WO2011120498A1 - Verfahren zur prozessführung einer edukt-limitierten, biochemischen reaktion - Google Patents

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WO2011120498A1
WO2011120498A1 PCT/DE2011/000302 DE2011000302W WO2011120498A1 WO 2011120498 A1 WO2011120498 A1 WO 2011120498A1 DE 2011000302 W DE2011000302 W DE 2011000302W WO 2011120498 A1 WO2011120498 A1 WO 2011120498A1
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WO
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reaction
enzyme
nutrient
reaction solution
starting material
Prior art date
Application number
PCT/DE2011/000302
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English (en)
French (fr)
Inventor
Frank Kensy
Johannes Hemmerich
Carsten Müller
Original Assignee
M2P-Labs Gmbh
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Publication date
Application filed by M2P-Labs Gmbh filed Critical M2P-Labs Gmbh
Publication of WO2011120498A1 publication Critical patent/WO2011120498A1/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/22—Processes using, or culture media containing, cellulose or hydrolysates thereof

Definitions

  • the invention describes a process for the process control of a reactant-limited, biochemical reaction, in particular for the simplified growth of cells in the fermentation.
  • the invention has the object cells in a fermentation under nutrient limitation and simultaneous pH control or regulation to increase in a so-called fed-batch fermentation, and thus to increase the biosynthesis of products in the productivity, wherein the cells real product can be.
  • the nutrient availability for nutrient limitation can be realized at different rates or
  • CONFIRMATION COPY be completely exposed.
  • the nutrient limitation rates can also be varied in chronological order and the exposure is reversible.
  • a temporary or complete suspension, pH control or regulation is also feasible.
  • the pH-controlled fedbatch technology can be used in a variety of fermentation scale bars (nL to m 3 ) without changing key process characteristics, except for size scale and related process engineering conditions.
  • the invention enables a one-pot (one-pot) fermentation or cell-free biosynthesis reaction in only one bioreactor. There are no additional, separate Vorhalte capableer for pH adjusters and nutrients and the associated pumps needed. Thus, substantial investments in the fermentation plant and the operating costs can be reduced.
  • the invention is intended to simplify the fermentation procedure considerably.
  • the user should as usual in the very common batch process (without nutrient limitation and feeding, without pH control) submit all media components in the medium in dissolved form, except that in the process according to the invention not a batch process but a pH-controlled or controlled fed-batch process is realized, which comes much closer to the industrial process in production.
  • cell culture medium refers to all known and modified liquid nutrient compositions used or related to cell cultivation and fermentation Cell of inorganic chemicals, mineral salts, vitamins, nitrogen sources, carbon and energy sources to sustain and sustain the energy balance, growth, and product formation of a cell.
  • these nutrient compositions can be complex, sometimes undefined Ingredients such as yeast extracts, hydrolyzates, peptones and industrial wastes, as well as other defined ingredients such as amino acids, growth factors, hormones, inducers, buffering agents, antibiotics, selection markers, cytokines, nucleotides and serum proteins.
  • Large suppliers of cell culture media include Becton, Dickinson and Company (BD), Invitrogen and Lonza, whose product catalogs contain a variety of media.
  • Nutrient is a component of the cell culture medium that is essential for the growth, the energy balance, its function and / or product formation of a cell and promotes the individual functions of the cell.
  • Polymers are chemical compounds of chain or branched molecules (macromolecules), which in turn consist of identical or similar units (the so-called monomers) .
  • the monomers can be of organic and inorganic nature and mixed in the polymer
  • the polymers are used in this invention as storage of nutrients or pH-active substances.
  • the polymers can not be metabolized directly by the cells.
  • the following polymers can serve as carbon nutrient supplier: for example polysaccharides such as starch, treated starch, Starch extracts, starch derivatives, glycogen, carrageenan, amylose, amylopectins, pullulans, dextranes, dextrins, maltodextrins, maltotriose and maltose or else cellulose, treated cellulose, cellulose extracts, cellulose derivatives, hemicellulose, glucans, cellobiose
  • the following polymers may be used as suppliers of pH-active substances serve: eg urea, G polyacrylamide, polyamide
  • Enzymes are widely used in the field of biotechnology and catalyze biochemical reactions
  • the enzymes are used in particular for the biocatalytic cleavage or hydrolysis of polymers into oligo-, di- or monomers which in the reaction mixture as Nutrient or act as a pH-regulating substance.
  • polysaccharides hydrolyzing enzymes such as amylases or cellulases provide the function of nutrient release (eg, glucose from starch).
  • amidases, peptidases, proteases, transglutaminases, transferases for releasing pH-active substances, such as, for example, the base ammonia (NH 3 ) from urea by urease can be used.
  • phosphatases and phytase can be used for the release of protons from polyphosphates.
  • cells are meant: all prokaryotes and eukaryotes, in particular bacteria, yeasts, fungi, mycelists, animal, plant and human cells in suspended or adherent form as well as their tissue (engl., Tissue) Systems "are reactions for the biosynthesis of natural or synthetic enzymes and proteins meant that do not contain living cells but otherwise contain all the necessary functional components of the transcriptional and translational apparatus of a cell for the synthesis of enzymes and proteins.
  • cell lysates, purified or artificial lysates, starting materials such as peptides and amino acids as well as cofactors (FAD, FMN, NADH, NADPH, etc.) are used.
