WO2012000784A1 - 11c-labelled peptide for detecting neurons which express an acetylcholine receptor - Google Patents

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WO2012000784A1
WO2012000784A1 PCT/EP2011/059875 EP2011059875W WO2012000784A1 WO 2012000784 A1 WO2012000784 A1 WO 2012000784A1 EP 2011059875 W EP2011059875 W EP 2011059875W WO 2012000784 A1 WO2012000784 A1 WO 2012000784A1
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peptide
acetylcholine receptor
neurons
carbon atom
amino acids
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PCT/EP2011/059875
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Ursus KRÜGER
Oliver Lade
Arno Steckenborn
Sylvie Von Werder
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Siemens Aktiengesellschaft
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins

Definitions

  • the invention relates to the use of a peptide for the manufacture ⁇ position of an agent for the detection of neurons expressing an acetylcholine receptor. It further relates to a radiolabel comprising such a peptide for the detection of neurons expressing an acetylcholine receptor.
  • a challenge of modern medicine is the correct diagnosis of increasingly common neurological diseases.
  • CNS central nervous system
  • PNS peripheral-nervous system
  • Some of these diseases can be difficult against other be distinguished because on the one hand their symptoms are similar and on the other hand, atypical symptoms often occur, especially in the early stages.
  • the socially very significant neurological diseases Alzheimer dementia and Parkinson's disease are both based on the loss of neurons of the CNS and are initially characterized by unspecific, not clearly classifiable symptoms. This complicates an accurate diagnosis, increasing the risk of a false treatmen ⁇ development of the patient.
  • CT computer tomography
  • MRT Kernspintomogra ⁇ tomography
  • the invention is therefore based on the object, a cost-effective and well-tolerated for the patient agent for the detection of neurons that carry an acetylcholine receptor provide.
  • This object is achieved by the use of a peptide for the production of an agent for the detection of neurons expressing an acetylcholine receptor.
  • the agent according to the invention it is possible to specifically differentiate diseases attributable to the loss of acetylcholine receptor-positive neurons from other neurological diseases.
  • the agent may be prepared kos ⁇ -effectively and can not be easily metabolized in the organism in which the New ⁇ rone be detected.
  • peptide refers to an organic compound of at least two amino acids linked via a peptide bond. It includes both oligopeptides of up to about ten amino acids, polypeptides up to about 50 Amino Text ⁇ ren and proteins of up to 150 amino acids, regardless of their primary, secondary or tertiary structure. Here are both naturally occurring as well as biotechnological or comprises synthetically produced compounds.
  • the peptide used in the invention is chosen so that it binds to the acetylcholine receptor. Antibodies, their fragments and other polypeptides which bind to the acetylcholine receptor are suitable for this purpose. By their specific binding, the peptides can be used to detect neurons that carry the acetylcholine receptor.
  • the peptide is selected since at such ⁇ that the bond between the peptide and the acetylcholine receptor, so called a linear coefficient.
  • KD value comprises of ⁇ 100 nM, preferably ⁇ 10 nM, more preferably of 7.5 nM.
  • the peptide itself is composed of amino acids, that is, of the body's own or body-like molecules, so that it is very well tolerated by the patient. It is not toxic and can of course be metabolized, broken down and excreted.
  • nerve refers to a nerve cell of the PNS or CNS. Nerve cells are classified according to their function, morphology, localization or gene expression. Together with macroglia (astrocytes) and oligodendroglia (oligodendrocytes), they form cellular systems that fulfill specific functions in the nervous system. These systems may be limited to certain Re ⁇ regions of the nervous system, or may extend over several regions of the brain of time, such as nerve fiber bundles from the ventral tegmental area of the Sehhü ⁇ gel (thalamus) and the midbrain (mesencephalon) innervie ⁇ ren.
  • astrocytes oligodendroglia
  • oligodendrocytes oligodendrocytes
  • Such neural systems often characterized by spe ⁇ -specific properties, for example in that Ner ⁇ venimpulse mediated rotransmitter between these cells by a specific new.
  • Bil ⁇ the use projection neurons of the ventral tegmental area and out of the basal forebrain (Stria- growth), as well as a subset of neurons of the striatum Inter the three essential cholinergic system of the central nervous system, acetylcholine as a neurotransmitter.
  • the presynaptic cholinergic neuron releases acetylcholine in response to a nerve impulse. This binds to the acetylcholine receptor of the postsynaptic neuron and triggers a depolarization of this neuron.
  • the cells of the cholinergic system are thus characterized by the formation of Acetylcho ⁇ lin and acetylcholine receptors, and can be detected by means of the inventively used peptide, which binds to the acetone tylcholinrezeptor.
  • the detection of the peptide and of the acetylcholine receptor bound thereto takes place via an integrated 11 C carbon atom.
  • the decay of the C-11 carbon isotope positron ⁇ nen are also referred to as SS + radiation is formed. Push the positron on an electron, they form two photon clays ent remove at an angle of 180 °, which is exactly in ⁇ opposite direction, from each other.
  • the photons can be detected and the position of the positrons ⁇ nemission, or the C 11 carbon atom calculated therefrom.
  • the integration of a C-11 carbon atom in the inventiveness used according to the peptide makes it possible to avoid the use of chemical ⁇ shear, foreign substances.
  • 11 C-carbon isotope in the peptide is the ra ⁇ diozine marking without complexing agents such as diethylenetriamine minpentaacetat (DTPA), 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane- 1, 4, 7, 10-tetraacetic acid ( DOTA) or ethylenediamine tetraacetate (EDTA). You can also avoid that
  • radioactive foreign substance such as fluorine, xenon, or 68 gallium
  • the processes described in patent applications DE 10 2009 035 648.7 and DE 10 2009 035 645.2 are particularly suitable.
  • both the presence, and the position of the acetylcholine receptor can be detected by the inventive Ver ⁇ application of the peptide and tobil- be.
  • Another advantage of the directly labeled with 11 C peptide lies in the favorable signal / background ratio during detection. The peptide binds specifically to the acetylcholine receptor and forms a stable complex with it.
  • the peptide has at least one D-amino acid.
  • amino acids have a chiral center at their alpha carbon atom and can therefore exist as configurational isomers, namely as the D or L amino acid. Endogenous peptides and proteins are largely made up of amino acids in ⁇ L-configuration.
  • a wide ⁇ re possibility that pharmacological clearance of the peptide to to affect, is to replace some of the amino acids of the peptide by non-natural amino acids with similar chemical properties.
  • the non-natural amino acids are metabolized more slowly because the body's proteolytic enzymes are specially adapted to the breakdown of natural amino acids.
  • the non-natural amino acids should be chosen so that the binding affinity of the peptide is not altered.
  • other chemical modifications of individual amino acids of the peptide are possible in order to specifically influence the half-life of the peptide.
  • the terminal amino group of the peptide may be replaced by an isonitrile group.
  • Such modes ⁇ fication reduces, mediated by the amino group of an interaction with proteolytic enzymes without altering the bond between the peptide used in the invention and the acetyl cholinrezeptor.
  • the peptide is an antagonist of the acetylcholine receptor.
  • acetylcholine receptors are activated by the binding of acetylcholine or its agonists, so that there is a depolarization or hyperpolarization of the cell membrane.
  • the peptide binds to the acetyl ⁇ cholinrezeptor without activating it.
  • Particularly suitable for this purpose are peptides which act as antagonists of the acetylcholine receptor. They show a specific
  • the peptide is chosen so that it traverses the blood-brain barrier independently.
  • the blood-brain barrier represents a barrier between the brain and the rest of the organism, which can not be overcome by all molecules, without further ado. Small, especially lipophilic molecules can diffuse through the blood-brain barrier ⁇ formed of astrocytes of the brain and Epithelzel ⁇ len of the blood vessels. Other molecules, such as ions, amino acids, and sugar molecules, are transported across the blood-brain barrier by channels or active transporter proteins.
  • the blood brain barrier independently, preferably by free diffusion, is particularly advantageous because the agent can be injected into the bloodstream and (not directly into the cerebrospinal fluid CSF ce ⁇ rebrospinalis ) must be applied.
  • the acetylcholine receptor is a nicotinic acetylcholine receptor.
  • the loss of the dopamine transporter goes well with a reduction of nicotiner- gen acetylcholine receptors in the neurons of the nucleus caudatus and putamen of the forebrain accompanied (Quik M et al., 2001).
  • a strong decrease of nicotinergic acetylcholine receptors of the striatal interneurons has also been observed (Dani JA and Bertrand D, 2007).
  • the agent is a radiopharmaceutical.
  • radiopharmaceuticals refers to medicines containing radionuclides whose radiation is used for diagnosis and therapy. The main applications are in oncology, Kar ⁇ ogy and neurology, as well as pharmaceutical research.
  • radionuclides are gamma or beta radiation emitting nuclides, for example Xenon 133, "technetium, gallium 68, fluorine 18 and used. They are usually bound via Kom ⁇ formers such as DOTA, DTPA or EDTA mono- or polysaccharides. Depending on the nature of their radiation, the nuclides are detected by means of scintigraphy, single photon emission com- puted tomography (SPECT) or positron emission tomography (PET)
  • SPECT single photon emission com- puted tomography
  • PET positron emission tomography
  • the C-carbon atom is the carbonyl carbon atom of an amino acid.
