WO2012002472A1 - Ａｃｆ検出方法 - Google Patents

Ａｃｆ検出方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2012002472A1
WO2012002472A1 PCT/JP2011/064997 JP2011064997W WO2012002472A1 WO 2012002472 A1 WO2012002472 A1 WO 2012002472A1 JP 2011064997 W JP2011064997 W JP 2011064997W WO 2012002472 A1 WO2012002472 A1 WO 2012002472A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
acf
region
detection method
specific expression
molecule
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/064997
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
葉子 堀野
Original Assignee
オリンパス株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by オリンパス株式会社 filed Critical オリンパス株式会社
Priority to EP11800934.9A priority Critical patent/EP2589666A4/en
Priority to CN2011800317868A priority patent/CN102985564A/zh
Priority to JP2012522682A priority patent/JPWO2012002472A1/ja
Publication of WO2012002472A1 publication Critical patent/WO2012002472A1/ja
Priority to US13/720,688 priority patent/US20130130256A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting ACF using, as an index, a molecule that is highly expressed specifically in ACF (abnormal crypt).
  • This application claims the priority based on Japanese Patent Application No. 2010-148649 for which it applied to Japan on June 30, 2010, and uses the content here.
  • Colorectal cancer is the leading cause of death in Japan and the second leading cause of death in the United States. In the United States, approximately 150,000 new colorectal cancers are discovered annually, and more than 50,000 die annually (estimated by the American Cancer Society). On the other hand, since colorectal cancer often takes several decades to progress from a benign tumor to a malignant tumor, early risk assessment / discovery is expected to contribute to good prognosis and prevention.
  • fecal occult blood tests enema X-ray contrast examinations, total colonoscopy, sigmoid colonoscopy, and the like as colorectal adenoma / tumor screening examination methods currently generally performed.
  • blood may be detected by factors other than adenomas and tumors, so it cannot be said that the specificity for colorectal adenomas / tumors is high. Prone to false positives.
  • enema X-ray contrast examinations can detect large-sized advanced cancers, but have the disadvantage that small lesions are difficult to detect.
  • the examination by the endoscope directly recognizes the lesion site, so that the examination result is highly reliable and contributes to the reduction in colorectal cancer mortality and incidence.
  • the lesion site is very small, so that it is difficult to detect by an endoscopic examination.
  • a method for detecting colorectal cancer from the stage of early lesions a method of analyzing at the molecular level using nucleic acid and protein analysis techniques has been attracting attention.
  • a genetic background as represented by familial polyposis (FAP) as a risk factor for colorectal cancer
  • FAP familial polyposis
  • the risk assessment of colorectal cancer can be performed by analyzing the gene of the subject.
  • lifestyle factors such as age (over 50 years old) and obesity / drinking / smoking have been observed in future colorectal cancer in both groups with and without a characteristic genetic background such as FAP. It is known to increase risk.
  • Nucleic acid analysis technology in feces and blood has been developed as a technology for detecting molecular abnormalities in the large intestine.
  • the amount of nucleic acid derived from a micro lesion is very small, and it is difficult to detect an early molecular abnormality.
  • the stool contains a large amount of intestinal bacteria and epithelial cells detached from areas other than the lesions, so that noise increases.
  • ACF abnormal crypts
  • ACF has been increasingly used as an index for colorectal cancer prevention research.
  • a micro ACF of 1 mm or less is difficult to detect by a normal endoscopic examination, and is generally detected by using an magnifying endoscope.
  • the magnifying endoscopy requires a long time to work, the use opportunity is limited and it is difficult to use it for primary screening of early colorectal cancer.
  • the development of technology for detecting microscopic ACF microscopically / endoscopically and evaluating the risk of colorectal cancer has not been realized.
  • Non-Patent Document 3 molecular variation is analyzed using a sample of the entire large intestine, so the specificity for ACF is low, and only in ACF when compared with surrounding tissues Molecular variation was not analyzed.
  • cyclinD1 prior research see Non-patent Document 4
  • iNOS prior research see Non-Patent Document 5
  • CD44 prior research see Non-Patent Document 6
  • only immunostaining data is analyzed. It is poor in sex and specificity and has not yet been applied to medical applications.
  • Non-Patent Document 7 a relatively large ACF of 50 crypts is targeted for analysis, and analysis of micro ACF molecular fluctuations at an early stage is performed. Not. Thus, although several molecules have been known that have been suggested to be usable as marker molecules for ACF, none of them are reliable enough to be clinically available.
  • micro-ACF stage of micro-lesion represented by micro-ACF of 1 mm or less (ie, early stage), analyze the molecules whose expression level fluctuates, and grasp the future colorectal cancer risk in molecular biology and easily evaluate it. Has not been realized yet.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting ACF by analyzing a test region of a large intestine tissue at a molecular level.
  • the present inventor showed that GSTp, iNOS, CD44, EGFR, COX2, and Fzd1 are expressed in a small amount of ACF whose size is 1 mm or less, and the expression level is increased as compared with normal tissue As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention (1) A method for detecting an ACF (abnormal crypt), An ACF detection method comprising detecting one or more ACF-specific expression-enhancing molecules selected from the group consisting of GSTp, iNOS, CD44, EGFR, COX2, and Fzd1 in a test region of a large intestine tissue, (2) The ACF detection method according to (1), wherein a diameter of the test region is 0.5 mm or less, (3) The ACF detection method according to (1) or (2), wherein the test region includes a region suspected of being ACF, (4) comparing the amount of the ACF-specific expression increasing molecule in the test region with the amount of the ACF-specific expression increasing molecule in the normal tissue region in the same large intestine tissue as the test region.
  • ACF detection method characterized in that (5) The ACF detection method according to any one of (1) to (4), wherein the test region is a sample collected from a living body, (6) The ACF detection method according to any one of (1) to (4), wherein the ACF-specific expression increasing molecule is detected in vivo.
  • ACF can be detected using molecular biological techniques.
  • the ACF detection method of the present invention can accurately detect a minute ACF of 1 mm or less. Since ACF is used as an indicator of colorectal cancer and colorectal adenoma, the ACF detection method of the present invention is useful for early detection of colorectal cancer and colorectal adenoma, evaluation of onset risk, and the like.
  • Example 1 it is the figure which showed the expression level relative value of GSTp in the control sample (sample of a surrounding normal tissue) and ACF sample (sample of an ACF site
  • Example 1 it is the figure which showed the expression level relative value of iNOS in the control sample and ACF sample of each rat individual.
  • Example 1 it is the figure which showed the expression level relative value of the EGFR in the control sample and ACF sample of each rat individual.
  • Example 1 it is the figure which showed the expression level relative value of Fzd1 in the control sample and ACF sample of each rat individual.
  • Example 1 it is the figure which showed the expression level relative value of Cdh1 in the control sample and ACF sample of each rat individual. In Example 1, it is the figure which showed the expression level relative value of Ctsb in the control sample and ACF sample of each rat individual. In Example 1, it is the figure which showed the expression level relative value of PCNA in the control sample and ACF sample of each rat individual. In Example 1, it is the figure which showed the expression level relative value of Ctnnb in the control sample and ACF sample of each rat individual. In Example 1, it is the figure which showed the expression level relative value of Met in the control sample and ACF sample of each rat individual.
  • Example 1 it is the figure which showed the relative expression level value of COX2 in the control sample and ACF sample of each rat individual.
  • Example 2 it is the figure which showed the fluorescence dyeing
  • Example 2 it is the figure which showed the analysis result of the fluorescence intensity of the ACF site
  • Example 2 it is the figure which showed the analysis result of the fluorescence intensity of the ACF site
  • Example 2 it is the figure which showed the immunostaining image of the AOM rat performed using the fluorescence labeled anti- GSTp antibody.
  • the ACF-specific expression increasing molecule means a molecule whose gene expression level is increased in the ACF in the large intestine tissue in the same individual as in the surrounding normal tissue.
  • the large intestine refers to a region including the cecum, colon, rectum, and anal canal
  • the large intestine tissue refers to a tissue including large intestinal mucosa and large intestine epithelium.
  • the diameter of a region indicates a diameter (a major axis in the case of an ellipse) when the region is a circle or an ellipse, and the region is other than a circle or an ellipse.
  • the ACF detection method of the present invention is selected from the group consisting of GSTp (glutathione S-transferase pi), iNOS (NOS2), CD44, EGFR, COX2, and Fzd1 (Frizzled homolog 1) in the test region of colon tissue.
  • GSTp glutthione S-transferase pi
  • iNOS NOS2
  • CD44 EGFR
  • COX2 COX2
  • Fzd1 Randomzled homolog 1
  • ACF-specific expression increasing molecules are detected.
  • GSTp may have a plurality of isoforms. However, GSTp may be an isoform expressed in large intestine tissue, and may detect only one type of isoform or may detect a plurality of isoforms. Good.
  • These six types of ACF-specific expression-enhancing molecules are molecules whose expression levels are higher than those of surrounding normal tissues in the small ACF having a size of 1 mm or less.
  • ACF-specific expression-enhancing molecules are clinically useful marker molecules for ACF detection, particularly micro-ACF detection, and the expression level of these ACF-specific expression-enhancing molecules is used as an index. By doing so, not only a relatively large ACF (that is, an ACF in which morphological abnormality has progressed) but also an early minute ACF can be detected with high accuracy.
  • the ACF detection method of the present invention it is sufficient to detect at least one kind of the six kinds of ACF-specific expression increasing molecules, and two or more kinds of molecules may be detected for one test region. .
  • the test region for detecting the expression level of the ACF-specific expression increasing molecule is not particularly limited as long as it is a region in the large intestine tissue, but includes a region suspected of being ACF (suspected ACF region). It is preferable that As the suspected ACF region, for example, there is a region deeply stained with methylene blue in the large intestine tissue. In methylene blue staining, regions other than ACF are also stained, but in the ACF detection method of the present invention, ACF can be detected with higher accuracy than methylene blue staining by using the expression level of the ACF-specific expression increasing molecule as an index. Can do. Examples of the suspected ACF region include regions where morphological abnormalities are observed by endoscopic observation, microscopic observation, image analysis, and the like.
  • the six types of ACF-specific expression increasing molecules to be detected in the present invention are all molecules in which the gene expression level of micro ACF is higher than that of normal tissue. Therefore, in the present invention, the micro ACF can be detected by setting the region including the suspected ACF region having a diameter of 1 mm or less as the test region.
  • the size of the test area in the ACF detection method of the present invention is not particularly limited, and can be appropriately determined in consideration of the size of the suspected ACF area, for example.
  • a higher proportion of ACF region is preferred.
  • the proportion of the normal tissue region in the test region is too high, even if the suspected ACF region is actually ACF, the ACF-specific expression increased molecular weight in the test region and the ACF specific in the normal tissue It becomes difficult to detect the difference from the molecular expression increase molecular weight.
  • the diameter of the test region is preferably 1 mm or less, more preferably less than 1 mm, and even more preferably 0.5 mm or less.
  • the ACF-specific expression increasing molecule detected in the ACF detection method of the present invention may be a molecule reflecting the gene expression level, and may be mRNA or protein. That is, the ACF detection method of the present invention can detect ACF in the test region by acquiring information on the ACF-specific expression increasing molecule in the test region at the RNA level or the protein level.
  • the detection method of each ACF-specific expression increasing molecule may be a method whose detection result depends on the amount and concentration of each molecule in the test region, and is a known method used for detection of mRNA or protein in a specimen. It can be appropriately selected from among them. Of these, the method used in expression analysis is preferred. Each method can be performed by a conventional method.
  • the ACF in the test region is detected by comparing the amount of the ACF-specific expression increasing molecule in the test region with the amount of the ACF-specific expression increasing molecule in the normal tissue in the large intestine tissue. be able to. That is, when the amount of the ACF-specific expression increasing molecule in the test region is larger than that in the normal tissue, ACF is contained in the test region, which is almost equal to or less than that in the normal tissue. In this case, it can be determined that ACF is not included in the test region.
  • the comparison of the amount of the ACF-specific expression increasing molecule in the test region and the normal tissue region may be performed per unit surface area or unit volume of each region, and the unit nucleic acid amount or unit protein contained in each region It may be done per quantity.
  • the test region in the large intestine tissue of the same individual, it is preferable to compare the test region with the surrounding normal tissue.
