WO2012057328A1 - 高い内在化能力を有する抗cdh3抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
(1) カドヘリンのカドヘリンドメイン1(EC1)を認識し、かつ高い内在化能を示す抗カドヘリン抗体。
(2) カドヘリンがPカドヘリンである、(1)に記載の抗体。
(3) PカドヘリンまたはPカドヘリンを発現している細胞を免疫原として投与した免疫動物から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である、(1)又は(2)に記載の抗体。
(4) Pカドヘリンが全長、あるいは細胞外領域のみを発現させた可溶型Pカドヘリン、またはその断片である、(3)に記載の抗体。
(5) モノクローナル抗体である、(1)から(4)の何れかに記載の抗体。
(6) モノクローナル抗体が、キメラ化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、(5)に記載の抗体。
(8) (7)に記載のモノクローナル抗体を改変して作られたキメラ化抗体又はヒト化抗体。
(9) (7)に記載のモノクローナル抗体のVH及び/またはVLドメインのアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるVH及び/またはVLドメインを有する抗体またはその断片。
(10) 抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体(scFv)、二量体化V領域(Diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)およびCDRを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、(1)から(9)のいずれか1項に記載の抗体。
(12) 受託番号NITE BP-988、NITE BP-1145、NITE BP-1147又はNITE BP-1148を有する細胞株。
(13) (1)から(10)の何れかに記載の抗体を含む、細胞傷害剤。
(14) 上記抗体に、細胞傷害性物質が結合している、(13)に記載の細胞傷害剤。
(15) 細胞傷害性物質が薬剤、トキシン、又は放射性物質である、(14)に記載の細胞傷害剤。
(17) 細胞傷害性物質が、DM1、DM3又はDM4から選択されるメイタンシノイド誘導体、またはMMAE又はMMAFから選択されるアウリスタチン誘導体である、(16)に記載の細胞傷害剤。
(18) 抗体と細胞傷害性物質とがリンカーにより連結している、(14)から(17)のいずれか1項に記載の細胞傷害剤。
(19) リンカーが、2価反応性架橋試薬である、(18)に記載の細胞傷害剤。
(20) リンカーが、スルフォスクシイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート (Sulfo-SMCC)、N-スクシンイミジル4-(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(SMCC)、N-スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシ-(6-アミドカプロエート)(LC-SMCC)、rc-マレイミドウンデカン酸N-スクシンイミジルエステル(KMUA)、γ-マレイミド酪酸N-スクシンイミジルエステル(GMBS)、ε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(EMCS)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、N-(α-マレイミドアセトキシ)-スクシンイミドエステル(AMAS)、スクシンイミジル-6-(β-マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート(SMPH)、N-スクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)-ブチレート(SMPB)、およびN-(p-マレイミドフェニル)イソシアネート(PMPI)、6-マレイミドカプロイル(MC)、マレイミドプロパノイル(MP)、p-アミノベンジルオキシカルボンイル(PAB)、N-スクシンイミジル4(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(SPP)及びN-スクシンイミジル(4-イオドーアセチル)アミノ安息香酸エステル(SIAB)、バリン-シトルリン(val-cit)、アラニン-フェニルアラニン(ala-phe)から成る群より選択される、(18)又は(19)に記載の細胞傷害剤。
(22) (13)から(21)のいずれか1項に記載の細胞傷害剤を有効成分として含有する医薬組成物。
(23) (13)から(21)のいずれか1項に記載の細胞傷害剤を有効成分として含有するヒトCDH3高発現疾患の治療薬。
(24) ヒトCDH3高発現疾患が癌である、(23)に記載の治療薬。
更に本発明によれば、細胞傷害剤の製造のための、上記した本発明の抗体の使用が提供される。更に本発明によれば、カドヘリン高発現疾患の治療薬の製造のための、上記した本発明の抗体の使用が提供される。
本発明の抗体は、カドヘリンのカドヘリンドメイン1(EC1)を認識し、かつ高い内在化能を有する抗カドヘリン抗体である。
カドヘリンドメイン1(EC1):配列番号2のアミノ酸配列の第108位~第236位
