WO2012065322A1 - 一种青岛文昌鱼细胞系及其建立方法 - Google Patents
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Definitions
- the invention belongs to the field of cell biology, and particularly relates to a amphioxus cell line and a method for constructing the same. Background technique
- the marine model animal amphioxus the Latin literature named B. chisteroma belcher i, belongs to the original cord animal, which retains some of the characteristics of invertebrates and has the characteristics of vertebrates. It is between invertebrates and vertebrates. Transition type. Amphioxus has appeared 500 million years ago and is considered to be the representative of the existing vertebrate ancestors. It is known as the "living fossil”. Due to its unique evolutionary status, it is considered to be a typical model animal for studying animal evolution and embryonic development. It has a high academic position and is a hotspot of genetic, immunological, evolutionary, developmental and genomics research in recent years.
- Wenchang fish has strict and demanding habitats and ecological environment, and its distribution in the world is very narrow and the yield is very small. It is living in the sand, requiring high transparency of the seawater, clean water, water depth of 5-10 meters, the optimum salinity is 14-29 grams of salt per liter of seawater, and the pH is 8. 1-8. Amphioxus is mainly distributed in Xiamen, Qingdao and Yantai coastal areas in China.
- amphioxus In order to further deepen the study of amphioxus, the establishment of the amphioxus cell line is a crucial link. In the 1980s, people tried to cultivate amphioxus cells, but they were limited to primary culture, and cells could not be passaged. For example, in the article "Journal of Xiamen University (Natural Science Edition)", 2006, B05, pp. 181-183, "Study on primary culture of cultured in vitro cells of cultured fish", a method for primary culture of amphioxus cells is disclosed. There have been no reports of amphioxus cell lines at home and abroad, and the study of amphioxus gene function can only be carried out by cell lines of other species. The main reason is that amphioxus cells do not proliferate in vitro and rapidly enter the senescence stage, so they cannot be expanded and subcultured.
- Telomeres are a special structure consisting of a short fragment repeat of 6 kb tandem (TTAGGG) n and some binding proteins at the end of the cell chromosome.
- TTAGGG 6 kb tandem
- Telomeres Each cell division telomere loses 30-50 nucleotides.
- Telomerase avoids instability at the ends of chromosomes by maintaining and extending telomeres at the ends of the chromosomes.
- a key point is to maintain or extend the telomeres of the cell's chromosomes, allowing telomerase to re-express.
- telomerase catalytic subunit TERT plays a crucial role in maintaining telomerase activity.
- Choy-Pik Chiu's team introduced hTERT into human dermal fibroblasts, which can be passaged in vitro for a long time, while maintaining the biological properties of the parental cells, as well as contact inhibition.
- Carmela P. Morales et al. also introduced hTERT into human dermal fibroblasts. They found that fibroblasts with high expression of hTERT could perform 280 population doublings (PD), while parental cells had only 70-80 PD. These cells proliferate at substantially the same rate as the parental cells.
- Ataxia-telangiectasia Another example in the prior art is that patients with ataxia telangiectasia Ataxia-telangiectasia (A_T) are very sensitive to ionizing radiation. It is very difficult to culture cells of AT patients in vitro, relying on high concentrations of serum, and is prone to aging. Wood LD et al. introduced hTERT into fibroblasts from AT patients, effectively inhibiting cell senescence. Summary of the invention
- the object of the present invention is to provide a Qingdao amphioxus cell line and a method for establishing the same, which establish a good experimental platform for the study of amphioxus, which is beneficial to the further development of inheritance, immunity, evolution, development and genomics. Research.
- the invention adopts the primary cells of the genus Diptera of Qingdao Wenchang, and achieves the successful passage of the cells by transfection of the human telomerase catalytic subunit hTERT, and establishes the Qingdao amphioxus cell line.
- the primary cell is a lymphocyte.
- the invention provides a method for establishing a Qingdao amphioxus cell line, and the steps are as follows:
- the expression vector of the human telomerase catalytic subunit hTERT used in the above method for establishing the Qingdao amphioxus cell line is the retroviral vector pBABE.
