WO2012005238A1 - ヒトサイトメガロウイルス感染の検出方法 - Google Patents

ヒトサイトメガロウイルス感染の検出方法 Download PDF

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信之 藤井
秀夫 本多
内田　好昭
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富士レビオ株式会社
小見 和也
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    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting human cytomegalovirus infection.
  • viral antigens are used for serological diagnosis of infectious diseases caused by human cytomegalovirus (HCMV).
  • HCMV cytomegalovirus
  • native antigen the lot difference caused by the preparation method cannot be ignored.
  • virus itself since the virus itself is handled, there is a problem in safety and simplicity.
  • Recombinant antigens are desired to achieve standardization of HCMV serological diagnosis, but it is known that the sensitivity and specificity of the test is not sufficient when only recombinant antigens are used. . This is because it is difficult to select an appropriate antigen to be recombined from a large number of viral antigens. In addition, it is considered that a partial expression fragment of each antigen protein is used.
  • pp150 which is known as a major antigen, is a protein having a molecular weight of about 150 kDa, so that mass synthesis using E. coli is impossible, and it is difficult to use the full-length protein for testing. Therefore, in a commercially available test kit, a pp150 fragment (typically about 30 to 40 residues) is appropriately mixed with other HCMV protein fragments and used as an antigen. However, it has been reported that the sensitivity of the test is insufficient at about 60% with only the partial expression fragment.
  • Non-Patent Document 1 shows the results of examining antibody reactivity of HCMV-positive patient serogroups against HCMV native antigen (including viral proteins in full length) and evaluating antibody reactivity for each protein.
  • pp150 has achieved detection sensitivity close to 100%, and the detection sensitivity is very low, about 50% or less, depending on the type of protein.
  • An object of the present invention is to provide a novel and highly practical means capable of detecting HCMV infection with high sensitivity.
  • pp28 full-length protein synthesized full-length proteins for 15 types of HCMV proteins, and as a result of intensive research on reactivity with sera of HCMV-infected patients, all infected patients were detected without omission when pp28 full-length protein was used as an antigen. It was found that pp28 full-length protein can be synthesized and purified in large quantities as a recombinant protein using Escherichia coli, and found to be commercially available as an antigen for HCMV testing, and the present invention has been completed.
  • the present invention is an artificial polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, which is derived in vivo against pp28 produced by human cytomegalovirus.
  • a method for detecting human cytomegalovirus infection is provided.
  • the present invention also relates to an artificial polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, which is derived in vivo against pp28 produced by human cytomegalovirus.
  • a reagent for detecting human cytomegalovirus infection which comprises an artificial polypeptide having a reactivity that binds to an antibody produced by an antigen-antibody reaction. Furthermore, the present invention provides a human cytomegalovirus infection detection kit comprising the detection reagent of the present invention.
  • the present invention provides a means for detecting HCMV infection with extremely excellent detection sensitivity. According to the present invention, all HCMV-infected patients can be reliably detected without omission by a simple immunoassay.
  • a known antibody test method there is a method using a pp28 fragment as an antigen.
  • Non-Patent Document 1 also describes a method for detecting anti-HCMV antibody in serum using pp28 as a fragment having a size of about 30 residues. Has been.
  • false negative occurs in more than 10% of patients with the pp28 fragment. The occurrence of false negatives is a serious problem in clinical laboratory testing because it can overlook infected patients. According to the method of the present invention, it becomes possible to reliably detect an infected patient without overlooking it, which can greatly contribute to a clinical examination.
  • Pp28 is a 28 kDa phosphoprotein, one of the structural proteins of HCMV, and is sometimes called UL99 because it is encoded by the UL99 gene.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the pp28 amino acid sequence of HCMV AD169 strain, and is registered in GenBank with an accession number such as X17403 (complete genome).
  • GenBank accession number such as X17403 (complete genome).
  • the nucleotide sequence of the viral DNA encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is shown in SEQ ID NO: 1.
  • artificial pp28 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is used as an antigen.
  • a small number of amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are substituted, deleted, inserted and / or added, and are derived in vivo with respect to pp28 produced by HCMV.
  • an antigen an artificial polypeptide having reactivity that binds to an antibody by an antigen-antibody reaction is used.
  • the latter polypeptide has an identity with SEQ ID NO: 2 of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more.
  • the latter polypeptide is also preferably composed of an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a polypeptide consisting of an arbitrary amino acid sequence has a reactivity of binding to an antibody induced in vivo with pp28 produced by HCMV by an antigen-antibody reaction is isolated from, for example, a known HCMV-infected patient. This can be easily confirmed by reacting a sample such as serum with the polypeptide. If the binding between the antibody present in serum and the polypeptide can be confirmed, it can be determined that the polypeptide has the above-described reactivity.
  • identity of amino acid sequences means that both amino acid sequences are aligned so that the amino acid residues of the two amino acid sequences to be compared match as much as possible, and the number of matched amino acid residues is the total number of amino acid residues. The percentage divided by is expressed as a percentage.
  • a gap is appropriately inserted in one or both of the two sequences to be compared as necessary. Such sequence alignment can be easily performed using a known program such as BLAST, FASTA, CLUSTAL W, and the like. When gaps are inserted, the total number of amino acid residues is the number of residues obtained by counting one gap as one amino acid residue.