カドヘリンドメイン2(EC2):配列番号2のアミノ酸配列の第237位~第348位
カドヘリンドメイン3(EC3):配列番号2のアミノ酸配列の第349位~第461位
カドヘリンドメイン4(EC4):配列番号2のアミノ酸配列の第462位~第550位
カドヘリンドメイン5(EC5):配列番号2のアミノ酸配列の第551位~第654位
・Eカドヘリン(CDH1)
カドヘリンドメイン1(EC1):配列番号4のアミノ酸配列の第155位~第283位
カドヘリンドメイン2(EC2):配列番号4のアミノ酸配列の第284位~第395位
カドヘリンドメイン3(EC3):配列番号4のアミノ酸配列の第396位~第507位
カドヘリンドメイン4(EC4):配列番号4のアミノ酸配列の第508位~第597位
カドヘリンドメイン5(EC5):配列番号4のアミノ酸配列の第598位~第704位
・Nカドヘリン(CDH2)
カドヘリンドメイン1(EC1):配列番号6のアミノ酸配列の第160位~第288位
カドヘリンドメイン2(EC2):配列番号6のアミノ酸配列の第289位~第402位
カドヘリンドメイン3(EC3):配列番号6のアミノ酸配列の第403位~第518位
カドヘリンドメイン4(EC4):配列番号6のアミノ酸配列の第519位~第607位
カドヘリンドメイン5(EC5):配列番号6のアミノ酸配列の第608位~第719位
ヒトCDH3発現細胞に抗ヒトCDH3抗体100ng、サポリン標識抗体(Advanced Targeting Systems社)100ngを加え、37℃、3日間、5%CO2インキュベーターにて保温した。その後、生細胞数計測試薬であるCellCountingKit-8(同仁化学研究所社)を使用することで各抗体の細胞殺傷性を評価した。細胞殺傷性は抗体を加えなかった時の細胞生存率を100%とした相対活性で表した。
ポリクローナル抗体を作製するためには、カドヘリン、カドヘリン細胞外領域発現物又はその部分ペプチド(EC1が好ましい)を抗原として、これを哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物1匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは0.1~100mgであり、アジュバントを用いるときは1~100μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内等に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2~5週問間隔で、1~10回、好ましくは2~5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から6~60目後に、酵素免疫測定法(ELISA)、放射性免疫測定法(RIA)等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。抗血清から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
モノクローナル抗体を作製するためには、カドヘリン、カドヘリン細胞外領域発現物又はその部分ペプチド(EC1が好ましい)を抗原として、これを哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギなどに投与する。抗原の動物1匹当たりの投与量は、アジュバントを用いないときは0.1~100mgであり、アジュバントを用いるときは1~100μgである。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント(FCA)、フロイント不完全アジュバント(FIA)、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2~5週間間隔で、1~10回、好ましくは2~5回免疫を行う。そして、最終の免疫日から1~60日後、好ましくは1~14日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられるが、脾臓細胞又は局所リンパ節細胞が好ましい。
本発明のFab'は、カドヘリンに特異的に反応するF(ab')2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のFab'断片をコードするDNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりFab'を発現させ、製造することができる。
本発明のCDRを含むペプチドは、カドヘリンに特異的に反応する抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得した後、CDRをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、CDRを含むペプチドを製造することができる。
正常ヒト組織および各種癌組織より、レーザーマイクロダイセクション法(Laser Capture Microdissection)で回収したサンプルよりISOGEN(ニッポンジーン社)を用い定法に従って全RNAを調製した。RNA各10ngをGeneChipU-133B(Affymetrix社)を用い、Expression Analysis Technical Manual(Affymetrix社)に準じて遺伝子発現を解析した。全遺伝子の発現スコアの平均値を100とし、癌細胞において発現が亢進する遺伝子を探索したところ、ヒトCDH3は正常ヒト組織では発現が限られ、肺癌、大腸癌、膵臓癌で発現が高かった(図3A、B)。また、分化度の異なる膵臓癌組織におけるCDH3mRNAの発現を検討したところ、分化度に関わらず発現が高い組織が認められた(図3C)。
