WO2013147299A1 - 生体組織の処理方法及び生体組織 - Google Patents

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岩▲崎▼　清隆
梅津　光生
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    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Definitions

  • the present invention relates to a biological tissue processing method and biological tissue, and more particularly to a biological tissue processing method that suppresses tissue degeneration and strength reduction due to sterilization and a biological tissue obtained by the processing method.
  • a living tissue collected from an animal and decellularized (hereinafter referred to as “acellular tissue”) is not used immediately after the decellularization treatment, but is subjected to a sterilization treatment and then once. May be saved.
  • treatment for sterilizing the acellular tissue is indispensable.
  • biological tissue a tissue composed of a living body-derived component or the like
  • biological tissue is significantly damaged, and the strength of the tissue is lower than that before the treatment.
  • the present inventors have found that when the biological tissue is freeze-dried and sterilized and then rehydrated, the moisture content decreases and the tissue becomes harder than the biological tissue before treatment. It has been found that it causes denaturation. Therefore, the present inventors have found that, when a living tissue is impregnated with a trehalose solution before the sterilization treatment of the living tissue, a decrease in strength and tissue degeneration can be suppressed with respect to the living tissue before the sterilization treatment.
  • the present invention has been devised based on such knowledge, and its purpose is to suppress a decrease in strength and tissue degeneration before treatment even when sterilization is performed on a tissue composed of a biological component or the like. It is providing the biological tissue processing method which can be performed, and the biological tissue obtained by the said processing method.
  • a tissue composed of a living body-derived component or the like (hereinafter referred to as “living tissue”) is immersed in a trehalose solution and shaken for about 24 hours, thereby impregnating the living tissue with the trehalose solution.
  • a trehalose solution a solution in which trehalose is dissolved in phosphate buffered saline is used, and preferably a trehalose concentration in the range of 20 wt% to 35 wt% is used.
  • the living tissue is subjected to a drying process to remove moisture from the living tissue.
  • the drying process here is not particularly limited, but is performed at a temperature of about ⁇ 45 ° C. for about 24 hours.
  • the tissue is sterilized by ethylene oxide gas sterilization.
  • the conditions for the sterilization treatment are not particularly limited, and for the purpose of suppressing collagen denaturation, the temperature is about 30 ° C., the action time is about 12 hours, and the aeration is about 20 hours.
  • other sterilization methods such as hydrogen peroxide low temperature plasma sterilization may be employed.
  • other disaccharide oligosaccharides such as sucrose, lactose and maltose can be used instead of trehalose. That is, in the same manner as described above, various aspects can be adopted as long as the biological tissue is impregnated with the oligosaccharide solution of the disaccharide and then the drying treatment and the sterilization treatment are performed.
  • the present invention even when a sterilization process is performed on a living tissue, it is possible to suppress tissue degeneration and strength reduction compared to before the process.
  • the tissue structure and strength in the living tissue before treatment can be maintained at substantially the same level.
  • Example 1 First, the collected bovine pericardium was formed into a rectangular sheet having a size of 5 cm ⁇ 7 cm, a thickness of about 300 ⁇ m, and a mass of 1.5 g, and washed with phosphate buffered saline (PBS) containing antibiotics.
  • PBS phosphate buffered saline
  • 40 ml of a trehalose solution obtained by adding trehalose to PBS is prepared, and the bovine pericardium (acellular tissue) after cell-free treatment is placed in a 50 ml centrifuge tube together with the trehalose solution.
  • the solution was shaken with the bovine pericardium immersed in the solution.
  • the concentration of trehalose in the trehalose solution was 1% by weight.
  • the shaking treatment was performed for 24 hours at a rotation speed of 180 rpm using a bioshaker warmed to 37 ° C.
  • the bovine pericardium was allowed to stand at about ⁇ 45 ° C. for about 24 hours to remove water from the bovine pericardium.
  • using an ethylene oxide gas sterilizer sterilization of bovine pericardium with ethylene oxide gas was performed, and a dry sterilized tissue of bovine pericardium was obtained.
  • the working temperature was 30 ° C.
  • the working time was 12 hours
  • the aeration was 20 hours.
  • Examples 2 to 9 Compared to Example 1, only the concentration of trehalose in the solution was changed to obtain a dry sterilized tissue of bovine pericardium. That is, the bovine pericardium treated in the same manner as described above is placed in each trehalose solution in which the trehalose concentration is set to 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50% by weight, respectively. The above-described shaking treatment was performed, and then the above-mentioned dry sterilization treatment was performed to obtain the dry sterilization tissue of bovine pericardium according to Examples 2 to 9. Since the concentration of trehalose dissolved in PBS at a temperature of 37 ° C. is about 50%, the maximum concentration of trehalose was set to 50%.
