WO2012029694A1 - Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質の第１００番アミノ酸がアルギニンであるか否かを判定する方法 - Google Patents

Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質の第１００番アミノ酸がアルギニンであるか否かを判定する方法 Download PDF

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antibody
amino acid
arginine
influenza
virus
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PCT/JP2011/069399
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信之 藤井
貴志 白川
内田　好昭
和也 小見
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富士レビオ株式会社
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    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1018—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G—PHYSICS
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining whether the 100th amino acid of influenza A virus nucleoprotein is arginine, which is useful for detection of avian influenza virus.
  • NP nucleoprotein
  • Many of the simple kits for detecting influenza A virus currently on the market use antibodies against nucleoprotein (NP), but these react in common with type A viruses. Such an antibody cannot distinguish between human influenza A virus and avian influenza virus.
  • NP nucleoprotein
  • Several cases of avian influenza virus infecting humans have been reported in the past, and there is concern about the generation of a new avian influenza virus that has acquired human-to-human infectivity. There is a need to develop diagnostic methods that can be detected separately.
  • Patent Document 1 describes a rapid diagnosis method specific to an avian influenza virus using an anti-avian influenza virus NP antibody.
  • the antibody recognizes an epitope present in the region of positions 46 to 159 from the N-terminal side of the amino acid sequence of avian influenza virus NP, but no detailed epitope has been identified, and its effectiveness Is limited. For example, it is impossible to predict the antibody reactivity when an NP amino acid mutation occurs.
  • the present invention is to provide a novel means useful for distinguishing and detecting avian influenza virus from other influenza A viruses.
  • the inventors of the present invention use an avian influenza virus (H5 subtype) recombinant NP full-length protein as an immunogen, and screen for avian influenza virus (H5 subtype), new influenza virus Pandemic (H1N1) 2009, seasonal H1 subtype
  • H5 subtype avian influenza virus
  • H1N1 new influenza virus Pandemic
  • monoclonal antibodies were prepared using the recombinant NP full-length protein of virus and seasonal H3 subtype virus, we succeeded in obtaining multiple antibodies that react specifically with H5 subtype avian influenza virus.
  • the reactivity of the antibody is lost to fragmented NP, and when the 100th arginine of avian influenza virus NP is replaced with valine, the antibody is not recognized That the antibody reacts when the 100th amino acid of human influenza virus NP is substituted with arginine, and the antibody specifically recognizes the NP of influenza A virus whose 100th amino acid is arginine I found out that I can do it. Furthermore, the database analysis revealed that the 100th arginine of NP is an amino acid characteristic of avian influenza virus, and the present invention was completed.
  • the present invention is substantially different from the nucleoprotein of influenza A virus that binds to the nucleoprotein whose 100th amino acid is arginine by antigen-antibody reaction and whose 100th amino acid is valine or isoleucine.
  • An antibody that does not bind to the antibody or an antigen-binding fragment thereof is brought into contact with a specimen, and immunoassay is performed for substantial binding between the influenza A virus nucleoprotein that may be present in the specimen and the antibody or the antigen-binding fragment thereof.
  • a method for determining whether or not the 100th amino acid of influenza A virus nucleoprotein is arginine comprising detecting by a method.
  • a means for determining whether the 100th amino acid of influenza A virus NP is arginine or not by the binding property with an antibody is provided.
  • NP's 100th arginine is an amino acid characteristic of avian influenza virus, and all known H5 subtype influenza viruses derived from avians that have been infected with humans are NP's 100th amino acid is arginine is there. Therefore, an antibody specific for NP of No. 100 arginine is useful for detecting avian influenza viruses, particularly influenza viruses derived from birds that infect humans.
  • An antibody specific for avian influenza virus NP is known as described in Patent Document 1, but no example is known in which a region important for specific binding to an antigen is specified at the level of 1 amino acid. .
  • avian influenza antibodies With known avian influenza antibodies, the usefulness of mutations in the NP sequence of avian influenza virus is not clear.
  • the specificity of the antibody used in the present invention is specified at the level of one amino acid, its usefulness when a mutation occurs in the avian influenza virus is clear.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the recombinant NP fragment of A / duck / Hokkaido / Vac-1 / 04 (H5N1) produced for the epitope analysis of antibody H5-119. It is a schematic cross section of the immunoassay instrument (immunochromatography instrument) produced in the examples. It is a schematic top view of the immunoassay instrument (immunochromatography instrument) produced in the Example.
  • the antibody used in the present invention binds to an NP ("NP-R100") in which the 100th amino acid of the influenza A virus nucleoprotein (NP) is arginine by an antigen-antibody reaction, and the 100th amino acid is valine.
  • NP that is isoleucine
  • anti-NP-R100 antibody this antibody is referred to as “anti-NP-R100 antibody”.
  • the antibody is contacted with a specimen that may contain influenza A virus NP, and substantial binding between the antibody and NP is detected by immunoassay, whereby the 100th amino acid of the NP is arginine. It can be determined whether or not there is.
  • substantially does not bind and “not substantially bind” means that NP-V100 and NP-I100 do not bind at a detectable level, or bind at a detectable level.
  • the degree of binding is very weak and clearly less than that of NP-R100, and those skilled in the art only bind to the extent that it is determined not to bind to NP-V100 and NP-I100. Means.
  • reactivity with various influenza A viruses is examined by immunochromatography using the antibody of the present invention, but when this method is used, color development by a labeling enzyme is detected in the detection zone. If not, it can be determined that there is no binding at a detectable level.
  • the anti-NP-R100 antibody binds only to NP-R100 and does not bind to NP-V100 and NP-I100 at a detectable level.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the NP amino acid sequence of A / duck / Hokkaido / Vac-1 / 04 (H5N1), which is one of the H5 subtype influenza virus isolates. Is the nucleotide sequence of the NP gene encoding. These sequences are also registered in GenBank with accession number AB259713.
  • the “100th amino acid” as used in the present invention represents the position based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • There are a number of isolates of influenza A virus including H5 subtype avian influenza virus the amino acid sequences of these NPs are also known, and the number of amino acids of NP is usually 498.
  • the antibody used in the present invention is not particularly limited, but a monoclonal antibody is preferable from the viewpoint of reproducibility in immunoassay.
  • the anti-NP-R100 antibody used in the present invention is a full-length NP of influenza A virus in which the 100th amino acid is arginine (for example, A / duck / Hokkaido / Vac-1 / 04 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2).
  • the recombinant NP of (H5N1) can be used as an immunogen, and can be prepared by immunizing animals (excluding humans) with the appropriate NP together with an adjuvant according to a well-known conventional method.
  • Methods for producing recombinant proteins are also well known, and those skilled in the art can appropriately design primers with reference to the base sequence (eg, SEQ ID NO: 1) encoding recombinant NP-R100, and use influenza virus genomic RNA as a template. It can be easily obtained by synthesizing cDNA by RT-PCR, incorporating it into an appropriate expression vector, introducing it into a host cell, and recovering the expressed NP-R100. In the immunized animal, antibodies against NP-R100 are induced.
  • base sequence eg, SEQ ID NO: 1
  • hybridomas are prepared by fusing antibody-producing cells such as spleen cells and lymphocytes collected from immunized animals with myeloma cells, and then binding to full-length NP-R100 from the obtained hybridomas.
  • antibody-producing cells such as spleen cells and lymphocytes collected from immunized animals with myeloma cells
  • NP-R100 full-length NP-R100 from the obtained hybridomas.
