WO2012000791A2 - Diagnostic for localizing a diseased tissue - Google Patents

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WO2012000791A2
WO2012000791A2 PCT/EP2011/059924 EP2011059924W WO2012000791A2 WO 2012000791 A2 WO2012000791 A2 WO 2012000791A2 EP 2011059924 W EP2011059924 W EP 2011059924W WO 2012000791 A2 WO2012000791 A2 WO 2012000791A2
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aptamer
peptide
diseased tissue
agent
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Hartmuth C. Kolb
Ursus KRÜGER
Oliver Lade
Arno Steckenborn
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Siemens Aktiengesellschaft
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    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody

Definitions

  • the invention relates to a diagnostic for the localization of a diseased tissue and a biomolecule for the production of such a diagnostic agent.
  • biochemical analyzes of blood, other body fluids and tissue samples are used to characterize diseases. It examines the presence and amount of molecules that are typical of a particular disease. In addition to foreign substances, the body's own substances are detected, which are formed, for example, only in the event of infection by viruses or bacteria.
  • tumor cells often form large amounts of certain proteins, particularly cellular Vietnamese Nos., IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, IL-12, etc.
  • Many of the proteins that are made specifically from diseased cells are surface molecules that are anchored in the membrane which he ⁇ diseased cells. These surface molecules can be detected by appropriate diagnostic methods. For this purpose, usually cells from tissue or blood samples are examined with antibodies that bind to specific, specific for a disease surface molecules.
  • Such in vitro studies can diagnose the presence of a disease. But it is not possible to determine the exact location of the diseased tissue. For this purpose, imaging techniques such as X-ray, ultrasound, and nuclear spin tomography are typically used. In particular, ectopic cell aggregates, such as tumors, or swellings of individual organs can be located with them. However, does a diseased tissue show no marked morphological abnormalities, or is it relatively small, it can easily be overlooked in traditional studies.
  • the invention is therefore based on the object of providing a diagnostic kit with which a diseased tissue can be detected specifically and independently of its size.
  • a diagnostic for the localization of a diseased tissue comprising an agent A and an agent B.
  • Agent A has a complex comprising an aptamer and a linking molecule
  • Agent B has a biomolecule.
  • diagnostic refers to medicines that are used to detect, identify, and / or locate diseases in a patient's body.
  • the most important applications of the diagnostic agent according to the invention are in oncology, cardiology and neuro ⁇ logy.
  • Conventional radiological diagnostics contain ge ⁇ ′lich gamma- or beta-emitting nuclides, for example Xenon 133, "technetium, gallium 68, or 18 fluorine.
  • radionuclides are typically about chelating agents like diethylene triamine pentaacetate (DTPA), 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid (DOTA) or ethylenediaminetetraacetate (EDTA) to mono- or polysaccharides, so-called tracers.
  • DTPA diethylene triamine pentaacetate
  • DOTA 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid
  • EDTA ethylenediaminetetraacetate
  • the nuclides are, depending on the nature of their radiation, by means of scintigraphy, single photon emission computed tomography (SPECT) or positron emission tomography (PET) is detected. Because of their non-physiological component parts ⁇ conventional radionuclide-containing diagnostic JE but side effects such as anaphylactic or allergic re ⁇ actions that cause a patient's body.
  • the diagnostic agent of the invention comprises two separated ge ⁇ agents, agent A and agent B.
  • agent A comprises a molecule which binds to the diseased tissue and is present as a com plex with ⁇ a connecting molecule. This complex can be designed in particular as a conjugate.
  • the agent B in turn has a radioactively labeled biomolecule. In this way, both functions are separated, and the molecules ⁇ le, according to their respective function, can be optimally selected. Both agents can simultaneously administered to the patient, however, preferably one after the ⁇ .
  • aptamer refers to short, single-stranded nucleic lein Textre oligomers that can accommodate both RNA and DNA molecules to ⁇ . Depending on their respective sequence aptamers form diverse structures and bind to Zielmo ⁇ leküle of various classes. This results in a specific structural compatibility between an aptamer and its target molecule, similar to antigen-antibody binding.
  • the structural compatibility of the molecules via electrostatic interactions, ionic Bin ⁇ compounds, van der Waals interactions, hydrogen bonds and so-called. stacking interactions between the aromatic rings of the bases of nucleic acids.
  • Aptamers that bind to a specific target molecule are identified and produced by in vitro selection and amplification techniques known as SELEX processes (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment).
  • Aptamers comprise regularly 8-220 nucleic ⁇ otide, preferably 20 to 60 nucleotides. However, it is also possible to use aptamers with up to 500 nucleotides. They can be produced synthetically or obtained by enzymatic degradation of genomic DNA (Kulbachinskiy AV, 2007).
  • aptamers can be identified that bind a specific Zielmole ⁇ kül. This can be both larger biomolecules, such as proteins, as well as to individual chemical ele ⁇ ments. In addition, aptamers bind almost all classes of substances, so that aptamers can also be identified that recognize and bind to specific protein modifications, such as fatty acid or sugar modifications.
  • Each cell carries on its surface, anchored in its cell membrane, a multitude of different molecules, most of which belong to the class of proteins. Besides Mole ⁇ cules with basic biological functions that are found in almost every cell, many molecules only by cells of a particular tissue or a particular cell type can be expressed. In addition, cells that are infested with pathogens or have impaired cell functions, such as tumor cells, form their own molecules. Many of these disease-specific molecules are membrane bound and Queen ⁇ NEN be detected on the surface of the respective cell. By choosing an aptamer, with one, for one Morbid tissue characterizing molecule interacts, the detective ⁇ ter det specific to the diseased tissue.
  • the aptamer is selected so that the bond between the aptamer and the target molecule is a linear chalient Koef-, so-called.
  • KD value of ⁇ 100 nM, preferably ⁇ 10 nM, most preferably of 7.5 nM having. With such an aptamer even a few cells of a diseased tissue can be specifically detected.
  • diseased tissue refers to cells, parts of organs or whole organs that do not or not fully fulfill their physiological function. These include, for example, viruses or bacteria infected cells, hypertrophic tissue, inflamed tissue and organs, hyperplasti ⁇ MOORISH and neoplastic tissue, such as ulcers, tumors and cancers. Diseased cells often form proteins whose expression is indicative of a particular disease, for example, because they are derived from the genetic material of a virus or bacterium. When these molecules are cell surface molecules, they are anchored to the cell membrane. By specifically binding a surface molecule of a diseased tissue, the aptamer enables a reliable localization of this tissue.
  • linking molecule includes chemical Verbindun ⁇ gen suitable ren to interagie- with a biomolecule. It is due to chemical interactions between the linker molecule and the biomolecule to form a stable binding of the two molecules, similar to an antigen-antibody Interaction.
  • short-chain peptides, sugar compounds and chemical at ⁇ particular natural compounds, as well as aptamers are therefore geeig ⁇ net as the compound molecules.
  • compound molecules are advantageous, which consist of body-like components are built so that they can be metabolized by endogenous mechanisms.
  • biomolecule includes molecules of biological origin or are made up of natural ingredients and have the ability to specifically interact with other Mole ⁇ cules and retain them.
  • the biomolecule is chosen so that it binds to the complex of agent A, without interacting with other molecules. It is preferred that the biomolecule binds to the compound molecule. This is chosen so that it is not similar to any other common molecule in a patient's body. The biomolecule binds then only the connection molecule, so that a strong positive signal arises with at the same time low background signals.
  • the organic ⁇ molecule is chosen so that the bond between the organic ⁇ molecule and the target molecule is a linear coefficient called. KD value of ⁇ 100 nM, preferably ⁇ 10 nM, most be ⁇ vorzugt of 7, 5 nM.
  • the biomolecule binds to the complexes of the agent A, which are attached to the diseased tissue and serves to determine the Positi ⁇ on these complexes or the diseased tissue.
  • the detection of the biomolecule takes place via its radio ⁇ active marker with an 11 C carbon atom.
  • positrons also referred to as ⁇ + radiation, are formed. If the positrons hit an electron, they form two photons, which move away from each other at an angle of 180 °, ie exactly in the opposite direction. The photons can be detected and used to calculate the position of the positron emission, or of the 11 C carbon atom.
  • An advantage of the use of an aptamer, and a d e ⁇ labeled biomolecule is that both are composed of responsibilitiesei ⁇ antigenic components, namely nucleic acids and amino acids, whereby they are compatible to the organism. Both the aptamer and the biomolecule and its individual nucleic acids or amino acids are non-toxic, they can naturally metabolized, degraded and are ⁇ eliminated. By using an integrated X1 C carbon atom, it is also possible to prevent a ra- 1
  • diooxider impurity such as fluorine, xenon, or 68 gallium
  • diooxider impurity such as fluorine, xenon, or 68 gallium
  • carbon is an element that occurs in the body and can naturally be metabolised.
  • Another advantage of the diagnostic is the favorable signal / background ratio during detection.