- the present invention also provides a cell culture solution specially designed for the above-mentioned method for establishing a Qingdao amphioxus cell line, which is based on Leibovitz's L-15 (L15) culture medium and contains the following components: one or more Essential and non-essential amino acids, one or more vitamins, one or more salts, one or more trace elements, one or more buffers and sugars, one or more phenolic compounds
- the amino acids are alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine, Phenylalanine, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, proline and pheny
- the vitamins are biotin, choline chloride, folic acid, inositol inositol, thiamine phosphate, vitamin B6, calcium pantothenate, riboflavin, nicotinamide;
- the salts are calcium chloride, sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, sodium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate, sodium pyruvate;
- the saccharide is dextran galactose;
- the pH of the culture solution was 7. 2-7. 4; 10% (by volume) fetal calf serum was added to the culture solution before use.
- each component is: 380-420 mg/L for glycine, 400-480 mg/L for L-alanine, 800-1100 mg/L for L-left arginine, and 450 for L-asparaginic acid.
- -530 mg/L L-cysteine 200-260 mg/L, L-glutamine 570-620 mg/L, L-histidine 480-520 mg/L, L-isolated Acid is 480-520 mg/L, L-leucine is 220-270 mg/L, and L-lysine is 120-170 mg/L.
- L-methionine is 120-170 mg/L
- L-phenylalanine is 230-280 mg/L
- L-serine is 360-420 mg/L
- L-threonine is 550-610 mg/L
- L 5-2. 2 - Tryptophan is 36-43 mg / L
- L-tyrosine is 530-620 mg / L
- L-valine 160-220 mg / L
- choline chloride is 1. 7-2. 2
- the mg/L, D-calcium pantothenate is 1. 8-2. 3 mg / L
- folic acid is 1. 7-2.
- nicotinamide is 1. 6-2.
- vitamin B6 is The thiol phosphate is 1. 9-2.
- the optically active inositol is 3. 6 -4. 3 mg/L, calcium chloride 250-300 mg/L, magnesium chloride 170-198 mg/L, magnesium sulfate 180-200 mg/L, potassium chloride 770-810 mg/L, phosphoric acid Potassium dihydrogen is 110-130 mg/L, sodium chloride is 19500-20100 mg/L, sodium dihydrogen phosphate is 370-390 mg/L, dextran galactose is 1650-1900 mg/L, and phenol red is 18 -21 mg/L, sodium pyruvate is 1050-1120 mg/L.
- the invention provides a Qingdao amphioxus cell line by the above-mentioned establishing method and the special culture liquid thereof, and successfully solves the technical problem of subcultured amphioxus cells in vitro, and is beneficial to promoting genetics, immunity, evolution, development and genomics. In-depth research in other fields. DRAWINGS
- Figure 1 Primary culture of the amphibian tissue of amphioxus. After 12 hours, the cells released the tissue block.
- Figure 2 shows that after 5 days of transfection, the cells can reach a long antennae when they are attached.
- Figure 3 Third generation passage cells of the amphioxus cell line established using the present invention.
- Figure 4 Sixth generation passage cells of the amphioxus cell line established using the present invention.
- Figure 5 Eighth passage passage cells of the amphioxus cell line established using the present invention.
- Figure 6 Wright-Gimsa staining results. detailed description
- telomere catalytic subunit hTERT was transfected into the primary cells of the carp of Qingdao Wenchang fish. 293T cells with good growth status were selected 24 hours before transfection. After pancreatic digestion and passage, they were inoculated into 24 well cultures with 4 ⁇ 10 5 cells per well. After cell coverage reached 60%, they were used for transfection. Ordinary medium; the floating layer was collected on the 5th day, centrifuged at 2000 rpm/min for 20 minutes, and the supernatant was filtered with a filter of 0.55 ⁇ m; 1/4 volume of virus infection solution + 3/4 volume of amphioxus cell culture solution, After mixing, the primary cells are added.