  • NP-V100 examples include recombinant NP of human seasonal H1 subtype or H3 subtype influenza virus
  • specific examples of NP-I100 include swine-derived human influenza A virus Pandemic ( H1N1) 2009 recombinant NP.
  • the 100th arginine of NP is an amino acid characteristic of avian influenza virus.
  • the anti-NP-R100 antibody used in the present invention has a sequence other than the 100th amino acid of human influenza virus NP. Even so, if the 100th amino acid is arginine, it can be bound (see Examples below). Therefore, it is also possible to use influenza virus NP mutants of animals other than birds in which the 100th amino acid is substituted with arginine as an immunogen or screening antigen.
  • Antigen-binding fragment means an antibody fragment that maintains the binding ability (antigen-antibody reactivity) of the antibody to the corresponding antigen, such as an Fab fragment or F (ab ′) 2 fragment of an immunoglobulin, for example. To do. It is well known that such antigen-binding fragments can also be used for immunoassays, and are useful in the same manner as the original antibody. Fab fragments and F (ab ′) 2 fragments can be obtained by treating monoclonal antibodies with proteolytic enzymes such as papain and pepsin, as is well known.
  • the antigen-binding fragment is not limited to the Fab fragment or the F (ab ′) 2 fragment, and may be any fragment that maintains the binding property with the corresponding antigen. It may be prepared.
  • an antibody in which a single chain fragment of variable region (scFv: single chain fragment of variable region) is expressed in E. coli can be used by a genetic engineering technique.
  • the method for producing scFv is also well known.
  • the hybridoma mRNA produced as described above is extracted, single-stranded cDNA is prepared, and PCR is performed using primers specific to immunoglobulin H chain and L chain for immunization.
  • the presence or absence of substantial binding is detected by immunoassay.
  • the immunoassay method itself is a well-known conventional method. Classification by reaction mode includes sandwich method, competition method, agglutination method, Western blot method and the like. Further, when classified by label, there are radioimmunoassay, fluorescent immunoassay, enzyme immunoassay, biotin immunoassay and the like. In the present invention, any immunoassay method may be used. If a quantitative method is used, it is possible to examine the amount of NP-R100 present in the specimen.
  • the sandwich method, the competitive method, and the agglutination method are preferable as the immunoassay method used in the present invention because they are simple in operation and do not require a large-scale apparatus.
  • sandwich methods such as sandwich ELISA and immunochromatography are more preferred when the method of the present invention is carried out quickly and easily at a medical site.
  • NP-R100 any specimen can be used as long as it is desired to detect whether or not NP-R100 is contained.
  • Body fluids such as blood (including whole blood, plasma, and serum), saliva, sputum, mucous wipes, instruments, etc.
  • the wiping liquid of an installation can be mentioned, it is not limited to these.
  • influenza A virus NP When binding between the anti-NP-R100 antibody and its antigen is detected by immunoassay, influenza A virus NP is present in the sample and the 100th amino acid of the NP is arginine It is determined.
  • influenza A virus NP whose 100th amino acid is arginine is not present in the sample.
  • influenza A virus NP may not be present in the sample in the first place, or influenza A virus NP that is not NP-R100 may exist.
  • both NP of influenza virus virus NP 100th NP that is arginine and NP that is not arginine (specific examples are NP-V100 and NP-I100) It is possible to examine whether or not influenza A virus NP itself exists in the specimen by performing an immunoassay using an anti-A NP antibody that can commonly detect type A NP that binds to A.
  • the anti-A type NP antibody here specifically refers to type A that commonly binds to NPs of various subtypes of influenza A virus (for example, NP-R100, NP-V100, NP-I100, etc.).
  • An antibody for detection which is substantially non-binding to influenza B virus NP, preferably at a detectable level. Many such antibodies are known and are also used in commercially available influenza test kits.
  • the anti-NP-R100 antibody used in the present invention specifically recognizes and binds to the full-length NP in which the 100th amino acid is arginine, but the NP is about half or less in size as in the following examples. When fragmented, even fragments containing the 100th amino acid will not bind.
  • the 100th arginine is an amino acid characteristic of avian influenza virus, but the anti-NP-R100 antibody binds even if it is a point mutant in which the 100th amino acid of NP of human influenza A virus is replaced with arginine To do. From this, it is presumed that the anti-NP-R100 antibody used in the present invention recognizes the three-dimensional structure (surface shape) of the NP molecule formed when the 100th amino acid is arginine.
  • the determination method of the present invention is performed on a sample isolated from an animal other than birds (for example, humans). As a result, influenza A virus NP is present in the sample, and the 100th amino acid of the NP is If it is determined to be arginine, it can be determined that the animal is infected with an avian-derived influenza virus. Therefore, the determination method for No. 100 arginine of the present invention can also be implemented as a method for detecting an avian-derived influenza virus.
  • bird-derived influenza virus refers to an influenza A virus that has infected an animal other than a bird but has not acquired infectivity between the animals and an animal other than a bird.
  • Influenza A viruses that have acquired infectivity between the animals are included.
  • human infectious avian influenza viruses that have not acquired human-to-human infectivity, and influenza viruses that have acquired human-human infectivity are included.
  • the 100th amino acid of the NP of the virus is Any arginine can be detected by the method of the present invention.
  • the anti-NP-R100 antibody used in the present invention has a specificity specified at a single amino acid level. Therefore, the usefulness when a mutation occurs in the avian influenza virus is also clear.
  • an anti-influenza A virus NP antibody is immobilized on a solid phase and reacted with a sample. After washing, the labeled anti-influenza A virus NP antibody is reacted, and after washing, the labeled antibody bound to the solid phase is measured.
  • the presence of NP-R100 can be detected by using an anti-NP-R100 antibody as at least one of the immobilized antibody and the labeled antibody.
  • the anti-NP-R100 antibody can be used for both the immobilized antibody and the labeled antibody.
  • the anti-NP-R100 antibody is used only for either one of the immobilized antibody and the labeled antibody, the other is, for example, type A NP in which No. 100 is arginine and type A NP that is not arginine (specific examples are: Antibodies that can detect both type A and bind to both NP-V100 and NP-I100) can be used.
  • an antibody that can be detected in common with type A (the same antibody as the labeled antibody may be used. If different antibodies may be immobilized on the solid phase, the presence or absence of NP in influenza A virus that is not NP-R100 can be detected simultaneously with NP-R100.
  • An antibody that can be detected in common with type A as described above, binds in common to NPs of various subtypes of influenza A virus, and is substantially, preferably detectable with influenza B virus NP. It is an antibody for type A detection that does not bind at the level. As described above, an antigen-binding fragment of the antibody can be used instead of the antibody.
  • immunochromatography When quantifying the virus in a specimen, a sandwich method using a microplate well or bead as a solid phase, such as ELISA, can be preferably used.
  • immunochromatography (often abbreviated as “immunochromatography”) is preferably used when it is desired to quickly and easily detect viruses in a specimen at a medical site. Immunochromatography itself and instruments used therefor (hereinafter sometimes referred to as “immunochromatography instruments”) are well known and are also specifically described in the following examples.
  • immunochromatography instruments are well known and are also specifically described in the following examples.
  • a lateral flow type immunochromatography will be described by taking an immunochromatography instrument for detecting NP-R100 as an example.
  • a matrix made of a porous material such as a nitrocellulose membrane is usually formed in a strip shape.
  • a detection zone in which an anti-NP-R100 monoclonal antibody that specifically binds to NP-R100 is solid-phased, and labeled upstream (upstream in the flow direction of the developing solution described later)
  • a labeled reagent zone in which the anti-A-type NP monoclonal antibody is spotted is provided.
