WO2012057253A1 - 蛍光シリコンナノ粒子及びその製造方法 - Google Patents

蛍光シリコンナノ粒子及びその製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2012057253A1
WO2012057253A1 PCT/JP2011/074781 JP2011074781W WO2012057253A1 WO 2012057253 A1 WO2012057253 A1 WO 2012057253A1 JP 2011074781 W JP2011074781 W JP 2011074781W WO 2012057253 A1 WO2012057253 A1 WO 2012057253A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
silicon
silicon nanoparticles
modified
nanoparticles
gas
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/074781
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
晋 稲澤
由岐夫 山口
鵬 沈
誠一 太田
Original Assignee
国立大学法人 東京大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人 東京大学 filed Critical 国立大学法人 東京大学
Priority to JP2012540928A priority Critical patent/JPWO2012057253A1/ja
Publication of WO2012057253A1 publication Critical patent/WO2012057253A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B33/00—Silicon; Compounds thereof
    • C01B33/02—Silicon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B33/00—Silicon; Compounds thereof
    • C01B33/02—Silicon
    • C01B33/021—Preparation
    • C01B33/027—Preparation by decomposition or reduction of gaseous or vaporised silicon compounds other than silica or silica-containing material
    • C01B33/035—Preparation by decomposition or reduction of gaseous or vaporised silicon compounds other than silica or silica-containing material by decomposition or reduction of gaseous or vaporised silicon compounds in the presence of heated filaments of silicon, carbon or a refractory metal, e.g. tantalum or tungsten, or in the presence of heated silicon rods on which the formed silicon is deposited, a silicon rod being obtained, e.g. Siemens process

