Qualitätsbestimmunq von Stammzellen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Qualitätsbestimmung von pluripotenten Stammzellen.
In der regenerativen Medizin werden sehr intensiv vielfältige Ansätze verfolgt, um Stammzellen in zellersatztherapeutischer Anwendung den, unter degenerativer Erkrankung leidenden Patienten, verabreichen zu können. Bereits jetzt erfolgen Therapien in diversen Kliniken unter Verwendung von Stammzellen, die der Knorpelregeneration dienen . In absehbarer Zukunft wird sich die Anwendung von Stammzellen potenzieren. Hierzu wird die Methode der Reprogrammierung von körpereigenen, terminal differenzierten Zellen mittels Induktion von Pluripotenz beitragen. Hierdurch werden sowohl Probleme der Im m unabstoßung als auch ethische Aspekte umgangen.
Bei allen existierenden Ansätzen erfordert dies jedoch die Zellkultivierung in- vitro, wobei keine einheitlichen Standards existieren . Für eine Anwendung beim Menschen ist es erforderlich, die Güte- bzw. Qualität der Stammzellen zu bestimmen.
Chuanying Pan et al., J. Genet. Genomics 37 (2010) 241-248 untersuchten die Demethylierung der Promotoren von NANOG und OCT4 in induzierten pluripo- tenten Stammzellen von Fibroblasten.
Prashant Mali et al., Stern Cells 28 (2010) 713-720 untersuchen die Demethylierung von induzierten pluripotenten Stammzellen mit Hilfe eines HumanMethylation27 BeadChips.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein einfaches Verfahren zur Güte- und Qualitätsbestimmung bereitzustellen.
Gelöst wi rd die Aufgabe du rch ein Verfahren zur Qualitätsbestimmung von pluripotenten Stammzellen umfassend die Schritte:
- Messen der DNA-Methylierung mindestens eines CpG in einer CpG-Insel in mindestens drei Genen der pluripotenten Stammzelle
- Vergleich mit der DNA-Methylierung des mindestens einen CpG in einer CpG-Insel in den mindestens drei Genen mindestens einer Referenzzelle wobei die Gene auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert sind und zur Genfamilie der olfaktorischen Rezeptorgene gehören.
Die Ausprägung eines speziellen Zelltyps z. B. einer Stammzelle erfordert eine zelltypenspezifische Genexpression. Diese setzt eine qualitativ und quantitativ angepasste Genregulation voraus. Einer der wesentlichen Mechanismen zur Genregulation ist die DNA- Methylierung. Schätzungsweise 60% der menschlichen Gene werden in differenzierten Zel len du rch D NA-Methylierung beei nfl usst . I n der D NA kann Cytosi n, welches sich im Kontext eines pali ndrom ischen CpG Dinukleotids befi ndet, ei ne zusätzl iche Methylg ru ppe tragen . Solche entsprechend methylierten Gene werden nicht oder stark vermindert exprimiert.
Die Methylierung ist in den Genen aber nicht genomweit gleichmäßig verteilt, sondern liegt in sogenannten CpG-Inseln vermehrt vor, die in den 5' Regionen der Gene liegen.
Wenn eine CpG-Insel lückenlos methyliert ist, ist eine Transkription des kor- respondierenden Gens nicht möglich . Im Falle einer Unmethylierung hat das Gen transkriptioneile Kompetenz, d.h. es kann transkribiert werden.
