DE102010026066A1 - 11C-labeled aptamer for the detection of a diseased tissue - Google Patents

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Abstract

Es wird die Verwendung eines Aptamers (1) zur Herstellung eines Agens zur Detektion eines krankhaften Gewebes (18) beschrieben. Das Aptamer (1) bindet dabei an das krankhafte Gewebe (18) und ist an eine Aminosäure (2) gekoppelt, die wiederum ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist. Ferner wird ein Radiopharmakon zur Lokalisation eines Tumors (18) beschrieben, das ein solches Aptamer (1) umfasst.The use of an aptamer (1) for the production of an agent for the detection of diseased tissue (18) is described. The aptamer (1) binds to the diseased tissue (18) and is coupled to an amino acid (2), which in turn has a 11C carbon atom. Furthermore, a radiopharmaceutical for localizing a tumor (18) is described which comprises such an aptamer (1).

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Aptamers zur Herstellung eines Agens zur Detektion eines krankhaften Gewebes. Sie betrifft ferner ein Radiopharmakon zur Lokalisation eines krankhaften Gewebes, das ein solches Aptamer umfasst.The invention relates to the use of an aptamer for the production of an agent for the detection of a diseased tissue. It further relates to a radiopharmaceutical for the localization of a diseased tissue comprising such an aptamer.

In der modernen Diagnostik werden zur Charakterisierung von Krankheiten vor allem biochemische Analysen von Blut, anderen Körperflüssigkeiten und Gewebeproben eingesetzt. Dabei wird die Anwesenheit und Menge von Molekülen untersucht, die für eine bestimmte Krankheit typisch sind. Neben Fremdstoffen werden auch körpereigene Stoffe nachgewiesen, die beispielsweise nur bei einer Infektion durch Viren oder Bakterien gebildet werden. Insbesondere Tumorzellen bilden häufig große Mengen bestimmter Proteine, insbesondere zelluläre Rezeptoren, deren Expression für eine Tumorart spezifisch ist. Viele der Proteine, die speziell von krankhaften Zellen gebildet werden, sind Oberflächenmoleküle, die in der Membran der erkrankten Zellen verankert werden. Diese Oberflächenmoleküle können mit entsprechenden diagnostischen Verfahren nachgewiesen werden. Dazu werden üblicherweise Zellen aus Gewebe- oder Blutproben mit Antikörpern untersucht, die an bestimmte, für eine Krankheit spezifische Oberflächenmoleküle binden. Durch derartige in vitro Untersuchungen kann das Vorliegen einer Krankheit diagnostiziert werden. Es ist aber nicht möglich, auch den genauen Ort des erkrankten Gewebes festzustellen. Zu diesem Zweck werden in der Regel bildgebende Verfahren, wie beispielsweise Röntgen, Ultraschall und Kernspinntomographie verwendet. Mit ihnen lassen sich vor allem ektopische Zellansammlungen, wie etwa Tumore, oder Schwellungen einzelner Organe lokalisieren. Zeigt ein krankhaftes Gewebe jedoch keine deutlichen morphologischen Auffälligkeiten, oder ist es verhältnismäßig klein, kann es bei traditionellen Untersuchungen leicht übersehen werden.In modern diagnostics, biochemical analyzes of blood, other body fluids and tissue samples are used to characterize diseases. It examines the presence and amount of molecules that are typical of a particular disease. In addition to foreign substances also endogenous substances are detected, which are formed, for example, only in an infection by viruses or bacteria. In particular, tumor cells often form large quantities of certain proteins, in particular cellular receptors whose expression is specific for a type of tumor. Many of the proteins that are specifically formed by diseased cells are surface molecules that are anchored in the membrane of the diseased cells. These surface molecules can be detected by appropriate diagnostic methods. For this purpose, usually cells from tissue or blood samples are examined with antibodies that bind to specific, specific for a disease surface molecules. Such in vitro studies can diagnose the presence of a disease. But it is not possible to determine the exact location of the diseased tissue. For this purpose, imaging techniques such as X-ray, ultrasound, and nuclear spin tomography are typically used. In particular, ectopic cell aggregates, such as tumors, or swellings of individual organs can be located with them. However, if a diseased tissue shows no marked morphological abnormalities, or is relatively small, it can easily be overlooked in traditional studies.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde ein Agens bereitzustellen, mit dem ein krankhaftes Gewebe spezifisch und unabhängig von seiner Größe detektiert werden kann. Diese Aufgabe wird durch die Verwendung eines Aptamers zur Herstellung eines Agens zur Detektion eines krankhaften Gewebes gelöst. Indem das Aptamer an das krankhafte Gewebe bindet und an eine Aminosäure gekoppelt ist, die wiederum ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist, können selbst wenige Zellen eines krankhaften Gewebes an Hand des radioaktiven Signals lokalisiert werden.The invention is therefore based on the object to provide an agent with which a pathological tissue can be detected specifically and independently of its size. This object is achieved by the use of an aptamer for the production of an agent for the detection of a diseased tissue. By attaching the aptamer to the diseased tissue and coupling it to an amino acid, which in turn has an 11 C carbon atom, even a few cells of a diseased tissue can be localized by the radioactive signal.

