WO2012014978A1 - 免疫アジュバント - Google Patents

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直幸 守屋
▲祐▼生子 守屋
忠昭 宮崎
安弘 二川
志保 青木
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国立大学法人北海道大学
株式会社アウレオ
株式会社アウレオサイエンス
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    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to an immune adjuvant that is administered together with the immunogenic substance to enhance immunity by the immunogenic substance.
  • ⁇ -glucan is a polysaccharide composed of D-glucose as a constituent sugar.
  • ⁇ -1,3-glucan has ⁇ -pyranose type cyclic D-glucose bonded to carbon at the 1-position of glucose.
  • a polysaccharide which is condensed by a ⁇ -1,3 glucoside bond between a hydroxyl group which is bonded to a carbon at the 3-position of glucose, and a cyclic ⁇ -pyranose type D-glucose is polymerized It is.
  • Polysaccharides such as ⁇ -glucan are found in a wide variety of natural organisms as storage molecules for sugar, which is an energy source, and as structural molecules such as cell walls, but mushrooms such as Agaricus moth, Reishi, Mai ⁇ -glucan contained in maitake, shiitake, etc. is known to have various physiological activities for maintaining and enhancing health, immune enhancing action, antitumor activity, cancer cell proliferation Attempts to use it as functional materials and pharmaceuticals for the purpose of suppressing, antiallergic, anti-inflammatory, cholesterol-lowering, antithrombotic, dietary fiber, hypotensive, hypoglycemic, and liver Many have been made.
  • ⁇ -glucan having beneficial activity ⁇ -1,3-1,6- having a side chain of D-glucose from carbon at the 6-position of glucose in addition to a main chain consisting of ⁇ -1,3 glucoside bonds
  • glucans are well known and branching structures are thought to be necessary for activity, the mechanism of action is not always clear.
  • ⁇ -glucan is a high molecular polymer obtained from natural products
  • the structure such as the degree of branching, the length of the main chain, the length of the side chain, and the like can also be obtained by amination, phosphorylation, methylation,
  • the presence / absence and degree of modification of the D-glucose hydroxyl group by acetylation and the like are not uniform, and the principle regarding the effect of the structure and chemical modification on the activity is not shown. Therefore, empirically, there is a aspect in which ⁇ -glucan derived from mushrooms is preferably used, and there have been few attempts to use ⁇ -glucan derived from other species.
  • mushrooms are also derived from ⁇ -1,3-1,6-glucan produced by microorganisms (commonly known as black yeast) belonging to the genus Aureobasidium sp. It has been clarified that a function equivalent to or better than that of ⁇ -glucan can be obtained.
  • an aureobasidium culture solution containing ⁇ -1,3-1,6 glucan as a main component has a high oral antitumor activity and immunostimulatory activity, and is a drug for various diseases. It is described that it can be applied.
  • immunoadjuvants those that have the effect of enhancing the immunity effect by immunogenic substances are called immunoadjuvants, and those that have the action of such immunoadjuvants include inorganic aluminum hydroxide, calcium phosphate
  • immunoadjuvants include inorganic aluminum hydroxide, calcium phosphate
  • Freund's complete adjuvant in which dead bacteria of M. tuberculosis are suspended in a micelle of mineral oil or liquid paraffin is known.
  • immunoadjuvants may not be able to exert sufficient effects depending on the type of vaccine, etc., and may themselves cause side effects that worsen allergic symptoms, and it was expected to provide new immune adjuvants. .
  • an object of the present invention is to provide an immunoadjuvant that uses an active ingredient derived from a natural product and has an excellent effect.
  • the present invention is as follows.
  • An immunoadjuvant administered together with an immunogenic substance for strengthening immunity by the immunogenic substance comprising a culture composition obtained from a culture of microorganisms belonging to the genus Aureobasidium sp.
  • the immunoadjuvant according to the above [2], wherein the vaccine is an influenza virus vaccine.
  • the composition contains a culture composition obtained from a culture of microorganisms belonging to the genus Aureobasidium sp. As an active ingredient. Strengthen the immunostimulatory effect of the immunogenic substance.
  • FIG. 3 is a chart summarizing the average results of test groups 1 to 4 for IgA antibody titers in nasal washings. It is the graph which compared the result according to the solid of the test group 1 and the test group 2 about the IgA antibody titer in a nasal cavity washing
  • 6 is a chart collectively showing the average results of each test group of test groups 1 to 4 for serum IgG antibody titers.
  • the immunoadjuvant of the present invention contains a culture composition obtained from a culture of microorganisms belonging to the genus Aureobasidium sp. (Hereinafter referred to as “Aureobasidium-derived culture composition”) as an active ingredient.
  • the aureobasidium-derived culture composition includes a culture solution obtained by culturing a microorganism belonging to the genus Aureobasidium (sp.) (Hereinafter referred to as “Aureobasidium microorganism”), and separating the cells by centrifugation or the like.
  • the removed culture solution the concentrate of the culture solution, the diluted solution of the culture solution, or the solids obtained by removing water from the culture solution, but also desalting them to specific components such as ⁇ -glucan Those with a higher content of are also included.
  • the Aureobasidium microorganism used in the present invention may be any microorganism belonging to the genus Aureobasidium sp. And having the ability to produce ⁇ -glucan.
  • Aureobasidium spp. pullulans M-1, AIST (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) Patent Biological Deposit Center FERM BP-08615), Aureobasidium pullulans M-2, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biology Deposit center accession number FERM BP-10014) is preferably used.
  • ⁇ -glucan produced by these strains was analyzed from the main chain in which glucose was ⁇ -1,3 linked by NMR analysis (13C NMR: Varian UNITY INOVA500 type, 1HNMR: Varian UNITY INOVA600 type). It has been revealed that ⁇ -1,3-1,6-glucan has a structure in which glucose is branched by -1,6 bonds.