  • Example 10 to 18 For Examples 1 to 9, a dry sterilized tissue of bovine pericardium was obtained under the same conditions as described above, except that no cell-free treatment was performed.
  • Example 19 to 36 For Examples 1 to 18, a dry sterilized tissue of bovine tendon was obtained under the same conditions as described above except that the tissue to be treated was changed from bovine pericardium to bovine tendon.
  • the bovine tendon used here has a length of about 10 cm and a thickness of about 10 mm.
  • Example 1 (Comparative Example 1) With respect to Example 1, the above-described drying treatment and sterilization treatment were performed without impregnating the bovine pericardium after cell-free treatment with the trehalose solution to obtain a dry sterilized tissue of bovine pericardium.
  • Comparative Example 2 A dry sterilized tissue of bovine pericardium was obtained under the same conditions as in Comparative Example 1 in which trehalose solution was not impregnated except that no cell-free treatment was performed on Comparative Example 1.
  • each dry sterilized tissue is placed in a 50 ml centrifuge tube by adding 40 ml of PBS containing antibiotics. Then, using a bioshaker warmed to 37 ° C., the mass of each dry sterilized tissue rehydrated by shaking for 24 hours at 180 rpm is measured with an electronic balance. And about the dry-sterilized tissue of each Example, the increase rate of the mass with respect to the dry-sterilized tissue of the corresponding comparative example which is not made to impregnate a trehalose solution was computed.
  • Comparative Example 1 is a corresponding comparative example
  • Comparative Example 2 is a corresponding comparative example
  • Comparative Example 3 is a comparative comparison.
  • Comparative Example 4 is a corresponding comparative example.
  • Examples 1 to 18 and Comparative Examples 1 and 2 using bovine pericardium as a tissue to be treated were performed under the following conditions.
  • a strip-shaped test piece having a width of 3 mm was prepared, and a tensile test was performed with an initial chuck distance of 7 mm. went.
  • the tensile test conditions here were an initial tensile load of 0.5 N, a test piece elongation of 20%, a tensile test speed of 120 mm / min, and a repetition count of 3000 times.
  • the stress relaxation rate over time calculated by dividing the value obtained by subtracting the load after 3000 times from the initial load by the initial load is obtained, and the stress relaxation rate of the dry sterilized tissue of the corresponding comparative example The rate of increase from was calculated.
  • the stress relaxation rate here is an index representing viscoelastic properties (flexibility), and the greater the stress relaxation rate, the more flexible. It has been found that when a biological tissue is sterilized, the stress relaxation rate is lower than that before the treatment.
  • Examples 19 to 36 and Comparative Examples 3 and 4 using bovine tendon as a tissue to be treated were performed under the following conditions.
  • Each specimen having the above-described shape was rehydrated under the same conditions as in the first experiment, and then a tensile test was conducted with the width of the specimen being 4 mm and the initial distance between chucks being 45 mm.
  • the conditions for the tensile test were as follows. First, an initial tensile load of 66.7 N was applied for 15 minutes, and then a tensile load of 100 N was repeatedly applied 10,000 times at a tensile test speed of 300 mm / min. And about each test piece, the place where the increase in strain every 100 times is less than 0.15% is obtained, and the increase in strain every 100 times reaches less than 0.15% from the value of strain up to 10,000 times.
  • a biological tissue that has been treated by a conventional method has a lower mass than an untreated tissue, but according to the above experimental results, the treatment of the present invention has been performed.
  • Biological tissue hereinafter referred to as “the treated tissue of the present invention”
  • the treated tissue of the present invention can increase the mass compared to the conventional treated tissue.
  • the trehalose concentration is within the range of 20 wt% to 35 wt%, the highest mass peak among the treated tissues of the present invention can be obtained, and the mass can be almost the same as that of the untreated tissues. It became possible.
  • the conventional treated tissue causes a decrease in strength due to a decrease in flexibility compared to the untreated tissue, but according to the above experimental results, the treated tissue of the present invention is more flexible than the conventional treated tissue.
  • the strength can be increased.
  • the trehalose concentration is within the range of 20 wt% to 35 wt%, the highest flexibility peak among the treated tissues of the present invention can be obtained, and the level is almost the same as the flexibility of the untreated tissues. It became possible.
  • the present invention is not limited to the tissue of the above embodiment as long as it is composed of a living body-derived component or the like, and can be similarly applied.
  • the present invention can be used for processing for industrial processing and storage using tissue collected from animals as tissue for transplantation of the human body.