  • the homology is the total number of amino acid residues in the longer sequence, and the number of amino acid residues matched. Is calculated by dividing.
  • the 20 amino acids constituting the natural protein are neutral amino acids having low side chains (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), and neutral amino acids having hydrophilic side chains (Asn , Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (Arg, Lys, His), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp) It is known that the properties of a polypeptide often do not change if substitution is made between these groups.
  • polypeptide comprising an amino acid sequence thus substituted is a preferred example of a polypeptide comprising an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 2 among the polypeptides used as antigens in the present invention.
  • an "artificial polypeptide” is a polypeptide that has been artificially produced by chemical synthesis, genetic engineering techniques, or other methods, and the protein expressed and produced from the HCMV genome in cells infected with HCMV was recovered. Things are not included.
  • the amino acid sequence of pp28 and the base sequence that encodes it are registered in the database as described above and are known, and are also described in the sequence listing of the present application.
  • the codons encoding each amino acid are known, the base sequence of a polynucleotide encoding a specific amino acid sequence can be easily specified. Therefore, even a polypeptide consisting of an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 2 can easily identify the base sequence of the polynucleotide encoding it.
  • the polypeptide used as an antigen in the present invention can be produced by any method based on the sequence information.
  • the chemical synthesis method examples include Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method) and the like. Moreover, it can also synthesize
  • polypeptides by genetic engineering techniques are also well known. Briefly, a polynucleotide encoding the polypeptide is prepared, the polynucleotide is incorporated into an appropriate expression vector, and an appropriate expression system is used.
  • the target antigen polypeptide can be obtained as a recombinant polypeptide by expressing it and recovering and purifying it. Since the polypeptide used as an antigen in the present invention has a size of a hundred or more residues, a recombinant polypeptide is produced using host cells such as Escherichia coli by genetic engineering techniques in order to synthesize a large amount at a low cost. It is preferable.
  • the recombinant polypeptide can be modified by various post-translational modifications (elimination of N-terminal methionine, N-terminal acetylation, glycosylation, limited degradation by intracellular protease, myristoylation, isoprenylation, As long as such a post-translationally modified form of the polypeptide is also reactive with the antibody induced in vivo against pp28 produced by HCMV, the method of the present invention It can be used as an antigen.
  • the polynucleotide encoding the polypeptide is, for example, HCMV having pp28 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. It can be prepared by infecting a suitable host cell (such as AD169 strain), extracting viral DNA from the infected cell, and synthesizing DNA by PCR. Primers used in PCR can be easily designed and prepared by those skilled in the art based on the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, for example, primers comprising the base sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 used in the examples. Can be used.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of an amino acid sequence different from SEQ ID NO: 2 can be prepared.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide having a desired amino acid sequence can be obtained using a commercially available nucleic acid synthesizer or appropriately introducing mutations into DNA prepared as described above by a conventional method.
  • a desired polypeptide can be obtained by incorporating the prepared polynucleotide into an appropriate vector, expressing it in an appropriate expression system, and collecting and purifying it.
  • vectors used and various expression systems are also well known.
  • Various vectors, host cells, reagents, kits Can be appropriately selected and used by those skilled in the art.
  • HCMV strains are also commercially available, and can be obtained separately from infected patients, so that they are easily available. Methods such as viral DNA extraction, PCR, DNA integration into a vector, introduction of a vector into a host cell, and recovery / purification of an expressed polypeptide are well-known conventional methods.
  • the recombinant polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 can be expressed using an E. coli expression system, and the expressed polypeptide is, for example, pp28 Can be easily purified using an antibody column on which a monoclonal antibody that specifically binds to the antibody is immobilized.
  • the recombinant polypeptide thus obtained is used as an antigen for immunoassay, all HCMV-infected patients can be detected without omission.
  • the preparation method of a monoclonal antibody is a well-known normal method, and if it is an expert, it can produce it easily.
  • an animal is immunized with an inactivated virus, antibody-producing cells such as spleen cells are collected from the animal, and this is fused with myeloma cells to produce a hybridoma.
  • a monoclonal antibody that specifically binds to pp28 can be recovered from the culture supernatant by selecting and growing a hybridoma that produces an antibody having the binding ability.
  • Immunoassays themselves are well known in this field.
  • the immunoassay can be classified by reaction mode, such as sandwich method, competition method, aggregation method, immunochromatography method, Western blot method, etc. If classified by label, radioimmunoassay, fluorescent immunoassay, enzyme immunoassay (EIA), biotin immunity There are measurements.
  • various methods of antibody testing using antigens are known. Specific examples include, but are not limited to, EIA (ELISA, CLEIA (chemiluminescence enzyme immunoassay), Western blot, etc.), aggregation Method (latex aggregation method, etc.), complement binding reaction (CF) and the like.
  • EIA ELISA, CLEIA (chemiluminescence enzyme immunoassay), Western blot, etc.
  • aggregation Method latex aggregation method, etc.
  • complement binding reaction CF
  • any known immunoassay method may be used.
  • the term “measurement” includes detection
  • the artificial polypeptide antigen described above is used in the form of an arbitrary amino acid sequence added to one or both ends (as a polypeptide comprising an amino acid sequence containing such an additional sequence). can do.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence containing such an additional sequence can do.