Der Begriff ”Aptamer” bezeichnet kurze, einzelsträngige Nukleinsäure-Oligomere, die sowohl RNA als auch DNA Moleküle umfassen können. In Abhängigkeit von ihrer jeweiligen Sequenz bilden Aptamere vielfältige Strukturen und binden an Zielmoleküle der verschiedensten Stoffklassen. Dabei kommt es zu einer spezifischen Strukturkompatibilität zwischen einem Aptamer und seinem Zielmolekül, ähnlich einer Antigen-Antikörper-Bindung. Die Strukturkompatibilität der Moleküle erfolgt über elektrostatische Wechselwirkungen, ionische Bindungen, van-der-Waals Wechselwirkungen, Wasserstoffbrücken und sog. Stacking Interactions zwischen den aromatischen Ringen der Basen der Nukleinsäuren. Aptamere, die ein bestimmtes Zielmolekül binden, werden durch in vitro Selektionsverfahren und Amplifikationstechniken, sog. SELEX-Prozesse (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) identifiziert und produziert. Aptamere umfassen regelmäßig 8 bis 220 Nukleotide, vorzugsweise 20 bis 60 Nukleotide. Es können aber auch Aptamere mit bis zu 500 Nukleotiden verwendet werden. Sie können synthetisch hergestellt oder durch enzymatischen Abbau genomischer DNA gewonnen werden ( Kulbachinskiy AV, 2007 ).The term "aptamer" refers to short, single-stranded nucleic acid oligomers that can comprise both RNA and DNA molecules. Depending on their sequence, aptamers form diverse structures and bind to target molecules of various classes. This results in a specific structural compatibility between an aptamer and its target molecule, similar to antigen-antibody binding. The structural compatibility of the molecules takes place via electrostatic interactions, ionic bonds, van der Waals interactions, hydrogen bonding and so-called stacking interactions between the aromatic rings of the bases of the nucleic acids. Aptamers that bind to a specific target molecule are identified and produced through in vitro selection and amplification techniques known as SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) processes. Aptamers regularly comprise 8 to 220 nucleotides, preferably 20 to 60 nucleotides. However, it is also possible to use aptamers with up to 500 nucleotides. They can be produced synthetically or obtained by enzymatic degradation of genomic DNA ( Kulbachinskiy AV, 2007 ).

Unter Verwendung umfangreicher Aptamer Bibliotheken können Aptamere identifiziert werden, die ein spezifisches Zielmolekül binden. Dabei kann es sich sowohl um größere Biomoleküle, beispielsweise Proteine, als auch um einzelne chemische Elemente handeln. Darüber hinaus binden Aptamere nahezu alle Stoffklassen, so dass auch Aptamere identifiziert werden können, die spezielle Proteinmodifikationen, wie beispielsweise Fettsäure- oder Zuckermodifikationen erkennen und binden.Using extensive aptamer libraries, aptamers can be identified that bind to a specific target molecule. These may be both larger biomolecules, for example proteins, as well as individual chemical elements. In addition, aptamers bind almost all classes of substances, so that aptamers can be identified that recognize and bind to specific protein modifications, such as fatty acid or sugar modifications.

Jede Zelle trägt auf ihrer Oberfläche, verankert in ihrer Zellmembran, eine Vielzahl unterschiedlicher Moleküle, wobei die meisten zur Stoffklasse der Proteine gehören. Neben Molekülen mit grundlegenden biologischen Funktionen, die in nahezu jeder Zelle vorkommen, werden viele Moleküle nur von Zellen eines bestimmten Gewebes oder eines bestimmten Zelltyps exprimiert. Außerdem bilden Zellen, die von Krankheitserregern befallen sind oder gestörte Zellfunktionen aufweisen, wie beispielsweise Tumorzellen, eigene Moleküle. Viele dieser krankheitsspezifischen Moleküle sind membranständig und können auf der Oberfläche der jeweiligen Zelle nachgewiesen werden. Indem ein Aptamer gewählt wird, das mit einem, für ein krankhaftes Gewebe kennzeichnenden Molekül interagiert, bindet das Aptamer spezifisch an das krankhafte Gewebe. Vorzugsweise wird das Aptamer dabei so gewählt, dass die Bindung zwischen dem Aptamer und dem Zielmolekül einen linearen Koeffizient, sog. kD-Wert, von ≤ 100 nM, bevorzugt von ≤ 10 nM, am meisten bevorzugt von 7,5 nM aufweist. Mit einem solchen Aptamer können selbst wenige Zellen eines krankhaften Gewebes spezifisch nachgewiesen werden.Each cell carries on its surface, anchored in its cell membrane, a multitude of different molecules, most of which belong to the class of proteins. In addition to molecules with basic biological functions found in almost every cell, many molecules are only expressed by cells of a particular tissue or cell type. In addition, cells that are infested with pathogens or have impaired cell functions, such as tumor cells, form their own molecules. Many of these disease-specific molecules are membrane-bound and can be detected on the surface of each cell. By choosing an aptamer that interacts with a molecule indicative of a diseased tissue, the aptamer specifically binds to the diseased tissue. Preferably, the aptamer is chosen so that the bond between the aptamer and the target molecule has a linear coefficient, so-called kD value, of ≦ 100 nM, preferably of ≦ 10 nM, most preferably of 7.5 nM. With such an aptamer even a few cells of a diseased tissue can be specifically detected.

Der Begriff ”krankhaftes Gewebe” bezeichnet Zellen, Teile von Organen oder ganze Organe, die ihre physiologische Funktion nicht oder nicht in vollem Umfand erfüllen. Dazu zählen beispielsweise mit Viren oder Bakterien infizierte Zellen, hypertrophes Gewebe, entzündete Gewebe und Organe, hyperplastisches und neoplastisches Gewebe, etwa Geschwüre, Tumore und Karzinome. Krankhafte Zellen bilden häufig Proteine, deren Expression für eine bestimmte Erkrankung kennzeichnend ist, beispielsweise weil sie vom genetischen Material eines Virus oder eines Bakteriums abstammen. Handelt es sich bei diesen Molekülen um Zelloberflächenmoleküle, werden sie auf der Zellmembran verankert. Indem das Aptamer speziell ein Oberflächenmolekül eines krankhaften Gewebes bindet, ermöglicht es eine zuverlässige Lokalisation dieses Gewebes.The term "diseased tissue" refers to cells, parts of organs or whole organs that their physiological function is not or not fully met. These include, for example, cells infected with viruses or bacteria, hypertrophic tissue, inflamed tissues and organs, hyperplastic and neoplastic tissue, such as ulcers, tumors and carcinomas. Diseased cells often form proteins whose expression is indicative of a particular disease, for example, because they are derived from the genetic material of a virus or bacterium. When these molecules are cell surface molecules, they are anchored to the cell membrane. By specifically binding a surface molecule of a diseased tissue, the aptamer enables a reliable localization of this tissue.

