WO2011142407A1 - 無細胞化方法及び人体移植用人工組織 - Google Patents

無細胞化方法及び人体移植用人工組織 Download PDF

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tissue
animal
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岩▲崎▼　清隆
梅津　光生
友博 太田
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学校法人早稲田大学
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    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Definitions

  • the present invention relates to a decellularization method suitable for decellularization of all kinds of animal tissues, and an artificial tissue for human transplantation obtained by the method.
  • Patent Documents 1 and 2 The present applicants have already proposed a method for acellularization of animal tissues such as heart valves collected from animals such as cows and pigs in the human body (Patent Documents 1 and 2). reference).
  • This decellularization method is a method of removing the original cells of the animal tissue by irradiating the animal tissue with microwaves in a state where the animal tissue is immersed in a surfactant to which pulsatile flow is applied. .
  • the present invention has been devised by paying attention to such knowledge, and the object thereof is obtained by a decellularization method capable of decellularization of tendons and ligaments collected from animals and the method. It is to provide an artificial tissue for human body transplantation.
  • the present invention provides a decellularization method in which the treatment of immersing the animal tissue in a surfactant imparted with a flow is performed to remove the original cells of the animal tissue, A technique of immersing the animal tissue after the treatment in a nucleolytic enzyme solution is employed.
  • a pulsatile flow may be imparted to the surfactant.
  • the artificial tissue for transplanting a human body according to the present invention has a configuration in which the animal tissue is acellularized by the above-described methods.
  • animal tendons and ligaments that could not be reduced to zero DNA by conventional techniques can be acellularized.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view of a biological tissue processing apparatus used in the cell-free method according to the present embodiment.
  • a biological tissue processing apparatus 10 is an apparatus used when decellularizing an animal tissue T composed of tendons and ligaments collected from animals such as cows.
  • the biological tissue processing apparatus 10 includes a solution circulation unit 11 that circulates a cell removal solution for decellularizing the animal tissue T in one direction (in the direction of the arrow in the figure) by a predetermined circuit, and a middle part of the solution circulation unit 11.
  • a tissue holder 12 that is provided and holds the cell removal solution immersed in the animal tissue T; and a microwave irradiation means 13 that is disposed around the tissue holder 12 and that can irradiate the animal tissue T with microwaves. It is configured with.
  • the solution circulation unit 11 includes a pulsation pump 15 that imparts a pulsating flow to the cell removal solution, and a circulation path 16 that is arranged so that the cell removal solution discharged from the pulsation pump 15 returns to the pulsation pump 15.
  • the control means 17 for controlling the operation of the pulsating pump 15 so that the cell removal solution in the circulation path 16 is in a desired state, and the cooling means 18 provided in the middle of the circulation path 16 for cooling the cell removal solution.
  • a measuring device 25 that measures the flow rate and pressure of the cell removal solution in the circulation path 16 that has flowed out of the tissue holding unit 12, and the temperature of the cell removal solution in the circulation path 16 that has just flowed out of the tissue holding unit 12 And a temperature sensor 29.
  • the pulsating pump 15 may be any pulsating pump capable of generating a pulsating flow at the time of discharge, such as a pump already proposed by the present applicant (see Japanese Patent Application No. 2002-167836). .
  • the circulation path 16 is configured in a closed loop shape in which the cell removal solution discharged from the outflow port 20 of the pulsation pump 15 flows into the inflow port 21 in a non-contact state with the outside air.
  • the circulation path 16 adopts a structure that can simulate the body circulation state of human blood, and is substantially the same as the structure already proposed by the present applicant (International Publication No. 2004/100831). It has a structure.
  • the control means 17 drives the pulsating pump 15 based on the flow rate and pressure of the cell removal solution measured by the measuring device 25 so that a desired pulsating flow is applied to the cell removal solution in the circulation path 16. Is to control.