  • the carbonyl groups are part of the peptide bonds between the amino acids and are located inside the peptide. This ensures that the ⁇ C-carbon atom is not cleaved from the peptide, as it would be possible at about a 39ket ⁇ th one of the amino acids.
  • the C-carbon atom is the carbonyl carbon atom of N-terminal amino acid of the peptide.
  • This embodiment is particularly preferred because the peptide immediately after the on ⁇ bring the 11 C-labeled amino acid can be used.
  • 11 C-carbon has ten a half-life of only about 20 for minutes, so that the radiation dose to be selected the higher, the more time between the synthesis of the peptide and be ⁇ ner is situated. If the 11 C-labeling with the N-terminal amino acid and thus in the last step of the synthesis is applied, the peptide can be used immediately after its synthesis.
  • Another object of the invention is a radiopharmaceutical comprising a peptide having an 11 C carbon atom for the detection of neurons expressing an acetylcholine receptor.
  • the radiopharmaceutical according to the invention therefore offers an economically and medically advantageous agent for determining in vivo the amount and distribution of neurons expressing an acetylcholine receptor.
  • the peptides contained therein are distributed into the body and bind specifically Acetylcholine receptors. As a result, they accumulate at the acetylcholine receptor-positive neurons, where they are detected by the radioactive signal of the 11 C carbon atom. In this way, the neurons are detected in the nervous system of the patient.
  • the 11 C carbon atom is a carbonyl carbon atom of an amino acid, preferably the carbonyl carbon atom of the N-terminal amino acid of the peptide.
  • the radiopharmaceutical is a PET biomarker.
  • PET is an established method for detecting the radiation of radioactive elements and determining their position (Massoud TF, Gambhir SS, 2003). With the aid of detector devices arranged annularly around the patient, sectional images are created on which the decay events are represented in their spatial distribution in the interior of the body. In contrast to the usual scintigraphic chromatography method, is by the annular configuration of the PET detectors a more precise spatial localization of the positron ⁇ nenemission and thus a substantially more accurate and detailed ⁇ profiled imaging the diseased tissue is possible. PET also makes it possible to quantify the amount of labeled molecules in a tissue.
  • Also disclosed is a method of detecting neurons in an organism expressing an acetylcholine receptor comprising the steps of a) providing a peptide, b) administering the peptide to the organism, and c) detecting the peptide in the organism by positron emission Tomography (PET).
  • PET positron emission Tomography
  • the peptide binds to the acetylcholine receptor and has an 11 C carbon atom.
  • an acetyl ⁇ cholinrezeptor is detected inside an organism and lo ⁇ kalillon, so that the distribution of the acetylcholine receptor can be observed in the body of a patient. In this way, the amount and distribution of acetylcholine receptor positive neurons can be determined.
  • the present invention ver ⁇ turned peptide therefore also for observing the progression of a disease and its treatment, so-called. Therapy monitoring, are suitable.
  • FIG. 1 shows schematically the bond between a peptide 1 and a nicotinergic acetylcholine receptor 4.
  • Peptide 1 comprises 16 amino acids 2, of which the N-terminal amino acid 3 is radioactively labeled with an 11 C carbon atom.
  • the radioactive label is represented by an asterisk (*).
  • the amino acids 2 at positions two and eight, and three and sixteen are each connected by disulfide bridges 5, which are represented by lines. This covalent bond between the sulfur atoms of two cysteine side chains contributes to the stability of the three-dimensional structure of the molecule.
  • Part of peptide 1 is attached to the nicotinic acetylcholine receptor 4, which is located on the surface of a neuron 18.
  • the C-labeled peptide 1 ⁇ specifically binds to the nicoti ⁇ nergen acetylcholine receptor 4, but not to other molecules.
  • the peptide 1 can therefore be used to detect the nicotinergic acetylcholine receptor 4.
  • the positrons released upon the decay of the 11 C carbon are
  • Positron emission tomography detected.
  • the location of the positron emission corresponds to the location of the peptide 1 and the nicotinic acetylcholine receptor 4 bound thereto.
  • the peptide 1 can therefore be used to determine the position of a Neurons 18, which forms the nicotinergic acetylcholine receptor 4.
  • a patient is a radiopharmaceutical containing the 11 C-labeled peptide 1, administered to detect neurons 18 that express a nicotinergic acetylcholine receptor 4.
  • Peptide 1 binds specifically to the nicotinic acetylcholine receptor 4 and thus accumulates on the neurons 18 which carry the nicotinic acetylcholine receptor 4. This accumulation is represented by PET and the distribution of the nicotinergic acetylcholine receptor 4 or the amount and distribution of the neurons 18, especially in the caudate nucleus and in the putamen of the patient.
  • the medication of a therapeutic agent for example, amount of active ingredient and administration schedule can be adjusted accordingly entspre ⁇ the result of such an investigation can.
  • FIG. 2 shows a representation of a peptide 1 having the sequence SEQ ID NO: 1 by means of a chemical formula sold under the trade name -Conotoxin MII by Tocris Bioscience (16144 Westwoods Business Park, Ellisville, Missouri 63021, USA).
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 comprises 16 amino acids 2 of the following sequence: glycine-cysteine-cysteine-serine-asparagine-proline-valine-cysteine-histidine-leucine-glutamic acid-histidine-serine-asparagine-leucine-cysteine Am i d .
  • the N-terminal amino acids 2 glycine and cysteine are represented by structural formula, the following amino acids 2 by their respective three-letter code.
  • the amino acid 2 cysteine Am i d is designated Cys A and possesses a C-termial amide.
  • the cysteines at position two and eight resp. three and sixteen are connected by disulfide bridges, represented by lines.
  • the sequence of the peptide is also given in SEQ ID NO: 1.
  • the carbonyl carbon atom of the N-terminal glycine is an 11 C carbon atom represented by the number 11 above the carbonyl carbon atom.
  • Peptide 1 is prepared by conventional protein synthesis methods and the 11 C-labeled N-terminal amino acid 3 is added in the last step because the half-life of the 11 C carbon isotope is only about 20 minutes. By completing the peptide synthesis with the 11 C-labeled amino acid 3, the peptide 1 can be used immediately after the radioactive labeling.
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 binds specifically to a nicotinic acetylcholine receptor 4. These receptors belong to the family of ligand-gated ion channels and consist of a total of five identical or different subunits. They are activated by the binding of acetylcholine or an agonist, resulting in a conformational change of the
  • Nicotinergic acetylcholine receptors 4 are cation channels through which, in particular, sodium and calcium ions enter the cell. This leads to the depolarization of the cell membrane and the transmission of the nerve impulse.
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 binds to the nicotinergic acetylcholine receptor 4, but without activating it. It is therefore particularly suitable for the detection of neurons 18 which express nicotinergic acetylcholine receptors 4. Labeling by means of X1 carbon carbon is particularly advantageous because it does not affect the physiological structure of the peptide 1 and does not adversely affect the distribution in the tissue or the compatibility of the peptide 1.
  • Alzheimer dementia or Parkinson's disease can be excluded with great certainty. If, on the other hand, a loss becomes visible, it is possible to treat the affected patients early enough. This is particularly important because a Regenera ⁇ tion already dead neurons is not possible and the preservation of intact cells must be promoted. Therefore, the therapies available with early use show significantly better treatment results.
  • Figure 3 shows a schematic representation (greatly simplified by Faller A, Schünke M, The Human Body, Thieme, 2008) of a circulatory system 10 of an organism and the distribution of a peptide 1 therein.
  • the circulatory system 10 includes various schematically illustrated organs such as lung 12, heart 13, liver 14, intestine 15, kidney 16, and brain 19, as well as neurons 18 therein.
  • the main veins 11 which represented these organs ver ⁇ bind are.
  • the peptide 1 is represented by triangles along the wires 11.
  • the degradation products 17 of the peptide 1 are represented by individual dashes within the outline of the kidney 16.
  • the distribution of peptide 1 in the circulatory system 10 comprises four phases, which are listed along the top-down view.
  • Phase I Peptide 1 is injected into the circulatory system 10 of the organism.
  • Phase II Via the blood circulation system 10, the peptide 1 is trans ⁇ ported into the organs 12, 13, 14, 15, 16 and 19 of the organism.
  • Phase III The circulating peptide 1 binds specifically to the acetylcholine receptor 4 and accumulates on the neurons 18 because they produce the acetylcholine receptor 4.
  • Phase IV Unbound peptide 1 is rapidly metabolised and enzymatically degraded.
  • the organism not failed ⁇ det between own peptides and the peptide 1, because it is composed of amino acids 2, 3, which correspond to the body's own molecules.
  • the degradation products 17 of the peptide of amino acids 1 and 2, 3 collect predominantly they are over the bladder and the ureter excreted ⁇ in the kidney 16 from where. references

Abstract

The use of a peptide (1) for producing an agent for detecting neurons (18) which express an acetylcholine receptor (4) is described. The peptide (1) binds to the acetylcholine receptor (4) and has an 11C carbon atom. Also described is a radiopharmacon for detecting neurons (18) which express an acetylcholine receptor (4). This comprises a peptide (1) which binds to the acetylcholine receptor (4) and has an 11C carbon atom.