Definitions

  • the present invention relates to chemically modified silicon nanoparticles that exhibit extremely stable fluorescence properties and allow site-selective cell staining.
  • the present invention also relates to a method for obtaining silicon nanoparticles having a chemically modified surface, silicon nanoparticles used in the method, and a method for producing the silicon nanoparticles.
  • silicon nanoparticles have been studied as a low-toxic fluorescent probe instead of a dye molecule, but conventional silicon nanoparticle production techniques have a problem in productivity.
  • fluorescence characteristics are poor in stability and there is a problem that the fluorescence intensity is lowered by long-term storage or ultraviolet irradiation
  • alkyl organics and siloxanes are used to stabilize the fluorescence characteristics of silicon nanoparticles.
  • surface modification is required, and the manufacturing method is complicated.
  • an object of the present invention is to provide silicon nanoparticles that are excellent in light stability and impart site-selective cell staining ability.
  • the present inventors can not only achieve dispersion in water by chemically modifying the surface of silicon nanoparticles with a specific compound, The present inventors have found that the fluorescence characteristics are very excellent, and in addition, it is possible to perform site-selective cell staining of silicon nanoparticles with surface-modified species that could not be predicted by conventional knowledge.
  • the present inventors have found that silicon nanoparticles prepared by a method using gas phase plasma using a silicon compound as a raw material as a synthesis field itself have stable fluorescence characteristics, and the surface of this is chemically treated. It has been found that the fluorescence properties are further improved by the treatment.
  • the present invention (1) Silicon nanoparticles whose surface is modified, wherein the silicon nanoparticles are chemically modified with a surface-modifying species, (2) The surface-modified silicon according to (1), wherein the surface modification species is selected from the group consisting of a block copolymer having an amphiphilic functional group, an amine molecule, a compound having a carboxyl group, and a salt thereof.
  • Nanoparticles (3) The surface-modified silicon according to (1) or (2), wherein the silicon nanoparticles are prepared by a method using a gas of a silicon compound as a raw material and gas phase plasma as a synthesis field Nanoparticles, (4) Silicon nanoparticles are The method includes a step of introducing a silicon compound, argon gas, and hydrogen gas into a plasma chamber, and a step of generating a plasma by generating a plasma by applying a predetermined frequency in the plasma chamber.
  • the present invention also provides: (11) A method for producing silicon nanoparticles, using a gas of a silicon compound as a raw material and using gas phase plasma as a synthesis field, (12) including a step of introducing a silicon compound, argon gas, and hydrogen gas into the plasma chamber, and a step of generating a plasma by generating a plasma by applying a predetermined frequency in the plasma chamber. (11) The method described in (13) The method according to (12), wherein the total pressure of the silicon compound gas, argon gas, and hydrogen gas in the plasma chamber is 1.0 to 10.0 Torr, (14) The method according to (12) or (13), wherein the partial pressure of the silicon compound gas in the plasma chamber is 3.3 ⁇ 10 ⁇ 3 to 7.5 Torr.
  • Described method (19) The method according to any one of (12) to (18), wherein the frequency is 13.56 MHz.
  • a surface modification species selected from the group consisting of a compound having a carboxyl group and a salt thereof, Involved.
  • a method for producing silicon nanoparticles exhibiting excellent fluorescence characteristics in a single step is provided. Can do. According to the experiments by the present inventors, even when the dispersion of silicon nanoparticles produced by the method of the present invention is stored in the air for more than half a year, it maintains an intensity of 80% or more of the initial fluorescence intensity. Even after irradiation with ultraviolet rays for 3 hours or more, the intensity of 80% or more of the initial fluorescence intensity was exhibited.
  • the remarkable fluorescence quenching phenomenon under the light irradiation seen in the dye molecule was not observed, and the fluorescence was stably displayed for a long time. Therefore, according to the present invention, it is possible to provide a fluorescent probe that does not quench for a long time. Further, in the present invention, by changing the synthesis conditions of silicon nanoparticles, it is possible to obtain silicon nanoparticles that emit fluorescent colors in the entire visible light region from blue to red. Unlike conventional dye molecules, It is possible to produce a full-color fluorescent probe from the material, which is also useful in that the fluorescence wavelength during cell observation can be changed.
  • the site selection selectively stains specific organelles in cells.
  • Conventionally used fluorescent dye molecules have the same function, but in addition to this, the fluorescence fading seen with dye molecules hardly occurs in silicon nanoparticles.
  • the fluorescent silicon nanoparticles of the present invention can be used as a fluorescent probe for observing specific organelles over a long period of time, which has been a problem with fluorescent dye molecules.
  • the surface-modified silicon nanoparticles of the present invention can be used as fluorescent detectors for DNA fragments, antigen-antibody reactions, cancer marker labels, etc. by binding organic compounds capable of binding to biological substances to the surface-modified species. Can do.
  • (1) Chemical modification of the surface of silicon nanoparticles can be realized by subjecting the surface of silicon nanoparticles to chemical modification treatment.
  • the surface-modifying species that can be used in the present invention include polar functional groups having strong interaction with water, such as carboxyl group, hydroxyl group, amino group, allylamino group, cyano group, sulfone group, amide group, imide group, and sulfate ester. Examples thereof include a compound having a group or the like or a salt thereof, and sugars, peptides and the like containing these functional groups.
  • an amphiphilic surfactant can also be used as the surface modification species, and examples thereof include BRIJ, Igepal (registered trademark), TX-100 and the like.
  • a block copolymer having an amphiphilic functional group can also be used.
  • Pluronic P123, F-127, or a block copolymer of a styrene monomer and an acrylic acid monomer is preferably used.
  • dispersibility in water can only be obtained by using an amine molecule such as allylamine, a compound having a carboxyl group or a salt thereof, and a block copolymer having an amphiphilic functional group among the above surface-modified species.
  • an amine molecule such as allylamine, a compound having a carboxyl group or a salt thereof, and a block copolymer having an amphiphilic functional group among the above surface-modified species.
  • site-selective cell staining of silicon nanoparticles with surface-modified species is possible, which is preferable.
  • the surface of the silicon nanoparticles can be chemically modified by a known method. For example, it can be carried out by stirring an amphiphilic block copolymer solution and a dispersion solution of silicon nanoparticles for an appropriate time at room temperature.
  • silicon nanoparticles whose surface is chemically modified (hereinafter also referred to as “surface-modified silicon nanoparticles”) can be obtained.
  • the surface modification species may be covalently bonded, intermolecularly bonded, ionic bonded, or hydrogen bonded to the surface of the silicon nanoparticles, or a combination thereof. May be.
  • the surface of the silicon nanoparticles may be coated with a surface-modified species in a form that does not involve bonding, such as a hydrophilic / hydrophobic interaction.
  • the surface-modified silicon nanoparticles can be obtained by etching the silicon nanoparticles and then chemically modifying the surface.
  • any silicon nanoparticles can be used.
  • Such silicon nanoparticles can be obtained by the following production method.
  • silane (silicon hydride) or halogen-containing silicon compound can be used as the silicon compound.
  • halogen-containing silicon compound examples include silane trichloride, silicon tetrachloride, silicon tetrabromide, and silicon tetraiodide.
  • silane or silane trichloride when used as the silicon compound, since these compounds are gases at room temperature, they can be used together with a carrier gas or alone in a place (plasma field) for generating plasma such as a plasma chamber. Can be introduced.
  • silicon tetrachloride or silicon tetrabromide when used as the silicon compound in the method of the present invention, these compounds are liquid at room temperature, so the liquid is pre-gasified and introduced into the plasma field together with the carrier gas. Alternatively, the liquid may be bubbled through the carrier gas and introduced into the plasma field together with the carrier gas, but the latter can be performed more easily.
  • silicon tetraiodide when used as the silicon compound, it is solid at room temperature, so it is heated and gasified in advance and introduced into the plasma field together with the carrier gas or heated to liquid. And can be bubbled through the carrier gas and introduced into the plasma field along with the carrier gas.
  • a carrier gas that can be used in the method of the present invention is argon gas.
  • hydrogen gas is also introduced into the plasma field as a reducing agent.
  • Hydrogen gas can be introduced into the plasma field separately from the silicon compound, but can also be introduced into the plasma field together with the silicon compound and the carrier gas.
  • silicon tetrachloride, silicon tetrabromide, or silicon tetraiodide is used as the silicon compound, a carrier gas and hydrogen gas can be passed through the compound in the liquid state and introduced together into the plasma field.
  • a plasma chamber can generally be used as an apparatus for generating plasma.
  • RF capacitively coupled horizontal electrode discharge plasma is preferably used.
  • upper and lower electrodes are horizontally disposed in a vacuum chamber, and source gas is supplied from a shower head portion of the upper electrode.
  • the lower electrode is a temperature-controllable substrate and can control the reaction temperature.
  • the plasma power density in the plasma chamber is usually set to 0.1 to 2.5 W / cm 2 .
  • the temperature of the electrode is usually set to room temperature for the upper electrode and from room temperature to 600 ° C. for the lower electrode.
  • the frequency although the frequency normally used with a high frequency induction thermal plasma can be used, Preferably the frequency of 13.56 MHz is used.
  • the flow rate at which the silicon compound is introduced into the plasma chamber is generally 1 to 30 sccm (standard cubic centimeter / minute), preferably 1 to 3 sccm.
  • the total flow rate for introducing argon gas into the plasma field is usually in the range of 40 to 300 sccm, preferably 115 to 155 sccm.
  • the flow rate for introducing hydrogen gas into the plasma chamber is usually 20 sccm.
  • the total pressure of silicon compound gas, argon gas and hydrogen gas in the plasma chamber is generally 1.0 to 10.0 Torr, preferably 2.5 to 5.0 Torr, more preferably 2.5. Controlled to ⁇ 3.5 Torr.
  • the reaction time is preferably 3 to 30 minutes.
  • the partial pressure of the silicon compound gas in the plasma chamber is generally 3.3 ⁇ 10 ⁇ 3 to 7.5 Torr, preferably 1.6 ⁇ 10 ⁇ 2 to 0.13 Torr, more preferably Is controlled in the range of 1.6 ⁇ 10 ⁇ 2 to 9.1 ⁇ 10 ⁇ 2 Torr.
  • a filter may be provided between the vacuum chamber and the exhaust gas pipe and collected on the filter.
  • a PTFE filter is preferably used as the filter.
  • a cold trap can be installed at the outlet of the vacuum chamber in order to collect the generated silicon nanoparticles.
  • Liquid nitrogen is preferably used as a cold trap cooling medium.
  • the silicon nanoparticles produced by the method of the present invention exhibit excellent fluorescence characteristics. Specifically, it maintains an intensity of 80% or more of the initial fluorescence intensity even when stored in the air for more than half a year, and an intensity of 80% or more of the initial fluorescence intensity even after irradiation with ultraviolet rays for 3 hours or more. Indicates.
  • the surface-modified silicon nanoparticles can be obtained by chemically modifying the surface of the silicon nanoparticles themselves produced by the method of the present invention. Further, the silicon nanoparticles can be etched by the method described below, and then the surface of the silicon nanoparticles can be chemically modified.
  • Etching of silicon nanoparticles The silicon nanoparticles produced by the method of the present invention can be optionally etched. This can increase the fluorescence intensity. Etching can be performed using hydrogen fluoride or a mixed acid of hydrogen fluoride and nitric acid. Etching can be performed by dispersing the silicon nanoparticles of the present invention in an alcohol such as ethanol or an organic solvent such as toluene and directly adding hydrogen fluoride or the like to the dispersion.
  • the amount of hydrogen fluoride or the like to be added is at least 1 time, preferably at least 10 times the stoichiometric amount of hydrogen fluoride with respect to silicon nanoparticles (assuming that all the existing powder is made of SiO 2 ).
  • the silicon nanoparticles of the present invention are excellent in fluorescence stability, they should be suitably used as a fluorescent probe for staining biological tissues, cells, subcellular organelles, etc. Can do.
  • Any of the silicon nanoparticles themselves obtained by the production method of the present invention, those obtained by etching the silicon nanoparticles, and those obtained by chemically modifying the surface of the silicon nanoparticles or the silicon nanoparticles subjected to the etching treatment It can be used as a fluorescent probe for staining (hereinafter referred to as “the silicon nanoparticle of the present invention”), and further, site-selective staining is also possible.
  • the fluorescent probe for staining using the silicon nanoparticles of the present invention is usually used as a staining solution in which the silicon nanoparticles of the present invention are dispersed in an organic solvent such as dimethyl sulfoxide (DMSO) or water.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the fluorescent probe for staining of the present invention can be used for any tissue or cell that has been immobilized and subjected to a cell membrane permeabilization treatment, or a living tissue or cell.
  • a known method for permeabilization and immobilization of cells and tissues.
  • a commercially available confocal microscope and fluorescent microscope can be used to observe cells and tissues stained with the fluorescent probe for staining of the present invention.
  • a semiconductor laser (405 nm) is generally used in the case of a confocal microscope, and an ultraviolet ray (365 nm) is generally used in the case of a fluorescence microscope.
  • Another embodiment of the present invention is a surface-modified silicon nanoparticle in which an organic compound capable of binding to a biological substance is bound to a surface-modified species.
  • Organic compounds that can bind to biological substances include substances that undergo antigen-antibody reaction with biological substances, substances that bind to avidinized biological substances via an avidin-biotin bond, and specific functional groups contained in biological substances.
  • Various substances such as substances that are coupled by coupling are included. Examples include, but are not limited to, avidin, streptavidin, neutroavidin, biotin, albumin, glutaraldehyde.
  • an organic compound capable of binding to a biological substance may be directly bonded to the surface-modified species, or may be bonded via a crosslinking agent and / or a coupling agent.
  • crosslinking agent and coupling agent include glutaraldehyde, EDC (1-ethyl-3- [3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride) / sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide), and the like.