  • the expression level of each ACF-specific expression-enhancing molecule varies from individual to individual, the effect of individual differences can be suppressed by comparing the same individual.
  • ACF-specific increased expression molecules may not be detected in normal tissues, but may be detected only in ACF.
  • ACF-specific expression increasing molecule when the ACF-specific expression increasing molecule is detected in the test region, ACF is contained in the test region, and the ACF-specific expression increasing molecule is not detected. It is determined that ACF is not included in the test area.
  • the detection method for each ACF-specific expression increasing molecule is a method using a nucleic acid amplification reaction using a primer specific to each molecule, or a method specific to each molecule. Examples thereof include a method using hybridization using a probe.
  • a method using a nucleic acid amplification reaction for example, cDNA is synthesized by reverse transcription reaction from RNA contained in a test region, and then a nucleic acid amplification reaction such as RT-PCR is performed using the obtained cDNA as a template.
  • a nucleic acid amplification reaction such as RT-PCR is performed using the obtained cDNA as a template.
  • Can be used to detect an ACF-specific expression increasing molecule in the test region or to measure it quantitatively to an extent comparable to the amount in the normal tissue region. Extraction of RNA from the test region, reverse transcription reaction, and nucleic acid amplification reaction such as RT-PCR can be performed by appropriately selecting from methods known in the art.
  • the amplified ACF-specific expression increasing molecule can be fluorescently labeled and quantitatively detected by using a fluorescent intercalator, a primer labeled with a fluorescent substance, or the like. it can.
  • the ACF-specific expression increase in the test region Molecules can be fluorescently labeled and detected quantitatively.
  • each ACF-specific expression increasing molecule can be detected by, for example, an immunological technique using an antibody (specific antibody) that specifically recognizes each molecule. . Specifically, after binding a specific antibody of each molecule labeled with a labeling substance to the molecule in the test region, the signal from the labeling substance is measured, whereby the ACF specific in the test region is measured.
  • the molecular expression-enhancing molecule can be fluorescently labeled and detected quantitatively.
  • the labeling substance may be bound directly to a specific antibody of each molecule, or may be bound to a secondary antibody that specifically binds to the specific antibody.
  • the labeling substance can be appropriately selected from labeling substances generally used for detecting the presence of antigen-antibody reaction or the binding of two molecules.
  • a labeling substance include a fluorescent substance, a magnetic substance, and a radioisotope. From the viewpoint of high sensitivity and high safety, it is preferable to use a fluorescent substance as a labeling substance.
  • the antigen-antibody reaction can be performed by a conventional method. In addition to immunological techniques, for example, by using a specific probe showing the activity of an ACF-specific expression increasing molecule and detecting the probe, the amount of ACF-specific expression increase that is a protein can be detected. it can.
  • the detection of an ACF-specific expression increasing molecule can be performed on a specimen collected from a living body.
  • a sample of a test region including a suspected ACF region can be collected under a microscope from a colon tissue excision sample obtained by surgically excising a partial region of a large intestine tissue.
  • a normal tissue region preferably a normal tissue sample around the region to be examined, is collected from the same large intestine tissue resection sample.
  • a sample (biopsy sample) of a test region can be directly collected from a living body by previously staining a large intestine tissue of a living body with methylene blue and surgically excising a test region including a darkly stained region.
  • a sample of normal tissue around the test region can also be collected from the living body.
  • the sample of the test region or normal tissue region collected in this way is used for detection of an ACF-specific expression increasing molecule.
  • Methylene blue staining of in vivo large intestine tissue can be performed by a conventional method.
  • the detection of an ACF-specific expression increasing molecule can also be performed in vivo.
  • a labeled probe specific to an ACF-specific expression-enhancing molecule, a specific antibody of an ACF-specific expression-enhancing molecule that is directly or indirectly labeled, or a specific labeled that indicates the activity of an ACF-specific expression-enhancing molecule A probe is applied to or sprayed on a region including a test region in the large intestine of a living body, the probe or specific antibody is bound to an ACF-specific expression increasing molecule, and the ACF-specific expression increasing molecule is labeled, and then the label is applied.
  • an ACF-specific expression increasing molecule can be detected.
  • an ACF-specific expression increasing molecule in vivo it is preferable to detect the ACF-specific expression increasing molecule by fluorescent labeling. Specifically, first, an ACF-specific expression increasing molecule in a test region is fluorescently labeled using a probe or a specific antibody labeled with a fluorescent substance. Thereafter, the fluorescence emitted from the label is optically detected using an endoscope or a digestive tract videoscope that enables spectral detection, and a fluorescence image is obtained. By analyzing the obtained fluorescence image, an ACF-specific expression increasing molecule can be detected with high sensitivity and quantitatively.
  • an endoscope system in which at least a part is placed in a body cavity of a living body and acquires an image of an imaging target in the body cavity, which is combined with a specific substance inside the imaging target or
  • a chemical discharge means for discharging a sensitive fluorescent drug that reacts or a fluorescent drug accumulated in the imaging target toward the imaging target, a discharge control means for controlling the drug discharge means, and for exciting the fluorescent drug
  • a light source unit that emits excitation light and irradiation light having a spectral characteristic different from that of the excitation light, an optical system that propagates the excitation light and irradiation light from the light source unit toward the imaging target, and a body cavity Fluorescence emitted from the imaging object by the excitation light and light having a wavelength band different from that of the fluorescence emitted from the imaging object by the irradiation light.
  • a probe or a specific antibody specific to an ACF-specific expression increasing molecule labeled with a fluorescent substance may be used.
  • the sample used for detection of an ACF-specific expression-enhancing molecule may be derived from the large intestine of an animal, and may be a sample derived from any animal of fish, birds, reptiles, and mammals. Also good.
  • a mammal-derived sample is preferable.
  • non-human animals such as rodents such as mice, rats, guinea pigs, and rabbits, dogs, cats, cows, horses, sheep, pigs, monkeys, and the like may be used.
  • the detection result obtained by the ACF detection method of the present invention is useful as information provided for ACF diagnosis.
  • the detection result obtained by the ACF detection method is very effective information for judging the existence risk of colorectal cancer and evaluating the risk of developing colorectal cancer in the early and minimally invasive manner.
  • the amount of ACF-specific expression increasing molecules in the test region is larger in the subject's large intestine than in the surrounding normal tissue region, and ACF is detected in the test region. If so, it can be assessed that the subject is at high risk of developing colorectal cancer and colorectal adenoma in the future.
  • the subject when the amount of the ACF-specific expression increasing molecule in the test region is the same as or less than that in the surrounding normal tissue region, and ACF is not detected in the test region, the subject may have future colorectal cancer. And a low risk of developing colorectal adenoma.
  • Example 1 GSTp1, iNOS (NOS2), CD44, EGFR, Fzd1, Cdh1 (Cadherin 1), Ctsb (Cathepsin B), PCNA (proliferating cell nuclear antigen), Ctnnb1 (Catenin et. Molecules in which the gene expression levels in the surrounding normal tissue and the suspected ACF region in the same individual are compared with all 11 types of candidate molecules, and the gene expression level is increased specifically in ACF among these candidate molecule groups was identified.
  • a sample obtained by collecting only a region confirmed to be an ACF site under a microscope from a colon tissue excision sample collected from a rat in which ACF was formed in the colon tissue by administration of azoxymethane (AOM); Samples obtained only from the surrounding normal tissue region were prepared, and the expression level of each molecule in each sample was measured and compared. More details are given below.
  • a micro ACF having a size of 1 mm or less was selected and collected.
  • surrounding normal tissue was collected as a control sample.
  • the remaining 3 rats (rats AC) were less than 0.5 mm in diameter ACF samples and control samples were collected using the biopsy instrument.
  • RT reaction was carried out at 37 ° C. for 60 minutes in a reaction solution (final volume 20 ⁇ L) to which RIN7 or higher RNA (5 ng) was added to synthesize cDNA.
  • a pre-amplification reaction a pre-amplification reaction with a small number of cycles was performed using the obtained cDNA as a template and a primer set for amplifying each candidate molecule.
  • primer sets commercially available products (manufactured by Applied Biosystems) shown in Table 1 were used.
  • reaction solution 10 ⁇ L of the reaction solution after RT reaction and 12.5 ⁇ L of a solution prepared by mixing each primer set in advance, 25 ⁇ L of nucleic acid amplification reagent (Taqman Gene Expression Master Mix, manufactured by Applied Biosystems), 2.5 ⁇ L Were added to prepare a reaction solution having a final volume of 50 ⁇ L.
  • Each reaction solution was set in a PCR apparatus (manufactured by Eppendorf), heat-treated at 95 ° C. for 10 minutes, and then subjected to 14 cycles of heat reaction at 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 4 minutes. After the reaction, the reaction solution diluted 20 times was used as a real-time PCR sample.
  • Real-time PCR was performed using the preamplified cDNA as a template, and the expression product (mRNA) of each candidate molecule was detected. Specifically, 5 ⁇ L of each cDNA after the pre-amplification reaction was dispensed into a 0.2 mL 96-well plate, and then 4 ⁇ L of ultrapure water and 10 ⁇ L of a nucleic acid amplification reagent (Taqman Gene Expression Master Mix, (Applied Biosystems) 1 ⁇ L of primer probe set was added to prepare a PCR reaction solution. This 96-well plate was set in a real-time PCR apparatus (Applied Biosystems), heat-treated at 50 ° C. for 2 minutes and at 95 ° C. for 10 minutes, and then heated at 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute. The reaction was performed for 40 cycles, and the fluorescence intensity was measured over time.
  • Example 2 In Example 1, six types of molecules GSTp1, iNOS, CD44, EGFR, COX2, and Fzd1 in which the expression level was observed to increase specifically in ACF lesions were specifically reacted with each molecule. Each probe was prepared, and for each fluorescent probe, the reactivity between the surrounding normal tissue and the suspected ACF region in the same individual was compared. Specifically, the above-described fluorescent probe was sprayed on the excised tissue of a colon removed from a rat in which ACF was formed in the colon tissue by administration of azoxymethane (AOM), and the ACF site was confirmed under a stereomicroscope. Fluorescence observation was performed under a microscope. More details are given below. For GSTp1, a fluorescent probe that reacts with all isoforms of GSTp was used.
  • AOM azoxymethane
  • Fluorescent probes used are those described in Reference A (JACS 2008, vol. 130, p 14533-14543) or Reference B (WO 2007/149456 pamphlet), and commercially available antibodies that are fluorescently labeled. Was used.
  • FIG. 12A shows a fluorescent stained image of a GSTp-specific fluorescent probe described in Reference A
  • FIG. 12B shows a white observation image (transmitted light image) in the same field of view as FIG. Show.
  • the transmitted light image of FIG. 12 (B) the part other than the tissue piece was painted black by image processing.
  • the location shown with the arrow in FIG. 12 (A) and (B) shows the position of the pin which fixed the tissue piece.
  • the fluorescence stained image of the AOM rat in FIG. 12 (A) the enlarged images are shown together with the transmitted light image for two ACF sites (two regions that are strongly stained with the fluorescent probe).
  • FIG. 12A shows a fluorescent stained image of a GSTp-specific fluorescent probe described in Reference A
  • FIG. 12B shows a white observation image (transmitted light image) in the same field of view as FIG. Show.
  • the transmitted light image of FIG. 12 (B) the part other than the tissue piece was painted black by image processing.
  • FIG. 13 shows the result of analyzing the fluorescence intensity of the ACF site in the fluorescence stained image of the AOM rat of FIG. 12 and the fluorescence intensity of the normal tissue region having the same area as the ACF site by image analysis.
  • FIG. 14 shows a fluorescent staining image of the COX2-specific fluorescent probe described in Reference Document B.
  • FIG. 14A is a fluorescent stained image of an AOM rat
  • FIG. 14B is a fluorescent stained image of a normal rat.
  • an enlarged image of the ACF site region strongly stained with the fluorescent probe
  • FIG. 15 shows the result of analyzing the fluorescence intensity of the ACF site in the fluorescence stained image of the AOM rat of FIG. 14A and the fluorescence intensity of the normal tissue region having the same area as the ACF site by image analysis.
  • FIG. 16 shows an immunostained image of an AOM rat performed using a commercially available anti-GSTp antibody.
  • FIG. 16A is an HE-stained image
  • FIG. 16B is an immunostained image with an anti-GSTp antibody on a continuous section of the same tissue block as FIG. 16A.
  • a region that is relatively strongly stained and present in the center of the HE-stained image in FIG. 16A is the ACF region.
  • ACF can be detected with high accuracy by a molecular biological technique, so that it can be used not only in academic research but also in the field of clinical examination for colorectal cancer / colorectal adenoma diagnosis. Is possible.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Endoscopes (AREA)