  • the anti-pp28 antibody in the sample can be immunoassayed.
  • the artificial polypeptide is used in such a form, it is a part of the artificial polypeptide that functions as the antigen of the anti-pp28 antibody in the fusion protein. Is used as an antigen.
  • the artificial polypeptide antigen is used in a form in which an arbitrary amino acid sequence is added to one end or both ends is also included in the method of the present invention.
  • the amino acid sequence added to the artificial polypeptide may constitute any functional protein or a functional fragment thereof, or may be a sequence having no physiological activity such as a linker.
  • a tag sequence such as GST or His may be added in the production process, but it can be used as an antigen even if such a tag sequence remains added.
  • the artificial polypeptide antigen is immobilized on a plate or particle, respectively, and this is reacted with the sample to capture the anti-pp28 antibody in the sample on the solid phase. Then, it is reacted with enzyme-labeled anti-IgG antibody and / or anti-IgM antibody, and after washing, a substrate substance is added. Based on the amount of enzyme reaction, the anti-pp28 antibody captured on the solid phase can be measured.
  • the artificial polypeptide antigen is transferred to a membrane after electrophoresis, and this membrane is reacted with a sample, and then reacted with an enzyme-labeled anti-IgG antibody and / or anti-IgM antibody in the same manner as described above. You can do it.
  • the artificial polypeptide antigen is immobilized on latex particles or the like, reacted with a sample, and the amount of aggregation of the particles may be measured by absorbance or the like.
  • the antibodies induced against HCMV in vivo are mainly IgG and IgM.
  • IgM In the case of primary infection, IgM first rises, reaches a peak several days after infection, decreases thereafter, and IgG begins to rise about one week after infection and continues for a long period after that. Therefore, in the case of a technique capable of detecting anti-pp28 antibody in a sample by dividing it into IgG and IgM (for example, the above ELISA or Western blot), the anti-pp28 antibody supplemented with an antigen is used from the viewpoint of reliably detecting HCMV infection. It is preferable to use both an anti-IgG antibody and an anti-IgM antibody for detection.
  • the sample to which the method of the present invention is applied is a sample separated from a subject, preferably a blood sample (whole blood, plasma, serum, etc.).
  • an HCMV antigen protein other than the artificial polypeptide or a fragment thereof may be used at the same time.
  • all antigens may be mixed and immobilized on a plate, or may be immobilized in separate wells and reacted with a sample.
  • all the antigens may be mixed and solid-phased into particles, which may be reacted with the sample.
  • all antigens may be mixed and electrophoresed, then transferred to a membrane, and reacted with a sample.
  • the mixed antigen may be immobilized on the particles, or the particles each having the antigen immobilized thereon may be mixed, and the particles may be reacted with the sample.
  • the above-mentioned artificial polypeptide can be provided as a detection reagent for HCMV infection.
  • the reagent may contain only the above-described polypeptide, or may further contain one or more types of antigen proteins other than pp28 or fragments thereof. Further, it may further contain other components useful for stabilizing these polypeptides.
  • the antigen polypeptide can also be provided in a form immobilized on a solid phase such as a plate or particle.
  • the detection reagent can be provided as an HCMV infection detection kit in combination with other reagents as appropriate.
  • Other reagents necessary for immunoassays are well known.
  • the detection kit of the present invention includes, in addition to the detection reagent described above, a buffer that can be used as a sample diluent or washing solution, a labeled anti-immunoglobulin antibody for detecting an antibody bound to an antigen polypeptide, and the like. obtain.
  • HCMV proteins For 15 types of HCMV proteins (Table 1 below), full-length proteins were synthesized by a wheat germ cell-free expression system. For synthesis, Cellfree Science Protemist DT was used. The insert DNA to be inserted into the vector is obtained by infecting MRC-5 cells with HCMV AD169 strain (purchased from RIKEN BioResource Center), extracting viral DNA from the infected cells, and PCR using a commercially available kit to extract each full-length protein. The encoding DNA was obtained by amplification. Each DNA was cloned into a plasmid vector containing the SP6 promoter, and the resulting plasmid DNA was used for a transcription reaction at 37 ° C. for 6 hours and translation at 15 ° C.
  • pp28 DNA DNA 25 ⁇ g.
  • primers consisting of the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 (including BamHI recognition sequence and NotI recognition sequence, respectively) were used, and Pfu Ultra DNA plymerase (Agilent Technologies) was used. PCR was performed under the reaction conditions of 95 ° C for 2 minutes, 30 cycles of 95 ° C for 20 seconds-55 ° C for 20 seconds-72 ° C for 1 minute, and finally 72 ° C for 3 minutes.
  • Pp28 that could be expressed in E. coli was purified using an antibody column.
  • a mouse was immunized with the inactivated virus to prepare a pp28 antigen-specific monoclonal antibody by a conventional method, and this antibody was immobilized on a CNBr-Activated Sepharose 4B column (GE Healthcare) to obtain an antibody column for purification.
  • the pp28 protein could be purified by only one column treatment without contamination of E. coli-derived protein (FIG. 1). This recombinant pp28 protein was able to detect 100% of HCMV-infected patients.