Hierbei sind die methylierbaren CpG Dinukleotide jedoch nicht gleichwertig für die Regulation des Gens, dem sie angehören . Die Methylierung von bestimmten CpGs, die über ihre Assoziation mit Zielsequenzen von Transkriptionsfakto- ren wi rken, üben den größten Ei nfl uss auf die Genexpression aus. Es wird vermutet, dass die methylierten CpGs über ihre sterische Positionierung in die großen Furchen der DNA die Transkriptionsfaktorbindung beeinflussen. So
kann eine nicht lückenlos methylierte CpG-Insel, je nachdem welche, CpGs methyliert sind, einen Transkriptionsblock oder eine verminderte Transkription zur Folge haben, es kann aber auch gar keinen reprimierenden Einfluss auf die Transkription geben. Erfindungsgemäß wird die DNA-Methylierung mindestens eines CpG in einer CpG-Insel in mindestens drei Genen einer zu untersuchenden pluripotenten Stammzelle analysiert, d . h . es werden Gene ausgewählt und an denen von diesen Genen bekannten CpG-Inseln wird an mindestens einer Position der CpG-Insel die Methylierung gemessen . Bevorzugt wird eine Position in einer CpG-Insel gemessen, die für die Transkriptionssteuerung möglichst relevant ist. Anschließend erfolgt ein Vergleich dieser Methylierung mit der Methylierung einer Referenzzelle, wobei bei den gleichen Genen die gleichen CpG- Inseln und die gleichen Positionen innerhalb der CpG-Inseln der Referenzzelle verglichen werden. In einer Ausführungsform der Erfindung kann es sich bei der untersuchten pluripotenten Stammzelle um eine induzierte pluripotente Stammzelle handeln, dabei eignet sich dann als Referenzzelle eine bekannte pluripotente Stammzelle.
Weisen die untersuchte Stammzelle und die Referenzzelle ähnliche oder über- ei nsti mmende Methylierungsmuster auf, spricht dies für eine erfolgreiche Reprogrammierung und damit eine hohe Qualität der erhaltenen induzierten, pluripotenten Stammzelle. Zusätzlich oder alternativ kann als Referenzzelle auch die Ausgangszelle eingesetzt werden, beispielsweise eine Fibroblastenzel- le. Aus dem Umfang der Änderung der DNA-Methylierung kann ebenfalls auf den Erfolg der Induktion geschlossen werden, d .h . je ähnlicher die ausdifferenzierte Zelle und die vermeintlich induzierte Stammzelle sind, desto schlechter ist die Qualität der induzierten Stammzelle.
Stammzellen werden häufig längere Zeit in Kultur gehalten. Es gibt Stammzelll inien, tei lweise auch aus embryonalen Stammzellen, die über Jahre in Kultur gehalten werden. Es ist in solchen Fällen nicht auszuschließen, dass die
Stammzellen im Rahmen der Kultivierung Schäden erleiden, die über lange Zeit unbemerkt bleiben können. Hierbei kann das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden, um im Laufe einer Kultivierung den Methylierungsgrad einer oder mehrerer CpG-Inseln von zwei oder mehr Genen zu beobachten und aus einem Auftreten von Unterschieden auf eine Veränderung der kultivierten Zelle zu schließen. Mit anderen Worten, eine Zelle, die gegenüber ihrer ursprünglich kultivierten Zel le ei n a bweichendes D NA-Methylierungsmuster aufweist, ist qualitativ weniger hochwertig.
Es wird erfindungsgemäß bevorzugt, dass nicht nur die DNA-Methylierung von drei Genen bestimmt wird, sondern mehr Gene eingesetzt werden, um Unterschiede deutlicher zu machen . Erfindungsgemäß kann es sich dabei um drei oder vier oder fünf oder sieben oder zehn oder mehr Gene handeln.
Um einen repräsentativen Eindruck des Methyloms zu erhalten werden Gene, die auf verschiedenen Chromosomen lokalisiert sind untersucht, weil dies ei- nen verbesserten Überblick über die Situation der Zelle gibt.
In vielen Fällen wird es sinnvoll sein, Gene zu untersuchen, die zumindest teilweise einer Genfamilie angehören. In anderen Ausführungsformen kann es auch sinnvoll sein, beispielsweise zehn Gene zu untersuchen, wobei einige Gene zu einer Genfamilie gehören und die anderen Gene zu einer anderen Genfamilie gehören.