- adherent cells After 5 days of hTERT transfection of adherent cells and suspension cells, the suspension cells began to split, and most of the cells gradually became semi-adherent, and a small number of cells adhered to the bottom of the cell culture dish.
- the morphology of the semi-adherent and adherent cells is essentially the same as that of the primary suspension cells. Observed under an inverted microscope, the cells are round in shape, and the nucleus is located in the center of the cell.
- adherent cells sometimes extend long antennae, but last for up to 2 days, after which the antennae gradually disappear and the cells return to their original state. As the number of passages increases, the size difference of cells gradually shrinks, but the phenomenon of cell size is still different.
- L-tyrosine 620 concentration (mg/L) L-proline 220 choline chloride 2.
- the culture medium is based on Leibovitz's L-15 (L15), and the other components are added to 0.8 liters of ultrapure water (resistivity 18.2 ⁇ ); the osmotic pressure is adjusted to 750-800 m0sm / kg; The pH is adjusted to 7. 0-7. 2; the total volume of the culture solution is adjusted to 1 liter with ultrapure water (resistivity 18.2 ⁇ ); fully mixed, filtered and sterilized, stored at 4 ° C, filtered and cultured. The pH of the liquid reached 7. 2-7. 4; 10% (by volume) fetal calf serum was added before use.
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Description
一种青岛文昌鱼细胞系及其建立方法
技术领域
本发明属于细胞生物学领域， 具体涉及一种文昌鱼细胞系及其建系的方法。 背景技术