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Abstract

ＨＣＭＶ感染を高感度に検出できる実用性の高い新規な手段が開示されている。本願発明者らは、１５種類ものＨＣＭＶタンパク質について全長タンパク質を合成し、ＨＣＭＶ感染患者血清との反応性を鋭意検討した結果、pp28全長タンパク質を抗原として用いた場合に全ての感染患者を漏れなく検出可能であることを見出した。pp28全長タンパク質は大腸菌を用いて組換えタンパク質として大量合成・精製が可能であり、ＨＣＭＶ検査のための抗原として商業利用が可能である。

Description

ヒトサイトメガロウイルス感染の検出方法
　本発明は、ヒトサイトメガロウイルス感染の検出方法に関する。
　ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）を原因とする感染症の血清学的診断には、一般的に、ウイルス抗原（native抗原）が使用されている。しかしながら、native抗原では、調製法により生じるロット差を無視できない。また、ウイルス自体を扱うことから、安全性や簡便さに問題がある。
　HCMV血清学的診断の標準化を達成するために、抗原のリコンビナント化が望まれているが、リコンビナント抗原のみを用いた場合には、検査の感度・特異性が十分ではないことが知られている。これは、多数のウイルス抗原の中からリコンビナント化すべき適切な抗原を選択することが困難だからである。それに加えて、各抗原タンパク質の部分発現断片を使用していることも一因と考えられている。
　例えば、主要な抗原として知られているpp150は、分子量が約150kDaのタンパク質であるため大腸菌を用いた大量合成が不可能であり、全長タンパク質を検査に利用することは困難である。そのため、市販の検査キットでは、pp150の断片（典型的には３０残基～４０残基程度）を他のHCMVタンパク質断片と適宜混合して抗原として用いている。しかしながら、部分発現断片のみでは、検査の感度が60％程度と不十分であることが報告されている。
　もっとも、免疫測定による血清検査の分野では、全長抗原を用いたからといって必ずしも検出感度が上がらないことも知られている。例えば、非特許文献１には、HCMVのnative抗原（ウイルスタンパク質を全長で含む）に対してHCMV陽性患者血清群の抗体反応性を調べ、タンパク質ごとに抗体反応性を評価した結果が示されているが、１００％に近い検出感度を達成できているのはpp150のみであり、タンパク質の種類によっては検出感度が５０％程度以下と非常に低くなっている。
特表2000-514300号公報
Journal of Clinical Microbiology:37(1), p179-188, 1999
　本発明の目的は、HCMV感染を高感度に検出できる実用性の高い新規な手段を提供することにある。
　本願発明者らは、１５種類ものHCMVタンパク質について全長タンパク質を合成し、HCMV感染患者血清との反応性を鋭意検討した結果、pp28全長タンパク質を抗原として用いた場合に全ての感染患者を漏れなく検出可能であること、pp28全長タンパク質は大腸菌を用いて組換えタンパク質として大量合成・精製が可能であり、HCMV検査のための抗原として商業利用が可能であることを見出し、本願発明を完成した。
　すなわち、本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る人工のポリペプチドであって、ヒトサイトメガロウイルスが産生するpp28に対して生体内で誘導された抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有する人工のポリペプチドを抗原として用いた免疫測定により、被検者から分離された試料中に含まれ得る、pp28に対する抗体を測定することを含む、ヒトサイトメガロウイルス感染の検出方法を提供する。また、本発明は、配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る人工のポリペプチドであって、ヒトサイトメガロウイルスが産生するpp28に対して生体内で誘導された抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有する人工のポリペプチドを含む、ヒトサイトメガロウイルス感染の検出試薬を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の検出試薬を含む、ヒトサイトメガロウイルス感染の検出キットを提供する。
　本発明により、検出感度が極めて優れたHCMV感染の検出手段が提供された。本発明によれば、簡便な免疫測定によって、全てのHCMV感染患者を漏れなく確実に検出することができる。公知の抗体検査方法には、pp28断片を抗原として用いる方法があり、例えば非特許文献１にもpp28を30残基程度のサイズの断片で用いて血清中の抗HCMV抗体を検出する方法が記載されている。しかしながら、非特許文献１によると、pp28断片では1割以上の患者で偽陰性が発生している。偽陰性が発生すると感染患者を見落とすことになるため、臨床検査では重大な問題である。本発明の方法によれば、感染患者を見落とすことなく確実に検出可能になり、臨床検査に大いに貢献できる。
大腸菌で発現させたpp28組換えタンパク質を抗体カラムで精製した過程をウエスタンブロットにより確認した結果である。左は実施例で調製した抗pp28モノクローナル抗体を使用して検出、右は大腸菌抗原に対する抗体を使用して検出した結果である。Ma: マーカー、元: カラム添加前、pass: 通過画分、elute: 溶出画分、conc.: 濃縮画分。
　pp28は、HCMVの構造タンパク質のうちのひとつである28 kDaのリンタンパク質であり、UL99遺伝子にコードされていることからUL99と呼ばれることもある。配列番号２に示されるアミノ酸配列は、HCMV AD169株が有するpp28のアミノ酸配列であり、GenBankにもX17403（complete genome）等のアクセッション番号で登録されている。配列番号２のアミノ酸配列をコードするウイルスDNAの塩基配列を配列番号１に示す。
　本発明では、配列番号２に示すアミノ酸配列から成る人工のpp28を抗原として用いる。あるいは、配列番号２のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換され、欠失され、挿入され及び／又は付加されたアミノ酸配列から成り、且つ、HCMVが産生するpp28に対し生体内で誘導された抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有する人工のポリペプチドを抗原として用いる。後者のポリペプチドは、配列番号２との同一性が９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上である。後者のポリペプチドとしては、配列番号２のアミノ酸配列のうち１個又は数個のアミノ酸残基が置換され、欠失され、挿入され及び／又は付加されたアミノ酸配列から成るものも好ましい。