Um das an ein Gewebe gebundene Aptamer zu detektieren, wird das Aptamer an eine Aminosäure gekoppelt, die wiederum ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist. Beim Zerfall des 11C-Kohlenstoffisotops werden Positronen, die auch als β+-Strahlung bezeichnet werden, gebildet. Stoßen die Positronen auf ein Elektron, bilden sie zwei Photonen, die sich in einem Winkel von 180°, also genau in entgegen gesetzter Richtung, von einander entfernen. Die Photonen können detektiert und daraus die Position der Positronenemission, bzw. des 11C-Kohlenstoffatoms, berechnet werden. Des Weiteren kann auch die Menge an Aptameren, die sich an einer bestimmten Stelle befindet, quantifiziert werden. Die Kopplung einer Aminosäure mit einem 11C-Kohlenstoffatom an das erfindungsgemäß verwendete Aptamer ermöglicht es, sowohl das Vorhandensein, als auch die Position des Aptamers nachzuweisen und abzubilden. Zur Herstellung einer 11C-markierten Aminosäure und zur Kopplung der Aminosäure an das Aptamer sind insbesondere die Verfahren, die in den Patentanmeldungen DE 10 2009 035 648.7 , und DE 10 2009 035 645.2 beschrieben werden, geeignet.To detect the tissue-bound aptamer, the aptamer is coupled to an amino acid, which in turn has an 11 C carbon atom. Upon decay of the 11 C carbon isotope, positrons, also referred to as β + radiation, are formed. If the positrons hit an electron, they form two photons, which move away from each other at an angle of 180 °, ie exactly in the opposite direction. The photons can be detected and used to calculate the position of the positron emission, or of the 11 C carbon atom. Furthermore, the amount of aptamers located at a particular site can also be quantified. The coupling of an amino acid with an 11 C carbon atom to the aptamer used in the invention makes it possible to detect and image both the presence and the position of the aptamer. For the preparation of an 11 C-labeled amino acid and for the coupling of the amino acid to the aptamer are in particular the methods described in the patent applications DE 10 2009 035 648.7 , and DE 10 2009 035 645.2 be described, suitable.

Die Markierung das Aptamers mit einem 11C-Kohlenstoffatom über eine Aminosäure ist insbesondere vorteilhaft, weil dadurch keine der üblichen Komplexbildner, wie Diethylentriaminpentaacetat (DTPA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) verwendet werden müssen. Der entstehende Komplex aus Aptamer und Aminosäure umfasst körpereigene Moleküle, wodurch er für den Organismus besonders verträglich ist. Sowohl das Aptamer und seine einzelnen Nukleinsäuren, als auch die Aminosäure sind nicht toxisch. Sie können natürlich verstoffwechselt, abgebaut und ausgeschieden werden. Durch die Verwendung eines integrierten 11C-Kohlenstoffatoms kann außerdem vermieden werden, dass ein radioaktiver Fremdstoff, wie beispielsweise 18Fluor, 133Xenon, oder 68Gallium, in den Organismus eingebracht werden muss.The labeling of the aptamer with an 11 C carbon atom via an amino acid is particularly advantageous because it eliminates any of the usual complexing agents such as diethylenetriamine pentaacetate (DTPA), 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) must be used. The resulting complex of aptamer and amino acid comprises the body's own molecules, making it particularly compatible with the organism. Both the aptamer and its single nucleic acids, as well as the amino acid, are non-toxic. They can of course be metabolized, broken down and excreted. By using an integrated 11 C carbon atom, it is also possible to prevent a radioactive foreign substance such as 18 fluorine, 133 xenon or 68 gallium from being introduced into the organism.

Ein weiterer Vorteil des über eine Aminosäure mit 11C-Kohlenstoff markierten Aptamers liegt in dem günstigen Signal/Hintergrund Verhältnis während der Detektion des Aptamers. Das Aptamer bindet an das krankhafte Gewebe, wohingegen freie, ungebundene Aptamere rasch verstoffwechselt und aus dem Organismus ausgeschieden werden, weil sie von endogenen Enzymen zügig abgebaut werden. Dadurch entsteht ein starkes und spezifisches Signal an der Position des krankhaften Gewebes, und das Hintergrundsignal wird minimiert.Another advantage of the labeled via an amino acid with 11 C carbon aptamer is the favorable signal / background ratio during the detection of the aptamer. The aptamer binds to the diseased tissue, whereas free, unbound aptamers are rapidly metabolised and excreted from the organism because they are rapidly degraded by endogenous enzymes. This results in a strong and specific signal at the location of the diseased tissue, and the background signal is minimized.