海洋模式动物文昌鱼， 拉丁文学名为 B遺 chiostoma belcher i, 属于原索 动物， 既保留了无脊椎动物的一些特性， 又具有脊椎动物的特点， 是介于无脊 椎动物和脊椎动物之间的过渡类型。 文昌鱼早在 5 亿年前就已经出现， 被认为 是现存的脊椎动物始祖代表， 素有 "活化石"之称。 由于其独特的进化地位， 被认为是研究动物进化和胚胎发育的典型模式动物， 在学术上有很高的进化地 位， 是国内外近年来遗传、 免疫、 进化、 发育和基因组学研究的热点。 但文昌 鱼对栖息地生态环境的要求十分严格和苛刻， 在世界分布范围很窄， 产量很少。 它生活在沙质中， 要求海水透明度较高， 水质洁净， 水深在 5-10米， 最适盐度 为每升海水中含 14-29克盐，酸碱度在 8. 1-8. 2。文昌鱼在我国主要分布在厦门、 青岛和烟台沿海。
为进一歩深化文昌鱼的研究， 建立文昌鱼细胞系是至关重要的一个环节。 二十世纪八十年代就有人尝试培养文昌鱼细胞， 但只局限于原代培养， 细胞无 法传代。如《厦门大学学报（自然科学版）》 2006年 第 B05期第 181-183页《文 昌鱼离体细胞原代培养初歩研究》一文中就公开了一种原代培养文昌鱼细胞的 方法。 至今国内外也尚无文昌鱼细胞建系的报道， 研究文昌鱼基因功能只能通 过其他物种的细胞系来进行。 其主要原因是文昌鱼细胞在体外不增殖， 迅速进 入衰老期， 因而无法扩增和传代培养。
端粒为细胞染色体末端一种有 6kb串联的短片段重复序列（TTAGGG) n及一 些结合蛋白组成的特殊结构。 细胞在体外培养过程中进入复制性衰老与端粒有 关。 每次细胞分裂端粒丢失 30-50个核苷酸。 端粒酶通过维持和延伸细胞染色 体末端端粒， 避免了染色体末端的不稳定性。 目前认为细胞永生化过程中的一
个关键点是维持或延长细胞染色体的端粒， 使端粒酶重新表达。 端粒酶催化亚 单位 TERT在维持端粒酶的活性中起着致关重要的作用。 现有技术中的一个例子 是， Choy-Pik Chiu的研究小组将 hTERT导入人皮肤成纤维细胞， 此转染细胞可 以在体外持续传代， 而且保持亲本细胞的生物学特性， 同样有接触性抑制。 Carmela P. Morales等人同样将 hTERT导入人皮肤成纤维细胞， 他们发现高表 达 hTERT的成纤维细胞可以进行 280次 population doublings (PD)， 而亲本细 胞则只有 70-80 PD。 这些细胞的增殖速度与亲本细胞基本相同。 现有技术中的 另一个例子是， 共济失调毛细血管扩张 Ataxia-telangiectasia (A_T) 患者对 离子辐射十分敏感， 体外培养 A-T 患者的细胞十分困难， 依赖高浓度血清， 而 且很容易衰老。 Wood LD 等人将 hTERT导入 A-T患者的成纤维细胞， 有效地抑 制了细胞衰老。 发明内容
本发明的目的是提供一种青岛文昌鱼细胞系以及建立这种细胞系的方法， 为 文昌鱼的研究建立良好的实验平台， 以利于对遗传、 免疫、 进化、 发育和基因 组学的进一歩深入的研究。
本发明采用青岛文昌鱼腮部原代细胞， 通过用人端粒酶催化亚单位 hTERT的 cDNA转染来实现细胞的成功传代， 建立了青岛文昌鱼细胞系。 该原代细胞为淋 巴细胞。
本发明提供了一种建立青岛文昌鱼细胞系的方法， 歩骤如下：
1. 培养青岛文昌鱼腮部原代细胞： 将文昌鱼冰浴至昏迷， 7 0〜7 5 %酒 精消毒体表， 无菌解剖， 取文昌鱼腮部组织， 用含双抗的细胞培养液漂洗后， 剪切为细小组织块， 将其移至六孔细胞培养板， 涂布均匀， 2 5〜2 9 °C下恒 温静置培养使其贴壁， 每日观察细胞生长状态， 并补加 0. 5〜lm L细胞培养液。 3日后更换 1 / 2体积的细胞培养液；
2. 将人端粒酶催化亚单位 hTERT的 cDNA转染青岛文昌鱼腮部原代细胞： 转 染前 24小时选择生长状态良好的 293T细胞， 胰酶消化后传代后， 接种于 24孔
培养中， 每孔 4X105个细胞， 待细胞覆盖率达到 60 %后用于转染； 次日换普通培 养基。 第 5天收集漂浮层， 2000rpm/min离心 20分钟， 上清液用 0. 45 μ m的滤 膜过滤； 病毒感染液 1/4 体积 +文昌鱼细胞培养液 3/4体积， 混合后加入原代细 胞；