　実施例では、配列番号２に示すアミノ酸配列から成るpp28全長タンパク質のみを抗原として用いて、HCMV感染患者由来の１００検体を全て検出可能であった。ウイルスはゲノムの変異が頻繁であり、pp28のアミノ酸配列についても臨床分離株で種々の変異配列が見出されている。そのため、これらの検体を採取した１００人の感染患者間でも、HCMVのpp28のアミノ酸配列には一部相違があるものと考えられる。そのような種々のアミノ酸配列から成る天然のpp28に対して生体内で誘導された抗体であっても、いずれも、配列番号２に示すアミノ酸配列から成るポリペプチドと反応して検出されるのであるから、配列番号２とはアミノ酸配列に一部相違があるポリペプチドを抗原とした場合であっても、やはり同様にpp28に対する抗体（抗pp28抗体）を検出できると考えられる。配列番号２との同一性が十分に高いポリペプチドであれば、HCMV感染者体内で誘導された抗pp28抗体との反応性が、もとの配列番号２から成るpp28と同等である蓋然性が高い。
　なお、任意のアミノ酸配列から成るポリペプチドが、HCMVが産生するpp28に対し生体内で誘導された抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有するかどうかは、例えば、既知のHCMV感染患者から分離した血清等の試料とそのポリペプチドとを反応させることで容易に確認できる。血清中に存在する抗体とポリペプチドとの結合が確認できれば、該ポリペプチドは上記した反応性を有すると判断できる。
　ここで、アミノ酸配列の「同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列を整列させ、一致したアミノ酸残基数を全アミノ酸残基数で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばBLAST、FASTA、CLUSTAL W等の周知のプログラムを用いて容易に行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、相同性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。
　なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro)、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, Lys, His)、芳香族アミノ酸(Phe, Tyr, Trp)のように類似の性質を有するものにグループ分けでき、これらの間での置換であればポリペプチドの性質が変化しないことが多いことが知られている。従って、配列番号２の少数のアミノ酸残基がこれらの各グループ内で置換されている場合には、HCMVが産生するpp28に対して生体内で誘導された抗体との反応性が、もとの配列番号２のアミノ酸配列から成るポリペプチドと同等である可能性が特に高い。このように置換されたアミノ酸配列から成るポリペプチドは、本発明で抗原として用いられるポリペプチドのうち、配列番号２とは異なるアミノ酸配列から成るものの好ましい一例である。
　「人工のポリペプチド」とは、化学合成、遺伝子工学的手法その他の方法で人為的に製造されたポリペプチドであり、HCMVに感染した細胞内でHCMVゲノムから発現し産生されたタンパク質を回収したものは包含されない。pp28のアミノ酸配列及びこれをコードする塩基配列は、上記した通りデータベースに登録され公知であり、本願配列表にも記載されている。また、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、配列番号２とは異なるアミノ酸配列から成るポリペプチドであっても、それをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を容易に特定できる。本発明で抗原として用いるポリペプチドは、これらの配列情報に基づき、いずれの方法によっても製造することができる。
　化学合成法の具体例としては、例えばFmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等を挙げることができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。化学合成の場合は、アミノ酸配列のみに基づいて所望のポリペプチドを合成できる。
　遺伝子工学的手法によるポリペプチドの作製方法も周知であり、簡単に記載すると、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを適当な発現ベクターに組み込み、適当な発現系を使用して発現させ、これを回収・精製することにより、目的とする抗原ポリペプチドを組換えポリペプチドとして得ることができる。本発明で抗原として用いるポリペプチドは百数十残基以上のサイズを有するので、低コストで大量合成するためには遺伝子工学的手法により大腸菌等の宿主細胞を用いて組換えポリペプチドを作製することが好ましい。使用する宿主細胞の種類に応じて、組換えポリペプチドは各種の翻訳後修飾（N末端メチオニンの脱離、N末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化など）を受け得るが、そのような翻訳後修飾された形態のポリペプチドも、HCMVが産生するpp28に対し生体内で誘導された抗体との反応性を有する限り、本発明の方法で抗原として使用できる。