  • the culture of the aureobasidium microorganism can be performed according to a known method (see JP-A-57-149301, etc.). That is, a medium (pH 5.2 to 5.0) containing carbon source (sucrose) 0.5 to 5.0% by mass, N source 0.1 to 5.0% by mass, and other trace substances (for example, vitamins and minerals). 6.0) is inoculated with bacteria and aerated culture at a temperature of 20 to 30 ° C. for 2 to 14 days, preferably aerated and stirred. As ⁇ -glucan is produced, the viscosity of the culture solution increases and becomes a highly viscous gel. The culture solution thus obtained usually contains 0.6 to 10% by mass of solid content, and the solid content contains 5 to 80% by mass of ⁇ -glucan.
  • a culture containing ⁇ -glucan obtained by the above culture after heating or autoclaving.
  • the cells may be sterilized after being separated and removed by centrifugation or the like.
  • what was concentrated or dried as needed can also be used.
  • purified it can also be used.
  • the immunoadjuvant of the present invention is used so as to be administered together with the immunogenic substance in order to enhance the immunity effect by the immunogenic substance.
  • it can be used to enhance the effect when immunization by a vaccine is expressed.
  • a vaccine for example, influenza virus vaccine etc. are mentioned.
  • antiserum for the purpose of producing antiserum in animals such as mice, rats, rabbits, goats, cows, monkeys, etc., it can be used to enhance the effect when immunization with a predetermined antigen is expressed.
  • the immune adjuvant of the present invention is administered together to effect the immunity.
  • the administration route There is no particular limitation on the administration route, and it is possible to select a known preparation form as appropriate and adapt it to oral administration, intramuscular administration, intranasal administration and the like.
  • the immunoadjuvant of the present invention is preferably administered in combination in the form of a mixture with an immunogenic substance. According to this, a synergistic action with an immunogenic substance for enhancing the effect of immunity can be expected more.
  • the dose of the immunoadjuvant of the present invention and the use amount relative to the use amount of the immunogenic substance are different from the immunogenic substance, the health state, symptoms, age, administration method / number of administration / administration of the recipient or animal. It can be determined appropriately depending on the time.
  • a general dose for example, when taken orally, it is taken in an amount of 0.025 to 4000 mg / kg (body weight) in terms of solid content of the aureobasidium-derived culture composition.
  • intranasal administration it is ingested in an amount of 0.05 to 5 mg / kg (body weight) in terms of solid content of the aureobasidium-derived culture composition.
  • Aureobasidium pullulans M-2 As a culture solution for microorganisms belonging to the genus Aureobasidium sp., Aureobasidium pullulans M-2 (FERM BP-10014) is cultured, and the culture solution is kept at 121 ° C. for 15 minutes. A culture solution prepared by sterilization and having a ⁇ -glucan content of 0.65 g / 100 g was used. Hereinafter, this is referred to as “Aureo broth”.
  • H1N1 subtype influenza virus A / PR / 8 was used as an influenza virus to infect mice.
  • an inactivated HA vaccine (A / PR8 split vaccine, total protein amount 2.1 mg / day) prepared by treating virus particles with diethyl ether and extracting into the ether phase according to a conventional method as a vaccine against it. ml) was used.
  • mice C57BL / 6NJcl strain, male, 6 weeks old were prepared and acclimated for 1 week.
  • Table 1 (1) Aureo culture solution and vaccine were passed through.
  • Test group 1 for nasal administration (2) Test group 2 for nasal administration of vaccine alone, (3) Test group 3 for nasal administration of PBS, (4) Oral culture solution administered orally and nasal administration of vaccine
  • the test group 4 was divided into a total of 4 groups.
  • Nasal administration of the vaccine to mice was performed as follows. That is, the mouse was placed in a container filled with isoflurane, taken out after confirming slow respiration, and 5 ⁇ l was inoculated into the nasal cavity of the mouse with a micropipette. At that time, in test group 1, the aureo culture was mixed with the vaccine and inoculated. After that, it was confirmed that it was awakened from anesthesia and returned to the breeding gauge. In Test Group 4, oral administration of Aureo broth was started on the same day as the first vaccine nasal administration, and 200 ⁇ L was orally administered once a day during the test period by the sonde method.
  • Immunization with the vaccine was performed twice, a first time for mice after acclimation rearing and a second time at 4-day intervals. Influenza virus was infected 4 days after the final immunization. Mice were infected with influenza virus as follows. That is, a diluted virus solution was prepared by serial dilution with PBS so that the virus titer was 5 ⁇ 10 5 pfu / ml, and 2 ⁇ l (1000 pfu / animal) of the diluted nasal cavity of anesthetized mice was used in the same manner as described above. Inoculated inside.
  • nasal lavage fluid and serum were collected from the mice, and by ELISA, IgA antibody titer in nasal lavage fluid reactive to inactivated influenza virus, IgG antibody titer in serum, and IgM Each antibody titer was measured.
  • the inactivated influenza virus used for the antibody titer measurement by ELISA method was prepared as follows. That is, MDCK cells were cultured as a host to increase influenza virus, and the virus was concentrated from the culture solution by ultracentrifugation. This was suspended in PBS, suspended, and inactivated by adding 10 times the amount of Disruption buffer (0.1% Triton-X / PBS). The inactivated virus was diluted with PBS to a virus concentration of 5 ⁇ g / mL.
  • the antibody titer measurement by ELISA method was performed as follows. That is, the inactivated influenza virus adjusted to the above virus concentration was added to a 96-well plate by 50 ⁇ L / well, and allowed to stand overnight at 4 ° C. to solidify the virus. After discarding the virus solution from the well, it was blocked with 3% skim milk / PBS-T. Thereafter, serially diluted nasal lavage fluid or serum collected from the mice was added to each well, and a secondary antibody was further added to react.