癌臨床検体でのCDH3タンパク質の発現を確認するため、癌検体組織アレイで免疫染色を行った。
癌細胞組織アレイは、上海芯超生物科技有限公司社(Shanghai Outdo Biotech Co.,Ltd.)製の、膵癌(腺癌)、肺癌(腺癌)、肺癌(扁平上皮癌)および大腸癌(腺癌)を使用した。
図4に結果を示す。癌細胞は抗ヒトCDH3抗体で染色され正常細胞は染色されなかった。
抗ヒトCDH3抗体スクリーニング用細胞株を得るため、全長CDH3を発現するCHO細胞の樹立を行った。
(1)CDH3遺伝子発現ベクターの作製
配列番号1に示す全長ヒトCDH3DNAを哺乳類発現ベクターpEF4/myc-HisB(インビトロジェン社)へ挿入するため、2種類の制限酵素KpnI(タカラバイオ社)及びXbaI(タカラバイオ社)で37℃、1時間処理した後、同じくKpnI及びXbaIで処理したpEF4/myc-HisBへT4 DNAリガーゼ(プロメガ社)により常法に従って挿入し、発現ベクターpEF4―CDH3―myc-Hisを得た。
FuGENE(登録商標)6トランスフェクション試薬(ロシュ・ダイアグノスティックス社)のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径10cmディッシュに8×105細胞のCHO細胞を播種し一晩培養後、8μgの発現ベクターpEF4―CDH3―myc-Hisと16μLのFuGENE6試薬を400μLの無血清RPMI1640培地(SIGMA ALDRICH社)に混合し15分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬(Zeocin(登録商標))を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
抗ヒトCDH3抗体作製の免疫原とするため、C末端膜貫通領域以降を欠損させたヒトCDH3細胞外領域(sCDH3)タンパク質を作製した。
(1)sCDH3抗原発現ベクターの作製
ヒトCDH3全長cDNAをテンプレートとして、ヒトCDH3細胞外領域に相当する部分(配列番号2の1-654に相当、以下sCDH3cDNA)を増幅するように設計されたフォワードプライマー(配列番号7:CGCGGTACCATGGGGCTCCCTCGT)とリバースプライマー(配列番号8:CCGTCTAGATAACCTCCCTTCCAGGGTCC)を用いてPCR反応を行った。反応にはKOD-Plus(東洋紡社)を用い、94℃-15秒、55℃-30秒、68℃-90秒、30サイクルの反応条件で行った。
FuGENE6トランスフェクション試薬のプロトコールに準じ、トランスフェクション前日に径10cmディッシュに8×105個のCHO細胞を播種し一晩培養後、8μgの発現ベクターpEF4-sCDH3-myc-Hisと16μLのFuGENE6試薬を400μLの無血清RPMI1640培地に混合、15分間室温放置後、細胞培養液に加えトランスフェクションを行った。トランスフェクション翌々日に選択試薬(Zeocin)を用いて限界希釈法にてクローニングを行った。
(1)可溶型CDH3たんぱく質を免疫原としたモノクローナル抗体の作製
生理食塩水に溶解した50μgの可溶型CDH3タンパク質とTiter-MAX Gold(登録商標)(タイターマックス社)を等量混合し、MRL/lprマウス(日本エスエルシー株式会社)の腹腔内および皮下に注射する事により初回免疫を行った。2回目以降の免疫は同様に調製した25μgタンパク質量相当の可溶型CDH3タンパク質とTiter-MAX Goldを混合して腹腔内および皮下に注射することにより実施した。最終免疫から3日後にマウスから脾臓細胞を無菌的に調製し、常法に従って、ポリエチレングリコール法によりマウスミエローマ細胞SP2/O-Ag14あるいはP3-X63-Ag8.653との細胞融合を行った。
抗ヒトCDH3抗体の選抜は、EXZ1501を用いたフローサイトメトリで行った。
すなわち、EXZ1501を2mM EDTA-PBSで処理することで培養プレートから剥離後、1×106個/mLとなるようにFACS溶液に懸濁した。この細胞懸濁液を50μL/ウェルとなるように96ウェルプレートに播種し、ハイブリドーマ培養上清を加えて4℃で60分間反応させ、FACS溶液(200μL/ウェル)で2回洗浄した後、AlexaFluor488標識抗マウスIgG・ヤギF(ab')2(インビトロジェン社)を加えて、4℃で30分間反応させた。その後FACS溶液で2回洗浄した後、フローサイトメトリを実施し、EXZ1501との反応が認められるハイブリドーマを選抜した。
内在化能の測定は、タンパク質合成を阻害する毒素(サポリン)を標識した抗マウスIgG抗体を使用して行なった。サポリンによる細胞殺傷は細胞内部移行が必須であるため、MabZAP(Advanced Targeting Systems社製)を2次抗体とした抗ヒトCDH3抗体のヒトCDH3発現細胞に対する殺傷程度を測定する事で抗ヒトCDH3抗体の内在化能を評価する事が可能である。
得られた抗ヒトCDH3抗体のエピトープ分類は、ヒトCDH3部分配列発現物とのウェスタンブロット法により行った。ヒトCDH3部分配列発現物は各断片間で十分に配列が重複するように断片1から5を設計した(図8)。