  • surface-modified silicon nanoparticles in which glutaraldehyde is bound to surface-modified species surface-modified silicon nanoparticles in which glutaraldehyde is bound to surface-modified species
  • organic compounds that can bind to biological substances such as avidin are bound to glutaraldehyde
  • biological materials include antibodies, proteins, and nucleic acids, and those biotinylated on these biological materials are also included.
  • the silicon nanoparticle is treated with allylamine to introduce an amino group on the surface of the silicon nanoparticle, By reacting this with glutaraldehyde and further reacting with streptavidin, silicon nanoparticles whose surface is modified with streptavidin can be obtained.
  • the avidin family consisting of streptavidin, avidin, and neutroavidin can selectively bind to biotin, and can be used to label DNA fragments, antibodies, and cancer markers with biotin.
  • the obtained silicon nanoparticles can be used as a fluorescence detector such as an antigen-antibody reaction. Moreover, it can also be used as a fluorescence detector for antigen-antibody reaction by binding a biotinylated antibody to silicon nanoparticles modified with the avidin family and further binding a secondary antibody by another antigen-antibody reaction.
  • TEM Transmission electron microscope
  • EDS energy dispersive X-ray spectrometer
  • Fluorescence / absorption spectrum For measurement of fluorescence, photoluminescence (PL) excitation (PLE) and quantum efficiency, UV-vis-NIR spectrometer (Hitachi U-4100) and fluorescence spectrometer (JASCO Corporation) Company FP-6500) was used.
  • quantum efficiency a reference compound R6G having a known quantum efficiency (95%) was dispersed in ethanol.
  • PL lifetime was obtained by measuring frequency-domain phase modulation using a FluorologTau-3 lifetime system (Jobin Yvon Horiba).
  • Ludox registered trademark
  • TMA Aldrich, containing 34% by weight of colloidal silica
  • the staining solution (silicon nanoparticle dispersion) was diluted 5-fold with PBS and then incubated with the cells at room temperature for 1 hour for staining.
  • the staining solution (silicon nanoparticle dispersion) is diluted 5-fold with a medium and then incubated with the cells in an incubator (37 ° C., 5% CO 2 ) for 6 hours to stain the cells. went.
  • Observation of stained cells A confocal microscope (Leica TCS-SP2) was used for observation of stained cells. A fluorescence image was observed at a wavelength of 430 to 700 nm using blue light having an excitation wavelength of 405 nm.
  • silicon nanoparticles are synthesized from RF (13.56 MHz high frequency) capacitively coupled horizontal electrode discharge plasma.
  • Example 1 (1) Synthesis Procedure Silicon nanoparticles were synthesized by the following procedure using the silicon nanoparticle production apparatus shown in FIG. A stainless steel pressure vessel was filled with 250 ml of liquid silicon tetrabromide (purchased from Sigma-Aldrich, purity: 99.995%). Argon gas is passed through liquid silicon tetrabromide in the vessel, and hydrogen gas as a reducing agent is introduced into the plasma chamber from another gas line, and a precursor consisting of silicon tetrabromide, argon gas and hydrogen gas is introduced into the plasma chamber.
  • liquid silicon tetrabromide purchased from Sigma-Aldrich, purity: 99.995%
  • the plasma power density was fixed at 1.25 W / cm 2 .
  • the flow rate of silicon tetrabromide was 1-3 sccm (standard cubic centimeter / minute) calculated using the saturated vapor pressure of silicon tetrabromide at the reactor control temperature (generally 50 ° C.). During the synthesis, the temperature of the lower electrode was maintained at 400 ° C.
  • the flow rate of hydrogen gas was set to 20 sccm, and the total flow rate of argon gas was in the range of 115 to 155 sccm.
  • the total pressure of silicon tetrabromide gas, argon gas, and hydrogen gas in the plasma chamber was controlled at 3 Torr. The reaction time was 3 minutes.
  • the formed silicon nanoparticles were collected by a PTFE filter (Millipore) having a pore diameter of 10 ⁇ m provided between the plasma chamber and the exhaust gas pipe.
  • the collection rate of the produced particles by the PTFE filter was 0.2 to 0.7 mg / min. From this, the yield of the particles was estimated to be about 18%.
  • the collected particles were transferred from the filter into ethanol. As a result, a nanoparticle suspension (dispersion solution) that was transparent and colorless under natural light was obtained.
  • FIG. 4 shows the change in fluorescence intensity (integrated PL area) after the ethanol dispersion of silicon nanoparticles is irradiated with ultraviolet rays. From this figure, it can be seen that the synthesized silicon nanoparticles show an intensity of 80% or more of the initial fluorescence intensity even after 180 minutes of ultraviolet irradiation.
  • Example 2 Synthesis of silicon nanoparticles with varying total pressure
  • the total pressure of silicon tetrabromide gas, argon gas and hydrogen gas in the plasma chamber is 3.5, 3.2, 2.8, 2.2 Torr and 2.0 Torr or less. Except for the control, the silicon nanoparticles were synthesized under the same conditions as in Example 1 to obtain an ethanol dispersion thereof. (Each sample is referred to as Examples 2-1 to 2-5.)
  • an ethanol dispersion solution of silicon nanoparticles was irradiated with ultraviolet light at 365 nm, the solution exhibited the following luminescence according to the total pressure during synthesis.
  • the PL spectrum of each sample is shown in FIG. However, when controlled at a total pressure of 2.0 Torr or less, visible PL is not observed immediately after synthesis, and red light emission can be confirmed by etching with a mixed acid of hydrogen fluoride / nitric acid.
  • Example 3 Synthesis of silicon nanoparticles using a cold trap
  • a manufacturing apparatus in which a cold trap is installed is used. Got ready. The outline is shown in FIG. Liquid nitrogen was used as the cooling medium.
  • silicon nanoparticles were synthesized under the same conditions as in Example 1. As a result, silicon nanoparticles were collected in argon and hydrogen bromide liquefied and solidified by cooling with liquid nitrogen in the cold trap. When the trap containing liquid nitrogen was removed and the evaporated argon was gradually removed from the exhaust pipe, silicon nanoparticles were collected around the bottom of the trap. The yield of the produced particles was 80%.
  • Example 4 Etching treatment of silicon nanoparticles
  • the silicon nanoparticles obtained in Example 1 were etched. 0.2 mg of silicon nanoparticles were placed in a PTFE container, and 2 ml of ethanol was added thereto to obtain an ethanol dispersion solution, and 6 ⁇ l of hydrogen fluoride was directly added to the solution.
  • the amount of hydrogen fluoride added corresponds to at least 10 times the stoichiometric amount of hydrogen fluoride relative to silicon nanoparticles (assuming that all the powder present consists of SiO 2 ).
  • FIG. 7 shows a TEM image and a particle size distribution graph of silicon nanoparticles before and after etching with hydrogen fluoride.
  • FIG. 7 shows a TEM image and a particle size distribution graph of silicon nanoparticles before and after etching with hydrogen fluoride.
  • FIG. 8 shows a graph showing changes in the absorption spectrum and the PL spectrum before and after etching.
  • FIG. 7 shows that the particle size of silicon nanoparticles is reduced as a whole by etching
  • FIG. 8 shows that the fluorescence intensity is increased by etching.
  • FIG. 9 shows TEM images before and after modification of the surface of the silicon nanoparticle with the block copolymer (F-127). Moreover, the particle size distribution in the solution before the modification of the silicon nanoparticle surface and after the modification (the solvent before modification is ethanol and the solvent after modification is pure water) is shown in FIG. FIG.
  • FIG. 10 shows that the dispersion and aggregation properties in the solution are controlled by chemically modifying the surface of the silicon nanoparticles.
  • FIG. 11 is a graph showing changes in absorption spectra and PL spectra before and after modification of the surface of silicon nanoparticles with a block copolymer (F-127). From FIG. 11, it can be confirmed that the quantum efficiency is improved by about 3 times from about 15% to 43% by chemically modifying the surface of the silicon nanoparticles.
  • FIG. 12 shows changes in fluorescence intensity (integrated PL area) after the surface-modified silicon nanoparticles A are dispersed in water with ultraviolet rays. From this figure, it can be seen that the surface-modified silicon nanoparticles of the present invention show an intensity of 80% or more with respect to the initial fluorescence intensity even after irradiation with ultraviolet rays for 180 minutes.
  • Example 6 Surface modification of silicon nanoparticles with allylamine-1 After etching 50 mg of silicon nanoparticles obtained in Example 4, a solution dispersed in 8 ml of ethanol was prepared. To this solution, H 2 PtCl 6 ⁇ 6H 2 O10ml of 0.05 M, was added allylamine (3-amino-propene) 0.2 ml, was allowed to react for 12 hours at 70 ° C.. Thereafter, ethanol as a solvent was evaporated, and 8 ml of pure water was added to disperse the particles, thereby obtaining silicon nanoparticles surface-modified with allylamine (surface-modified silicon nanoparticles B).
  • Example 7 (1) Surface modification of silicon nanoparticles with block copolymer (PS-b-PAA)
  • PS-b-PAA block copolymer represented by the following formula consisting of polystyrene monomer and acrylic acid monomer is prepared did.
  • X 54 to 65
  • y 26 to 32, weight average molecular weight: 7470 to 9130
  • etching 50 mg of the silicon nanoparticles obtained in Example 4 a solution dispersed in 9.0 ml of THF was prepared.
  • a solution in which 50 mg of block copolymer (PS-b-PAA) was dissolved in 9.0 ml of THF was prepared.
  • FIG. 14 is a graph showing the PL spectrum of the surface-modified silicon nanoparticles C. Since PS-b-PAA itself has fluorescence around 405 nm, it is shown in a form overlapping with the fluorescence of silicon nanoparticles.
  • Example 8 Surface modification of silicon nanoparticles with block copolymer-2
  • the silicon nanoparticles obtained in Example 3 were subjected to chemical modification of the particle surface with a block copolymer without etching with hydrogen fluoride.
  • silicon nanoparticles (surface-modified silicon nanoparticles D) surface-modified with a block copolymer (F-127) were obtained.
  • Example 9 Surface modification of silicon nanoparticles with allylamine-2
  • the silicon nanoparticles obtained in Example 3 were chemically modified on the particle surface with allylamine without etching with hydrogen fluoride. According to the procedure described in Example 6, silicon nanoparticles surface-modified with allylamine (surface-modified silicon nanoparticles E) were obtained.
  • Fluorescent probe for staining using surface-modified silicon nanoparticles Observation of immobilized cells (1)
  • Cell staining A staining solution A was prepared by dispersing 15 mg of the surface-modified silicon nanoparticles A obtained in Example 5 in 10 ml of pure water.
  • Staining solution B was prepared by dispersing 15 mg of the surface-modified silicon nanoparticles B obtained in Example 6 in 10 ml of pure water.
  • Normal human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were fixed with 3.7% formaldehyde for 10 minutes, and then subjected to cell membrane permeabilization for 5 minutes with 0.1% Triton X-100.
  • FIG. 15 shows the results of observation with a confocal microscope of cells stained with staining solutions A and B.
  • a transmission image is shown on the left side of FIG. 15, a fluorescence image is shown in the middle, and an image obtained by superimposing the transmission image and the fluorescence image is shown on the right side.
  • the surface-modified silicon nanoparticle B (allylamine-modified) selectively stains the cell nucleus
  • the surface-modified silicon nanoparticle A block copolymer (F-127) modified
  • Example 11 Observation of live cells (1) Site-selective cell staining with surface-modified species Staining solution C was prepared by dispersing 15 mg of surface-modified silicon nanoparticles C obtained in Example 7 in 10 ml of pure water. For normal human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), living cells that were not subjected to cell membrane permeabilization treatment were stained using the staining solutions A and B and staining solution C used in Example 10. The results of observation with a confocal microscope for the stained cells are shown in FIG. 16-1. 16A shows a transmission image on the left side, a fluorescence image in the middle, and a superposition of the transmission image and the fluorescence image on the right side.
  • VEC normal human umbilical vein endothelial cells
  • FIG. 16-2 An enlarged view of the fluorescence image is shown in FIG. 16-2. From these figures, it is shown that the surface-modified silicon nanoparticles B selectively stain lysosomes and the surface-modified silicon nanoparticles A selectively stain the endoplasmic reticulum. Moreover, the result of having observed with the confocal microscope about the cell dye
  • PS-b-PAA modification are selectively stained for lysosomes.
  • Example 12 Evaluation of fluorescence stability About the vascular endothelial cell after the cell membrane permeabilization treatment used in Example 10, a fluorescent dye (Texas Red-phalloidin (compound in which Texas Red (dye) and phalloidin were combined)) and staining solution B were used. Stained. The stained cells were observed with a confocal microscope, and the change of the image with the excitation light irradiation time is shown in FIG. The left side of FIG. 19 shows a fluorescence image immediately after observation (excitation light irradiation 0 minutes), the middle shows a fluorescence image 3 minutes after excitation light irradiation, and the right side shows a fluorescence image 6 minutes after excitation light irradiation.
  • a fluorescent dye Texas Red-phalloidin (compound in which Texas Red (dye) and phalloidin were combined)
  • staining solution B were used. Stained. The stained cells were observed with a confocal microscope, and the change of the image
  • the image immediately after observation shows that the fluorescent dye selectively stains the actin filaments, and the surface-modified silicon nanoparticles B selectively stain the nuclei. Then, as the excitation light irradiation time elapses, the image of the fluorescent dye gradually fades, and the fluorescence fades almost 6 minutes after irradiation. In contrast, it can be seen that the fluorescence intensity of the surface-modified silicon nanoparticles B hardly fades.
  • FIG. 20A shows a fluorescent image of a gold wire treated with a dispersion of surface-modified silicon nanoparticles F
  • FIG. 20B shows a fluorescent image of a gold wire treated with a dispersion of surface-modified silicon nanoparticles F
  • 20B shows silicon nanoparticles that are not surface-modified with streptavidin (surface-modified silicon nanoparticles B
  • immobilized the biotin processed by the dispersion liquid of) is shown. From (a), since fluorescence derived from silicon nanoparticles is observed along the shape of the gold wire, it is confirmed that the gold wire is coated with the silicon nanoparticles by the streptavidin-biotin bond. On the other hand, when the surface-modified silicon nanoparticles B modified only with allylamine are used, it is confirmed that the gold wire is not covered with the silicon nanoparticles.
  • a method for producing silicon nanoparticles exhibiting excellent fluorescence characteristics is provided.
  • the dispersion of silicon nanoparticles produced by the method of the present invention maintains high fluorescence intensity even after being stored in air for more than half a year, and exhibits high fluorescence intensity even after irradiation with ultraviolet rays for 3 hours or more.
  • silicon nanoparticles that emit fluorescent colors in the entire visible light region from blue to red (purple) can be obtained.
  • red red
  • the silicon nanoparticles and surface-modified silicon nanoparticles produced by the method of the present invention can be used as fluorescent probes for observing specific organelles over a long period of time, which has been a problem in fluorescent dye molecules. .
  • the surface-modified silicon nanoparticles of the present invention can be used as fluorescent detectors for DNA fragments, antigen-antibody reactions, cancer marker labels, etc. by binding organic compounds capable of binding to biological substances to the surface-modified species. Can do.