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Abstract

　本発明は、生体由来成分等からなる組織について、乾燥処理や滅菌処理を行っても、処理前からの強度低下や組織変性を抑制する。すなわち、生体組織をトレハロース溶液に浸漬させ、振とうさせることで、生体組織にトレハロース溶液を含浸させる。ここでのトレハロース溶液は、リン酸緩衝生理食塩水にトレハロースを溶解したものが用いられ、好ましくは、トレハロースの濃度が、２０重量％～３５重量％の範囲内のものが用いられる。その後、生体組織の乾燥処理を行い当該生体組織の水分を除去し、エチレンオキサイドガス滅菌による組織の滅菌処理を行う。

Description

生体組織の処理方法及び生体組織
　本発明は、生体組織の処理方法及び生体組織に係り、更に詳しくは、滅菌処理による組織変性や強度低下を抑制する生体組織の処理方法及び当該処理方法によって得られる生体組織に関する。
　本出願人らは、ウシやブタ等の動物から採取した心膜、腱等の動物組織を人体に移植するために、当該動物組織を無細胞化させる方法を既に提案している（特許文献１等参照）。ここで、動物から採取して無細胞化された生体組織（以下、「無細胞化組織」と称する）は、無細胞化処理後、直ぐに利用されずに、滅菌処理を施した上で、一旦保存しておく場合がある。このような動物由来の無細胞化組織の実用化には、無細胞化組織を滅菌する処理が不可欠である。
国際公開第２０１１／１４２４０７号パンフレット
　しかしながら、生体由来成分等からなる組織（以下、「生体組織」と称する。）に滅菌処理を施すと、生体組織の著しい損傷を招来し、処理前に比べて組織の強度が低下する。また、本発明者らは、鋭意実験研究を行った結果、生体組織を凍結乾燥して滅菌した後に再水和すると、処理前の生体組織に対し、含有水分が減少して組織が硬くなる組織変性を招来することを見出した。そこで、本発明者らは、生体組織の滅菌処理前に、トレハロース溶液を生体組織に含浸させたところ、滅菌処理前の生体組織に対する強度低下や組織変性を抑制可能になることを知見した。
　本発明は、このような知見に基づいて案出されたものであり、その目的は、生体由来成分等からなる組織について、滅菌処理を行っても、処理前からの強度低下や組織変性を抑制することができる生体組織の処理方法及び当該処理方法によって得られる生体組織を提供することにある。
　本発明では、生体由来成分等からなる組織（以下、「生体組織」と称する。）をトレハロース溶液に浸漬させ、２４時間程度振とうさせることで、生体組織にトレハロース溶液を含浸させる。ここでのトレハロース溶液は、リン酸緩衝生理食塩水にトレハロースを溶解したものが用いられ、好ましくは、トレハロースの濃度が、２０重量％～３５重量％の範囲内のものが用いられる。
　その後、生体組織の乾燥処理を行い当該生体組織の水分を除去する。ここでの乾燥処理は、特に限定されるものではないが、－４５℃程度の温度で、２４時間程度行われる。
　そして、エチレンオキサイドガス滅菌による組織の滅菌処理を行う。ここでの滅菌処理の条件としては、特に限定されるものではなく、コラーゲン変性を抑制する目的で温度を３０℃程度とし、作用時間を１２時間程度、エアレーションを２０時間程度とする。なお、過酸化水素低温プラズマ滅菌等の他の滅菌手法の採用も可能である。なお、本発明においては、トレハロースの代わりに、スクロース、ラクトース、マルトース等の他の二糖類のオリゴ糖を用いることもできる。つまり、前述と同様にして、二糖類のオリゴ糖溶液を生体組織に含浸させてから、乾燥処理、滅菌処理を行う限りにおいて、種々の態様を採ることができる。
　本発明によれば、生体組織に滅菌処理を行っても、処理前に対する組織変性や強度低下を抑制することができる。
　しかも、トレハロース溶液中のトレハロース濃度を２０重量％～３５重量％とすると、処理前の生体組織における組織構造と強度をほぼ同程度に維持することが可能になる。
　（実施例１）
　先ず、採取されたウシ心膜について、縦横５ｃｍ×７ｃｍ、厚さ約３００μｍ、質量１．５ｇの大きさの長方形シート状にし、抗生物質入りのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。
　そして、洗浄後のウシ心膜について、本発明者らが既に提案している手法（特開２０１１－０５０４３号公報参照）により、無細胞化処理を行った。