  • This labeled antibody may be an antibody that commonly binds to NPs of various subtypes of influenza A virus, may be the same antibody as the immobilized anti-NP-R100 antibody, It may be a second antibody that specifically binds to NP-R100, which is different from the immobilized anti-NP-R100 antibody.
  • the labeling reagent zone is usually formed by a porous pad on which the labeled antibody is spotted. Composed.
  • a developing solution tank storing a developing solution is provided at the upstream end of the matrix.
  • a development confirmation part in which the antibody against the label is immobilized to confirm whether or not the development of the labeled antibody has occurred downstream of the detection zone, and a developing solution that has flowed further downstream are provided.
  • a developing liquid absorption zone provided with a porous absorption pad for absorption is provided.
  • the label is an enzyme
  • a substrate zone in which a substrate for the labeling enzyme is spotted is provided upstream of the labeling reagent zone.
  • the sample is added to the labeling reagent zone, the developing solution tank is broken, and the developing solution is applied to the upper end of the matrix.
  • the developing solution flows downstream due to the capillary action of the matrix.
  • the substrate is eluted in the developing solution, and the developing solution containing the substrate flows.
  • the labeled antibody and the sample are eluted in the developing solution, and the developing solution containing the substrate, the labeled antibody, and the sample flows.
  • NP-R100 is contained in the sample, NP-R100 and labeled antibody are bound by an antigen-antibody reaction.
  • the immobilized antibody and NP-R100 bind to each other by the antigen-antibody reaction in the detection zone.
  • the labeled antibody is immobilized on the detection zone via NP-R100. Therefore, NP-R100 can be detected by measuring the label immobilized on the detection zone.
  • NP-R100 is not contained in the sample, nothing is bound to the immobilized antibody, so that the labeled antibody is not fixed to the detection zone but flows further downstream. Therefore, no label is detected in the detection zone.
  • the antibody against the label is solid-phased in the developing solution confirmation section downstream of the detection zone, the labeled antibody is fixed to the developing solution confirmation section. When a label is detected in the developing solution confirmation unit, it is confirmed that the developing solution has flowed correctly.
  • the developing liquid is further absorbed by the absorption pad downstream thereof.
  • the immobilized antibody is an anti-NP-R100 monoclonal antibody, and it has been explained that the labeled antibody can be an antibody that binds to type A NP in common.
  • the labeled antibody may be reversed.
  • the antibody used may be an antigen-binding fragment.
  • the immunochromatography instrument may further include another detection zone.
  • a common type A detection zone that can commonly detect various subtypes of type A influenza viruses may be provided.
  • the labeled antibody is an antibody that commonly binds to NP of type A
  • the NP-R100 detection zone is an anti-NP-R100 antibody
  • the A type detection zone is an antibody that binds to A type NP in common ( The same antibody as the labeled antibody or a different antibody) may be immobilized.
  • the presence or absence of an A-type NP that is not NP-R100 is detected at the same time, so it is possible to examine whether or not the A-type influenza virus NP itself is present in the sample.
  • rNP anti-avian influenza virus NP monoclonal antibody
  • Recombinant full-length NP (rNP) (SEQ ID NO: 2) of avian influenza virus A / duck / Hokkaido / Vac-1 / 04 (H5N1) was prepared by an ordinary method as an immunogen. Specifically, cDNA encoding NP is synthesized from the genomic RNA of the virus strain by RT-PCR, purified, then incorporated into a known expression vector, introduced into Escherichia coli, and the expressed rNP collected and purified on a column I got it. This was immunized to a mouse, and a hybridoma producing an antibody against the immunogen was prepared by a conventional hybridoma method. Screening was carried out by sandwich ELISA using four types of recombinant full-length NPs shown in Table 1 below as antigens prepared by a conventional method.
  • Solid phase ELISA A solution prepared by adding rNP to PBS at 1 ⁇ g / ml was added to a 96-well assay plate at 50 ⁇ l / well and coated at 37 ° C. for 1 hour. After washing with PBST, 50 ⁇ l / well of an anti-NP antibody solution was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing with PBST, 50 ⁇ l / well of POD-labeled anti-mouse IgG antibody was added, reacted at 37 ° C. for 1 hour, washed with PBST, developed with ABTS substrate system, and absorbance at A405 nm was measured with a microplate reader. .
  • Sandwich ELISA with FVA2-11 A solution of anti-mouse IgG antibody prepared at 5 ⁇ g / ml in PBS was added to a 96-well assay plate at 50 ⁇ l / well and coated at 37 ° C. for 1 hour. After washing with PBST, 50 ⁇ l / well of an anti-NP antibody solution was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing with PBST, rNP was added at 50 ⁇ l / well and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing with PBST, alkaline phosphatase-labeled FVA2-11 was added at 50 ⁇ l / well and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • FVA2-11 is a known anti-A type NP antibody that is also used in commercially available influenza detection kits, and is an antibody that can commonly detect type A (reference: Gui-Rong BAI et.al). .: Improvement of a Rapid Diagnosis Kit to Detect Either Influenza A or B Virus Infection. J. Vet. Med. Sci. 68 (1); 1-6, 2006, and WO / 2005/007697).
  • H5-119 Epitope analysis of anti-avian influenza virus mAb H5-119 (1) Analysis using recombinant NP fragment of A / duck / Hokkaido / Vac-1 / 04 (H5N1) Fragment of recombinant NP of avian influenza virus A / duck / Hokkaido / Vac-1 / 04 (H5N1) Fig. 1) was prepared, and the reactivity of H5-119 was examined by Western blotting. As a result, H5-119 did not react with these NP fragments. It is considered that H5-119 recognizes NP conformational epitope, not linear epitope.
  • a solution prepared by adding anti-NP antibody (FVA2-11 or H5-119) to 5 ⁇ g / ml with PBS was added to a 96-well assay plate at 100 ⁇ l / well and coated at 37 ° C. for 1 hour.
  • a mixed solution of biotinylated H5HrNP and each chimeric rNP was added at 100 ⁇ l / well and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • 100 ⁇ l / well of streptavidin-conjugated alkaline phosphatase was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • color was developed with the p-NPP substrate system, and the absorbance at A405 nm was measured with a microplate reader.
  • biotin-labeled H5 rNP bound to an anti-NP antibody immobilized on a plate is measured.
  • the chimeric rNP competes and binds to the immobilized antibody, the binding between the biotin-labeled rNP and the antibody is inhibited, and the measured value decreases. Thereby, the presence or absence of inhibition by the chimeric rNP can be examined.
  • NCBI Influenza Virus Resource stores the sequence information of influenza viruses identified so far. Using this database, the 100th amino acid of influenza A virus NP isolated from humans and birds during the period 2005-2008 and July-December 2009 was examined. The results are shown in Table 4.
  • H5 virus In human influenza viruses (H1 subtype and H3 subtype), almost all were valine or isoleucine, and only about 1800 out of 1800 isolates were arginine.
  • all of the 89 strains of H5 virus that infected humans (avian influenza virus that infected humans) were arginine.
  • influenza virus isolated from birds 99.3% of 818 strains were arginine, and only 5 strains were valine or isoleucine.
  • the 100th arginine of NP was an amino acid characteristic of avian influenza virus.
  • the H5-119 antibody that recognizes NP whose 100th is R is useful as an antibody that specifically detects avian influenza viruses, particularly avian influenza viruses that infect humans.
  • the A-type NP is located at 16mm and 13.5mm from the end of the developing solution absorption zone 5 side of the matrix 2 of nitrocellulose membrane (Millipore) having a width of 5mm and a length of 50mm.