Abstract

　光安定性に優れ、部位選択的な細胞染色を可能にする、表面を化学的に修飾したシリコンナノ粒子を提供すること。シリコンナノ粒子の表面を特定の化合物で化学的に修飾することにより、水への分散を実現し、蛍光特性が非常に優れ、加えて、従来の知見では全く予想できなかった表面修飾種によるシリコンナノ粒子の部位選択的な細胞染色を可能とする。

Description

蛍光シリコンナノ粒子及びその製造方法
　本発明は、極めて安定な蛍光特性を示し、部位選択的な細胞染色を可能にする、表面を化学的に修飾したシリコンナノ粒子に関わる。また、本発明は、表面を化学的に修飾したシリコンナノ粒子を得るための方法、当該方法に用いるシリコンナノ粒子、及び当該シリコンナノ粒子を製造する方法に関わる。
従来技術
　細胞内の特定の小器官を部位選択的に染色する技術は、分子生物学上の観察、測定を行う上で、極めて重要な技術であり、現在は色素分子を用いた染色が主流である。しかしながら、色素分子の蛍光退色は早く、観察の途中で蛍光が消光するため、長時間の観察が困難であるという問題がある。従って、蛍光が消光しない光安定性に優れた部位選択的な細胞染色を行う技術が要望されている。
　また、色素分子に代わる低毒性の蛍光プローブとしてシリコンナノ粒子が検討されているが、従来のシリコンナノ粒子の製造技術は生産性に問題があった。また、蛍光特性も安定性に乏しく、長時間の貯蔵または紫外線照射により蛍光強度が下がるという問題もあったことから、従来技術においては、シリコンナノ粒子の蛍光特性の安定化のためアルキル有機物やシロキサン等で表面改質が必要とされ、製造方法として煩雑なものとなっていた。更に、従来技術によるシリコンナノ粒子は部位選択的な細胞染色を行うことが困難であった。従って、蛍光プローブとして色素分子に代えてシリコンナノ粒子を使用するためには、安定な蛍光特性を示すシリコンナノ粒子を簡便に製造する技術を確立することが不可欠である。
国際公開第２０１０／００４７７４号
　長時間にわたる細胞観察には、光安定性に優れ、部位選択的な細胞染色を可能とする蛍光プローブを開発することが必要である。本発明は、従来の色素蛍光プローブの問題に鑑み、光安定性に優れ、部位選択的な細胞染色能を付与するシリコンナノ粒子を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、シリコンナノ粒子の表面を特定の化合物で化学的に修飾することにより、水への分散を実現できるのみならず、蛍光特性が非常に優れ、加えて、従来の知見では全く予想できなかった表面修飾種によるシリコンナノ粒子の部位選択的な細胞染色が可能となることを見出した。また、本発明者らは、ケイ素化合物を原料とした気相プラズマを合成場として用いる方法により調製されるシリコンナノ粒子がそれ自体安定な蛍光特性を有しており、このものの表面を化学的に処理すると蛍光特性が更に向上することを見出した。
　即ち、本発明は、
（１）シリコンナノ粒子が表面修飾種により化学的修飾がされてなる、表面が修飾されたシリコンナノ粒子、
（２）表面修飾種が、両親媒性官能基を有するブロックコポリマー、アミン類分子、カルボキシル基を有する化合物及びその塩からなる群より選択される、（１）に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子、
（３）シリコンナノ粒子が、ケイ素化合物のガスを原料として、気相プラズマを合成場として使用する方法により調製されるものである、（１）又は（２）に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子、
（４）シリコンナノ粒子が、
　ケイ素化合物、アルゴンガス、及び水素ガスをプラズマチャンバー内に導入する工程、及び
　プラズマチャンバー内で所定の周波数をかけてプラズマを発生させてシリコンナノ粒子を生成させる工程
　を含む方法により調製されるものである、（１）～（３）のいずれか１に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子、
（５）ケイ素化合物がハロゲン含有ケイ素化合物である、（３）又は（４）に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子、
（６）シリコンナノ粒子が、調製後にエッチング処理を施されたものである（３）～（５）のいずれか１に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子、
（７）表面修飾種に生体物質と結合可能な有機化合物が結合している、（１）～（６）のいずれか１に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子、
（８）生体物質と結合可能な有機化合物が架橋剤及び／又はカップリング剤を介して表面修飾種に結合している、（７）に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子。
（９）生体物質と結合可能な有機化合物がアビジン、ストレプトアビジン、ニュートロアビジン、ビオチン、アルブミン、グルタルアルデヒドの中から選ばれる少なくとも１種である、（７）又は（８）に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子、及び
（１０）（１）～（９）のいずれか１に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子を使用した染色用蛍光プローブ、
に関わる。
　また、本発明は、
（１１）ケイ素化合物のガスを原料として、気相プラズマを合成場として使用する、シリコンナノ粒子の製造方法、
（１２）ケイ素化合物、アルゴンガス、及び水素ガスをプラズマチャンバー内に導入する工程、及び
　プラズマチャンバー内で所定の周波数をかけてプラズマを発生させてシリコンナノ粒子を生成させる工程
　を含む、（１１）に記載の方法、
（１３）プラズマチャンバー内におけるケイ素化合物ガス、アルゴンガス及び水素ガスの全圧が１．０～１０．０Ｔｏｒｒである、（１２）に記載の方法、
（１４）プラズマチャンバー内におけるケイ素化合物ガスの分圧が３．３×１０－３～７．５Ｔｏｒｒである、（１２）又は（１３）に記載の方法、
（１５）生成したシリコンナノ粒子を、プラズマチャンバーの出口に設置したコールドトラップで捕集する工程を更に含む、（１２）～（１４）のいずれか１に記載の製造方法、
（１６）ケイ素化合物がハロゲン含有ケイ素化合物である（１２）～（１５）のいずれか１に記載の方法、
（１７）液体ハロゲン含有ケイ素化合物にアルゴンガス、及び水素ガスを通して、これらを一緒にプラズマチャンバー内に導入する、（１６）に記載の方法、
（１８）液体ハロゲン含有ケイ素化合物にアルゴンガスを通して、これらを一緒にプラズマチャンバー内に導入すると共に、液体ハロゲン含有ケイ素化合物及びアルゴンガスとは別に水素ガスをプラズマチャンバー内に導入する、（１６）に記載の方法、
（１９）周波数が１３．５６ＭＨｚである（１２）～（１８）のいずれか１に記載の方法、
（２０）（１１）～（１９）の方法により得られるシリコンナノ粒子、
（２１）（２０）に記載のシリコンナノ粒子をフッ化水素でエッチングするシリコンナノ粒子の表面処理方法、
（２２）（２１）に記載の表面処理方法により得られるシリコンナノ粒子、
（２３）（２０）又は（２２）に記載のシリコンナノ粒子の表面を化学的に修飾するシリコンナノ粒子の表面処理方法、及び
（２４）両親媒性官能基を有するブロックコポリマー、アミン類分子、カルボキシル基を有する化合物及びその塩からなる群より選択される表面修飾種によりシリコンナノ粒子の表面を修飾する（２３）に記載の方法、
に関わる。
　本発明においては、ケイ素化合物のガスを原料として、気相プラズマを合成場として利用することにより、安定性に優れた蛍光特性を示すシリコンナノ粒子を一段階の工程で製造できる方法を提供することができる。本発明者らの実験によると、本発明の方法により製造されたシリコンナノ粒子の分散液を空気中で半年以上にわたり保存をしても初期の蛍光強度の８割以上の強度を維持し、また３時間以上紫外線を照射した後でも初期の蛍光強度の８割以上の強度を示した。また、色素分子に見られる光照射下での著しい蛍光消光現象は観察されず、長時間安定に蛍光を示した。従って、本発明により、長時間にわたり消光しない蛍光プローブを提供することが可能となる。また、本発明においては、シリコンナノ粒子の合成条件を変えることで、青色から赤色まで可視光全域の蛍光色を発するシリコンナノ粒子を得ることができ、従来の色素分子とは異なり、単一の材料からフルカラーの蛍光プローブを作製することが可能となり、細胞観察時における蛍光波長を変えることができる点でも有用である。
　また、本発明の製造方法により得られるシリコンナノ粒子にエッチングや表面修飾を施すことにより、蛍光特性が更に向上することに加えて、細胞内の特定の小器官を選択的に染色する、部位選択的細胞染色の機能を発現することができる。従来使用されている蛍光色素分子も同様の機能を有するが、シリコンナノ粒子ではこれに加えて色素分子で見られる蛍光退色がほとんど起こらない。更に、固定化後（細胞膜の透過処理後）のみならず、生きている細胞（生細胞）に対しても染色が可能である。従って、本発明の蛍光シリコンナノ粒子は、蛍光色素分子における課題であった、長時間にわたる特定の細胞内小器官を観察する蛍光プローブとして使用が可能である。
　更に、本発明の表面修飾シリコンナノ粒子において、表面修飾種に生体物質と結合可能な有機化合物を結合させることにより、ＤＮＡ断片、抗原抗体反応、がんマーカーの標識などの蛍光ディテクターとして使用することができる。
シリコンナノ粒子製造装置の概略図 シリコンナノ粒子のエタノール分散溶液の吸収、ＰＬ及びＰＬＥスペクトル シリコンナノ粒子のＴＥＭ画像 シリコンナノ粒子エタノール分散溶液の室温保管後の蛍光強度（積分ＰＬ強度）の変化 シリコンナノ粒子エタノール分散溶液の紫外線照射後の蛍光強度（積分ＰＬ面積）の変化 全圧を変化させて合成したシリコンナノ粒子のＰＬスペクトル コールドトラップを使用したシリコンナノ粒子製造装置の概略図 フッ化水素によるエッチング処理前後のシリコンナノ粒子のＴＥＭ像と粒径分布のグラフ フッ化水素によるエッチング前後の吸収スペクトルとＰＬスペクトルの変化 ブロックコポリマー（Ｆ－１２７）によるシリコンナノ粒子表面の修飾前後のＴＥＭ像 ブロックコポリマー（Ｆ－１２７）によるシリコンナノ粒子表面の修飾前後の溶液中での粒径分布 ブロックコポリマー（Ｆ－１２７）によるシリコンナノ粒子表面の修飾前後での吸収スペクトルとＰＬスペクトルの変化 表面修飾シリコンナノ粒子Ａの水分散溶液に紫外線を照射した後の蛍光強度（積分ＰＬ面積）の変化 表面修飾シリコンナノ粒子Ｃの水分散溶液の粒径分布 表面修飾シリコンナノ粒子ＣのＰＬスペクトル 染色液Ａ、Ｂで染色した固定化細胞（血管内皮細胞）の共焦点顕微鏡による観察結果 染色液Ａ、Ｂで染色した生細胞（血管内皮細胞）の共焦点蛍光顕微鏡による観察結果 染色液Ａ、Ｂで染色した生細胞（血管内皮細胞）の共焦点蛍光顕微鏡による蛍光像の拡大図 染色液Ｃで染色した生細胞（血管内皮細胞）の共焦点蛍光顕微鏡による観察結果 染色液Ａ、Ｆで染色した生細胞（血管内皮細胞）の共焦点顕微鏡による蛍光像 蛍光色素（テキサスレッド-ファロイジン）と染色液Ｂで染色した固定化細胞（血管内皮細胞）の励起光照射時間による蛍光像の変化 ビオチンを固定化した金線を、表面修飾シリコンナノ粒子Ｆの分散液で処理した場合（ａ）、表面修飾シリコンナノ粒子Ｂの分散液で処理した場合（ｂ）における共焦点顕微鏡による蛍光像
（１）シリコンナノ粒子の表面の化学的修飾
　本発明においては、シリコンナノ粒子の表面に化学的修飾処理を施すことにより、水への分散性を実現することができる。本発明に使用できる表面修飾種としては、水との相互作用の強い極性の官能基、例えば、カルボキシル基、水酸基、アミノ基、アリルアミノ基、シアノ基、スルホン基、アミド基、イミド基、硫酸エステル基等を有する化合物又はその塩等、またこれらの官能基を含む糖、ペプチド等が挙げられる。また、本発明においては、表面修飾種として、両親媒性界面活性剤も使用することができ、例えば、ＢＲＩＪ、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）、ＴＸ－１００などが挙げられる。また、本発明においては、両親媒性官能基を有するブロックコポリマーも使用することができ、例えば、ＰｌｕｒｏｎｉｃＰ１２３、Ｆ－１２７や、スチレンモノマーとアクリル酸モノマーのブロックコポリマーなどが好適に使用される。
　本発明においては、上記表面修飾種の中でも、アリルアミン等のアミン類分子、カルボキシル基を有する化合物又はその塩、両親媒性官能基を有するブロックコポリマーを使用すると、水への分散性が得られるのみならず、表面修飾種によるシリコンナノ粒子の部位選択的な細胞染色が可能となり好ましい。
　本発明において、シリコンナノ粒子の表面を化学的に修飾するには公知の方法で行うことができる。例えば、両親媒性ブロックコポリマーの溶液と、シリコンナノ粒子の分散溶液を適当な時間常温で攪拌することにより行うことができる。こうして表面が化学的に修飾されたシリコンナノ粒子（以下「表面修飾シリコンナノ粒子」ともいう。）を得ることができる。ここで、本発明の表面修飾ナノ粒子においては、表面修飾種がシリコンナノ粒子の表面と共有結合、分子間結合、イオン結合、又は水素結合していていてもよく、あるいはこれらの組合わせであってもよい。また、本発明の表面修飾ナノ粒子においては、シリコンナノ粒子の表面が表面修飾種により、親水性/疎水性相互作用など、結合を介さない形で被覆されていてもよい。
　本発明においては、シリコンナノ粒子にエッチング処理を施した後に、その表面を化学的に修飾して表面修飾シリコンナノ粒子を得ることができる。
　本発明における表面修飾シリコンナノ粒子を製造するには、任意のシリコンナノ粒子を使用することができるが、特に、シリコンナノ粒子自体として安定な蛍光特性を示すものを使用することが好ましい。このようなシリコンナノ粒子は、以下に示す製造方法により得ることができる。
（２）安定な蛍光特性を有するシリコンナノ粒子の製造方法
　本発明者は、ケイ素化合物のガスを原料として、気相プラズマを合成場として使用する方法で製造されるシリコンナノ粒子はそれ自体安定した蛍光特性を示すことを見出した。かかるシリコンナノ粒子の製造方法及びこれにより得られるシリコンナノ粒子も本発明の範囲内である。
　本発明においては、ケイ素化合物として、シラン（水素化ケイ素）、ハロゲン含有ケイ素化合物を使用できる。本発明において使用できるハロゲン含有ケイ素化合物としては、例えば、三塩化シラン、四塩化ケイ素、四臭化ケイ素、四ヨウ化ケイ素が挙げられる。
　本発明の方法において、ケイ素化合物としてシラン、三塩化シランを使用する場合は、これら化合物は常温で気体であるため、搬送ガスと共にまたは単独でプラズマチャンバーなどのプラズマを発生させる場（プラズマ場）に導入することができる。また、本発明の方法において、ケイ素化合物として四塩化ケイ素、四臭化ケイ素を使用する場合は、これら化合物は常温で液体であるため、液体を予めガス化させて搬送ガスと共にプラズマ場に導入してもよいし、液体に搬送ガスを通してバブリングして、搬送ガスと共にプラズマ場に導入してもよいが、後者の方が簡便に行うことができる。更に、本発明の方法において、ケイ素化合物として四ヨウ化ケイ素を使用する場合は、常温で固体であるため、加熱して予めガス化させて搬送ガスと共にプラズマ場に導入するか、加熱して液体にして搬送ガスを通してバブリングして、搬送ガスと共にプラズマ場に導入することができる。本発明の方法において使用することができる搬送ガスは、アルゴンガスがある。