　配列番号２に示すアミノ酸配列から成るポリペプチドを遺伝子工学的手法で作製する場合、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号１）は、例えば、配列番号２のアミノ酸配列から成るpp28を有するHCMV（AD169株等）を適当な宿主細胞に感染させ、この感染細胞からウイルスDNAを抽出し、PCRによりDNAを合成することで調製できる。PCRに使用するプライマーは、当業者であれば、配列番号１に示した塩基配列に基づいて容易に設計・調製でき、例えば実施例で用いている配列番号３及び４に示す塩基配列から成るプライマーを使用できる。他のアミノ酸配列から成るpp28を発現するHCMV株を用いれば、配列番号２とは異なるアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製できる。また、所望のアミノ酸配列から成るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、市販の核酸合成機を用いて、又は上記の通りに調製したDNAに常法により適宜変異を導入して得ることができる。調製したポリヌクレオチドを適当なベクターに組み込み、適当な発現系にて発現させ、これを回収・精製することで、所望のポリペプチドを得ることができる。用いるベクターや各種の発現系（細菌発現系、酵母細胞発現系、哺乳動物細胞発現系、昆虫細胞発現系、無細胞発現系など）も周知であり、種々のベクターや宿主細胞、試薬類、キットが市販されているため、当業者であれば適宜選択して使用することができる。HCMV株も市販されており、また、感染患者から分離して得ることもできるので、入手は容易である。ウイルスDNAの抽出、PCR、ベクターへのDNAの組み込み、宿主細胞へのベクターの導入、発現させたポリペプチドの回収・精製等の手法自体は周知の常法である。
　下記実施例に具体的に記載されるように、配列番号２に示すアミノ酸配列から成る組換えポリペプチドは、大腸菌発現系を用いて発現させることができ、この発現させたポリペプチドは、例えばpp28と特異的に結合するモノクローナル抗体を固定化した抗体カラムを用いて簡便に精製できる。こうして得られた組換えポリペプチドを免疫測定の抗原として用いると、HCMV感染患者を漏れなく全て検出できる。なお、モノクローナル抗体の作製方法は周知の常法であり、当業者であれば容易に作製できる。例えば、下記実施例にも記載されるように、不活化ウイルスを動物に免疫し、該動物から脾細胞等の抗体産生細胞を採取し、これをミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、所望の結合性を有する抗体を産生するハイブリドーマを選択して増殖させることで、培養上清からpp28に特異的に結合するモノクローナル抗体を回収することができる。
　免疫測定自体はこの分野で周知である。免疫測定を反応様式で分類すると、サンドイッチ法、競合法、凝集法、イムノクロマト法、ウェスタンブロット法等があり、標識で分類すると、放射免疫測定、蛍光免疫測定、酵素免疫測定（EIA）、ビオチン免疫測定等がある。また、抗原を用いた抗体検査法も各種の手法が知られており、具体例としては、これらに限定されないが、EIA（ELISA、CLEIA（化学発光酵素免疫測定法）、ウエスタンブロット等）、凝集法（ラテックス凝集法等）、補体結合反応（CF）等が挙げられる。本発明の方法で試料中の抗pp28抗体を測定する際には、公知の免疫測定法のいずれを用いてもよい。なお、本発明において、「測定」という語には、検出、定量及び半定量が包含される。
　免疫測定において用いる際には、上記した人工ポリペプチド抗原は、任意のアミノ酸配列が片末端又は両末端に付加された形態で（そのような付加配列を含んだアミノ酸配列から成るポリペプチドとして）使用することができる。この分野において、異なるタンパク質と融合させた融合タンパク質であっても、一方のタンパク質を認識する抗体で検出可能であることは広く知られた事実である。従って、このような形態で上記人工ポリペプチドを用いても、試料中の抗pp28抗体を免疫測定することができる。例えば、他のタンパク質との融合タンパク質の形態で用いた場合でも、その融合タンパク質の中で抗pp28抗体の抗原として機能しているのは上記人工ポリペプチドの部分であるから、「人工のポリペプチドを抗原として用いる」ことに包含される。このように、上記人工ポリペプチド抗原を任意のアミノ酸配列が片末端又は両末端に付加された形態で用いる場合も、本発明の方法に包含される。上記人工ポリペプチドに付加されるアミノ酸配列は、何らかの機能性タンパク質又はその機能性断片を構成するものであってよいし、リンカー等の生理活性のない配列であってもよい。組換えポリペプチドの場合は、製造工程でGSTやHis等のタグ配列が付加されることがあるが、そのようなタグ配列が付加されたままの状態であっても抗原として使用可能である。
　例えば、ELISAやCLEIAの場合には、上記人工ポリペプチド抗原を、それぞれプレートまたは粒子等に固相化し、これを試料と反応させて試料中の抗pp28抗体を固相上に捕捉し、洗浄後、酵素標識された抗IgG抗体及び/又は抗IgM抗体と反応させ、洗浄後、基質物質を添加する。酵素反応量に基づき、固相上に捕捉された抗pp28抗体を測定することができる。ウエスタンブロットの場合には、上記人工ポリペプチド抗原を電気泳動後メンブレンに転写し、このメンブレンを試料と反応させた後、上記と同様に酵素標識された抗IgG抗体及び/又は抗IgM抗体と反応させればよい。凝集法の場合には、例えばラテックス粒子等に上記人工ポリペプチド抗原を固定化し、これを試料と反応させ、粒子の凝集量を吸光度等により測定すればよい。
　生体内でHCMVに対して誘導される抗体は主にIgGとIgMである。初感染の場合、まずIgMが上昇し、感染数日後にピークに達してそれ以後は減少、IgGは感染後１週間程度で上昇し始め以後長期間持続する。従って、試料中の抗pp28抗体をIgGとIgMに分けて検出可能な手法の場合（例えば上記のELISAやウエスタンブロット等）、HCMV感染を確実に検出する観点からは、抗原で補足した抗pp28抗体の検出に抗IgG抗体及び抗IgM抗体の両者を用いることが好ましい。
　本発明の方法が適用される試料は、被検者から分離された試料であり、好ましくは血液試料（全血、血漿、血清等）である。
　本発明の方法を実施する際には、上記人工ポリペプチド以外のHCMV抗原タンパク質又はその断片を同時に用いてもよい。例えば、ELISAの場合には、抗原を全て混合してプレートに固相化するか、又は別個のウェルにそれぞれ固相化し、これを試料と反応させてもよい。CLEIAの場合には、抗原を全て混合して粒子に固相化し、これを試料と反応させてもよい。ウエスタンブロットの場合には、例えば抗原を全て混合して電気泳動した後にメンブレンに転写し、これを試料と反応させてもよい。凝集法の場合には、混合した抗原を粒子に固定化するか、又は抗原をそれぞれ単独で固定化した粒子を混合し、この粒子を試料と反応させてもよい。
　上記した人工のポリペプチドは、HCMV感染の検出試薬として提供することができる。該試薬は、上記したポリペプチドのみを含んでいてもよいし、pp28以外の１種以上の抗原タンパク質又はその断片をさらに含んでいてもよい。また、これらのポリペプチドの安定化等に有用な他の成分をさらに含んでいてもよい。さらにまた、抗原ポリペプチドがプレートや粒子等の固相上に固定化された形態で提供することもできる。