  • the agent A After the agent A has been administered to the patient, the ent ⁇ contained complexes are distributed in the body and bind by the binding specificity of the aptamer to the diseased tissue. Free, unbound complexes, on the other hand, are rapidly metabolised and excreted from the organism because they can be degraded by endogenous enzymes.
  • the patient is administered the agent B, which binds extremely selek ⁇ tively and with high binding specificity to the complex. This causes a non-specific attachment in the body of the prevents patients, and there is a strong and specifi ⁇ cal signal at the position of the diseased tissue, whereas the background signal is minimized.
  • the distribution of biomolecules by high selectivity Particularly efficiently so that the time between Verabrei ⁇ chen of the agent B and the detection can be shortened. Both result in that the dose of agent B can be minimized and the radiation exposure for the patient is reduced.
  • the biomolecule With a particularly high affinity and specificity of the biomolecule for the complex of agent A, the biomolecule can be chosen to be metabolized faster than the complex. In this case, both agents can be administered at extremely short intervals or optionally simultaneously.
  • the biomolecule is selected from the group consisting of peptides, aptamers and micro-antibodies. These biomolecules are all made up of body-like components, such as nucleic acids or amino acids, and are therefore particularly well tolerated by the patient.
  • the biomolecule is a peptide and the 11 C carbon atom is the carbonyl carbon atom of one of the amino acids.
  • the carbonyl groups are part of the peptide bonds between the amino acids and are located inside the peptide. This ensures that the 11 C-carbon atom is not cleaved by the peptide from ⁇ how it would be possible for example in a side chain of the amino acids.
  • the 11 C carbon atom is the carbonyl carbon atom of the N-terminal amino acid of the peptide.
  • This embodiment is particularly preferred because the peptide can be used directly after the on ⁇ bring the 11 C-labeled amino acid.
  • 11 C-carbon has a half-life of only about 20 Minu ⁇ th, so that the radiation dose must be chosen the higher, the more time is between the synthesis of the peptide and its ⁇ ner use. If the 11 C-labeling with the N-terminal amino acid and thus in the last step of the synthesis is applied, the peptide can be used immediately after its synthesis.
  • the peptide has at least one D-amino acid.
  • D-amino acid With the exception of glycine, all amino acids have a chiral center at their alpha carbon atom and can therefore exist as configurational isomers, namely as the D or L amino acid. Endogenous peptides and proteins are largely out
  • a further possibility for influencing the pharmacological clearance of the peptide consists of replacing individual amino acids of the peptide with non-natural amino acids having similar chemical properties.
  • the non-natural amino acids are metabolized more slowly because the body's own proteolytic enzymes are specially adapted to the degradation of natural amino acids.
  • the non-natural amino acids should be chosen so that the binding affinity of the peptide is not altered.
  • other chemical Mo ⁇ dtechniken individual amino acids of the peptide are possible to influence the half-life of the peptide specifically.
  • the terminal amino group of the peptide may be replaced by an isonitrile group. Such modes ⁇ fication reduces, mediated by the amino group, in ⁇ ter syndrome with proteolytic enzymes without altering the bond between the peptide and the complex.
  • the biomolecule is an aptamer and the amino acid is coupled via a peptide bond to a free amino group of a nucleotide of the aptamer.
  • the labeling of the aptamer with an 11 C carbon atom via an amino acid is particularly advantageous because it does not require the use of any of the conventional complexing agents, such as DTPA or DOTA.
  • the resulting complex of aptamer and amino acid comprises endogenous Mole ⁇ molecules, whereby it is particularly compatible with the organism. Both the aptamer and its individual nucleic acids, and the amino acid are non-toxic, they can natuer metabolized ⁇ Lich, be broken down and excreted.
  • Another object of the invention is the use of a biomolecule for the preparation of a diagnostic agent for the detection of a diseased tissue.
  • the biomolecule binds to a complex comprising an aptamer and a dacasmo ⁇ lekül and the aptamer to the diseased tissue (18) binds the biomolecule is suitable, even a few cells ei ⁇ nes diseased tissue in a patient's body to locate. Characterized in that the biomolecule has an amino acid with egg nem ⁇ ⁇ C-carbon atom, it may be PET detek- advantage.
  • PET is an established method for detecting the radiation of radioactive elements and determining their position (Massoud TF, Gambhir SS, 2003). With the aid of detector devices arranged annularly around the patient, sectional images are created on which the decay events are represented in their spatial distribution in the interior of the body. PET also makes it possible to determine the amount of labeled Mo ⁇ lekülen quantitatively in a tissue.
  • the biomolecule is selected from the group consisting of peptides, aptamers and micro-antibodies. These molecules are built up from body-like components and are therefore particularly well tolerated by the patient.
  • the biomolecule is a peptide and the 11 C carbon atom is the carbonyl carbon atom of one of the amino acids, preferably the N-terminal amino acid of the peptide.
  • the biomolecule is an aptamer and the amino acid is linked to the aptamer via a peptide bond with a free amino group of a nucleotide.
  • Also disclosed is a method of localizing diseased tissue in an organism comprising the steps of: a) administering to the organism an agent A comprising a complex or conjugate comprising an aptamer and a linking molecule, b) administering an agent B with a biomolecule, the bin to the complex or conjugate ⁇ det, to the organism, and c) detecting the biomolecule in the organism by means of positron emission tomography
  • the aptamer binds to the diseased tissue and the biomolecule has one amino acid
  • the diagnostic agent according to the invention is therefore ideal for monitoring the course and success of a treatment, so-called therapy monitoring.
  • FIG. 1 shows schematically a complex of an aptamer 6 4 and a linker molecule 5 to which a biomolecule 1, NaEM ⁇ Lich a peptide is attached.
  • the complex 6 is bound to a pathological tissue 18.
  • Peptide 1 comprises 8
  • Amino acids 2 of which the N-terminal amino acid 3 is radiolabeled with ei ⁇ nem 11 C carbon atom.
  • the radioactive label is represented by an asterisk (*).
  • the specific binding affinity between the complex 6 and the diseased tissue 18 is due to the chemical interactions between the aptamer 4 and the surface of the diseased tissue 18. These interactions are determined by the nucleic acid sequence of aptamer 4.
  • an aptamer 4 is identified that interacts with a surface molecule of the diseased tissue ⁇ bes 18th Subsequently, the aptamer 4 is coupled to a linker molecule 5 which is adapted to be bound by egg ⁇ nem peptide 1 extremely selectively and with high affinity.
  • Peptide 1 which has an 11 C-labeled amino acid 3, is used to produce an agent B. Peptide 1 can then by the decay of the 11 C-carbon atom toge ⁇ positron surrounded by positron emission tomography (PET) can be detected. The location of the positron emission corresponding to the location of Complex 6, and therefore that of the sick ⁇ exemplary fabric 18, to which the complex is bound. 6
  • agent B is administered to the patient.
  • the peptides 1 bind rapidly to the complex plexes 6 because they do not interact with other molecules in the patient's body. In this way, they accumulate on the cells of the diseased tissue 18. This accumulation becomes visible in a positron emission tomography (PET), so that the distribution of the complex 6 or the position of the diseased tissue 18 in the body of the patient are determined can.
  • PET positron emission tomography
  • FIG. 2 shows a schematic illustration (greatly simplified according to Faller A, Schünke M, The body of man,
  • the circulation system 10 includes various organs schematically represented, such as the lungs 12, heart 13, liver 14, 15 intestine and kidney 16 and the main wires 11 which these organs ver ⁇ bind. Left of center of the circulatory system 10 is additionally ⁇ a diseased tissue 18, for example, a tumor or an inflammation, shown, are attached to the already Komple ⁇ xe. 6
  • the peptide 1 is represented by triangles, ent ⁇ long of the veins 11 and bound to the complexes 6 on the diseased tissue 18 shown.
  • the degradation products 17 of the complex 6 and the peptide 1 are represented by individual lines within the outline of the kidney 16.
  • the distribution of the peptide 1 in the circulatory system 10 comprises four phases, which are listed along the top-down view.
  • Phase I Peptide 1 is injected into the circulatory system 10 of the organism.
  • Phase II is via the blood circulatory system 10 Peptide 1 in the organs 12, 13, 14, 15, and 16 of the body transported ⁇ advantage.
  • Phase III The circulating peptide 1 specifically binds to the complexes 6, which are already at the pathological tissue 18 ⁇ superimposed.
  • Phase IV Unbound peptide 1 is rapidly metabolised and enzymatically degraded.
  • the organism not failed ⁇ det between the body's own molecules and the peptide 1, because it is composed of amino acids 2, 3, corresponding to the stressesei ⁇ antigenic molecules.
  • the degradation products 17 of the peptide 1 and the amino acids 2, 3 accumulate predominantly in the kidney 16, from where they are excreted via the bladder and the ureter.
  • Massoud TF, Gambhir SS Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light; Genes Dev. 2003 Mar 1; 17 (5): 545-80.