3. 获得存活细胞， 并进行传代培养： 转染 hTERT 的细胞开始增殖后， 细胞 数目增多， 细胞生长密度较大时， 用移液管轻轻吸打的方法传代悬浮细胞， 传 代稀释比例为 1 : 4; 以后每次传代视细胞生长状态， 3〜4日传代一次；
4. 进行细胞生物学鉴定， 验证细胞特征。
以上建立青岛文昌鱼细胞系的方法所用人端粒酶催化亚单位 hTERT 的表达 载体为逆转录病毒载体 pBABE。 本发明还提供了一种专用于上述建立青岛文昌鱼细胞系方法的细胞培养 液， 该培养液以 Leibovitz' s L-15 ( L15 ) 为基础培养液， 并含有以下组分： 一 种或多种必须氨基酸及非必须氨基酸、 一种或多种维生素、 一种或多种盐类、 一种或多种微量元素、 一种或多种缓冲液及糖类、 一种或多种酚类化合物； 所述氨基酸为丙氨酸、 精氨酸、 天冬酰胺、 天冬氨酸、 半胱氨酸、 谷氨酰 胺、 甘氨酸、 组氨酸、 异亮氨酸、 亮氨酸、 赖氨酸、 苯丙氨酸、 丝氨酸、 苏氨 酸、 色氨酸、 酪氨酸、 缬氨酸和苯基丙氨酸；
所述的维生素为生物素、 氯化胆碱、 叶酸、 无旋光肌醇、 硫胺磷酸酯、 维 生素 B6、 泛酸钙、 核黄素、 烟酰胺；
所述的盐类为氯化钙、 氯化钠、 氯化钾、 氯化镁、 磷酸二氢钠、 磷酸二氢 钾、 硫酸镁、 丙酮酸钠；
所述的糖类为右旋半乳糖；
所述培养液的 pH为 7. 2-7. 4； 使用前在所述培养液中加入 10% (体积比） 胎牛血清。
其中各组分含量： 甘氨酸为 380-420mg/L， L-丙氨酸为 400-480 mg/L, L- 左型精氨酸为 800-1100 mg/L , L-天冬酰胺酸为 450-530 mg/L , L-半胱氨酸 为 200-260 mg/L , L-谷氨酰胺为 570-620 mg/L, L-组氨酸为 480-520 mg/L, L-异 亮氨酸为 480-520 mg/L， L-亮氨酸为 220-270 mg/L， L-赖氨酸为 120-170 mg/L，
L-蛋氨酸为 120-170 mg/L , L-苯丙氨酸为 230-280 mg/L, L-丝氨酸为 360-420 mg/L, L-苏氨酸为 550-610 mg/L， L-色氨酸为 36-43 mg/L， L-酪氨酸为 530-620 mg/L, L-缬氨酸为 160-220 mg/L,氯化胆碱为 1. 7-2. 2 mg/L, D-泛酸钙为 1. 8-2. 3 mg/L,叶酸为 1. 7-2. 2 mg/L，烟酰胺为 1. 6-2. 2 mg/L,维生素 B6为 1. 8-2. 3 mg/L, 核黄素为 0. 18-0. 22 mg/L, 硫胺磷酸酯为 1. 9-2. 1 mg/L , 无旋光肌醇为 3. 6-4. 3 mg/L,氯化钙为 250-300 mg/L,氯化镁为 170-198 mg/L ,硫酸镁为 180-200 mg/L, 氯化钾为 770-810 mg/L, 磷酸二氢钾为 110-130 mg/L, 氯化钠为 19500-20100 mg/L，磷酸二氢钠为 370-390 mg/L，右旋半乳糖为 1650-1900 mg/L，酚红为 18-21 mg/L, 丙酮酸钠为 1050-1120 mg/L。
本发明通过上述建系方法及其专用培养液提供了一种青岛文昌鱼细胞系， 成功地解决了离体传代培养文昌鱼细胞的技术难题， 有利于促进遗传、 免疫、 进化、 发育和基因组学等领域的深入研究。 附图说明
图 1 : 将文昌鱼的腮部组织进行原代培养， 12小时后细胞游离出组织块。 图 2 : 显示转染 5天后细胞在贴壁的状态下可以伸出长长的触角。
图 3 : 利用本发明建立的文昌鱼细胞系的第三代传代细胞。