  • the detection zones 6a and 6b were prepared by spotting and drying an aqueous solution of an antibody FVA2-11 that commonly recognizes and an aqueous solution of an avian influenza virus NP-specific antibody H5-119, respectively. Further, an anti-alkaline phosphatase antibody (rabbit) was spotted and dried at a position 11 mm from the end of the developing solution absorption zone 5 side of the matrix 2 to prepare a development confirmation part 10. Next, an alkaline phosphatase-labeled aqueous solution of FVA2-11 was spotted on the pad and dried to create a labeling reagent zone comprising the enzyme-labeling reagent pad 4.
  • the developing solution pad 3 is a 6 mm wide and 20 mm long filter paper (Millipore), and 100 ⁇ g of 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphoric acid (BCIP) as a substrate is formed into a line shape with a width of 6.0 mm. Created by spotting and drying.
  • the matrix 2, the developing solution pad 3, the enzyme labeling reagent pad 4 and the absorption pad 5 are fixed to a plastic case having a developing solution tank 11.
  • the immunochromatographic instrument for simultaneous measurement of influenza A and avian influenza shown in FIGS.

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Abstract

要約　トリインフルエンザウイルスを他のA型インフルエンザウイルスと区別して検出するために有用な新規な手段が開示されている。本願発明者らが確立した抗体は、A型インフルエンザウイルスの核タンパク質（NP）のうち、第100番アミノ酸がアルギニンであるNPと抗原抗体反応により結合し、第100番アミノ酸がバリン又はイソロイシンであるNPとは実質的に結合しない。該抗体又はその抗原結合性断片を用いれば、検体中のA型インフルエンザウイルスNPの第100番アミノ酸がアルギニンであるか否かを免疫測定により判定できる。NPの第100番のアルギニンはトリインフルエンザウイルスに特徴的なアミノ酸であり、従って上記抗体又はその抗原結合性断片はトリ由来のインフルエンザウイルスの検出に有用である。

Description

Ａ型インフルエンザウイルス核タンパク質の第１００番アミノ酸がアルギニンであるか否かを判定する方法
　本発明は、トリインフルエンザウイルスの検出に有用な、A型インフルエンザウイルス核タンパク質の第100番アミノ酸がアルギニンであるか否かを判定する方法に関する。
　現在市販されているA型インフルエンザウイルス検出のための簡易キットは、核タンパク質（NP）に対する抗体を利用しているものが多いが、これらはA型ウイルス共通に反応する。このような抗体では、ヒトA型インフルエンザウイルスであるかトリインフルエンザウイルスであるかを区別することはできない。過去にトリインフルエンザウイルスがヒトに感染した例が複数報告されており、ヒトからヒトへの感染力を獲得した新型のトリ由来インフルエンザウイルスの発生が懸念されていることからも、トリインフルエンザウイルスを区別して検出できる診断法の開発が必要とされている。
　特許文献１には、抗トリインフルエンザウイルスNP抗体を用いたトリインフルエンザウイルスに特異的な迅速診断法が記載されている。該抗体は、トリインフルエンザウイルスNPのアミノ酸配列のN末端側から第46位～第159位の領域に存在するエピトープを認識する抗体であるが、詳細なエピトープは同定されておらず、その有効性は限定的である。たとえば、NPのアミノ酸変異が起こった場合の抗体反応性の是非は予測できない。
特開2008-83024号公報
　従って、本発明は、トリインフルエンザウイルスを他のA型インフルエンザウイルスと区別して検出するために有用な新規な手段を提供することにある。
　本願発明者らは、トリインフルエンザウイルス（H5亜型）の組換えNP全長タンパク質を免疫原とし、スクリーニングにトリインフルエンザウイルス（H5亜型）、新型インフルエンザウイルスPandemic(H1N1)2009、季節性H1亜型ウイルス及び季節性H3亜型ウイルスの組換えNP全長タンパク質を用いてモノクローナル抗体を作製したところ、H5亜型トリインフルエンザウイルスに特異的に反応する複数の抗体を取得することに成功した。得られた抗体のエピトープ解析の結果、断片化されたNPに対しては該抗体の反応性が失われること、トリインフルエンザウイルスNPの第100番目のアルギニンをバリンに置換すると該抗体が認識しなくなること、ヒトインフルエンザウイルスNPの第100番アミノ酸をアルギニンに置換すると該抗体が反応することを見出し、該抗体がA型インフルエンザウイルスのNPのうち第100番アミノ酸がアルギニンであるものを特異的に認識できることを見出した。さらに、データベース解析により、NPの100番目のアルギニンはトリインフルエンザウイルスに特徴的なアミノ酸であることを見出し、本願発明を完成した。
　すなわち、本発明は、A型インフルエンザウイルスの核タンパク質のうち、第100番アミノ酸がアルギニンである核タンパク質と抗原抗体反応により結合し、第100番アミノ酸がバリン又はイソロイシンである核タンパク質とは実質的に結合しない抗体又はその抗原結合性断片と検体とを接触させ、該検体中に存在し得るA型インフルエンザウイルス核タンパク質と前記抗体又はその抗原結合性断片との間の実質的な結合を免疫測定法により検出することを含む、A型インフルエンザウイルス核タンパク質の第100番アミノ酸がアルギニンであるか否かを判定する方法を提供する。
　本発明により、A型インフルエンザウイルスNPの第100番アミノ酸がアルギニンであるか否かを抗体との結合性により判定する手段が初めて提供された。NPの第100番のアルギニンはトリインフルエンザウイルスに特徴的なアミノ酸であり、ヒトに感染したとされているトリ由来のH5亜型インフルエンザウイルスで公知のものは全てNPの第100番アミノ酸がアルギニンである。従って、第100番がアルギニンのNPに特異的な抗体は、トリインフルエンザウイルス、とりわけヒトに感染したトリ由来のインフルエンザウイルスの検出に有用である。トリインフルエンザウイルスのNPに特異的な抗体は特許文献１にも記載されるように公知であるが、抗原との特異的結合に重要な領域が1アミノ酸レベルで特定された例は知られていない。公知のトリインフルエンザ抗体では、トリインフルエンザウイルスのNP配列に変異が生じた場合の有用性が明らかではない。一方、本発明で用いる抗体は、特異性が一アミノ酸レベルで特定されているので、トリインフルエンザウイルスに変異が生じた場合の有用性が明確である。
抗体H5-119のエピトープ解析のために作製した、A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)の組換えNP断片を示す図である。 実施例で作製した、免疫測定器具（イムノクロマト器具）の模式断面図である。 実施例で作製した、免疫測定器具（イムノクロマト器具）の模式平面図である。
