- oxoglutárico, ácido glicerofosfórico, ácido glicólico, ácido hipúrico, ácido isobutírico, ácido láctico, ácido lactobiónico, ácido láurico, ácido maleico, ácido oleico, ácido cerótico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamoico, ácido propiónico, ácido piroglutámico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido 4- aminosalicílico, ácido sebácico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido tiociánico, ácido p-toluenosulfónico, ácido trifluoroacético, ácido undecilénico, y similares.
Sal farmacéuticamente aceptable por adición de bases se refiere a aquellas sales que retienen la efectividad biológica y las propiedades de los ácidos libres, que no son indeseables ni biológicamente ni de otra manera. Estas sales se preparan a partir de la adición de una base inorgánica o de una base orgánica al ácido libre. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen, pero sin limitación, sales de sodio, de potasio, de litio, de amonio, de calcio, de magnesio, de hierro, de zinc, de cobre, de manganeso, de aluminio y similares. Las sales derivadas de bases orgánicas incluyen, pero sin limitación, sales de aminas primarias, secundarías y terciarias; aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas naturales, aminas cíclicas, guanidinas sustituidas y resinas básicas de intercambio iónico, tales como amoníaco, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, dietanolamina, etanolamina, deanol, 2-metilaminoetanol, 2-dietílaminoetanol, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procalna, hidrabamina, colina, betaína, benetamina, benzatina, etílendíamina, glucosalina, metilglucamina, teobromina, trietanolamina, trometamina, purinas, piperazina, A/-etilpiperidina, guanidina, resinas de poliamina y similares.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Expresión de canales de calcio en útero de rata.
Figura 2 A y B Contracciones inducidas por KCI.
Figura 3 A y B Contracciones inducidas por oxitocína y metacolina.
Figura 4 A y B.Contracciones inducidas por veratridina.
Figura 5.Efectos inducidos por la mezcla de crambescidinas 800 y 81 6 sobre las contracciones fásicas espontáneas del miometrio.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 : Procedimiento de aislamiento de un extracto de ia mezcla de crambescidinas 800 y 816 en proporción 1 :3.
Se sacó una muestra de esponja Crambe crambe de su medio, y se introdujo en una botella de cristal color topacio que contenía 750 mL de acetona en la cual se maceró durante 48 horas a temperatura de 7-8 eC. Después de ese tiempo se filtró a través de placa de vidrio y se volvió a poner en maceración durante otras 48 horas con nueva acetona (750 mL). Este procedimiento de macerado se repitió cuatro veces. Los filtrados de acetona se fueron llevando a sequedad cada vez. El resto sólido de la esponja extraída se dejó secar a temperatura ambiente (1 02 g).
Lo extraído de la esponja se suspendió de nuevo en 250 mL de agua Mili Q (18 Mohms), se transfirió a un embudo de decantación y se extrajo con n-BuOH (3 x250 mL). A continuación se lavó el agua con Et20 (2 250 mL). Se reunieron todos los extractos orgánicos y se los llevó a sequedad conformando lo que constituye el extracto de la esponja (10,4 g) de un color rojo muy fuerte.
A continuación se realizó una cromatografía en columna Sephadex LH-20 al extracto eluyendo con MeOH. Para ello se utilizó una columna de dicha gel de las siguientes características: Longitud: 66 cm; diámetro interno 3,6 cm; volumen de muestra (en MeOH): 20 mL; volumen muerto: 275 mL; volumen de fracción 20 mL; flujo: 3 mL/min. En estas condiciones el producto deseado eluyó en las fracciones 2 a 14, con un fíF de 0.46. La detección se hizo por cromatografía en capa fina desarrollando con la mezcla n-BuOH/AcOH/H2O (6:1 .5:2.5; v/v/v), utilizando como revelador inmersión de la TLC en solución de ácido fosfomolíbdico (30 g) en etanol (hasta 1 L) y posterior calentamiento de la TLC.
A continuación se purificaron las fracciones provenientes de la columna Sephadex LH20 a través de una columna μ-Bondapakde Waters (7,8 χ 300 mm, 10 μιη de diámetro de partícula). Se eluyó con MeOH/NaCI 0.1 M (9:1 , v/v), a un flujo de 1 .5 mL/mín y detección por UV a 230 nm (PDA 996 de Waters). La fracción a purificar (184 mg) se disolvió en 1 ,5 mL de MeOH y se inyectaron 100 μΐ cada vez. Se empezó a recolectar a los 5 minutos y se hizo hasta el minuto 15, tomando fracciones cada 30 segundos. El producto eluyó en las fracciones 8 y 9.