　上記検出試薬は、他の試薬類等と適宜に組み合わせてHCMV感染の検出キットとして提供することができる。免疫測定に必要な他の試薬類は周知である。例えば、本発明の検出キットには、上記した検出試薬の他、サンプル希釈液又は洗浄液等として使用可能な緩衝液、抗原ポリペプチドに結合した抗体を検出するための標識抗免疫グロブリン抗体等を含み得る。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
１．抗原候補の選択
　HCMVタンパク質のうち１５種類（下記表１）のタンパク質について、小麦胚芽無細胞発現系により全長タンパク質を合成した。合成にはセルフリーサイエンス社のProtemist DTを使用した。ベクターに挿入するインサートDNAは、HCMV AD169株（理研バイオリソースセンターより購入）をMRC-5細胞に感染させ、この感染細胞からウイルスDNAを抽出し、市販のキットを用いたPCRにより、各全長タンパク質をコードするDNAを増幅して得た。SP6プロモーターを含むプラスミドベクターに各DNAをクローニングし、得られたプラスミドDNAを用いて、5mLの反応系（プラスミドDNA 25μg）にて３７℃、６時間の転写反応及び１５℃、２０時間の翻訳を行ない、それぞれの全長タンパク質を合成した。なお、pp28のDNAの増幅には、配列番号３及び４に示す塩基配列から成るプライマー（それぞれ、BamHI認識配列及びNotI認識配列を含む）を使用し、Pfu Ultra DNA plymerase(Agilent Technologies社）を用いて95℃2分間の変性処理、95℃20秒－55℃20秒－72℃1分を30サイクル、最後に72℃3分間の反応条件でＰＣＲを行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
２．候補抗原の決定
　上記で合成した各全長タンパク質について、ウエスタンブロット法によりHCMV感染患者血清100例との反応性を調べた。各全長タンパク質を電気泳動してメンブレンに転写し、メンブレンをHCMV感染患者血清100例と反応させた後、anti-Human IgG + IgMにて検出した。その結果、下記表２に示す通り、pp150, pp28, gp130の3種類が100%の反応性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
３．大腸菌発現系による抗原の作製
　組換えタンパク質の大量生産のためには大腸菌発現系を利用することが望ましい。そこで、１００％の反応性を示した３種類の抗原について、常法の大腸菌発現系を用いて全長タンパク質の作製を検討した。上記で調製した各抗原タンパク質をコードするcDNAを大腸菌用の発現ベクターに組み込み、大腸菌に導入して発現させた。その結果、pp28の発現を確認することができた。一方、pp150, gp130(膜タンパク質）は大腸菌で発現不可能であった。
　大腸菌で発現できたpp28は、抗体カラムを用いて精製を行なった。不活化ウイルスをマウスに免疫して常法によりpp28抗原特異的モノクローナル抗体を作製し、この抗体をCNBr-Activated Sepharose 4Bカラム（GE Healthcare社）に固定化して精製用の抗体カラムとした。その結果、一回のカラム処理のみで、大腸菌由来タンパク質のコンタミもなくpp28タンパク質を精製することができた（図１）。この組換えpp28タンパク質によっても、HCMV感染患者を１００％検出することができた。

Claims (6)

  1. 　配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る人工のポリペプチドであって、ヒトサイトメガロウイルスが産生するpp28に対して生体内で誘導された抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有する人工のポリペプチドを抗原として用いた免疫測定により、被検者から分離された試料中に含まれ得る、pp28に対する抗体を測定することを含む、ヒトサイトメガロウイルス感染の検出方法。
  2. 　前記人工のポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸が置換され、欠失され、挿入され及び／若しくは付加されたアミノ酸配列から成る請求項１記載の方法。
  3. 　前記人工のポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列から成る請求項２記載の方法。
  4. 　前記人工のポリペプチドは、遺伝子工学的手法により作製された組換えポリペプチドである請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列から成る人工のポリペプチドであって、ヒトサイトメガロウイルスが産生するpp28に対して生体内で誘導された抗体と抗原抗体反応により結合する反応性を有する人工のポリペプチドを含む、ヒトサイトメガロウイルス感染の検出試薬。
  6. 　請求項５に記載の検出試薬を含む、ヒトサイトメガロウイルス感染の検出キット。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105510581A (zh) * 2015-12-11 2016-04-20 郑州安图生物工程股份有限公司 巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3258265B1 (en) 2015-02-09 2022-04-13 Xiamen University Method for assessing risk of human cytomegalovirus active infection in body and related kit
KR102281998B1 (ko) * 2017-08-30 2021-07-27 삼성전자 주식회사 이종재질 통신장치 함체
CN112694520B (zh) * 2020-12-02 2023-01-17 图凌(杭州)生物医药有限公司 一种人工多肽hm、其抗体及在病理检测中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000514300A (ja) * 1996-07-12 2000-10-31 アクゾ・ノベル・エヌ・ベー ヒトサイトメガロウイルス（ｃｍｖ）を検出するためのペプチド試薬
JP2008263983A (ja) * 2007-04-20 2008-11-06 F Hoffmann La Roche Ag 病原体の一次感染の検出
JP2010517544A (ja) * 2007-02-07 2010-05-27 シグマ−タウ・インドゥストリエ・ファルマチェウチケ・リウニテ・ソシエタ・ペル・アチオニ ヒトサイトメガロウイルス（ｈｃｍｖ）の組換え抗原