  • the cooling means 18 includes a water tank 27 that cools the cell removal solution by immersing a part of the circulation path 16 immediately before flowing into the inflow port 21, and a cooling device 28 that reduces the water temperature in the water tank 27. I have.
  • the cooling device 28 functions to cool the cell removal solution in the circulation path 16 heated by the microwave irradiation.
  • the tissue holding unit 12 can guide the cell removal solution flowing in the circulation path 16 and hold the animal tissue T in the cell removal solution.
  • the microwave irradiating means 13 is provided at a lower position of the tissue holding unit 12 and is provided on a disk-like table 31 that is rotatable with respect to the tissue holding unit 12.
  • An irradiation device 32 that irradiates microwaves from the side of the holding unit 12 is provided.
  • the table 31 is rotated in a state in which the rotation speed is controlled by a motor or the like (not shown), and the rotation of the table 31 makes it universal to the animal tissue T from almost the entire side of the tissue holder 12.
  • the microwave will be irradiated.
  • the irradiation device 32 is a known device using a magnetron (not shown) as a microwave generation source.
  • the irradiation device 32 is capable of irradiating microwaves having a frequency of 2.45 GHz and an output of about 0 W to 1500 W.
  • the microwave irradiation is automatically performed. Is to stop or start. That is, when the cell removal solution in the circulation path 16 is heated by microwave irradiation and becomes higher than the human body temperature (about 37 ° C.), the microwave irradiation is automatically stopped. It has become. Then, as described above, when the temperature of the cell removal solution in the circulation path 16 is lowered below the human body temperature (about 37 ° C.) by the cooling device 28, the microwave irradiation is started again. .
  • the member drawn with the dashed-dotted line in the figure is the case 34 in which the tissue holding part 12 is accommodated and can rotate integrally with the table 31.
  • the case 34 is designed so that the irradiation unit 32A of the irradiation device 32 enters therein, and the microwave irradiated from the irradiation unit 32A is not leaked to the outside of the case 34.
  • reference numeral 35 in the figure denotes a slip ring provided to prevent the cord C of the irradiation device 32 from being entangled with the rotation of the table 31.
  • an animal tissue T such as an animal tendon or ligament is set in the tissue holding unit 12, a cell removal solution is injected into the biological tissue processing apparatus 10, and the cell removal solution is circulated.
  • a cell removal solution for example, a surfactant such as deoxycholic acid (bile acid), sodium dodecyl sulfate (SDS), Triton X-100 or the like is used.
  • a predetermined switch not shown
  • the pulsation pump 15 is driven, the cell removal solution circulates in the circulation path 16, and the cell removal solution discharged from the pulsation pump 15 becomes a pulsatile flow as a tissue. It flows through the holding unit 12 and further flows into the pulsation pump 15 while flowing through the circulation path 16.
  • the irradiation device 32 is rotated, and the microwaves are evenly irradiated to almost the entire side of the animal tissue T.
  • the animal tissue T is taken out from the biological tissue processing apparatus 10 and immersed in the nucleolytic enzyme solution for a predetermined time, the animal tissue T is decellularized and an artificial tissue for human body transplantation is obtained. That is, in the animal tissue T obtained here, various original cells (endothelial cells, fibroblasts, smooth muscle cells) are removed, and only the substrate made of collagen, elastin and the like is obtained.
  • the nucleolytic enzyme solution used here include Benzonase (registered trademark) or a mixed solution of deoxyribonuclease (DNase) and ribonuclease (RNase).
  • the treatment with the nucleolytic enzyme solution described above may be performed. Good.
  • the present inventors conducted an experiment for demonstrating the effect of the cell-free treatment described above.
  • a bovine finger extensor tendon having a width of 4 mm, a thickness of 4 mm, and a length of 50 mm was used as the animal tissue, the following treatments were performed, and the DNA amount of the animal tissue after the treatment was measured. The residual ratio (%) of DNA to animal tissues was calculated.