Abstract

本発明は、大腸組織の被検領域を分子レベルで解析することによってＡＣＦを検出するための方法を提供する。すなわち、本発明は、ＡＣＦ（異常腺窩）を検出する方法であって、大腸組織の被検領域中のＧＳＴｐ、ｉＮＯＳ、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＣＯＸ２、及びＦｚｄ１からなる群より選択される１種以上のＡＣＦ特異的発現上昇分子を検出することを特徴とする、ＡＣＦ検出方法；前記被検領域の直径が、０．５ｍｍ以下であることを特徴とする前記記載のＡＣＦ検出方法；ＧＳＴｐ、ｉＮＯＳ、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＣＯＸ２、又はＦｚｄ１である、ＡＣＦ検出用マーカー；前記いずれかに記載のＡＣＦ検出方法を用いて、被検者の大腸組織の被検領域中のＡＣＦを検出した結果に基づき、当該被検者の結腸直腸癌及び結腸直腸腺腫のリスクを評価する方法に係る。

Description

ＡＣＦ検出方法
　本発明は、ＡＣＦ（異常腺窩）特異的に高発現している分子を指標として、ＡＣＦを検出する方法に関する。
　本願は、２０１０年６月３０日に日本国に出願された特願２０１０－１４８６４９号に基づく優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　結腸直腸癌は、日本における死亡原因第一位、米国においては癌による死亡原因の第二位である。米国では年間約１５万人に新たな結腸直腸癌が発見されており、年間５万人以上が死亡している（アメリカ癌協会による推定）。一方で、結腸直腸癌は、良性腫瘍から悪性腫瘍への進行に数十年かかる例も多いため、早期におけるリスク評価・発見は、良好な予後及び予防に貢献すると期待される。
　現在一般的に行われている結腸直腸腺腫・腫瘍スクリーニング検査方法として、便潜血検査、注腸Ｘ線造影検査、全大腸内視鏡検査、Ｓ状結腸内視鏡検査等が存在する。しかしながら、例えば便潜血検査の場合、腺腫や腫瘍以外の要因でも血液が検出されるケースがあるため、結腸直腸腺腫・腫瘍に対する特異性が高いとは言えず、早期検出を目的とした場合には擬陽性となりやすい。一方で注腸Ｘ線造影検査は、形態の大きな進行癌は検出することができるが、小さな病変は検出しにくいという欠点がある。
　また、内視鏡による検査は、直接病変部位を視認するため、検査結果の信頼性が高く、結腸直腸癌死亡率及び発生率の低下に貢献することが示されている。しかしながら、早期癌では病変部位が微小であるため、内視鏡による検査では検出が困難である、という問題がある。
　このように、結腸直腸癌リスクが高い群や早期結腸直腸癌を効果的に抽出する検出技術は依然として未熟であるため、ある程度病期が進行した段階で初めて診断される場合が多い。そこで、早期に、かつ低侵襲若しくは非侵襲に、結腸直腸癌のリスク評価・発見を行うことを可能にする、感度・特異度の高い検査方法が望まれている。
　結腸直腸癌を早期病変の段階から検出する方法として、核酸やタンパク質の解析技術を用いて分子レベルで解析する方法が注目されている。例えば、結腸直腸癌のリスク要因として、家族性ポリポーシス（ＦＡＰ）に代表されるような遺伝的背景があり、被験者の遺伝子を解析することによって結腸直腸癌のリスク評価を行うことができる。また近年では、ＦＡＰの様な特徴的な遺伝的背景を有する群と有さない群のいずれにおいても、年齢（５０歳以上）や肥満・飲酒・喫煙といった生活習慣因子が、将来の結腸直腸癌リスクを高めることが知られている。このため、将来の結腸直腸癌を予測する手法として、生活習慣に起因する分子異常（エピジェネティクス、発現異常）が注目されている。実際に、ＧＷＡＳ（ゲノムワイド関連解析）研究成果等から、結腸直腸癌との関わりが示唆される分子が多数見出されている。
　大腸における分子異常を捉える技術として、糞便や血液中の核酸解析技術が開発されてきている。しかしながら、微小病変由来の核酸は非常に微量であり、早期の分子異常を検出することは難しい。特に、大きさが１ｍｍ以下の微小病変内の変化が血液中に反映されることは、解析装置の感度の点から見ても困難である。また、糞便中には、多量の腸内細菌の他、病変以外の領域から剥離した上皮細胞も含まれているため、ノイズが多くなる。このため、糞便を検体として早期の結腸直腸癌・結腸直腸腺腫を検出するためには、癌化・腺腫化の早期に、正常組織よりも発現量が増大する優れた分子マーカーが必要である。このため、大腸における早期の分子異常を検出することによって、早期に結腸直腸癌リスクを評価する技術開発は、未だ実現していない。
　一方、異常腺窩（ＡＣＦ）は、発癌物質（アゾキシメタン）を投与したラットの大腸においてメチレンブルーに濃染される微小病変として、１９８７年にＢｉｒｄらにより報告された。ＡＣＦは、形態学的に検出できる最初の異常形態であり（例えば、非特許文献１参照。）、細胞増殖活性の亢進やＫ－ｒａｓ変異が認められたことから、結腸直腸癌や結腸直腸腺腫発症との関わりが示唆されている。ヒト大腸摘出標本においても、同様にメチレンブルーで濃染される病変が癌患者やポリープ患者において認められ、当該病変の数は健常人、ポリープ患者、癌患者の順に多くなることが報告されている（例えば、非特許文献２参照。）。これらの知見を受けて、結腸直腸癌予防研究の指標としてＡＣＦが用いられるケースが増えてきた。
　１ｍｍ以下の微小ＡＣＦは、通常の内視鏡検査により検出することは困難であり、一般的には、拡大内視鏡を用いて検出される。しかしながら、拡大内視鏡検査は作業に長時間を要することから、使用機会が限られており、早期の結腸直腸癌の一次スクリーニングに用いることは難しい。このように、微小ＡＣＦを顕微鏡・内視鏡的に検出し、結腸直腸癌リスクを評価する技術開発は実現していなかった。
　また、ＡＣＦを分子レベルで解析するために、有用なマーカー分子の探索が行われている。具体的には、ＡＣＦにおいて発現量が変動する分子として、ｃｙｃｌｉｎ　Ｄ１、ＣＯＸ２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ　２)、β　ｃａｔｅｎｉｎ (ｃａｔｅｎｉｎ, ｂｅｔａ１)、ｉＮＯＳ（ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　２，ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、及びＣＤ４４ (ＣＤ４４　ｍｏｌｅｃｕｌｅ)等が報告されている。但し、いずれも小規模試験からの報告であり、結腸直腸癌とは異なり、ＡＣＦ病変における分子変動についての大規模試験評価に関する報告は、未だなされていない。
　例えば、ＣＯＸ２先行研究（非特許文献３参照。）の例では、大腸全体のサンプルを用いて分子変動を解析しているため、ＡＣＦに対する特異性が低く、周辺組織と比較した場合のＡＣＦのみにおける分子変動が解析されていなかった。また、ｃｙｃｌｉｎＤ１先行研究（非特許文献４参照。）やｉＮＯＳ先行研究（非特許文献５参照。）、ＣＤ４４先行研究（非特許文献６参照。）では、免疫染色データのみの解析であるため、定量性や特異性に乏しく、医療応用されるまでに至っていない。さらにｉＮＯＳ先行研究（非特許文献７参照。）やＥＧＦＲ先行研究（非特許文献８参照。）では、５０ｃｒｙｐｔｓという比較的巨大なＡＣＦを解析対象としており、早期段階の微小ＡＣＦ分子変動の解析は行っていない。このように、ＡＣＦのマーカー分子として使用できる可能性が示唆されている分子は幾つか知られているものの、いずれも臨床的に利用可能な程度に信頼できるものではない。
　つまり、１ｍｍ以下の微小ＡＣＦに代表される微小病変段階（すなわち、早期）において、発現量が変動する分子を解析し、将来の結腸直腸癌リスクを分子生物学に捉えて、簡便に評価することは、未だ実現できていなかった。
特開２００７－２２９０５４号公報
ケロフ（Kelloff）、他３９名、２００６年、クリニカル・キャンサー・リサーチ（Clinical Cancer Research）、第１２巻第１２号、第３６６１～３６９７ページ。 タカヤマ（Takayama）、他９名、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（The New England Journal of Medicine）、１９９８年、第３３９巻第１８号、第１２７７～１２８４ページ。 フィケラ（Fichera）、他１２名、ジャーナル・オブ・サージカル・リサーチ（Journal of Surgical Research）、２００７年、第１４２巻、第２３９～２４５ページ。 ポールセン（Paulsen）、他５名、キャンサー・リサーチ（Cancer Research）、２００５年、第６５巻、第１２１～１２９ページ。 ク（Xu）、他３名、ワールド・ジャーナル・ガストロエンテロロジー（World Journal of Gastroenterology）、２００３年、第９巻第６号、第１２４６～１２５０ページ。 ブーン（Boon）、他４名、キャンサー・リサーチ（Cancer Research）、２００２年、第６２巻、第５１２６～５１２８ページ。 タカハシ（Carcinogenesis）、他４名、カルシノジェネシス（）、２０００年、第２１巻第７号、第１３１９～１３２７ページ。 コーヘン（Cohen）、他１９名、キャンサー・リサーチ（Cancer Research）、２００６年、第６６巻、第５１２６～５１２８ページ。
　本発明は、大腸組織の被検領域を分子レベルで解析することによってＡＣＦを検出するための方法を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＧＳＴｐ、ｉＮＯＳ、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＣＯＸ２、及びＦｚｄ１が、大きさが１ｍｍ以下の微小なＡＣＦにおいて、正常組織よりも発現量が増大していることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、
（１）　ＡＣＦ（異常腺窩）を検出する方法であって、