  • Anti-Mouse IgA HRP was used for IgA antibody titers, Anti-Mouse IgG HRP for IgG antibody titers, and Anti-Mouse IgM HRP for IgM antibody titers.
  • the color was developed with a TMB reagent, the reaction was stopped with 2N H 2 SO 4 , and the absorbance at 450 nm was measured. And the value of the light absorbency obtained according to the dilution rate of the sample used for ELISA was plotted, and each antibody titer was compared.
  • FIG. 1, FIG. 5 and FIG. 9 are graphs collectively showing the average results of each test group for each of the IgA antibody titer, serum IgG antibody titer, and serum IgM antibody titer in the nasal lavage fluid. is there.
  • FIG. 2, FIG. 6, and FIG. 10 are diagrams comparing the results of each test group 1 and test group 2 for the IgA antibody titer, serum IgG antibody titer, and serum IgM antibody titer in the nasal lavage fluid. It is.
  • FIG. 11 are graphs comparing the results of test group 2 and test group 4 for each of the IgA antibody titer, serum IgG antibody titer, and serum IgM antibody titer in nasal lavage fluid. It is.
  • FIG. 4, FIG. 8, and FIG. 12 are diagrams comparing the results of each test group 2 and test group 3 for the IgA antibody titer, serum IgG antibody titer, and serum IgM antibody titer in the nasal washing solution, respectively. It is.
  • test group 1 in which the aureo culture solution was mixed with the vaccine and administered nasally rather than test group 2 inoculated with the vaccine alone.
  • test group 4 in which the aureo broth was orally administered together with nasal administration of the vaccine, the antibody titer was higher. Therefore, it was revealed that the aureo culture medium functions as an immune adjuvant that enhances nasal cavity immunity against influenza virus.
  • the aureo culture solution was administered to the vaccine more than the test group 2 inoculated with the vaccine alone.
  • the antibody titer was higher in Test Group 1 administered nasally after mixing in Test Group 4 and Test Group 4 administered orally with the aureo broth along with nasal administration of the vaccine. Therefore, it was revealed that the aureo culture medium functions as an immune adjuvant that enhances systemic immunity against influenza virus.
  • aureo culture solution is effective as an immune adjuvant when immunizing with an influenza virus vaccine.
  • Test Example 2 In Test Example 1 described above, it became clear that the Aureo broth was effective as an immune adjuvant. Therefore, synthetic double-stranded RNA Poly (I: C) (manufactured by Amersham Biosciences), which is a ligand of TLR3 (Toll-Like Receptor 3), which is known as an immunoadjuvant of a nasal mucosal vaccine against influenza virus, and yeast Using Zymosan (manufactured by Sigma-Aldrich) which is a cell wall fraction, the effectiveness as an immune adjuvant was further examined.
  • synthetic double-stranded RNA Poly (I: C) manufactured by Amersham Biosciences
  • TLR3 Toll-Like Receptor 3
  • yeast Using Zymosan manufactured by Sigma-Aldrich
  • Aureo culture solution, influenza virus, vaccine, and mouse were the same as in Test Example 1 above. Also, Aureobasidium lupullulans M-2 (FERM BP-10014) was cultured, and the culture was dried to prepare a powder having a ⁇ -glucan content of 0.39 g / 100 g. . Hereinafter, this is referred to as “Aureo powder”.
  • test group 5 for administration
  • Test group 6 for nasal administration of aureo powder and vaccine
  • Test group 7 for nasal administration of aureo culture solution
  • Poly (I: C) and vaccine (8) Zymosan (Zymosan), Poly (I: C) and vaccine group 8
  • Poly (I: C) and vaccine group 9 10
  • Nasal vaccine alone The test group 10 was divided into 8 groups: (11) test group 11 in which PBS was administered nasally, (12) test group 12 in which aureo culture solution was orally administered, and vaccine was administered nasally.
  • test substance prepared in 5 ⁇ l of PBS with a micropipette was inoculated into the nasal cavity of the mouse under anesthesia.
  • oral administration of the aureo broth was started one week before the first nasal administration of vaccine, and 200 ⁇ L was orally administered once a day during the test period by the sonde method.
  • Immunization with the vaccine was performed twice, a first time for mice after acclimation rearing and a second time at 3-week intervals. Influenza virus was infected 2 weeks after the final immunization. Mice were infected with influenza virus as follows. That is, a diluted virus solution was prepared by serial dilution with PBS so that the virus titer would be 1 ⁇ 10 5 pfu / ml, and 2 ⁇ l (200 pfu / animal) of the diluted nasal cavity of anesthetized mice was prepared in the same manner as described above. Inoculated inside.
  • mice Three days after virus infection, nasal lavage fluid and serum were collected from the mice, and in the same manner as in Test Example 1 above, the IgG antibody titer in the serum reactive to inactivated influenza virus and IgM by ELISA method. The antibody titer and the IgA antibody titer in the nasal wash were measured.
  • FIG. 15 shows the IgA antibody titer in the nasal wash when diluted 1 to 8 times.
  • the serum IgG antibody titer was obtained by using the aureo broth as a vaccine, rather than the test group 10 inoculated with the vaccine alone or the test group 12 in which the aureo broth was orally administered and nasally administered.
  • Test group 5 mixed and administered nasally
  • Test group 6 mixed nasally with aureo powder mixed with vaccine
  • Test group 9 mixed nasally with Poly (I: C) mixed with vaccine
  • the antibody titer increased.
  • the effect was limited. This was considered to be because the amount of influenza virus infection in this test example was less than 1/5 (200 pfu / animal) compared to test example 1.