  • Example 1 The animal tissue is first subjected to a decellularization process (hereinafter referred to as “pulsatile circulation process”) by the biological tissue processing apparatus 10 and then immersed in a nucleolytic enzyme solution and shaken ( Hereinafter, this is referred to as “shaking treatment”.
  • pulsatile circulation process a decellularization process
  • a nucleolytic enzyme solution and shaken a nucleolytic enzyme solution and shaken
  • this is referred to as “shaking treatment”.
  • deoxycholic acid was used as a surfactant
  • the average flow rate was 6 liters per minute
  • the average hydraulic pressure was 90 mmhg.
  • the frequency was 2.45 GHz and it irradiated for a total of 72 hours with the output of 600W.
  • Example 2 The same processing as in Example 1 was performed with the same conditions as in Example 1 except that the microwave irradiation time was 48 hours. Also in this example, the same result as in Example 1 was obtained.
  • Example 3 The same processing as in Example 1 was performed for Example 1 except that the microwave irradiation time was 24 hours, and the same conditions as in Example 1 were used. Also in this example, the same result as in Example 1 was obtained.
  • Example 4 Example 1 was subjected to the same treatment as Example 1 except that microwave irradiation was not performed. According to this example, most of the DNA in the animal tissue was removed, and the residual ratio of DNA to the untreated animal tissue was 0.2%.
  • Example 5 While immersing the animal tissue in a surfactant to which a steady flow is given by a steady flow generator (not shown), the surroundings of the animal tissue are irradiated with microwaves, and then the same nucleolytic enzyme solution as in Example 1 is used. The shaking process was performed. In this treatment, deoxycholic acid was used as a surfactant, the flow rate was 6 liters per minute, and the hydraulic pressure was 90 mmhg. Moreover, about the microwave irradiated, the frequency was 2.45 GHz and it irradiated for a total of 24 hours with the output of 600W. Also in this example, the same result as in Example 1 was obtained.
  • Example 6 The same processing as in Example 5 was performed on Example 5 with the same conditions except that microwave irradiation was not performed. According to this example, most of the DNA in the animal tissue was removed, and the residual ratio of DNA to the untreated animal tissue was 3.8%.
  • Example 7 In contrast to Example 1, a mixed solution of DNase (150 U / ml) and RNase (100 U / ml) was used as the nucleolytic enzyme solution instead of the Benzonase (registered trademark) solution. It was the same. Also in this example, the same result as in Example 1 was obtained.
  • Example 1 For Example 1, only the pulsating circulation process was performed under the same conditions, and the shaking process was not performed. As a result, the residual ratio of DNA to untreated animal tissue was 61%.
  • Example 2 For Example 1, only the shaking treatment with a Benzonase (registered trademark) solution was performed under the same conditions, and the pulsation circulation treatment was not performed. As a result, DNA was hardly removed from untreated animal tissues.
  • Example 4 (Comparative Example 4) With respect to Example 5, the pulsation circulation process and the shaking process were set under the same conditions, and these processes were performed in the reverse order. That is, the pulsating circulation process was performed after the shaking process. As a result, the residual ratio of DNA to untreated animal tissues was 41%.
  • the animal tissue obtained by the treatment of Example 1 is higher in the animal tissue after treatment obtained in Example 1 and Example 7, respectively. It turned out to be strong. Therefore, it is preferable to use a Benzonase (registered trademark) solution rather than a mixed solution of DNase and RNase as the nucleolytic enzyme solution used during the shaking treatment.
  • a Benzonase (registered trademark) solution rather than a mixed solution of DNase and RNase as the nucleolytic enzyme solution used during the shaking treatment.
  • the cell-free method according to the present invention does not necessarily require the use of the biological tissue processing apparatus 10 in the above-described embodiment, and can be performed using various apparatuses and means as long as the various processes described above can be performed. .
  • an artificial tissue such as an artificial ligament for transplantation and an artificial tendon having excellent biocompatibility.