Description

Beschreibung description
11C-markiertes Peptid zur Detektion von Neuronen, die einen Acetylcholinrezeptor exprimieren 11 C-labeled peptide for the detection of neurons expressing an acetylcholine receptor
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Peptids zur Her¬ stellung eines Agens zur Detektion von Neuronen, die einen Acetylcholinrezeptor exprimieren. Sie betrifft ferner ein Ra- diopharmakon, das ein solches Peptid umfasst, zum Nachweis von Neuronen, die einen Acetylcholinrezeptor exprimieren. The invention relates to the use of a peptide for the manufacture ¬ position of an agent for the detection of neurons expressing an acetylcholine receptor. It further relates to a radiolabel comprising such a peptide for the detection of neurons expressing an acetylcholine receptor.
Eine Herausforderung der modernen Medizin ist die korrekte Diagnose von, zunehmend häufiger auftretenden, neurologischen Erkrankungen. Darunter fallen eine Vielzahl sehr unterschied- licher Krankheiten des Zentralnervensystems (ZNS) , wie De¬ menz, Morbus Parkinson und Schizophrenie, und des Peripher- nervensystems (PNS) , wie Muskelschwäche und Multiple Sklero¬ se. Manche dieser Krankheiten können nur schwer gegen andere abgegrenzt werden, weil sich einerseits ihre Krankheitsmerk- male ähneln und andererseits, vor allem in den Frühstadien, oft atypische Symptome auftreten. Die heute gesellschaftlich sehr bedeutenden neurologischen Erkrankungen Alzheimerdemenz und Morbus Parkinson gehen beide auf den Verlust von Neuronen des ZNS zurück und äußern sich anfangs durch unspezifische, nicht eindeutig klassifizierbare Symptome. Das erschwert eine exakte Diagnose und erhöht die Gefahr einer falschen Behand¬ lung des Patienten. A challenge of modern medicine is the correct diagnosis of increasingly common neurological diseases. This includes a variety of very of different diseases of the central nervous system (CNS), such as De ¬ menz, Parkinson's disease and schizophrenia, and peripheral-nervous system (PNS), such as muscle weakness and multiple scleral ¬ se. Some of these diseases can be difficult against other be distinguished because on the one hand their symptoms are similar and on the other hand, atypical symptoms often occur, especially in the early stages. The socially very significant neurological diseases Alzheimer dementia and Parkinson's disease are both based on the loss of neurons of the CNS and are initially characterized by unspecific, not clearly classifiable symptoms. This complicates an accurate diagnosis, increasing the risk of a false treatmen ¬ development of the patient.
Weil einige neurologische Erkrankungen durch den Verlust von Neuronen des ZNS oder PNS gekennzeichnet sind, wird im Rahmen einer Diagnose, mittels Computer- (CT) oder Kernspintomogra¬ phie (MRT) untersucht, ob die Gehirnmasse reduziert ist oder mit fortschreitender Erkrankung abnimmt. Mit herkömmlichen Verfahren kann aber lediglich die gesamte Masse bzw. Dichte der Gehirnzellen und, mittels Positronen-Emissions- Tomographie (PET) , deren StoffWechselaktivität ermittelt wer¬ den. Es ist jedoch nicht möglich einzelne Populationen von Neuronen zu beobachten, wie beispielsweise die Neurone der cholinergen Systeme des ZNS und PNS . Diese Neurone verwenden Acetylcholin als Neurotransmitter. Fehlfunktionen der Reizweiterleitung (engl.: „neurotransmission" ) mittels Acetylcholin treten auf wenn es zu einem Verlust von Acetylcholinre- zeptoren oder Acetylcholinrezeptor-positiven Neuronen kommt, wie dies bei mehreren neurologischen Erkrankungen beobachtet wird . Because some neurological diseases are characterized by loss of neurons of the CNS or PNS, by means of computer tomography (CT) or Kernspintomogra ¬ tomography (MRT), is in the context of a diagnosis, investigated whether the brain tissue is reduced or decreases with progressive disease. With conventional methods, but only the entire mass or density of brain cells and, by means of positron emission tomography (PET), which determines metabolic activity of the ¬. However, it is not possible to observe single populations of neurons, such as the neurons of the cholinergic systems of the CNS and PNS. These neurons use acetylcholine as a neurotransmitter. Acetylcholine dysfunctions due to neurotransmission occur when acetylcholine receptor-positive neurons are lost, as seen in several neurological disorders.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein kostengünstiges und für den Patienten gut verträgliches Agens zur Detektion von Neuronen, die einen Acetylcholinrezeptor tragen, bereitzustellen. Diese Aufgabe wird durch die Verwendung eines Peptids zur Herstellung eines Agens zur Detektion von Neuronen, die einen Acetylcholinrezeptor exprimieren, gelöst. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Agens ist es möglich, Erkrankungen, die auf den Verlust von Acetylcholinrezeptor- positiven Neuronen zurückgehen, von anderen neurologischen Erkrankungen spezifisch abzugrenzen. Dadurch, dass ein Peptid, welches an den Acetylcholinrezeptor bindet und ein X1C- Kohlenstoffatom aufweist, verwendet wird, kann das Agens kos¬ tengünstig hergestellt und in dem Organismus, in dem die Neu¬ rone nachgewiesen werden, gut verstoffwechselt werden. The invention is therefore based on the object, a cost-effective and well-tolerated for the patient agent for the detection of neurons that carry an acetylcholine receptor provide. This object is achieved by the use of a peptide for the production of an agent for the detection of neurons expressing an acetylcholine receptor. With the aid of the agent according to the invention, it is possible to specifically differentiate diseases attributable to the loss of acetylcholine receptor-positive neurons from other neurological diseases. Characterized in that a peptide which binds to the acetylcholine receptor and a X1 C- carbon atom, is used, the agent may be prepared kos ¬-effectively and can not be easily metabolized in the organism in which the New ¬ rone be detected.
Der Begriff "Peptid" bezeichnet eine organische Verbindung aus mindestens zwei, über eine Peptidbindung verknüpften, Aminosäuren. Er umfasst dabei sowohl Oligopeptide aus bis zu ca. zehn Aminosäuren, Polypeptide aus bis zu ca. 50 Aminosäu¬ ren als auch Proteine von bis zu 150 Aminosäuren, unabhängig von deren Primär-, Sekundär- oder Tertiärstruktur. Dabei sind sowohl natürlich vorkommende als auch biotechnologisch oder synthetisch hergestellte Verbindungen umfasst. Das erfindungsgemäß verwendete Peptid wird so gewählt, dass es an den Acetylcholinrezeptor bindet. Geeignet sind dazu Antikörper, deren Fragmente und andere Polypeptide, die an den Acetylcho- linrezeptor binden. Durch ihre spezifische Bindung können die Peptide zum Nachweis von Neuronen eingesetzt werden, die den Acetylcholinrezeptor tragen. Vorzugsweise wird das Peptid da¬ bei so gewählt, dass die Bindung zwischen dem Peptid und dem Acetylcholinrezeptor einen linearen Koeffizienten, sog. kD- Wert, von < 100 nM, bevorzugt von < 10 nM, weiter bevorzugt von 7,5 nM aufweist. Das Peptid selbst ist aus Aminosäuren, das heißt aus körpereigenen bzw. körperähnlichen Molekülen aufgebaut, so dass es für den Patienten sehr gut verträglich ist. Es ist nicht toxisch und kann natürlich verstoffwech- seit, abgebaut und ausgeschieden werden. The term "peptide" refers to an organic compound of at least two amino acids linked via a peptide bond. It includes both oligopeptides of up to about ten amino acids, polypeptides up to about 50 Aminosäu ¬ ren and proteins of up to 150 amino acids, regardless of their primary, secondary or tertiary structure. Here are both naturally occurring as well as biotechnological or comprises synthetically produced compounds. The peptide used in the invention is chosen so that it binds to the acetylcholine receptor. Antibodies, their fragments and other polypeptides which bind to the acetylcholine receptor are suitable for this purpose. By their specific binding, the peptides can be used to detect neurons that carry the acetylcholine receptor. Preferably, the peptide is selected since at such ¬ that the bond between the peptide and the acetylcholine receptor, so called a linear coefficient. KD value comprises of <100 nM, preferably <10 nM, more preferably of 7.5 nM. The peptide itself is composed of amino acids, that is, of the body's own or body-like molecules, so that it is very well tolerated by the patient. It is not toxic and can of course be metabolized, broken down and excreted.