A continuación se eluyó el producto a través de una columna Waters XBridge RP 18 (10 x 250 mm, 5 μιτι de diámetro de partícula). La elución se hizo con gradiente de MeOH/NaCI 0.1 M (60:40). El flujo fue de 5 mL/min y la detección por UV a 212 nm (PDA 996 de Waters). El gradiente fue de 60:40 (MeOH/NaCI 0.1 M) hasta 75:25 (<MeOH/NaCI 0.1 M) en 45 minutos y luego de 60:40 (MeOH/NaCI 0.1 M) durante 15 minutos para estabilizar la columna. La muestra (100 mg) se disolvió en 2 mL de MeOH y se inyectaron 100 μί cada vez. El producto eluyó del minuto 26 al minuto 35. Al final de procedimiento anteriormente descrito se obtuvieron 57,5 mg de la mezcla de crambescidínas 800 y 816 en proporción 1 :3.
Ejemplo 2: Ensayos biológicos de actividad dei extracto mezcla de crambescidinas 800 v 816 en proporción 1 :3.
ACTIVIDAD
El extracto de composición definida (mezcla de crambescidinas 800 y 816 en proporción 1 :3, respectivamente) posee actividad biológica como bloqueador/agonista parcial de los canales de calcio dependientes del voltaje en útero de rata.
Estudios de expresión génica
El análisis de la expresión de los canales de Ca2+ en el útero se ha llevado a cabo mediante técnicas de RT-PCR, estudiando la presencia de los ARNm que codifican los distintos tipos de canales de Ca2+ existentes. La metodología que se ha seguido ha sido la siguiente:
1 ) Extracción de ARN total a partir de la muestra.
2) Obtención de ADNc a partir del ARN total obtenido de las muestras, en una reacción con transcriptasa inversa.
3) Amplificación con los cebadores adecuados y mediante PCR de los ADNc procedentes de los ARNm de los distintos canales de sodio y de la β- actina (cuyo ARNm en el útero se mantiene en una tasa prácticamente constante).
4) Separación de los productos de amplificación mediante electroforesis en geles de agarosa y tinción con bromuro de etidío para su visualización a la luz UV.
5) Identificación de los fragmentos amplificados mediante la determinación de la secuencia del fragmento amplificado. Estudios funcionales
Para el estudio de la actividad farmacológica de la mezcla de crambescidinas 800 y 816 se analizaron sus efectos sobre la contractilidad del miometrio de rata. La elección de esta preparación farmacológica se basa en el hecho de ser uno de los únicos músculos lisos que posee canales de Ca2+, K+ y Na+ funcionalmente activos por lo que proporciona un modelo sencillo para el estudio de los efectos de la mezcla de crambescidinas 800 y 816 sobre canales dependientes de voltaje.
Empleamos ratas Wístar vírgenes con un peso comprendido entre 200 y 250 g. Todas las ratas utilizadas se encontraban de forma espontánea en la fase estro del ciclo hormonal. La determinación de la fase del ciclo ováríco se realizó mediante frotis vaginal. Se obtuvieron segmentos de músculo liso uterino longitudinal que se montaron en la copa de un baño de órganos conteniendo solución fisiológica de Krebs a una temperatura de 37 °C. Los segmentos uterinos, de aproximadamente 1 cm de longitud y 2-3 mm de anchura, se sometieron a una tensión inicial de 1 g y se fijaron a transductores ¡sométricos Grass FT-07, con el fin de detectar la contracción muscular y los cambios que se produzcan en la misma.
Para el estudio de la mezcla de crambescidinas800 y 816 se procedió a la adición de dosis acumulativas crecientes del compuesto (10 nM-0.3 mM) en preparaciones precontraídas por agonistas que actúan por distintos mecanismos:
1 ) KCI 40 mM, como modelo de contracción mediada primariamente por apertura de canales de Ca2+ dependientes de voltaje de tipo L. En segmentos uterinos montados en paralelo se analizaron los efectos de la nifedipina (inhibidor altamente selectivo de canales de Ca2+ dependientes de voltaje de tipo L, que son los predominantes en el músculo liso uterino) o su solvente. 2) veratridina 60 μΜ, con el fin de estudiar su posible efecto sobre los canales de Na+ dependientes de voltaje. En segmentos uterinos montados en paralelo se analizaron los efectos de la tetrodotoxina (inhibidor altamente selectivo de canales de Na+) o su solvente.
