JP2009060821A - Ａｃｃ亜分類の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】
ＡＣＣ患者に対して、有効な治療を行うために、ＡＣＣの悪性度と、薬剤治療適応性判定して、ＡＣＣ亜分類を検出するための方法を提供することをその主な課題とする。
【解決手段】
被験者由来の組織細胞を材料として、染色体ＣＧＨ（ｃ−ＣＧＨ）法、アレイＣＧＨ（ａ−ＣＧＨ）法、または免疫組織化学的手法によって、ＡＣＣ患者の染色体、及び／又は遺伝子の異常を、統計学的に正常細胞と比較解析することにより、ＡＣＣの悪性度と、チロシンキナーゼ活性阻害作用を有する薬剤のＡＣＣ患者に対する有効性を判定する、ＡＣＣ亜分類の検出方法を提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ＡＣＣ（ａｄｅｎｏｉｄ ｃｙｓｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の亜分類の検出方法に関し、詳しくは、特定の染色体領域、又は遺伝子におけるＤＮＡコピー数の増減、あるいは特定遺伝子の発現状態を指標として、ＡＣＣ患者の悪性度を検出し、薬剤治療適応性を判定する方法、該判定の指標となる染色体領域および遺伝子の検出方法に関する。

ＡＣＣは、まれな悪性上皮腫瘍で、切除した後でも、徐々に再発することが多い。主として唾液腺に生じるが、唾液腺のほか、乳房、肺、気管等の組織でも報告されている。ＡＣＣは、弱い進行度で長い臨床期間を示し、唾液腺癌の５〜１０％を占め、ヒトの頭・首の悪性腫の２〜４％を占める。この癌腫は、１８５６年にＢｉｌｌｒｏｔｈによる最初の報告がある。成長パターンは篩状、管状および充実状のタイプがある。この腫瘍は、高い頻度で神経侵入が起るため、痛みと神経障害が起る。また、この腫瘍は、早期の潜在性・無痛性の期間が長く、後期の急速な成長が始まると激しく、容赦ないことが知られている。転移はゆっくり起るが、成長が永続的で、予測できないことが多い。この疾患については、わずかの統計値しかなく、どのような疾患形態が悪性の腫瘍であるかの報告が非常に少なく、ＡＣＣの原因は明らかではない。そのため、ＡＣＣの有効な治療方針を立てることが困難であり、局部的な治療で、患者の再発防止が可能であったかどうかの判断ができない。現在、この新生物に関する何らかの特徴や血清マーカー等、この疾患に関する医薬的な情報はほとんどない。

ＡＣＣの生物学的な習性は、最初に腫瘍細胞の中でそれ自身がゲノム改変を起こすと考えられている。このまれな腫瘍の細胞遺伝学的異常性に関しては、染色体６ｑと９ｐの端の部分の異常の報告があり、ヘテロ接合性を消失した領域に癌抑制遺伝子の存在が示唆されるｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ（ＬＯＨ）解析で、染色体６ｑ２３−３５に高いＬＯＨ頻度を実証している（非特許文献１、２）。しかしながら、ＡＣＣの全ゲノムにおける異常の傾向は明確ではなく、その結果、細胞の悪性度があいまいになっている。

近年、医学・生物学的研究の進歩により、癌発症のメカニズムが分子レベルまで解明され、癌と遺伝子の関連研究が多く見られるようになった。特許においても、すでに遺伝子レベルの比較を用いた診断法はいくつか知られている。肺癌、胃癌、膵臓癌、大腸癌、胆管癌、脳腫瘍、骨髄種等の各種の癌において、正常細胞と比較して、増幅又は欠失している特定の遺伝子を網羅的に見いだし、これらの癌関連遺伝子の増幅又は欠失を指標とする癌の検出方法（特許文献１）が報告されている。染色体異常が原因として起る癌などの診断方法として、染色体の特定部位における増幅と欠失を検出することにより、リンパ節転移をする食道癌の診断法（特許文献２）、染色体全体あるいはその一部のＤＮＡコピー数の異常を検出することによる、口腔癌細胞の検出方法（特許文献３）、同様に、胃癌、口腔扁平上皮癌の検出方法（特許文献４）、同様に、前立腺癌細胞の検出（特許文献５）等が報告されている。これらの、遺伝子の増幅又は欠失、あるいは染色体異常の分析は、主に比較ゲノムハイブリダイゼージョン（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＣＧＨ）法や、アレイＣＧＨ（ａ−ＣＧＨ）法が用いられている。
特開２００５−３０４４９７号公報 特開２００１−１７２００号公報 特開２００６−９４７６０号公報 特開２００６−９４７３３号公報 特表２０００−５１１４３３号公報 Ｓｔｅｎｍａｎ Ｇ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ ２２：２８３−２９３，１９８６ Ｈｉｇａｓｈｉ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｃａｎｃｅｒ ３：２１−２３，１９９１

現在、ＡＣＣの悪性度について、判定方法が明確ではなく、ＡＣＣ患者に対する適切な治療は行われていない。そのため、ＡＣＣは難治性腫瘍と考えられている。従って、本発明は、ＡＣＣ患者に対して有効な治療を行うため、ＡＣＣの悪性度を検出し、それにより薬剤治療適応性を判定するための方法を提供することをその主な課題とする。

本発明者等は、ＡＣＣ患者の組織から得られたＤＮＡコピー数について、染色体ＣＧＨ（ｃ−ＣＧＨ）法で染色体の異常を検出し、さらにアレイＣＧＨ（ａ−ＣＧＨ）法により、特定遺伝子のＤＮＡコピー数の増減を検出し、免疫組織化学的分析により特定遺伝子の発現状態を確認することにより、ＡＣＣで特徴的な異常を示す遺伝子、および染色体領域を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）を提供する。

（１）被験者由来の組織細胞における遺伝子、及び／又は染色体の異常を検出することを特徴とする、ＡＣＣの悪性度、及び薬剤治療適応性を判定する、ＡＣＣ亜分類の検出方法。

（２）被験者由来の組織細胞における遺伝子の異常が、ＡＭＹ２Ａ遺伝子、ＧＯＮ４Ｌ遺伝子、ＤＳＴ遺伝子、ＲＵＮＸ２遺伝子、ＴＦＡＰ２Ｂ遺伝子、ＴＲＥＭ１遺伝子、ＴＲＥＭＬ３遺伝子、ＴＲＥＭＬ４遺伝子、Ｃ６ｏｒｆ１２９遺伝子、ＨＬＡ−２１遺伝子、ＨＣＧ４Ｐ５遺伝子、ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＢＴＮ３Ａ１遺伝子、ＢＴＮ２Ａ３遺伝子、ＢＴＮ３Ａ３遺伝子、ＤＯＣＫ８遺伝子、ＡＮＫＲＤ１５遺伝子、ＡＢＬ１遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＲＡＰ１Ｂ遺伝子、ＮＵＰ１０７遺伝子、ＳＬＣ３５Ｅ３遺伝子、ＣＰＭ遺伝子、ＳＹＮ３遺伝子、ＴＩＭＰ３遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ３Ｆ遺伝子、ＧＡＧＥ８遺伝子、ＧＡＧＥ４遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子のＤＮＡコピー数の増加、及び／又はＥＳＲ１遺伝子、ＭＡＳ１遺伝子、ＲＰＳ６ＫＡ２遺伝子、ＭＬＬＴ４遺伝子、Ｃ６ｏｒｆ５４遺伝子、ＴＨＢＳ２遺伝子、ＦＡＭ９０Ａ６Ｐ遺伝子、ＦＡＭ９０Ａ７遺伝子、ＯＣＡ２遺伝子、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１遺伝子、ＺＮＦ４４７遺伝子、ＺＮＦ３２９遺伝子、ＳＴＡＧ２遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子のＤＮＡコピー数の減少であって、統計学的に正常細胞のコピー数と比較解析することを特徴とする、上記（１）に記載の検出方法。