Wichtig für das erfindungsgemäße Verfahren ist, dass immer nur der Methylierungsgrad identischer Positionen in identischen CpG-Inseln von identischen Genen miteinander verglichen werden können.
Erfindungsgemäß ist es bevorzugt, dass an jeder der gemessenen CpG-Inseln nicht nur eine einzelne Position, sondern mehrere Positionen analysiert werden oder bei Vorhandensein mehrerer CpG-Inseln mehrere Positionen in mehreren CpG-Inseln.
Die Genfamilie, die erfindungsgemäß eingesetzt wird, ist die Genfamilie der olfaktorischen Rezeptor-Gene (The h u man olfactory receptor gene family, Malnic B, Godfrey PA, Buck LB. Proc Natl Acad Sei U S A. 2004 Feb 24; 101(8) : 2584-9. Erratum in : Proc Natl Acad Sei U S A. 2004 May 4; 101(18) : 7205 und The mouse olfactory receptor gene family. Godfrey PA, Malnic B, Buck LB. Proc Natl Acad Sei U S A. 2004 Feb 17; 101(7) : 2156-61. Epub 2004 Feb 9). Die olfaktorischen Rezeptor-Gene sind die größte Genfamilie im humanen Genom (ca. 1.000 Gene). Diese Gene sind in embryonalen und in induzierten pluripotenten Stammzellen in ihrem 5' Bereich mit einer CpG- Insel assoziiert und diese ist in beiden Stammzelltypen dicht methyliert. Hingegen sind dieselben CpG-Inseln derselben Gene in Fibroblasten weitestgehend unmethyliert. Da dieser Unterschied in jedem Chromosom mehrfach zu finden ist, stellt er eine ausgeprägte Repräsentanz für die DNA-Methylierung des Genoms ("Methylom") dar. Der besondere Vorteil der Genfamilie der olfak- torischen Rezeptor-Ge n e l i egt i n i h re r g ro ße n A n za h l , d i e ü be r a l l e Chromosonen verteilt sind und der dichten Methylierung bei embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen. Damit ist es möglich, die Methylierung an einer Vielzahl von differentiell methylierbaren genomischen Stellen zu ermitteln. Bevorzugt werden mindestens 10 Stellen, mehr bevorzugt mindestens 20, mindestens 50, mindestens 100 oder mindestens 1000 Stellen analysiert und für die Bewertung herangezogen.
Die Nomenklatur der Gene lautet "ORnXm", wobei
"OR" für die Olfactory Receptor Superfamily steht;
"n" eine ganze Zahl ist, die die Familie repräsentiert, wobei die Mitglieder eine Sequenzidentität von mehr als 40% aufweisen;
"X" ein einzelner Buchstabe ist, der eine Unterfamilie repräsentiert, wobei die Mitglieder mehr als 60% Sequenzidentität haben und
"m" eine ganze Zahl ist, die ein individuelles Familienmitglied bezeichnet.
So ist beispielsweise OR1A1 die erste Isoform der Subfamilie A der olfaktorischen Rezeptorfamilie 1.
Es wird davon ausgegangen, dass Rezeptoren der gleichen Subfamilie ähnliche Moleküle erkennen. Es existieren zwei große Gruppen, die Klasse I (fish-like receptor) mit den OR- Familien 51 bis 56 und die Klasse II (tetrapod) mit den OR-Familien 1 bis 13.