图 4: 利用本发明建立的文昌鱼细胞系的第六代传代细胞。
图 5 : 利用本发明建立的文昌鱼细胞系的第八代传代细胞。
图 6: Wright-Gimsa染色结果。 具体实施方式
下面结合具体实施例进一歩阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的应用范围。
实施例 1
1. 培养青岛文昌鱼腮部原代细胞。将文昌鱼冰浴至昏迷， 7 0〜 7 5 %酒 精消毒体表， 无菌解剖， 取文昌鱼腮部组织， 用含双抗的细胞培养液漂洗后， 剪切为细小组织块， 将其移至六孔细胞培养板， 涂布均匀， 2 5〜2 9 °C下恒 温静置培养使其贴壁， 每日观察细胞生长状态， 并补加 0. 5〜lm L细胞培养液。 3日后更换 1 / 2体积的细胞培养液。 如图 1所示， 利用文昌鱼腮部组织进行原 代培养后， 可见贴壁细胞和悬浮细胞从组织中游离出来， 悬浮细胞呈圆形， 贴 壁细胞呈多角形， 但原代细胞不分裂。
2. 将人端粒酶催化亚单位 hTERT的 cDNA转染青岛文昌鱼腮部原代细胞。转 染前 24小时选择生长状态良好的 293T细胞， 胰酶消化后传代后， 接种于 24孔 培养中， 每孔 4X105个细胞， 待细胞覆盖率达到 60%后用于转染； 次日换普通培 养基； 第 5天收集漂浮层， 2000rpm/min离心 20分钟， 上清液用 0. 45 μ m的滤 膜过滤； 病毒感染液 1/4 体积 +文昌鱼细胞培养液 3/4体积， 混合后加入原代细 胞。
对贴壁细胞和悬浮细胞同时进行 hTERT转染 5天后， 悬浮细胞开始出现分 裂， 并有大部分细胞逐渐趋于半贴壁状态， 少部分细胞贴壁， 与细胞培养皿底 部粘着紧密。 半贴壁和贴壁的细胞形态与原代的悬浮细胞基本相同。 在倒置显 微镜下观察， 细胞虽然大小不一， 但均呈圆形， 细胞核位于细胞的中央。 如图 2 所示， 贴壁细胞有时会伸出长长的触角， 但最长持续 2 天， 之后触角会逐渐消 失， 细胞恢复原状。 随着传代次数的增加， 细胞的大小差异有逐渐缩小的趋势， 但细胞大小不等的现象仍然存在。
3. 获得存活细胞， 并进行传代培养。 转染 hTERT 的细胞开始增殖后， 细
胞数目增多， 细胞生长密度较大时， 用移液管轻轻吸打的方法传代悬浮细胞， 传代稀释比例为 1 : 4; 以后每次传代视细胞生长状态， 3〜4日传代一次。 图 3 为第三代传代细胞， 图 4为第六代传代细胞， 图 5为第八代传代细胞。 由此可 见， 第一代至第八代的细胞形态没有十分明显差别， 但证明了此细胞成功实现 了传代培养， 是可以传代培养的文昌鱼细胞系。 至目前已传到了第 12代， 细胞 增殖旺盛。
4. 进行细胞生物学鉴定， 验证细胞特征。 将细胞悬浊液滴至载玻片上进行 涂片， 干燥后进行 Wright-Gimsa染色。 结果如图 6所示。 从染色结果上判断， 此细胞系为淋巴细胞。 实施例 2
成分 浓度 (mg/L) 甘氨酸 380
L-丙氨酸 400
L-左型精氨酸 800
L-天冬酰胺酸 450
L-半胱氨酸 200
L-谷氨酰胺 570
L-组氨酸 480
L-异亮氨酸 480
L-亮氨酸 220
L-赖氨酸 120
成分 浓度 (mg/L)
L-蛋氨酸 120
L-苯丙氨酸 230
L-丝氨酸 360
L-苏氨酸 550
L-色氨酸 36
L-酪氨酸 530
L-缬氨酸 160 氯化胆碱 1. 7
D-泛酸钙 1. 8 叶酸 1. 7 烟酰胺 1. 6 盐酸吡多辛 （维生素 B6) 1. 8 核黄素 0. 18 硫胺磷酸酯 1. 9 无旋光肌醇 3. 6 氯化钙 （CaC12) 250 氯化镁 170 硫酸镁 180 氯化钾 770 磷酸二氢钾 110 氯化钠 19500 磷酸二氢钠 370 成分 浓度 (mg/L)
右旋半乳糖 1650 酚红 18 丙酮酸钠 1050