（３）被験者由来の組織細胞における染色体の異常が、ＡＦＭ２９８ＷＥ１，ＳＨＧＣ１５５２８９、ＲＨ１０３８９７、ＳＨＧＣ−１０７６１８、ＳＴＣＢ４４Ｈ３Ｂで示される染色体領域から選ばれる１箇所以上の染色体領域のコピー数の増加、及び／又はＳＨＧＣ−１４８９９８、ＳＨＧＣ−１４２６０１、ＳＨＧＣ−１００９２９、ＳＨＧＣ−１３０５９６で示される染色体領域から選ばれる１箇所以上の染色体領域のＤＮＡコピー数の減少であって、統計学的に正常細胞のコピー数と比較解析することを特徴とする、上記（１）に記載の検出方法。

（４）被験者由来の組織細胞における染色体の異常が、上記（２）に記載の遺伝子、及び／又は上記（３）に記載の染色体領域を含む下記染色体の異常であって、１ｐ２１領域、１ｑ２２領域、６ｐ１２−２２領域、９ｐ２４領域、９ｑ３４領域、１２ｑ１５領域、２０ｑ１３領域、２２ｑ１２−１３領域、Ｘｐ１１領域から選ばれる１箇所以上の染色体領域におけるＤＮＡコピー数の増加、及び／又は６ｑ２５−２７領域、８ｐ２３領域、１０ｑ２６領域、１５ｑ１２−１３領域、１７ｐ１３領域、１９ｑ１３領域、Ｘｑ２３領域、Ｘｑ２５領域から選ばれる１箇所以上の染色体領域におけるＤＮＡコピー数の減少を、統計学的に正常細胞のコピー数と比較解析することを特徴とする、上記（１）に記載の検出方法。

（５）被験者由来の組織細胞における遺伝子の異常が、ＭＤＭ２遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、及びｃ−ｋｉｔ遺伝子の発現状態であって、前記４つ遺伝子の発現状態を、統計学的に正常細胞における前期４つの遺伝子の発現状態と比較解析することを特徴とする、上記（１）に記載の検出方法。

（６）被験者由来の組織細胞における遺伝子、又は染色体の異常を、該組織細胞を材料として、染色体ＣＧＨ（ｃ−ＣＧＨ）法、ＢＡＣアレイＣＧＨ（ａ−ＣＧＨ）法、及び免疫組織化学的手法から選ばれる方法によって測定することを特徴とする、上記（１）〜（５）のいずれか一項に記載の検出方法。

（７）ＡＣＣの薬剤治療適応性が、チロシンキナーゼ活性阻害作用を有する抗ＭＤＭ２薬および抗ｃ−ｋｉｔ薬に対するものであって、ＭＤＭ２遺伝子及びＡＢＬ１遺伝子のＤＮＡコピー数の異常と、ＭＤＭ２遺伝子及びｃ−ｋｉｔ遺伝子の発現状態を、統計学的に正常細胞と比較解析して薬剤選択の指標とすることを特徴とする、上記（１）に記載の検出方法。

（８）チロシンキナーゼ活性阻害物質が、トラスツズマブ、イマニチブ、ヌトリン、ベパシズムである上記（７）に記載の検出方法。

本発明により、特定の染色体領域の増加や減少、特定遺伝子の増加や減少、あるいは特定遺伝子の発現状態から、ＡＣＣの亜分類が検出できるため、ＡＣＣ患者の有効な治療が可能となる。

本発明は、被験者由来の組織細胞における特定の染色体領域の増加や減少、さらにまた特定遺伝子の異常を測定することにより、ＡＣＣの悪性度、及び薬剤治療適応性を判定する、ＡＣＣ亜分類を検出するものである。

ＡＣＣの悪性度について説明を行うと、「悪性度が高い」とは、ＡＣＣ患者のうち死亡する可能性の高い場合をいい、その理由として化学的あるいは放射線的治療の効果が期待できないことや癌の進行が早いことがあげられる。「悪性度が低い」とは、ＡＣＣ患者に対し化学的あるいは放射線的治療の効果が期待できる程度の腫瘍である場合をいう。

ＡＣＣ亜分類の検出は、ＡＣＣ患者の組織から得られたサンプルにおいて、染色体１ｐ２１領域、１ｑ２２領域、６ｐ１２−２２領域、９ｐ２４領域、９ｑ３４領域、１２ｑ１５領域、２０ｑ１３領域、２２ｑ１２−１３領域、Ｘｐ１１領域から選ばれる１箇所以上の染色体領域におけるＤＮＡコピー数の増加、あるいは６ｑ２５−２７領域、８ｐ２３領域、１０ｑ２６領域、１５ｑ１２−１３領域、１７ｐ１３領域、１９ｑ１３領域、Ｘｑ２３領域、Ｘｑ２５領域から選ばれる１箇所以上の染色体領域におけるＤＮＡコピー数の減少を、統計学的に正常細胞のコピー数と比較解析することにより行うことができる。上記領域でコピー数の異常が認められ、特に、１ｑ２２領域、６ｐ１２−２２領域、９ｐ２４領域、９ｑ３４領域、１２ｑ１５領域、２０ｑ１３領域、２２ｑ１２−１３領域、Ｘｐ１１領域におけるＤＮＡコピー数の増加、あるいは６ｑ２５−２７領域、８ｐ２３領域、１０ｑ２６領域、１７ｐ１３領域、１９ｑ１３領域におけるＤＮＡコピー数の減少が認められた場合、悪性度が高いと判断することができる。

また、本発明のＡＣＣ亜分類の検出は、ＡＣＣ患者から得られたサンプルにおいて、上記染色体群上に存在する遺伝子のコピー数の異常を、統計学的に正常細胞のコピー数と比較解析することによって行うことができる。

すなわち、ＡＭＹ２Ａ遺伝子、ＧＯＮ４Ｌ遺伝子、ＤＳＴ遺伝子、ＲＵＮＸ２遺伝子、ＴＦＡＰ２Ｂ遺伝子、ＴＲＥＭ１遺伝子、ＴＲＥＭＬ３遺伝子、ＴＲＥＭＬ４遺伝子、Ｃ６ｏｒｆ１２９遺伝子、ＨＬＡ−２１遺伝子、ＨＣＧ４Ｐ５遺伝子、ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＢＴＮ３Ａ１遺伝子、ＢＴＮ２Ａ３遺伝子、ＢＴＮ３Ａ３遺伝子、ＤＯＣＫ８遺伝子、ＡＮＫＲＤ１５遺伝子、ＡＢＬ１遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＲＡＰ１Ｂ遺伝子、ＮＵＰ１０７遺伝子、ＳＬＣ３５Ｅ３遺伝子、ＣＰＭ遺伝子、ＳＹＮ３遺伝子、ＴＩＭＰ３遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ３Ｆ遺伝子、ＧＡＧＥ８遺伝子、ＧＡＧＥ４遺伝子等から選択される１種以上の遺伝子のＤＮＡコピー数の増加を、統計学的に正常細胞のコピー数と比較解析して行うことができる。特に、ＧＯＮ４Ｌ遺伝子、ＤＳＴ遺伝子、ＲＵＮＸ２遺伝子、ＴＦＡＰ２Ｂ遺伝子、ＴＲＥＭ１遺伝子、ＴＲＥＭＬ３遺伝子、ＴＲＥＭＬ４遺伝子、Ｃ６ｏｒｆ１２９遺伝子、ＨＬＡ−２１遺伝子、ＨＣＧ４Ｐ５遺伝子、ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＢＴＮ３Ａ１遺伝子、ＢＴＮ２Ａ３遺伝子、ＢＴＮ３Ａ３遺伝子、ＤＯＣＫ８遺伝子、ＡＮＫＲＤ１５遺伝子、ＡＢＬ１遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＲＡＰ１Ｂ遺伝子、ＮＵＰ１０７遺伝子、ＳＬＣ３５Ｅ３遺伝子、ＣＰＭ遺伝子、ＳＹＮ３遺伝子、ＴＩＭＰ３遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ３Ｆ遺伝子、ＧＡＧＥ８遺伝子、ＧＡＧＥ４遺伝子から選択される１種以上の遺伝子にＤＮＡコピー数の異常な増加が認められたＡＣＣでは、悪性度が高いと判断することができる。