Der Begriff "Neuron" bezeichnet eine Nervenzelle des PNS oder ZNS. Nervenzellen werden an Hand ihrer Funktion, Morphologie, Lokalisation oder Genexpression klassifiziert. Zusammen mit Makroglia (Astrozyten) und Oligodendroglia (Oligodendrozyten) bilden sie zelluläre Systeme, die spezifische Funktionen im Nervensystem erfüllen. Diese Systeme können auf bestimmte Re¬ gionen des Nervenssystems beschränkt sein, oder sich über mehrere Gehirnregionen hinweg erstrecken, wie beispielsweise Nervenfaserbündel, die vom ventralen Tegmentum aus den Sehhü¬ gel (Thalamus) und das Mittelhirn (Mesencephalon) innervie¬ ren. Derartige neuronale Systeme zeichnen sich oft durch spe¬ zifische Eigenschaften aus, beispielsweise dadurch, dass Ner¬ venimpulse zwischen diesen Zellen durch einen bestimmten Neu- rotransmitter vermittelt werden. Projektionsneurone aus dem ventralen Tegmentum und aus dem basalen Vorderhirn (Stria- tum) , sowie eine Untergruppe Interneurone des Striatums bil¬ den die drei wesentlichen cholinergen Systeme des ZNS, die Acetylcholin als Neurotransmitter verwenden. Zur Weiterlei- tung eines Nervenimpulses schüttet das präsynaptische choli- nerge Neuron Acetylcholin aus. Dieses bindet an den Acetyl- cholinrezeptor des postsynaptischen Neurons und löst eine De- polarisation dieses Neurons aus. Die Zellen der cholinergen Systeme sind dementsprechend durch die Bildung von Acetylcho¬ lin und Acetylcholinrezeptoren gekennzeichnet und können mittels des erfindungsgemäß verwendeten Peptids, das an den Ace- tylcholinrezeptor bindet, nachgewiesen werden. Die Detektion des Peptids und des daran gebundenen Acetylcho- linrezeptors erfolgt über ein integriertes 11C-Kohlenstoff- atom. Beim Zerfall des 11C-Kohlenstoffisotops werden Positro¬ nen, die auch als ß+-Strahlung bezeichnet werden, gebildet. Stoßen die Positronen auf ein Elektron, bilden sie zwei Pho- tonen, die sich in einem Winkel von 180°, also genau in ent¬ gegen gesetzter Richtung, von einander entfernen. Die Photonen können detektiert und daraus die Position der Positrone¬ nemission, bzw. des 11C-Kohlenstoffatoms , berechnet werden. Die Integration eines 11C-Kohlenstoffatom in das erfindungs- gemäß verwendete Peptid, ermöglicht es, die Verwendung chemi¬ scher, körperfremder Stoffe zu vermeiden. Durch den direkten Einbau des 11C-Kohlenstoffisotops in das Peptid ist die ra¬ dioaktive Markierung ohne Komplexbildner, wie Diethylentria- minpentaacetat (DTPA), 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane- 1, 4, 7, 10-tetraacetic acid (DOTA) oder Ethylendiamintetraace- tat (EDTA) , möglich. Außerdem kann vermieden werden, dass ein The term "neuron" refers to a nerve cell of the PNS or CNS. Nerve cells are classified according to their function, morphology, localization or gene expression. Together with macroglia (astrocytes) and oligodendroglia (oligodendrocytes), they form cellular systems that fulfill specific functions in the nervous system. These systems may be limited to certain Re ¬ regions of the nervous system, or may extend over several regions of the brain of time, such as nerve fiber bundles from the ventral tegmental area of the Sehhü ¬ gel (thalamus) and the midbrain (mesencephalon) innervie ¬ ren. Such neural systems often characterized by spe ¬-specific properties, for example in that Ner ¬ venimpulse mediated rotransmitter between these cells by a specific new. Bil ¬ the use projection neurons of the ventral tegmental area and out of the basal forebrain (Stria- growth), as well as a subset of neurons of the striatum Inter the three essential cholinergic system of the central nervous system, acetylcholine as a neurotransmitter. For onward The presynaptic cholinergic neuron releases acetylcholine in response to a nerve impulse. This binds to the acetylcholine receptor of the postsynaptic neuron and triggers a depolarization of this neuron. The cells of the cholinergic system are thus characterized by the formation of Acetylcho ¬ lin and acetylcholine receptors, and can be detected by means of the inventively used peptide, which binds to the acetone tylcholinrezeptor. The detection of the peptide and of the acetylcholine receptor bound thereto takes place via an integrated 11 C carbon atom. The decay of the C-11 carbon isotope positron ¬ nen are also referred to as SS + radiation is formed. Push the positron on an electron, they form two photon clays ent remove at an angle of 180 °, which is exactly in ¬ opposite direction, from each other. The photons can be detected and the position of the positrons ¬ nemission, or the C 11 carbon atom calculated therefrom. The integration of a C-11 carbon atom in the inventiveness used according to the peptide makes it possible to avoid the use of chemical ¬ shear, foreign substances. By the direct incorporation of 11 C-carbon isotope in the peptide is the ra ¬ dioaktive marking without complexing agents such as diethylenetriamine minpentaacetat (DTPA), 1, 4, 7, 10-tetraazacyclododecane- 1, 4, 7, 10-tetraacetic acid ( DOTA) or ethylenediamine tetraacetate (EDTA). You can also avoid that
1 radioaktiver Fremdstoff, wie beispielsweise Fluor, Xenon, oder 68Gallium, in den Organismus eingebracht werden muss. Zur Herstellung eines erfindungsgemäß zu verwendenden Peptids sind insbesondere die Verfahren, die in den Patentanmeldungen DE 10 2009 035 648.7 und DE 10 2009 035 645.2 beschrieben werden, geeignet. Somit kann durch die erfindungsgemäße Ver¬ wendung des Peptids sowohl des Vorhandensein, als auch die Position des Acetylcholinrezeptors nachgewiesen und abgebil- det werden. Des Weiteren kann auch die Menge an Peptiden, die sich an einer bestimmten Stelle befindet, quantifiziert wer¬ den . Ein weiterer Vorteil des direkt mit 11C markierten Peptids liegt in dem günstigen Signal/Hintergrund Verhältnis während der Detektion. Das Peptid bindet spezifisch an den Acetylcho- linrezeptor und bildet mit diesem einen stabilen Komplex. Freie, ungebundene Peptide werden dagegen rasch verstoffwech- seit und aus dem Organismus ausgeschieden, weil sie von endo¬ genen Enzymen zügig abgebaut werden können. Dadurch entsteht ein starkes und spezifisches Signal an der Position des Ace- tylcholinrezeptors , und das Hintergrundsignal wird minimiert. In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung weist das Peptid mindestens eine D-Aminosäure auf. Mit Ausnahme des Glycins, besitzen Aminosäuren an ihrem alpha-C-Kohlenstoff- atom ein chirales Zentrum und können daher als Konfigurationsisomere, nämlich als D- oder L-Aminosäure, vorliegen. Körpereigene Peptide und Proteine sind weitgehend aus Amino¬ säuren in L-Konfiguration aufgebaut. Zudem arbeiten die meisten natürlichen Proteasen und Peptidasen stereoselektiv und verstoffwechseln hauptsächlich L-Aminosäuren . Daher dauert der Abbau von D-Aminosäuren durch körpereigene Enzyme länger als der von L-Aminosäuren. Dieser Umstand kann verwendet werden, um die Halbwertszeit eines Proteins oder Peptids zu ver¬ längern, indem neben L-Aminosäuren auch D-Aminosäuren verwendet werden (Neundorf I et al . , 2008) . Dadurch kann die pharmakologische Clearance, also die Zeit bis das Peptid aus dem Organismus ausgeschieden wird, positiv beeinflusst werden. Bei dem Austausch einzelner L-Aminosäuren gegen ihre D- Konfiguration ist jedoch darauf zu achten, dass die Bin- dungsspezifität des Peptids nicht verändert wird. Eine weite¬ re Möglichkeit, die pharmakologische Clearance des Peptids zu beeinflussen, besteht darin einzelne der Aminosäuren des Peptids durch nicht natürliche Aminosäuren mit ähnlichen chemischen Eigenschaften zu ersetzen. Die nicht natürlichen Aminosäuren werden langsamer verstoffwechselt , weil die körperei- genen proteolytischen Enzyme speziell an den Abbau natürlicher Aminosäuren angepasst sind. Bei der Modifizierung des Peptids sollten die nicht natürlichen Aminosäuren jedoch so gewählt werden, dass die Bindungsaffinität des Peptids nicht verändert wird. Darüber hinaus sind auch andere chemische Mo- difikationen einzelner Aminosäuren des Peptids möglich, um die Halbwertszeit des Peptids gezielt zu beeinflussen. Bei¬ spielsweise kann die endständige Aminogruppe des Peptids durch eine Isonitrilgruppe ersetzt werden. Eine solche Modi¬ fikation reduziert die, von der Aminogruppe vermittelte, In- teraktion mit proteolytischen Enzymen, ohne die Bindung zwischen dem erfindungsgemäß verwendeten Peptid und dem Acetyl- cholinrezeptor zu verändern. 