実施例3の全長ヒトCDH3cDNAをテンプレートとし、後述のプライマーセットを用いてPCR反応を行った。この反応にはiProofHighFideIityDNAポリメラーゼ(バイオラッド社)を用い、条件は98℃-10秒、60℃-10秒、72℃-30秒、35サイクルで行なった。アガロースゲル電気泳動により目的のサイズに近いバンドを含むゲルを切り出し、QIA(登録商標)クイックゲル抽出キットを用いて、目的のヒトCDH3cDNA部分断片を得た。
フォワードプライマー:TATGGAGCTCGGTACCGATTGGGTGGTTGCTCCAATATCTG(配列番号:9)
リバースプライマー:AGATTACCTATCTAGACTACTGCATCACAGAAGTACCTGGTAGG(配列番号:10)
フォワードプライマー:TATGGAGCTCGGTACCAAGTCTAATAAAGATAGAGACACCAAG(配列番号:11)
リバースプライマー:AGATTACCTATCTAGACTACCTCTGCACCTCATGGCCCACTGCATTCTCA(配列番号:12)
フォワードプライマー:TATGGAGCTCGGTACCGTGACAGCCACGGATGAGGATGATG(配列番号:13)
リバースプライマー:AGATTACCTATCTAGACTAGACACACACAGGCTCCCCAGTG(配列番号:14)
フォワードプライマー:TATGGAGCTCGGTACCCTGACGGTCACTGATCTGGACG(配列番号;15)
リバースプライマー:AGATTACCTATCTAGACTAGGGCTCAGGGACTGGGCCATGGTCATTG(配列番号:16)
フォワードプライマー:TATGGAGCTCGGTACCTACACTGCAGAAGACCCTGACAAGG(配列番号:17)
リバースプライマー:AGATTACCTATCTAGACTAACCTCCCTTCCAGGGTCCAGGGCAGGTTTCG(配列番号:18)
(1)のCDH3断片の発現ベクターを使用して、常法により大腸菌Rossetta(登録商標)2(メルク社)を形質転換し、LB培地中で培養。600nmの吸光値が0.4となった段階で、30分間氷冷し、イソプロピルーβ一チオガラクトピラノシド(IPTG)濃度を0.5mMとし、20℃で18時間培養後、回収した。
即ち、上述した大腸菌培養液量の1/10量に相当する泳動緩衝液を加え、還元条件下5-20%グラジエントゲル(バイオラッド社)にチャージして電気泳動後、イモビロン(登録商標)P(ミリポア社)に転写した。転写膜は、TBS-T(0.05%Tween(登録商標)20、TBS)で軽く洗った後、40%BSA入りTBSで1時間振とう後、10%ブロックエー・一ス(登録商標)(雪印乳業社)入りTBS-Tで希釈した各抗CDH3抗体を加え1時間振とうした。TBS-Tで洗った後10%ブロックエー一ス入りTBS-Tで希釈したHRP一抗マウスIgG抗体(GEヘルスケアバイオサイエンス社)で1時間振とう後、TBS-Tで洗った。発色はメーカーの解説書に従い、ECL(登録商標)-Plus(GEヘルスケアバイオサイエンス社)を用いて、X線フィルムRX-u(富士フイルム社)にて検出した。得られた結果を図9に示す。
上述の各CDH3部分配列を発現させた大腸菌溶解物を還元条件下、5-20%グラジエントゲル(バイオラッド社)にチャージして電気泳動後、プロッティング装置(バイオラッド社)を用いて、イモビロンP(ミリポア社)に転写した。転写膜は、TBS-T(0.05%Tween20、TBS)で軽く洗った後、40%BSA入りTBSで1時間振とう後、短冊状に等間隔で切断し、10%ブロックエース入りTBS-Tで希釈した各抗CDH3抗体を加え1時間振とうした。TBS-Tで洗った後10%ブロックエース入りTBS-Tで希釈したHRP一抗マウスIgG抗体(GEヘルスケアバイオサイエンス社)で1時間振とう後、TBS-Tで洗った。発色はメーカーの解説書に従い、EcL-PIus(GEヘルスケアバイオサイエンス社)を用いて、x線FilmRx-u(富士フイルム社)にて検出した。ここで得られた結果を図10に示す。各CDH3部分配列発現物との反応性により、各抗体が認識する領域を決定した。
(3)のCDH3部分配列発現物によるエピトープ決定において、その境界領域に相当したと考えられる抗体PPAT-055-13を対象に、ペプチドアレイ(JPT Peptide TechnoIogies社製Replitope)を用いてより詳細にエピトープ決定を行った。具体的には、CDH3の細胞外領域に相当する領域(配列番号2の108位一563位に相当)を、N端から13残基ずつ、2アミノ酸残基ずつスライドして合成したペプチド(108位一120位、110位一122位…551位一563位)をガラススライドに固相化、SuperBlock(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)にてブロッキングしたものを調製し、1次抗体としてエピトープ検索対象の抗体と反応させた。TBS-Tで3度洗浄後、DyLight649蛍光標識した抗マウス抗体(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)で検出した。エピトープ検索対象の抗体を反応させないものを陰性コントロールとして測定した。測定結果を図11に示す。配列番号2に示されたCDH3のアミノ酸配列446位一472位、490位一504位に相当する領域に強いシグナルが観察され、当該抗体のエピトープと推定された。
EC1:108位一236位
EC2:237位一348位
EC3:349位一461位
EC4:462位一550位