　次に、ＰＢＳにトレハロースを添加することで得られたトレハロース溶液４０ｍｌを用意し、５０ｍｌ遠沈管内に、当該トレハロース溶液とともに無細胞化処理後のウシ心膜（無細胞化組織）を入れ、トレハロース溶液にウシ心膜を浸漬させた状態で振とう処理を行った。本実施例では、トレハロース溶液中のトレハロースの濃度を１重量％とした。また、振とう処理は、３７℃に温めておいたバイオシェーカーを用い、回転数１８０ｒｐｍで２４時間行った。
　その後、凍結乾燥器を使い、ウシ心膜を－４５℃程度で２４時間程度放置し、ウシ心膜の水分を除去した。
　そして、エチレンオキサイドガス滅菌器を使い、エチレンオキサイドガスによるウシ心膜の滅菌処理を行い、ウシ心膜の乾燥滅菌処理組織が得られた。ここでは、作用温度を３０℃、作用時間を１２時間、エアレーションを２０時間とした。
　（実施例２～９）
　実施例１に対し、溶液中のトレハロースの濃度のみを変えてウシ心膜の乾燥滅菌処理組織を得た。すなわち、前述と同様に無細胞化処理されたウシ心膜を、トレハロースの濃度が５、１０、２０、２５、３０、３５、４０、５０重量％にそれぞれ設定された各トレハロース溶液中に入れて前述の振とう処理を行い、その後、前述の乾燥滅菌処理を行って実施例２～９に係るウシ心膜の乾燥滅菌処理組織を得た。
　なお、温度３７℃のＰＢＳ中で溶解するトレハロースの濃度は、約５０％程度であることから、トレハロースの最高濃度を５０％とした。
　（実施例１０～１８）
　実施例１～９に対し、無細胞化処理を行わない他は、前述と同一の条件でウシ心膜の乾燥滅菌処理組織を得た。
　（実施例１９～３６）
　実施例１～１８に対し、処理対象組織をウシ心膜からウシ腱に代えた他は、前述と同一の条件でウシ腱の乾燥滅菌処理組織を得た。
　ここでのウシ腱は、長さ１０ｃｍ、厚さ１０ｍｍ程度のものを用いた。
　（比較例１）
　実施例１に対し、無細胞化処理後のウシ心膜をトレハロース溶液に含浸させずに、前述の乾燥処理及び滅菌処理を行ってウシ心膜の乾燥滅菌処理組織を得た。
　（比較例２）
　比較例１に対し、無細胞化処理を行わない他は、トレハロース溶液に含浸させない比較例１と同一の条件でウシ心膜の乾燥滅菌処理組織を得た。
　（比較例３、４）
　比較例１、２に対し、処理対象組織をウシ心膜から実施例１９等と同一のウシ腱に代えた他は、トレハロース溶液に含浸させない比較例１、２と同一の条件でウシ腱の乾燥滅菌処理組織を得た。
　次に、本発明の効果を実証するための実験を行った。
　第１の実験として、前記各実施例と前記各比較例で得られた乾燥滅菌処理組織について、組織変性における本発明の抑制効果の実証実験を行った。
　すなわち、各乾燥滅菌処理組織それぞれについて、５０ｍｌ遠沈管内に、抗生物質入りのＰＢＳ４０ｍｌを加えて各乾燥滅菌処理組織を入れる。そして、３７℃に温めておいたバイオシェーカーを用い、回転数１８０ｒｐｍで２４時間振とうすることで再水和された各乾燥滅菌処理組織の質量を電子天秤で計測する。そして、各実施例の乾燥滅菌処理組織について、トレハロース溶液に含浸させない対応比較例の乾燥滅菌処理組織に対する質量の増加率を算出した。なお、実施例１～９については、比較例１が対応比較例となり、実施例１０～１８については、比較例２が対応比較例となり、実施例１９～２７については、比較例３が対応比較例となり、実施例２８～３６については、比較例４が対応比較例となる。
　第２の実験として、前記各実施例と前記各比較例で得られた乾燥滅菌処理組織について、組織の強度低下における本発明の抑制効果を実証するための引張試験を行った。
　当該実験において、処理対象組織としてウシ心膜を用いた実施例１～１８及び比較例１、２については、以下の条件で行った。
　ウシ心膜の乾燥滅菌処理組織について、第１の実験の同一条件で再水和を行った後に、幅３ｍｍの短冊状形状の試験片を作製し、初期のチャック間距離を７ｍｍとして引張試験を行った。ここでの引張試験の条件は、初期引張荷重０．５Ｎ、試験片の伸び２０％、引張試験速度を１２０ｍｍ／ｍｉｎ、繰り返し回数を３０００回とした。そして、各試験片について、初期荷重から３０００回経過後の荷重を引いた値を初期荷重で割って算出した経時的な応力緩和率を求め、前記対応比較例の乾燥滅菌処理組織の応力緩和率からの増加率を算出した。なお、ここでの応力緩和率は、粘弾性特性（柔軟性）を表す指標であり、応力緩和率が大きい程、柔軟性があることを意味する。生体組織を滅菌処理すると、応力緩和率が処理前に比べ低下することが判明している。