2. 优选培养液组分 2 :
成分 浓度 (mg/L) 甘氨酸 420
L-丙氨酸 480
L-左型精氨酸 1100
L-天冬酰胺酸 530
L-半胱氨酸 260
L-谷氨酰胺 620
L-组氨酸 520
L-异亮氨酸 520
L-亮氨酸 270
L-赖氨酸 170
L-蛋氨酸 170
L-苯丙氨酸 280
L-丝氨酸 420
L-苏氨酸 610
L-色氨酸 43
L-酪氨酸 620 成分 浓度 (mg/L)
L-缬氨酸 220 氯化胆碱 2. 2
D-泛酸钙 2. 3 叶酸 2. 2 烟酰胺 2. 2 盐酸吡多辛 （维生素 B6 ) 2. 3 核黄素 0. 22 硫胺磷酸酯 2. 1 无旋光肌醇 4. 3 氯化钙 （CaC12) 300 氯化镁 198 硫酸镁 200 氯化钾 810 磷酸二氢钾 130 氯化钠 20100 磷酸二氢钠 390 右旋半乳糖 1900 酚红 21 丙酮酸钠 1120
3. 优选培养液组分 3 :
成分 浓度 (mg/L) 甘氨酸 380-420
L-丙氨酸 400-480
L-左型精氨酸 800-1100
L-天冬酰胺酸 450-530
L-半胱氨酸 200-260
L-谷氨酰胺 570-620
L-组氨酸 480-520
L-异亮氨酸 480-520
L-亮氨酸 220-270
L-赖氨酸 120-170
L-蛋氨酸 120-170
L-苯丙氨酸 230-280
L-丝氨酸 360-420
L-苏氨酸 550-610
L-色氨酸 36-43
L-酪氨酸 530-620
L-缬氨酸 160-220 氯化胆碱 1. 7-2. 2
D-泛酸钙 1. 8-2. 3 叶酸 1. 7-2. 2 烟酰胺 1. 6-2. 2 成分 浓度 (mg/L) 盐酸吡多辛 （维生素 B6 ) 1. 8-2. 3 核黄素 0. 18-0. 22
硫胺磷酸酯 1. 9-2. 1 无旋光肌醇 3. 6-4. 3 氯化钙 （CaC12) 250-300 氯化镁 170-198 硫酸镁 180-200 氯化钾 770-810 磷酸二氢钾 110-130 氯化钠 19500-20100 磷酸二氢钠 370-390 右旋半乳糖 1650-1900 酚红 18-21 丙酮酸钠 1050-1120 实施例 3
细胞培养液的配制：
以 Leibovitz' s L-15 (L15 ) 为基础培养液， 将其他组分加入 0. 8升的超纯 水 （电阻率 18. 2 Ω ) 中；将渗透压调配至 750-800m0sm / kg ; 将酸碱度调至 7. 0-7. 2； 用超纯水 （电阻率 18. 2 Ω ) 将培养液的总体积调至 1升；充分混匀后 过滤灭菌后 4°C保存， 过滤后培养液的 pH值达到 7. 2-7. 4； 使用前加入 10% (体 积比） 胎牛血清。
Claims
1. 一种青岛文昌鱼细胞系， 其特征在于用人端粒酶催化亚单位 hTERT 的 cDNA转染青岛文昌鱼腮部原代细胞。
2. 根据权利要求 1所述的青岛文昌鱼细胞系，其特征在于：所述原代细胞 为淋巴细胞。
3. 一种建立权利要求 1所述青岛文昌鱼细胞系的方法， 包括以下歩骤：
1 ) 培养青岛文昌鱼腮部原代细胞： 将文昌鱼冰浴至昏迷， 7 0〜7 5 %酒 精消毒体表， 无菌解剖， 取文昌鱼腮部组织， 用含双抗的细胞培养液漂洗后， 剪切为细小组织块， 将其移至六孔细胞培养板， 涂布均匀， 2 5〜2 9 °C下恒 温静置培养使其贴壁， 每日观察细胞生长状态， 并补加 0. 5〜l m L细胞培养液； 3日后更换 1 / 2体积的细胞培养液；