また、ＥＳＲ１遺伝子、ＭＡＳ１遺伝子、ＲＰＳ６ＫＡ２遺伝子、ＭＬＬＴ４遺伝子、Ｃ６ｏｒｆ５４遺伝子、ＴＨＢＳ２遺伝子、ＦＡＭ９０Ａ６Ｐ遺伝子、ＦＡＭ９０Ａ７遺伝子、ＯＣＡ２遺伝子、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１遺伝子、ＺＮＦ４４７遺伝子、ＺＮＦ３２９遺伝子、ＳＴＡＧ２遺伝子等から選択される１種以上の遺伝子のＤＮＡコピー数の減少を、統計学的に正常細胞のコピー数と比較解析して行うことができる。特に、ＥＳＲ１遺伝子、ＭＡＳ１遺伝子、ＲＰＳ６ＫＡ２遺伝子、ＭＬＬＴ４遺伝子、Ｃ６ｏｒｆ５４遺伝子、ＴＨＢＳ２遺伝子、ＦＡＭ９０Ａ６Ｐ遺伝子、ＦＡＭ９０Ａ７遺伝子、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１遺伝子、ＺＮＦ４４７遺伝子、ＺＮＦ３２９遺伝子から選択される１種以上の遺伝子にＤＮＡコピー数の異常な減少が認められたＡＣＣでは、悪性度が高いと判断することができる。

さらに、本発明のＡＣＣ亜分類の検出は、ＡＣＣ患者から得られたサンプルにおいて、上記染色体群上に存在する、数１００〜５００程度の塩基からなる染色体領域であるＡＦＭ２９８ＷＥ１，ＳＨＧＣ１５５２８９、ＲＨ１０３８９７、ＳＨＧＣ−１０７６１８、ＳＴＣＢ４４Ｈ３Ｂ、ＳＨＧＣ−１４８９９８、ＳＨＧＣ−１４２６０１、ＳＨＧＣ−１００９２９、ＳＨＧＣ−１３０５９６で示される染色体領域から選ばれる１箇所以上の染色体領域のコピー数の増加あるいは減少を、統計学的に正常細胞のコピー数と比較解析して行うことができる。上記領域でのコピー数の異常が認められたＡＣＣでは、悪性度が高いと判断することができる。

さらにまた、本発明のＡＣＣ亜分類の検出は、ＡＣＣ患者から得られたサンプルにおいて、ＭＤＭ２遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、及びｃ−ｋｉｔ遺伝子の発現状態を、統計学的に正常細胞における前期４つの遺伝子の発現状態と比較解析して行うことができる。正常細胞においては、ＭＤＭ２遺伝子、ｐ５３遺伝子の発現がなく、ｐ２１遺伝子とｃ−ｋｉｔ遺伝子がわずかに発現していることから、ＡＣＣ患者におけるＭＤＭ２遺伝子の過剰発現は、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の機能不全を招き、ｐ５３遺伝子の下流に位置するｐ２１遺伝子発現を抑制すると考えられる。このため、ＭＤＭ２遺伝子の高度の発現と、ｐ５３遺伝子及びｐ２１遺伝子の未発現が認められたＡＣＣでは、抗ＭＤＭ２薬剤により、ｐ５３機能不全が解除され、予後が高度に延長されることが期待できるため、ＡＣＣは軽度に分類することができ、ＭＤＭ２遺伝子とｐ５３遺伝子の高度の発現が認められたＡＣＣでは、悪性度が高いと判断される。

遺伝子の情報は、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ＤＤＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ）から得ることができる。

ＭＤＭ２遺伝子は、ゲノム配列上１２番染色体に存在する分子量９０ｋＤの核リンタンパク質である。ｐ５３に結合して複合体を形成し、ｐ５３を分解させる方向に働く。ＭＤＭ２遺伝子が、過剰発現すると細胞の腫瘍形成能が高められると推定される。

ｐ５３遺伝子は、ゲノム配列上１７番染色体に存在する核タンパクで、細胞周期のＧ０からＧ１への移行段階の制御に重要な役割を果たす、癌抑制遺伝子である。ＭＤＭ２と直接的に結合すると、ｐ５３はユビキチン化し、分解される。

ｐ２１遺伝子は、ゲノム配列上６番染色体に存在するｐ５３の下流遺伝子である。細胞周期のＧ１期の停止やＤＮＡ複製の阻害に関与し、癌細胞に対しても抑制的に働く。

ｃ−ｋｉｔ遺伝子は、ゲノム配列上４番染色体に存在する、原癌遺伝子である。

ＡＣＣ患者のサンプルにおいて、ＤＮＡコピー数の増加が多く認められるＡＢＬ１遺伝子は、ゲノム配列上９番染色体に存在する原癌遺伝子である。細胞分化、細分裂、細胞接着、およびストレス応答の過程に関与する。ＢＣＲ遺伝子と直列融合した状態では、骨髄性白血病をもたらす。また、ＡＭＹ２Ａ遺伝子は、ゲノム配列上１番染色体に存在する膵臓性アミラーゼの遺伝子で、ＡＭＹ１（唾液腺性アミラーゼ）とともに、肺がんで過剰発現することが報告されている。

その他、ＡＣＣ患者のサンプルにおいて、ＤＮＡコピー数の増加が認められる遺伝子であるＧＯＮ４Ｌ遺伝子は１番染色体上に、ＤＳＴ遺伝子、ＲＵＮＸ２遺伝子、ＴＦＡＰ２Ｂ遺伝子、ＴＲＥＭＬ３遺伝子、ＴＲＥＭＬ４遺伝子、ＴＲＥＭ１遺伝子、Ｃ６ｏｒｆ１２９遺伝子、ＨＬＡ２１遺伝子、ＨＣＧ４Ｐ５遺伝子、ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＢＴＮ３Ａ１遺伝子、ＢＴＮ２Ａ３遺伝子、ＢＴＮ３Ａ３遺伝子はともに６番染色体上に存在し、ＤＯＣＫ８遺伝子、ＡＮＫＲＤ１５遺伝子は９番染色体上に、ＣＰＭ遺伝子、ＲＡＰ１Ｂ遺伝子、ＮＵＰ１０７遺伝子、ＳＬＣ３５Ｅ３遺伝子は１２番染色体上に、ＳＹＮ３遺伝子、ＴＩＭＰ３遺伝子は２２番染色体上に、ＰＰＰ１Ｒ３Ｆ遺伝子、ＧＡＧＥ８遺伝子、ＧＡＧＥ４遺伝子はＸ染色体上に存在することが明らかにされている。

また、ＡＣＣ患者のサンプルにおいて、ＤＮＡコピー数の減少が認められる遺伝子であるＥＳＲ１遺伝子、ＭＡＳ１遺伝子、ＲＰＳ６ＫＡ２遺伝子、ＭＬＬＴ４遺伝子、Ｃ６ｏｒｆ５４遺伝子、ＴＨＢＳ２遺伝子は６番染色体上に、ＦＡＭ９０Ａ６Ｐ遺伝子、ＦＡＭ９０Ａ７遺伝子は８番染色体上に、ＯＣＡ２遺伝子は１５番染色体上に、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１遺伝子は１７番染色体上に、ＺＮＦ４４７遺伝子、ＺＮＦ３２９遺伝子は１９番染色体上に、ＳＴＡＧ２遺伝子はＸ染色体上に存在することが明らかにされている。