Bevorzugt verwendete Rezeptorgene sind folgende:
OR1A1; OR1A2; OR1AA1P; OR1AB1P; OR1AC1P; OR1B1; OR1C1; OR1D2;
OR1D3P; OR1D4; OR1D5; OR1E1; OR1E2; OR1E3; OR1F1; OR1F2P; OR1F12; OR1G1; OR1H1P; OR1I1; OR1J1; OR1J2; OR1J4; OR1K1; OR1L1; OR1L3;
OR1L4; OR1L6; OR1L8; OR1M1; OR1M4P; OR1N1; OR1N2; OR1P1; OR1Q1;
OR1R1P; OR1S1; OR1S2; OR1X1P; OR1X5P; OR2A1; OR2A2; OR2A3P;
OR2A4; OR2A5; OR2A7; OR2A9P; OR2A12; OR2A13P; OR2A14; OR2A15P;
OR2A20P; OR2A25; OR2A41P; OR2A42; OR2AD1P; OR2AE1; OR2AF1P; OR2AG1; OR2AG2; OR2AH1P; OR2AI1P; OR2AJ1; OR2AK2; OR2AL1P;
OR2AM1P; OR2A01P; OR2AP1; OR2AQ1P; OR2AS1P; OR2AS2P; OR2AT1P;
OR2AT2P; OR2AT4; OR2B2; OR2B3; OR2B4P; OR2B6; OR2B7P; OR2B8P;
OR2B11; OR2BH1P; OR2C1; OR2C3; OR2D2; OR2D3; OR2E1P; OR2F1;
OR2F2; OR2G1P; OR2G2; OR2G3; OR2G6; OR2H1; OR2H2; OR2H4P; OR2H5P; OR2I1P; OR2J1; OR2J2; OR2J3; OR2J4P; OR2K2; OR2L1P; OR2L2;
OR2L3; OR2L5; OR2L6P; OR2L8; OR2L9P; OR2L13; OR2M1P; OR2M2;
OR2M3; OR2M4; OR2M5; OR2M7; OR2N1P; OR2P1P; OR2Q1P; OR2R1P;
OR2S1P; OR2S2; OR2T1; OR2T2; OR2T3; OR2T4; OR2T5; OR2T6; OR2T7;
OR2T8; OR2T10; OR2T11; OR2T12; OR2T27; OR2T29; OR2T32P; OR2T33; OR2T34; OR2T35; OR2U1P; OR2U2P; OR2V1; OR2V2; OR2W1; OR2W2P;
OR2W3; OR2W4P; OR2W5; OR2W6P; OR2X1P; OR2Y1; OR2Z1; OR3A1;
OR3A2; OR3A3; OR3A4P; OR3B1P; OR3D1P; OR4A1P; OR4A2P; OR4A3P;
OR4A4P; OR4A5; OR4A6P; OR4A7P; OR4A8P; OR4A9P; OR4A10P; OR4A11P;
OR4A12P; OR4A13P; OR4A14P; OR4A15; OR4A16; OR4A17P; OR4A18P; OR4A19P; OR4A21P; OR4A40P; OR4A41P; OR4A42P; OR4A43P; OR4A44P;
OR4A45P; OR4A46P; OR4A47; OR4A48P; OR4A49P; OR4A50P; OR4B1;
OR4B2P; OR4C1P; OR4C2P; OR4C3; OR4C4P; OR4C5; OR4C6; OR4C7P;
OR4C9P; OR4C10P; OR4C11; OR4C12; OR4C13; OR4C14P; OR4C15;
OR4C16; OR4C45; OR4C46; OR4C48P; OR4C49P; OR4C50P; OR4D1; OR4D2; OR4D5; OR4D6; OR4D7P; OR4D8P; OR4D9; OR4D10; OR4D11; OR4D12P;
OR4E1; OR4E2; OR4F1P; OR4F2P; OR4F3; OR4F4; OR4F5; OR4F6; OR4F7P;
OR4F8P; OR4F13P; OR4F14P; OR4F15; OR4F16; OR4F17; OR4F21; OR4F28P;
OR4F29; OR4G1P; OR4G2P; OR4G3P; OR4G4P; OR4G6P; OR4G11P; OR4H6P;
OR4H12P; OR4K1; OR4K2; OR4K3; OR4K4P; OR4K5; OR4K6P; OR4K7P; OR4K8P; OR4K11P; OR4K12P; OR4K13; OR4K14; OR4K15; OR4K16P;