　本発明で用いる抗体は、A型インフルエンザウイルスの核タンパク質（NP）のうち、第１００番アミノ酸がアルギニンであるNP（「NP-R100」）と抗原抗体反応により結合し、第１００番アミノ酸がバリン又はイソロイシンであるNP（「NP-V100」、「NP-I100」）とは実質的に結合しないものである。以下、この抗体を「抗NP-R100抗体」と呼ぶ。該抗体を、A型インフルエンザウイルスNPが含まれ得る検体と接触させ、該抗体とNPとの間の実質的な結合を免疫測定法により検出することで、該NPの第100番アミノ酸がアルギニンであるか否かを判定することができる。
　ここで、「実質的に結合しない」、「実質的な結合がない」とは、NP-V100及びNP-I100とは検出可能なレベルで結合しないか、又は検出し得るレベルで結合しても、その結合の程度がごく微弱であってNP-R100との結合よりも明らかに少なく、当業者であればNP-V100及びNP-I100とは結合していないと判断する程度にしか結合しないことを意味する。例えば、下記実施例では、本発明の抗体を用いたイムノクロマトグラフィーにより各種A型インフルエンザウイルスとの反応性を調べているが、このような方法で調べた場合に検出ゾーンに標識酵素による発色が検出されなければ、検出可能なレベルで結合していないと判断することができる。好ましくは、抗NP-R100抗体は、NP-R100とのみ結合し、NP-V100及びNP-I100とは検出可能なレベルで結合しないものである。
　配列番号２に示すアミノ酸配列は、H5亜型トリインフルエンザウイルスの分離株の一つであるA/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)のNPのアミノ酸配列であり、配列番号１はそれをコードするNP遺伝子の塩基配列である。これらの配列はGenBankにもアクセッション番号AB259713で登録されている。本発明でいう「第100番アミノ酸」とは、この配列番号２のアミノ酸配列を基準として位置を表現したものである。H5亜型トリインフルエンザウイルスも含めA型インフルエンザウイルスには多数の分離株が存在し、それらのNPのアミノ酸配列も公知であり、NPのアミノ酸数は通常４９８である。もっとも、NPの鎖長が異なる分離株が存在する場合であっても、当業者であれば、公知の手法で適宜ギャップを挿入しながら他のNP配列と配列番号２のアミノ酸配列とを整列化し、いずれの残基が本発明に言う「第100番アミノ酸」に該当するかを容易に特定できる。
　本発明で用いる抗体としては、特に限定されないが、免疫測定における再現性の観点からモノクローナル抗体が好ましい。
　本発明で用いられる抗NP-R100抗体は、第100番アミノ酸がアルギニンであるA型インフルエンザウイルスの全長NP（例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列から成るA/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)の組換えNP）を免疫原として使用し、周知の常法に従い、該NPを適宜アジュバントとともに動物（ヒトを除く）に免疫することで作製することができる。組換えタンパク質の作製方法も周知であり、当業者であれば、組換えNP-R100をコードする塩基配列（例えば配列番号１）を参照して適宜プライマーを設計し、インフルエンザウイルスゲノムRNAを鋳型としてRT-PCRによりcDNAを合成し、これを適当な発現ベクターに組み込んで宿主細胞内に導入し、発現したNP-R100を回収することで容易に得ることができる。免疫された動物体内では、NP-R100に対する抗体が誘起される。
　モノクローナル抗体の作製方法も周知の常法である。具体的には、例えば、免疫した動物から採取した脾細胞やリンパ球のような抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを調製し、次いで、得られたハイブリドーマから、全長NP-R100に結合し全長NP-V100及び全長NP-I100には結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択し、これを増殖することで、培養上清から所望の結合性を有するモノクローナル抗体を回収できる。NP-V100の具体例としては、ヒトの季節性H1亜型又はH3亜型インフルエンザウイルスの組換えNPが挙げられ、また、NP-I100の具体例としては、ブタ由来ヒトA型インフルエンザウイルスPandemic(H1N1)2009の組換えNPが挙げられる。
　なお、後述の通り、NPの100番目のアルギニンはトリインフルエンザウイルスに特徴的なアミノ酸であるが、本発明で用いる抗NP-R100抗体は、第100番アミノ酸以外の配列がヒトインフルエンザウイルスNPのものであっても、第100番アミノ酸がアルギニンであれば結合できる（下記実施例参照）。従って、免疫原やスクリーニングの抗原として、第100番アミノ酸をアルギニンに置換したトリ以外の動物のインフルエンザウイルスNP変異体を使用することも可能である。
　得られた抗体から抗原結合性断片を調製することも可能である。「抗原結合性断片」とは、例えば免疫グロブリンのFab断片やF(ab')2断片のような、当該抗体の対応抗原に対する結合性（抗原抗体反応性）を維持している抗体断片を意味する。このような抗原結合性断片も免疫測定に利用可能であることは周知であり、もとの抗体と同様に有用である。Fab断片やF(ab')2断片は、周知の通り、モノクローナル抗体をパパインやペプシンのようなタンパク分解酵素で処理することにより得ることができる。なお、抗原結合性断片は、Fab断片やF(ab')2断片に限定されるものではなく、対応抗原との結合性を維持しているいかなる断片であってもよく、遺伝子工学的手法により調製されたものであってもよい。また、例えば、遺伝子工学的手法により、一本鎖可変領域 (scFv: single chain fragment of variable region) を大腸菌内で発現させた抗体を用いることもできる。scFvの作製方法も周知であり、上記の通りに作製したハイブリドーマのmRNAを抽出し、一本鎖cDNAを調製し、免疫グロブリンＨ鎖及びＬ鎖に特異的なプライマーを用いてPCRを行なって免疫グロブリンＨ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子を増幅し、これらをリンカーで連結し、適切な制限酵素部位を付与してプラスミドベクターに導入し、それで大腸菌を形質転換し、大腸菌からscFvを回収することによりscFvを作製することができる。このようなscFvも「抗原結合性断片」として本発明の範囲に包含される。以下、本発明において、単に「抗体」といった場合には、文脈からそうではないことが明らかな場合を除き、抗原結合性断片も包含されるものとする。
　本発明の方法では、免疫測定法により実質的な結合の有無、好ましくは検出可能なレベルでの結合の有無を検出する。免疫測定法自体は周知の常法である。反応様式で分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法、ウェスタンブロット法等がある。また、標識で分類すると、放射免疫測定、蛍光免疫測定、酵素免疫測定、ビオチン免疫測定等がある。本発明では、いずれの免疫測定方法を用いてもよい。定量的な方法を用いれば、検体中に存在するNP-R100の量を調べることも可能である。特に限定されないが、サンドイッチ法、競合法及び凝集法は、操作が簡便で大掛かりな装置等を必要としないため、本発明で用いる免疫測定法として好ましい。中でも、医療現場で本発明の方法を迅速・簡便に実施する場合には、サンドイッチELISAやイムノクロマトグラフィー等のサンドイッチ法がより好ましい。
　検体は、NP-R100が含まれているか否かを検出したい検体であれば何でもよく、血液（全血、血漿、血清を包含）、唾液、痰等の体液や、粘膜のぬぐい液、器具や設備のぬぐい液等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
　免疫測定法により調べた結果、抗NP-R100抗体とその抗原との結合が検出された場合、検体中にA型インフルエンザウイルスNPが存在し、かつ、該NPの第100番アミノ酸がアルギニンであると判定される。