  • test group 7 which used aureo culture solution and Poly (I: C) in combination
  • Zymosan and Poly I: The same effects as those of the test group 8 using C) were obtained.
  • the serum IgM antibody titer was not significantly different between the test groups. As described above, in this test example, it was considered that the amount of influenza virus infection was less than 1/5 (200 pfu / animal) compared to test example 1.
  • mice As experimental animals, BALB / c mice (6 weeks old, female) were prepared and acclimated for 1 week, and then (i) a control group that only performed normal antigen immunization, and (ii) antigen immunization. The group was divided into a total of 3 groups (8 mice each): a group to which 200 ⁇ L of aureo culture solution was administered, and a group to which (iii) 400 ⁇ L was administered. Aureo broth or lactic acid bacteria beverage was orally administered by the sonde method once a day continuously during the test period.
  • thyroglobulin (Tg) purified and purified from thyroid tissue by a conventional method was used, and an emulsion was prepared at a ratio of 1: 9 with Freund's complete adjuvant (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and then administered intraperitoneally to mice (80 ⁇ g). /). Immunization was performed at 0, 2, 4, and 6 weeks after the start of the test.
  • antibody titer For measurement of antibody titer, blood was collected on the administration start date and at 3, 5, and 7 weeks after immunization, and the antibody titer of anti-Tg antibody (IgG) was measured by homemade ELISA using the above thyroglobulin (Tg).
  • IgG anti-Tg antibody
  • Tg thyroglobulin
  • mouse serum was serially diluted 1000 to 10,000 times using an enzyme-labeled IgG secondary antibody in accordance with a conventional method, and the absorbance within a range of its quantification was measured.
  • control group was 0.781 ⁇ 0.226
  • aureo culture solution 200 ⁇ L group was 1.341 ⁇ 0.304
  • aureo culture solution 400 ⁇ L group was 1
  • the absorbance was 314 ⁇ 0.322
  • the antibody titer was significantly (P ⁇ 0.05) increased by administration of 200 ⁇ L or 400 ⁇ L of the aureo broth compared to the control group.
  • the antibody titer is increased by administration of aureo medium even when thyroglobulin (Tg) is used as an immunogenic substance.

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Abstract

　天然物由来の有効成分を利用する免疫アジュバントであって、優れた効果を有するものを提供する。　免疫アジュバントの有効成分として、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物から得られる培養組成物を含有せしめる。この免疫アジュバントによれば、抗原に対する抗体の産生能を向上させて、ワクチン等の免疫原性物質による免疫の効果を高めることができる。

Description

免疫アジュバント
　本発明は、免疫原性物質による免疫力強化のために該免疫原性物質とともに投与する免疫アジュバントに関するものである。