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Abstract

There is described a diagnostic for localizing a diseased tissue (18), which diagnostic comprises an agent A with a complex (6) comprising an aptamer (4) and a linker molecule (5), and an agent B with a biomolecule (1) which binds to the complex (6). The aptamer (4) binds to the diseased tissue (18), and the biomolecule (1) includes an amino acid (2) with an 11C carbon atom. There is furthermore described the use of a biomolecule (1) for the preparation of such a diagnostic.

Description

Beschreibung description
Diagnostikum zur Lokalisation eines krankhaften Gewebes Die Erfindung betrifft ein Diagnostikum zur Lokalisation eines krankhaften Gewebes und ein Biomolekül zur Herstellung eines solchen Diagnostikums . The invention relates to a diagnostic for the localization of a diseased tissue and a biomolecule for the production of such a diagnostic agent.
In der modernen Diagnostik werden zur Charakterisierung von Krankheiten vor allem biochemische Analysen von Blut, anderen Körperflüssigkeiten und Gewebeproben eingesetzt. Dabei wird die Anwesenheit und Menge von Molekülen untersucht, die für eine bestimmte Krankheit typisch sind. Neben Fremdstoffen werden auch körpereigene Stoffe nachgewiesen, die beispiels- weise nur bei einer Infektion durch Viren oder Bakterien gebildet werden. Insbesondere Tumorzellen bilden häufig große Mengen bestimmter Proteine, insbesondere zelluläre Rezepto¬ ren, deren Expression für eine Tumorart spezifisch ist. Viele der Proteine, die speziell von krankhaften Zellen gebildet werden, sind Oberflächenmoleküle, die in der Membran der er¬ krankten Zellen verankert werden. Diese Oberflächenmoleküle können mit entsprechenden diagnostischen Verfahren nachgewiesen werden. Dazu werden üblicherweise Zellen aus Gewebe- oder Blutproben mit Antikörpern untersucht, die an bestimmte, für eine Krankheit spezifische Oberflächenmoleküle binden. Durch derartige in vitro Untersuchungen kann das Vorliegen einer Krankheit diagnostiziert werden. Es ist aber nicht möglich, auch den genauen Ort des erkrankten Gewebes festzustellen. Zu diesem Zweck werden in der Regel bildgebende Verfahren, wie beispielsweise Röntgen, Ultraschall und Kernspinntomographie verwendet. Mit ihnen lassen sich vor allem ektopische Zellansammlungen, wie etwa Tumore, oder Schwellungen einzelner Organe lokalisieren. Zeigt ein krankhaftes Gewebe jedoch keine deutlichen morphologischen Auffälligkeiten, oder ist es ver- hältnismäßig klein, kann es bei traditionellen Untersuchungen leicht übersehen werden. In modern diagnostics, biochemical analyzes of blood, other body fluids and tissue samples are used to characterize diseases. It examines the presence and amount of molecules that are typical of a particular disease. In addition to foreign substances, the body's own substances are detected, which are formed, for example, only in the event of infection by viruses or bacteria. In particular, tumor cells often form large amounts of certain proteins, particularly cellular Rezepto ¬ reindeer, whose expression is specific to a tumor type. Many of the proteins that are made specifically from diseased cells are surface molecules that are anchored in the membrane which he ¬ diseased cells. These surface molecules can be detected by appropriate diagnostic methods. For this purpose, usually cells from tissue or blood samples are examined with antibodies that bind to specific, specific for a disease surface molecules. Such in vitro studies can diagnose the presence of a disease. But it is not possible to determine the exact location of the diseased tissue. For this purpose, imaging techniques such as X-ray, ultrasound, and nuclear spin tomography are typically used. In particular, ectopic cell aggregates, such as tumors, or swellings of individual organs can be located with them. However, does a diseased tissue show no marked morphological abnormalities, or is it relatively small, it can easily be overlooked in traditional studies.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde ein Diagnosti- kum bereitzustellen, mit dem ein krankhaftes Gewebe spezifisch und unabhängig von seiner Größe detektiert werden kann. Diese Aufgabe wird durch ein Diagnostikum zur Lokalisation eines krankhaften Gewebes gelöst, das ein Agens A und ein Agens B umfasst. Das Agens A weist einen Komplex auf, der ein Aptamer und ein Verbindungsmolekül umfasst, und Agens B weist ein Biomolekül auf. Indem das Aptamer an das krankhafte Gewe¬ be bindet, das Biomolekül an den Komplex mit dem Aptamer bin¬ det und eine Aminosäure mit einem 11C-Kohlenstoffatom auf¬ weist, können selbst wenige Zellen eines krankhaften Gewebes an Hand des radioaktiven Signals des Diagnostikums lokali¬ siert werden. The invention is therefore based on the object of providing a diagnostic kit with which a diseased tissue can be detected specifically and independently of its size. This object is achieved by a diagnostic for the localization of a diseased tissue comprising an agent A and an agent B. Agent A has a complex comprising an aptamer and a linking molecule, and Agent B has a biomolecule. By the aptamer binds to the pathological tissue ¬ be, the biomolecule in the complex with the aptamer am ¬ det and has an amino acid with an 11 C-carbon atom ¬, few cells of a diseased tissue can even on hand of the radioactive signal of the diagnostic lokali ¬ be siert.
Der Begriff "Diagnostikum" bezeichnet Arzneimittel, die dazu verwendet werden um Krankheiten zu erkennen, zu identifizie- ren und/oder im Körper eines Patienten zu lokalisieren. Die wichtigsten Anwendungsgebiete des erfindungsgemäßen Diagnostikums sind dabei die Onkologie, Kardiologie und Neuro¬ logie. Herkömmliche radiologische Diagnostika enthalten ge¬ wöhnlich Gamma- bzw. Beta-Strahlen emittierende Nuklide, zum Beispiel 133Xenon, "Technetium, 68Gallium, oder 18Fluor. Diese Radionuklide werden üblicherweise über Komplexbildner wie Diethylentriaminpentaacetat (DTPA), 1, 4, 7, 10-tetraazacyclo- dodecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid (DOTA) oder Ethylendiamin- tetraacetat (EDTA) an Mono- oder Polysaccharide, sog. Tracer, gebunden. Die Nuklide werden, je nach der Art ihrer Strahlung, mittels Szintigraphie, Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) oder Positronen-Emissions-Tomographie (PET) detektiert. Aufgrund ihrer unphysiologischen Bestand¬ teile können herkömmliche Radionuklid-haltige Diagnostika je- doch Nebenwirkungen, wie anaphylaktische oder allergische Re¬ aktionen, im Körper eines Patienten verursachen. Bei herkömmlichen Diagnostika handelt es sich zudem häufig um große kom¬ plexe Moleküle, die mehreren Funktionen gerecht werden müs- sen. Sie müssen spezifisch an das nachzuweisende Gewebe bin¬ den und gleichzeitig über eine geeignete Markierung verfügen, um detektiert werden zu können. Deshalb müssen bei der Ges¬ taltung herkömmlicher radiologischer Diagnostika oft Kompromisse eingegangen werden, indem beispielsweise Chelatormole- küle verwendet werden um die radioaktive Markierung anzuhef¬ ten. Dabei kann aber die Struktur des Bindungsmoleküls beein- flusst werden, so dass die Bindungsspezifität verringert wird . The term "diagnostic" refers to medicines that are used to detect, identify, and / or locate diseases in a patient's body. The most important applications of the diagnostic agent according to the invention are in oncology, cardiology and neuro ¬ logy. Conventional radiological diagnostics contain ge ¬ wöhnlich gamma- or beta-emitting nuclides, for example Xenon 133, "technetium, gallium 68, or 18 fluorine. These radionuclides are typically about chelating agents like diethylene triamine pentaacetate (DTPA), 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid (DOTA) or ethylenediaminetetraacetate (EDTA) to mono- or polysaccharides, so-called tracers.The nuclides are, depending on the nature of their radiation, by means of scintigraphy, single photon emission computed tomography (SPECT) or positron emission tomography (PET) is detected. Because of their non-physiological component parts ¬ conventional radionuclide-containing diagnostic JE but side effects such as anaphylactic or allergic re ¬ actions that cause a patient's body. In conventional diagnostics are also often at great com ¬ plex molecules that meet multiple functions sen müs-. You must be specific to the detected tissue am ¬ and simultaneously have a suitable marker to be detected to. Therefore, in the Ges ¬ taltung conventional radiological diagnostics often compromises must be made, for example by Chelatormole- be used molecules to radiolabeling anzuhef ¬ th. But this case, the structure of the binding molecule can be influenced so that the binding specificity is reduced.