大腸組織の被検領域中のＧＳＴｐ、ｉＮＯＳ、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＣＯＸ２、及びＦｚｄ１からなる群より選択される１種以上のＡＣＦ特異的発現上昇分子を検出することを特徴とする、ＡＣＦ検出方法、
（２）　前記被検領域の直径が、０．５ｍｍ以下であることを特徴とする前記（１）に記載のＡＣＦ検出方法、
（３）　前記被検領域が、ＡＣＦであることが疑われる領域を含むことを特徴とする前記（１）又は（２）に記載のＡＣＦ検出方法、
（４）　前記被検領域中の前記ＡＣＦ特異的発現上昇分子の量と、前記被検領域と同一の大腸組織内の正常組織領域中の当該ＡＣＦ特異的発現上昇分子の量とを比較することを特徴とする前記（３）に記載のＡＣＦ検出方法、
（５）　前記被検領域が、生体から採取された検体であることを特徴とする前記（１）～（４）のいずれか一つに記載のＡＣＦ検出方法、
（６）　前記ＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出を、生体内で行うことを特徴とする前記（１）～（４）のいずれか一つに記載のＡＣＦ検出方法、
（７）　前記ＡＣＦ特異的発現上昇分子を蛍光標識することにより検出することを特徴とする前記（１）～（６）のいずれか一つに記載のＡＣＦ検出方法、
（８）　前記ＡＣＦ特異的発現上昇分子がｍＲＮＡ又はタンパク質であることを特徴とする前記（１）～（７）のいずれか一つに記載のＡＣＦ検出方法、
（９）　ＧＳＴｐ、ｉＮＯＳ、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＣＯＸ２、又はＦｚｄ１である、ＡＣＦ検出用マーカー、
（１０）　前記（１）～（８）のいずれか一つに記載のＡＣＦ検出方法を用いて、被検者の大腸組織の被検領域中のＡＣＦを検出した結果に基づき、当該被検者の結腸直腸癌及び結腸直腸腺腫のリスクを評価する方法、
を提供する。
　本発明のＡＣＦ検出方法により、ＡＣＦを分子生物学的な手法を用いて検出することができる。特に、本発明のＡＣＦ検出方法は、１ｍｍ以下の微小ＡＣＦをも精度よく検出することができる。
　ＡＣＦは結腸直腸癌や結腸直腸腺腫の指標とされるから、本発明のＡＣＦ検出方法は、結腸直腸癌や結腸直腸腺腫の早期検出や、発症リスク評価等にも有用である。
実施例１において、各ラット個体のコントロールサンプル（周辺正常組織のサンプル）及びＡＣＦサンプル（ＡＣＦ部位のサンプル）におけるＧＳＴｐの発現量相対値を示した図である。 実施例１において、各ラット個体のコントロールサンプル及びＡＣＦサンプルにおけるｉＮＯＳの発現量相対値を示した図である。 実施例１において、各ラット個体のコントロールサンプル及びＡＣＦサンプルにおけるＥＧＦＲの発現量相対値を示した図である。 実施例１において、各ラット個体のコントロールサンプル及びＡＣＦサンプルにおけるＣＤ４４の発現量相対値を示した図である。 実施例１において、各ラット個体のコントロールサンプル及びＡＣＦサンプルにおけるＦｚｄ１の発現量相対値を示した図である。 実施例１において、各ラット個体のコントロールサンプル及びＡＣＦサンプルにおけるＣｄｈ１の発現量相対値を示した図である。 実施例１において、各ラット個体のコントロールサンプル及びＡＣＦサンプルにおけるＣｔｓｂの発現量相対値を示した図である。 実施例１において、各ラット個体のコントロールサンプル及びＡＣＦサンプルにおけるＰＣＮＡの発現量相対値を示した図である。 実施例１において、各ラット個体のコントロールサンプル及びＡＣＦサンプルにおけるＣｔｎｎｂの発現量相対値を示した図である。 実施例１において、各ラット個体のコントロールサンプル及びＡＣＦサンプルにおけるＭｅｔの発現量相対値を示した図である。 実施例１において、各ラット個体のコントロールサンプル及びＡＣＦサンプルにおけるＣＯＸ２の発現量相対値を示した図である。 実施例２において、ＡＯＭラットのＧＳＴｐ特異的蛍光プローブの蛍光染色画像を示した図である。 実施例２において、図１２のＡＯＭラットの蛍光染色画像中のＡＣＦ部位の蛍光強度、及び該ＡＣＦ部位と同じ面積の正常組織領域の蛍光強度の解析結果を示した図である。 実施例２において、ＡＯＭラット及び正常ラットのＣＯＸ２特異的蛍光プローブの蛍光染色画像を示した図である。 実施例２において、図１４のＡＯＭラットの蛍光染色画像中のＡＣＦ部位の蛍光強度、及び該ＡＣＦ部位と同じ面積の正常組織領域の蛍光強度の解析結果を示した図である。 実施例２において、蛍光標識抗ＧＳＴｐ抗体を用いて行ったＡＯＭラットの免疫染色画像を示した図である。
　本発明及び本願明細書において、ＡＣＦ特異的発現上昇分子とは、同一個体中の大腸組織において、周辺の正常組織よりもＡＣＦにおいて、遺伝子発現レベルが上昇している分子を意味する。
　また、本発明及び本願明細書において、大腸とは、盲腸、結腸、直腸、及び肛門管を含む領域を示し、大腸組織とは、大腸粘膜及び大腸上皮を含む組織を示す。
　本発明及び本願明細書において、領域の直径とは、当該領域が円形又は楕円形である場合には、直径（楕円形の場合は長径）を示し、当該領域が円形又は楕円形以外である場合には、当該領域を円形に近似させた場合の近似円の直径、又は当該領域を楕円形に近似させた場合の近似楕円の長径を意味する。
　本発明のＡＣＦ検出方法は、大腸組織の被検領域中のＧＳＴｐ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｐｉ）、ｉＮＯＳ（ＮＯＳ２）、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＣＯＸ２、及びＦｚｄ１（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ　ｈｏｍｏｌｏｇ　１）からなる群より選択される１種以上のＡＣＦ特異的発現上昇分子を検出することを特徴とする。ＧＳＴｐは複数のアイソフォームが存在する場合があるが、大腸組織において発現しているアイソフォームであればよく、１種類のアイソフォームのみを検出してもよく、複数のアイソフォームを検出してもよい。これらの６種類のＡＣＦ特異的発現上昇分子は、いずれも大きさが１ｍｍ以下である微小ＡＣＦにおいて、周辺正常組織よりも発現量が増大している分子である。このため、これらの６種類のＡＣＦ特異的発現上昇分子は、いずれもＡＣＦ検出、特に微小ＡＣＦ検出のための臨床上有用なマーカー分子であり、これらのＡＣＦ特異的発現上昇分子の発現量を指標とすることにより、比較的大きなＡＣＦ（すなわち、形態異常が進行したＡＣＦ）のみならず、早期の微小なＡＣＦをも精度よく検出することができる。
　本発明のＡＣＦ検出方法においては、前記６種類のＡＣＦ特異的発現上昇分子の少なくとも１種類の分子を検出すればよく、一の被検領域に対して２種類以上の分子を検出してもよい。
　ＡＣＦ特異的発現上昇分子の発現量を検出する被検領域は、大腸組織中の領域であれば特に限定されるものではないが、ＡＣＦであることが疑われる領域（被疑ＡＣＦ領域）を含む領域であることが好ましい。被疑ＡＣＦ領域としては、例えば、大腸組織中のメチレンブルーによって濃染された領域がある。メチレンブルー染色では、ＡＣＦ以外の領域も染色されてしまうが、本発明のＡＣＦ検出方法では、ＡＣＦ特異的発現上昇分子の発現量を指標とすることにより、メチレンブルー染色よりも精度よくＡＣＦを検出することができる。被疑ＡＣＦ領域としては、その他、内視鏡観察、顕微鏡観察や画像解析等により形態異常が観察されている領域等が挙げられる。
　本発明において検出対象とされる６種類のＡＣＦ特異的発現上昇分子は、いずれも微小ＡＣＦにおいても正常組織よりも遺伝子発現レベルが上昇している分子である。このため、本発明において、直径が１ｍｍ以下の被疑ＡＣＦ領域を含む領域を被検領域とすることにより、微小ＡＣＦを検出することができる。
　本発明のＡＣＦ検出方法における被検領域の大きさは、特に限定されるものではなく、例えば、被疑ＡＣＦ領域の大きさ等を考慮して適宜決定することができるが、被検領域に占める被疑ＡＣＦ領域の割合が高いほうが好ましい。被検領域に占める正常組織領域の割合が高すぎる場合には、当該被疑ＡＣＦ領域が実際にＡＣＦであった場合でも、当該被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子量と正常組織中のＡＣＦ特異的発現上昇分子量との差が検出し難くなる。例えば、直径が１ｍｍ以下の被疑ＡＣＦ領域を含める場合、被検領域の直径は１ｍｍ以下であることが好ましく、１ｍｍ未満であることがより好ましく、０．５ｍｍ以下であることがさらに好ましい。
　本発明のＡＣＦ検出方法において検出されるＡＣＦ特異的発現上昇分子は、遺伝子発現量を反映する分子であればよく、ｍＲＮＡであってもよく、タンパク質であってもよい。すなわち、本発明のＡＣＦ検出方法は、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子の情報を、ＲＮＡレベルやタンパク質レベルで取得することにより、当該被検領域のＡＣＦを検出することができる。
　各ＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出方法は、検出結果が被検領域中の各分子の量や濃度に依存する方法であればよく、検体中のｍＲＮＡやタンパク質の検出に用いられる公知の方法の中から、適宜選択して用いることができる。中でも、発現解析において用いられている方法で行うことが好ましい。各方法は常法により行うことができる。
　被検領域中にＡＣＦが含まれている場合には、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子の量は、大腸組織内の正常組織中よりも多くなる。このため、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子の量と、大腸組織内の正常組織中のＡＣＦ特異的発現上昇分子の量とを比較することにより、被検領域中のＡＣＦを検出することができる。すなわち、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子の量が正常組織中よりも多い場合には、当該被検領域中にＡＣＦが含まれており、正常組織中とほぼ同等又はそれ以下である場合には、当該被検領域中にはＡＣＦが含まれていないと判断することができる。被検領域と正常組織領域とにおけるＡＣＦ特異的発現上昇分子の量の比較は、各領域の単位表面面積又は単位体積当たりで行ってもよく、各領域に含まれている単位核酸量又は単位タンパク質量当たりで行ってもよい。