OR4K17; OR4L1; OR4M1; OR4M2; OR4N1P; OR4N2; OR4N3P; OR4N4;
OR4N5; OR4P1P; OR4P4; OR4Q1P; OR4Q2; OR4Q3; OR4R1P; OR4R2P;
OR4R3P; OR4S1; OR4S2; OR4T1P; OR4U1P; OR4V1P; OR4W1P; OR4X1;
OR4X2; OR4X7P; OR5A1; OR5A2; OR5AC1; OR5AC2; OR5AC4P; OR5AH1P; OR5AK1P; OR5AK2; OR5AK3P; OR5AK4P; OR5AL1; OR5AL2P; OR5AM1P;
OR5AN1; OR5AN2P; OR5A01P; OR5AP1P; OR5AP2; OR5AQ1P; OR5AR1;
OR5AS1; OR5AU1; OR5AW1P; OR5AZ1P; OR5B1P; OR5B2; OR5B3; OR5B10P;
OR5B12; OR5B15P; OR5B17; OR5B19P; OR5B21; OR5BA1P; OR5BB1P;
OR5BC1P; OR5BD1P; OR5BE1P; OR5BH1P; OR5BJ1P; OR5BK1P; OR5BL1P; OR5BM1P; OR5BN1P; OR5BN2P; OR5BP1P; OR5BQ1P; OR5BR1P; OR5BS1P;
OR5BT1P; OR5C1; OR5D2P; OR5D3P; OR5D13; OR5D14; OR5D15P; OR5D16;
OR5D17P; OR5D18; OR5E1P; OR5F1; OR5F2P; OR5G1P; OR5G3; OR5G4P;
OR5G5P; OR5H1; OR5H2; OR5H3P; OR5H4P; OR5H5P; OR5H6; OR5H7P;
OR5H8P; OR5H14; OR5H15; OR5I1; OR5J1P; OR5J2; OR5J7P; OR5K1; OR5K2; OR5K3; OR5K4; OR5L1; OR5L2; OR5M1; OR5M2P; OR5M3; OR5M4P;
OR5M5P; OR5M6P; OR5M7P; OR5M8; OR5M9; OR5M10; OR5M11; OR5M12P;
OR5M13P; OR5M14P; OR5P1P; OR5P2; OR5P3; OR5P4P; OR5R1; OR5S1P;
OR5T1; OR5T2; OR5T3; OR5V1; OR5W1P; OR5W2; OR6A2; OR6B1; OR6B2;
OR6B3; OR6C1; OR6C2; OR6C3; OR6C4; OR6C5P; OR6C6; OR6C7P; OR6C64P; OR6C65; OR6C66P; OR6C68; OR6C69P; OR6C70; OR6C71P;
OR6C72P; OR6C73P; OR6C74; OR6C75; OR6C76; OR6D1P; OR6E1P; OR6F1;
OR6J1; OR6K1P; OR6K2; OR6K3; OR6K4P; OR6K5P; OR6K6; OR6L1P;
OR6L2P; OR6M1; OR6M2P; OR6M3P; OR6N1; OR6N2; OR6P1; OR6Q1;
OR6R1P; OR6R2P; OR6S1; OR6T1; OR6U2P; OR6V1; OR6W1P; OR6X1; OR6Y1; OR7A1P; OR7A2P; OR7A3P; OR7A5; OR7A8P; OR7A10; OR7A11P;
OR7A15P; OR7A17; OR7A18P; OR7A19P; OR7C1; OR7C2; OR7D1P; OR7D2;
OR7D4; OR7D11P; OR7E1P; OR7E2P; OR7E4P; OR7E5P; OR7E7P; OR7E8P;
OR7E10P; OR7E11P; OR7E12P; OR7E13P; OR7E14P; OR7E15P; OR7E16P;
OR7E18P; OR7E19P; OR7E21P; OR7E22P; OR7E23P; OR7E24; OR7E25P; OR7E26P; OR7E28P; OR7E29P; OR7E31P; OR7E33P; OR7E35P; OR7E36P;
OR7E37P; OR7E38P; OR7E39P; OR7E41P; OR7E43P; OR7E46P; OR7E47P;
OR7E53P; OR7E55P; OR7E59P; OR7E62P; OR7E66P; OR7E83P; OR7E84P;
OR7E85P; OR7E86P; OR7E87P; OR7E89P; OR7E90P; OR7E91P; OR7E93P;