　本発明の方法においては、還元剤として水素ガスもプラズマ場に導入する。水素ガスは、ケイ素化合物と別にプラズマ場に導入することもできるが、ケイ素化合物、搬送ガスとともにプラズマ場に導入することもできる。ケイ素化合物として四塩化ケイ素、四臭化ケイ素、四ヨウ化ケイ素を使用する場合には、液体状態の化合物に搬送ガス及び水素ガスを通して、これらを一緒にプラズマ場に導入することができる。
　プラズマを発生させる装置としてはプラズマチャンバーが一般に使用できる。本発明においては、ＲＦ容量結合水平電極放電プラズマが好適に使用される。この装置は、真空チャンバー内に上下電極が水平に配置され、原料ガスは上部電極のシャワーヘッド部から供給される。また、下部電極は温度制御可能な基板であり、反応温度の制御を行える。
　本発明の方法においては、プラズマチャンバー内でのプラズマ出力密度は、通常、０．１～２．５Ｗ／ｃｍ２に設定される。電極の温度は、通常、上部電極は室温に、下部電極は室温～６００℃に設定される。また、周波数については、高周波誘導熱プラズマで通常使用される周波数を使用することができるが、好ましくは１３．５６ＭＨｚの周波数が使用される。
　プラズマチャンバーにケイ素化合物を導入する流速は、一般には、１～３０ｓｃｃｍ（標準立法センチメートル／分）、好ましくは１～３ｓｃｃｍである。また、プラズマ場へのアルゴンガスを導入する全流速は、通常４０～３００ｓｃｃｍ、好ましくは１１５～１５５ｓｃｃｍの範囲である。また、プラズマチャンバーに水素ガスを導入する流速は、通常、２０ｓｃｃｍである。
　本発明の方法においては、プラズマチャンバー内におけるケイ素化合物ガス、アルゴンガス及び水素ガスの全圧は、一般に１．０～１０．０Ｔｏｒｒ、好ましくは２．５～５．０Ｔｏｒｒ、より好ましくは２．５～３．５Ｔｏｒｒに制御される。また、本発明においては、好適には、反応時間は３～３０分である。
　また、本発明の方法においては、プラズマチャンバー内におけるケイ素化合物ガスの分圧は、一般に３．３×１０－３～７．５Ｔｏｒｒ、好ましくは１．６×１０－２～０．１３Ｔｏｒｒ、より好ましくは１．６×１０－２～９．１×１０－２Ｔｏｒｒの範囲に制御される。これにより、シリコンナノ粒子の蛍光色を制御することが可能である。ケイ素化合物ガスの分圧が低いほど赤色シリコンナノ粒子が生成し、分圧が高いほど青色シリコンナノ粒子が生成する。
　本発明の方法において、プラズマチャンバー内で形成されたシリコンナノ粒子を捕集するには、真空チャンバーと排ガス管の間にフィルターを設けて当該フィルター上で捕集することができる。フィルターとしてはＰＴＦＥフィルターが好適に使用される。
　更に、本発明の方法においては、生成したシリコンナノ粒子を捕集するために、真空チャンバーの出口にコールドトラップを設置することができる。コールドトラップの冷却媒体として液体窒素が好適に使用される。コールドトラップを設けることにより、生成したシリコンナノ粒子と一緒にプラズマチャンバーから排出されるアルゴンガスやハロゲン化水素ガス、ハロゲンガスが液化若しくは固化し、シリコンナノ粒子が液化物、固化物とともに捕集容器の側壁や底部に堆積するため、シリコンナノ粒子が容器内で散逸することを防ぐことができ、捕集率を向上させることができる。
　本発明の方法により製造されるシリコンナノ粒子は、安定性に優れた蛍光特性を示す。具体的には、空気中で半年以上にわたり保存をしても初期の蛍光強度の８割以上の強度を維持し、また３時間以上紫外線を照射した後でも初期の蛍光強度の８割以上の強度を示す。
　本発明の方法により製造されるシリコンナノ粒子自体の表面を化学的に修飾して前記表面修飾シリコンナノ粒子を得ることができる。また、当該シリコンナノ粒子を以下に記載の方法でエッチング処理して、その後、シリコンナノ粒子の表面を化学的に修飾することもできる。
（３）シリコンナノ粒子のエッチング
　本発明の方法で製造されるシリコンナノ粒子は、場合により、エッチングを施すことができる。これにより蛍光強度を増大させ得る。エッチングは、フッ化水素、又はフッ化水素と硝酸の混酸を用いて行うことができる。エッチングは、本発明のシリコンナノ粒子をエタノール等のアルコール類やトルエン等の有機溶媒に分散させ、この分散溶液にフッ化水素等を直接添加することにより行うことができる。添加するフッ化水素等の量として、シリコンナノ粒子（存在する粉末全てがＳｉＯ２からなると仮定した場合）に対する化学量論量のフッ化水素の少なくとも1倍、好ましくは少なくとも１０倍添加する。
（４）シリコンナノ粒子を使用した染色用蛍光プローブ
　本発明のシリコンナノ粒子は、蛍光安定性に優れることから、生体組織、細胞、細胞内小器官などの染色用蛍光プローブとして好適に使用することができる。本発明の製造方法で得られるシリコンナノ粒子自体、当該シリコンナノ粒子にエッチング処理を施したもの、及び当該シリコンナノ粒子又はエッチング処理を施したシリコンナノ粒子の表面を化学的に修飾したもののいずれも（以下「本発明のシリコンナノ粒子等」という）染色用蛍光プローブとして使用することができ、更には、部位選択的な染色も可能となる。
　本発明のシリコンナノ粒子等を使用した染色用蛍光プローブは、本発明のシリコンナノ粒子等をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の有機溶媒や水に分散させた染色液として通常使用される。本発明の染色用蛍光プローブは、固定化し細胞膜透過処理を施した組織や細胞、或いは生きている組織や細胞の何れにも使用することができる。細胞や組織の透過処理、固定化は公知の方法（例えば、ホルムアルデヒドで固定化した後、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００によって細胞膜透過処理を行う方法）を用いることができる。
　本発明の染色用蛍光プローブを用いて染色した細胞や組織を観察するには、市販の共焦点顕微鏡及び蛍光顕微鏡（透過型蛍光顕微鏡または落射型蛍光顕微鏡）を使用することができる。励起光には、共焦点顕微鏡の場合は半導体レーザー（４０５ｎｍ）、蛍光顕微鏡の場合は紫外線（３６５ｎｍ）を一般に使用する。
　本発明のもう一つ別の態様は、表面修飾種に生体物質と結合可能な有機化合物が結合している表面修飾シリコンナノ粒子である。生体物質と結合可能な有機化合物とは、生体物質と抗原抗体反応をする物質や、アビジン化された生体物質とアビジン－ビオチン結合を介して結合する物質、生体物質に含まれる特定の官能基とカップリングして結合する物質等、種々のものが含まれる。例として、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートロアビジン、ビオチン、アルブミン、グルタルアルデヒドが挙げられるが、これらに限定されない。本発明においては、表面修飾種に生体物質と結合可能な有機化合物が直接結合していてもよく、また、架橋剤及び／又はカップリング剤を介して結合していてもよい。架橋剤及びカップリング剤としては、グルタルアルデヒド、ＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）／スルホ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド）などが挙げられる。従って、表面修飾種にグルタルアルデヒドが結合した表面修飾シリコンナノ粒子、表面修飾種にグルタルアルデヒドが結合し、グルタルアルデヒドにアビジンなどの生体物質と結合可能な有機化合物が結合した表面修飾シリコンナノ粒子も本発明の範囲内である。また、生体物質としては、例えば、抗体、タンパク質、核酸があり、これら生体物質にビオチン化されたものも含まれる。
　表面修飾種に生体物質と結合可能な有機化合物が結合した表面修飾シリコンナノ粒子の非限定的な例として、シリコンナノ粒子をアリルアミンで処理して、シリコンナノ粒子の表面にアミノ基を導入し、これをグルタルアルデヒドと反応させ、更に、ストレプトアビジンを反応させることにより、表面がストレプトアビジンで修飾されたシリコンナノ粒子を得ることができる。ストレプトアビジン、アビジン及びニュートロアビジンからなるアビジンファミリーは、ビオチンと選択的に結合することができ、また、ビオチンを用いてＤＮＡ断片、抗体、がんマーカーを標識することができるため、アビジンファミリーで修飾したシリコンナノ粒子は、抗原抗体反応などの蛍光ディテクターとして使用することができる。また、アビジンファミリーで修飾したシリコンナノ粒子にビオチン化された抗体を結合させ、更に他の抗原抗体反応により二次抗体を結合させることで、抗原抗体反応の蛍光ディテクターとして使用することもできる。
　以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
［測定方法］
（１）透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
　以下の各実施例で得られたシリコンナノ粒子を、エネルギー分散型Ｘ線分光計（ＥＤＳ）（Ｔｒａｃｏｒ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｖｏｙａｇｅｒ社）を装備した透過型電子顕微鏡（日本電子（株）２０１０Ｆ）を用いて、２００ｋＶの加速電圧で、直接観察した。ＴＥＭ試料は、炭素被覆銅ＴＥＭ格子上に試料溶液の液滴を滴下することにより調製した。シリコンナノ粒子の粒径分布グラフは、ＴＥＭ像中の４００個超の粒子の大きさを測定することにより得られた。
（２）蛍光／吸収スペクトル
　蛍光、フォトルミネッセンス（ＰＬ）励起（ＰＬＥ）及び量子効率の測定には，ＵＶ－ｖｉｓ－ＮＩＲ分光計（日立（株）Ｕ－４１００）及び蛍光分光計（日本分光株式会社ＦＰ－６５００）を使用した。また、量子効率の測定には、量子効率が既知である（９５％）参照化合物Ｒ６Ｇをエタノールに分散させた。ＦｌｕｏｒｏｌｏｇＴａｕ－３ライフタイムシステム（Ｊｏｂｉｎ　Ｙｖｏｎ　Ｈｏｒｉｂａ）を用いて周波数－ドメイン位相変調を測定してＰＬライフタイムを得た。参照試料として、Ｌｕｄｏｘ（登録商標）ＴＭＡ（アルドリッチ社、コロイダルシリカを３４重量％含有）を用いた。測定には、３６０ｎｍの励起波長を用い、光カットフィルターを用いて４００ｎｍより長波長の蛍光を検出した。
（３）液中での粒径分布
　動的光散乱測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Lｔｄ,　Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ）内に溶液試料を挿入し、波長６３３ｎｍの赤色光を照射した際に得られる１７３°の散乱光強度を測定して、溶液中の粒子粒径分布を測定した。
（４）細胞の染色
　正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をガラスボトムディッシュ上で培養し、染色に用いた。固定化細胞の染色の場合、染色液（シリコンナノ粒子分散液）をＰＢＳで５倍希釈した後、細胞と共に室温で１時間インキュベートすることにより、染色を行った。また、生細胞の染色の場合、染色液（シリコンナノ粒子分散液）を培地で５倍希釈した後、細胞と共にインキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２）中で６時間インキュベートすることにより、染色を行った。
（５）染色細胞の観察
　細胞の染色像の観察には、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ　ＴＣＳ－ＳＰ２）を用いた。励起波長は４０５ｎｍの青色光を用い、波長４３０－７００ｎｍで蛍光像を観察した。
１．シリコンナノ粒子の合成と評価
　以下の実施例では、ＲＦ（１３．５６ＭＨｚ高周波）容量結合水平電極放電プラズマからシリコンナノ粒子を合成する。
［実施例１］
（１）合成手順
　図１に示すシリコンナノ粒子製造装置を用いて、以下の手順によりシリコンナノ粒子を合成した。ステンレス製の耐圧容器に液体四臭化ケイ素（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入、純度：９９．９９５％）２５０ｍｌを充填した。容器中の液体四臭化ケイ素にアルゴンガスを通し、また還元剤として水素ガスを別のガスラインからプラズマチャンバー内に導入し、四臭化ケイ素、アルゴンガス、水素ガスからなる前駆物質をプラズマチャンバー内に導入した。プラズマ出力密度を１．２５Ｗ／ｃｍ２に固定した。四臭化ケイ素の流速は、反応器の制御温度（一般に５０℃）における四臭化ケイ素の飽和蒸気圧を用いて計算したところ、１～３ｓｃｃｍ（標準立法センチメートル／分）であった。合成の間、下部電極の温度を４００℃に維持した。水素ガスの流速を２０ｓｃｃｍに設定し、アルゴンガスの全流速を１１５～１５５ｓｃｃｍの範囲とした。プラズマチャンバー内における四臭化ケイ素ガス、アルゴンガス及び水素ガスの全圧を３Ｔｏｒｒに制御した。反応時間は３分であった。形成されたシリコンナノ粒子は、プラズマチャンバーと排ガス管の間に設けた細孔径１０μｍのＰＴＦＥフィルター（ミリポア社）で捕集した。ＰＴＦＥフィルターによる生成粒子の捕集率は０．２～０．７ｍｇ／分であり、これから粒子の収率は約１８％と見積もられた。穏やかな超音波処理を用いて、捕集した粒子をフィルターからエタノール中に移した。その結果、透明で、自然光下で無色なナノ粒子の懸濁液（分散溶液）を得た。
（２）シリコンナノ粒子の光物性評価
　（１）で得られたシリコンナノ粒子のエタノール分散溶液に３６５ｎｍの紫外線を照射すると、溶液は鮮やかな青色発光を示した。また、このシリコンナノ粒子のエタノール分散溶液の吸収、ＰＬ及びＰＬＥスペクトルを図２－１に示す。この溶液は、３４０ｎｍで励起した場合に、４７０ｎｍでピークを有するＰＬ発光を示した。ＰＬＥスペクトルは４７０ｎｍで観察され、これは、３６０ｎｍで励起された場合に最高ピーク強度を示した。また、得られた粒子のＴＥＭ画像を図２－２に示す。
　また、シリコンナノ粒子のエタノール分散溶液を室温で保管した後の、蛍光強度（積分ＰＬ強度）の変化を図３に示す。この図から、合成されたシリコンナノ粒子は、２４０日まで保管した後でも初期の蛍光強度に対して８割以上の強度を示すことが分かる。また、シリコンナノ粒子のエタノール分散溶液に紫外線を照射した後の蛍光強度（積分ＰＬ面積）の変化を図４に示す。この図から、合成されたシリコンナノ粒子は、１８０分紫外線を照射した後でも初期の蛍光強度に対して８割以上の強度を示すことが分かる。
［実施例２］
　全圧を変化させたシリコンナノ粒子の合成
　プラズマチャンバー内における四臭化ケイ素ガス、アルゴンガス及び水素ガスの全圧を３．５、３．２、２．８、２．２Ｔｏｒｒ及び２．０Ｔｏｒｒ以下に制御した以外は、実施例１と同様の条件でシリコンナノ粒子を合成し、そのエタノール分散溶液を得た。（夫々の試料を実施例２－１～２－５とする。）シリコンナノ粒子のエタノール分散溶液に３６５ｎｍの紫外線を照射すると溶液は、合成時の全圧に応じて以下の発光を示した。また、各試料のＰＬスペクトルを図５に示す。ただし、２．０Ｔｏｒｒ以下の全圧で制御した場合は、合成直後には可視ＰＬは観察されず、フッ化水素／硝酸の混酸でエッチングすることで赤色の発光を確認できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［実施例３］