Das erfindungsgemäße Diagnostikum umfasst dagegen zwei ge¬ trennte Agenzien, Agens A und Agens B. Agens A umfasst ein Molekül, welches an das krankhafte Gewebe bindet und als Kom¬ plex mit einem Verbindungsmolekül vorliegt. Dieser Komplex kann insbesondere als Konjugat ausgebildet sein. Das Agens B wiederum weist ein radioaktiv markiertes Biomolekül auf. Auf diese Weise werden beide Funktionen getrennt, und die Molekü¬ le können, ihrer jeweiligen Funktion entsprechend, optimal ausgewählt werden. Beide Agenzien können dem Patienten gleichzeitig, bevorzugt jedoch nacheinander verabreicht wer¬ den . In contrast, the diagnostic agent of the invention comprises two separated ge ¬ agents, agent A and agent B. agent A comprises a molecule which binds to the diseased tissue and is present as a com plex with ¬ a connecting molecule. This complex can be designed in particular as a conjugate. The agent B in turn has a radioactively labeled biomolecule. In this way, both functions are separated, and the molecules ¬ le, according to their respective function, can be optimally selected. Both agents can simultaneously administered to the patient, however, preferably one after the ¬.
Der Begriff "Aptamer" bezeichnet kurze, einzelsträngige Nuk- leinsäure-Oligomere, die sowohl RNA als auch DNA Moleküle um¬ fassen können. In Abhängigkeit von ihrer jeweiligen Sequenz bilden Aptamere vielfältige Strukturen und binden an Zielmo¬ leküle der verschiedensten Stoffklassen . Dabei kommt es zu einer spezifischen Strukturkompatibilität zwischen einem Aptamer und seinem Zielmolekül, ähnlich einer Antigen- Antikörper-Bindung . Die Strukturkompatibilität der Moleküle erfolgt über elektrostatische Wechselwirkungen, ionische Bin¬ dungen, van-der-Waals Wechselwirkungen, Wasserstoffbrücken und sog. Stacking Interactions zwischen den aromatischen Ringen der Basen der Nukleinsäuren. Aptamere, die ein bestimmtes Zielmolekül binden werden durch in vitro Selektionsverfahren und Amplifikationstechniken, sog. SELEX-Prozesse (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) identifiziert und produziert. Aptamere umfassen regelmäßig 8 bis 220 Nukle¬ otide, vorzugsweise 20 bis 60 Nukleotide. Es können aber auch Aptamere mit bis zu 500 Nukleotiden verwendet werden. Sie können synthetisch hergestellt oder durch enzymatischen Abbau genomischer DNA gewonnen werden (Kulbachinskiy AV, 2007) . The term "aptamer" refers to short, single-stranded nucleic leinsäure oligomers that can accommodate both RNA and DNA molecules to ¬. Depending on their respective sequence aptamers form diverse structures and bind to Zielmo ¬ leküle of various classes. This results in a specific structural compatibility between an aptamer and its target molecule, similar to antigen-antibody binding. The structural compatibility of the molecules via electrostatic interactions, ionic Bin ¬ compounds, van der Waals interactions, hydrogen bonds and so-called. stacking interactions between the aromatic rings of the bases of nucleic acids. Aptamers that bind to a specific target molecule are identified and produced by in vitro selection and amplification techniques known as SELEX processes (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Aptamers comprise regularly 8-220 nucleic ¬ otide, preferably 20 to 60 nucleotides. However, it is also possible to use aptamers with up to 500 nucleotides. They can be produced synthetically or obtained by enzymatic degradation of genomic DNA (Kulbachinskiy AV, 2007).
Unter Verwendung umfangreicher Aptamer-Bibliotheken können Aptamere identifiziert werden, die ein spezifisches Zielmole¬ kül binden. Dabei kann es sich sowohl um größere Biomoleküle, beispielsweise Proteine, als auch um einzelne chemische Ele¬ mente handeln. Darüber hinaus binden Aptamere nahezu alle Stoffklassen, so dass auch Aptamere identifiziert werden kön- nen, die spezielle Proteinmodifikationen, wie beispielsweise Fettsäure- oder Zuckermodifikationen erkennen und binden. Using extensive aptamer libraries aptamers can be identified that bind a specific Zielmole ¬ kül. This can be both larger biomolecules, such as proteins, as well as to individual chemical ele ¬ ments. In addition, aptamers bind almost all classes of substances, so that aptamers can also be identified that recognize and bind to specific protein modifications, such as fatty acid or sugar modifications.
Jede Zelle trägt auf ihrer Oberfläche, verankert in ihrer Zellmembran, eine Vielzahl unterschiedlicher Moleküle, wobei die meisten zur Stoffklasse der Proteine gehören. Neben Mole¬ külen mit grundlegenden biologischen Funktionen, die in nahezu jeder Zelle vorkommen, werden viele Moleküle nur von Zellen eines bestimmten Gewebes oder eines bestimmten Zelltyps exprimiert. Außerdem bilden Zellen, die von Krankheitserre- gern befallen sind oder gestörte Zellfunktionen aufweisen, wie beispielsweise Tumorzellen, eigene Moleküle. Viele dieser krankheitsspezifischen Moleküle sind membranständig und kön¬ nen auf der Oberfläche der jeweiligen Zelle nachgewiesen werden. Indem ein Aptamer gewählt wird, das mit einem, für ein krankhaftes Gewebe kennzeichnenden, Molekül interagiert, bin¬ det das Aptamer spezifisch an das krankhafte Gewebe. Vorzugs¬ weise wird das Aptamer dabei so gewählt, dass die Bindung zwischen dem Aptamer und dem Zielmolekül einen linearen Koef- fizient, sog. kD-Wert, von < 100 nM, bevorzugt von < 10 nM, am meisten bevorzugt von 7,5 nM aufweist. Mit einem solchen Aptamer können selbst wenige Zellen eines krankhaften Gewebes spezifisch nachgewiesen werden. Each cell carries on its surface, anchored in its cell membrane, a multitude of different molecules, most of which belong to the class of proteins. Besides Mole ¬ cules with basic biological functions that are found in almost every cell, many molecules only by cells of a particular tissue or a particular cell type can be expressed. In addition, cells that are infested with pathogens or have impaired cell functions, such as tumor cells, form their own molecules. Many of these disease-specific molecules are membrane bound and Queen ¬ NEN be detected on the surface of the respective cell. By choosing an aptamer, with one, for one Morbid tissue characterizing molecule interacts, the detective ¬ter det specific to the diseased tissue. Preference ¬ example the aptamer is selected so that the bond between the aptamer and the target molecule is a linear fizient Koef-, so-called. KD value of <100 nM, preferably <10 nM, most preferably of 7.5 nM having. With such an aptamer even a few cells of a diseased tissue can be specifically detected.
Der Begriff "krankhaftes Gewebe" bezeichnet Zellen, Teile von Organen oder ganze Organe, die ihre physiologische Funktion nicht oder nicht in vollem Umfand erfüllen. Dazu zählen beispielsweise mit Viren oder Bakterien infizierte Zellen, hypertrophes Gewebe, entzündete Gewebe und Organe, hyperplasti¬ sches und neoplastisches Gewebe, etwa Geschwüre, Tumore und Karzinome. Krankhafte Zellen bilden häufig Proteine, deren Expression für eine bestimmte Erkrankung kennzeichnend ist, beispielsweise weil sie vom genetischen Material eines Virus oder eines Bakteriums abstammen. Handelt es sich bei diesen Molekülen um Zelloberflächenmoleküle, werden sie auf der Zellmembran verankert. Indem das Aptamer speziell ein Oberflächenmolekül eines krankhaften Gewebes bindet, ermöglicht es eine zuverlässige Lokalisation dieses Gewebes. Der Begriff "Verbindungsmolekül" umfasst chemische Verbindun¬ gen, die geeignet sind um mit einem Biomolekül zu interagie- ren. Dabei kommt es auf Grund von chemischen Wechselwirkungen zwischen dem Verbindungsmolekül und dem Biomolekül zu einer stabilen Bindung der beiden Moleküle, ähnlich einer Antigen- Antikörper Interaktion. Als Verbindungsmoleküle sind daher insbesondere kurzkettige Peptide, Zuckerverbindungen und an¬ dere natürliche chemische Verbindungen sowie Aptamere geeig¬ net. Für eine gute Verträglichkeit des Diagnostikums sind vor allem Verbindungsmoleküle vorteilhaft, die aus körperähnli- chen Bestandteilen aufgebaut sind, so dass sie durch endogene Mechanismen verstoffwechselt werden können. The term "diseased tissue" refers to cells, parts of organs or whole organs that do not or not fully fulfill their physiological function. These include, for example, viruses or bacteria infected cells, hypertrophic tissue, inflamed tissue and organs, hyperplasti ¬ MOORISH and neoplastic tissue, such as ulcers, tumors and cancers. Diseased cells often form proteins whose expression is indicative of a particular disease, for example, because they are derived from the genetic material of a virus or bacterium. When these molecules are cell surface molecules, they are anchored to the cell membrane. By specifically binding a surface molecule of a diseased tissue, the aptamer enables a reliable localization of this tissue. The term "joining molecule" includes chemical Verbindun ¬ gen suitable ren to interagie- with a biomolecule. It is due to chemical interactions between the linker molecule and the biomolecule to form a stable binding of the two molecules, similar to an antigen-antibody Interaction. In particular short-chain peptides, sugar compounds and chemical at ¬ particular natural compounds, as well as aptamers are therefore geeig ¬ net as the compound molecules. For a good compatibility of the diagnostic agent, especially compound molecules are advantageous, which consist of body-like components are built so that they can be metabolized by endogenous mechanisms.