　β－グルカンは、Ｄ-グルコースを構成糖として構成される多糖類であるが、例えばβ-１，３グルカンは、β－ピラノース型の環状Ｄ-グルコース同士がグルコース１位の炭素に結合している水酸基部位とグルコース３位の炭素に結合している水酸基部位との間でβ－１，３グルコシド結合によって縮合し、環状β－ピラノース型のＤ-グルコースが重合するように構成される多糖類である。β－グルカンのような多糖類はエネルギー源である糖の貯蔵分子や細胞壁などの構造分子として自然界の生物中に多種多様に見出されるが、キノコ類であるアガリクス茸、霊芝（レイシ）、舞茸（マイタケ）、椎茸（シイタケ）等に含有するβ－グルカンには、健康を維持増進ための様々な生理活性を有していることが知られ、免疫増強作用、抗腫瘍活性、ガン細胞増殖抑制作用、抗アレルギー作用、抗炎症作用、コレステロール低下作用、抗血栓作用、食物繊維作用、血圧降下作用、血糖降下作用、肝機能亢進などを目的とする機能性素材や医薬品等として利用する試みが数多くなされている。また、難消化性であることから、便秘の予防・改善のための整腸剤、あるいは、その保湿性を利用する化粧品など、幅広い応用が期待できる多糖類の機能性素材として期待されている。
　有益な活性を有するβ－グルカンとして、β－１，３グルコシド結合からなる主鎖に加えて、グルコース６位の炭素からのＤ-グルコースの側鎖を有するβ－１，３－１，６－グルカンがよく知られており、枝分かれ構造が活性に必要であると考えられているが、その作用機序は必ずしも明らかでない。また、β－グルカンは天然物から得られる高分子ポリマーであることから、分岐の度合、主鎖の長さ、側鎖の長さ等の構造は、また、アミノ化、リン酸化、メチル化、アセチル化等によるＤ-グルコース水酸基の修飾の有無や度合も、均一ではなく、その構造や化学修飾が活性に与える影響に関する原理は示されていない。そこで、経験的にキノコ類由来のβ－グルカンが好んで用いられているに過ぎない面があり、他の生物種由来のβ－グルカンを利用する試みは少なかった。
　最近、自然界に広く存在する不完全菌であるアウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物（通称、黒酵母）が産生するβ－１，３－１，６－グルカンによっても、キノコ類由来のβ－グルカンと同等又は同等以上の機能が得られることが明らかとされている。
　例えば、下記特許文献１には、β－１，３－１，６グルカンを主成分とするアウレオバシジウム培養液が、経口的に高い抗腫瘍活性及び免疫賦活活性を有し、各種疾病に対する医薬品として応用できる旨が記載されている。
　一方、ワクチンや抗体生産の分野では、免疫原性物質による免疫の効果を高めるため効果を持つものを免疫アジュバントと称し、このような免疫アジュバントの作用を有するものとして、無機物の水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、ミョウバンなどや、鉱油や流動パラフィンのミセルに結核菌の死菌を懸濁したフロイントの完全アジュバントなどが知られている。
特開２００２－２０４６８７号公報
　しかしながら、免疫アジュバントには、ワクチン等の種類によっては十分な効果を発揮できない場合や、それ自体、アレルギー症状を悪化させる副作用を引き起こす場合もあり、新たな免疫アジュバントを提供することが期待されていた。
　したがって、本発明の目的は、天然物由来の有効成分を利用する免疫アジュバントであって、優れた効果を有するものを提供することにある。
　本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］　免疫原性物質による免疫力強化のために該免疫原性物質とともに投与する免疫アジュバントであって、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物から得られる培養組成物を有効成分として含有することを特徴とする免疫アジュバント。
［２］　前記免疫原性物質は、ワクチンの形態である上記［１］記載の免疫アジュバント。
［３］　前記ワクチンは、インフルエンザウイルスワクチンである上記［２］記載の免疫アジュバント。
［４］　　経口投与、筋肉内投与、又は鼻腔内投与に適応する、上記［１］～［３］のいずれか1つに記載の免疫アジュバント。
　本発明の免疫アジュバントによれば、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物から得られる培養組成物を有効成分として含有するので、抗原に対する抗体の産生能を増強させ、ワクチン等の免疫原性物質による免疫賦活作用を強化する。
鼻腔洗浄液中ＩｇＡ抗体価について試験群１～４の各試験群の平均の結果をまとめて示す図表である。 鼻腔洗浄液中ＩｇＡ抗体価について試験群１と試験群２の固体別の結果を比較した図表である。 鼻腔洗浄液中ＩｇＡ抗体価について試験群２と試験群４の固体別の結果を比較した図表である。 鼻腔洗浄液中ＩｇＡ抗体価について試験群２と試験群３の固体別の結果を比較した図表である。 血清中ＩｇＧ抗体価について試験群１～４の各試験群の平均の結果をまとめて示す図表である。 血清中ＩｇＧ抗体価について試験群１と試験群２の個体別の結果を比較した図表である。 血清中ＩｇＧ抗体価について試験群２と試験群４の固体別の結果を比較した図表である。 血清中ＩｇＧ抗体価について試験群２と試験群３の固体別の結果を比較した図表である。 血清中ＩｇＭ抗体価について試験群１～４の各試験群の平均の結果をまとめて示す図表である。 血清中ＩｇＭ抗体価について試験群１と試験群２の固体別の結果を比較した図表である。 血清中ＩｇＭ抗体価について試験群２と試験群４の個体別の結果を比較した図表である。 血清中ＩｇＭ抗体価について試験群２と試験群３の固体別の結果を比較した図表である。 血清中ＩｇＧ抗体価について試験群５～１２の各試験群の平均の結果を示す図表である。 血清中ＩｇＭ抗体価について試験群５～１２の各試験群の平均の結果を示す図表である。 １～８倍希釈での鼻腔洗浄液中ＩｇＡ抗体価について試験群５～１２の各試験群の平均の結果を示す図表である。
　本発明の免疫アジュバントは、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物から得られる培養組成物（以下、「アウレオバシジウム由来培養組成物」という。）を有効成分として含有する。このアウレオバシジウム由来培養組成物としては、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物（以下、「アウレオバシジウム微生物」という。）を培養した培養液そのもの、遠心分離等により菌体を分離除去した培養液、その培養液の濃縮液、その培養液の希釈液、あるいはその培養液から水分を除いた固形物等だけでなく、これらを脱塩等してβ－グルカン等の特定の成分の含有量を高めたものも含まれる。