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist das Agens ein Radiopharmakon. Der Begriff ”Radiopharmaka” bezeichnet Arzneimittel, die Radionuklide enthalten, deren Strahlung zur Diagnostik und Therapie verwendet wird. Die wichtigsten Anwendungsgebiete sind dabei die Onkologie, Kardiologie und Neurologie, aber auch die Arzneimittelforschung. Als Radionuklide werden Gamma- bzw. Beta-Strahlen emittierende Nuklide, zum Beispiel 133Xenon, 99mTechnetium, 68Gallium, und 18Fluor, verwendet. Sie werden üblicherweise über Komplexbildner wie DTPA, DOTA oder Ethylendiamintetraacetat (EDTA) an Mono- oder Polysaccharide gebunden. Die Nuklide werden, je nach der Art ihrer Strahlung, mittels Szintigraphie, Single Photon Emission Computed Tomography (SPECT) oder Positronen-Emissions-Tomographie (PET) detektiert. Aufgrund ihrer unphysiologischen Bestandteile können herkömmliche Radiopharmaka jedoch Nebenwirkungen, wie anaphylaktische oder allergische Reaktionen, im Körper eines Patienten verursachen. Die Verwendung eines Aptamers aus körpereigenen Nukleinsäuren reduziert diese Gefahr deutlich, weil weder das Aptamer selbst, noch seine Abbauprodukte toxisch sind. Zudem ist Kohlenstoff, im Gegensatz zu Technetium oder Xenon, ein im Körper vorkommendes Element, das natürlich verstoffwechselt werden kann.In an advantageous embodiment of the invention, the agent is a radiopharmaceutical. The term "radiopharmaceuticals" refers to medicines containing radionuclides whose radiation is used for diagnosis and therapy. The most important fields of application are oncology, cardiology and neurology as well as drug research. The radionuclides used are gamma or beta-emitting nuclides, for example 133 xenon, 99m technetium, 68 gallium, and 18 fluorine. They are usually bound via complexing agents such as DTPA, DOTA or ethylenediaminetetraacetate (EDTA) to mono- or polysaccharides. The nuclides are detected by scintigraphy, single photon emission computed tomography (SPECT) or positron emission tomography (PET), depending on the nature of their radiation. However, because of their nonphysiological components, conventional radiopharmaceuticals can cause side effects, such as anaphylactic or allergic reactions, in a patient's body. The use of an aptamer from the body's own nucleic acids significantly reduces this risk because neither the aptamer itself nor its degradation products are toxic. In addition, unlike technetium or xenon, carbon is an element found in the body that naturally can be metabolized.

Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist die Aminosäure Glycin, Alanin, Valin oder Serin. Die Verwendung einer dieser Aminosäuren, um das 11C-Kohlenstoffisotop an das Aptamer zu koppeln, ist besonders vorteilhaft, weil diese Aminosäuren verhältnismäßig klein sind und keine reaktiven Seitenketten aufweisen. Sie beeinflussen daher weder die Konformation noch die Bindungsaffinität das Aptamers, und die Spezifität des Aptamers für sein Zielmolekül bleibt erhalten.According to an advantageous development of the invention, the amino acid is glycine, alanine, valine or serine. The use of one of these amino acids to couple the 11 C-carbon isotope to the aptamer is particularly advantageous because these amino acids are relatively small and have no reactive side chains. Therefore, they neither affect the conformation nor the binding affinity of the aptamer, and the specificity of the aptamer for its target molecule is retained.

Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist die Aminosäure über eine Peptidbindung an eine freie Aminogruppe eines Nukleotids des Aptamers gekoppelt. Dadurch können herkömmliche Peptidsyntheseverfahren, wie beispielsweise eine Festphasensynthese, zur Koppelung der Aminosäure an das Aptamer verwendet werden. Die Herstellung des Komplexes ist daher ohne aufwendige zusätzliche Syntheseverfahren möglich, wodurch der technische und finanzielle Aufwand reduziert wird. Des Weiteren kann der Komplex aus Aptamer und Aminosäure direkt nach dem Anbringen der 11C-markierten Aminosäure verwendet werden kann. 11C-Kohlenstoff hat eine Halbwertszeit von nur ca. 20 Minuten, so dass die Strahlungsdosis desto höher gewählt werden muss, je mehr Zeit zwischen der Synthese des Komplexes und seiner Verwendung liegt. Wird die Aminosäure mit der 11C-Markierung im letzten Schritt der Synthese angebracht, kann das Aptamer anschließend sofort verwendet werden. Auf diese Weise wird die Zeitspanne zwischen der Verarbeitung des 11C-Kohlenstoffs und dem Einsatz des Aptamers reduziert, so dass der Strahlungsverlust während der Herstellung des Komplexes minimiert wird. Deshalb kann die Strahlendosis, die bei der Verarbeitung des 11C-Kohlenstoffs eingesetzt werden muss um eine bestimmte Strahlungsstärke des Produkts zu gewährleisten, entsprechend geringer sein. Die Herstellung wird dadurch kostengünstiger und die Strahlenbelastung für das technische Personal, welches das Agens herstellt, verringert.According to an advantageous embodiment of the invention, the amino acid is coupled via a peptide bond to a free amino group of a nucleotide of the aptamer. Thereby, conventional peptide synthesis methods, such as solid phase synthesis, can be used to couple the amino acid to the aptamer. The preparation of the complex is therefore possible without expensive additional synthesis process, whereby the technical and financial effort is reduced. Furthermore, the complex of aptamer and amino acid can be used directly after attaching the 11 C-labeled amino acid. 11C carbon has a half-life of only about 20 minutes, so the longer the time between synthesis of the complex and its use, the higher the radiation dose must be. If the 11 C-labeled amino acid is added in the last step of the synthesis, then the aptamer can be used immediately. In this way, the time between the processing of the 11 C carbon and the use of the aptamer is reduced, so that the radiation loss during the production of the complex is minimized. Therefore, the radiation dose that must be used in the processing of the 11 C carbon to ensure a certain radiation intensity of the product, be correspondingly lower. The production is thereby cheaper and reduces the radiation exposure for the technical personnel who produces the agent.

Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist das 11C-Kohlenstoffatom das Carbonylkohlenstoffatom der Peptidbindung. Die Peptidbindung liegt verhältnismäßig geschützt im Inneren des Komplexes aus Aptamer und Aminosäure. Dadurch ist gewährleistet, dass das 11C-Kohlenstoffatom nicht von der Aminosäure abgespalten wird, wie es etwa bei einer exponierten Seitenkette der Aminosäuren möglich wäre.According to an advantageous embodiment of the invention, the 11 C carbon atom is the carbonyl carbon of the peptide bond. The peptide bond is relatively protected inside the complex of aptamer and amino acid. This ensures that the 11 C carbon atom is not split off from the amino acid, as would be possible with an exposed side chain of the amino acids.

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist die Aminosäure eine D-Aminosäure. Mit Ausnahme des Glycins besitzen alle Aminosäuren an ihrem alpha-C-Kohlenstoffatom ein chirales Zentrum und können daher als Konfigurationsisomere, nämlich als D- oder L-Aminosäure, vorliegen. Endogene Peptide und Proteine sind weitgehend aus Aminosäuren in L-Konfiguration aufgebaut. Zudem arbeiten die meisten natürlichen Proteasen und Peptidasen stereoselektiv und verstoffwechseln hauptsächlich L-Aminosäuren. Daher dauert der Abbau von D-Aminosäuren durch körpereigene Enzyme länger als der von L-Aminosäuren. Dieser Umstand kann verwendet werden, um die Halbwertszeit des Komplexes aus Aptamer und einer Aminosäure zu verlängern, indem statt einer L-Aminosäure eine D-Aminosäure verwendet wird ( Neundorf I et al., 2008 ). Dadurch kann die Zeit bis die Aminosäure von dem Aptamer, durch proteolytischen Verdau, abgespalten wird, positiv beeinflusst werden. Eine weitere Möglichkeit, die Abspaltung zu verzögern, besteht darin, eine nicht natürliche Aminosäure zu verwenden. Die nicht natürlichen Aminosäuren werden langsamer verstoffwechselt, weil die körpereigenen proteolytischen Enzyme speziell an den Abbau natürlicher Aminosäuren angepasst sind. Darüber hinaus sind auch andere chemische Modifikationen der Aminosäure möglich. Beispielsweise kann die endständige Aminogruppe der Aminosäure durch eine Isonitrilgruppe ersetzt werden. Eine solche Modifikation reduziert die von der Aminogruppe vermittelte Interaktion mit proteolytischen Enzymen, ohne die Bindungsspezifität zu verändern.In an advantageous embodiment of the invention, the amino acid is a D-amino acid. With the exception of glycine, all amino acids have a chiral center at their alpha carbon atom and can therefore exist as configurational isomers, namely as the D or L amino acid. Endogenous peptides and proteins are largely composed of amino acids in L configuration. In addition, most natural proteases and peptidases work stereoselectively and mainly metabolize L-amino acids. Therefore, the degradation of D-amino acids by endogenous enzymes takes longer than that of L-amino acids. This fact can be used to extend the half-life of the aptamer-amino acid complex by using a D-amino acid instead of an L-amino acid ( Neundorf I et al., 2008 ). Thus, the time until the amino acid is cleaved off the aptamer by proteolytic digestion can be positively influenced. Another way to delay the cleavage is to use a non-natural amino acid. The non-natural amino acids are metabolized more slowly because the body's own proteolytic enzymes are specially adapted to the degradation of natural amino acids. In addition, other chemical modifications of the amino acid are possible. For example, the terminal amino group of the amino acid can be replaced by an isonitrile group. Such modification reduces the amino group-mediated interaction with proteolytic enzymes without altering the binding specificity.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Radiopharmakon zur Lokalisation eines Tumors, das ein Aptamer umfasst. Indem das Aptamer an den Tumor bindet und an eine Aminosäure gekoppelt ist, die wiederum ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist, können selbst wenige Zellen des Tumors lokalisiert werden.Another object of the invention is a radiopharmaceutical for the localization of a tumor comprising an aptamer. By binding the aptamer to the tumor and coupling it to an amino acid which in turn has an 11 C carbon atom, even a few cells of the tumor can be localized.

Auf Grund der Vorteile des enthaltenen Komplexes aus Aptamer und Aminosäure bietet das erfindungsgemäße Radiopharmakon ein sensitives und spezifisches Agens, um die Position eines Tumors in vivo zu bestimmen. Das Radiopharmakon wird dem Patienten verabreicht und die darin enthaltenen Aptamere, die an die 11C-markierte Aminosäuren gekoppelt sind, verteilen sich auf Grund ihrer Größe schnell und effizient im Körper. Sie binden an den Tumor und sammeln sich an dessen Oberfläche.Due to the advantages of the contained aptamer-amino acid complex, the radiopharmaceutical of the present invention provides a sensitive and specific agent for determining the position of a tumor in vivo. The radiopharmaceutical is administered to the patient and the aptamers contained therein, which are coupled to the 11 C-labeled amino acids, are distributed quickly and efficiently in the body due to their size. They bind to the tumor and collect on its surface.

Die Häufung der radioaktiv markierten Aptamere wird mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) nachgewiesen und so die genaue Position des Tumors im Körper des Patienten bestimmt.The accumulation of radioactively labeled aptamers is detected by positron emission tomography (PET) to determine the exact location of the tumor in the patient's body.

Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist die Aminosäure Glycin, Alanin, Valin oder Serin, so dass weder die Konformation noch die Bindungsaffinität das Aptamers durch die Aminosäure beeinflusst werden.According to an advantageous development of the invention, the amino acid is glycine, alanine, valine or serine, so that neither the conformation nor the binding affinity of the aptamer is influenced by the amino acid.

Gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist das 11C-Kohlenstoffatom das Kohlenstoffatom der endständigen α-Carboxylgruppe der Aminosäure. Dadurch kann das 11C-Kohlenstoffatom nicht von der Aminosäure abgespalten werden, wie es etwa bei einer exponierten Seitenkette der Aminosäuren möglich wäre.According to an advantageous embodiment of the invention, the 11 C carbon atom is the carbon atom of the terminal α-carboxyl group of the amino acid. Thus, the 11 C carbon atom can not be cleaved from the amino acid, as would be possible for an exposed side chain of the amino acids.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Radiopharmakon ein PET Biomarker. Die PET ist ein etabliertes Verfahren um die Strahlung radioaktiver Elemente zu erfassen und ihre Position zu bestimmen ( Massoud TF, Gambhir SS, 2003 ). Mit Hilfe von ringförmig um den Patienten angeordneten Detektorgeräten werden Schnittbilder erstellt, auf denen die Zerfallsereignisse in ihrer räumlichen Verteilung im Körperinneren dargestellt werden. Die PET ermöglicht es auch, die Menge an markierten Molekülen in einem Gewebe quantitativ zu bestimmen.In a preferred embodiment, the radiopharmaceutical is a PET biomarker. PET is an established method for detecting the radiation of radioactive elements and determining their position ( Massoud TF, Gambhir SS, 2003 ). With the aid of detector devices arranged annularly around the patient, sectional images are created on which the decay events are represented in their spatial distribution in the interior of the body. PET also makes it possible to quantify the amount of labeled molecules in a tissue.

Außerdem wird ein Verfahren zur Lokalisation eines krankhaften Gewebes in einem Organismus offenbart, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Aptamers, das an eine Aminosäure gekoppelt ist; b) Verabreichen des Aptamers an den Organismus; und c) Detektieren des Aptamers in dem Organismus mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET). Indem das Aptamer an den Tumor bindet und die Aminosäure ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist, kann das krankhafte Gewebe im Organismus des Patienten spezifisch lokalisiert werden.Also disclosed is a method of localizing a diseased tissue in an organism, comprising the steps of: a) providing an aptamer linked to an amino acid is coupled; b) administering the aptamer to the organism; and c) detecting the aptamer in the organism by positron emission tomography (PET). By binding the aptamer to the tumor and the amino acid has an 11 C carbon atom, the diseased tissue can be specifically localized in the patient's organism.

Mit dem erfindungsgemäß verwendeten Aptamer, an das eine 11C-markierte Aminosäure gekoppelt ist, wird ein krankhaftes Gewebe im Inneren eines Organismus detektiert und lokalisiert, und kann so, im Körper eines Patienten, beobachtet werden. Auf diese Weise kann beispielsweise die Größe oder Ausdehnung einer Infektion oder eines Tumors bestimmt werden. Das erfindungsgemäß verwendete Aptamer ist daher hervorragend zur Beobachtung von Verlauf und Erfolg einer Behandlung, sog. Therapiemonitoring, geeignet.With the aptamer used according to the invention, to which an 11 C-labeled amino acid is coupled, a diseased tissue is detected and localized inside an organism, and can thus be observed in the body of a patient. In this way, for example, the size or extent of an infection or a tumor can be determined. The aptamer used according to the invention is therefore outstandingly suitable for monitoring the course and success of a treatment, so-called therapy monitoring.

Im Folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung anhand der beigefügten schematischen Zeichnungen erläutert.Hereinafter, preferred embodiments of the invention will be explained with reference to the accompanying schematic drawings.

1 zeigt schematisch ein Aptamer 1 mit 14 Nukleotiden 3, das an ein krankhaftes Gewebe 18 gebunden ist. Das Aptamer 1 ist an eine Aminosäure 2 gekoppelt, die mit einem 11C-Kohlenstoffatom radioaktiv markiert ist. Die radioaktive Markierung ist durch einen Stern (*) dargestellt. 1 shows schematically an aptamer 1 with 14 nucleotides 3 that is attached to a pathological tissue 18 is bound. The aptamer 1 is an amino acid 2 which is radioactively labeled with an 11 C carbon atom. The radioactive label is represented by an asterisk (*).

Die spezifische Bindungsaffinität zwischen dem Aptamer 1 und dem krankhaften Gewebe 18 kommt auf Grund chemischer Wechselwirkungen zwischen dem Aptamer 1 und der Oberfläche des krankhaften Gewebes 18 zustande. Das krankhafte Gewebe 18 bildet Oberflächenmoleküle, die für die Erkrankung des Gewebes kennzeichnend sind. Aus einer Aptamer-Bibliothek wird ein Aptamer 1 identifiziert, das mit einem Oberflächenmolekül des krankhaften Gewebes 18 interagiert. Anschließend wird eine Aminosäure, die mit einem 11C-Kohlenstoffatom markiert ist, an das Aptamer 1 gekoppelt. Das Aptamer 1 kann dann durch die beim Zerfall des 11C-Kohlenstoffatoms abgegebenen Positronen mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) nachgewiesen werden. Der Ort der Positronenemission entspricht dem Ort des Aptamers 1 und somit dem des krankhaften Gewebes 18, an welches das Aptamer 1 gebunden ist.The specific binding affinity between the aptamer 1 and the diseased tissue 18 comes due to chemical interactions between the aptamer 1 and the surface of the diseased tissue 18 conditions. The pathological tissue 18 forms surface molecules that are characteristic of the disease of the tissue. An aptamer library becomes an aptamer 1 identified with a surface molecule of the diseased tissue 18 interacts. Subsequently, an amino acid labeled with an 11 C carbon atom is added to the aptamer 1 coupled. The aptamer 1 can then be detected by positron emission tomography (PET) by the positron emitted at the decay of the 11 C carbon atom. The location of the positron emission corresponds to the location of the aptamer 1 and thus that of the diseased tissue 18 to which the aptamer 1 is bound.