　本発明においては、同一個体の大腸組織において、被検領域とその周辺の正常組織とを比較することが好ましい。各ＡＣＦ特異的発現上昇分子の発現量は個体差があるが、同一個体中で比較することにより、個体差による影響を抑えることができる。
　用いる検出方法の種類や感度によっては、正常組織ではＡＣＦ特異的発現上昇分子は検出されず、ＡＣＦにおいてのみ検出される場合がある。この場合には、被検領域において当該ＡＣＦ特異的発現上昇分子が検出された場合には、当該被検領域中にＡＣＦが含まれており、当該ＡＣＦ特異的発現上昇分子が検出されなかった場合には、当該被検領域中にはＡＣＦは含まれていない、と判断される。
　ＡＣＦ特異的発現上昇分子がＲＮＡである場合、各ＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出方法としては、各分子に特異的なプライマーを用いた核酸増幅反応を利用した方法や、各分子に特異的なプローブを用いたハイブリダイゼーションを利用した方法等が挙げられる。核酸増幅反応を利用した方法としては、例えば、被検領域に含まれているＲＮＡから逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後、得られたｃＤＮＡを鋳型としてＲＴ－ＰＣＲ等の核酸増幅反応を行うことによって、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子を検出し、若しくは正常組織領域中の量と比較可能な程度に定量的に測定する方法が挙げられる。被検領域からのＲＮＡの抽出、逆転写反応、ＲＴ－ＰＣＲ等の核酸増幅反応は、当該技術分野において公知の手法の中から、適宜選択して行うことができる。
　核酸増幅反応を利用した方法においては、蛍光性インターカレーターや、蛍光物質により標識されたプライマー等を用いることにより、増幅されたＡＣＦ特異的発現上昇分子を蛍光標識し、定量的に検出することができる。一方、ハイブリダイゼーションを利用した方法においては、蛍光物質により標識されたプローブや、ハイブリダイズした場合に初めて蛍光を発するように修飾されたプローブを用いることにより、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子を蛍光標識し、定量的に検出することができる。
　ＡＣＦ特異的発現上昇分子がタンパク質である場合、各ＡＣＦ特異的発現上昇分子は、例えば、各分子を特異的に認識する抗体（特異的抗体）を用いた免疫学的手法により検出することができる。具体的には、標識物質により標識した各分子の特異的抗体を、被検領域中の当該分子に結合させた後、当該標識物質からのシグナルを測定することにより、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子を蛍光標識し、定量的に検出することができる。標識物質による標識は、各分子の特異的抗体に直接標識物質を結合させてもよく、当該特異的抗体に特異的に結合する二次抗体に結合させてもよい。標識物質としては、抗原抗体反応や、２分子の結合の有無を検出する際に一般的に用いられている標識物質の中から適宜選択して用いることができる。このような標識物質としては、例えば、蛍光物質、磁性体、放射性同位体等が挙げられる。高感度であり、かつ安全性が高い点から、蛍光物質を標識物質として用いることが好ましい。抗原抗体反応は、常法により行うことができる。免疫学的手法以外には、例えば、ＡＣＦ特異的発現上昇分子の活性を示す特異的なプローブを用い、当該プローブを検出することによっても、タンパク質であるＡＣＦ特異的発現上昇分を検出することができる。
　ＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出は、生体から採取された検体に対して行うことができる。例えば、生体の大腸組織の部分領域を外科的に切除して採取された大腸組織切除サンプルから、顕微鏡下で被疑ＡＣＦ領域を含む被検領域のサンプルを採取することができる。この際、必要に応じて、同一の大腸組織切除サンプルから、正常組織領域、好ましくは被検領域の周辺の正常組織のサンプルを採取する。また、予め生体の大腸組織をメチレンブルー染色し、濃染された領域を含む被検領域を外科的に切除することにより、生体から直接被検領域のサンプル（バイオプシーサンプル）を採取することができる。大腸組織切除サンプルの場合と同様に、被検領域の周辺の正常組織のサンプルも、生体から採取することができる。このようにして採取された被検領域や正常組織領域のサンプルを、ＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出に供する。生体内の大腸組織のメチレンブルー染色は、常法により行うことができる。
　ＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出は、生体内で行うこともできる。例えば、ＡＣＦ特異的発現上昇分子に特異的な標識済みプローブや、直接又は間接的に標識したＡＣＦ特異的発現上昇分子の特異的抗体、ＡＣＦ特異的発現上昇分子の活性を示す特異的な標識済みプローブを、生体の大腸内の被検領域を含む領域に塗布又は噴霧し、当該プローブ又は特異的抗体をＡＣＦ特異的発現上昇分子に結合させてＡＣＦ特異的発現上昇分子を標識した後に当該標識を検出することにより、ＡＣＦ特異的発現上昇分子を検出することができる。
　生体内においてＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出を行う場合には、ＡＣＦ特異的発現上昇分子を蛍光標識して検出することが好ましい。具体的には、まず、蛍光物質で標識されたプローブや特異的抗体を用いて被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子を蛍光標識する。その後、分光検出を可能とする内視鏡や消化管ビデオスコープを用いて当該標識から発される蛍光を光学的に検出し、蛍光画像を得る。得られた蛍光画像を解析することにより、ＡＣＦ特異的発現上昇分子を高感度かつ定量的に検出することができる。
　生体内におけるＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出は、蛍光内視鏡を用いることにより、より簡便かつ効率よく行うことができる。より具体的には、例えば、生体の体腔内に少なくとも一部が入れられ、該体腔内の撮影対象の画像を取得する内視鏡システムであって、前記撮影対象内部の特定の物質と結合若しくは反応する感受性蛍光薬剤又は当該撮影対象内部に蓄積される蛍光薬剤を前記撮影対象に向けて吐出する薬剤吐出手段と、該薬剤吐出手段を制御する吐出制御手段と、前記蛍光薬剤を励起させるための励起光および該励起光とは異なる分光特性の照射光を発する光源部と、該光源部からの前記励起光および照射光を前記撮影対象に向けて伝播する光学系と、前記体腔内に入れられる部位に設けられるとともに、前記励起光によって前記撮影対象から放射される蛍光および前記照射光によって前記撮影対象から放射される当該蛍光とは異なる波長帯域の光とを撮影可能な撮像手段とを備える内視鏡システムを用いて行うことができる（特開２００７－２２９０５４号公報参照。）。蛍光薬剤として、蛍光物質で標識されたＡＣＦ特異的発現上昇分子に特異的なプローブや特異的抗体を用いればよい。
　本発明のＡＣＦ検出方法において、ＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出に供される試料は、動物の大腸由来であればよく、魚類、鳥類、爬虫類、及び哺乳類のいずれの動物由来の試料であってもよい。本発明においては、哺乳類由来の試料であることが好ましい。例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等のげっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、サル等のヒト以外の動物であってもよく、ヒトであってもよい。
　被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子の量が正常組織中の量よりも多いかどうかという情報は、被検領域中にＡＣＦが存在しているか否かを判断する際に有用である。よって、本発明のＡＣＦ検出方法により得られた検出結果は、ＡＣＦ診断のために提供される情報として有用である。
　また、本発明における６種類のＡＣＦ特異的発現上昇分子の発現レベルの上昇はＡＣＦの存在を示しており、かつ、ＡＣＦは将来結腸直腸癌へと進行する可能性が高いことから、本発明のＡＣＦ検出方法により得られた検出結果は、結腸直腸癌の存在リスクの判断や、将来の結腸直腸癌発症リスクを早期に、低侵襲に評価する際に、非常に有効な情報である。例えば、本発明のＡＣＦ検出方法により、被検者の大腸組織において、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子の量が周辺の正常組織領域中よりも多く、当該被検領域にＡＣＦが検出された場合には、当該被験者が将来結腸直腸癌及び結腸直腸腺腫を発症するリスクが高いと評価することができる。逆に、被検領域中のＡＣＦ特異的発現上昇分子の量が周辺の正常組織領域中と同等若しくは少なく、当該被検領域にＡＣＦが検出されなかった場合には、当該被験者が将来結腸直腸癌及び結腸直腸腺腫を発症するリスクが低いと評価することができる。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　ＧＳＴｐ１、ｉＮＯＳ（ＮＯＳ２）、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、Ｆｚｄ１、Ｃｄｈ１（Ｃａｄｈｅｒｉｎ　１）、Ｃｔｓｂ（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ　Ｂ）、ＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ　ｃｅｌｌ　ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｔｉｇｅｎ）、Ｃｔｎｎｂ１（Ｃａｔｅｎｉｎ　ｂｅｔａ）、Ｍｅｔ（ｍｅｔ　ｐｒｏｔｏ－ｏｎｃｏｇｅｎｅ）、及びＣＯＸ２の全１１種類の候補分子に対して、同一個体中の周辺正常組織と被疑ＡＣＦ領域とにおける遺伝子発現レベルを比較し、これらの候補分子群のうちＡＣＦ特異的に遺伝子発現レベルが上昇している分子を同定した。