さらに、ＡＣＣ患者のサンプルにおいて、ＤＮＡコピー数の異常が認められる染色体領域であるＡＦＭ２９８ＷＥ１，ＳＨＧＣ１５５２８９、ＳＨＧＣ−１４８９９８、ＳＨＧＣ−１４２６０１は６番染色体上に、ＳＨＧＣ−１００９２９、ＳＨＧＣ−１３０５９６は１０番染色体上に、ＲＨ１０３８９７は２０番染色体上に、ＳＨＧＣ−１０７６１８、ＳＴＣＢ４４Ｈ３Ｂは２２番染色体上に存在することが明らかにされている。

遺伝子群の発現様式のうち、特定の機能を有する遺伝子が原因で起る腫瘍であるか否かを判定する場合では、該遺伝子の発現量を、健常人や患者の正常な細胞の発現量と比較解析することで腫瘍の原因が該遺伝子にあること、さらに該遺伝子が有する特定の機能によると判定することが可能である。これは、疾病とその原因となっている遺伝子と、その特定の機能が明確になった場合には、公知の医薬が同様の原理と方法により別の腫瘍にも効果を有すると判断することができる。

ＭＤＭ２遺伝子、ｃ−ｋｉｔ遺伝子、ＡＢＬ１遺伝子はいずれもチロシンキナーゼという作用機序を有するタンパクである。腫瘍に関与する遺伝子がチロシンキナーゼを共通に発現することは、これらの遺伝子に対する抗体、あるいは類似するが生理作用の少ないタンパクは、当該腫瘍の治療に対して効果的であることが推察される。ＭＤＭ２遺伝子及びＡＢＬ１遺伝子のＤＮＡコピー数の異常、またはＭＤＭ２遺伝子及びｃ−ｋｉｔ遺伝子の発現状態を測定することによって、チロシンキナーゼ阻害活性を作用機序に有するものとして市販されている、抗ｃ−ｋｉｔ薬であるイマニチブ、抗ＨＥＲ２（ｈｕｍａｎ ＥＧＦＲ−ｒｅｌａｔｅｄ ２）剤であるトラスツズマブ、ＭＤＭ２増幅を持つ腫瘍に対して臨床上有効で、ｐ５３とＭＤＭ２との相互作用を阻害するヌトリン、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）剤のベバシズマブ等の使用可能性を判定することができる。

ＡＣＣ患者のサンプルにおいて、遺伝子のＤＮＡコピー数の異常を検出する場合、１つの異常を検出すれば良いが、精度を高めるためには、２つ以上、好ましくは３つ以上の領域の異常を検出することが望ましい。

ＤＮＡコピー数の検出法としては、ヒト組織を材料として、ｃ−ＣＧＨ法、ａ−ＣＧＨ法、定量的ＰＣＲ法を用いることができ、遺伝子発現の増強を確認するためには、免疫組織化学的手法を用いることが望ましい。

ｃ−ＣＧＨ分析では、染色体のゲノム−ワイドの細かいスキャンで、がん細胞における多くの染色体コピー数異常、例えば１０Ｍｂの低いコピー数や、２Ｍｂの高いコピー数増幅等、ＤＮＡ配列のコピー数異常（ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ：ＤＳＣＮＡ）について幅広い分析を行うことができる。

さらに、精度のよい分析法として、Ｐｉｎｋｅｌら（Ｐｉｎｋｅｌ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２０：２０８−２１１，１９９８）は、ＣＧＨアレイのＢＡＣ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）クローンを用いて、４０ｋｂについて高い分析が可能になると報告している。これはａ−ＣＧＨ法と呼ばれており、Ｍａｃｒｏｇｅｎ’ｓ ＫＯＧＥＮＯＭＥ Ｐｒｏｊｅｃｔで作成されたＤＮＡ断片からなるＢＡＣクローンを、スライドガラス上にスポットしたアレイを用いて行うもので、ＢＡＣクローンとのハイブリダイゼーション法を用いて、腫瘍／正常の蛍光強度比を測定するものである。

ａ−ＣＧＨ法による分析は、ＢＡＣクローンをスポットした市販のものを入手して利用することも可能である。例えば、Ｍａｃｒｏｇｅｎ社のＭＡＣ Ａｒｒａｙ（登録商標）、ＳＰＥＣＴＲＡＬ ＧＥＮＯＭＩＣＳ社のＳｐｅｃｔｒａｌＣｈｉｐ（登録商標）等がある。ＭＡＣ Ａｒｒａｙ（登録商標）の場合、アレイスライド上には全染色体を網羅する４０３０個のＢＡＣクローンがスポットされている。ＢＡＣ開始位置、終了位置等の情報クローン情報は、Ｍａｃｒｏｇｅｎ社のＨＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｃｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｅｎｇ／ｆｉｌｅ／４Ｋ＿ｌｉｓｔ＿０４１２２１．ｘｌｓ）に掲載され更新されている。

ＢＡＣクローンと反応させるＤＮＡは、ランダムプライム法等で標識するが、このような方法で蛍光標識する場合、腫瘍細胞、正常細胞はそれぞれ別の色素による標識を行う。腫瘍細胞由来の試験用ＤＮＡは、Ｃｙａｎｉｎｅ５−ｄＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で、正常細胞由来の対照ＤＮＡはＣｙａｎｉｎｅ３−ｄＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で標識することができる。試験用ＤＮＡおよび対照ＤＮＡ由来の蛍光による画像は、レーザースキャナーや、ＣＣＤカメラ等の定量的検出装置により取得し、ＣＧＨ解析用ソフトウェアにより画像解析を行うことができる。

試験用ＤＮＡおよび対照ＤＮＡ由来の蛍光による画像においては、試験用ＤＮＡのコピー数が多い場合には、試験用ＤＮＡの蛍光強度が増加し、試験用ＤＮＡのコピー数が少ない場合には、対照ＤＮＡの蛍光強度が増加することから、ＡＣＣ患者および健常人の組織から得られたＤＮＡサンプルのアレイスポットの特定の蛍光波長における蛍光強度を測定することによって、ＢＡＣクローンごとの異常を検出することができる。ａ−ＣＧＨに用いるＤＮＡにはＢＡＣクローンのほか、より短い配列のＤＮＡを用いることもできる。

さらに、ＡＣＣ患者における遺伝子の発現状態の異常を検出する方法として、免疫組織化学的手法を用いることもできる。免疫組織化学的手法は、抗原−抗体反応という特異的な結合反応を利用して、目的とする蛋白質の細胞内外および組織内の局在を検出する手法であり、抗原に対する特異的抗体である一次抗体に酵素や蛍光物質を直接結合させて検出する方法や、一次抗体に対する抗体である二次抗体を用いて可視化する方法等がある。本発明は、上記のどちらの手法を用いることもできる。また、ここで用いる抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても良い。抗体には、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｉａｎａｔｅ）等の蛍光物質や、ペルオキシダーゼ、ビオチン等の酵素標識を施すことにより、精度良く効率的な検出を行うことができる。これらの標識された抗体は、市販のキットを用いることもできる。

以下、本発明を更に詳しく説明するため、実施例を挙げるが本発明はこれに限定されない。

＜ｃ−ＣＧＨ法によるＤＮＡコピー数異常の検出＞

腫瘍サンプル
山口大学病院外科から得られた、原発性唾液腺組織腫瘍８例、唾液腺組織からの肺転移腫瘍１例、原発性気管上皮腫瘍１例の計１０例のＡＣＣサンプルを用いた。どの患者も外科へ来る前に化学療法や、放射線治療を受けていなかった。すべての標本はＤＮＡを抽出するまで−８０℃で保存した。