Das an eine 11C-markierte Aminosäure 2 gekoppelte Aptamer 1 wird einem Patienten in Form eines Arzneimittels verabreicht. Es bindet an das krankhafte Gewebe 18 und sammelt sich an dessen Zellen. Diese Anhäufung wird bei einer PET sichtbar, so dass die Verteilung des Aptamer 1 bzw. die Position des krankhaften Gewebes 18 im Körper des Patienten bestimmt werden können.The 11 C-labeled amino acid 2 coupled aptamer 1 is administered to a patient in the form of a drug. It binds to the pathological tissue 18 and collects on its cells. This accumulation is visible on a PET, allowing the distribution of the aptamer 1 or the position of the diseased tissue 18 can be determined in the body of the patient.

2 zeigt eine Darstellung eines Aptamers mittels chemischer Formel. Das Aptamer hat die Sequenz SEQ ID Nr.: 1 und ist an eine 11C-markierte Aminosäure, nämlich Glycin, gekoppelt. 2 shows a representation of an aptamer by chemical formula. The aptamer has the sequence SEQ ID NO: 1 and is coupled to an 11 C-labeled amino acid, glycine.

Das Aptamer umfasst 70 Nukleinsäuren der folgenden Sequenz: GGG AGG ACG AUG CGG ACC GAA AAA GAC CUG ACU UCU AUA CUA AGU CUA CGU UCC CAG ACG ACU CGC CCG A.The aptamer comprises 70 nucleic acids of the following sequence: GGG AGG ACG AUG CGG ACC GAA AAA GAC CUG ACU UCU AUA CUA AGU CUA CGU UCC CAG ACG ACU CGC CCG A.

Das 3' terminale Adenosin des Aptamers und das daran gekoppelte Glycin sind mittels Strukturformel dargestellt, die restlichen Nukleinsäuren 3 durch ihren jeweiligen Buchstaben Code. Die Sequenz des Aptamers ist auch in SEQ ID Nr.: 1 angegeben. Das Carbonylkohlenstoffatom Glycins ist ein 11C-Kohlenstoffatom, dargestellt durch die Ziffer 11 oberhalb des Carbonylkohlenstoffatoms.The 3 'terminal adenosine of the aptamer and the glycine coupled thereto are represented by structural formula, the remaining nucleic acids 3 by their respective letter code. The sequence of the aptamer is also given in SEQ ID NO: 1. The carbonyl carbon glycine is an 11 C carbon atom represented by the numeral 11 above the carbonyl carbon atom.

Das Aptamer mit der SEQ ID Nr.: 1 weist eine spezifische Bindungsaffinität zu dem Prostata spezifischen Membran Antigen (PSMA) auf. Dieses Protein wird vor allem in Prostatagewebe exprimiert und kommt in Prostatkarzinomen in besonders hohen Mengen vor. PSMA ist ein Membranprotein, das in gesunden Prostatazellen aber in einer besonderen zytoplasmatischen Form vorliegt. Bei Prostatakarzinomen ist es vor allem auf der Zellmembran der Tumorzellen lokalisiert.The aptamer with SEQ ID NO: 1 has a specific binding affinity for the prostate specific membrane antigen (PSMA). This protein is mainly expressed in prostate tissue and occurs in prostate carcinomas in particularly high amounts. PSMA is a membrane protein present in healthy prostate cells but in a particular cytoplasmic form. In prostate cancer, it is mainly located on the cell membrane of tumor cells.

Das Aptamer 1 wird anhand seiner Bindungsspezifität zu PSMA mit SELEX Verfahren aus einer Aptamer-Bibliothek ausgewählt und amplifiziert. Anschließend wird die 11C-markierte Aminosäure 2 mit einem herkömmlichen Peptidsyntheseverfahren an das Aptamer 1 gekoppelt. Das Aptamer 1 wird dem Patienten verabreicht und so das Prostatakarzinom mittels PET dargestellt. Auf diese Weise können auch Metastasen, die ebenfalls membranständiges PSMA exprimieren, lokalisiert werden.The aptamer 1 is selected and amplified by its binding specificity to PSMA with SELEX methods from an aptamer library. Subsequently, the 11 C-labeled amino acid 2 with a conventional peptide synthesis method to the aptamer 1 coupled. The aptamer 1 is administered to the patient and so the prostate cancer is represented by PET. In this way, metastases which also express membrane-bound PSMA can be localized.

3 zeigt eine schematische Darstellung (stark vereinfacht nach Faller A, Schünke M, Der Körper des Menschen, Thieme, 2008 ) eines Blutkreislaufsystems 10 eines Organismus und die Verteilung eines Aptamers 1 darin. 3 shows a schematic representation (greatly simplified after Faller A, Schünke M, The Human Body, Thieme, 2008 ) of a circulatory system 10 of an organism and the distribution of an aptamer 1 in this.