EC5:551位一654位
ハイブリドーマPPAT-055-09(受託番号NITE BP-989)、及びハイブリドーマPPAT-055-24(受託番号NITE BP-991)から、細胞質に存在するRNAをGough, Rapid and quantitative preparation of cytoplasmic RNA from small numbers of cells, Analytical Biochemisty, 173, p93-95 (1988)により記載されている方法(ただし、この論文に記されている溶解緩衝液のかわりに別のTNE緩衝液(25mMTris-HCl、pH 7.5、1% NP-40、150mMNaCl、1mMEDTA、pH 8.0)を用いた)に従って単離した。具体的な操作方法としては、5x106個のハイブリドーマ細胞を0.2mLのTNE緩衝液に懸濁して細胞膜を溶解後、遠心により細胞核を除去した。得られた約0.2mL細胞質上清に0.2mLの抽出緩衝液(10mMTris-HCl、pH7.5、0.35MNaCl、1%(w/v)SDS、10mMEDTA、pH8.0、7M尿素)を加えた。この混合物をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、得られたRNA溶液にキャリアとしてグリコーゲン(ロッシュ社、Cat No.901393)を加えてから、エタノールで沈澱させた。次にRNA沈殿物を、細胞質RNA濃度が0.5~2ug/uLになるように10~50uLの滅菌蒸留水を加えて溶解した。
一本鎖cDNAを合成するため、前記のように調製した細胞質RNAの0.5~3ugを50mMTris-HCl,pH 8.3(室温)、75mMKCl、3mMMgCl2、10mMDTT、100ngのランダムプライマー、0.5mMdNTP、200ユニットのSuperscriptII(逆転写酵素、インビトロジェン社)を含む20マイクロリットル反応混合液を調製し、42℃で50分間インキュベートした。このように合成したcDNAライブラリーをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法の鋳型として直接使用した。
実験に用いたプライマーはすべて北海道システムサイエンス株式会社で合成した。
A.マウス軽鎖の可変領域をコードする遺伝子をPCR法で増幅するために使用するプライマー
5’末端においてFR1部分と相同性を有するDNAプライマーと3’末端においてマウスL鎖内のJ鎖遺伝子と相同性を有する4セットプライマー(1)、あるいは、5’末端においてL鎖シグナル部分(7セットプライマー)と3’末端においてKC部分(KVLアンチセンスプライマー)と相同性を有するプライマーセット(2)の2種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該cDNAからマウス免疫グロブリンL鎖可変域DNAを単離した。プライマー配列は次のとおりであった。
「Phage Display -A Laboratory Manual , Barbas Burton Scott Silverman」 PROTOCOL9.5を参考にSense Primer 17種、Reverse Primer 3種を北海道システムサイエンス社で合成した。
配列番号20:5’-GAYATTGTTCTCWCCCAGTC-3’(縮重度4)
配列番号21:5’-GAYATTGTGMTMACTCAGTC-3’(縮重度8)
配列番号22:5’-GAYATTGTGYTRACACAGTC-3’(縮重度8)
配列番号23:5’-GAYATTGTRATGACMCAGTC-3’(縮重度8)
配列番号24:5’-GAYATTMAGATRAMCCAGTC-3’(縮重度16)
配列番号25:5’-GAYATTCAGATGAYDCAGTC-3’(縮重度12)
配列番号26:5’-GAYATYCAGATGACACAGAC-3’(縮重度4)
配列番号27:5’-GAYATTGTTCTCAWCCAGTC-3’(縮重度4)
配列番号28:5’-GAYATTGWGCTSACCCAATC-3’(縮重度8)
配列番号29:5’-GAYATTSTRATGACCCARTC-3’(縮重度16)
配列番号30:5’-GAYRTTKTGATGACCCARAC-3’(縮重度16)
配列番号31:5’-GAYATTGTGATGACBCAGKC-3’(縮重度12)
配列番号32:5’-GAYATTGTGATAACYCAGGA-3’(縮重度4)
配列番号33:5’-GAYATTGTGATGACCCAGWT-3’(縮重度4)
配列番号34:5’-GAYATTGTGATGACACAACC-3’(縮重度2)
配列番号35:5’-GAYATTTTGCTGACTCAGTC-3’(縮重度2)
J1 / J2アンチセンスプライマー (1)
配列番号36:5’-GGSACCAARCTGGAAATMAAA-3’(縮重度:8)
J4アンチセンスプライマー (2)
配列番号37:5’-GGGACAAAGTTGGAAATAAAA-3’
J5アンチセンスプライマー(3)
配列番号38:5’-GGGACCAAGCTGGAGCTGAAA-3’
J1 / J2, J4, J5アンチセンスプライマー混合物 (4)
VKセンス(シグナルペプチド部分)
このプライマーはノバジェン社のマウスIg-プライマーセット(Novagen; Merck, Cat.No.69831-3)を元に制限酵素部位を除去するように塩基配列を改変した。
配列番号39:5’-ATGRAGWCACAKWCYCAGGTCTTT-3’