OR7E94P; OR7E96P; OR7E97P; OR7E99P; OR7E100P; OR7E101P; OR7E102P; OR7E104P; OR7E105P; OR7E106P; OR7E108P; OR7E109P; OR7E110P;
OR7E111P; OR7E115P; OR7E116P; OR7E117P; OR7E121P; OR7E122P;
OR7E125P; OR7E126P; OR7E128P; OR7E129P; OR7E130P; OR7E136P;
OR7E140P; OR7E145P; OR7E148P; OR7E149P; OR7E154P; OR7E155P;
OR7E156P; OR7E157P; OR7E158P; OR7E159P; OR7E160P; OR7E161P; OR7E162P; OR7G1; OR7G2; OR7G3; OR7G15P; OR7H1P; OR7H2P; OR7K1P;
OR7L1P; OR7M1P; OR8A1; OR8A2P; OR8A3P; OR8B1P; OR8B2; OR8B3;
OR8B4; OR8B5P; OR8B6P; OR8B7P; OR8B8; OR8B9P; OR8B10P; OR8B12;
OR8C1P; OR8D1; OR8D2; OR8D4; OR8F1P; OR8G1; OR8G2; OR8G3P;
OR8G5; OR8G7P; OR8H1; OR8H2; OR8H3; OR8I1P; OR8I2; OR8I4P; OR8J1; OR8J2; OR8J3; OR8K1; OR8K2P; OR8K3; OR8K4P; OR8K5; OR8L1P; OR8Q1P;
OR8R1P; OR8S1; OR8S21P; OR8T1P; OR8U1; OR8U8; OR8U9; OR8V1P;
OR8X1P; OR9A1P; OR9A2; OR9A3P; OR9A4; OR9G1; OR9G2P; OR9G3P;
OR9G4; OR9G9; OR9H1P; OR9I1; OR9I2P; OR9I3P; OR9K1P; OR9K2;
OR9L1P; OR9M1P; OR9N1P; OR9P1P; OR9Q1; OR9Q2; OR9R1P; OR9S24P OR10A2; OR10A3; OR10A4; OR10A5; OR10A6; OR10A7; OR10AA1P OR10AB1P; OR10AC1P; OR10AD1; OR10AE1P; OR10AE3P; OR10AF1P OR10AG1; OR10AH1P; OR10AK1P; OR10B1P; OR10C1; OR10D1P; OR10D3 OR10D4P; OR10D5P; OR10G1P; OR10G2; OR10G3; OR10G4; OR10G5P OR10G6; OR10G7; OR10G8; OR10G9; OR10H1; OR10H2; OR10H3; OR10H4 OR10H5; OR10J1; OR10J2P; OR10J3; OR10J4; OR10J5; OR10J6P; OR10J7P OR10J8P; OR10J9P; OR10K1; OR10K2; OR10N1P; OR10P1; OR10Q1 OR10Q2P; OR10R1P; OR10R2; OR10R3P; OR10S1; OR10T1P; OR10T2 OR10U1P; OR10V1; OR10V2P; OR10V3P; OR10V7P; OR10W1; OR10X1 OR10Y1P; OR10Z1; OR11A1; OR11G1P; OR11G2; OR11H1; OR11H2 OR11H3P; OR11H4; OR11H5P; OR11H6; OR11H7; OR11H12; OR11H13P OR11I1P; OR11J1P; OR11J2P; OR11J5P; OR11K1P; OR11K2P; OR11L1 OR11M1P; OR11N1P; OR11P1P; OR11Q1P; OR12D1P; OR12D2; OR12D3 OR13A1; OR13C1P; OR13C2; OR13C3; OR13C4; OR13C5; OR13C6P, OR13C7P; OR13C8; OR13C9; OR13D1; OR13D2P; OR13D3P; OR13E1P OR13F1; OR13G1; OR13H1; OR13I1P; OR13J1; OR13K1P; OR13Z1P OR13Z2P; OR13Z3P; OR14A2; OR14A16; OR14C36; OR14I1; OR14J1 OR14K1; OR14L1P; OR51A1P; OR51A2; OR51A3P; OR51A4; OR51A5P OR51A6P; OR51A7; OR51A8P; OR51A9P; OR51A10P; OR51AB1P; OR51B2 