Der Begriff "Biomolekül" umfasst Moleküle, die biologischen Ursprungs sind oder aus natürlichen Bestandteilen aufgebaut sind und die Fähigkeit besitzen, spezifisch mit anderen Mole¬ külen zu interagieren und an diese zu binden. Das Biomolekül wird dabei so gewählt, dass es an den Komplex des Agens A bindet, ohne mit anderen Molekülen zu interagieren. Bevorzugt wird dabei, dass das Biomolekül an das Verbindungsmolekül bindet. Dieses wird so gewählt, dass es keinem anderen, im Körper eines Patienten häufig vorkommenden, Molekül ähnlich ist. Das Biomolekül bindet dann nur das Verbindungsmolekül, so dass ein starkes positives Signal bei gleichzeitig gerin- gen Hintergrundsignalen entsteht. Vorzugsweise wird das Bio¬ molekül dabei so gewählt, dass die Bindung zwischen dem Bio¬ molekül und dem Zielmolekül einen linearen Koeffizient, sog. kD-Wert, von < 100 nM, bevorzugt von < 10 nM, am meisten be¬ vorzugt von 7,5 nM aufweist. The term "biomolecule" includes molecules of biological origin or are made up of natural ingredients and have the ability to specifically interact with other Mole ¬ cules and retain them. The biomolecule is chosen so that it binds to the complex of agent A, without interacting with other molecules. It is preferred that the biomolecule binds to the compound molecule. This is chosen so that it is not similar to any other common molecule in a patient's body. The biomolecule binds then only the connection molecule, so that a strong positive signal arises with at the same time low background signals. Preferably, the organic ¬ molecule is chosen so that the bond between the organic ¬ molecule and the target molecule is a linear coefficient called. KD value of <100 nM, preferably <10 nM, most be ¬ vorzugt of 7, 5 nM.
Das Biomolekül bindet an die Komplexe des Agens A, die an das krankhafte Gewebe angelagert sind und dient dazu, die Positi¬ on dieser Komplexe bzw. des krankhaften Gewebes zu bestimmen. Die Detektion des Biomoleküls erfolgt dabei über seine radio¬ aktive Markierung mit einem 11C-Kohlenstoffatom. Beim Zerfall des 11C-Kohlenstoffisotops werden Positronen, die auch als ß+- Strahlung bezeichnet werden, gebildet. Stoßen die Positronen auf ein Elektron, bilden sie zwei Photonen, die sich in einem Winkel von 180°, also genau in entgegen gesetzter Richtung, von einander entfernen. Die Photonen können detektiert und daraus die Position der Positronenemission, bzw. des 11C- Kohlenstoffatoms , berechnet werden. Die Integration eines 11C-Kohlenstoffatom in das Biomolekül, ermöglicht es sowohl des Vorhandensein, als auch die Position des Biomoleküls nachzuweisen und abzubilden. Des Weiteren kann auch die Menge an Biomolekülen, die sich an einer bestimmten Stelle befindet, quantifiziert werden. Zur Herstellung eines solchen Bio- moleküls sind insbesondere die Verfahren, die in den Patent¬ anmeldungen DE 10 2009 035 648.7, und DE 10 2009 035 645.2 beschrieben werden, geeignet. The biomolecule binds to the complexes of the agent A, which are attached to the diseased tissue and serves to determine the Positi ¬ on these complexes or the diseased tissue. The detection of the biomolecule takes place via its radio ¬ active marker with an 11 C carbon atom. Upon decay of the 11 C carbon isotope, positrons, also referred to as β + radiation, are formed. If the positrons hit an electron, they form two photons, which move away from each other at an angle of 180 °, ie exactly in the opposite direction. The photons can be detected and used to calculate the position of the positron emission, or of the 11 C carbon atom. The integration of an 11 C carbon atom into the biomolecule allows both the presence as well as the position of the biomolecule to detect and image. Furthermore, the amount of biomolecules located at a particular site can also be quantified. To produce such a bio-molecule are in particular the method described in the patent applications DE 10 2009 035 ¬ 648.7 and DE 10 2009 035 645.2, are suitable.
Ein Vorteil der Verwendung eines Aptamers und eines de¬ markierten Biomoleküls liegt darin, dass beide aus körperei¬ genen Bestandteilen, nämlich Nukleinsäuren und Aminosäuren aufgebaut sind, wodurch sie für den Organismus verträglich sind. Sowohl das Aptamer als auch das Biomolekül und ihre einzelnen Nukleinsäuren bzw. Aminosäuren sind nicht toxisch, sie können natürlich verstoffwechselt , abgebaut und ausge¬ schieden werden. Durch die Verwendung eines integrierten X1C- Kohlenstoffatoms kann außerdem vermieden werden, dass ein ra- 1 An advantage of the use of an aptamer, and a d e ¬ labeled biomolecule is that both are composed of körperei ¬ antigenic components, namely nucleic acids and amino acids, whereby they are compatible to the organism. Both the aptamer and the biomolecule and its individual nucleic acids or amino acids are non-toxic, they can naturally metabolized, degraded and are ¬ eliminated. By using an integrated X1 C carbon atom, it is also possible to prevent a ra- 1
dioaktiver Fremdstoff, wie beispielsweise Fluor, Xenon, oder 68Gallium, in den Organismus eingebracht werden muss. Zudem ist Kohlenstoff, im Gegensatz zu Technetium oder Xenon, ein im Körper vorkommendes Element, das natürlich verstoff- wechselt werden kann. dioaktiver impurity such as fluorine, xenon, or 68 gallium, must be introduced into the organism. In addition, unlike technetium or xenon, carbon is an element that occurs in the body and can naturally be metabolised.
Ein weiterer Vorteil des Diagnostikums liegt in dem günstigen Signal/Hintergrund Verhältnis während der Detektion. Nachdem das Agens A dem Patienten verabreicht wurde, werden die ent¬ haltenen Komplexe im Körper verteilt und binden durch die Bindungsspezifität des Aptamers an das krankhafte Gewebe. Freie, ungebundene Komplexe werden dagegen rasch verstoff- wechselt und aus dem Organismus ausgeschieden, weil sie von endogenen Enzymen abgebaut werden können. Anschließend wird dem Patienten das Agens B verabreicht, welches extrem selek¬ tiv und mit hoher Bindungsspezifität an den Komplex bindet. Dadurch wird eine unspezifische Anlagerung im Körper des Pa- tienten verhindert, und es entsteht ein starkes und spezifi¬ sches Signal an der Position des krankhaften Gewebes, wohingegen das Hintergrundsignal minimiert wird. Zudem wird die Verteilung der Biomoleküle durch die hohe Selektivität beson- ders effizient, so dass die Zeitspanne zwischen dem Verabrei¬ chen des Agens B und der Detektion verkürzt werden kann. Beides führt dazu, dass die Dosis des Agens B minimiert werden kann und die Strahlenbelastung für den Patienten reduziert wird. Bei einer besonders hohen Affinität und Spezifität des Biomoleküls für den Komplex des Agens A kann das Biomolekül so gewählt werden, dass es schneller verstoffwechselt wird als der Komplex. In diesem Fall können beide Agenzien in extrem kurzem zeitlichem Abstand oder gegebenenfalls auch gleichzeitig verabreicht werden. Another advantage of the diagnostic is the favorable signal / background ratio during detection. After the agent A has been administered to the patient, the ent ¬ contained complexes are distributed in the body and bind by the binding specificity of the aptamer to the diseased tissue. Free, unbound complexes, on the other hand, are rapidly metabolised and excreted from the organism because they can be degraded by endogenous enzymes. Subsequently, the patient is administered the agent B, which binds extremely selek ¬ tively and with high binding specificity to the complex. This causes a non-specific attachment in the body of the prevents patients, and there is a strong and specifi ¬ cal signal at the position of the diseased tissue, whereas the background signal is minimized. In addition, the distribution of biomolecules by high selectivity Particularly efficiently so that the time between Verabrei ¬ chen of the agent B and the detection can be shortened. Both result in that the dose of agent B can be minimized and the radiation exposure for the patient is reduced. With a particularly high affinity and specificity of the biomolecule for the complex of agent A, the biomolecule can be chosen to be metabolized faster than the complex. In this case, both agents can be administered at extremely short intervals or optionally simultaneously.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Biomolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Peptiden, Aptameren und Mikro-Antikörpern . Diese Biomoleküle sind alle aus körperähnlichen Bestandteilen, wie Nukleinsäuren oder Aminosäuren, aufgebaut und daher für den Patienten besonders gut verträglich. According to a preferred embodiment of the invention, the biomolecule is selected from the group consisting of peptides, aptamers and micro-antibodies. These biomolecules are all made up of body-like components, such as nucleic acids or amino acids, and are therefore particularly well tolerated by the patient.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Biomolekül ein Peptid und das 11C-Kohlenstoffatom das Carbonylkohlenstoffatom einer der Aminosäuren. Die Carbo- nylgruppen sind Teil der Peptidbindungen zwischen den Aminosäuren und liegen im Inneren des Peptids. Dadurch ist gewährleistet, dass das 11C-Kohlenstoffatom nicht vom Peptid ab¬ gespalten wird, wie es etwa bei einer Seitenkette einer der Aminosäuren möglich wäre. According to a further preferred embodiment of the invention, the biomolecule is a peptide and the 11 C carbon atom is the carbonyl carbon atom of one of the amino acids. The carbonyl groups are part of the peptide bonds between the amino acids and are located inside the peptide. This ensures that the 11 C-carbon atom is not cleaved by the peptide from ¬ how it would be possible for example in a side chain of the amino acids.