　具体的には、アゾキシメタン（ＡＯＭ）投与により大腸組織内にＡＣＦを形成させたラットから採取された大腸組織切除サンプルから、顕微鏡下でＡＣＦ部位であることを確認した領域のみを採取したサンプルと、その周辺の正常組織領域のみを採取したサンプルとをそれぞれ調製し、各サンプル中の各分子の発現量を測定し、比較した。より詳細に、下記に示す。
　５匹のＦ３４４／Ｎラット（雄、４週齢）を１週間の馴化後、ＡＯＭ皮下投与（１５ｍｇ／ｋｇ）を週１回、３週に渡り実施した。最終投与から１１週～１４週にかけて、それぞれのラットから大腸を摘出し、ＡＣＦのサンプリングを実施した。具体的には、摘出したラット大腸を冷ＰＢＳで洗浄して内容物を除去し、縦方向に開いた後、６０％メタノール／１０％酢酸を用いて固定した。固定後、大腸粘膜表層を０．２％メチレンブルーで染色した。染色されたラット大腸から、顕微鏡下でＡＣＦ部位であることが確認された部位を含む領域をＡＣＦサンプルとして採取した。この際、大きさが１ｍｍ以下の微小ＡＣＦを選択して採取した。同時にコントロールサンプルとして周辺の正常組織を採取した。２匹のラット（ラット１及び２）からは市販されている最小サイズの生検器具（直径１ｍｍ）を用いて、残る３匹のラット（ラットＡ～Ｃ）からは自作した直径０．５ｍｍ未満の生検器具を用いて、ＡＣＦサンプル及びコントロールサンプルの採取を行った。
　得られたＡＣＦサンプル及びコントロールサンプルから、ＰＡＸｇｅｎｅ　Ｔｉｓｓｕｅ　ＲＮＡ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を用いて品質確認を行った。ＲＩＮ７以上のＲＮＡ（５ｎｇ）を添加した反応溶液（最終容量２０μＬ）中で、３７℃で６０分間のＲＴ反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。前増幅反応として、得られたｃＤＮＡを鋳型とし、各候補分子を増幅するためのプライマーセットを用いて、サイクル数の少ない前増幅反応を行った。プライマーセットは、表１に記載の市販のもの（アプライドバイオシステムス社製）をそれぞれ用いた。具体的には、１０μＬのＲＴ反応後の反応溶液と、事前に各プライマーセットを混合した溶液１２．５μＬ、２５μＬの核酸増幅試薬（Ｔａｑｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、アプライドバイオシステムズ社製）、２．５μＬの超純水をそれぞれ添加して、最終容量５０μＬの反応溶液を調製した。各反応溶液をＰＣＲ装置（エッペンドルフ社製）にセットし、９５℃で１０分間の熱処理を行った後、９５℃で１５秒間、６０℃で４分間の熱反応を１４サイクル行った。反応後、反応液を２０倍に希釈したものを、リアルタイムＰＣＲサンプルとして供した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　前増幅を行ったｃＤＮＡを鋳型として、リアルタイムＰＣＲを実施し、各候補分子の発現産物（ｍＲＮＡ）の検出を行った。具体的には、０．２ｍＬの９６ウェルプレートに、前増幅反応後の各ｃＤＮＡを５μＬずつ分注した後、各ウェルに４μＬの超純水と１０μＬの核酸増幅試薬（Ｔａｑｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、アプライドバイオシステムズ社製）、１μＬのプライマープローブセットを添加し、ＰＣＲ反応溶液を調整した。この９６ウェルプレートをリアルタイムＰＣＲ装置（アプライドバイオシステムズ社製）にセットし、５０℃で２分間、９５℃で１０分間の熱処理を行った後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間の熱反応を４０サイクル行い、経時的に蛍光強度を測定した。
　蛍光強度の計測結果を分析し、各サンプルから回収されたＲＮＡ中の候補分子の遺伝子発現量を算出した。コントロールサンプルにおける遺伝子発現量を１とし、同一個体から採取されたＡＣＦサンプルにおける遺伝子発現量の相対値を算出した。候補分子ごとの算出結果を図１～１１にそれぞれ示す。各図中、（Ａ）は自作した直径０．５ｍｍ未満の生検器具を用いてサンプリングしたものの結果であり、（Ｂ）は市販の直径１ｍｍの生検器具を用いてサンプリングしたものの結果である。また、各図中、「Ｘ－ｃｏｎ」はラットＸのコントロールサンプルの結果であり、「Ｘ－ＡＣＦ」はラットＸのＡＣＦサンプルの結果である。また、ＡＣＦサンプルの発現量相対値が１．３以上を示したサンプルを「＊」で示した。
　この結果、同一個体中の周辺正常組織における発現量とＡＣＦにおける発現量とを比較したところ、直径０．５ｍｍ未満の生検器具を用いてサンプリングした場合には、ＧＳＴｐ１、ｉＮＯＳ、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＣＯＸ２、及びＦｚｄ１の６種類の分子では、ラット３個体全てにおいて、ＡＣＦ病変（ＡＣＦサンプル）では、周辺正常組織（コントロールサンプル）と比較し、発現量が増大していた。つまり、これらの６種類の分子は、ＡＣＦ特異的に遺伝子発現レベルが上昇していることが分かった。
　一方で、直径１ｍｍの生検器具を用いてサンプリングした場合には、ＡＣＦ病変と周辺正常組織において、遺伝子発現量に差が認められなかった。これらの結果から、１ｍｍ以下の微小ＡＣＦを検出する場合には、従来法より小さな、直径０．５ｍｍ未満の生検器具を用いてサンプルを採取した場合においてのみ、ＡＣＦ特異的な遺伝子発現解析が可能となることが示唆された。
［実施例２］
　実施例１において、ＡＣＦ病変特異的に発現量が増大していることが観察されたＧＳＴｐ１、ｉＮＯＳ、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＣＯＸ２、及びＦｚｄ１の６種類の分子について、各分子に特異的に反応する蛍光プローブをそれぞれ作製し、各蛍光プローブについて、同一個体中の周辺正常組織と被疑ＡＣＦ領域とにおける反応性を比較した。
　具体的には、アゾキシメタン（ＡＯＭ）投与により大腸組織内にＡＣＦを形成させたラットから摘出された大腸切除組織に、上述した蛍光プローブを散布し、実体顕微鏡下でＡＣＦ部位を確認すると共に、蛍光顕微鏡下で蛍光観察を行った。より詳細に、下記に示す。なお、ＧＳＴｐ１については、ＧＳＴｐの全てのアイソフォームに反応する蛍光プローブを用いた。
　５匹のＦ３４４／Ｎラット（雄、４週齢）を１週間の馴化後、ＡＯＭ皮下投与（１５ｍｇ／ｋｇ）を週１回、３週に渡り実施した。最終投与から７週～１０週にかけて、それぞれのラットから大腸を摘出し、蛍光プローブ評価を実施した。具体的には、摘出したラット大腸を冷ＰＢＳで洗浄して内容物を除去し、縦方向に開いた後、各分子特異的に反応する蛍光プローブを散布した。染色されたラット大腸を蛍光顕微鏡下で観察し、被疑ＡＣＦ領域における反応（蛍光強度）を確認すると共に、実体顕微鏡下で同領域のＡＣＦ病変を確認した。同時に、ＰＢＳを皮下投与したコントロール群についても同様の観察を実施した。使用した蛍光プローブは、参考文献Ａ（ＪＡＣＳ ２００８,ｖｏｌ.１３０,ｐ１４５３３～１４５４３）又は参考文献Ｂ（ＷＯ２００７／１４９４５６号パンフレット）に記載されているものの他、市販されている抗体を蛍光ラベルしたものを用いた。
　蛍光染色画像及び蛍光強度解析の結果を図１２～１５に示す。図１２（Ａ）は、参考文献Ａに記載されているＧＳＴｐ特異的蛍光プローブの蛍光染色画像を、図１２（Ｂ）は図１２（Ａ）と同一視野の白色観察像（透過光画像）を示す。図１２（Ｂ）の透過光画像は、組織片以外の部位を、画像処理により黒塗りした。また、図１２（Ａ）及び（Ｂ）中、矢印で示した箇所は、組織片を固定したピンの位置を示す。図１２（Ａ）のＡＯＭラットの蛍光染色画像中、２つのＡＣＦ部位（蛍光プローブで強く染色されている２領域）については、拡大画像を透過光画像とともに示した。図１３は、図１２のＡＯＭラットの蛍光染色画像中のＡＣＦ部位の蛍光強度と、該ＡＣＦ部位と同じ面積の正常組織領域の蛍光強度とを、画像解析により解析した結果を示す。図１４は、参考文献Ｂに記載されているＣＯＸ２特異的蛍光プローブの蛍光染色画像を示す。図１４（Ａ）はＡＯＭラットの蛍光染色画像であり、図１４（Ｂ）は正常ラットの蛍光染色画像である。図１４（Ａ）のＡＯＭラットの蛍光染色画像中、ＡＣＦ部位（蛍光プローブで強く染色されている領域）の拡大画像も示した。図１５は、図１４（Ａ）のＡＯＭラットの蛍光染色画像中のＡＣＦ部位の蛍光強度と、該ＡＣＦ部位と同じ面積の正常組織領域の蛍光強度とを、画像解析により解析した結果を示す。さらに、図１６に、市販されている抗ＧＳＴｐ抗体を用いて行ったＡＯＭラットの免疫染色画像を示す。図１６（Ａ）はＨＥ染色画像であり、図１６（Ｂ）は、図１６（Ａ）と同組織ブロックの連続切片に対して抗ＧＳＴｐ抗体による免疫染色画像である。図１６（Ａ）のＨＥ染色画像の中心に存在する比較的強く染色されている領域がＡＣＦ部位である。
　この結果、同一個体中のＡＣＦ部位における蛍光強度は、周辺正常組織における蛍光強度に比べ、相対値が１．４以上と明らかに高いことが観察された（図１３、１５）。また、正常ラット（コントロール群）においては、ＡＯＭラットで認められたようなシグナル部位は認められなかった（図１４）。さらにＡＯＭラットにおいてＨＥ染色により確認されたＡＣＦ部位のタンパク発現を免疫染色で確かめたところ、周辺正常部位と比較して強く染色されていることが確認された（図１６）。これらの結果から、ＡＣＦ部位において、周辺正常部位よりもＧＳＴｐがより多く発現していることが明らかである。
　本発明のＡＣＦ検出方法により、ＡＣＦを分子生物学的手法により精度よく検出することができるため、学術研究のみならず、結腸直腸癌・結腸直腸腺腫診断のための臨床検査等の分野において利用が可能である。
 