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Abstract

本発明は、ウシ等の動物から採取した腱や靭帯について、ＤＮＡの残存量をゼロにする無細胞化を可能にすることを目的とする。本発明に係る無細胞化方法は、流れが付与された界面活性剤に動物組織を浸漬した状態で、当該動物組織にマイクロ波を照射する拍動循環処理の後で、核酸分解酵素溶液中に前記動物組織を浸漬し、振とう処理を行うことにより、前記動物組織の原細胞を除去し、コラーゲン、エラスチン等からなる基質のみにする。前記核酸分解酵素溶液としては、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、或いは、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）とリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の混合液が挙げられる。

Description

無細胞化方法及び人体移植用人工組織
　本発明は、あらゆる種類の動物組織を無細胞化するのに好適となる無細胞化方法、及びその方法によって得られた人体移植用人工組織に関する。
　本出願人らは、ウシやブタ等の動物から採取した心臓弁等の動物組織を人体に移植するために、当該動物組織を無細胞化させる方法を既に提案している（特許文献１、２参照）。この無細胞化方法は、拍動流が付与された界面活性剤に動物組織を浸漬した状態で、当該動物組織にマイクロ波を照射することで、前記動物組織の原細胞を除去する手法である。
国際公開第２００４／１００８３１号パンフレット 特開２００７－３０１２６２号公報
　しかしながら、本発明者らが、鋭意実験研究を行った結果、動物から採取した心臓弁について前述の手法による無細胞化処理を行った場合には、組織中の残存細胞がほぼゼロになるものの、動物から採取した腱や靭帯について同様の無細胞化処理を行った場合には、組織中に細胞が残存することを知見した。
　本発明は、このような知見に着目して案出されたものであり、その目的は、動物から採取した腱や靭帯についても無細胞化することができる無細胞化方法及びその方法によって得られた人体移植用人工組織を提供することにある。
　（１）前記目的を達成するため、本発明は、流れが付与された界面活性剤に前記動物組織を浸漬する処理を行い、動物組織の原細胞を除去する無細胞化方法において、
　前記処理後の前記動物組織を核酸分解酵素溶液中に浸漬する、という手法を採っている。
　（２）また、前記界面活性剤に前記動物組織を浸漬した状態で、当該動物組織にマイクロ波を照射する処理を経て、核酸分解酵素溶液中に前記動物組織を浸漬する、という手法を採ることもできる。
　（３）更に、前記界面活性剤に拍動流を付与するとよい。
　（４）また、本発明に係る人体移植用人工組織は、前述の各手法により無細胞化された前記動物組織からなる、という構成を採っている。
　本発明によれば、動物から採取した血管や心臓弁等の他、従来の手法では、ＤＮＡ量をゼロにすることができなかった動物の腱や靭帯についても、無細胞化することができる。
本実施形態に係る無細胞化方法に用いられる生体組織処理装置の概略斜視図。
　以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。
　図１には、本実施形態に係る無細胞化方法に用いられる生体組織処理装置の概略斜視図が示されている。この図において、生体組織処理装置１０は、ウシ等の動物から採取した腱や靭帯からなる動物組織Ｔを脱細胞する際に用いられる装置である。
　前記生体組織処理装置１０は、動物組織Ｔを脱細胞するための細胞除去溶液を所定の回路によって一方向（図中矢印方向）に循環させる溶液循環部１１と、この溶液循環部１１の途中に設けられ、動物組織Ｔに対し細胞除去溶液を浸漬した状態で保持する組織保持部１２と、組織保持部１２の周囲に配置され、動物組織Ｔにマイクロ波を照射可能なマイクロ波照射手段１３とを備えて構成されている。