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das 11C-Kohlenstoffatom das Carbonylkohlenstoffatom der N-terminalen Aminosäure des Peptids. Diese Ausführungsform ist besonders bevorzugt, weil das Peptid direkt nach dem An¬ bringen der 11C-markierten Aminosäure verwendet werden kann. 11C-Kohlenstoff hat eine Halbwertszeit von nur ca. 20 Minu¬ ten, so dass die Strahlungsdosis desto höher gewählt werden muss, je mehr Zeit zwischen der Synthese des Peptids und sei¬ ner Verwendung liegt. Wird die 11C-Markierung mit der N- terminalen Aminosäure und damit im letzten Schritt der Synthese angebracht, kann das Peptid sofort nach seiner Synthese verwendet werden. Auf diese Weise wird die Zeitspanne zwi- sehen der Verarbeitung des 11C-Kohlenstoffs und dem Einsatz des Peptids reduziert, so dass der Strahlungsverlust während der Herstellung des Peptids minimiert wird. Deshalb kann die Strahlendosis, die bei der Verarbeitung des 11C-Kohlenstoffs eingesetzt werden muss, um eine bestimmte Strahlungsstärke des Produkts zu gewährleisten, entsprechend geringer sein. Die Herstellung wird dadurch kostengünstiger und die Strahlenbelastung für das technische Personal, welches das Peptid herstellt, verringert. In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung weist das Peptid mindestens eine D-Aminosäure auf. Mit Ausnahme des Glycins besitzen alle Aminosäuren an ihrem alpha-C- Kohlenstoffatom ein chirales Zentrum und können daher als Konfigurationsisomere, nämlich als D- oder L-Aminosäure, vor- liegen. Endogene Peptide und Proteine sind weitgehend ausIn a further preferred embodiment of the invention, the 11 C carbon atom is the carbonyl carbon atom of the N-terminal amino acid of the peptide. This embodiment is particularly preferred because the peptide can be used directly after the on ¬ bring the 11 C-labeled amino acid. 11 C-carbon has a half-life of only about 20 Minu ¬ th, so that the radiation dose must be chosen the higher, the more time is between the synthesis of the peptide and its ¬ ner use. If the 11 C-labeling with the N-terminal amino acid and thus in the last step of the synthesis is applied, the peptide can be used immediately after its synthesis. In this way, the time between the processing of the 11 C carbon and the use of the peptide is reduced, so that the radiation loss during the preparation of the peptide is minimized. Therefore, the radiation dose that must be used in the processing of the 11 C carbon to ensure a certain radiation intensity of the product, be correspondingly lower. The production is thereby cheaper and reduces the radiation exposure to the technical staff, which produces the peptide. In an advantageous embodiment of the invention, the peptide has at least one D-amino acid. With the exception of glycine, all amino acids have a chiral center at their alpha carbon atom and can therefore exist as configurational isomers, namely as the D or L amino acid. Endogenous peptides and proteins are largely out
Aminosäuren in L-Konfiguration aufgebaut. Zudem arbeiten die meisten natürlichen Proteasen und Peptidasen stereoselektiv und verstoffwechseln hauptsächlich L-Aminosäuren . Daher dauert der Abbau von D-Aminosäuren durch körpereigene Enzyme länger als der von L-Aminosäuren. Dieser Umstand kann verwendet werden, um die Halbwertszeit eines Proteins oder Peptids zu verlängern, indem neben L-Aminosäuren auch D-Aminosäuren verwendet werden (Neundorf I et al . , 2008) . Dadurch kann die pharmakologische Clearance, also die Zeit bis das Peptid aus dem Organismus ausgeschieden ist, positiv beeinflusst werden. Bei dem Austausch einzelner L-Aminosäuren gegen ihre D- Konfiguration ist jedoch darauf zu achten, dass die Bin- dungsspezifität des Peptids nicht verändert wird. Eine weite¬ re Möglichkeit, die pharmakologische Clearance des Peptids zu beeinflussen, besteht darin, einzelne der Aminosäuren des Peptids durch nicht natürliche Aminosäuren mit ähnlichen che¬ mischen Eigenschaften zu ersetzen. Die nicht natürlichen Aminosäuren werden langsamer verstoffwechselt , weil die körpereigenen proteolytischen Enzyme speziell an den Abbau natürlicher Aminosäuren angepasst sind. Bei der Modifizierung des Peptids sollten die nicht natürlichen Aminosäuren jedoch so gewählt werden, dass die Bindungsaffinität des Peptids nicht verändert wird. Darüber hinaus sind auch andere chemische Mo¬ difikationen einzelner Aminosäuren des Peptids möglich, um die Halbwertszeit des Peptids gezielt zu beeinflussen. Bei¬ spielsweise kann die endständige Aminogruppe des Peptids durch eine Isonitrilgruppe ersetzt werden. Eine solche Modi¬ fikation reduziert die, von der Aminogruppe vermittelte, In¬ teraktion mit proteolytischen Enzymen, ohne die Bindung zwischen dem Peptid und dem Komplex zu verändern. Built up amino acids in L configuration. In addition, most natural proteases and peptidases work stereoselectively and mainly metabolize L-amino acids. Therefore, the degradation of D-amino acids by endogenous enzymes takes longer than that of L-amino acids. This fact can be used to extend the half-life of a protein or peptide by using D-amino acids besides L-amino acids (Neundorf I et al., 2008). This can reduce the pharmacological clearance, ie the time it takes for the peptide to get out excreted in the organism. However, when replacing individual L-amino acids with their D-configuration, care must be taken not to alter the binding specificity of the peptide. A further possibility for influencing the pharmacological clearance of the peptide consists of replacing individual amino acids of the peptide with non-natural amino acids having similar chemical properties. The non-natural amino acids are metabolized more slowly because the body's own proteolytic enzymes are specially adapted to the degradation of natural amino acids. However, when modifying the peptide, the non-natural amino acids should be chosen so that the binding affinity of the peptide is not altered. In addition, other chemical Mo ¬ difikationen individual amino acids of the peptide are possible to influence the half-life of the peptide specifically. In ¬ play, the terminal amino group of the peptide may be replaced by an isonitrile group. Such modes ¬ fication reduces, mediated by the amino group, in ¬ teraktion with proteolytic enzymes without altering the bond between the peptide and the complex.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Biomolekül ein Aptamer und die Aminosäure über eine Peptidbindung an eine freie Aminogruppe eines Nukleotids des Aptamers gekoppelt. Die Markierung das Aptamers mit einem 11C-Kohlenstoffatom über eine Aminosäure ist insbesondere vorteilhaft, weil dadurch keine der üblichen Komplexbildner, wie DTPA oder DOTA, verwendet werden müssen. Der entstehende Komplex aus Aptamer und Aminosäure umfasst körpereigene Mole¬ küle, wodurch er für den Organismus besonders verträglich ist. Sowohl das Aptamer und seine einzelnen Nukleinsäuren, als auch die Aminosäure sind nicht toxisch, sie können natür¬ lich verstoffwechselt , abgebaut und ausgeschieden werden. Durch die Verwendung eines integrierten C-Kohlenstoffatoms kann außerdem vermieden werden, dass ein radioaktiver Fremdstoff in den Organismus eingebracht werden muss. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Biomoleküls zur Herstellung eines Diagnostikums zur De- tektion eines krankhaften Gewebes. Indem das Biomolekül an einen Komplex bindet, der ein Aptamer und ein Verbindungsmo¬ lekül aufweist und das Aptamer an das krankhafte Gewebe (18) bindet, ist das Biomolekül geeignet, selbst wenige Zellen ei¬ nes krankhaften Gewebes im Körper eines Patienten zu lokalisieren. Dadurch, dass das Biomolekül eine Aminosäure mit ei¬ nem ^C-Kohlenstoffatom aufweist, kann es durch PET detek- tiert werden. According to another preferred embodiment of the invention, the biomolecule is an aptamer and the amino acid is coupled via a peptide bond to a free amino group of a nucleotide of the aptamer. The labeling of the aptamer with an 11 C carbon atom via an amino acid is particularly advantageous because it does not require the use of any of the conventional complexing agents, such as DTPA or DOTA. The resulting complex of aptamer and amino acid comprises endogenous Mole ¬ molecules, whereby it is particularly compatible with the organism. Both the aptamer and its individual nucleic acids, and the amino acid are non-toxic, they can natuer metabolized ¬ Lich, be broken down and excreted. By using an integrated C-carbon atom, it can also be avoided that a radioactive foreign substance has to be introduced into the organism. Another object of the invention is the use of a biomolecule for the preparation of a diagnostic agent for the detection of a diseased tissue. By the biomolecule binds to a complex comprising an aptamer and a Verbindungsmo ¬ lekül and the aptamer to the diseased tissue (18) binds the biomolecule is suitable, even a few cells ei ¬ nes diseased tissue in a patient's body to locate. Characterized in that the biomolecule has an amino acid with egg nem ¬ ^ C-carbon atom, it may be PET detek- advantage.