　本発明において用いられる上記アウレオバシジウム微生物としては、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属し、β－グルカン生産能を有する微生物であればよいが、例えば、アウレオバシジウム プルランスＭ―１（Aureobasidium pullulans M-1、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号ＦＥＲＭ　ＢＰ－０８６１５）や、アウレオバシジウム プルランスＭ―２（Aureobasidium pullulans M-2、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号FERM BP-10014）が好適に用いられる。なお、これらの菌株が産生するβ－グルカンは、NMR測定（１３ＣＮＭＲ　：Ｖａｒｉａｎ社ＵＮＩＴＹ　ＩＮＯＶＡ５００型、１ＨＮＭＲ　：　Ｖａｒｉａｎ社ＵＮＩＴＹ　ＩＮＯＶＡ６００型）による構造解析で、グルコースがβ－１，３結合した主鎖からβ－１，６結合でグルコースが分岐した構造を有するβ－１，３－１，６－グルカンであることが明らかとなっている。
　上記アウレオバシジウム微生物の培養は、公知の方法（特開昭５７－１４９３０１号公報等参照）に準じて行うことができる。すなわち、炭素源（ショ糖）０．５～５．０質量％、Ｎ源０．１～５．０質量％、その他微量物質（例えば、ビタミン類、無機質）を加えた培地（ｐＨ５．２～６．０）に菌を接種し、温度２０～３０℃で２～１４日間通気培養、好ましくは通気撹拌培養すればよい。β－グルカンが生成されるにしたがって培養液の粘度が上昇し、粘性の高いジェル状になる。このようにして得られる培養液には、通常、０．６～１０質量％の固形分が含まれており、該固形分中にはβ－グルカンが５～８０質量％含まれている。
　本発明においては、上記の培養によって得られるβ－グルカンを含む培養物を加熱又は加圧加熱殺菌して用いることが好ましい。また、遠心分離等により菌体を分離除去した後殺菌して用いてもよい。また、必要に応じて濃縮したもの、あるいは乾燥したものを用いることもできる。更に、β?グルカンに富む成分を抽出したものや、それを脱塩、精製したものを用いることもできる。なお、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物は、増粘安定剤等の食品添加物として使用されているものであり安全性が高い。
　本発明の免疫アジュバントは、免疫原性物質による免疫の効果を高めるために該免疫原性物質とともに投与されるように用いられる。すなわち、病原性細菌やウイルスの感染を予防し、又はその重篤化を予防、治療することを目的として、ワクチンによる免疫を発現させるときに、その効果を高めるために用いることができる。例えば、インフルエンザウイルスワクチンなどが挙げられる。あるいは、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ、サルなどの動物に抗血清を産生させることを目的として、所定抗原による免疫を発現させるときに、その効果を高めるために用いることができる。
　本発明の適用形態としては、ワクチンや所定抗原などの免疫原性物質をヒト又は動物に接種してこれによる免疫を発現させる際、本発明の免疫アジュバントを併用投与することにより、その免疫の効果を高めることができる。投与経路に特に制限はなく、公知の製剤形態を適宜選択して、経口投与、筋肉内投与、鼻腔内投与などに適応することが可能である。
　本発明の免疫アジュバントは、免疫原性物質との混合物の形態としたうえで併用投与することが好ましい。これによれば、免疫の効果を高めるための免疫原性物質との相乗作用がより期待できる。
　本発明の免疫アジュバントの投与量や、免疫原性物質の使用量に対する使用量は、免疫原性物質のちがい、被投与者又は動物の健康状態、症状、年齢や、投与方法・投与回数・投与時期などによって、適宜決定することができる。一般的な投与量を例示すれば、例えば、経口的に摂取する場合には、アウレオバシジウム由来培養組成物の固形分換算にして０．０２５～４０００ｍｇ/ｋｇ（体重）の量で摂取する。また、鼻腔内投与の場合には、アウレオバシジウム由来培養組成物の固形分換算にして０．０５～５ｍｇ/ｋｇ（体重）の量で摂取する。
　以下実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
　［試験例１］　
　アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養液を用いて、その免疫アジュバントとしての有効性を調べた。具体的にはインフルエンザウイルスワクチンで免疫するときの免疫アジュバントとしての有効性を調べた。
　アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養液としては、アウレオバシジウム プルランスＭ－２（Aureobasidium pullulans M-2）(ＦＥＲＭ　ＢＰ－１００１４)を培養し、その培養液を１２１℃１５分間殺菌して調製された培養液であって、β－グルカン含有量が０．６５ｇ／１００ｇのものを用いた。以下、これを「アウレオ培養液」という。
　マウスに感染させるインフルエンザウイルスとしてはＨ１Ｎ１亜型インフルエンザウイルスA/PR/8を使用した。また、それに対するワクチンとしては、常法に従い、ウイルス粒子をジエチルエーテルで処理してそのエーテル相に抽出することにより調製した、不活化ＨＡワクチン（Ａ／ＰＲ８　ｓｐｌｉｔ　ｖａｃｃｉｎｅ　、総たんぱく量　２．１ｍｇ／ｍｌ）を使用した。
　実験動物としては、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌ系統、雄、６週齢）を準備し、１週間順化飼育を行った後、下記表１に記載のとおり、（１）アウレオ培養液とワクチンを経鼻投与する試験群１、（２）ワクチンのみを経鼻投与する試験群２、（３）ＰＢＳを経鼻投与する試験群３、（４）アウレオ培養液を経口投与しワクチンを経鼻投与する試験群４、の計４群に分けた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　マウスへのワクチンの経鼻投与（試験群３ではＰＢＳの投与）は次のようにして行った。すなわち、イソフルランを充満させた容器にマウスを入れ、呼吸がゆっくりになるのを確認してから取り出し、マウスの鼻腔内にマイクロピペットで５μlを接種した。その際、試験群１ではアウレオ培養液をワクチンと混合して接種した。その後、麻酔から醒めたのを確認して飼育ゲージに戻した。また、試験群４では、１回目のワクチン経鼻投与と同じ日にアウレオ培養液の経口投与を開始し、ゾンデ法により１日１回２００μLを試験期間中連続して経口投与した。