OR51B3P; OR51B4; OR51B5; OR51B6; OR51B8P; OR51C1P; OR51C4P OR51D1; OR51E1; OR51E2; OR51F1; OR51F2; OR51F3P; OR51F4P; OR51F5P OR51G1; OR51G2; OR51H1P; OR51H2P; OR51I1; OR51I2; OR51J1, OR51K1P; OR51L1; OR51M1; OR51N1P; OR51P1P; OR51Q1; OR51R1P OR51S1; OR51T1; OR51V1; OR52A1; OR52A4; OR52A5; OR52B1P; OR52B2 OR52B3P; OR52B4; OR52B5P; OR52B6; OR52D1; OR52E1; OR52E2 OR52E3P; OR52E4; OR52E5; OR52E6; OR52E7P; OR52E8; OR52H1 OR52H2P; OR52I1; OR52I2; OR52J1P; OR52J2P; OR52J3; OR52K1; OR52K2 OR52K3P; OR52L1; OR52L2P; OR52M1; OR52M2P; OR52N1; OR52N2 OR52N3P; OR52N4; OR52N5; OR52P1P; OR52P2P; OR52Q1P; OR52R1, OR52S1P; OR52T1P; OR52U1P; OR52V1P; OR52W1; OR52X1P; OR52Y1P OR52Z1; OR55B1P; OR56A1; OR56A3; OR56A4; OR56A5; OR56A7P; OR56B1; OR56B2P; OR56B3P; OR56B4.
Als Verfahren zur Bestimmung der DNA-Methylierung sind verschiedenste Verfahren gebräuchlich. Ein gebräuchliches Verfahren ist die methylierungs- spezifische PCR. Hierbei wird durch Einsatz von Bisulfit das methylierte Cytosin in Uracil umgewandelt. Durch die Verwendung spezifischer Primer kann untersucht werden, ob die jeweils zu untersuchenden Stellen methyliert sind oder nicht. Das Messverfahren ist dabei eine Real Time-PCR, bei der markierte Marker oder markierte Sonden eingesetzt werden.
Ein alternatives Verfahren zur Bestimmung ist das sogenannte Nimble-Gene der Firma Roche. Bei diesem Verfahren werden DNA-Fragmente mit Hilfe von
5'-Methylcytidinspezifischen Antikörpern ausgefällt, isoliert und nach Amplifi- kation auf einen Array detektiert.
Auch andere Verfahren beispielsweise durch radioaktive Markierung, durch Southern Blot o.ä. sind möglich. Bei der Analyse mehrerer CpG-Inseln oder mehrerer Positionen in einer CpG- Insel oder mehrerer Gene können die dafür verwendeten methylierungsspezi- fischen PCR-Reaktionen grundsätzlich auch in einer PCR mit einer Vielzahl von Primern durchgeführt werden. Um die Spezifität der PCR zu erhöhen, ist es bevorzugt, dass die jeweiligen Untersuchungen getrennt durchgeführt werden. In vielen Ausführungsformen wird es hilfreich sein, zusätzlich Kontrollen einzufügen, um die Qualität der Messung zu überprüfen.