Unter Verwendung des Biomoleküls kann ein Diagnostikum mit den oben beschriebenen Vorteilen hergestellt, und ein krankhaftes Gewebe kann mittels PET bestimmt und beobachtet wer¬ den. Die PET ist ein etabliertes Verfahren um die Strahlung radioaktiver Elemente zu erfassen und ihre Position zu bestimmen (Massoud TF, Gambhir SS, 2003) . Mit Hilfe von ringförmig um den Patienten angeordneten Detektorgeräten werden Schnittbilder erstellt, auf denen die Zerfallsereignisse in ihrer räumlichen Verteilung im Körperinneren dargestellt wer- den. Die PET ermöglicht es auch, die Menge an markierten Mo¬ lekülen in einem Gewebe quantitativ zu bestimmen. Using the biomolecule a diagnostic agent with the benefits described above can be manufactured, and an abnormal tissue can be determined by means of PET and observed ¬ the. PET is an established method for detecting the radiation of radioactive elements and determining their position (Massoud TF, Gambhir SS, 2003). With the aid of detector devices arranged annularly around the patient, sectional images are created on which the decay events are represented in their spatial distribution in the interior of the body. PET also makes it possible to determine the amount of labeled Mo ¬ lekülen quantitatively in a tissue.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Biomolekül ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Peptiden, Aptameren und Mikro-Antikörpern . Diese Moleküle sind aus körperähnlichen Bestandteilen aufgebaut und daher für den Patienten besonders gut verträglich. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Biomolekül ein Peptid und das 11C-Kohlenstoffatom das Carbo- nylkohlenstoffatom einer der Aminosäuren, vorzugsweise der N- terminalen Aminosäure des Peptids. According to a preferred embodiment of the invention, the biomolecule is selected from the group consisting of peptides, aptamers and micro-antibodies. These molecules are built up from body-like components and are therefore particularly well tolerated by the patient. According to a preferred embodiment of the invention, the biomolecule is a peptide and the 11 C carbon atom is the carbonyl carbon atom of one of the amino acids, preferably the N-terminal amino acid of the peptide.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Biomolekül ein Aptamer und die Aminosäure über eine Peptid- bindung mit einer freien Aminogruppe eines Nukleotids an das Aptamer gebunden. According to a preferred embodiment of the invention, the biomolecule is an aptamer and the amino acid is linked to the aptamer via a peptide bond with a free amino group of a nucleotide.
Außerdem wird ein Verfahren zur Lokalisation eines krankhaften Gewebes in einem Organismus offenbart, umfassend die Schritte: a) Verabreichen eines Agens A mit einem Komplex oder Konjugat, umfassend ein Aptamer und ein Verbindungsmole- kül, an einen Organismus, b) Verabreichen eines Agens B mit einem Biomolekül, das an den Komplex oder das Konjugat bin¬ det, an den Organismus, und c) Detektieren des Biomoleküls in dem Organismus mittels Positronen-Emissions-Tomographie Also disclosed is a method of localizing diseased tissue in an organism, comprising the steps of: a) administering to the organism an agent A comprising a complex or conjugate comprising an aptamer and a linking molecule, b) administering an agent B with a biomolecule, the bin to the complex or conjugate ¬ det, to the organism, and c) detecting the biomolecule in the organism by means of positron emission tomography
(PET) . Dabei bindet das Aptamer an das krankhafte Gewebe und das Biomolekül weist eine Aminosäure mit einem (PET). The aptamer binds to the diseased tissue and the biomolecule has one amino acid
11C-Kohlenstoffatom auf. 1 1 carbon atom on.
Mit dem erfindungsgemäßen Diagnostikum wird ein krankhaftes Gewebe im Inneren eines Organismus detektiert und lokali- siert, und kann so im Körper eines Patienten beobachtet wer¬ den. Auf diese Weise kann beispielsweise die Größe oder Aus¬ dehnung einer Infektion oder eines Tumors bestimmt werden. Das erfindungsgemäße Diagnostikum ist daher hervorragend zur Beobachtung von Verlauf und Erfolg einer Behandlung, sog. Therapiemonitoring, geeignet. With the inventive diagnostic a morbid tissue inside an organism is detected and localized Siert, and can be as observed in the body of a patient who ¬. In this way, the size or from ¬ expansion of infection or a tumor, for example, be determined. The diagnostic agent according to the invention is therefore ideal for monitoring the course and success of a treatment, so-called therapy monitoring.
Im Folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung anhand der beigefügten schematischen Zeichnungen erläutert . Figur 1 zeigt schematisch einen Komplex 6 aus einem Aptamer 4 und einem Verbindungsmolekül 5, an das ein Biomolekül 1, näm¬ lich ein Peptid, angelagert ist. Der Komplex 6 ist dabei an ein krankhaftes Gewebe 18 gebunden. Das Peptid 1 umfasst 8Hereinafter, preferred embodiments of the invention will be explained with reference to the accompanying schematic drawings. 1 shows schematically a complex of an aptamer 6 4 and a linker molecule 5 to which a biomolecule 1, NaEM ¬ Lich a peptide is attached. The complex 6 is bound to a pathological tissue 18. Peptide 1 comprises 8
Aminosäuren 2, von denen die N-terminale Aminosäure 3 mit ei¬ nem 11C-Kohlenstoffatom radioaktiv markiert ist. Die radioaktive Markierung ist durch einen Stern (*) dargestellt. Amino acids 2, of which the N-terminal amino acid 3 is radiolabeled with ei ¬ nem 11 C carbon atom. The radioactive label is represented by an asterisk (*).
Die spezifische Bindungsaffinität zwischen dem Komplex 6 und dem krankhaften Gewebe 18 kommt auf Grund der chemischen Wechselwirkungen zwischen dem Aptamer 4 und der Oberfläche des krankhaften Gewebe 18 zustande. Diese Wechselwirkungen werden durch die Nukleinsäuresequenz des Aptamers 4 bestimmt. The specific binding affinity between the complex 6 and the diseased tissue 18 is due to the chemical interactions between the aptamer 4 and the surface of the diseased tissue 18. These interactions are determined by the nucleic acid sequence of aptamer 4.
Aus einer Aptamer-Bibliothek wird ein Aptamer 4 identifiziert, das mit einem Oberflächenmolekül des krankhaften Gewe¬ bes 18 interagiert. Anschließend wird das Aptamer 4 an ein Verbindungsmolekül 5 gekoppelt, welches geeignet ist, von ei¬ nem Peptid 1 extrem selektiv und mit hoher Affinität gebunden zu werden. From an aptamer library an aptamer 4 is identified that interacts with a surface molecule of the diseased tissue ¬ bes 18th Subsequently, the aptamer 4 is coupled to a linker molecule 5 which is adapted to be bound by egg ¬ nem peptide 1 extremely selectively and with high affinity.
Das Peptid 1, das eine 11C-markierten Aminosäure 3 aufweist, wird verwendet um ein Agens B herzustellen. Das Peptid 1 kann dann durch die beim Zerfall des 11C-Kohlenstoffatoms abgege¬ benen Positronen mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) nachgewiesen werden. Der Ort der Positronenemission entspricht dem Ort des Komplexes 6, und somit dem des krank¬ haften Gewebes 18, an das der Komplex 6 gebunden ist. Peptide 1, which has an 11 C-labeled amino acid 3, is used to produce an agent B. Peptide 1 can then by the decay of the 11 C-carbon atom abgege ¬ positron surrounded by positron emission tomography (PET) can be detected. The location of the positron emission corresponding to the location of Complex 6, and therefore that of the sick ¬ exemplary fabric 18, to which the complex is bound. 6
Mit einer angemessenen zeitlichen Verzögerung, die ausreicht, damit die Komplexe 6 an das krankhafte Gewebe 18 binden und die freien Komplex 6 abgebaut werden, wird dem Patienten das Agens B verabreicht. Die Peptide 1 binden zügig an die Kom- plexe 6, weil sie nicht mit anderen Molekülen im Körper des Patienten interagieren . Auf diese Weise sammeln sie sich an den Zellen des krankhaften Gewebes 18. Diese Anhäufung wird bei einer Positronen-Emissions-Tomographie (PET) sichtbar, so dass die Verteilung des Komplexes 6 bzw. die Position des krankhaften Gewebes 18 im Körper des Patienten bestimmt werden können. With adequate time delay sufficient to allow complexes 6 to bind to the diseased tissue 18 and to degrade the free complex 6, agent B is administered to the patient. The peptides 1 bind rapidly to the complex plexes 6 because they do not interact with other molecules in the patient's body. In this way, they accumulate on the cells of the diseased tissue 18. This accumulation becomes visible in a positron emission tomography (PET), so that the distribution of the complex 6 or the position of the diseased tissue 18 in the body of the patient are determined can.