腫瘍と対照のＤＮＡ抽出
凍結した組織標本はＨａｓｈｉｍｏｔｏらの方法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｙ．，Ｏｇａ Ａ．，Ｏｋａｍｉ Ｋ．，Ｉｍａｔｅ Ｙ．，Ｙａｍａｓｈｉｔａ Ｙ．，Ｓａｓａｋｉ Ｋ．，ｅｔ ａｌ． Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ４０：１６１−１６６，２０００）に準じて、正常細胞の混入を少なくするためにマイクロディゼクションを行ない、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用して、試験用として選択的に分離した組織から、対照としてリンパ球から、ＤＮＡを抽出した。

ｃ−ＣＧＨとデジタルイメージ解析
ｃ−ＣＧＨは、上記Ｈａｓｈｉｍｏｔｏらの方法に準じて行い、デジタルイメージは、ＣＧＨシステム（ＱＵＩＰＳ ＸＬ、ＶＹＳＩＳ，Ｄｏｗｎｅｒｓ Ｇｒｏｖｅ社）で解析した。各染色体で、緑−赤の平均的な蛍光率が観察され、ＤＮＡコピー数における増加と減少は、緑／赤の割合が、概ね１．２以上と、０．８以下で決定される。高いレベルのコピー数増加は、緑／赤の割合が１．４以上とした。

結果
１０例中８例でＤＮＡコピー数の異常が見られ、平均４．１カ所あり、２例では異常は観察されなかった（図１）。頻度高く異常が見られた染色体は、１番と６番の染色体であった。増加は染色体６ｑ１１−１６で５０％、６ｐ１１−２１で３０％、９ｐで３０％が観察され、減少は、染色体６ｑ２５−２７で６０％、１ｐ３４−３６で４０％観察された。

＜ａ−ＣＧＨ法によるＤＮＡコピー数異常の検出＞
腫瘍サンプル及びＤＮＡの抽出方法は、実施例１と同様に行った。ａ−ＣＧＨ法は、Ｙａｍａｍｏｔｏらの方法（Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｙ，Ｍａｔｓｕｙａｍａ Ｈ，Ｃｈｏｃｈｉ Ｙ，Ｏｋｕｄａ Ｍ，Ｋａｗａｕｃｈｉ Ｓ，Ｉｎｏｕｅ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ １７４：４２−４７，２００７）と、Ｈｉｒａｓａｋｉらの方法（Ｈｉｒａｓａｋｉ Ｓ，Ｎｏｇｕｃｈｉ Ｔ，Ｍｉｍｏｒｉ Ｋ，Ｉｎｏｕｅ Ｈ，Ｓｕｇｉｈａｒａ Ｋ，Ｍｏｒｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １２（４）：４０７−４１７，２００７）に準じて行った。

ＤＮＡ標識プローブの作製
試験用ＤＮＡおよび対照ＤＮＡ５００ｎｇをそれぞれ別々のチューブに分注し、精製水を加えて全量を２１μｌとした。これらＤＮＡ溶液に２０μｌの２．５×Ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 ＢｉｏＰｒｉｍｅ（登録商標）ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ）を加えて混合し、１００℃にて５分間加熱後、直ちに氷上に移し、５分間冷却した。遠心（４０００ｒｐｍ １０秒）の後、５μｌのＡ溶液（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社ＭＡＣ Ａｒｒａｙ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｋｉｔ）を加え、試験用ＤＮＡのチューブには３μｌの１ｍＭ Ｃｙａｎｉｎｅ５−ｄＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を、対照ＤＮＡのチューブには３μｌの１ｍＭ Ｃｙａｎｉｎｅ３−ｄＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を加え、氷上で１μｌ（４０ｕｎｉｔ）のＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社 ＢｉｏＰｒｉｍｅ（登録商標）ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ）を添加混合した後、３７℃で一晩反応させた。６５℃で２０分加熱し酵素を失活させた後、氷上で１分間冷やした。

標識プローブの洗浄
上記で得られたＤＮＡの各標識プローブ中の未反応Ｃｙａｎｉｎｅ標識ｄＣＴＰ等を除去するため、ＱＩＡ ｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して洗浄を行った。まず、５０μｌの標識プローブを２５０μｌのＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒと混合し、スピンカラムに滴下し、１３０００回転／分で１分間遠心した。流れ落ちた液体を捨て、７００μｌのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒをスピンカラムに加え、１３０００回転／分で１分間遠心した。流れ落ちた液体を捨て、再度１３０００回転／分で１分間遠心した。スピンカラムを清潔な１．５ｍｌのチューブ内に設置し、５０μｌのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを滴下して加え、３分間室温で静置した。さらに、１３０００回転／分で１分間遠心を行い、再度３０μｌのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒをスピンカラムに滴下し、３分間室温で静置した。１３０００回転／分で１分間遠心して、以下の試験用に使用する標識プローブを得た。

エタノール沈殿およびアレイハイブリダイゼーション混合液の作製
蛍光標識した試験用ＤＮＡおよび対照ＤＮＡ各８０μｌおよび１００μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｂ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社）を混合し、さらに３０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび６００μｌの氷冷１００％エタノールを加えて混合撹拌した。冷凍庫（−２０℃）にて１時間静置した後、４℃の温度下に１３０００回転／分で２０分間遠心した。ＤＮＡ残渣を残して上清を除去し、氷冷７０％エタノールを５００μｌ加え、再度１３０００回転／分で５分間遠心した。上清を除去した後、１０分間自然乾燥させた。得られたＤＮＡ残渣に４μｌの Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｄ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社）および４０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｃ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社）を添加して３０分間遮光下に静置してＤＮＡを緩やかに溶解させた。ＤＮＡを十分に撹拌溶解させた後、７０℃の水浴中で１５分間加熱することでＤＮＡを熱変性させ、３７℃のインキュベータ内で１時間静置することで繰り返し配列のブロッキング反応を行った。

Ａｒｒａｙスライドの前処理
３０μｌのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｃに、１０μｌのＳｏｕｌｔｉｏｎ Ｅを加えて混合し、７０℃水浴中で１０分間加熱して前処理液を熱変性させた後、氷上で５分間冷却した。４０μの前処理液をアレイスライド（Ｍａｃｒｏｇｅｎ社のＭＡＣ Ａｒｒａｙ（登録商標）Ｋａｒｙｏ ４０００）上に滴下し、液がアレイ全体に行き渡るよう２２×４０ｍｍのカバーグラスを載せ、密閉箱中にスライドを置き、室温で３０分間静置した。その後カバーグラスを外し、スライドグラスを１０秒間蒸留水中に浸漬し、再度１０秒間新しい蒸留水中に浸漬した後、１００％イソプロパノールに浸漬した後、スライドグラスを乾燥させた。

ハイブリダイゼーション
上記で作製した４４μｌのアレイハイブリダイゼーション混合液をアレイスライド上に滴下した。２２×４０ｍｍのカバーグラスをかけ、密閉湿潤箱中にスライドを静置し、３７℃で４８時間静置した。

アレイスライドの洗浄
４６℃に保った洗浄液１（５０％ホルムアミド／２×ＳＳＣ、ｐＨ７．０）中に、アレイスライドを１５分間静置し、時々振盪した。次いで、４６℃に保った洗浄液２（０．１％ＳＤＳ／２×ＳＳＣ、ｐＨ７．０）中に、アレイスライドを３０分間静置し、時々振盪した。さらに、室温に保った洗浄液３（０．１％ＮＰ−４０／０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）中に１５分間、室温に保った洗浄液４（２×ＳＳＣ、ｐＨ７．０）中に、アレイスライドを５分間静置した。その後、７０％エタノール、８５％エタノール、１００％エタノールの順に室温下でアレイスライドを各１分間ずつ浸漬後、アレイスライドを乾燥させた。