　前記溶液循環部１１は、細胞除去溶液に拍動流を付与する拍動ポンプ１５と、この拍動ポンプ１５から吐出した細胞除去溶液が拍動ポンプ１５に戻るように配置された循環路１６と、この循環路１６内の細胞除去溶液が所望の状態になるように拍動ポンプ１５の動作を制御する制御手段１７と、循環路１６の途中に設けられて細胞除去溶液を冷却する冷却手段１８と、組織保持部１２から流出した循環路１６内の細胞除去溶液の流量及び圧力を測定する計測装置２５と、組織保持部１２から流出した直後の循環路１６内の細胞除去溶液の温度を測定する温度センサ２９とを備えて構成されている。
　前記拍動ポンプ１５は、吐出時に拍動流を生成可能な拍動型ポンプであれば何でも良く、例えば、本出願人によって既提案された（特願２００２－１６７８３６号等参照）ポンプが挙げられる。
　前記循環路１６は、拍動ポンプ１５の流出ポート２０から吐出した細胞除去溶液が、外気に非接触となる状態で流入ポート２１に流入する閉ループ状に構成されている。この循環路１６は、人体の血液の体循環状態を模擬可能となる構造が採用されており、本出願人によって既提案された構造（国際公開第２００４／１００８３１号パンフレット）と実質的に同一の構造となっている。
　前記制御手段１７は、前記計測装置２５により測定された細胞除去溶液の流量及び圧力に基づき、循環路１６内の細胞除去溶液に所望の拍動流が付与されるように拍動ポンプ１５の駆動を制御するようになっている。
　前記冷却手段１８は、流入ポート２１に流入する直前の循環路１６の一部分を水に浸漬させることで細胞除去溶液を冷却する水槽２７と、この水槽２７内の水温を低下させる冷却装置２８とを備えている。この冷却装置２８は、マイクロ波の照射によって加温された循環路１６内の細胞除去溶液を冷却するように機能する。
　前記組織保持部１２は、循環路１６内を流れる細胞除去溶液を導き、当該細胞除去溶液に動物組織Ｔを浸漬させた状態で保持可能となっている。
　前記マイクロ波照射手段１３は、組織保持部１２の下側位置に設けられて当該組織保持部１２に対して回転可能に設けられた円盤状のテーブル３１と、このテーブル３１上に載るとともに、組織保持部１２の側方からマイクロ波を照射する照射装置３２とを備えて構成されている。
　前記テーブル３１は、図示しないモータ等によって回転速度が制御された状態で回転されるようになっており、テーブル３１の回転により、組織保持部１２の側方ほぼ全周から動物組織Ｔに万遍なくマイクロ波が照射されることになる。
　前記照射装置３２は、マイクロ波の発生源として図示しないマグネトロンを利用した公知の装置である。この照射装置３２は、周波数が２．４５ＧＨｚ、出力が０Ｗ～１５００Ｗ程度のマイクロ波を照射可能となるものが用いられており、前記温度センサ２９の計測値に基づき、自動的にマイクロ波の照射を停止若しくは開始するようになっている。すなわち、循環路１６内の細胞除去溶液がマイクロ波の照射によって加温されて、ヒトの体温程度（約３７℃）以上になった場合には、マイクロ波の照射を自動的に停止するようになっている。そして、前述したように、冷却装置２８により、循環路１６内の細胞除去溶液の温度がヒトの体温程度（約３７℃）未満に低下すると、再びマイクロ波の照射を開始するようになっている。
　なお、図中一点鎖線で描かれた部材は、組織保持部１２が収容されてテーブル３１と一体回転可能なケース３４である。当該ケース３４は、その内部に照射装置３２の照射部３２Ａが入り込んでおり、当該照射部３２Ａから照射されたマイクロ波をケース３４の外側に漏出させないように設計されている。
　また、図中符号３５は、テーブル３１の回転に伴う照射装置３２のコードＣの絡まりを防止するために設けられたスリップリングである。
　次に、本発明に係る無細胞化方法について説明する。