3) Contracciones inducidas por oxitocina (1 nM) y metacolina (10 μΜ). La oxitocina y la metacolina inducen contracciones a través de la activación de receptores específicos de membrana ligados a proteína G.
4) Contracciones espontáneas. En una solución fisiológica con Ca2+ 1.9 mM, el segmento aislado de útero de rata desarrolla una motilidad espontánea. Resultados previos de nuestro grupo han demostrado que estas contracciones son dependientes de la presencia de calcio extracelular e inhibidas de forma dependiente de la dosis por la nifedipina, lo que demuestra su dependencia de la entrada de Ca2+ en el citoplasma celular a través de canales dependientes de voltaje.
En cada preparación uterina se ha estudiado un único compuesto y la primera dosis se adicionó al baño 30 min después de la adición del agonista (en el caso de la oxitocina y la metacolina), 90 min después de la adición del agonista (en el caso de la veratridina) o tras la obtención de una meseta estable de contracción (en el caso del KCI). En todos los casos se realizaron experiencias control en segmentos uterinos montados en paralelo en las que se estudiaron a) los efectos del solvente de la mezcla de crambescidinas 800 y 816, adicionado a la preparación a los mismos tiempos que el compuesto y b) la respuesta del agonista a los mismos tiempos, sin adición de producto ni solvente. Igualmente, se han realizado controles inicíales y finales de KCI (40 mM) y metacolina (MCh, 10 μΜ) con el fin de identificar la existencia de posibles efectos inespecíficos conducentes a un bloqueo general de la contractilidad del segmento uterino.
Resultados
Los canales de Ca2+ dependientes de voltaje son proteínas localizadas en la membrana celular que juegan un papel primordial en la regulación de un gran número de funciones celulares. Se trata de proteínas muy complejas, constituidas por una subunidad muy voluminosa, denominada cci , y varias subunídades auxiliares denominadas α2, β, γ y δ. La subunidad ai que constituye el canal propiamente dicho, está constituida por cuatro motivos, cada uno de ellos con seis segmentos transmembrana de hélices en alfa. Existe una gran homología estructural entre los distintos canales iónicos dependientes de voltaje, como los de Na\ Ca2+ y K+, lo que habla de su origen evolutivo, ya que todos parecen derivar de un gen ancestral común que ha sufrido una serie de duplicaciones a lo largo de la evolución.
La diversidad estructural de los canales de Ca2+ deriva fundamentalmente de la existencia de distintas subunídades cc-i . Actualmente se conocen 10 subunídades cc-i , cada una de ellas codificada por un gen diferente. Recientemente se ha establecido una nomenclatura para estos canales que establece la existencia de tres subfamilias (Tabla 1 ). La subfamilia Cav1 está constituida por cuatro miembros (Cav1 .1 , Cav1 .2, Cav1 .3 y Cav1 .4) e incluye los conocidos clásicamente como canales tipo L. La subfamilia Cav2 está constituida por tres miembros (Cav2.1 , Cav2.2 y Cav2.3) e incluye los conocidos clásicamente como canales tipo P/Q, N y R. La subfamilia Cav3 está constituida por tres miembros (Cav3.1 , Cav3.2 y Cav3.3) e incluye los conocidos clásicamente como canales tipo T.
Nombre Nombre del Nombre del
Nombre Nombre del
IUPHAR del gen gen de clásico gen de rata
receptor humano ratón
L Cav1 .1 CACNA 1S Cacna ls Cacna ls
L Cav1 .2 CACNA 1C Cacna lc Cacna lc
L Cav1 .3 CACNA 1D Cacna ld Cacna ld
L Cav1 .4 CACNA 1F Cacnalf Cacnalf
P/Q Cav2.1 CACNA 1A Cacna 1a Cacna 1a
N Cav2.2 CACNA 1B Cacna 1b Cacna 1b R Cav2.3 CACNA 1E Cacnale Cacnale
T Cav3.1 CACNA1G Cacnalg Cacnalg
T Cav3.2 CACNA1H Cacnalh Cacnalh
T Cav3.3 CACNA1I Cacnali Cacnali
Tabla 1. Canales de calcio dependientes de voltaje.