アレイスライドの読み取りおよび解析
ハイブリダイズしたアレイは、ＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ａ ２色蛍光スキャナーでスキャンし、ＧｅｎｅＰｉｘ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）で定量した。次に、Ｃｙ３、Ｃｙ５のイメージ獲得のための自動的にスポットし、蛍光率をカウントするために分析用ソフトウェア（ＭａｃＶｉｅｗｅｒ Ｍａｃｒｏｇｅｎ社）を使用した。ＤＮＡコピー数増減の判定に際し、補正済みＣｙ５／Ｃｙ３値について、底を２とする対数で表される数値を用いた。シグナル強度の補正は、正常部のＣｙ５／Ｃｙ３値が１となるように自動的に分析用ソフトウェアで計算されることで行われる。測定スポットにおける補正後のＣｙ５／Ｃｙ３値を、底を２とする対数で表し、ｌｏｇ_２のシグナル比と呼ぶとき、増加をｌｏｇ_２のシグナル比が、０．２５以上とし、そのうちｌｏｇ_２のシグナル比が、１．０以上を高レベルの増加（増幅）とした。同じように、減少はｌｏｇ_２のシグナル比が−０．２５以下とし、ｌｏｇ_２のシグナル比が−１．０以下を高レベルの減少とした。

結果
４０４２箇所のＤＮＡ領域のうち、非特異的反応（交差ハイブリ）の見られることのある７３箇所を除き、３９６９箇所について調査した。３９６９箇所のうち、増幅（高レベル増加）は１７箇所に出現し、うち、繰り返し（２回以上）増幅がみられたのはＭＤＭ２（１２ｑ１５）１箇所のみであった。また、３９６９箇所のうち、頻度高く（２０％以上）増加の見られたのは１５１箇所であった。さらに高頻度（３０％以上）に認めたのは４０４２カ所の箇所のＤＮＡ領域のうち２１箇所で、交差ハイブリをする領域を除くと２０箇所みられた。うち、既知の遺伝子部は染色体上の１６地点に検出でき、以下の遺伝子座を含んでいた。結果を表１に示した。頻度順にＡＢＬ１遺伝子、ＡＭＹ２Ａ遺伝子（５０％）、ＧＯＮ４Ｌ遺伝子、ＴＲＥＭＬ３遺伝子、ＴＲＥＭＬ４遺伝子、ＴＲＥＭ１遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ３Ｆ遺伝子、ＧＡＧＥ８遺伝子、ＧＡＧＥ４遺伝子（３３％）、ＤＳＴ遺伝子、ＲＵＮＸ２遺伝子、ＴＦＡＰ２Ｂ遺伝子、Ｃ６ｏｒｆ１２９遺伝子、ＨＬＡ−２１遺伝子、ＨＣＧ４Ｐ５遺伝子、ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＢＴＮ３Ａ１遺伝子、ＢＴＮ２Ａ３遺伝子、ＢＴＮ３Ａ３遺伝子、 ＤＯＣＫ８遺伝子、ＡＮＫＲＤ１５遺伝子、ＳＹＮ３遺伝子、ＴＩＭＰ３遺伝子（３０％）、ＭＤＭ２遺伝子、ＣＰＭ遺伝子、ＲＡＰ１Ｂ遺伝子、ＮＵＰ１０７遺伝子、ＳＬＣ３５Ｅ３遺伝子（２０％、増幅１回以上）であった。既知の遺伝子を含まない、以下の記号で区別される染色体上の特定の領域、すなわち、２０ｑ１３．２染色体上のＲＨ１０３８９７（３３％）、６ｐ２１．１染色体上のＡＦＭ２９８ＷＥ１、ＳＨＧＣ−１５５２８９、２２ｑ１３．３１染色体上のＳＨＧＣ−１０７６１８、ＳＴＣＢ４４Ｈ３Ｂ（３０％）でも遺伝子の増加は高頻度に認められた。

また、ＭＤＭ２遺伝子の強い増幅と、ＡＢＬ１遺伝子の頻度高いＤＮＡコピー数の増加が見られた患者Ｎｏ．２、および染色体の１ｑ２２領域、６ｐ１２−２２領域、９ｐ２４領域、２０ｑ１３領域において増加が見られた患者Ｎｏ．５、６は死亡に至った。

一方、高頻度減少領域（３０％以上）は、８０箇所あり交差ハイブリ（非特異的なハイブリ）を示すものとＹ染色体上のものを除くと６０箇所あった。うち、頻度が３３％以上であるもの、あるいは高レベルの減少が見られた領域を表２にまとめた（高レベル減少は一カ所もなかった）。うち、既知の遺伝子部は染色体上の１１地点に検出でき、以下の遺伝子座を含んでいた。頻度順に、ＦＡＭ９０Ａ６Ｐ遺伝子、ＦＡＭ９０Ａ７遺伝子（６０％）、ＥＳＲ１遺伝子、ＭＡＳ１遺伝子、ＲＰＳ６ＫＡ２遺伝子、ＭＬＬＴ４遺伝子、Ｃ６ｏｒｆ５４遺伝子、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１遺伝子（４４％）、ＴＨＢＳ２遺伝子（４０％）、ＯＣＡ２遺伝子、ＺＮＦ４４７遺伝子、ＺＮＦ３２９遺伝子、ＳＴＡＧ２遺伝子（３３％）であった。既知の遺伝子を含まない染色体上の特定の領域、６ｑ２６（４０％）、Ｘｑ２３（３８％）、あるいは以下の記号で区別される染色体上の特定の領域、すなわち、６ｑ２７染色体上のＳＨＧＣ−１４８９９８、ＳＨＧＣ−１４２６０１、１０ｑ２６．２染色体上のＳＨＧＣ−１００９２９、ＳＨＧＣ−１３０５９６（３３％）においても高頻度のコピー数の減少が認められた。

また、染色体の６ｑ２５−２７領域、１９ｑ１３領域、８ｐ２３領域、１７ｐ１３領域においてＤＮＡコピー数の減少が見られた患者Ｎｏ．５、６は死亡に至った。１０ｑ２６領域と１７ｐ１３領域において減少が見られた患者Ｎｏ．２も死亡に至った。

以上の結果から、チロシンキナーゼに属するＡＢＬ１遺伝子やＭＤＭ２遺伝子コピー数の増加、あるいは増幅は、チロシンキナーゼに関連する他の悪性腫瘍である慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）や間葉系腫瘍（ＧＩＳＴ）と同じように、腫瘍の発生や進展を助長することが示唆された。また、上記高頻度増加あるいは減少の認められた遺伝子は、同じ方法で食道癌を調査したＨｉｒａｓａｋｉらの文献（Ｈｉｒａｓａｋｉ Ｓ，Ｈｉｒａｎｏ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，２００７）で報告されている高頻度異常領域（増幅４６遺伝子、減少１１遺伝子）と、１箇所も一致しておらず、良性腫瘍における上記の遺伝子の異常は報告されていないことから、ＡＣＣの特徴的な遺伝子異常と推定できる。