　結合が検出されない場合、第100番アミノ酸がアルギニンであるA型インフルエンザウイルスNPが検体中に存在しないと判定される。この場合、A型インフルエンザウイルスNPがそもそも検体中に存在しないか、又はNP-R100ではないA型インフルエンザウイルスNPが存在する可能性がある。上記した本発明の第100番アルギニンの判定方法と同時に、A型インフルエンザウイルスNPのうち第100番目がアルギニンであるNP及びアルギニンではないNP（具体例としてはNP-V100及びNP-I100）の両者と結合する、A型NPを共通して検出可能な抗A型NP抗体を用いた免疫測定を行なうことで、検体中にA型インフルエンザウイルスNP自体が存在するか否かを調べることができる。ここでいう抗A型NP抗体とは、具体的には、A型インフルエンザウイルスの各種亜型のNP（例えば、NP-R100、NP-V100及びNP-I100など）に共通して結合するA型検出用抗体であり、B型インフルエンザウイルスNPとは実質的に、好ましくは検出可能なレベルで結合しないものである。そのような抗体は多くのものが公知であり、市販のインフルエンザ検査キットにも用いられている。
　2005年以降にデータベースNCBI Influenza Virus Resourceに登録されたA型インフルエンザウイルスのうち、ヒトから分離された季節性（H1亜型及びH3亜型）、Pandemic(H1N1)2009及びH5亜型のウイルス株のNP配列について、第100番アミノ酸を調べると、ヒトインフルエンザウイルス（H1亜型、H3亜型）ではほとんど全てがバリンかイソロイシンであり、およそ1800株に上る分離株のうちアルギニンであったのはほんの1株のみである。一方、ヒトに感染したH5亜型ウイルス（ヒトに感染したトリインフルエンザウイルス）89株では全てアルギニンであり、また、トリから分離されたインフルエンザウイルスでは、818株のうち99.3％がアルギニンである。従って、上記した抗NP-R100抗体を用いて免疫測定を行えば、トリインフルエンザウイルスのみを特異的に検出することができる。
　本発明で用いる抗NP-R100抗体は、全長NPのうちで第100番アミノ酸がアルギニンであるものを特異的に認識して結合するが、NPを下記実施例のように半分程度以下のサイズに断片化すると、第100番アミノ酸を含む断片であっても結合しなくなる。また、第100番のアルギニンはトリインフルエンザウイルスに特徴的なアミノ酸だが、ヒトA型インフルエンザウイルスのNPの第100番アミノ酸をアルギニンに置換した点変異体であっても、抗NP-R100抗体は結合する。このことから、本発明で用いられる抗NP-R100抗体は、第100番アミノ酸がアルギニンであることによって形成されるNP分子の立体構造（表面形状）を認識しているものと推察される。
　トリ以外の動物（例えばヒト）から分離された検体に対し本発明の判定方法を実施し、その結果、該検体中にA型インフルエンザウイルスNPが存在し、且つ、該NPの第100番アミノ酸がアルギニンであると判定された場合には、該動物はトリ由来のインフルエンザウイルスに感染していると判定することができる。従って、本発明の第100番アルギニンの判定方法は、トリ由来インフルエンザウイルスの検出方法として実施することも可能である。
　ここで、「トリ由来インフルエンザウイルス」には、トリからトリ以外の動物に感染したがその動物間での感染力を獲得していないA型インフルエンザウイルス、及び、トリからトリ以外の動物に感染し、該動物間での感染力を獲得したA型インフルエンザウイルスが包含される。具体的には、例えば、ヒトからヒトへの感染力を獲得していないヒト感染性のトリインフルエンザウイルス、及びヒト－ヒト間の感染力を獲得したインフルエンザウイルスが包含される。
　現在までに、ヒト－ヒト間の感染力を獲得したトリ由来インフルエンザウイルスの発生は報告されていないが、そのようなトリ由来インフルエンザウイルスが発生した場合でも、該ウイルスのNPの第100番アミノ酸がアルギニンである限り、本発明の方法で検出できる。公知のトリインフルエンザ特異的抗体では、トリインフルエンザウイルスのNP配列に変異が生じた場合の有用性が明らかではないが、本発明で用いる抗NP-R100抗体は、特異性が一アミノ酸レベルで特定されているので、トリインフルエンザウイルスに変異が生じた場合の有用性も明確である。
　上記した免疫測定法自体は周知であり、本明細書で説明する必要はないが、簡単に記載すると、例えば、サンドイッチ法では、抗A型インフルエンザウイルスNP抗体を固相に固定化し、検体と反応させ、洗浄後、標識された抗A型インフルエンザウイルスNP抗体を反応させ、洗浄後、固相に結合した標識抗体を測定する。固相化抗体及び標識抗体の少なくともいずれか一方として抗NP-R100抗体を用いることにより、NP-R100の存在を検出することができる。
　この分野で周知の通り、インフルエンザウイルスのNPは3量体で存在しているので、固相化抗体と標識抗体が同一の抗体であっても、インフルエンザウイルスNPのサンドイッチアッセイが可能である。従って、本発明の方法においては、抗NP-R100抗体を固相化抗体と標識抗体の両者に用いることも可能である。抗NP-R100抗体を固相化抗体及び標識抗体のいずれか一方にのみ用いる場合、他方としては、例えば、第100番がアルギニンであるA型NP及びアルギニンではないA型NP（具体例としてはNP-V100及びNP-I100）の両者と結合する、A型を共通して検出可能な抗体を用いることができる。抗NP-R100抗体を固相に固定化し、A型を共通して検出可能な抗体を標識抗体として用いた場合、A型を共通して検出可能な抗体（標識抗体と同一の抗体でもよいし、異なる抗体でもよい）をさらに固相に固定化すれば、NP-R100ではないA型インフルエンザウイルスのNPの有無をNP-R100と同時に検出することができる。A型を共通して検出可能な抗体とは、上述した通り、A型インフルエンザウイルスの各種亜型のNPに共通して結合し、B型インフルエンザウイルスNPとは実質的に、好ましくは検出可能なレベルで結合しないA型検出用抗体である。なお、上述したように、抗体に代えて、該抗体の抗原結合性断片を用いることもできる。
　検体中のウイルスを定量する場合には、ELISA等の、マイクロプレートのウェルやビーズを固相とするサンドイッチ法を好ましく用いることができる。一方、検体中のウイルスを医療現場において迅速、簡便に検出したい場合には、イムノクロマトグラフィー（しばしば「イムノクロマト」と略される）が好ましく用いられる。イムノクロマトグラフィー自体及びそれに用いられる器具（以下、「イムノクロマト器具」と呼ぶことがある）は周知であり、下記実施例にも具体的に記載されている。以下、NP-R100を検出するためのイムノクロマト器具を例として、ラテラルフロー方式のイムノクロマトグラフィーについて説明する。
　ニトロセルロース膜のような多孔性素材から成るマトリックスは、通常、帯状に形成される。このマトリックス上に、NP-R100と特異的に結合する抗NP-R100モノクローナル抗体が固相化された検出ゾーンが設けられ、その上流側（後述する展開液が流れる方向における上流側）に、標識した抗A型NPモノクローナル抗体を点着した標識試薬ゾーンが設けられる。この標識抗体は、A型インフルエンザウイルスの各種亜型のNPに共通して結合する抗体であってもよいし、固相化した抗NP-R100抗体と同一の抗体であってもよく、また、固相化した抗NP-R100抗体とは異なる、NP-R100に特異的に結合する第２の抗体であってもよい。
　標識試薬ゾーンには検体が添加され、かつ、標識抗体は、標識試薬ゾーンから流出してマトリクス内を流れる必要があるので、通常、標識試薬ゾーンは、標識抗体を点着した多孔性のパッドにより構成される。マトリックスの上流端には、展開液を貯蔵した展開液槽が設けられている。さらに、通常、上記検出ゾーンの下流に、標識抗体の展開が起きたかどうかを確認するための、標識に対する抗体を固相化した展開確認部と、さらにその下流に、流れて来た展開液を吸収するための多孔性の吸収パッドが設けられた展開液吸収ゾーンが設けられる。さらに、標識が酵素である場合には、標識試薬ゾーンよりも上流に、標識酵素の基質を点着した基質ゾーンが設けられている。