　ワクチンでの免疫は、順化飼育後のマウスに第１回目を行い、４日間隔で第２回目を行い、計２回行った。最終免疫から４日後にインフルエンザウイルスを感染させた。マウスへのインフルエンザウイルスの感染は次のようにして行った。すなわち、ウイルス力価が５×１０５ｐｆｕ／ｍｌになるようにＰＢＳにて段階希釈して希釈ウイルス液を調製し、その２μl（１０００ｐｆｕ／匹）を上記と同様にして麻酔下のマウスの鼻腔内に接種した。
　ウイルスの感染後３日目にマウスから鼻腔洗浄液と血清を回収し、ＥＬＩＳＡ法にて、不活化インフルエンザウイルスに反応性を有する鼻腔洗浄液中のＩｇＡ抗体価と、血清中のＩｇＧ抗体価、及びＩｇＭ抗体価をそれぞれ測定した。
　なお、ＥＬＩＳＡ法による抗体価測定に用いた不活化インフルエンザウイルスの調製は次のようにして行った。すなわち、ＭＤＣＫ細胞を宿主として培養し、インフルエンザウイルスを増やし、その培養液から超遠心によってウイルスを濃縮した。これをＰＢＳに懸濁して浮遊させ、Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ(０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ／ＰＢＳ)を１０倍量加えて不活化させた。不活化ウイルスはＰＢＳで希釈し、ウイルス濃度５μｇ/ｍＬとした。
　また、ＥＬＩＳＡ法による抗体価測定は次のようにして行った。すなわち、上記のウイルス濃度に調整した不活化インフルエンザウイルスを５０μＬ／ｗｅｌｌずつ９６ｗｅｌｌプレートに加え、４℃で一晩静置してウイルスの固層化を行った。ウェルからウイルス溶液を捨てた後、３％スキムミルク/ＰＢＳ－Ｔでブロッキングした。その後、マウスから回収した鼻腔洗浄液又は血清を段階希釈したものを、それぞれウェルに加え、更に、二次抗体を加えて反応させた。なお、二次抗体としては、ＩｇＡ抗体価についてＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＡ　ＨＲＰ、ＩｇＧ抗体価についてＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ ＨＲＰ、ＩｇＭ抗体価についてＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＭ　ＨＲＰをそれぞれ使用した。常法に従い、ＴＭＢ試薬で発色させ２Ｎ Ｈ2ＳＯ4で反応を止めて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。そして、ＥＬＩＳＡに供した試料の希釈倍率に応じて得られた吸光度の値をプロットし、それぞれの抗体価を比較した。
　その結果を、図１～図１２に示す。なお、そのうち図１、図５、図９は、鼻腔洗浄液中ＩｇＡ抗体価、血清中ＩｇＧ抗体価、血清中ＩｇＭ抗体価について、それぞれ各試験群の固体別の結果の平均をまとめて示す図表である。また、そのうち図２、図６、図１０は、鼻腔洗浄液中ＩｇＡ抗体価、血清中ＩｇＧ抗体価、血清中ＩｇＭ抗体価について、それぞれ試験群１と試験群２の固体別の結果を比較した図表である。また、そのうち図３、図７、図１１は、鼻腔洗浄液中ＩｇＡ抗体価、血清中ＩｇＧ抗体価、血清中ＩｇＭ抗体価について、それぞれ試験群２と試験群４の固体別の結果を比較した図表である。また、そのうち図４、図８、図１２は、鼻腔洗浄液中ＩｇＡ抗体価、血清中ＩｇＧ抗体価、血清中ＩｇＭ抗体価について、それぞれ試験群２と試験群３の固体別の結果を比較した図表である。
　その結果、図４に見られるように、鼻腔洗浄液中ＩｇＡ抗体価について、ワクチンを接種した試験群２とＰＢＳを接種した試験群３とにほとんど差が認められなかった。また、図８及び図１２に見られるように、血清中ＩｇＧ抗体価及びＩｇＭ抗体価についても、同様に、ワクチンを接種した試験群２において有意な抗体価の上昇が認められなかった。したがって、本試験例では、ワクチン接種の効果は比較的限定的であった。これは、本試験例では、ワクチン接種の期間が短かったためであると考えられた。
　これに対して、図２，３に見られるように、鼻腔洗浄液中ＩｇＡ抗体価について、ワクチンのみを接種した試験群２よりも、アウレオ培養液をワクチンに混合して経鼻投与した試験群１や、ワクチンの経鼻投与とともにアウレオ培養液を経口投与した試験群４のほうが、抗体価が高くなった。したがって、アウレオ培養液が、インフルエンザウイルスに対する鼻腔局所の免疫を高める免疫アジュバントとして機能することが明らかとなった。
　同様に、図６，７に血清中ＩｇＧ抗体価について、図１０，１１に血清中ＩｇＭ抗体価について、それぞれに見られるように、ワクチンのみを接種した試験群２よりも、アウレオ培養液をワクチンに混合して経鼻投与した試験群１や、ワクチンの経鼻投与とともにアウレオ培養液を経口投与した試験群４のほうが、抗体価が高くなった。したがって、アウレオ培養液が、インフルエンザウイルスに対する全身性免疫を高める免疫アジュバントとして機能することが明らかとなった。
　以上から、アウレオ培養液が、インフルエンザウイルスワクチンで免疫するときの免疫アジュバントとして有効であることが明らかとなった。
　［試験例２］
　上記試験例１では、アウレオ培養液が免疫アジュバントとして有効であることが明らかとなった。そこで、インフルエンザウイルスに対する経鼻粘膜投与型ワクチンの免疫アジュバントとして知られる、ＴＬＲ３（Toll-Like Receptor 3）のリガンドである合成二本鎖RNA Poly(I:C)（Amersham Biosciences社製）と、酵母細胞壁分画であるザイモサン（Zymosan）（Sigma-Aldrich社製）とを用いて、免疫アジュバントとしての有効性を更に検討した。
　アウレオ培養液、インフルエンザウイルス、ワクチン、及びマウスは、上記試験例１と同様とした。また、アウレオバシジウム プルランスＭ－２（Aureobasidium pullulans M-2）(ＦＥＲＭ　ＢＰ－１００１４)を培養し、その培養物を乾燥して、β－グルカン含有量が０．３９ｇ／１００ｇの粉末を調製した。以下、これを「アウレオ粉末」という。