＜免疫組織化学的手法による遺伝子の評価＞

腫瘍サンプル
腫瘍サンプルは、実施例１及び２で使用したサンプルに、さらに１１例の山口大学病院で処理された原発性唾液腺腫瘍のパラフィン組織切片を加えて試験をおこなった。２１例のＡＣＣ患者について、患者の臨床的、組織病理学的実際を表３に示した。診断時の患者の平均年齢は、５９．７歳（３５歳〜７８歳）で、男性（Ｍ）３９％、女性（Ｆ）６１％であった。腫瘍のタイプは、篩状（Ｃｒｉ：ｃｒｉｂｒｉｆｏｒｍ）、管状（Ｔｕｂ：ｔｕｂｕｌａｒ）、固形状（Ｓｏｌ：ｓｏｌｉｄ）に分類し、２つの状態を兼ねた症状をもつサンプルもあった。摘出した腫瘍の場所は、口腔底（ｍｏｕｔｈ ｆｌｏｏｒ）、上口唇（Ｕｐｐｅｒ ｌｉｐ） 、舌（Ｔｏｎｇｕｅ）、下口唇（Ｌｏｗｅｒ ｌｉｐ）、顎下腺（Ｓｕｂｍａｎｄｉｂｕｌａｒ ｇｌａｎｄ）、硬口蓋（Ｈａｒｄ ｐａｌａｔａｌ）、口蓋（Ｐａｌａｔｅ）、上顎洞（ｍａｘｉｌｌａｒｙ ｓｉｎｕｓ）、頬粘膜（Ｂｕｃｃａｌ ｍｕｃｏｓａ）であった。腫瘍の分類をＴＮＭ（ｔｕｍｏｒ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）で示した。腫瘍の程度（Ｔ）を、１〜４で、リンパ節転移について（Ｎ）を、０、１、３で、転移について（Ｍ）を０と１で表した。これは、統計的に予後に有意差のみられる複数のクラスに分類し、腫瘍の進行度を判定する指標とする分類である（各々小さい数字の方が統計的に予後良好）。生存についての結果は、生存（Ａ）とＡＣＣに起因した死亡（ＤＣ）、不明（ＮＡ）で表した。ＡＣＣはＵＩＣＣ ＴＮＭシステムにより分類した。また、患者Ｎｏ．４、７、１６、２０の正常な唾液腺組織（Ｎｏｒｍａｌ Ｓ．Ｇｓ）から採取したサンプルを対照として使用した。

免疫組織化学的手法
フォルマリン固定試料から４μｍの厚さのパラフィン封埋の標本を作った。免疫組織化学的染色法は、Ｌｉｕらの方法（Ｌｉｕ ＸＰ、Ｔｓｕｓｈｉｍｉ Ｋ，Ｔｓｕｓｈｉｍｉ Ｍ，Ｋａｗａｕｃｈｉ Ｓ，Ｏｇａ Ａ，Ｆｕｒｕｙａ Ｔ，Ｓａｓａｋｉ Ｋ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．１７０：１８３−１８９，２００１）に準じて行った。すなわち、切片をキシレンでパラフィン脱着し、連続して各濃度のエタノールで脱水した。次いでクエン酸Ｎａバッファー０．０１Ｍを加え、ＭＤＭ２溶液はｐＨ９．０に、その他の溶液はｐＨ６．０に調整した。電子レンジ（６５０Ｗ）で３０分間熱処理したのち、内因性のペルオキシダーゼの活性をブロックするために３％の過酸化水素を含むメタノール液で処理した。次いで、切片を、ｐ５３に対する一次抗体のＤＯ７（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 社 ニューカッスル、ＵＫ）、ＭＤＭ２に対する一次抗体のＭ４３０８（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社、セント・ルイス、ＭＯ）、ｐ２１に対する一次抗体の５５６４３０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、サンジェゴ、ＣＡ）とｃ−ｋｉｔに対する一次抗体ＣＤ１１７（Ｄａｋｏ Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ Ｇｌｏｓｔｒｕｐ社、Ｄｅｎｍａｒｋ）を、Ｄａｋｏ Ｒｅａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｓ２０２２で、ＤＯ７は１００分の１に、Ｍ４３０８は２００分の１に、５５６４３０は１００分の１に、ＣＤ１１７は４００分の１にそれぞれ希釈して室温で６０分間反応させた。次いで、免疫組織化学的染色法のキットＨＩＳＴＯＦＩＮＥ ＳＡＢ−ＰＯ（Ｍ）（登録商標：ニチレイ社）を使用して固定化した後、３，３−ジアミノベンジディン−ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−３，３’−ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｙｄｉｎｅ：ＤＢＡ）で免疫染色反応を行った。最後に、切片はＭｅｙｅｒ’ｓヘマトキシリンで染色し貼り付けた。乳癌と消化管間葉系腫瘍（ＧＩＳＴｓ）を、ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１とｃ−ｋｉｔのそれぞれのポジティブコントロールとして使用した。またネガティブコントロールとして、一次抗体を作用させないものを使用した。

免疫組織化学的染色法の評価
ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１とｃ−ｋｉｔの発現については、遺伝子発現レベルの部分的な違いからくる影響を小さくするためにほぼ同一とみなせる連続切片を使用し調べた。ｐ５３、ｐ２１の発現については、核に発色を認めた場合を陽性細胞とし、ＭＤＭ２とｃ−ｋｉｔの発現については、核、細胞質、又は細胞膜に発色を認めた場合を陽性細胞と判定した。ｐ５３、ＭＤＭ２、ｐ２１とｃ−ｋｉｔの発現状態は、腫瘍細胞において陽性細胞の割合から、０−１９％の発現ありの場合：陰性、２０−５０％の発現ありの場合：中間、５０％以上発現ありの場合：陽性と、３つの基準でスコア化した。

統計解析
統計解析は、市販のソフトウェア（ＳｔａｔＭａｔｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ， ＡＴＭＳ社）を使用して行った。免疫組織化学的結果は、腫瘍と正常の細胞間でＧテストにより計算した。全てのテストでＰ値が５％以下の場合を有意差ありとした。

結果
表４に、ＭＤＭ２、ｐ５３、ｐ２１とｃ−ｋｉｔの発現の結果を示し、表５に、ＭＤＭ２、ｐ５３、ｐ２１およびｃ−ｋｉｔ遺伝子の発現について、ＡＣＣと正常唾液腺部との比較を示した。ｐ５３の発現は、１５例で確認され、ｐ２１の発現は９例のみであり、ＭＤＭ２は全ての例で認められた。実施例２で、ＭＤＭ２遺伝子の高レベル増加の見られた患者Ｎｏ．１と２は、２例ともＭＤＭ２の発色は強く、ｐ２１やｐ５３の発現は見られなかった（図２、図３）。また、ｃ−ｋｉｔは、１５例で強く発現し、６例で中間の発現であった。４つの正常な唾液腺では、ＭＤＭ２、ｐ５３の発現がなくｃ−ｋｉｔやｐ２１の中間的な発現を有した。統計的な有意差検定は、Ｐ値で示した。正常唾液腺に比べＡＣＣではＭＤＭ２、ｃ−ｋｉｔ、ｐ−５３の遺伝子は、有意に高発現していた（ＭＤＭ２では、ｐ＝０．０００４１、ｐ５３では、ｐ＝０．００１３３９、ｃ−ｋｉｔでは、ｐ＝０．０１８４９）、一方ｐ２１の発現は正常対照と有意な差はみられなかった。

正常での発現は、ＭＤＭ２遺伝子、ｐ５３遺伝子が陰性、ｐ２１遺伝子とｃ−ｋｉｔ遺伝子が中間的発現と考えられる。ＭＤＭ２遺伝子の過剰発現が、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３の機能不全を招き、その結果として細胞増殖メカニズム経路上でｐ５３遺伝子の下流に位置するｐ２１を抑制していると考えられるケースが、全体の３３％（７／２１）にみられた。これらのケースは、抗ＭＤＭ２薬剤により、ｐ５３機能不全が解除され、予後が高度に延長されることが期待できる。また、ＡＣＣ全例でＭＤＭ２遺伝子発現がみられることより、ＡＣＣは全例に、抗ＭＤＭ２薬剤の効果が期待できる。同様にＡＣＣでは７１％（１５／２１）でｃ−ｋｉｔの高発現がみられ、それら症例には抗ｃ−ｋｉｔ効果のある薬剤治療が予後延長をもたらすことが期待できる。なお、ＭＤＭ２遺伝子、ｐ５３遺伝子がともに高発現していた症例は、２例（Ｎｏ．１５、１６）でいずれも死亡しており、予後不良型と推定できる。