1 radioactive foreign substance, such as fluorine, xenon, or 68 gallium, must be introduced into the organism. For the preparation of a peptide to be used according to the invention, the processes described in patent applications DE 10 2009 035 648.7 and DE 10 2009 035 645.2 are particularly suitable. Thus, both the presence, and the position of the acetylcholine receptor can be detected by the inventive Ver ¬ application of the peptide and abgebil- be. Furthermore, the amount of peptides, which is located at a certain point, quantified ¬ to. Another advantage of the directly labeled with 11 C peptide lies in the favorable signal / background ratio during detection. The peptide binds specifically to the acetylcholine receptor and forms a stable complex with it. Free, unbound peptides, however rapidly metabolised excreted from the body and since, because they can be degraded rapidly by endo ¬-related enzymes. This produces a strong and specific signal at the position of the acetylcholine receptor, and the background signal is minimized. In an advantageous embodiment of the invention, the peptide has at least one D-amino acid. With the exception of glycine, amino acids have a chiral center at their alpha carbon atom and can therefore exist as configurational isomers, namely as the D or L amino acid. Endogenous peptides and proteins are largely made up of amino acids in ¬ L-configuration. In addition, most natural proteases and peptidases work stereoselectively and mainly metabolize L-amino acids. Therefore, the degradation of D-amino acids by endogenous enzymes takes longer than that of L-amino acids. This fact can be used to determine the half-life of a protein or peptide to ver ¬ lengthen by even D-amino acids are used in addition to L-amino acids (Neundorf I et al., 2008). As a result, the pharmacological clearance, ie the time until the peptide is eliminated from the organism, can be positively influenced. However, when replacing individual L-amino acids with their D-configuration, care must be taken not to alter the binding specificity of the peptide. A wide ¬ re possibility that pharmacological clearance of the peptide to to affect, is to replace some of the amino acids of the peptide by non-natural amino acids with similar chemical properties. The non-natural amino acids are metabolized more slowly because the body's proteolytic enzymes are specially adapted to the breakdown of natural amino acids. However, when modifying the peptide, the non-natural amino acids should be chosen so that the binding affinity of the peptide is not altered. In addition, other chemical modifications of individual amino acids of the peptide are possible in order to specifically influence the half-life of the peptide. In ¬ play, the terminal amino group of the peptide may be replaced by an isonitrile group. Such modes ¬ fication reduces, mediated by the amino group of an interaction with proteolytic enzymes without altering the bond between the peptide used in the invention and the acetyl cholinrezeptor.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist das Peptid ein Antagonist des Acetylcholinrezeptors . Im natürli¬ chen Kontext werden Acetylcholinrezeptoren durch die Bindung von Acetylcholin oder dessen Agonisten aktiviert, so dass es zu einer Depolarisation bzw. Hyperpolarisation der Zellmembran kommt. Um zu vermeiden, dass durch die Bindung des erfin- dungsgemäß verwendeten Peptids an den Acetylcholinrezeptor eine ektopische De- oder Hyperpolarisation des Neurons ausge¬ löst wird, ist es vorteilhaft, wenn das Peptid an den Acetyl¬ cholinrezeptor bindet, ohne diesen zu aktivieren. Besonders geeignet sind hierfür Peptide, die als Antagonisten des Ace- tylcholinrezeptors fungieren. Sie zeigen eine spezifischeIn an advantageous embodiment of the invention, the peptide is an antagonist of the acetylcholine receptor. In Natürli ¬ chen context acetylcholine receptors are activated by the binding of acetylcholine or its agonists, so that there is a depolarization or hyperpolarization of the cell membrane. In order to avoid that due to the binding of the peptide According to the invention used at the acetylcholine receptor ectopic Removal or hyperpolarization of the neuron out is ¬ dissolves, it is advantageous if the peptide binds to the acetyl ¬ cholinrezeptor without activating it. Particularly suitable for this purpose are peptides which act as antagonists of the acetylcholine receptor. They show a specific
Bindungsaffinität zu dem Rezeptor, führen aber nicht zu des¬ sen Aktivierung. In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist das Peptid so gewählt, dass es die Bluthirnschranke selbständig überquert. Die Bluthirnschranke stellt eine Barriere zwischen dem Gehirn und dem restlichen Organismus dar, die nicht von allen Molekülen, ohne weiteres, überwunden werden kann. Kleine, insbesondere lipophile Moleküle können durch die Blut¬ hirnschranke, die von Astrozyten des Gehirns und Epithelzel¬ len der Blutgefäße gebildet wird, hindurch diffundieren. Andere Moleküle, wie beispielsweise Ionen, Aminosäuren und Zu- ckermoleküle, werden mittels Kanälen oder aktiven Transporterproteinen über die Bluthirnschranke transportiert. Ein er¬ findungsgemäß verwendetes Peptid, das die Eigenschaft auf¬ weist, die Bluthirnschranke selbständig, vorzugsweise durch freie Diffusion, zu überwinden, ist besonders vorteilhaft, weil das Agens in den Blutkreislauf injiziert werden kann und nicht direkt in die Zerebrospinalflüssigkeit (Liquor ce¬ rebrospinalis) appliziert werden muss. Binding affinity to the receptor, but do not lead to its ¬ sen activation. In an advantageous embodiment of the invention, the peptide is chosen so that it traverses the blood-brain barrier independently. The blood-brain barrier represents a barrier between the brain and the rest of the organism, which can not be overcome by all molecules, without further ado. Small, especially lipophilic molecules can diffuse through the blood-brain barrier ¬ formed of astrocytes of the brain and Epithelzel ¬ len of the blood vessels. Other molecules, such as ions, amino acids, and sugar molecules, are transported across the blood-brain barrier by channels or active transporter proteins. To overcome it ¬ inventively used peptide that has the property ¬, the blood brain barrier independently, preferably by free diffusion, is particularly advantageous because the agent can be injected into the bloodstream and (not directly into the cerebrospinal fluid CSF ce ¬ rebrospinalis ) must be applied.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist der Acetylcholinrezeptor ein nicotinerger Acetylcholinrezeptor . Der Verlust des Dopamintransporters , wie er bei Morbus Par¬ kinson auftritt, geht auch mit einer Reduktion von nicotiner- gen Acetylcholinrezeptoren in den Neuronen des Nucleus cauda- tus und Putamen des Vorderhirns einher (Quik M et al . , 2001) . Bei Alzheimerpatienten wurde außerdem eine starke Abnahme von nicotinergen Acetylcholinrezeptoren der Striatalen Interneurone beobachtet (Dani JA und Bertrand D, 2007) . Durch die er¬ findungsgemäße Verwendung eines Peptids, das an einen nicoti¬ nergen Acetylcholinrezeptor bindet, kann die Expression des nicotinergen Acetylcholinrezeptor nachgewiesen werden. Durch den Nachweis eines pathologischen Verlusts dieses Rezeptors ist eine verlässliche Abgrenzung von Alzheimerdemenz bzw. Morbus Parkinson gegen andere neurologische Erkrankungen mög¬ lich. In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist das Agens ein Radiopharmakon . Der Begriff "Radiopharmaka" bezeichnet Arzneimittel, die Radionuklide enthalten, deren Strahlung zur Diagnostik und Therapie verwendet wird. Die wichtigsten Anwendungsgebiete sind dabei die Onkologie, Kar¬ diologie und Neurologie, aber auch die Arzneimittelforschung. Als Radionuklide werden Gamma- bzw. Beta-Strahlen emittierende Nuklide, zum Beispiel 133Xenon, "Technetium, 68Gallium, und 18Fluor, verwendet. Sie werden üblicherweise über Kom¬ plexbildner wie DOTA, DTPA oder EDTA an Mono- oder Polysaccharide gebunden. Die Nuklide werden, je nach der Art ihrer Strahlung, mittels Szintigraphie, Single Photon Emission Com- puted Tomography (SPECT) oder Positronen-Emissions-Tomo- graphie (PET) detektiert. Aufgrund ihrer unphysiologischenIn an advantageous embodiment of the invention, the acetylcholine receptor is a nicotinic acetylcholine receptor. The loss of the dopamine transporter, such as occurs in Crohn par ¬ kinson, goes well with a reduction of nicotiner- gen acetylcholine receptors in the neurons of the nucleus caudatus and putamen of the forebrain accompanied (Quik M et al., 2001). In Alzheimer's patients, a strong decrease of nicotinergic acetylcholine receptors of the striatal interneurons has also been observed (Dani JA and Bertrand D, 2007). Through which it ¬ invention proper use of a peptide that binds to a nicoti ¬ nergen acetylcholine receptor, the expression of the nicotinic acetylcholine receptor can be detected. By detecting a pathological loss of this receptor a reliable distinction between Alzheimer's disease or Parkinson's disease against other neurological disorders is mög ¬ Lich. In an advantageous embodiment of the invention, the agent is a radiopharmaceutical. The term "radiopharmaceuticals" refers to medicines containing radionuclides whose radiation is used for diagnosis and therapy. The main applications are in oncology, Kar ¬ ogy and neurology, as well as pharmaceutical research. When radionuclides are gamma or beta radiation emitting nuclides, for example Xenon 133, "technetium, gallium 68, fluorine 18 and used. They are usually bound via Kom ¬ formers such as DOTA, DTPA or EDTA mono- or polysaccharides. Depending on the nature of their radiation, the nuclides are detected by means of scintigraphy, single photon emission com- puted tomography (SPECT) or positron emission tomography (PET)