Das Blutkreislaufsystem 10 umfasst verschiedene schematisch dargestellte Organe, wie Lunge 12, Herz 13, Leber 14, Darm 15 und Niere 16 und die Hauptadern 11, welche diese Organe verbinden. Das Aptamer 1 ist durch Dreiecke entlang der Adern 11 dargestellt. Die Abbauprodukte 17 des Aptamers 1 sind durch einzelne Striche innerhalb der Umrisse der Niere 16 dargestellt. Links der Mitte des Blutkreislaufsystems 10 ist zusätzlich ein krankhaftes Gewebe 18, zum Beispiel ein Tumor oder eine Entzündung, dargestellt, an das vermehrt Aptamere 1 angelagert sind.The circulatory system 10 includes various schematically represented organs, such as lungs 12 , Heart 13 , Liver 14 , Gut 15 and kidney 16 and the main veins 11 which connect these organs. The aptamer 1 is through triangles along the veins 11 shown. The degradation products 17 of the aptamer 1 are by single strokes within the outline of the kidney 16 shown. Left of the center of the circulatory system 10 is additionally a pathological tissue 18 , for example, a tumor or inflammation, shown to the increased aptamers 1 are attached.

Die Verteilung des Aptamers 1 im Blutkreislaufsystem 10 umfasst vier Phasen, die entlang der Darstellung von oben nach unten aufgeführt sind.
Phase I: Das Aptamer 1 wird in das Blutkreislaufsystem 10 des Organismus injiziert.
Phase II: Über das Blutkreislaufsystem 10 wird das Aptamer 1 in die Organe 12, 13, 14, 15, und 16 des Organismus transportiert.
Phase III: Das zirkulierende Aptamer 1 bindet spezifisch an das krankhafte Gewebe 18.
Phase IV: Nicht gebundenes Aptamer 1 wird schnell verstoffwechselt und enzymatisch abgebaut. Der Organismus unterscheidet nicht zwischen körpereigenen Molekülen und dem Aptamer 1, weil es aus Nukleinsäuren 3 und einer Aminosäure 2 aufgebaut ist, die den körpereigenen Molekülen entsprechen. Die Abbauprodukte 17 des Aptamer 1 und der Nukleinsäuren 3 bzw. der Aminosäure 2 sammeln sich vorwiegend in der Niere 16, von wo aus sie über die Blase und den Harnleiter ausgeschieden werden. The distribution of the aptamer 1 in the circulatory system 10 includes four phases that are listed along the top-down view.
Phase I: The aptamer 1 gets into the circulatory system 10 of the organism.
Phase II: About the circulatory system 10 becomes the aptamer 1 into the organs 12 . 13 . 14 . 15 , and 16 of the organism.
Phase III: The circulating aptamer 1 binds specifically to the diseased tissue 18 ,
Phase IV: unbound aptamer 1 is rapidly metabolized and enzymatically degraded. The organism does not differentiate between the body's own molecules and the aptamer 1 because it's made up of nucleic acids 3 and an amino acid 2 is constructed, which correspond to the body's own molecules. The degradation products 17 of the aptamer 1 and the nucleic acids 3 or the amino acid 2 accumulate predominantly in the kidney 16 from where they are excreted via the bladder and ureter.

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Claims (9)

Verwendung eines Aptamers (1) zur Herstellung eines Agens zur Detektion eines krankhaften Gewebes (18), dadurch gekennzeichnet, dass das Aptamer (1) an das krankhafte Gewebe (18) bindet, an eine Aminosäure (2) gekoppelt ist und die Aminosäure (2) ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist.Using an aptamer ( 1 ) for the production of an agent for the detection of a diseased tissue ( 18 ), characterized in that the aptamer ( 1 ) to the pathological tissue ( 18 ) binds to an amino acid ( 2 ) and the amino acid ( 2 ) has an 11 C carbon atom. Verwendung eines Aptamers (1) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Agens ein Radiopharmakon ist.Using an aptamer ( 1 ) according to claim 1, characterized in that the agent is a radiopharmaceutical. Verwendung eines Aptamers (1) nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure (2) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glycin, Alanin, Valin und Serin.Using an aptamer ( 1 ) according to claim 1 or 2, characterized in that the amino acid ( 2 ) is selected from the group consisting of glycine, alanine, valine and serine. Verwendung eines Aptamers (1) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure (2) über eine Peptidbindung an eine freie Aminogruppe eines Nukleotids (3) des Aptamers (1) gekoppelt ist.Using an aptamer ( 1 ) according to one of the preceding claims, characterized in that the amino acid ( 2 ) via a peptide bond to a free amino group of a nucleotide ( 3 ) of the aptamer ( 1 ) is coupled. Verwendung eines Aptamers (1) nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das 11C-Kohlenstoffatom das Carbonylkohlenstoffatom der Peptidbindung ist.Using an aptamer ( 1 ) according to claim 4, characterized in that the 11 C carbon atom is the carbonyl carbon atom of the peptide bond. Radiopharmakon zur Lokalisation eines Tumors (18) umfassend ein Aptamer (1), dadurch gekennzeichnet, dass das Aptamer (1) an den Tumor (18) bindet, an eine Aminosäure (2) gekoppelt ist und die Aminosäure (2) ein 11C-Kohlenstoffatom aufweist.Radiopharmaceutical for the localization of a tumor ( 18 ) comprising an aptamer ( 1 ), characterized in that the aptamer ( 1 ) to the tumor ( 18 ) binds to an amino acid ( 2 ) and the amino acid ( 2 ) has an 11 C carbon atom. Radiopharmakon nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure (2) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Glycin, Alanin, Valin und Serin.Radiopharmaceutical according to claim 6, characterized in that the amino acid ( 2 ) is selected from the group consisting of glycine, alanine, valine and serine. Radiopharmakon nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass das 11C-Kohlenstoffatom das Kohlenstoffatom der endständigen α-Carboxylgruppe der Aminosäure (2) ist.A radiopharmaceutical according to claim 6 or 7, characterized in that the 11 C carbon atom is the carbon atom of the terminal α-carboxyl group of the amino acid ( 2 ). Radiopharmakon nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Biomarker ist.Radiopharmaceutical according to one of claims 6 to 8, characterized in that it is a positron emission tomography (PET) biomarker.
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