　また、処理対象組織としてウシ腱を用いた実施例１９～３６及び比較例３、４については、以下の条件で行った。
　前述の形状の各試験片について、第１の実験の同一条件で再水和を行った後に、前記試験片の幅を４ｍｍとし、初期のチャック間距離を４５ｍｍとして引張試験を行った。ここでの引張試験の条件は、まず、初期引張荷重６６．７Ｎで１５分間作用させた後、引張荷重１００Ｎを、引張試験速度３００ｍｍ／ｍｉｎで１００００回繰り返し作用させた。そして、各試験片について、１００回ごとのひずみの増加が０．１５％未満となるところを求め、１００００回までのひずみの値から１００回ごとのひずみの増加が０．１５％未満に到達するところのひずみの値を引くことにより、組織を構成するコラーゲン等のクリンプ構造の影響をできるだけ排除し、組織構造そのもののひずみの変化率を算出した。なお、ここでのひずみの変化率は、同様に粘弾性特性を表す値である。そして、各試験片について、前記対応比較例の乾燥滅菌処理組織に対するひずみ変化率の増加率を算出した。
　以上の各実験結果を下表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　従来法の処理がなされた生体組織（以下、「従来の処理組織」と称する）は、未処理組織に比べて質量が低下するが、以上の実験結果によれば、本発明の処理がなされた生体組織（以下、「本発明の処理組織」と称する）は、従来の処理組織に対し、質量を増大させることが可能になった。しかも、トレハロース濃度を２０重量％～３５重量％の範囲内にすると、本発明の処理組織の中で最も高い質量のピークを得ることができ、未処理組織の質量とほぼ同一レベルにすることが可能になった。この結果、本発明によれば、処理前の組織微細構造を破壊する現象の抑制効果があるものと推測でき、従来法に比べ、処理前後での生体組織の変性が抑制されることが実証された。
　また、従来の処理組織は、未処理組織に比べて柔軟性の低下によって強度低下を招来するが、以上の実験結果によれば、本発明の処理組織は、従来の処理組織に比べ、柔軟性を増大させることができ、強度を高めることが可能になった。しかも、トレハロース濃度を２０重量％～３５重量％の範囲内にすると、本発明の処理組織の中で最も高い柔軟性のピークを得ることができ、未処理組織の柔軟性とほぼ同一レベルにすることが可能になった。この結果、本発明によれば、従来法に比べ、処理前後での生体組織の強度低下が抑制されることが実証された。
　更に、本発明によれば、生体組織を無細胞化処理した場合でも、乾燥及び滅菌処理による処理前からの組織変性や強度低下が抑制されることが実証された。
　なお、本発明は、生体由来成分等からなる組織であれば、前記実施例の組織に限定されずに同様に適用可能となる。
　本発明は、動物から採取された組織を人体の移植用組織として、加工や保存を工業的に行うための処理に用いることができる。

Claims (7)

  1. 　生体組織を滅菌する工程を含む処理方法において、
    　前記滅菌工程前に、二糖類のオリゴ糖溶液を前記生体組織に含浸させることを特徴とする生体組織の処理方法。
  2. 　生体組織を乾燥した後で滅菌する工程を含む処理方法において、
    　前記乾燥工程前に、二糖類のオリゴ糖溶液を前記生体組織に含浸させることを特徴とする生体組織の処理方法。
  3. 　無細胞化した生体組織を滅菌する工程を含む処理方法において、
    　前記滅菌工程前に、二糖類のオリゴ糖溶液を前記生体組織に含浸させることを特徴とする生体組織の処理方法。
  4. 　前記オリゴ糖溶液は、トレハロース溶液であることを特徴とする請求項１、２又は３記載の生体組織の処理方法。
  5. 　前記トレハロース溶液中の前記トレハロースの濃度は、２０重量％～３５重量％であることを特徴とする請求項４記載の生体組織の処理方法。
  6. 　生体組織に二糖類のオリゴ糖溶液を含浸させてから乾燥及び滅菌することで得られる生体組織。
  7. 　無細胞化された生体組織に二糖類のオリゴ糖溶液を含浸させてから乾燥及び滅菌することで得られる生体組織。
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