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3619902A1 (de) * 1986-06-13 1988-03-03 Biotechnolog Forschung Gmbh Cmv-dna-strukturen, expressionsvektor dafuer, cmv-proteinstrukturen und deren verwendung
US6733989B1 (en) * 1988-02-24 2004-05-11 Dade Behring Marburg Gmbh Structural phosphoprotein (pp28) of human cytomegalovirus (HCMV), the preparation and use thereof
EP0702083A3 (de) * 1994-07-26 1997-01-15 Biotest Ag Polypeptide und Fusionsproteine bestehend aus dem UL 57 Leserahmen bzw. dem C-terminalen Bereich des Tegumentproteins pp150 aus HCMV, entsprechende Oligonucleotide und Nachweis reagentien
US5945276A (en) * 1996-04-10 1999-08-31 Signal Pharmaceuticals, Inc. Reporter cell line system for detecting cytomegalovirus and identifying modulators of viral gene expression
AUPR593101A0 (en) * 2001-06-26 2001-07-19 Council Of The Queensland Institute Of Medical Research, The Cytomegalovirus t cell epitopes
ITRM20030386A1 (it) * 2003-08-05 2005-02-06 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Metodo e test diagnostici basati sull'analisi citofluorimetrica dei linfociti t antigene-specifici.
WO2006056027A1 (en) * 2004-11-29 2006-06-01 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Human cytomegalovirus immunotherapy
CN1307423C (zh) * 2005-01-08 2007-03-28 王明丽 重组抗原pp65包被酶标反应板的制法及ELISA检测试剂盒
JP2006223180A (ja) * 2005-02-17 2006-08-31 Hokkaido Univ マルチプレックスｐｃｒを用いたヘルペスウイルス遺伝子検出法
CA2682700A1 (en) * 2007-05-11 2008-11-20 Vakzine Projekt Management Gmbh Composition containing hcmv particles

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000514300A (ja) * 1996-07-12 2000-10-31 アクゾ・ノベル・エヌ・ベー ヒトサイトメガロウイルス（ｃｍｖ）を検出するためのペプチド試薬
JP2010517544A (ja) * 2007-02-07 2010-05-27 シグマ−タウ・インドゥストリエ・ファルマチェウチケ・リウニテ・ソシエタ・ペル・アチオニ ヒトサイトメガロウイルス（ｈｃｍｖ）の組換え抗原
JP2008263983A (ja) * 2007-04-20 2008-11-06 F Hoffmann La Roche Ag 病原体の一次感染の検出

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GREIJER A.E. ET AL.: "Molecular Fine- Specificity Analysis of Antibody Responses to Human Cytomegalovirus and Design of Novel Synthetic-Peptide-Based Serodiagnostic Assay", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 37, no. 1, 1999, pages 179 - 188, XP002257029 *
JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 37, no. 1, 1999, pages 179 - 188
KAORU WADA ET AL.: "Recombinant Tanpakushitsu (pp150,gp58) ni yoru CMV Kotai no Kenshutsu", PROCEEDINGS OF THE JAPANESE SOCIETY FOR IMMUNOLOGY, vol. 24, 25 October 1994 (1994-10-25), pages 624, XP008168634 *
MEYER H. ET AL.: "Identification and Procaryotic Expression of the Gene Coding for the Highly Immunogenic 28-Kilodalton Structural Phosphoprotein(pp28) of Human Cytomegalovirus", J. VIROL., vol. 62, no. 7, July 1988 (1988-07-01), pages 2243 - 2250, XP000106691 *
See also references of EP2592419A4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105510581A (zh) * 2015-12-11 2016-04-20 郑州安图生物工程股份有限公司 巨细胞病毒IgG抗体亲和力检测试剂盒

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