Se ha realizado un estudio previo con el fin de analizar la expresión y función de los canales de Ca2+ en el útero de rata. La expresión de canales de Ca2+ en el útero se ha realizado mediante amplificación por PCR a partir del ADN copia (ADNc), utilizando cebadores específicos para cada uno de los canales descritos en rata. Los resultados obtenidos demuestran que en el útero de animales no preñados, en la fase estro del ciclo hormonal, se expresan los canales Cav1.1 , Cav2.1 y los tres canales de la subfamilia Cav3 (Figura 1 ). Entre ellos, cabe destacar la expresión del canal Cav1.1 , responsable de las corrientes de Ca + tipo L que se han demostrado como mayoritarias y de carácter esencial en la regulación de la contracción uterina.
Paralelamente, se han realizado estudios de contractilidad sobre segmentos aislados de miometrio de rata no preñada, con el fin de estudiar la acción farmacológica de la mezcla de crambescidinas 800 y 816. La adición del compuesto sobre contracciones inducidas por KCI (que son debidas a la entrada de Ca2+ a través de canales de tipo L) produjo una relajación dependiente de la dosis, aunque se necesitaron concentraciones muy superiores a las indicadas por Berlink y col. (J. Nal Prod. 1993, 56, 1007- 1015) para la aparición de los efectos. En segmentos uterinos montados en paralelo, la nifedipina mostró una potencia y eficacia muy superior, con una IC50 del orden nanomolar (Figura 2).
La adición de la mezcla de crambescidinas 800 y 816 sobre contracciones inducidas por oxitocina (1 nM) o metacolina (10 μΜ) no indujo inhibición de las respuestas a estos agonistas. Por el contrario, a concentraciones iguales o superiores a 10 μΜ, la mezcla de crambescidinas 800 y 816 incrementó la contracción previa (Figura 3).
Se estudio a continuación los efectos de la mezcla de crambescidinas 800 y 816 sobre las respuestas a la veratridina. La adición de veratridina (60 μΜ) en segmento aislado de útero de rata induce una contracción en la que pueden diferenciarse claramente dos fases. La primera fase, en la que se observan contracciones rítmicas de amplitud y frecuencia irregular y que se extiende durante un periodo de 40-60 min desde la adición del agonista al baño de órganos. En aproximadamente un 30% de los segmentos se produce una remisión completa de la respuesta. Se inicia entonces una segunda fase en la que la veratridina produce contracciones rítmicas de amplitud creciente, manteniéndose una frecuencia de contracción muy regular a lo largo de toda la experiencia. Esta respuesta es totalmente inhibida por la tetrodotoxina, demostrando su dependencia de la apertura de canales de Na+ para permitir la entrada subsiguiente de Ca2+. Por el contrarío, la mezcla de crambescidinas 800 y 816 se mostró totalmente incapaz de inhibir la respuesta a la veratridina, lo que demuestra que no es capaz de interaccionar con canales de sodio. De forma similar a lo ocurrido con otros agonistas, la mezcla de crambescidinas 800 y 816 a concentraciones superiores a 1 μΜ, incrementó la contracción previa (Figura 4).
Se analizaron también los efectos inducidos por la mezcla de crambescidinas 800 y 816 sobre las contracciones fásicas espontáneas del miometrío (Figura 5). También en este caso, la mezcla de crambescidinas 800 y 816 indujo contracciones tónicas dependientes de la concentración. Estos resultados, en su conjunto, sugieren que la mezcla de crambescidinas 800 y 816 se comporta como un agonista parcial de canales de calcio dependientes de voltaje, necesitándose estudios más profundos para determinar de forma precisa su mecanismo de acción sobre estos canales.

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Un
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Crambescidína 800
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Crambescidina 816 en donde dichas crambescidinas están en proporción 1 :3.
2. La mezcla según la reivindicación 1 , para su uso como medicamento.
3. Una composición farmacéutica o veterinaria, que comprende la mezcla de crambescidinas 800 y 816 en proporción 1 :3 de la reivindicación 1 , junto con uno o más excipientes farmacéutica o veterínariamente aceptables y al menos un transportador farmacéutica o veterinariamente aceptable, adyuvante y/o vehículo.
4. La composición farmacéutica o veterinaria según la reivindicación 3, que además comprende otro principio activo.
5. La composición farmacéutica o veterinaria según cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, la cual se presenta en una forma adaptada a la administración parenteral, oral, sublingual, nasal, intratecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada.