2 )将人端粒酶催化亚单位 hTERT的 cDNA转染青岛文昌鱼腮部原代细胞： 转 染前 24小时选择生长状态良好的 293T细胞， 胰酶消化后传代后， 接种于 24孔 培养中， 每孔 4X105个细胞， 待细胞覆盖率达到 60 %后用于转染； 次日换普通培 养基； 第 5天收集漂浮层， 2000rpm/min离心 20分钟， 上清液用 0. 45 μ m的滤 膜过滤； 病毒感染液 1/4 体积 +文昌鱼细胞培养液 3/4体积， 混合后加入原代细 胞；
3 ) 获得存活细胞， 并进行传代培养： 转染 hTERT的细胞开始增殖后， 细胞 数目增多， 细胞生长密度较大时， 用移液管轻轻吸打的方法传代悬浮细胞， 传 代稀释比例为 1 : 4; 以后每次传代视细胞生长状态， 3〜4日传代一次；
4) 进行细胞生物学鉴定， 验证细胞特征。
4. 根据权利要求 3所述的建立青岛文昌鱼细胞系的方法，其特征在于：所 用人端粒酶催化亚单位 hTERT的表达载体为逆转录病毒载体 pBABE。
5. 一种专用于权利要求 3所述建立青岛文昌鱼细胞系的方法的培养液，以 L15为基础培养基， 并含有以下组分： 一种或多种必须氨基酸及非必须氨基酸、 一种或多种维生素、 一种或多种盐类、 一种或多种微量元素、 一种或多种缓冲 液及糖类、 一种或多种酚类化合物；
所述氨基酸为丙氨酸、 精氨酸、 天冬酰胺、 天冬氨酸、 半胱氨酸、 谷氨酰 胺、 甘氨酸、 组氨酸、 异亮氨酸、 亮氨酸、 赖氨酸、 苯丙氨酸、 丝氨酸、 苏氨 酸、 色氨酸、 酪氨酸、 缬氨酸和苯基丙氨酸；
所述的维生素为生物素、 氯化胆碱、 叶酸、 无旋光肌醇、 硫胺磷酸酯、 维 生素 B6、 泛酸钙、 核黄素、 烟酰胺；
所述的盐类为氯化钙、 氯化钠、 氯化钾、 氯化镁、 磷酸二氢钠、 磷酸二氢 钾、 硫酸镁、 丙酮酸钠；
所述的糖类为右旋半乳糖；
所述酚类化合物为酚红；
所述培养液的渗透压为 750-800m0sm I kg;
所述培养液的 pH为 7. 2-7. 4；
使用前在所述培养液中加入 10% (体积比） 胎牛血清。
6. 根据权利要求 5 所述的一种专用于建立青岛文昌鱼细胞系的方法的培 养液， 其特征在于各组分含量： 甘氨酸为 380-420mg/L， L-丙氨酸为 400-480 mg/L, L-左型精氨酸为 800-1100 mg/L , L-天冬酰胺酸为 450-530 mg/L , L-半 胱氨酸 为 200-260 mg/L, L-谷氨酰胺为 570-620 mg/L, L-组氨酸为 480-520 mg/L , L-异亮氨酸为 480-520 mg/L , L-亮氨酸为 220-270 mg/L , L-赖氨酸为 120-170 mg/L , L-蛋氨酸为 120—170 mg/L, L-苯丙氨酸为 230—280 mg/L, L-丝 氨酸为 360-420 mg/L, L-苏氨酸为 550-610 mg/L, L-色氨酸为 36-43 mg/L, L- 酪氨酸为 530-620 mg/L, L-缬氨酸为 160-220 mg/L, 氯化胆碱为 1. 7-2. 2 mg/L, D-泛酸钙为 1. 8-2. 3 mg/L, 叶酸为 1. 7-2. 2 mg/L, 烟酰胺为 1. 6-2. 2 mg/L, 维 生素 B6为 1. 8-2. 3 mg/L，核黄素为 0. 18-0. 22 mg/L，硫胺磷酸酯为 1. 9-2. 1 mg/L, 无旋光肌醇为 3. 6-4. 3 mg/L, 氯化钙为 250 - 300 mg/L, 氯化镁为 170-198 mg/L, 硫酸镁为 180-200 mg/L， 氯化钾为 770-810 mg/L， 磷酸二氢钾为 110-130 mg/L， 氯化钠为 19500-20100 mg/L , 磷酸二氢钠为 370-390 mg/L , 右旋半乳糖为 1650-1900 mg/L, 酚红为 18-21 mg/L, 丙酮酸钠为 1050-1120 mg/L。
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