Bestandteile können herkömmliche Radiopharmaka jedoch Neben¬ wirkungen, wie anaphylaktische oder allergische Reaktionen, im Körper eines Patienten verursachen. Die Verwendung eines Peptids aus körpereigenen Aminosäuren reduziert diese Gefahr deutlich, weil weder das Peptid selbst, noch seine Abbaupro¬ dukte toxisch sind. Zudem ist Kohlenstoff, im Gegensatz zu Technetium oder Xenon, ein im Körper vorkommendes Element, das natürlich verstoffwechselt werden kann. Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist das ^C-Kohlenstoffatom das Carbonylkohlenstoffatom einer Aminosäure. Die Carbonylgruppen sind Teil der Peptidbindungen zwischen den Aminosäuren und liegen im Inneren des Peptids. Dadurch ist gewährleistet, dass das ^C-Kohlenstoffatom nicht vom Peptid abgespalten wird, wie es etwa bei einer Seitenket¬ te einer der Aminosäuren möglich wäre. However, components can cause side effects ¬ as anaphylactic or allergic reactions in the body of a patient conventional radiopharmaceuticals. The use of a peptide from endogenous amino acids significantly reduced this risk because neither the peptide itself, nor his Abbaupro ¬-products are toxic. In addition, unlike technetium or xenon, carbon is an element found in the body that naturally can be metabolized. According to an advantageous development of the invention, the C-carbon atom is the carbonyl carbon atom of an amino acid. The carbonyl groups are part of the peptide bonds between the amino acids and are located inside the peptide. This ensures that the ^ C-carbon atom is not cleaved from the peptide, as it would be possible at about a Seitenket ¬ th one of the amino acids.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das ^C-Kohlenstoffatom das Carbonylkohlenstoffatom der N-terminalen Aminosäure des Peptids. Diese Ausführungsform ist besonders bevorzugt, weil das Peptid direkt nach dem An¬ bringen der 11C-markierten Aminosäure verwendet werden kann. 11C-Kohlenstoff hat eine Halbwertszeit von nur ca. 20 Minu- ten, so dass die Strahlungsdosis desto höher gewählt werden muss, je mehr Zeit zwischen der Synthese des Peptids und sei¬ ner Verwendung liegt. Wird die 11C-Markierung mit der N- terminalen Aminosäure und damit im letzten Schritt der Synthese angebracht, kann das Peptid sofort nach seiner Synthese verwendet werden. Auf diese Weise wird die Zeitspanne zwi¬ schen der Verarbeitung des 11C-Kohlenstoffs und dem Einsatz des Peptids reduziert, so dass der Strahlungsverlust während der Herstellung des Peptids minimiert wird. Deshalb kann die Strahlendosis, die bei der Verarbeitung des 11C-Kohlenstoffs eingesetzt werden muss um eine bestimmte Strahlungsstärke des Produkts zu gewährleisten, entsprechend geringer sein. Die Herstellung wird dadurch kostengünstiger und die Strahlenbelastung für das technische Personal, welches das Peptid her¬ stellt, verringert. According to a further preferred embodiment of the invention, the C-carbon atom is the carbonyl carbon atom of N-terminal amino acid of the peptide. This embodiment is particularly preferred because the peptide immediately after the on ¬ bring the 11 C-labeled amino acid can be used. 11 C-carbon has ten a half-life of only about 20 for minutes, so that the radiation dose to be selected the higher, the more time between the synthesis of the peptide and be ¬ ner is situated. If the 11 C-labeling with the N-terminal amino acid and thus in the last step of the synthesis is applied, the peptide can be used immediately after its synthesis. In this way, the time Zvi ¬'s processing of the C-11 carbon and the use of the peptide is reduced, so that the radiation loss is minimized during the manufacture of the peptide. Therefore, the radiation dose that must be used in the processing of the 11 C carbon to ensure a certain radiation intensity of the product, be correspondingly lower. The production is more cost-effective and thereby the radiation exposure for the technical staff that forth ¬ represents the peptide reduced.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Radiopharmakon, das ein Peptid mit einem 11C-Kohlenstoffatom umfasst, zum Nachweis von Neuronen, die einen Acetylcholinrezeptor expri- mieren. Indem ein Peptid, das an den Acetylcholinrezeptor bindet und ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist, verwendet wird, ist das Radiopharmakon für den Patienten gut verträglich und kann kostengünstig produziert werden. Another object of the invention is a radiopharmaceutical comprising a peptide having an 11 C carbon atom for the detection of neurons expressing an acetylcholine receptor. By using a peptide that binds to the acetylcholine receptor and has an 11 C carbon atom, the radiopharmaceutical is well tolerated by the patient and can be produced inexpensively.
Das erfindungsgemäße Radiopharmakon bietet daher ein wirt- schaftlich und medizinisch vorteilhaftes Agens, um die Menge und Verteilung von Neuronen, die einen Acetylcholinrezeptor exprimieren, in vivo zu bestimmen. Nachdem das Radiopharmakon einem Patienten verabreicht wurde, verteilen sich die darin enthaltenen Peptide in dessen Körper und binden spezifisch an Acetylcholinrezeptoren . Dadurch sammeln sie sich an den Ace- tylcholinrezeptor-positiven Neuronen, wo sie durch das radioaktive Signal des 11C-Kohlenstoffatoms detektiert werden. Auf diese Weise werden die Neurone im Nervensystem des Patienten nachgewiesen. The radiopharmaceutical according to the invention therefore offers an economically and medically advantageous agent for determining in vivo the amount and distribution of neurons expressing an acetylcholine receptor. After the radiopharmaceutical has been administered to a patient, the peptides contained therein are distributed into the body and bind specifically Acetylcholine receptors. As a result, they accumulate at the acetylcholine receptor-positive neurons, where they are detected by the radioactive signal of the 11 C carbon atom. In this way, the neurons are detected in the nervous system of the patient.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist das 11C- Kohlenstoffatom ein Carbonylkohlenstoffatom einer Aminosäure, bevorzugt das Carbonylkohlenstoffatom der N-terminalen Amino- säure des Peptids. According to an advantageous embodiment, the 11 C carbon atom is a carbonyl carbon atom of an amino acid, preferably the carbonyl carbon atom of the N-terminal amino acid of the peptide.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Radiopharmakon ein PET Biomarker. Die PET ist ein etabliertes Verfahren um die Strahlung radioaktiver Elemente zu erfassen und ihre Po- sition zu bestimmen (Massoud TF, Gambhir SS, 2003) . Mit Hilfe von ringförmig um den Patienten angeordneten Detektorgeräten werden Schnittbilder erstellt, auf denen die Zerfallsereig- nisse in ihrer räumlichen Verteilung im Körperinneren dargestellt werden. Im Gegensatz zu den bisher üblichen Szintigra- phie-Verfahren, ist durch die ringförmige Anordnung der PET- Detektoren eine exaktere räumliche Lokalisation der Positro¬ nenemission und damit eine wesentlich genauere und detail¬ lierter Abbildung des krankhaften Gewebes möglich. Die PET ermöglicht es auch, die Menge an markierten Molekülen in ei- nem Gewebe quantitativ zu bestimmen. In a preferred embodiment, the radiopharmaceutical is a PET biomarker. PET is an established method for detecting the radiation of radioactive elements and determining their position (Massoud TF, Gambhir SS, 2003). With the aid of detector devices arranged annularly around the patient, sectional images are created on which the decay events are represented in their spatial distribution in the interior of the body. In contrast to the usual scintigraphic chromatography method, is by the annular configuration of the PET detectors a more precise spatial localization of the positron ¬ nenemission and thus a substantially more accurate and detailed ¬ profiled imaging the diseased tissue is possible. PET also makes it possible to quantify the amount of labeled molecules in a tissue.
Außerdem wird ein Verfahren zum Nachweis von Neuronen in einem Organismus, die einen Acetylcholinrezeptor exprimieren, offenbart, umfassend die Schritte, a) Bereitstellen eines Peptids, b) Verabreichen des Peptids an den Organismus und c) Detektieren des Peptids in dem Organismus mittels Positronen- Emissions-Tomographie (PET) . Dabei bindet das Peptid an den Acetylcholinrezeptor und weist ein 11C-Kohlenstoffatom auf. Mit dem erfindungsgemäß verwendeten Peptid wird ein Acetyl¬ cholinrezeptor im Inneren eines Organismus detektiert und lo¬ kalisiert, so dass die Verteilung des Acetylcholinrezeptors im Körper eines Patienten beobachtet werden kann. Auf diese Weise kann die Menge und Verteilung der Acetylcholinrezeptor- positiven Neurone bestimmt werden. Das erfindungsgemäß ver¬ wendete Peptid ist daher auch zur Beobachtung des Verlaufs einer Erkrankung und ihrer Behandlung, sog. Therapiemonitoring, geeignet. Also disclosed is a method of detecting neurons in an organism expressing an acetylcholine receptor, comprising the steps of a) providing a peptide, b) administering the peptide to the organism, and c) detecting the peptide in the organism by positron emission Tomography (PET). The peptide binds to the acetylcholine receptor and has an 11 C carbon atom. With the peptide according to the invention an acetyl ¬ cholinrezeptor is detected inside an organism and lo ¬ kalisiert, so that the distribution of the acetylcholine receptor can be observed in the body of a patient. In this way, the amount and distribution of acetylcholine receptor positive neurons can be determined. The present invention ver ¬ turned peptide therefore also for observing the progression of a disease and its treatment, so-called. Therapy monitoring, are suitable.
Figur 1 zeigt schematisch die Bindung zwischen einem Peptid 1 und einem nicotinergen Acetylcholinrezeptor 4. FIG. 1 shows schematically the bond between a peptide 1 and a nicotinergic acetylcholine receptor 4.