　コールドトラップを用いたシリコンナノ粒子の合成
　実施例１で使用したシリコンナノ粒子の製造装置（図１参照）において、プラズマチャンバーの後ろにＰＴＦＥフィルターを設置する代わりに、コールドトラップを設置した製造装置を準備した。その概略を図６に示す。冷却媒体として液体窒素を使用した。この製造装置を用いて、実施例１と同様の条件でシリコンナノ粒子を合成した。その結果、コールドトラップ内に、液体窒素による冷却で液化や固化したアルゴン並びに臭化水素中にシリコンナノ粒子が捕集された。液体窒素の入ったトラップを外し、気化したアルゴンを排ガス管から徐々に取り除くとトラップの底部周辺にシリコンナノ粒子が捕集された。生成粒子の収率は８０％であった。
２．シリコンナノ粒子のエッチング処理
［実施例４］
　実施例１で得られたシリコンナノ粒子のエッチング処理を行った。ＰＴＦＥ容器にシリコンナノ粒子を０．２ｍｇ入れ、これに２ｍｌのエタノールを添加してエタノール分散溶液とし、当該溶液に６μｌのフッ化水素を直接加えた。添加したフッ化水素の量は、シリコンナノ粒子（存在する粉末全てがＳｉＯ２からなると仮定した場合）に対する化学量論量のフッ化水素の少なくとも１０倍に相当する。フッ化水素によるエッチング処理前後のシリコンナノ粒子のＴＥＭ像と粒径分布のグラフを図７に示す。また、エッチング前後での吸収スペクトルとＰＬスペクトルの変化を示すグラフを図８に示す。図７からエッチングによりシリコンナノ粒子の粒径が全体的に小さくなり、また、図８からエッチング処理により蛍光強度が増加することが示される。
３．シリコンナノ粒子の表面の化学的修飾
［実施例５］
（１）ブロックコポリマー（Ｆ－１２７）によるシリコンナノ粒子の表面修飾－１
　フッ化水素によるエッチング処理後のシリコンナノ粒子を用いて粒子表面の化学的修飾を行った。実施例４で得たシリコンナノ粒子５０ｍｇをエッチング処理後、２０ｍｌのトルエンに分散した溶液を準備した。また、ブロックコポリマー（Ｆ－１２７）１００mｇを５ｍｌの純水に溶解した溶液を準備した。２種類の溶液を混合して１０時間攪拌し、溶媒を全て蒸発させた後、５ｍｌの純水を加えて粒子を分散させた。その後、細孔径４５０ｎｍのＰＴＦＥフィルター（ミリポア社）で濾過をして、ブロックコポリマー（Ｆ－１２７）で表面修飾したシリコンナノ粒子（表面修飾シリコンナノ粒子Ａ）を得た。
（２）表面修飾シリコンナノ粒子Ａの分散性評価
　ブロックコポリマー（Ｆ－１２７）によるシリコンナノ粒子表面の修飾前と修飾後のＴＥＭ像を図９に示す。また、シリコンナノ粒子表面の修飾前と修飾後の溶液（修飾前の溶媒はエタノールであり、修飾後の溶媒は純水である）中での粒径分布を図１０に示す。図１０から、シリコンナノ粒子の表面を化学的に修飾することにより溶液中での分散凝集性が制御されることが示される。
（３）表面修飾シリコンナノ粒子Ａの光物性評価
　ブロックコポリマー（Ｆ－１２７）によるシリコンナノ粒子表面の修飾前後での吸収スペクトルとＰＬスペクトルの変化を示すグラフを図１１に示す。図１１から、シリコンナノ粒子の表面を化学的に修飾することにより、量子効率が約１５％から４３％と３倍程度向上することが確認できる。
　また、表面修飾シリコンナノ粒子Ａの水分散溶液に紫外線を照射した後の蛍光強度（積分ＰＬ面積）の変化を図１２に示す。この図から、本発明の表面修飾シリコンナノ粒子は、１８０分紫外線を照射した後でも初期の蛍光強度に対して８割以上の強度を示すことが分かる。
［実施例６］
　アリルアミンによるシリコンナノ粒子の表面修飾－１
　実施例４で得たシリコンナノ粒子５０mｇをエッチング処理後、８ｍｌのエタノールに分散した溶液を準備した。この溶液に、０．０５ＭのＨ２ＰｔＣｌ６・６Ｈ２Ｏ１０mｌ、アリルアミン（３－アミノプロペン）０．２ｍｌを添加し、７０℃で１２時間反応させた。その後、溶媒であるエタノールを蒸発させ、純水８ｍｌを加えて粒子を分散させることで、アリルアミンで表面修飾したシリコンナノ粒子（表面修飾シリコンナノ粒子Ｂ）を得た。
［実施例７］
（１）ブロックコポリマー（ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ）によるシリコンナノ粒子の表面修飾
　ポリスチレンモノマーとアクリル酸モノマーからなる以下の式で表されるブロックコポリマー（ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を準備した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （ｘ＝５４～６５、ｙ＝２６～３２、重量平均分子量：７４７０～９１３０）
　実施例４で得たシリコンナノ粒子５０ｍｇをエッチング処理後、９．０ｍｌのＴＨＦに分散した溶液を準備した。また、ブロックコポリマー（ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ）５０ｍｇを９．０ｍｌのＴＨＦに溶解した溶液を準備した。２種類の溶液を混合した後９．０ｍｌの純水を加え、１０時間攪拌した。溶媒を全て蒸発させた後、８．０ｍｌの純水を加えて粒子を分散させた。その後、細孔径４５０ｎｍのＰＴＦＥフィルター（ミリポア社）で濾過をして、ブロックコポリマー（ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ）で表面修飾したシリコンナノ粒子（表面修飾シリコンナノ粒子Ｃ）を得た。
（２）表面修飾シリコンナノ粒子Ｃの分散性評価
　表面修飾シリコンナノ粒子Ｃの水分散溶液の粒径分布を図１３に示す。図１３から、シリコンナノ粒子の表面をブロックコポリマー（ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ）で修飾することにより水分散性が実現できることが示される。
（３）表面修飾シリコンナノ粒子Ｃの光物性評価
　表面修飾シリコンナノ粒子ＣのＰＬスペクトルを示すグラフを図１４に示す。ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ自体が４０５ｎｍ付近に蛍光を有するためシリコンナノ粒子の蛍光と重なった形で示される。
［実施例８］
　ブロックコポリマーによるシリコンナノ粒子の表面修飾－２
　実施例３（コールドトラップを用いた合成）で得られたシリコンナノ粒子について、フッ化水素によるエッチングを行わずに、ブロックコポリマーによる粒子表面の化学的修飾を行った。実施例５に記載した手順に従って、ブロックコポリマー（Ｆ－１２７）で表面修飾したシリコンナノ粒子（表面修飾シリコンナノ粒子Ｄ）を得た。
［実施例９］
　アリルアミンによるシリコンナノ粒子の表面修飾－２
　実施例３で得られたシリコンナノ粒子について、フッ化水素によるエッチングを行わずに、アリルアミンによる粒子表面の化学的修飾を行った。実施例６に記載した手順に従って、アリルアミンで表面修飾したシリコンナノ粒子（表面修飾シリコンナノ粒子Ｅ）を得た。
４．表面修飾シリコンナノ粒子を用いた染色用蛍光プローブ
［実施例１０］
　固定化細胞の観察
（１）細胞染色
　実施例５で得た表面修飾シリコンナノ粒子Ａ１５ｍｇを１０ｍｌの純水に分散させて染色液Ａを調製した。実施例６で得た表面修飾シリコンナノ粒子Ｂ１５ｍｇを１０ｍｌの純水に分散させて染色液Ｂを調製した。
　正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対し、３．７％ホルムアルデヒドで固定化処理を１０分間行い、その後０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００で細胞膜透過処理を５分間施した。
　固定化処理した細胞に、染色液Ａ、Ｂを用いて上記した要領で染色処理を行った。
（２）染色細胞の観察
　染色液Ａ、Ｂで染色した細胞について共焦点顕微鏡による観察を行った結果を図１５に示す。図１５の左側には透過像を、真中には蛍光像を、右側には透過像と蛍光像を重ね合わせた像を示す。同図から、表面修飾シリコンナノ粒子Ｂ（アリルアミン修飾）は細胞の核に対して選択的に染色しており、表面修飾シリコンナノ粒子Ａ（ブロックコポリマー（Ｆ－１２７）修飾）は細胞基質に対して選択的に染色していることが示される。
［実施例１１］
　生細胞の観察
（１）表面修飾種による部位選択的細胞染色
　実施例７で得た表面修飾シリコンナノ粒子Ｃ１５ｍｇを１０ｍｌの純水に分散させて染色液Ｃを調製した。正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）について、細胞膜透過処理を施さない生細胞について、実施例１０で使用した染色液Ａ、Ｂおよび染色液Ｃを用いて染色処理を行った。
染色した細胞について共焦点顕微鏡による観察を行った結果を図１６－１に示す。図１６－１の左側には透過像を、真中には蛍光像を、右側には透過像と蛍光像の重ね合わせを示す。また、蛍光像の拡大図を図１６－２に示す。これらの図から、表面修飾シリコンナノ粒子Ｂはリソソームを選択的に染色し、表面修飾シリコンナノ粒子Ａは小胞体を選択的に染色していることが示される。また、染色液Ｃで染色した細胞について共焦点顕微鏡による観察を行った結果を図１７に示す。図１７の右側には透過像を、左側には蛍光像を示す。同図から、表面修飾シリコンナノ粒子Ｃ（ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ修飾）はリソソームに対して選択的に染色していることが示される。
（２）同一修飾種を用いたシリコンナノ粒子凝集体サイズによる部位選択的細胞染色
　実施例５で記した染色液Ａと、その半分の表面修飾種濃度で修飾した染色液Ｆを作製した。実施例５（２）に記した通り、同一の表面修飾種（Ｆ－１２７）の添加濃度を変えることで修飾された凝集体サイズの異なるシリコンナノ粒子溶液を作製できる。生細胞に対し、染色処理を施した。その結果を図１８に示す。凝集体サイズが小さい染色液Ａでは小胞体に選択的に染色している一方で、凝集体サイズが大きい染色液Eではリソソームに選択的に染色していることが示される。表面修飾種のみならず凝集体サイズによっても染色部位を制御できることが示される。
［実施例１２］
　蛍光安定性の評価
　実施例１０で用いた細胞膜透過処理後の血管内皮細胞について、蛍光色素（テキサスレッド-ファロイジン（テキサスレッド（色素）とファロイジンを結合させた化合物））と染色液Ｂを用いて染色した。染色した細胞について共焦点顕微鏡による観察を行い、励起光照射時間による像の変化を図１９に示す。図１９の左側は観察直後（励起光照射０分）の蛍光像、真中は励起光照射３分後の蛍光像、右側は励起光照射６分後の蛍光像を示す。観察直後の像から、蛍光色素がアクチンフィラメントを選択的に染色し、表面修飾シリコンナノ粒子Ｂが核を選択的に染色していることが示される。そして、励起光照射時間の経過に伴って、蛍光色素の像は徐々に薄くなり、照射６分後にはほぼ蛍光退色している。これに対して、表面修飾シリコンナノ粒子Ｂの蛍光強度はほとんど退色しないことが分かる。
５．表面修飾シリコンナノ粒子への生体物質と結合可能な有機化合物の導入
［実施例１３］
（ストレプトアビジンによる修飾）
　前記表面修飾シリコンナノ粒子Ｂ　５ｍｇをＰＢＳ（リン酸緩衝液）４ｍｌに分散した。分散液に、グルタルアルデヒド（和光純薬）１ｍｌ（２５％のＰＢＳ溶液）を加え、常温で２時間攪拌した。分散液を蒸発させ、余剰のグルタルアルデヒドを除去した。得られた粒子をＰＢＳ５ｍｌに再分散し、ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．６ｇを加えて常温で３時間攪拌した。これにより、ストレプトアビジンで表面修飾したシリコンナノ粒子（表面修飾シリコンナノ粒子Ｆ）の分散液が得られ、当該分散液を４℃で保存した。
　表面修飾シリコンナノ粒子ＦのＰＬスペクトルを測定したところ、表面修飾シリコンナノ粒子Ｂと同様に、４７０ｎｍ付近に蛍光を有していた。
（金線へのビオチンの固定）
　金線をｐｉｒａｎｈａ溶液（硫酸：過酸化水素＝３：１（体積比）の混合溶液）で洗浄し、表面の有機物を除去した。Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＡＭ　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（同仁化学研究所）をエタノールに溶解し、１００μＭの溶液を調製した。当該溶液に金線を浸漬し、室温で１時間静置した。これにより、金線上にビオチンを固体化した。その後、金線をエタノールと純水で洗浄した。
（共焦点顕微鏡観察）
　ビオチンを固定化した金線を、前記ストレプトアビジンで表面修飾したシリコンナノ粒子（表面修飾シリコンナノ粒子Ｆ）の分散液中に１時間浸漬した。その後、金線を取り出し、純水で洗浄した。この金線を共焦点顕微鏡観察した結果を図２０に示す。
　図２０の（ａ）は表面修飾シリコンナノ粒子Ｆの分散液で処理した金線の蛍光像を示し、（ｂ）は、ストレプトアビジンで表面修飾していないシリコンナノ粒子（表面修飾シリコンナノ粒子Ｂ）の分散液で処理したビオチンを固定化した金線の蛍光像を示す。（ａ）から、金線の形に沿って、シリコンナノ粒子由来の蛍光が観測されることから、ストレプトアビジン－ビオチン結合によって金線がシリコンナノ粒子で被覆されていることが確認される。一方、アリルアミンのみで修飾した表面修飾シリコンナノ粒子Ｂを用いた場合は、金線が当該シリコンナノ粒子で被覆されていないことが確認される。
　以上詳述したように、本発明においては、ケイ素化合物ガスを原料として、気相プラズマを合成場として利用することにより、安定性に優れた蛍光特性を示すシリコンナノ粒子の製造方法を提供することができる。本発明の方法により製造されたシリコンナノ粒子の分散液は、空気中で半年以上にわたり保存をしても高い蛍光強度を維持し、３時間以上紫外線を照射した後でも高い蛍光強度を示すように、極めて安定な蛍光特性を有する。従って、本発明により、長時間にわたり消光しない蛍光プローブを提供することが可能となる。また、本発明においては、シリコンナノ粒子の合成条件を変えることで、青色から赤色（紫色）まで可視光全域の蛍光色を発するシリコンナノ粒子を得ることができ、従来の色素分子とは異なり、単一の材料からフルカラーの蛍光プローブを作製することが可能となり、細胞観察時における蛍光波長を変えることができる点でも有用である。
　また、本発明の製造方法により得られるシリコンナノ粒子に、エッチングを施すことにより蛍光強度の増加を達成することができる。更に、本発明の製造方法により得られるシリコンナノ粒子の表面を化学的に修飾することにより、蛍光強度を更に増大し、かつ蛍光安定性も維持することが可能である。加えて、シリコンナノ粒子の表面を化学的に修飾することで、細胞内の特定の小器官を選択的に染色する、部位選択的細胞染色の機能を発現することができ、また、色素分子で見られる蛍光退色がほとんど起こらない。更に、固定化細胞のみならず生細胞に対しても染色が可能である。従って、本発明の方法により製造されるシリコンナノ粒子及び表面修飾シリコンナノ粒子は、蛍光色素分子における課題であった、長時間にわたる特定の細胞内小器官を観察する蛍光プローブとして使用が可能である。
　更に、本発明の表面修飾シリコンナノ粒子において、表面修飾種に生体物質と結合可能な有機化合物を結合させることにより、ＤＮＡ断片、抗原抗体反応、がんマーカーの標識などの蛍光ディテクターとして使用することができる。