　先ず、動物の腱や靭帯などの動物組織Ｔを組織保持部１２にセットして、生体組織処理装置１０内に細胞除去溶液を注入し、当該細胞除去溶液を循環させる。ここで、細胞除去溶液として、例えば、デオキシコール酸（胆汁酸）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、トリトンＸ－１００等の界面活性剤が用いられる。そして、図示しない所定のスイッチを投入すると、拍動ポンプ１５が駆動し、循環路１６内を細胞除去溶液が循環し、拍動ポンプ１５から吐出した細胞除去溶液は、拍動流となって組織保持部１２内を流れ、更に循環路１６を流れながら拍動ポンプ１５に流入する。
　この際、テーブル３１の回転により、照射装置３２が回転しながら動物組織Ｔの側方ほぼ全周に満遍なくマイクロ波が照射される。
　その後、動物組織Ｔを生体組織処理装置１０から取り出し、核酸分解酵素溶液に所定時間浸漬すると、動物組織Ｔが無細胞化されて人体移植用人工組織が得られる。すなわち、ここで得られた動物組織Ｔは、各種の原細胞（内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞）が除去され、コラーゲン、エラスチン等からなる基質のみになる。ここで用いられる核酸分解酵素溶液としては、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、或いは、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）とリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の混合液が挙げられる。
　なお、生体組織処理装置１０を用いずに、定常流が与えられた細胞除去溶液中に動物組織Ｔを浸漬した状態で、当該動物組織Ｔの周囲からマイクロ波を照射し、その後、前述の核酸分解酵素溶液による処理を行ってもよい。
　また、動物組織Ｔへのマイクロ波を行わずに、定常流若しくは拍動流が与えられた細胞除去溶液中に動物組織Ｔを浸漬した後で、前述の核酸分解酵素溶液による処理を行ってもよい。
　本発明者らは、前述の無細胞化処理の効果を実証するための実験を行った。
　この実験では、動物組織として、幅４ｍｍ、厚さ４ｍｍ、長さ５０ｍｍのウシ指伸筋腱を用い、以下の各処理を行い、当該処理後における動物組織のＤＮＡ量を測定し、未処理の動物組織に対するＤＮＡの残存割合（％）を算出した。
　（実施例１）
　前記動物組織に対し、先ず、生体組織処理装置１０による脱細胞化処理（以下、「拍動循環処理」と称する。）を行った後で、核酸分解酵素溶液に浸漬させて振とうする処理（以下、「振とう処理」と称する。）を行った。ここで、拍動循環処理は、界面活性剤としてデオキシコール酸を用い、その平均流量を毎分６リットル、平均液圧を９０ｍｍｈｇとした。また、照射装置３２で照射されるマイクロ波については、周波数を２．４５ＧＨｚとし、出力６００Ｗで延べ７２時間照射した。更に、核酸分解酵素溶液として、１００Ｕ／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）溶液を用い、振とう処理を２４時間行った。
　その結果、動物組織のＤＮＡ量はゼロになり、未処理の動物組織に対するＤＮＡの残存割合は０％となった。
　（実施例２）
　前記実施例１に対し、マイクロ波の照射時間を４８時間とした他は、実施例１の条件と同一とし、実施例１と同様の処理を行った。
　本実施例についても、実施例１と同様の結果が得られた。
　（実施例３）
　前記実施例１に対し、マイクロ波の照射時間を２４時間とした他は、実施例１の条件と同一とし、実施例１と同様の処理を行った。
　本実施例についても、実施例１と同様の結果が得られた。
　（実施例４）
　前記実施例１に対し、マイクロ波の照射を行わない他は、実施例１と条件を同一にして同様の処理を行った。
　本実施例によれば、動物組織のＤＮＡは殆ど除去され、未処理の動物組織に対するＤＮＡの残存割合は０．２％となった。
　（実施例５）
　図示しない定常流発生装置によって定常流が与えられた界面活性剤に前記動物組織を浸漬させながら、当該動物組織の周囲にマイクロ波を照射し、その後、実施例１と同様の核酸分解酵素溶液による振とう処理を行った。ここでの処理は、界面活性剤としてデオキシコール酸を用い、その流量を毎分６リットル、液圧を９０ｍｍｈｇとした。また、照射されるマイクロ波については、周波数を２．４５ＧＨｚとし、出力６００Ｗで延べ２４時間照射した。