特定の染色体領域や遺伝子のＤＮＡコピー数の増減、あるいは特定遺伝子の発現状態を検出することにより、ＡＣＣの悪性度を検出することができる。さらにまた、薬剤治療適応性の判定により、抗ＭＤＭ２薬剤や抗ｃ−ｋｉｔ薬剤に関して、ＡＣＣ患者に対する有効性の判断ができる。

ＡＣＣサンプルにおけるｃ−ＣＧＨ法による染色体異常を示す図である。増加は染色体イデオグラムの右側に、減少は左側に示す。増幅領域は、グレイラインで点描して示す。 染色体１２番目におけるＭＤＭ２増幅と、ＡＣＣの篩状タイプにおける免疫組織化学的分析を示す図である。（Ａ）染色体１２番目以外に異常がないｃ−ＣＧＨ法の結果を示す。（Ｂ）ＭＤＭ２遺伝子、ＲＡＰ１Ｂ遺伝子、ＮＵＰ１０７遺伝子を含む染色体１２ｑ１４．３−１５領域のａ−ＣＧＨ法の結果を示す。（Ｃ）免疫組織化学的染色によるｐ５３の非染色（＜２０％）を示す。（Ｄ）免疫組織化学的染色によるＭＤＭ２の強い染色（＞５０％）を示す。（Ｅ）免疫組織化学的染色によるｐ２１の非染色（＜２０％）を示す。（Ｆ）免疫組織化学的染色によるｃ−ｋｉｔの強い染色（＞５０％）を示す。 染色体１２番目におけるＭＤＭ２増幅と、ＡＣＣの固形タイプにおける免疫組織化学的分析を示す図である。（Ｇ）染色体１２番目で、ｑ２２−２４．３に減少が認められるｃ−ＣＧＨ法の結果を示す。（Ｈ）ＭＤＭ２遺伝子、ＲＡＰ１Ｂ遺伝子、ＮＵＰ１０７遺伝子を含む染色体１２ｑ１４．３−１５領域のａ−ＣＧＨ法の結果を示す。（Ｉ）免疫組織化学的染色によるｐ５３の非染色（０％）を示す。（Ｊ）免疫組織化学的染色によるＭＤＭ２の強い染色（＞５０％）を示す。（Ｋ）免疫組織化学的染色によるｐ２１の非染色（０％）を示す。（Ｌ）免疫組織化学的染色によるｃ−ｋｉｔの強い染色（＞５０％）を示す。

Claims (8)

1. 被験者由来の組織細胞における遺伝子、及び／又は染色体の異常を検出することを特徴とする、ＡＣＣの悪性度、及び薬剤治療適応性を判定する、ＡＣＣ亜分類の検出方法。
2. 被験者由来の組織細胞における遺伝子の異常が、ＡＭＹ２Ａ遺伝子、ＧＯＮ４Ｌ遺伝子、ＤＳＴ遺伝子、ＲＵＮＸ２遺伝子、ＴＦＡＰ２Ｂ遺伝子、ＴＲＥＭ１遺伝子、ＴＲＥＭＬ３遺伝子、ＴＲＥＭＬ４遺伝子、Ｃ６ｏｒｆ１２９遺伝子、ＨＬＡ−２１遺伝子、ＨＣＧ４Ｐ５遺伝子、ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＢＴＮ３Ａ１遺伝子、ＢＴＮ２Ａ３遺伝子、ＢＴＮ３Ａ３遺伝子、ＤＯＣＫ８遺伝子、ＡＮＫＲＤ１５遺伝子、ＡＢＬ１遺伝子、ＭＤＭ２遺伝子、ＲＡＰ１Ｂ遺伝子、ＮＵＰ１０７遺伝子、ＳＬＣ３５Ｅ３遺伝子、ＣＰＭ遺伝子、ＳＹＮ３遺伝子、ＴＩＭＰ３遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ３Ｆ遺伝子、ＧＡＧＥ８遺伝子、ＧＡＧＥ４遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子のＤＮＡコピー数の増加、及び／又はＥＳＲ１遺伝子、ＭＡＳ１遺伝子、ＲＰＳ６ＫＡ２遺伝子、ＭＬＬＴ４遺伝子、Ｃ６ｏｒｆ５４遺伝子、ＴＨＢＳ２遺伝子、ＦＡＭ９０Ａ６Ｐ遺伝子、ＦＡＭ９０Ａ７遺伝子、ＯＣＡ２遺伝子、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１遺伝子、ＺＮＦ４４７遺伝子、ＺＮＦ３２９遺伝子、ＳＴＡＧ２遺伝子から選ばれる１種以上の遺伝子のＤＮＡコピー数の減少であって、統計学的に正常細胞のコピー数と比較解析することを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
3. 被験者由来の組織細胞における染色体の異常が、ＡＦＭ２９８ＷＥ１，ＳＨＧＣ１５５２８９、ＲＨ１０３８９７、ＳＨＧＣ−１０７６１８、ＳＴＣＢ４４Ｈ３Ｂで示される染色体領域から選ばれる１箇所以上の染色体領域のコピー数の増加、及び／又はＳＨＧＣ−１４８９９８、ＳＨＧＣ−１４２６０１、ＳＨＧＣ−１００９２９、ＳＨＧＣ−１３０５９６で示される染色体領域から選ばれる１箇所以上の染色体領域のＤＮＡコピー数の減少であって、統計学的に正常細胞のコピー数と比較解析することを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
4. 被験者由来の組織細胞における染色体の異常が、請求項２に記載の遺伝子、及び／又は請求項３に記載の染色体領域を含む下記染色体の異常であって、１ｐ２１領域、１ｑ２２領域、６ｐ１２−２２領域、９ｐ２４領域、９ｑ３４領域、１２ｑ１５領域、２０ｑ１３領域、２２ｑ１２−１３領域、Ｘｐ１１領域から選ばれる１箇所以上の染色体領域におけるＤＮＡコピー数の増加、及び／又は６ｑ２５−２７領域、８ｐ２３領域、１０ｑ２６領域、１５ｑ１２−１３領域、１７ｐ１３領域、１９ｑ１３領域、Ｘｑ２３領域、Ｘｑ２５領域から選ばれる１箇所以上の染色体領域におけるＤＮＡコピー数の減少を、統計学的に正常細胞のコピー数と比較解析することを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
5. 被験者由来の組織細胞における遺伝子の異常が、ＭＤＭ２遺伝子、ｐ５３遺伝子、ｐ２１遺伝子、及びｃ−ｋｉｔ遺伝子の発現状態であって、前記４つ遺伝子の発現状態を、統計学的に正常細胞における前期４つの遺伝子の発現状態と比較解析することを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
6. 被験者由来の組織細胞における遺伝子、又は染色体の異常を、該組織細胞を材料として、染色体ＣＧＨ（ｃ−ＣＧＨ）法、ＢＡＣアレイＣＧＨ（ａ−ＣＧＨ）法、及び免疫組織化学的手法から選ばれる方法によって測定することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の検出方法。
7. ＡＣＣの薬剤治療適応性が、チロシンキナーゼ活性阻害作用を有する抗ＭＤＭ２薬および抗ｃ−ｋｉｔ薬に対するものであって、ＭＤＭ２遺伝子、ＡＢＬ１遺伝子のＤＮＡコピー数の異常、またはＭＤＭ２遺伝子、ｃ−ｋｉｔ遺伝子の発現状態を、統計学的に正常細胞と比較解析して薬剤選択の指標とすることを特徴とする、請求項１に記載の検出方法。
8. チロシンキナーゼ活性阻害物質が、トラスツズマブ、イマニチブ、ヌトリン、ベバシズマブである請求項７に記載の検出方法。

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