　使用時には、検体を標識試薬ゾーンに添加し、展開液槽を破って展開液をマトリックスの上端部に施す。展開液は、マトリックスの毛管現象により下流に向かって流れる。展開液が基質ゾーンを通過する際に基質が展開液中に溶出され、基質を含む展開液が流れていく。展開液が標識試薬ゾーンを通過する際に、標識抗体と検体とが展開液中に溶出され、基質、標識抗体及び検体を含む展開液が流れていく。検体中にNP-R100が含まれる場合には、NP-R100と標識抗体が、抗原抗体反応により結合する。これらの混合物が検出ゾーンまで流れてくると、検出ゾーンにおいて、固相化抗体とNP-R100とが抗原抗体反応により結合する。その結果、NP-R100を介して標識抗体が検出ゾーンに固定される。従って、検出ゾーンに固定された標識を測定することにより、NP-R100を検出することができる。検体中にNP-R100が含まれていない場合には、固相化抗体には何も結合されないので、標識抗体は検出ゾーンに固定されず、より下流に流れていく。従って、検出ゾーンでは標識は検出されない。検出ゾーンの下流の展開液確認部には、標識に対する抗体が固相化されているので、標識抗体は展開液確認部に固定される。展開液確認部に標識が検出された場合には、展開液はそこまで正しく流れて来たということが確認される。展開液は、さらにその下流の吸収パッドに吸収される。
　なお、上記したイムノクロマト器具の例では、固相化抗体を抗NP-R100モノクローナル抗体とし、標識抗体がA型NPに共通して結合する抗体等であり得るものと説明したが、固相化抗体と標識抗体はこの逆であってもよい。また、用いる抗体は抗原結合性断片でもよい。
　イムノクロマト器具には、NP-R100を特異的に検出する検出ゾーンに加えて、他の検出ゾーンをさらに設けてもよい。例えば、各種亜型のA型インフルエンザウイルスを共通して検出できるA型共通検出ゾーンを設けてもよい。この場合、標識抗体はA型のNPに共通して結合する抗体とし、NP-R100検出ゾーンは抗NP-R100抗体を、そしてA型検出ゾーンにはA型NPに共通して結合する抗体（標識抗体と同一の抗体でもよいし、異なる抗体でもよい）を固相化すればよい。このような同時測定器具によれば、NP-R100ではないA型NPの有無が同時に検出されるので、検体中にA型インフルエンザウイルスNP自体が存在するか否かを調べることができる。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
１．抗トリインフルエンザウイルスNPモノクローナル抗体の作製
　免疫原として、トリインフルエンザウイルスA/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)の組換え全長NP（rNP）（配列番号２）を常法により作製した。具体的には、該ウイルス株のゲノムRNAからRT-PCRによりNPをコードするcDNAを合成し、精製後、公知の発現ベクターに組み込んで大腸菌に導入し、発現したrNPをカラムにて回収・精製して得た。これをマウスに免疫し、常法のハイブリドーマ法により、免疫原に対する抗体を産生するハイブリドーマを作製した。スクリーニングは、常法により作製した下記表１に示す４種の組換え全長NPを抗原として用いたサンドイッチELISAにより実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
固相ELISA：
　rNPをPBSで1μg/mlに調製した溶液を96穴アッセイプレートに50μl/wellずつ加え、37℃で1時間コーティングさせた。PBSTで洗浄後、抗NP抗体溶液を50μl/wellずつ加え、37℃で1時間反応させた。PBSTで洗浄後、POD標識抗マウスIgG抗体を50μl/wellずつ加え、37℃で1時間反応させ、PBSTで洗浄後、ABTS基質系で発色を行い、マイクロプレートリーダーにてA405nmの吸光度を測定した。
FVA2-11とのサンドイッチELISA：
　抗マウスIgG抗体をPBSで5μg/mlに調製した溶液を96穴アッセイプレートに50μl/wellずつ加え、37℃で1時間コーティングさせた。PBSTで洗浄後、抗NP抗体溶液を50μl/wellずつ加え、37℃で1時間反応させた。PBSTで洗浄後、rNPを50μl/wellずつ加え、37℃で1時間反応させ、PBSTで洗浄後、アルカリホスファターゼ標識FVA2-11を50μl/wellずつ加え、37℃で1時間反応させた。PBSTで洗浄後、p-NPP基質系で発色を行い、マイクロプレートリーダーにてA405nmの吸光度を測定した。なお、FVA2-11は、市販のインフルエンザ検出キットにも使用されている公知の抗A型NP抗体であり、A型を共通して検出可能な抗体である（文献：Gui-Rong BAI et.al.:Improvement of a Rapid Diagnosis Kit to Detect Either Influenza A or B Virus Infection. J.Vet.Med.Sci.68(1);1-6,2006、及びWO/2005/007697）。
　A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)に反応し、A/Narita/1/2009(H1N1)、A/New Caledonia/20/99(H1N1)及びA/Kitakyushu/159/93(H3N2)に反応しない抗体をスクリーニングしたところ、A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)に特異的なモノクローナル抗体が複数ライン得られた。このうちのH5-119抗体を用いて以下の実験を行なった。
２．抗トリインフルエンザウイルスmAb H5-119のエピトープ解析
(1)　A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)の組換えNP断片を用いた解析
　トリインフルエンザウイルスA/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)の組換えNPの断片（図１）を作製し、ウエスタンブロッティングによりH5-119の反応性を調べた。その結果、H5-119はこれらのNP断片には反応を示さなかった。H5-119はlinear epitopeではなくNPの立体構造（conformational epitope）を認識しているものと考えられる。
(2)　キメラNPを用いたELISA反応阻害アッセイ
　下記表２に示す通り、A/Narita/1/2009(H1N1): pdmH1、A/Kitakyushu/159/93(H3N2): H3、及びA/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1): H5のキメラNPを作製し、下記の手順でELISA反応阻害アッセイを行なった。
　抗NP抗体（FVA2-11又はH5-119）をPBSで5μg/mlに調製した溶液を96穴アッセイプレートに100μl/wellずつ加え、37℃で1時間コーティングさせた。1%スキムミルク-PBSでマスキングし、PBSTで洗浄後、ビオチン標識したH5 rNPと各キメラrNPの混合溶液を100μl/wellずつ加え、37℃で1時間反応させた。PBSTで洗浄後、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼを100μl/wellずつ加え、37℃で1時間反応させた。PBSTで洗浄後、p-NPP基質系で発色を行い、マイクロプレートリーダーにてA405nmの吸光度を測定した。
　この方法では、プレートに固相化した抗NP抗体に結合したビオチン標識H5 rNPが測定される。キメラrNPが競合して固相化抗体に結合すると、ビオチン標識rNPと抗体との結合が阻害され、測定値が低くなる。これにより、キメラrNPによる阻害の有無を調べることができる。
　結果を表２に示す。H5-119抗体とH5 rNPとの結合は、N末側（aa1-333）がH5である組換えNPにより阻害された。すなわち、H5-119とNPとの結合にはNPのN末端側領域（aa1-333）が重要であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
(3)　NP点変異体を用いたELISA反応阻害アッセイ
　H5 NPの点変異体として、下記表３に示す変異体を作製し、これらを競合抗原として用いて上記と同様にELISA反応阻害アッセイを行なった。なお、「V33I」という表記は、野生型でバリン（V）である第３３番アミノ酸をイソロイシン（I）に置換したことを表す。
　結果は表３に示す通りであり、H5-119抗体とH5 NPとの反応には100番目のR（アルギニン）が重要であることが確認された。H5-119抗体は、ヒトインフルエンザウイルスであるpdmH1において第１００番アミノ酸をアルギニンに置換したNPに対しても結合することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