Bセットセンスプライマー
配列番号40:5’-ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3’
Cセットセンスプライマー
配列番号41:5’-ATGGAGWCAGACACACTSCTGYTATGGGT-3’
Dセットセンスプライマー(下記2種類のプライマーの混合物を使用)
配列番号42:5’-ATGAGGRCCCCTGCTCAGWTTYTTGGIWTCTT-3’
配列番号43:5’-ATGGGCWTCAAGATGRAGTCACAKWYYCWGG-3’
Eセットセンスプライマー(下記3種類のプライマーの混合物を使用)
配列番号44:5’-ATGAGTGTGCYCACTCAGGTCCTGGSGTT-3’
配列番号45:5’-ATGTGGGGAYCGKTTTYAMMCTTTTCAATTG-3’
配列番号46:5’-ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTTCC-3’
Fセットセンスプライマー(下記4種類のプライマーの混合物を使用)
配列番号47:5’-ATGAGIMMKTCIMTTCAITTCYTGGG-3’
配列番号48:5’-ATGAKGTHCYCIGCTCAGYTYCTIRG-3’
配列番号49:5’-ATGGTRTCCWCASCTCAGTTCCTTG-3’
配列番号50:5’-ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTCT-3’
Gセットセンスプライマー(下記4種類のプライマーの混合物を使用)
配列番号51:5’-ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3’
配列番号52:5’-ATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT-3’
配列番号53:5’-ATGGTYCTYATVTCCTTGCTGTTCTGG-3’
配列番号54:5’-ATGGTYCTYATVTTRCTGCTGCTATGG-3’
KVLアンチセンスプライマー
配列番号55:5’-ACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3’
5'末端においてマウスH鎖シグナル部分(4セットプライマー)と相同性を有するプライマーと3'末端においてKC部分と相同性を有するプライマー、あるいは5'末端においてFR1部分と相同性を有する1セットのプライマーと3'末端においてマウスH鎖の定常領域(IGHC)と相同性を有する2種類のプライマーセットを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、該cDNAからマウス免疫グロブリンH鎖可変域DNAを単離した。プライマー配列は次のとおりであった。
VHセンス(シグナル部分:4セットプライマー)
このプライマーはCurrent Protocols in Immunology (John Wiley and Sons, Inc.), Unit 2.12 Cloning, Expression, and Modification of Antibody V RegionsのTable 2.12.2を参考にした。
配列番号56:5’-ATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT-3’(縮重度:32)
配列番号57:5’-ATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3’(縮重度:8)
配列番号58:5’-ATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3’
配列番号59:5’-ATGGRCAGRCTTACWTYY-3’(縮重度:32)
VHセンス(FR1部分)
このプライマーはTan等、“Superhumanized” Antibodies: Reduction of Immunogenic Potential by Complementarity-Determining Region Grafting with Human Germline Sequences: Application to an Anti-CD281, Journal of Immunology 169(2002)p1119-1125のセンスプライマーの塩基配列を改変してデザインした。
配列番号60:5’-SAGGTSMARCTKSAGSAGTCWGG-3’(縮重度:256)
VHアンチセンス(3,4に共通のアンチセンスプライマー)
マウスIgGすべてのアイソフォームとアニーリングできるように塩基配列を縮重してデザインした。
配列番号61:5’-CASCCCCATCDGTCTATCC-3’(縮重度:6)
発現プラスミドの作製:DNA Engine (Peltier Thermal Cycler,バイオラッド社)を用いたPCR法により抗CDH3マウスモノクローナル抗体L鎖、H鎖それぞれの可変領域を実施例10に示したプライマーを用いて増幅した。増幅したDNAフラグメントはサブクローニングベクターpGEM(プロメガ社)に組み込んで、このベクターのT7,SP6ユニバーサルプライマーで塩基配列を決定した。
遺伝子操作された抗体遺伝子をCHO細胞を用いて高レベルで発現させるために、CMVプロモーター配列に連結し、ポリAシグナルを有したジヒドロフォレートレダクターゼ(dhfr)遺伝子を組み込んだ発現ベクターを作製した。