　本実施例についても、実施例１と同様の結果が得られた。
　（実施例６）
　前記実施例５に対し、マイクロ波の照射を行わない他は、実施例５と条件を同一にして同様の処理を行った。
　本実施例によれば、動物組織のＤＮＡは殆ど除去され、未処理の動物組織に対するＤＮＡの残存割合は３．８％となった
　（実施例７）
　前記実施例１に対し、核酸分解酵素溶液として、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）溶液の代わりに、ＤＮａｓｅ（１５０Ｕ／ｍｌ）とＲＮａｓｅ（１００Ｕ／ｍｌ）の混合液を用い、その他は、実施例１の条件と同一とした。
　本実施例についても、実施例１と同様の結果が得られた。
　（比較例１）
　前記実施例１に対し、拍動循環処理のみを同一条件で行い、前記振とう処理は行わなかった。
　その結果、未処理の動物組織に対するＤＮＡの残存割合は、６１％となった。
　（比較例２）
　前記実施例１に対し、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）溶液による振とう処理のみを同一条件で行い、拍動循環処理は行わなかった。
　その結果、未処理の動物組織に対し、ＤＮＡを殆ど除去できなかった。
　（比較例３）
　前記実施例５に対し、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅの混合液による振とう処理のみを同一条件で行い、拍動循環処理は行わなかった。
　その結果、未処理の動物組織に対するＤＮＡの残存割合は、３７％となった。
　（比較例４）
　前記実施例５に対し、前記拍動循環処理と前記振とう処理をそれぞれ同一条件とし、逆の手順でこれら各処理を行った。すなわち、前記振とう処理の後で前記拍動循環処理を行った。
　その結果、未処理の動物組織に対するＤＮＡの残存割合は、４１％となった。
　以上の結果により、定常流若しくは拍動流を付与した界面活性剤に動物組織を浸漬させた後で、当該動物組織を核酸分解酵素溶液に浸漬すると、ウシ指伸筋腱をほぼ完全に無細胞化させることが可能になる。
　なお、その他の腱や靭帯の他、血管、心臓弁、心膜等の動物組織についても、本発明の無細胞化方法を用いることにより、前記実施形態と同様の効果が得られる。
　また、前記実施例１と実施例７でそれぞれ得られた処理後の動物組織は、本発明者らの強度実験（引張試験）によれば、実施例１の処理による動物組織の方が、高強度であることが判明した。従って、振とう処理時に用いる核酸分解酵素溶液としては、ＤＮａｓｅとＲＮａｓｅの混合液よりも、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）溶液を用いることが好ましい。
　更に、本発明に係る無細胞化方法は、前記実施形態での生体組織処理装置１０の利用が必須ではなく、前述した各種処理を行える限りにおいて、種々の装置や手段を用いて行うことができる。
　本発明によれば、生体適合性が優れた移植用の人工靭帯や人工腱等の人工組織の生産が可能になる。
　１０　生体組織処理装置
　Ｔ　動物組織

Claims (4)

  1. 　流れが付与された界面活性剤に前記動物組織を浸漬する処理を行い、動物組織の原細胞を除去する無細胞化方法において、
    　前記処理後の前記動物組織を核酸分解酵素溶液中に浸漬することを特徴とする無細胞化方法。
  2. 　前記界面活性剤に前記動物組織を浸漬した状態で、当該動物組織にマイクロ波を照射する処理を経て、核酸分解酵素溶液中に前記動物組織を浸漬することを特徴とする請求項１記載の無細胞化方法。
  3. 　前記界面活性剤には、拍動流が付与されることを特徴とする請求項１又は２記載の無細胞化方法。
  4. 　前記請求項１、２又は３の何れかに記載された方法により無細胞化された動物組織からなる人体移植用人工組織。
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