Claims (10)

  1. 　ＡＣＦ（異常腺窩）を検出する方法であって、
    大腸組織の被検領域中のＧＳＴｐ、ｉＮＯＳ、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＣＯＸ２、及びＦｚｄ１からなる群より選択される１種以上のＡＣＦ特異的発現上昇分子を検出することを特徴とする、ＡＣＦ検出方法。
  2. 　前記被検領域の直径が、０．５ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載のＡＣＦ検出方法。
  3. 　前記被検領域が、ＡＣＦであることが疑われる領域を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のＡＣＦ検出方法。
  4. 　前記被検領域中の前記ＡＣＦ特異的発現上昇分子の量と、前記被検領域と同一の大腸組織内の正常組織領域中の当該ＡＣＦ特異的発現上昇分子の量とを比較することを特徴とする請求項３に記載のＡＣＦ検出方法。
  5. 　前記被検領域が、生体から採取された検体であることを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載のＡＣＦ検出方法。
  6. 　前記ＡＣＦ特異的発現上昇分子の検出を、生体内で行うことを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載のＡＣＦ検出方法。
  7. 　前記ＡＣＦ特異的発現上昇分子を蛍光標識することにより検出することを特徴とする請求項１～６のいずれか一項に記載のＡＣＦ検出方法。
  8. 　前記ＡＣＦ特異的発現上昇分子がｍＲＮＡ又はタンパク質であることを特徴とする請求項１～７のいずれか一項に記載のＡＣＦ検出方法。
  9. 　ＧＳＴｐ、ｉＮＯＳ、ＣＤ４４、ＥＧＦＲ、ＣＯＸ２、又はＦｚｄ１である、ＡＣＦ検出用マーカー。
  10. 　請求項１～８のいずれか一項に記載のＡＣＦ検出方法を用いて、被検者の大腸組織の被検領域中のＡＣＦを検出した結果に基づき、当該被検者の結腸直腸癌及び結腸直腸腺腫のリスクを評価する方法。 
PCT/JP2011/064997 2010-06-30 2011-06-30 Ａｃｆ検出方法 WO2012002472A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11800934.9A EP2589666A4 (en) 2010-06-30 2011-06-30 ACF DETECTION METHOD
CN2011800317868A CN102985564A (zh) 2010-06-30 2011-06-30 Acf检测方法
JP2012522682A JPWO2012002472A1 (ja) 2010-06-30 2011-06-30 Ａｃｆ検出方法
US13/720,688 US20130130256A1 (en) 2010-06-30 2012-12-19 Acf detection method