Claims (24)

  1. 　シリコンナノ粒子が表面修飾種により化学的修飾がされてなる、表面が修飾されたシリコンナノ粒子。
  2. 　表面修飾種が、両親媒性官能基を有するブロックコポリマー、アミン類分子、カルボキシル基を有する化合物及びその塩からなる群より選択される、請求項１に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子。
  3. 　シリコンナノ粒子が、ケイ素化合物のガスを原料として、気相プラズマを合成場として使用する方法により調製されるものである、請求項１又は２に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子。
  4. 　シリコンナノ粒子が、
    　ケイ素化合物、アルゴンガス、及び水素ガスをプラズマチャンバー内に導入する工程、及び
    　プラズマチャンバー内で所定の周波数をかけてプラズマを発生させてシリコンナノ粒子を生成させる工程
    　を含む方法により調製されるものである、請求項１～３のいずれか１項に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子。
  5. 　ケイ素化合物がハロゲン含有ケイ素化合物である、請求項３又は４に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子。
  6. 　シリコンナノ粒子が、調製後にエッチング処理を施されたものである請求項３～５のいずれか１項に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子。
  7. 　表面修飾種に生体物質と結合可能な有機化合物が結合している、請求項１～６のいずれか１項に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子。
  8. 　生体物質と結合可能な有機化合物が架橋剤及び／又はカップリング剤を介して表面修飾種に結合している、請求項７に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子。
  9. 　生体物質と結合可能な有機化合物がアビジン、ストレプトアビジン、ニュートロアビジン、ビオチン、アルブミン、グルタルアルデヒドの中から選ばれる少なくとも１種である、請求項７又は８に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子。
  10. 　請求項１～９のいずれか１項に記載の表面が修飾されたシリコンナノ粒子を使用した染色用蛍光プローブ。
  11. 　ケイ素化合物のガスを原料として、気相プラズマを合成場として使用する、シリコンナノ粒子の製造方法。
  12. 　ケイ素化合物、アルゴンガス、及び水素ガスをプラズマチャンバー内に導入する工程、及び
    　プラズマチャンバー内で所定の周波数をかけてプラズマを発生させてシリコンナノ粒子を生成させる工程
    　を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 　プラズマチャンバー内におけるケイ素化合物ガス、アルゴンガス及び水素ガスの全圧が１．０～１０．０Ｔｏｒｒである、請求項１２に記載の方法。
  14. 　プラズマチャンバー内におけるケイ素化合物ガスの分圧が３．３×１０－３～７．５Ｔｏｒｒである、請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 　生成したシリコンナノ粒子を、プラズマチャンバーの出口に設置したコールドトラップで捕集する工程を更に含む、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の製造方法。
  16. 　ケイ素化合物がハロゲン含有ケイ素化合物である請求項１２～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 　液体ハロゲン含有ケイ素化合物にアルゴンガス、及び水素ガスを通して、これらを一緒にプラズマチャンバー内に導入する、請求項１６に記載の方法。
  18. 　液体ハロゲン含有ケイ素化合物にアルゴンガスを通して、これらを一緒にプラズマチャンバー内に導入すると共に、液体ハロゲン含有ケイ素化合物及びアルゴンガスとは別に水素ガスをプラズマチャンバー内に導入する、請求項１６に記載の方法。
  19. 　周波数が１３．５６ＭＨｚである請求項１２～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 　請求項１１～１９の方法により得られるシリコンナノ粒子。
  21. 　請求項２０に記載のシリコンナノ粒子をフッ化水素でエッチングするシリコンナノ粒子の表面処理方法。
  22. 　請求項２１に記載の表面処理方法により得られるシリコンナノ粒子。
  23. 　請求項２０又は２２に記載のシリコンナノ粒子の表面を化学的に修飾するシリコンナノ粒子の表面処理方法。
  24. 　両親媒性官能基を有するブロックコポリマー、アミン類分子、カルボキシル基を有する化合物及びその塩からなる群より選択される表面修飾種によりシリコンナノ粒子の表面を修飾する請求項２３に記載の方法。
PCT/JP2011/074781 2010-10-27 2011-10-27 蛍光シリコンナノ粒子及びその製造方法 WO2012057253A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012540928A JPWO2012057253A1 (ja) 2010-10-27 2011-10-27 蛍光シリコンナノ粒子及びその製造方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34486210P 2010-10-27 2010-10-27
US61/344862 2010-10-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012057253A1 true WO2012057253A1 (ja) 2012-05-03