Da sich zwischen den Messungen Unterschiede ergeben können, wird es ebenfalls häufig sinnvoll sein, die Referenzzelle und die Stammzelle zeitgleich i n zwei Reaktionen zu prüfen. In vielen Fällen wird es aber auch genügen, für die Methylierung der Stammzellen auf frühere Messungen und entsprechend gespeicherte Daten zurückzugreifen.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Qualitätsbestimmung einer pluripotenten Stammzelle umfassend die Schritte
- Messen der DNA-Methylierung mindestens eines CpG in einer CpG-Insel in mindestens zwei Genen der pluripotenten Stammzelle
- Vergleich mit der DNA-Methylierung des mindestens einen CpG in einer CpG-Insel in den mindestens zwei Genen mindestens einer Referenzzelle.
Figur 1 zeigt den DNA Methylierungsstatus im 5 ' Bereich von je drei Olfaktorische Rezeptorgenen auf drei verschiedenen Chromosomen in Fibroblasten, IPSFibroblasten und ES Zellen (13).
Figur 2 zeigt den DNA Methylierungsstatus im 5' Bereich von Olfaktorische Rezeptorgenen auf Chromosom 1 in Fibroblasten, IPSFibroblasten und ES Zellen (13)
Figur 3 zeigt den DNA Methylierungsstatus im 5' Bereich von Olfaktorische Rezeptorgenen auf Chromosom 11 in Fibroblasten, IPSFibroblasten und ES Zellen (13)
Figur 4 zeigt den DNA Methylierungsstatus im 5' Bereich von Olfaktorische Rezeptorgenen auf Chromosom 19 in Fibroblasten, IPSFibroblasten und ES Zellen (13) Figur 5 zeigt den DNA Methylierungsstatus im 5' Bereich von Olfaktorische Rezeptorgenen auf Chromosom 17 in Fibroblasten, IPSFibroblasten und ES Zellen (13)
Figur 6 zeigt den DNA Methylierungsstatus im 5' Bereich von Olfaktorische Rezeptorgenen auf Chromosom 3 in Fibroblasten, IPSFibroblasten und ES Zellen (13)
Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele näher erläutert: 1. Isolierung qenomischer DNA
Genomische DNA wurde wie folgt isoliert: Die genomische DNA wurde mittels des Qiagen DNAeasy blood&tissue DNA isolations kit aus den Zellen isoliert. 2. Isolierung von methylierter DNA
genomischer DNA wurde durch Ultraschallsonifizierung in eine Fragmentgröße von etwa 300 bis 1.000 Basenpaare überführt. Die methylierten DNA-Fragmente wurden mittels eines methylcytosinspezifischen Antikörpers präzipitiert; verwendet wurde ein Methylamp Methylated DNA Capture Kit (MeDIP der Firma Diagenode).
3. Analyse der Methylierunq
Die Präzipitate wurden auf einem Nimble-Gene 385K Ref. Seq. Promoter Array HG18 hybridisiert (Firma Roche). Auf diesem Array befinden sich, kovalent gebunden, die Promoterregion aller bekannten CpG dinukleotidreichen Gene in Form von 50mer Oligonukleotidproben.
Die hybridisierten Arrays wurden mit einem Microarray-Scanner (molecular devices) gescannt und Bilder mit der Axon Genepix-Software generiert. Zur Analyse wurden Nimble-Scan Version 2.5 und Signal-Map Version 1.9 eingesetzt. 4. Oualitätsbestimmunq
Eingesetzt wurden (a) Zellen aus Fibroblasten, (b) pluripotenten Stammzellen, die aus Fibroblasten durch retroviralen Transfer der vier Transkriptionsfaktoren, Oct3/4, Sox2, c-Myc, and Klf4 induziert wurden (analog : Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Takahashi K, Yamanaka S. Cell. 2006 Aug 25; 126(4) : 663-76. Epub 2006 Aug 10 sowie (c) eine bekannte embryonale Zelllinie 1-3. Analysiert wurde die CpG-Methylierung auf olfaktorischen Rezeptorgenen verschiedener Chromosomen. Die Ergebnisse der Analysen sind in den Figuren 1 bis 6 dargestellt.