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-148649 2010-06-30
JP2010148649 2010-06-30

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/720,688 Continuation US20130130256A1 (en) 2010-06-30 2012-12-19 Acf detection method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012002472A1 true WO2012002472A1 (ja) 2012-01-05

Family

ID=45402175

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/064997 WO2012002472A1 (ja) 2010-06-30 2011-06-30 Ａｃｆ検出方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20130130256A1 (ja)
EP (1) EP2589666A4 (ja)
JP (1) JPWO2012002472A1 (ja)
CN (1) CN102985564A (ja)
WO (1) WO2012002472A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013099848A1 (ja) * 2011-12-27 2013-07-04 オリンパス株式会社 Ａｃｆ検出方法
WO2013099865A1 (ja) * 2011-12-27 2013-07-04 オリンパス株式会社 Ａｃｆ検出方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015028974A2 (en) * 2013-08-30 2015-03-05 Nestec S.A. Polyp recurrence
CN116004821A (zh) 2014-08-15 2023-04-25 深圳市晋百慧生物有限公司 用于检测肠癌的标记物及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007229054A (ja) 2006-02-28 2007-09-13 Olympus Corp 内視鏡システム
WO2007149456A2 (en) 2006-06-19 2007-12-27 Vanderbilt University Methods and compositions for diagnostic and therapeutic targeting of cox-2
JP2010148649A (ja) 2008-12-25 2010-07-08 Olympia:Kk 弾球遊技機

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007229054A (ja) 2006-02-28 2007-09-13 Olympus Corp 内視鏡システム
WO2007149456A2 (en) 2006-06-19 2007-12-27 Vanderbilt University Methods and compositions for diagnostic and therapeutic targeting of cox-2
JP2010148649A (ja) 2008-12-25 2010-07-08 Olympia:Kk 弾球遊技機

Non-Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOON ET AL., CANCER RESEARCH, vol. 62, 2002, pages 5126 - 5128
COHEN ET AL., CANCER RESEARCH, vol. 66, 2006, pages 5126 - 5128
DUYEN T. DANG ET AL.: "Glutathione S-Transferase n1 Promotes Tumorigenicity in HCT116 Human Colon Cancer Cells", CANCER RES, vol. 65, 2005, pages 9485 - 9494, XP055072984 *
FICHERA ET AL., JOURNAL OF SURGICAL RESEARCH, vol. 142, 2007, pages 239 - 245
GREG COHEN ET AL.: "Epidermal Growth Factor Receptor Signaling Is Up-regulated in Human Colonic Aberrant Crypt Foci", CANCER RES, vol. 66, 2006, pages 5656 - 5664, XP055072989 *
JACS, vol. 130, 2008, pages 14533 - 14543
JURRIT ZEILSTRA ET AL.: "Deletion of the WNT Target and Cancer Stem Cell Marker CD44 in Apc(Min/+) Mice Attenuates Intestinal Tumorigenesis", CANCER RES, vol. 68, 2008, pages 3655 - 3661, XP055072987 *
KELLOFF ET AL., CLINICAL CANCER RESEARCH, vol. 12, no. 12, 2006, pages 3661 - 3697
MAMI TAKAHASHI ET AL.: "Altered expression of P-catenin, inducible nitric oxide synthase and cyclooxygenase-2 in azoxymethane-induced rat colon carcinogenesis", CARCINOGENESIS, vol. 21, no. 7, 2000, pages 1319 - 1327, XP055072985 *
PAULSEN ET AL., CANCER RESEARCH, vol. 65, 2005, pages 121 - 129
R F HOLCOMBE ET AL.: "Expression of Wnt ligands and Frizzled receptors in colonic mucosa and in colon carcinoma", MOL PATHOL., vol. 55, no. 4, 2002, pages 220 - 226, XP002492379 *
See also references of EP2589666A4
TAKAHASHI ET AL., CARCINOGENESIS, vol. 21, no. 7, 2000, pages 1319 - 1327
TAKAYAMA ET AL., THE NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE, vol. 339, no. 18, 1998, pages 1277 - 1284
XU ET AL., WORLD JOURNAL OF GASTROENTEROLOGY, vol. 9, no. 6, 2003, pages 1246 - 1250

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013099848A1 (ja) * 2011-12-27 2013-07-04 オリンパス株式会社 Ａｃｆ検出方法
WO2013099865A1 (ja) * 2011-12-27 2013-07-04 オリンパス株式会社 Ａｃｆ検出方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2589666A4 (en) 2013-12-25
JPWO2012002472A1 (ja) 2013-08-29
EP2589666A1 (en) 2013-05-08
CN102985564A (zh) 2013-03-20
US20130130256A1 (en) 2013-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ilyas et al. Emerging technologies for the diagnosis of perihilar cholangiocarcinoma
JP6897970B2 (ja) 大腸腫瘍の有無を検査する方法
US20050014165A1 (en) Biomarker panel for colorectal cancer
ES2510842T3 (es) Gen asociado con cáncer de hígado, y método para la determinación del riesgo de adquirir cáncer de hígado
Vallböhmer et al. Cdx-2 expression in squamous and metaplastic columnar epithelia of the esophagus
JP6281873B2 (ja) 新規癌マーカーおよびその利用
WO2012002472A1 (ja) Ａｃｆ検出方法
Muguruma et al. Molecular imaging of aberrant crypt foci in the human colon targeting glutathione S-transferase P1-1
JP2006526390A (ja) 正常細胞およびがん細胞における遺伝子発現を検出する方法
JP2009506303A (ja) 癌の化学療法のための予測方法
JP5413818B2 (ja) 蛍光多重染色による蛋白定量法
Ceausu et al. A multidisciplinary approach in the diagnostic challenge of GIST
JP2008048668A (ja) Ｄｎａコピー数多型を用いた癌発症体質の判定方法
WO2013099865A1 (ja) Ａｃｆ検出方法
JP2016086678A (ja) 腎がんの悪性度の検査マーカー及び検査方法
CA2715170A1 (en) Colon cancer associated transcript 1 (ccat-1) as a cancer marker
CN105779612A (zh) 一种Lynch综合征基因检测试剂盒及其应用
ES2820732T3 (es) Marcadores de metilación de ADN no sesgados que definen un defecto de campo amplio en tejidos de próstata histológicamente normales asociados al cáncer de próstata: nuevos biomarcadores para hombres con cáncer de próstata
WO2013099848A1 (ja) Ａｃｆ検出方法
JP7100323B2 (ja) 組織検体を用いたがんの検出方法
Marzioni et al. PDX-1 mRNA expression in endoscopic ultrasound-guided fine needle cytoaspirate: perspectives in the diagnosis of pancreatic cancer
JP6103866B2 (ja) 大腸ガン検出方法、診断用キット及びｄｎａチップ
KR20220164456A (ko) 전립선암 진단 점수 계산 방법 및 그 용도
JP5410722B2 (ja) 膵臓の組織傷害あるいは細胞増殖性疾患の検出方法
JP2009060821A (ja) Ａｃｃ亜分類の検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201180031786.8

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11800934

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012522682

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011800934

Country of ref document: EP