　実験動物として、マウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪｃｌ系統、雄、６週齢）を準備し、２週間順化飼育を行った後、下記表２に記載のとおり、（５）アウレオ培養液とワクチンを経鼻投与する試験群５、（６）アウレオ粉末とワクチンを経鼻投与する試験群６、（７）アウレオ培養液とPoly(I:C)とワクチンを経鼻投与する試験群７、（８）ザイモサン（Zymosan）とPoly(I:C)とワクチンを経鼻投与する試験群８、（９）Poly(I:C)とワクチンを経鼻投与する試験群９、（１０）ワクチンのみを経鼻投与する試験群１０、（１１）ＰＢＳを経鼻投与する試験群１１、（１２）アウレオ培養液を経口投与しワクチンを経鼻投与する試験群１２、の計８群に分けた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　マウスへの経鼻投与は、上記試験例１と同様にして、麻酔下、マウスの鼻腔内にマイクロピペットで５μlのＰＢＳ中に調整した上記試験物質を接種した。また、試験群１２では、１回目のワクチン経鼻投与の１週間前からアウレオ培養液の経口投与を開始し、ゾンデ法により１日１回２００μLを試験期間中連続して経口投与した。
　ワクチンでの免疫は、順化飼育後のマウスに第１回目を行い、３週間間隔で第２回目を行い、計２回行った。最終免疫から２週間後にインフルエンザウイルスを感染させた。マウスへのインフルエンザウイルスの感染は次のようにして行った。すなわち、ウイルス力価が１×１０５ｐｆｕ／ｍｌになるようにＰＢＳにて段階希釈して希釈ウイルス液を調製し、その２μl（２００ｐｆｕ／匹）を上記と同様にして麻酔下のマウスの鼻腔内に接種した。
　ウイルスの感染後３日目にマウスから鼻腔洗浄液と血清を回収し、上記試験例１と同様にして、ＥＬＩＳＡ法にて、不活化インフルエンザウイルスに反応性を有する血清中のＩｇＧ抗体価、及びＩｇＭ抗体価と、鼻腔洗浄液中のＩｇＡ抗体価をそれぞれ測定した。
　その結果を、図１３～図１５に示す。なお、図１５には、１～８倍希釈のときの鼻腔洗浄液中のＩｇＡ抗体価を示す。
　図１３に見られるように、血清中ＩｇＧ抗体価について、ワクチンのみを接種した試験群１０や、アウレオ培養液を経口投与しワクチンを経鼻投与した試験群１２よりも、アウレオ培養液をワクチンに混合して経鼻投与した試験群５や、アウレオ粉末をワクチンに混合して経鼻投与した試験群６や、Poly(I:C)をワクチンに混合して経鼻投与した試験群９のほうが、抗体価が高くなった。しかしながらその効果は限定的であった。これは、本試験例では、インフルエンザウイルスの感染量が試験例１に比べて５分の１（２００ｐｆｕ／匹）と少なかったためであると考えられた。一方、アウレオ培養液とPoly(I:C)を併用した試験群７では、インフルエンザウイルスに対する経鼻粘膜投与型ワクチンの免疫アジュバントとしてその有効性が認められているザイモサン（Zymosan）とPoly(I:C)とを併用した試験群８と同程度の効果が得られた。
　同様に、図１５に見られるように、鼻腔洗浄液中のＩｇＡ抗体価について、アウレオ培養液とPoly(I:C)を併用した試験群７では、インフルエンザウイルスに対する経鼻粘膜投与型ワクチンの免疫アジュバントとしてその有効性が認められているザイモサン（Zymosan）とPoly(I:C)とを併用した試験群８に匹敵する効果が得られた。したがって、アウレオ培養液が、インフルエンザウイルスに対する免疫を高める免疫アジュバントとして、高い有効性を有することが明らかとなった。
　一方、図１４に見られるように、血清中ＩｇＭ抗体価については、試験群間における差が顕著ではなかった。上述したように、本試験例では、インフルエンザウイルスの感染量が試験例１に比べて５分の１（２００ｐｆｕ／匹）と少なかったためであると考えられた。
　［試験例３］　
　免疫原性物質としてサイログロブリン（Ｔｇ）を使用しときの抗体価の向上に、アウレオ培養液が寄与するかを調べた。
　実験動物としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス(６週齢、雌)を準備し、１週間順化飼育を行った後、（i）通常の抗原免疫のみを行うコントロール群、（ii）抗原免疫に加えてアウレオ培養液を２００μL投与する群、（iii）同４００μL投与する群、の計３群(各８匹)に分けた。アウレオ培養液又は乳酸菌飲料を、ゾンデ法で同投与量を試験期間中１日１回連続して経口投与した。
　抗原免疫は、常法により甲状腺組織から精製純化したサイログロブリン（Ｔｇ）を用い、フロイント完全アジュバント（和光純薬工業株式会社）と１：９の割合でエマルジョンを作成後、マウスに腹腔内投与(８０μg/匹)することにより行った。免疫は試験開始０、２、４、６週目にそれぞれ実施した。
　抗体価測定のため、投与開始日及び免疫後３、５、７週目に採血を行い、上記サイログロブリン（Ｔｇ）を用いた自家製ＥＬＩＳＡによって抗Ｔｇ抗体（ＩｇＧ）の抗体価を測定した。ＥＬＩＳＡ法による抗体価測定は、常法に従い、酵素標識したＩｇＧ二次抗体を用いて、マウス血清を１０００倍～１万倍に段階希釈し、その定量性のある範囲での吸光度を測定した。
　その結果、免疫7週目において、（i）ｃｏｎｔｒｏｌ群が０．７８１±０．２２６、（ii）アウレオ培養液２００μL群が１．３４１±０．３０４、（iii）アウレオ培養液４００μL群が１．３１４±０．３２２の吸光度を示し、ｃｏｎｔｒｏ１群に比べてアウレオ培養液の２００μL又は４００μLの投与で、それぞれ有意(P≦０．０５)に抗体価の上昇が認めた。
　以上から、免疫原性物質としてサイログロブリン（Ｔｇ）を使用したときにも、アウレオ培養液の投与により、抗体価が上昇することが明らかとなった。
[規則26に基づく補充 26.08.2011]　
Figure WO-DOC-RO134

Claims (4)

  1. 　免疫原性物質による免疫力強化を目的として該免疫原性物質とともに投与する免疫アジュバントであり、アウレオバシジウム属（Aureobasidium sp.）に属する微生物の培養物から得られる培養組成物を有効成分として含有することを特徴とする免疫アジュバント。
  2. 　前記免疫原性物質は、ワクチンの形態である請求項１記載の免疫アジュバント。
  3. 　前記ワクチンは、インフルエンザウイルスワクチンである請求項２記載の免疫アジュバント。
  4. 　経口投与、筋肉内投与、又は鼻腔内投与に適応する、請求項１～３のいずれか1つに記載の免疫アジュバント。
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