CHO dhfr(-)細胞(G. Urlaubら、Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, p4216-4220, 1980)を用いて、2種類のプラスミド(アンピシリン耐性遺伝子内のPvuIでプラスミドを切断して環状プラスミドから線状プラスミドにした)すなわち、キメラ抗CDH3L鎖を発現するためのpCAGGS-IGK-CMV-dhfr-Aベクター、および、キメラ抗CDH3H鎖を発現するためのpCAGGS-IGH-CMV-dhfr-Aベクターにより同時形質転換した。エレクトロポレーションはロンザ社製のAmaxaでおこなった。DNA(L鎖、H鎖各プラスミドにつき0.002mg/試料)を3x10e3 細胞の0.1mLのAmaxaエレクトロポレーションCHO用緩衝液に加えてパルスを与えた。
遺伝子導入したCHO細胞の培養上清をELISAにより測定して、キメラ化抗体が生産されていることを確認した。キメラ抗体を検出するため、プレートをヤギ抗ヒトIgG(H+L)(マウス、ウサギ、ウシ、マウスIgGに対して吸収済み)(コスモバイオ:AQI, Cat.A-110UD)でコートした。ブロックした後、抗CDH3キメラ抗体産生CHO細胞からの培養上清を段階希釈し、各ウエルに加えた。プレートをインキュベーション、および洗浄後、ヤギ抗ヒトIgG(H+L)(マウス、ウサギ、ウシ、マウスIgGに対して吸収済み)-HRP(コスモバイオ:AQI, Cat. A-110PD)を加えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。さらにインキュベーションした後、反応を停止しそして450nmにおける吸光度を測定した。標準として精製ヒトIgGを用いた。
作製したキメラ化抗体の内在化能は、実施例6で示したものと同様の方法で行なった。但し、サポリン標識抗体はキメラ化抗体に対応するため、HumZAP(Advanced Targeting Systems社)を使用した。その結果、親抗体で示されていた内在化能はキメラ化後もそのまま保持していた。表1で示した親抗体の結果を併せ、キメラ化後の内在性試験結果を表3に示す。
DM1SMeは、米国特許第5,208,020号および6,333,410B1号に以前に記載されたように調製した(図12)。
(1)結合薬剤の還元処理
エタノール300μuLで溶解した0.78mgのDM1SMeと50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.5)180uL,TCEPsolution(Bond Breaker, サーモフィッシャーサイエンティフィック社)20uLを混合し、窒素雰囲気下、室温で30分以上、攪拌しながら反応させ、薬剤を還元した。
還元薬剤はHPLCを使用して精製した後に溶媒留去後、10mg/mLになるようにジメチルアセトアミドに溶解した。
1mg/mL抗ヒトCDH3キメラ化抗体にモル比30倍過剰となる量のsulfo-SMCC(サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を加え、30℃、1時間反応させた。
過剰な架橋剤を除くため、50mMリン酸カリウム、50mM NaCl、2mM EDTA(pH6.5)で平衡化した脱塩カラムで脱塩処理(ZebaSpinColumn,サーモフィッシャーサイエンティフィック社)した。
1mg/mLのマレイミド化した抗CDH3キメラ抗体と、結合したマレイミド基数の1.7倍に相当する還元薬剤とを50mMリン酸カリウム、50mMNaCl、2mMEDTA(pH6.5)中で、室温にて一晩反応させた。過剰な薬剤を除くため、HPLCを使用してゲルろ過を実施した。
抗体当たりの薬剤結合数は、252nm及び280nmの吸光度を測定する事で決定した。決定方法は非特許文献(Widdison,W.C.,Wilhelm,S.D.,Cavanagh,E.E.,et al. (2006) Semisynthetic maytansine analogues for the targeted treatment of cancer. J.Med.Chem.,49,4392-4408)に記載の吸光係数εAb280=223,000M-1cm-1, εAb252=82,510M-1cm-1, εDM1280=5,180M-1cm-1, εDM1252=26,160M-1cm-1を利用した。その結果、各抗体1分子辺り3~4個程度の薬剤が導入されていると見積もられた。測定結果を表4に示す。
薬剤結合抗体の細胞毒性と特異性はWST-8を発色基質とした細胞増殖測定試薬(同仁化学研究所社,Cell counting assay kit-8)を使用して評価した。
即ち、ヒトCDH3が高発現であると確認されているヒト乳がん細胞株HCC1954(ATCC CRL-2338)と薬剤結合抗体(ADC)あるいは薬剤を結合していない抗体(Naked)を任意の量共存させ、37度で3日間、、5%CO2環境下でインキュベートした。その後、細胞増殖測定試薬を添加放置後A450/620の吸光度を測定し、癌細胞株のみで抗体を加えないウェルより得られた吸光度の値を100%としたときの相対的な値を細胞生存率として表記した(図13)。
薬剤結合抗体のインビボでの腫瘍縮小効果を、乳がん細胞株HCC1954を移植したゼノグラフトモデルにて確認した。投与は、抗アシアロGM1抗体(WAKO 014-09801)を、大塚蒸留水1mLで溶解後、大塚生理食塩水4mLを加えて全量5mLとした後、この溶液を、マウス1匹あたり100uL腹腔内投与。HCC1954は10%FBS含有RPMI1640培地を用いて培養し、SCIDマウス(メス、日本クレア)の右腹側部皮下に5x106個/マウスになるように移植した。