6. Uso de la mezcla de crambescidinas 800 y 816 en proporción 1 :3 de la reivindicación 1 o de la composición farmacéutica o veterinaria de las reivindicaciones 3 a 6, para la elaboración de un medicamento.
7. El uso según la reivindicación 6, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de aneurismas, angina de pecho, ateroesclerosis, ictus cerebral, arritmia cardíaca, infarto de miocardio, hipertensión arterial, insuficiencia cardiaca congestiva o enfermedad vascular periférica, cefalea en racimos, migraña, parto prematuro, síndrome de Raynaud y el tétano.
8. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, para su administración parenteral, oral, sublingual, nasal, intratecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada.
9. Procedimiento de obtención de un extracto que comprende una mezcla de crambescidinas 800 y 816 que comprende las siguientes etapas:
a. extracción a partir de la una esponja; y
b. purificación.
10. El procedimiento según la reivindicación 9, donde la etapa de extracción comprende al menos una etapa de extracción con un disolvente orgánico.
1 1. El procedimiento según la reivindicación 10, donde se llevan a cabo 3 tipos de extracción con disolvente orgánico.
12. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 10 ó 11 , donde cada tipo de extracción se lleva a cabo desde 1 a 4 veces.
13. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, donde uno de los 3 tipos de extracciones se lleva a cabo con acetona.
14. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 1 ó 12, donde uno de los 3 tipos de extracciones se lleva a cabo con dietil éter.
15. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, donde uno de los 3 tipos de extracciones se lleva a cabo con butanol.
16. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, donde se llevan a cabo 3 extracciones.
17. El procedimiento según la reivindicación 16, donde la primera extracción se realiza con acetona, la segunda con butanol y la tercera con dietil éter.
18. El procedimiento según la reivindicación 17, donde entre la extracción con acetona y la extracción con butanol se suspende el extracto con agua Mili Q.
19. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 18, donde la esponja es Crambe crambe.
20. El procedimiento según la reivindicación 9, donde la etapa de purificación comprende hacer pasar el extracto obtenido de la etapa de extracción, por al menos 1 columna cromatográfica.
21. El procedimiento según la reivindicación 20, donde se hace pasar al extracto procedente de la etapa de extracción por 3 columnas cromatográficas.
22. El procedimiento según la reivindicación 21 , donde una de las columnas cromatográficas es de tipo Sephadex LH-20.
23. El procedimiento según la reivindicación 21 , donde una de las columnas cromatográficas es de tipo XBridge RP 8.
24. El procedimiento según la reivindicación 21 , donde una de las columnas cromatográficas es de tipo μ-Bondapak.
25. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, donde la primera columna es de tipo Sephadex LH-20, la segunda columna por la que se hace pasar el extracto es de tipo μ-Bondapak y la tercera es de tipo XBridge RP 18.
26. Un extracto, mezcla de las crambescidinas 800 y 816, obtenible mediante el procedimiento de las reivindicaciones 9 a 25.
27. El extracto según la reivindicación 26, donde la mezcla de crambescidinas 800 y 816 está en proporción 1 :3.
28. El extracto según cualquiera de las reivindicaciones 26 ó 27, para su uso como medicamento.
29. Una composición farmacéutica o veterinaria, que comprende el extracto según la reivindicación 26,junto con uno o más excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables y al menos un transportador farmacéutica o veterinariamente aceptable, adyuvante y/o vehículo.
30. La composición según la reivindicación 29, donde además comprende otro principio activo.
31. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 29 ó 30, donde se presenta en una forma adaptada a la administración parenteral, oral, sublingual, nasal, intratecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada.
32. Uso del extracto, mezcla de crambescidinas 800 y 816 en proporción 1 :3 obtenible por el procedimiento de las reivindicaciones 9 a 25 o de la composición farmacéutica o veterinaria para la elaboración de un medicamento.
33. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 31 ó 32, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de de la aneurisma, angina de pecho, ateroesclerosis, ictus cerebral, arritmia cardiaca, infarto de miocardio, hipertensión arterial, insuficiencia cardiaca congestiva o enfermedad vascular periférica, cefalea en racimos, migraña, parto prematuro, síndrome de Raynaud y el tétano.
34. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, para su administración parenteral, oral, sublingual, nasal, intratecal, bronquial, linfática, rectal, transdérmica o inhalada.
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