３．データベースNCBI Influenza Virus Resourceを用いたインフルエンザNP 100番目アミノ酸の検索
　NCBI Influenza Virus Resourceには、現在までに同定されたインフルエンザウイルスの配列情報が登録されている。このデータベースを用いて、2005年～2008年及び2009年7月～12月の期間にヒト及びトリから分離されたA型インフルエンザウイルスのNPの第100番アミノ酸を調べた。その結果を表４に示す。
　ヒトインフルエンザウイルス（H1亜型、H3亜型）ではほとんど全てがバリンかイソロイシンであり、およそ1800株に上る分離株のうちアルギニンであったのはほんの1株のみであった。一方、ヒトに感染したH5亜型ウイルス（ヒトに感染したトリインフルエンザウイルス）89株では全てアルギニンであった。また、トリから分離されたインフルエンザウイルスでは、818株のうち99.3％がアルギニンであり、バリン又はイソロイシンであったのは5株のみであった。このように、NPの100番目のアルギニンはトリインフルエンザウイルスに特徴的なアミノ酸であった。100番目がRであるNPを認識するH5-119抗体は、トリインフルエンザウイルス、特にヒトに感染するトリインフルエンザウイルスを特異的に検出する抗体として有用である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
４．トリインフルエンザウイルス検出のイムノクロマト器具の作製及び評価
(1)　イムノクロマト器具の作製
　A型インフルエンザウイルスを共通して検出可能な抗A型インフルエンザウイルスNP抗体と、トリインフルエンザウイルスのNPを特異的に検出する抗体を用いて、トリインフルエンザウイルスと他のA型インフルエンザウイルスを同時に検出するイムノクロマト器具を作製した。
　図２及び図３に示すように、巾5mm、長さ50mmのニトロセルロース膜（ミリポア社製）のマトリクス２の展開液吸収ゾーン5側の末端から16mmと13.5mmの位置に、A型のNPを共通して認識する抗体FVA2-11の水溶液及びトリインフルエンザウイルスNP特異的抗体H5-119の水溶液をそれぞれ点着して乾燥させ、検出ゾーン6a及び6bを作成した。さらに、マトリクス2の展開液吸収ゾーン5側の末端から11mmの位置に抗アルカリホスファターゼ抗体（ウサギ）を点着し乾燥させ、展開確認部10を作成した。次いで、アルカリホスファターゼ標識したFVA2-11の水溶液をパッドに点着し乾燥させ、酵素標識試薬パッド４から成る標識試薬ゾーンを作成した。
　展開液パッド3は、巾6mm、長さ20mmのろ紙（ミリポア社製）上に、基質として５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルリン酸（BCIP）100μgを巾6.0mmのライン状に点着して乾燥させて作成した。前記マトリクス２、展開液パッド3、酵素標識試薬パッド4及び吸収パッド5（巾10mm、長さ15ｍｍ、厚さ1mmのろ紙（ワットマン社製））を、展開液槽11を有するプラスチックケースに固定して、図２及び図３に示すA型インフルエンザ及びトリインフルエンザ同時測定用イムノクロマト器具とした。
(2)　組換えNPに対する反応性
　A/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1)のNPのWild type: NP wtと、該H5 NPのpoint mutant: NP-R100Vとを抗原試料として用いて、上記で作製したイムノクロマト器具の反応性を確認した。抗原試料は5000 ng/mlの濃度で用いた。イムノクロマト器具の検体添加ゾーン8に試料30μLを添加した後、変形部材に設けた押し込み部12を下方に加圧して変形させて、変形部材に付設された突起部13によって展開液パッド3を展開液槽11に挿入して展開液を展開液パッド3に供給して測定を開始した。測定開始15分後、展開確認部10の発色によって展開液の展開を確認した後、検出ゾーン6a（FVA2-11）及び6b（H5-119）の発色を目視で測定した。結果は表５に示す通りであり、H5 NPの野生型（すなわち第100番アミノ酸がアルギニン）に対してはH5-119点着ゾーンに発色が認められたが、H5 NPの第100番アミノ酸をバリンに置換した点変異体に対してはH5-119点着ゾーンは発色しなかった。該イムノクロマト器具によれば第100番がRであるNPを特異的に検出できることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
(3)　ウイルス株に対する反応性
　各種インフルエンザウイルス株を用いてイムノクロマト器具の反応性を確認した。ウイルス株を孵化鶏卵培養して得た漿尿液を試料とし、試料希釈液として界面活性剤を含むトリス緩衝液(pH8.0)を使用した。結果は表6に示す通りであり、NPの第100番アミノ酸がアルギニンであるトリインフルエンザウイルスに対しては、FVA2-11点着ゾーンとH5-119点着ゾーンの両者が発色したが、NPの第100番アミノ酸がバリン又はイソロイシンであるヒトインフルエンザウイルス及びブタインフルエンザウイルスに対しては、H5-119点着ゾーンの発色が見られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006

Claims (8)

  1. 　A型インフルエンザウイルスの核タンパク質のうち、第100番アミノ酸がアルギニンである核タンパク質と抗原抗体反応により結合し、第100番アミノ酸がバリン又はイソロイシンである核タンパク質とは実質的に結合しない抗体又はその抗原結合性断片と検体とを接触させ、該検体中に存在し得るA型インフルエンザウイルス核タンパク質と前記抗体又はその抗原結合性断片との間の実質的な結合を免疫測定法により検出することを含む、A型インフルエンザウイルス核タンパク質の第100番アミノ酸がアルギニンであるか否かを判定する方法。
  2. 　前記抗体又はその抗原結合性断片は、第100番アミノ酸がバリン又はイソロイシンである核タンパク質とは検出可能なレベルで結合しないものであり、検体中に存在し得るA型インフルエンザウイルス核タンパク質と該抗体又はその抗原結合性断片との間の検出可能なレベルでの結合の有無に基づいて前記判定が行なわれる請求項１記載の方法。
  3. 　前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１又は２記載の方法。
  4. 　A型インフルエンザウイルス核タンパク質のうち、第100番アミノ酸がアルギニンである核タンパク質及びアルギニンではない核タンパク質の両者と抗原抗体反応により結合する抗体又はその抗原結合性断片を用いた免疫測定を同時に実施することをさらに含む請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　前記全ての免疫測定は、固相に固定化された固相化抗体と標識された標識抗体とを用いたサンドイッチ法により行なわれ、第100番アミノ酸がバリン又はイソロイシンである核タンパク質とは実質的に結合しない前記抗体又はその抗原結合性断片が、固相化抗体及び標識抗体の少なくともいずれか一方に用いられる請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　第100番アミノ酸がバリン又はイソロイシンである核タンパク質とは実質的に結合しない前記抗体又はその抗原結合性断片が固相化抗体として用いられる請求項５記載の方法。
  7. 　A型インフルエンザウイルスの核タンパク質のうち、第100番アミノ酸がアルギニンである核タンパク質及びアルギニンではない核タンパク質の両者と結合する抗体又はその抗原結合性断片が標識抗体として用いられ、かつ、A型インフルエンザウイルスの核タンパク質のうち、第100番アミノ酸がアルギニンである核タンパク質及びアルギニンではない核タンパク質の両者と結合する、前記標識抗体と同一の又は異なる抗体又はその抗原結合性断片がさらなる固相化抗体として用いられ、第100番アミノ酸がアルギニンではない核タンパク質の有無が同時に検出される請求項６記載の方法。
  8. 　イムノクロマトグラフィーによる請求項５ないし７のいずれか１項に記載の方法。
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