インビボ試験は各群5匹とし、15mg/kgを尾静脈より投与した。投与は平均腫瘍径が100-150mm3となった時点で開始し、1週間後に更に同量、計2回行なった。
腫瘍サイズの推移を図15に示す。
Claims (24)
- カドヘリンのカドヘリンドメイン1(EC1)を認識し、かつ高い内在化能を示す抗カドヘリン抗体。
- カドヘリンがPカドヘリンである、請求項1に記載の抗体。
- PカドヘリンまたはPカドヘリンを発現している細胞を免疫原として投与した免疫動物から取得した抗体産生細胞が産生する抗体である、請求項1又は2に記載の抗体。
- Pカドヘリンが全長、あるいは細胞外領域のみを発現させた可溶型Pカドヘリン、またはその断片である、請求項3に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項1から4の何れかに記載の抗体。
- モノクローナル抗体が、キメラ化抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項5に記載の抗体。
- 受託番号NITE BP-988、NITE BP-1145、NITE BP-1147又はNITE BP-1148を有する細胞が産生するモノクローナル抗体。
- 請求項7に記載のモノクローナル抗体を改変して作られたキメラ化抗体又はヒト化抗体。
- 請求項7に記載のモノクローナル抗体のVH及び/またはVLドメインのアミノ酸配列と90%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるVH及び/またはVLドメインを有する抗体またはその断片。
- 抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖抗体(scFv)
、二量体化V領域(Diabody)、ジスルフィド安定化V領域(dsFv)およびCDRを含むペプチドからなる群から選ばれる抗体断片である、請求項1から9のいずれか1項に記載の抗体。 - 請求項5から10の何れか1項に記載の抗体を産生する細胞株。
- 受託番号NITE BP-988、NITE BP-1145、NITE BP-1147又はNITE BP-1148を有する細胞株。
- 請求項1から10の何れかに記載の抗体を含む、細胞傷害剤。
- 上記抗体に、細胞傷害性物質が結合している、請求項13に記載の細胞傷害剤。
- 細胞傷害性物質が薬剤、トキシン、又は放射性物質である、請求項14に記載の細胞傷害剤。
- 細胞傷害性物質が、メイタンシノイド又はその誘導体あるいはアウリスタチン又はその誘導体から選択される薬剤である、請求項15に記載の細胞傷害剤。
- 細胞傷害性物質が、DM1、DM3又はDM4から選択されるメイタンシノイド誘導体、またはMMAE又はMMAFから選択されるアウリスタチン誘導体である、請求項16に記載の細胞傷害剤。
- 抗体と細胞傷害性物質とがリンカーにより連結している、請求項14から17のいずれか1項に記載の細胞傷害剤。
- リンカーが、2価反応性架橋試薬である、請求項18に記載の細胞傷害剤。
- リンカーが、スルフォスクシイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート (Sulfo-SMCC)、N-スクシンイミジル4-(マレイミドメチル)シクロヘキサンカルボキシレート(SMCC)、N-スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシ-(6-アミドカプロエート)(LC-SMCC)、rc-マレイミドウンデカン酸N-スクシンイミジルエステル(KMUA)、γ-マレイミド酪酸N-スクシンイミジルエステル(GMBS)、ε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(EMCS)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、N-(α-マレイミドアセトキシ)-スクシンイミドエステル(AMAS)、スクシンイミジル-6-(β-マレイミドプロピオンアミド)ヘキサノエート(SMPH)、N-スクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル)-ブチレート(SMPB)、およびN-(p-マレイミドフェニル)イソシアネート(PMPI)、6-マレイミドカプロイル(MC)、マレイミドプロパノイル(MP)、p-アミノベンジルオキシカルボンイル(PAB)、N-スクシンイミジル4(2-ピリジルチオ)ペンタノエート(SPP)及びN-スクシンイミジル(4-イオドーアセチル)アミノ安息香酸エステル(SIAB)、バリン-シトルリン(val-cit)、アラニン-フェニルアラニン(ala-phe)から成る群より選択される、請求項18又は19に記載の細胞傷害剤。
- 抗体1分子あたり1~10個のDM1がリンカーを介して結合している、請求項19又は20に記載の細胞傷害剤。
- 請求項13から21のいずれか1項に記載の細胞傷害剤を有効成分として含有する医薬組成物。
- 請求項13から21のいずれか1項に記載の細胞傷害剤を有効成分として含有するヒトCDH3高発現疾患の治療薬。
- ヒトCDH3高発現疾患が癌である、請求項23に記載の治療薬。
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