Das Peptid 1 umfasst 16 Aminosäuren 2, von denen die N- terminale Aminosäure 3 mit einem 11C-Kohlenstoffatom radioaktiv markiert ist. Die radioaktive Markierung ist durch einen Stern (*) dargestellt. Die Aminosäuren 2 an den Positionen zwei und acht sowie drei und sechzehn sind jeweils durch Di- sulfidbrücken 5, die durch Linien dargestellt sind, verbun- den. Diese kovalente Bindung zwischen den Schwefelatomen zweier Cystein Seitenketten trägt zur Stabilität der dreidimensionalen Struktur des Moleküls bei. Ein Teil des Peptids 1 ist an den nicotinergen Acetylcholinrezeptor 4 angelagert, der sich auf der Oberfläche eines Neurons 18 befindet. Peptide 1 comprises 16 amino acids 2, of which the N-terminal amino acid 3 is radioactively labeled with an 11 C carbon atom. The radioactive label is represented by an asterisk (*). The amino acids 2 at positions two and eight, and three and sixteen are each connected by disulfide bridges 5, which are represented by lines. This covalent bond between the sulfur atoms of two cysteine side chains contributes to the stability of the three-dimensional structure of the molecule. Part of peptide 1 is attached to the nicotinic acetylcholine receptor 4, which is located on the surface of a neuron 18.
Das ^C-markierte Peptid 1 bindet spezifisch an den nicoti¬ nergen Acetylcholinrezeptor 4, nicht aber an andere Moleküle. Das Peptid 1 kann daher zur Detektion des nicotinergen Acetylcholinrezeptors 4 verwendet werden. Die beim Zerfall des 11C-Kohlenstoffatoms abgegebenen Positronen werden mittelsThe C-labeled peptide 1 ^ specifically binds to the nicoti ¬ nergen acetylcholine receptor 4, but not to other molecules. The peptide 1 can therefore be used to detect the nicotinergic acetylcholine receptor 4. The positrons released upon the decay of the 11 C carbon are
Positronen-Emissions-Tomographie (PET) nachgewiesen. Der Ort der Positronenemission entspricht dem Ort des Peptids 1 und des daran gebundenen nicotinergen Acetylcholinrezeptors 4. Das Peptid 1 kann daher zur Bestimmung der Position eines Neurons 18 verwendet werden, das den nicotinergen Acetylcho- linrezeptor 4 bildet. Positron emission tomography (PET) detected. The location of the positron emission corresponds to the location of the peptide 1 and the nicotinic acetylcholine receptor 4 bound thereto. The peptide 1 can therefore be used to determine the position of a Neurons 18, which forms the nicotinergic acetylcholine receptor 4.
Im Rahmen einer Parkinsondiagnose wird einem Patienten ein Radiopharmakon, welches das 11C-markierte Peptid 1 enthält, verabreicht, um Neurone 18, die einen nicotinergen Acetylcho- linrezeptor 4 exprimieren, nachzuweisen. Das Peptid 1 bindet spezifisch an den nicotinergen Acetylcholinrezeptor 4 und sammelt sich so an den Neuronen 18, die den nicotinergen Ace- tylcholinrezeptor 4 tragen. Diese Anhäufung wird durch PET abgebildet und die Verteilung des nicotinergen Acetylcholin- rezeptors 4 bzw. die Menge und Verteilung der Neurone 18, vor allem im Nucleus caudatus und im Putamen des Patienten bestimmt. Außerdem kann die Medikation eines Therapeutikums, zum Beispiel Wirkstoffmenge und Verabreichungsplan, entspre¬ chend dem Ergebnis einer solchen Untersuchung angepasst werden . As part of a Parkinsondiagnose a patient is a radiopharmaceutical containing the 11 C-labeled peptide 1, administered to detect neurons 18 that express a nicotinergic acetylcholine receptor 4. Peptide 1 binds specifically to the nicotinic acetylcholine receptor 4 and thus accumulates on the neurons 18 which carry the nicotinic acetylcholine receptor 4. This accumulation is represented by PET and the distribution of the nicotinergic acetylcholine receptor 4 or the amount and distribution of the neurons 18, especially in the caudate nucleus and in the putamen of the patient. In addition, the medication of a therapeutic agent, for example, amount of active ingredient and administration schedule can be adjusted accordingly entspre ¬ the result of such an investigation can.
Figur 2 zeigt eine Darstellung eines Peptids 1 mit der Se- quenz SEQ ID Nr.: 1 mittels chemischer Formel, das unter dem Handelsnamen -Conotoxin MII von Tocris Bioscience (16144 Westwoods Business Park, Ellisville, Missouri 63021, USA) vertrieben wird. Das Peptid der SEQ ID Nr.: 1 umfasst 16 Aminosäuren 2 der folgenden Sequenz: Glycin-Cystein-Cystein-Serin-Asparagin- Prolin-Valin-Cystein-Histidin-Leucin-Glutaminsäure-Histidin- Serin-Asparagin-Leucin-CysteinAmid . Die N-terminalen Aminosäuren 2 Glycin und Cystein sind mittels Strukturformel dargestellt, die folgenden Aminosäuren 2 durch ihren jeweiligen Drei-Buchstaben Code. Die Aminosäure 2 CysteinAmid ist mit CysA bezeichnet und besitzt ein C- termiales Amid. Die Cysteine an Position zwei und acht bzw. drei und sechzehn sind durch Disulfidbrücken, dargestellt durch Linien, verbunden. Die Sequenz des Peptids ist auch in SEQ ID Nr.: 1 angegeben. Das Carbonylkohlenstoffatom des N- terminalen Glycins ist ein 11C-Kohlenstoffatom, dargestellt durch die Ziffer 11 oberhalb des Carbonylkohlenstoffatoms . FIG. 2 shows a representation of a peptide 1 having the sequence SEQ ID NO: 1 by means of a chemical formula sold under the trade name -Conotoxin MII by Tocris Bioscience (16144 Westwoods Business Park, Ellisville, Missouri 63021, USA). The peptide of SEQ ID NO: 1 comprises 16 amino acids 2 of the following sequence: glycine-cysteine-cysteine-serine-asparagine-proline-valine-cysteine-histidine-leucine-glutamic acid-histidine-serine-asparagine-leucine-cysteine Am i d . The N-terminal amino acids 2 glycine and cysteine are represented by structural formula, the following amino acids 2 by their respective three-letter code. The amino acid 2 cysteine Am i d is designated Cys A and possesses a C-termial amide. The cysteines at position two and eight resp. three and sixteen are connected by disulfide bridges, represented by lines. The sequence of the peptide is also given in SEQ ID NO: 1. The carbonyl carbon atom of the N-terminal glycine is an 11 C carbon atom represented by the number 11 above the carbonyl carbon atom.
Das Peptid 1 wird mit herkömmlichen Proteinsyntheseverfahren hergestellt und die 11C-markierte N-terminale Aminosäure 3 im letzten Schritt hinzu gefügt, weil die Halbwertszeit des 11C- Kohlenstoffisotops bei nur ca. 20 Minuten liegt. Dadurch, dass die Peptidsynthese mit der 11C-markierten Aminosäure 3 abgeschlossen wird, kann das Peptid 1 nach der radioaktiven Markierung sofort verwendet werden. Das Peptid der SEQ ID Nr.: 1 bindet spezifisch an einen nico- tinergen Acetylcholinrezeptor 4. Diese Rezeptoren gehören zur Familie der liganden-gesteuerten Ionenkanäle und bestehen aus insgesamt fünf gleichen oder unterschiedlichen Untereinheiten. Sie werden durch die Bindung von Acetylcholin oder eines Agonisten aktiviert, wodurch eine Konformationsänderung desPeptide 1 is prepared by conventional protein synthesis methods and the 11 C-labeled N-terminal amino acid 3 is added in the last step because the half-life of the 11 C carbon isotope is only about 20 minutes. By completing the peptide synthesis with the 11 C-labeled amino acid 3, the peptide 1 can be used immediately after the radioactive labeling. The peptide of SEQ ID NO: 1 binds specifically to a nicotinic acetylcholine receptor 4. These receptors belong to the family of ligand-gated ion channels and consist of a total of five identical or different subunits. They are activated by the binding of acetylcholine or an agonist, resulting in a conformational change of the
Rezeptors die Öffnung der Kanalpore bewirkt. Nicotinerge Ace- tylcholinrezeptoren 4 sind Kationenkanäle, durch die vor allem Natrium- und Calciumionen ins Innere der Zelle gelangen. Dadurch kommt es zur Depolarisation der Zellmembran und zur Weiterleitung des Nervenimpulses. Das Peptid der SEQ ID Nr.: 1 bindet an den nicotinergen Acetylcholinrezeptor 4, jedoch ohne diesen zu aktivieren. Es ist daher für die Detektion von Neuronen 18, die nicotinerge Acetylcholinrezeptoren 4 expri- mieren besonders geeignet. Eine Markierung mittels X1C- Kohlenstoff ist dabei besonders vorteilhaft, weil sie die physiologische Struktur des Peptids 1 nicht beeinflusst und weder die Verteilung im Gewebe noch die Verträglichkeit des Peptids 1 beeinträchtigt. Bei Patienten, die an Alzheimerdemenz leiden, wurde beobachtet, dass striatale, Acetylcholinrezeptor-positive Interneu¬ rone verloren gehen (Dani JA und Bertrand D, 2007) . Daneben konnte gezeigt werden, dass mit dem Verlust von dopaminergen Projektionsneuronen, wie er bei Morbus Parkinson beobachtet wird, auch nicotinerge Acetylcholinrezeptoren 4 in Neuronen 18 des Nucleus caudatus und Putamen verloren gehen (Quik M et al . , 2001) . Bei Verdacht auf eine dieser Krankheiten wird die Menge und Verteilung von Acetylcholinrezeptor-positiven Neu- ronen 18 mit Hilfe des Peptid der SEQ ID Nr.: 1 untersucht.Receptor causes the opening of the channel pore. Nicotinergic acetylcholine receptors 4 are cation channels through which, in particular, sodium and calcium ions enter the cell. This leads to the depolarization of the cell membrane and the transmission of the nerve impulse. The peptide of SEQ ID NO: 1 binds to the nicotinergic acetylcholine receptor 4, but without activating it. It is therefore particularly suitable for the detection of neurons 18 which express nicotinergic acetylcholine receptors 4. Labeling by means of X1 carbon carbon is particularly advantageous because it does not affect the physiological structure of the peptide 1 and does not adversely affect the distribution in the tissue or the compatibility of the peptide 1. In patients suffering from Alzheimer's disease, it was observed that striatal acetylcholine receptor positive Interneu ¬ rone lost (Dani YES and Bertrand D, 2007). In addition, it was shown that with the loss of dopaminergic projection neurons as observed in Parkinson's disease, nicotinergic acetylcholine receptors 4 are also lost in neurons 18 of the caudate nucleus and putamen (Quik M et al., 2001). If one of these diseases is suspected, the amount and distribution of acetylcholine receptor-positive neurons 18 is examined by means of the peptide of SEQ ID NO: 1.