Figur 2 zeigt eine schematische Darstellung (stark verein- facht nach Faller A, Schünke M, Der Körper des Menschen,FIG. 2 shows a schematic illustration (greatly simplified according to Faller A, Schünke M, The body of man,
Thieme, 2008) eines Blutkreislaufsystems 10 eines Organismus und die Verteilung eines Peptids 1 darin, nachdem dem Patienten bereits das Agens A mit dem Komplex 6 verabreicht wurde. Das Blutkreislaufsystem 10 umfasst verschiedene schematisch dargestellte Organe, wie Lunge 12, Herz 13, Leber 14, Darm 15 und Niere 16 und die Hauptadern 11, welche diese Organe ver¬ binden. Links der Mitte des Blutkreislaufsystems 10 ist zu¬ sätzlich ein krankhaftes Gewebe 18, zum Beispiel ein Tumor oder eine Entzündung, dargestellt, an das bereits die Komple¬ xe 6 angelagert sind. Das Peptid 1 ist durch Dreiecke, ent¬ lang der Adern 11 und an die Komplexe 6 am krankhaften Gewebe 18 gebunden, dargestellt. Die Abbauprodukte 17 des Komplexes 6 und des Peptids 1 sind durch einzelne Striche innerhalb der Umrisse der Niere 16 dargestellt. Thieme, 2008) of a circulatory system 10 of an organism and the distribution of a peptide 1 therein, after the patient has already been administered the agent A with the complex 6. The circulation system 10 includes various organs schematically represented, such as the lungs 12, heart 13, liver 14, 15 intestine and kidney 16 and the main wires 11 which these organs ver ¬ bind. Left of center of the circulatory system 10 is additionally ¬ a diseased tissue 18, for example, a tumor or an inflammation, shown, are attached to the already Komple ¬ xe. 6 The peptide 1 is represented by triangles, ent ¬ long of the veins 11 and bound to the complexes 6 on the diseased tissue 18 shown. The degradation products 17 of the complex 6 and the peptide 1 are represented by individual lines within the outline of the kidney 16.
Die Verteilung des Peptids 1 im Blutkreislaufsystem 10 umfasst vier Phasen, die entlang der Darstellung von oben nach unten aufgeführt sind. The distribution of the peptide 1 in the circulatory system 10 comprises four phases, which are listed along the top-down view.
Phase I: Das Peptid 1 wird in das Blutkreislaufsystem 10 des Organismus injiziert. Phase II: Über das Blutkreislaufsystem 10 wird das Peptid 1 in die Organe 12, 13, 14, 15, und 16 des Organismus transpor¬ tiert . Phase III: Das zirkulierende Peptid 1 bindet spezifisch an die Komplexe 6, die bereits an das krankhafte Gewebe 18 ange¬ lagert sind. Phase I: Peptide 1 is injected into the circulatory system 10 of the organism. Phase II: is via the blood circulatory system 10 Peptide 1 in the organs 12, 13, 14, 15, and 16 of the body transported ¬ advantage. Phase III: The circulating peptide 1 specifically binds to the complexes 6, which are already at the pathological tissue 18 ¬ superimposed.
Phase IV: Nicht gebundenes Peptid 1 wird schnell verstoff- wechselt und enzymatisch abgebaut. Der Organismus unterschei¬ det nicht zwischen körpereigenen Molekülen und dem Peptid 1, weil es aus Aminosäuren 2, 3 aufgebaut ist, die den körperei¬ genen Molekülen entsprechen. Die Abbauprodukte 17 des Peptids 1 und der Aminosäuren 2, 3 sammeln sich vorwiegend in der Niere 16, von wo aus sie über die Blase und den Harnleiter ausgeschieden werden. Phase IV: Unbound peptide 1 is rapidly metabolised and enzymatically degraded. The organism not failed ¬ det between the body's own molecules and the peptide 1, because it is composed of amino acids 2, 3, corresponding to the körperei ¬ antigenic molecules. The degradation products 17 of the peptide 1 and the amino acids 2, 3 accumulate predominantly in the kidney 16, from where they are excreted via the bladder and the ureter.
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Claims

Diagnostikum zur Lokalisation eines krankhaften Gewebes (18) umfassend zwei getrennte Agenzien, nämlich Diagnostic agent for the localization of a diseased tissue (18) comprising two separate agents, namely
a) ein Agens A, das ein Komplex (6), umfassend ein Ap- tamer (4) und ein Verbindungsmolekül (5), aufweist, und  a) an agent A which has a complex (6) comprising an apteramer (4) and a connecting molecule (5), and
b) ein Agens B, das ein Biomolekül (1) aufweist, das an den Komplex (6) bindet,  b) an agent B which has a biomolecule (1) which binds to the complex (6),
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t,  characterized,
dass das Aptamer (4) an das krankhafte Gewebe (18) bin¬ det, und das Biomolekül (1) eine Aminosäure (2) mit ei¬ nem 11C-Kohlenstoffatom aufweist. that the aptamer (4) to the diseased tissue (18) am ¬ det, and the biomolecule (1) an amino acid (2) with egg ¬ nem C-11 carbon atom.
Diagnostikum nach Anspruch 1, Diagnostic agent according to claim 1,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t,  characterized,
dass das Biomolekül (1) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Peptiden, Aptameren und Mikro-Antikörpern .  the biomolecule (1) is selected from the group consisting of peptides, aptamers and micro-antibodies.
Diagnostikum nach Anspruch 2, Diagnostic agent according to claim 2,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t,  characterized,
dass das Biomolekül (1) ein Peptid ist und das X1C- Kohlenstoffatom das Carbonylkohlenstoffatom einer der Aminosäuren (2), vorzugsweise der N-terminalen Aminosäure (3) des Peptids ist. the biomolecule (1) is a peptide and the X1 C carbon atom is the carbonyl carbon atom of one of the amino acids (2), preferably the N-terminal amino acid (3) of the peptide.
Diagnostikum nach Anspruch 2, Diagnostic agent according to claim 2,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t,  characterized,
dass das Biomolekül (1) ein Aptamer ist und die Amino¬ säure (2) über eine Peptidbindung an eine freien Ami- nogruppe eines Nukleotids des Aptamers gekoppelt ist. that the biomolecule (1) is an aptamer and the amino acid ¬ (2) is coupled via a peptide bond to a free amino nogruppe one nucleotide of the aptamer.
5. Verwendung eines Biomoleküls (1) zur Herstellung eines Diagnostikums , bestehend aus zwei getrennten Agenzien A und B zur Detektion eines krankhaften Gewebes (18), d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, 5. Use of a biomolecule (1) for the preparation of a diagnostic agent consisting of two separate agents A. and B for the detection of a diseased tissue (18), characterized
dass that
a) das Biomolekül (1) das Agens B bildet und an einen das Agens A bildenden Komplex (6) bindet, der ein Aptamer (4) und ein Verbindungsmolekül (5) auf¬ weist, a) the biomolecule (1) forms the agent B and binds to a complex A (6) forming the agent A, which has an aptamer (4) and a connecting molecule (5),
b) das Aptamer (4) an das krankhafte Gewebe (18) bin¬ det, und b) the aptamer (4) to the diseased tissue (18) am ¬ det, and
c) das Biomolekül (1) eine Aminosäure (2) mit einem 11C-Kohlenstoffatom aufweist. c) the biomolecule (1) has an amino acid (2) with a 1 1 C carbon atom.
Verwendung nach Anspruch 5, Use according to claim 5,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, characterized,
dass das Biomolekül (1) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Peptiden, Aptameren und Mikro-Antikörpe the biomolecule (1) is selected from the group consisting of peptides, aptamers and micro-antibodies
Verwendung nach Anspruch 6, Use according to claim 6,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, characterized,
dass das Biomolekül (1) ein Peptid ist und das X1C- Kohlenstoffatom das Carbonylkohlenstoffatom einer der Aminosäuren (2), vorzugsweise der N-terminalen Aminosäu re (3) des Peptids ist. the biomolecule (1) is a peptide and the X1 C carbon atom is the carbonyl carbon atom of one of the amino acids (2), preferably the N-terminal amino acid (3) of the peptide.
Verwendung nach Anspruch 6, Use according to claim 6,
d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, characterized,
dass das Biomolekül (1) ein Aptamer ist und die Amino¬ säure (2) über eine Peptidbindung mit einer freien Ami nogruppe eines Nukleotids an das Aptamer gebunden ist. that the biomolecule (1) is an aptamer and the amino acid ¬ (2) is bonded via a peptide bond to a free Ami nogruppe of a nucleotide to the aptamer.
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