Family

ID=45993957

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/074781 WO2012057253A1 (ja) 2010-10-27 2011-10-27 蛍光シリコンナノ粒子及びその製造方法

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPWO2012057253A1 (ja)
WO (1) WO2012057253A1 (ja)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015179671A (ja) * 2014-03-19 2015-10-08 オーシーアイ カンパニー リミテッドＯＣＩ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ． 炭素−シリコン複合体、これを用いたリチウム二次電池用負極およびリチウム二次電池
JP2015201621A (ja) * 2014-04-03 2015-11-12 国立研究開発法人物質・材料研究機構 発光性シリコンナノ粒子及び電流注入型発光素子
WO2015182116A1 (ja) * 2014-05-29 2015-12-03 株式会社豊田自動織機 ナノシリコン材料とその製造方法及び二次電池の負極
JP2016072286A (ja) * 2014-09-26 2016-05-09 京セラ株式会社 ナノ複合材料およびナノ複合材料分散溶液、ならびに光電変換装置
JP2016102057A (ja) * 2014-11-28 2016-06-02 エボニック デグサ ゲーエムベーハーＥｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨ シリコン中空体の製造方法
JP2016176039A (ja) * 2015-03-23 2016-10-06 国立研究開発法人物質・材料研究機構 水溶性近赤外発光ナノ粒子及び蛍光標識材
US10164255B2 (en) 2014-05-29 2018-12-25 Kabushiki Kaisha Toyota Jidoshokki Silicon material and negative electrode of secondary battery
US10217990B2 (en) 2014-05-29 2019-02-26 Kabushiki Kaisha Toyota Jidoshokki Silicon material and negative electrode of secondary battery

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01197309A (ja) * 1988-02-01 1989-08-09 Mitsubishi Metal Corp 粒状シリコンの製造方法
JP2009091168A (ja) * 2007-10-04 2009-04-30 Akihiro Kusumi 蛍光性ナノ粒子、及び、それを用いて生体物質を観察する方法
JP2009132771A (ja) * 2007-11-29 2009-06-18 Konica Minolta Medical & Graphic Inc コア／シェル型半導体ナノ粒子とその製造方法
JP2009227703A (ja) * 2008-03-19 2009-10-08 Konica Minolta Medical & Graphic Inc シリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜、シリコンナノ粒子、シリコンナノ粒子溶液、単一分子観察方法および分子観察方法
JP2010013313A (ja) * 2008-07-03 2010-01-21 Konica Minolta Medical & Graphic Inc 半導体ナノ粒子含有膜及び半導体ナノ粒子

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01197309A (ja) * 1988-02-01 1989-08-09 Mitsubishi Metal Corp 粒状シリコンの製造方法
JP2009091168A (ja) * 2007-10-04 2009-04-30 Akihiro Kusumi 蛍光性ナノ粒子、及び、それを用いて生体物質を観察する方法
JP2009132771A (ja) * 2007-11-29 2009-06-18 Konica Minolta Medical & Graphic Inc コア／シェル型半導体ナノ粒子とその製造方法
JP2009227703A (ja) * 2008-03-19 2009-10-08 Konica Minolta Medical & Graphic Inc シリコンナノ粒子含有酸化ケイ素膜、シリコンナノ粒子、シリコンナノ粒子溶液、単一分子観察方法および分子観察方法
JP2010013313A (ja) * 2008-07-03 2010-01-21 Konica Minolta Medical & Graphic Inc 半導体ナノ粒子含有膜及び半導体ナノ粒子

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
P.SHEN ET AL.: "Stable and color-tunable fluorescence from silicon nanoparticles formed by single-step plasma assisted decomposition of SiBr4", JOURNAL OF MATERIALS CHEMISTRY, vol. 20, no. 9, 7 March 2010 (2010-03-07), pages 1669 - 1675 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015179671A (ja) * 2014-03-19 2015-10-08 オーシーアイ カンパニー リミテッドＯＣＩ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ． 炭素−シリコン複合体、これを用いたリチウム二次電池用負極およびリチウム二次電池
JP2015201621A (ja) * 2014-04-03 2015-11-12 国立研究開発法人物質・材料研究機構 発光性シリコンナノ粒子及び電流注入型発光素子
WO2015182116A1 (ja) * 2014-05-29 2015-12-03 株式会社豊田自動織機 ナノシリコン材料とその製造方法及び二次電池の負極
CN106414326A (zh) * 2014-05-29 2017-02-15 株式会社丰田自动织机 纳米硅材料及其制造方法和二次电池的负极
US10164255B2 (en) 2014-05-29 2018-12-25 Kabushiki Kaisha Toyota Jidoshokki Silicon material and negative electrode of secondary battery
US10217990B2 (en) 2014-05-29 2019-02-26 Kabushiki Kaisha Toyota Jidoshokki Silicon material and negative electrode of secondary battery
US10347910B2 (en) 2014-05-29 2019-07-09 Kabushiki Kaisha Toyota Jidoshokki Nano silicon material, method for producing same, and negative electrode of secondary battery
CN106414326B (zh) * 2014-05-29 2019-08-09 株式会社丰田自动织机 纳米硅材料及其制造方法和二次电池的负极
JP2016072286A (ja) * 2014-09-26 2016-05-09 京セラ株式会社 ナノ複合材料およびナノ複合材料分散溶液、ならびに光電変換装置
JP2016102057A (ja) * 2014-11-28 2016-06-02 エボニック デグサ ゲーエムベーハーＥｖｏｎｉｋ Ｄｅｇｕｓｓａ ＧｍｂＨ シリコン中空体の製造方法
JP2016176039A (ja) * 2015-03-23 2016-10-06 国立研究開発法人物質・材料研究機構 水溶性近赤外発光ナノ粒子及び蛍光標識材

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2012057253A1 (ja) 2014-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2012057253A1 (ja) 蛍光シリコンナノ粒子及びその製造方法
Fan et al. Group IV nanoparticles: synthesis, properties, and biological applications
Cao et al. High-quality water-soluble and surface-functionalized upconversion nanocrystals as luminescent probes for bioimaging
Dou et al. Sandwich-structured upconversion nanoparticles with tunable color for multiplexed cell labeling
Osminkina et al. Photoluminescent biocompatible silicon nanoparticles for cancer theranostic applications
Pan et al. Phase and size controllable synthesis of NaYbF4 nanocrystals in oleic acid/ionic liquid two-phase system for targeted fluorescent imaging of gastric cancer
Ma et al. Highly bright water-soluble silica coated quantum dots with excellent stability
Matsuyama et al. Bioimaging application of highly luminescent silica-coated ZnO-nanoparticle quantum dots with biotin
Venkatachalam et al. Er 3+‐Doped Y 2 O 3 Nanophosphors for Near‐Infrared Fluorescence Bioimaging Applications
Serdiuk et al. Charge-driven selective localization of fluorescent nanoparticles in live cells
Wolska‐Pietkiewicz et al. Safe‐by‐Design Ligand‐Coated ZnO Nanocrystals Engineered by an Organometallic Approach: Unique Physicochemical Properties and Low Toxicity toward Lung Cells
Li et al. Highly controllable synthesis of near-infrared persistent luminescence SiO 2/CaMgSi 2 O 6 composite nanospheres for imaging in vivo
WO2010016289A1 (ja) 量子ドットを含有する蛍光標識剤
Diao et al. Carrier-free, water dispersible and highly luminescent dye nanoparticles for targeted cell imaging
Riccò et al. Ultra-small dye-doped silica nanoparticles via modified sol-gel technique
JPWO2008032534A1 (ja) 蛍光半導体微粒子集合体、生体物質蛍光標識剤集合体、これらを用いたバイオイメージング法及び生体物質解析方法
US8722095B2 (en) Fluorescent nanocrystals encapsulated in an inorganic shell
Shen et al. Horseradish peroxidase-immobilized magnetic mesoporous silica nanoparticles as a potential candidate to eliminate intracellular reactive oxygen species
Le et al. Development of a fluorescent label tool based on lanthanide nanophosphors for viral biomedical application
JPWO2009066548A1 (ja) 半導体ナノ粒子、それを用いた蛍光標識物質及び分子・細胞イメージング法
Borovaya et al. Biosynthesis of quantum dots and their potential applications in biology and biomedicine
Fucikova et al. Silicon nanocrystals and nanodiamonds in live cells: photoluminescence characteristics, cytotoxicity and interaction with cell cytoskeleton
Su et al. Plant cell imaging based on nanodiamonds with excitation-dependent fluorescence
JP2009132771A (ja) コア／シェル型半導体ナノ粒子とその製造方法
Kulesh et al. Total reflection x-ray fluorescence spectroscopy as a tool for evaluation of iron concentration in ferrofluids and yeast samples

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11836386

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2012540928

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 11836386

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1