Ist keine Reduktion von Acetylcholinrezeptoren in den betreffenden Gehirnregionen zu erkennen, können Alzheimerdemenz bzw. Morbus Parkinson mit großer Sicherheit ausgeschlossen werden. Wird hingegen ein Verlust sichtbar, ist es möglich die betroffenen Patienten bereits frühzeitig entsprechend zu behandeln. Das ist insbesondere wichtig, weil eine Regenera¬ tion bereits abgestorbener Neurone nicht möglich ist und die Erhaltung der noch intakten Zellen gefördert werden muss. Deshalb zeigen die zur Verfügung stehenden Therapien bei frühzeitiger Anwendung wesentlich bessere Behandlungsergebnisse. If no reduction of acetylcholine receptors in the respective brain regions can be detected, Alzheimer dementia or Parkinson's disease can be excluded with great certainty. If, on the other hand, a loss becomes visible, it is possible to treat the affected patients early enough. This is particularly important because a Regenera ¬ tion already dead neurons is not possible and the preservation of intact cells must be promoted. Therefore, the therapies available with early use show significantly better treatment results.
Figur 3 zeigt eine schematische Darstellung (stark vereinfacht nach Faller A, Schünke M, Der Körper des Menschen, Thieme, 2008) eines Blutkreislaufsystems 10 eines Organismus und die Verteilung eines Peptids 1 darin. Figure 3 shows a schematic representation (greatly simplified by Faller A, Schünke M, The Human Body, Thieme, 2008) of a circulatory system 10 of an organism and the distribution of a peptide 1 therein.
Das Blutkreislaufsystem 10 umfasst verschiedene schematisch dargestellte Organe, wie Lunge 12, Herz 13, Leber 14, Darm 15, Niere 16 und Gehirn 19, sowie Neuronen 18 darin. Darüber hinaus sind auch die Hauptadern 11, welche diese Organe ver¬ binden dargestellt. Das Peptid 1 ist durch Dreiecke entlang der Adern 11 dargestellt. Die Abbauprodukte 17 des Peptids 1 sind durch einzelne Striche innerhalb der Umrisse der Niere 16 dargestellt. The circulatory system 10 includes various schematically illustrated organs such as lung 12, heart 13, liver 14, intestine 15, kidney 16, and brain 19, as well as neurons 18 therein. In addition, the main veins 11 which represented these organs ver ¬ bind are. The peptide 1 is represented by triangles along the wires 11. The degradation products 17 of the peptide 1 are represented by individual dashes within the outline of the kidney 16.
Die Verteilung des Peptids 1 im Blutkreislaufsystem 10 um- fasst vier Phasen, die entlang der Darstellung von oben nach unten aufgeführt sind. The distribution of peptide 1 in the circulatory system 10 comprises four phases, which are listed along the top-down view.
Phase I: Das Peptid 1 wird in das Blutkreislaufsystem 10 des Organismus injiziert. Phase I: Peptide 1 is injected into the circulatory system 10 of the organism.
Phase II: Über das Blutkreislaufsystem 10 wird das Peptid 1 in die Organe 12, 13, 14, 15, 16 und 19 des Organismus trans¬ portiert . Phase II: Via the blood circulation system 10, the peptide 1 is trans ¬ ported into the organs 12, 13, 14, 15, 16 and 19 of the organism.
Phase III: Das zirkulierende Peptid 1 bindet spezifisch an den Acetylcholinrezeptor 4 und sammelt sich an den Neuronen 18, weil diese den Acetylcholinrezeptor 4 produzieren. Phase III: The circulating peptide 1 binds specifically to the acetylcholine receptor 4 and accumulates on the neurons 18 because they produce the acetylcholine receptor 4.
Phase IV: Nicht gebundenes Peptid 1 wird schnell verstoff- wechselt und enzymatisch abgebaut. Der Organismus unterschei¬ det nicht zwischen eigenen Peptiden und dem Peptid 1, weil es aus Aminosäuren 2, 3 aufgebaut ist, die den körpereigenen Molekülen entsprechen. Die Abbauprodukte 17 des Peptids 1 und der Aminosäuren 2, 3 sammeln sich vorwiegend in der Niere 16 von wo aus sie über die Blase und den Harnleiter ausgeschie¬ den werden. Referenzen Phase IV: Unbound peptide 1 is rapidly metabolised and enzymatically degraded. The organism not failed ¬ det between own peptides and the peptide 1, because it is composed of amino acids 2, 3, which correspond to the body's own molecules. The degradation products 17 of the peptide of amino acids 1 and 2, 3 collect predominantly they are over the bladder and the ureter excreted ¬ in the kidney 16 from where. references
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Claims

Verwendung eines Peptids (1) zur Herstellung eines Agens zur Detektion von Neuronen (18), die einen Acetylcholinrezeptor (4) exprimieren, Use of a peptide (1) for the production of an agent for the detection of neurons (18) expressing an acetylcholine receptor (4),
dadurch gekennzeichnet, characterized,
dass das Peptid (1) an den Acetylcholinrezeptor (4) bindet und ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist. the peptide (1) binds to the acetylcholine receptor (4) and has an 11 C carbon atom.
Verwendung nach Anspruch 1, Use according to claim 1,
dadurch gekennzeichnet, characterized,
dass das Peptid (1) mindestens eine D-Aminosäure (2) aufweist . the peptide (1) has at least one D-amino acid (2).
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, Use according to claim 1 or 2,
dadurch gekennzeichnet, characterized,
das Peptid (1) ein Antagonist des Acetylcholinrezeptors (4) ist. the peptide (1) is an antagonist of the acetylcholine receptor (4).
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, Use according to one of the preceding claims, characterized
dass der Acetylcholinrezeptor ( 4 ) ein nicotinerger Acetylcholinrezeptor (4) ist. the acetylcholine receptor (4) is a nicotinic acetylcholine receptor (4).
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, Use according to one of the preceding claims, characterized
dass das Agens ein Radiopharmakon ist. that the agent is a radiopharmaceutical.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, Use according to one of the preceding claims, characterized
dass das 11C-Kohlenstoffatom das Carbonylkohlenstoffatom einer Aminosäure (2), vorzugsweise der N-terminalen Aminosäure (3) des Peptids (1) ist. the 11 C carbon atom is the carbonyl carbon atom of an amino acid (2), preferably of the N-terminal amino acid (3) of the peptide (1).
7. Radiopharmakon zum Nachweis von Neuronen (18), die einen Acetylcholinrezeptor (4) exprimieren, umfassend ein Peptid (1), 7. A radiopharmaceutical for detecting neurons (18) expressing an acetylcholine receptor (4) comprising a peptide (1),
dadurch gekennzeichnet,  characterized,
dass das Peptid (1) an den Acetylcholinrezeptor (4) bindet und ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist. the peptide (1) binds to the acetylcholine receptor (4) and has an 11 C carbon atom.
Radiopharmakon nach Anspruch 7, Radiopharmaceutical according to claim 7,
dadurch gekennzeichnet,  characterized,
dass das 11C-Kohlenstoffatom das Carbonylkohlenstoffatom einer Aminosäure (2), vorzugsweise der N-terminalen Aminosäure (3) des Peptids (1) ist. the 11 C carbon atom is the carbonyl carbon atom of an amino acid (2), preferably of the N-terminal amino acid (3) of the peptide (1).
Radiopharmakon nach einem der Ansprüche 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, Radiopharmaceutical according to one of claims 7 or 8, characterized
dass es ein Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Bio- marker ist.  that it is a positron emission tomography (PET) biomarker.
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