  • high cell density and “high cell density fermentation” is meant the growth of cells in suspension of> lxlO 8 cells / mL in prokaryotic cells and> lxlO 6 cells / mL in eukaryotic cells. High cell densities are usually only achieved in a pH-controlled fed-batch fermentation or in a pH-controlled fermentation with cell retention or cell recycling via suitable separation techniques.
  • High throughput means the processing of samples with parallel reactors in a minimum of> 20,> 50,> 100,> 500,> 1000,> 10,000> 100,000,> 1,000,000, all per day or week.
  • reactor types or “fermenter types” are understood to mean any vessels or containers which make it possible to attract or multiply cells. These may be: microtiter plates, Eppendorf cones, vials, cuvettes, centrifuge tubes, Falcon tubes, Erlenmeyer flasks, T-bottles, spinners, stirred tanks, bubble columns, wave (plastic bags) bioreactors and similar known reactors or fermenters.
  • a "batch" process is understood to mean the simple approach of all reaction components of a reaction, such as in fermentation with the cell culture medium and the cells, at once without further addition of additional components to the reaction mixture or the decrease of components During the reaction time, of course, smaller sample quantities can be withdrawn for experimental purposes without affecting the reaction and the definition.
  • a “fed-batch” process is understood to mean the feed (feed) of educts to a reaction mixture, the rate of the feed being used to control the reaction, and in the fermentation area the main nutrient of the cells (eg. The slow feeding causes the cells to be restricted by the nutrient added to them.
  • the term “fedbatch” is also used for the in-situ release of nutrients to be metabolized (for example, from glucose to glycerol) Starch hydrolysed glucose) in the reaction mixture.
  • a "pH-controlled fedbatch” process is the extension of the fedbatch process to include pH control or regulation, adding a pH adjuster to the reaction mixture in addition to nutrient feed, adding acid or lye normally controlled via a closed loop with a processor and a pH sensor and with liquid pumps
  • the term “pH controlled fedbatch” process is also used for the parallel in-situ release of pH-active substances (eg ammonium). and of nutrients to be metabolized in the reaction mixture.
  • a "control” is the basic principle to measure the value of the controlled variable (actual value, eg the pH-value) and dependent on its deviation from the nominal value by means of the already existing possibility of influencing it ( “Control”) automatically (with the actuator) to intervene corrective.
  • the feedback of the controlled variable via measuring element and controller to the control variable creates a closed operating circle (Control circuit).
  • the closed loop is the unique distinguishing feature of a closed-loop control system.
  • the pH control is a preset release rate of the pH-active substance and the closed-loop control of the controlled change of the enzymatic activity of the pH-active substance-releasing enzyme from the pH polymer; which in turn is passed through the control variable (pH value) measured in the bioreactor with a sensor.
  • Scale up means the transfer of reaction results across reactor size scales, ie results from pH-controlled fed-batch fermentations from shaken microtiter plates can be reproduced in IL, 10L and larger stirred vessels. Scalability "is particularly facilitated if the same technique (eg pH-controlled fed-batch process) can be used in both scales and the relevant process parameters such as the specific mass transfer coefficient (k L a value), the oxygen transfer rate (OTR) , the specific power input or the mixing time over the scales holds equal.
  • k L a value specific mass transfer coefficient
  • OTR oxygen transfer rate
  • the solution according to the invention for this task entails that all media components which consist of the necessary nutrients for the growth and the biosynthesis of target products of the cells used are dissolved in the cell culture medium, in particular that which is initially non-metabolizable by the cells , longer chain nutrient polymer and the polymer for pH control or regulation. Only by the addition of an enzyme, which hydrolyzes the nutrient polymer to a monomeric or lower-chain and therefore metabolizable nutrient, and another enzyme which hydrolyzes the polymer for pH control (eg for the release of a base) and In order to regulate the pH, the pH-regulated fedbatch fermentation is started and then continued.
  • the nutrient polymer, the polymer for pH control and all or individual enzymes for the pH-controlled fedbatch fermentation can either at the beginning of the fermentation or else during the fermentation either in a liquid concentrate or as a powdered, ground solid are added to the fermentation medium.
  • solids are added to the fermentation medium, they should dissolve within a few (1-5) hours in the fermentation medium, but preferably within 1 hour, more preferably within 20-30 minutes or a few minutes.
  • the invention requires the precise matching of the release rates of the nutrient from the nutrient polymer and the rate of release of the pH-active substance from the polymer for pH control.
  • the fine tuning of these release rates is very expensive and can only be achieved with corresponding parallel fermentation systems, e.g. the micro-fermentation system BioLector.
  • the adjustment of release rates for the nutrient and pH adjuster should be based on the stoichiometry of the ongoing reaction, e.g. Cell growth, orient.
  • a N / C elemental composition of 0.02 to 0.35 may be used. This would mean that the release of nutrient such as e.g. Glucose as the main carbon source and the pH modifier which is e.g.
  • Ammonia may be the main nitrogen (N) source, for microbial cells in the ratio of 0.1 to 0.35 N / C and for eukaryotic cells in the ratio of 0.02 to 0.35 N / C should be.
  • N nitrogen
  • eukaryotic cells instead of ammonia, glutamine or other amino acids or peptides or mixtures of these can also act as N-source.
  • the absolute release rates are based on the growth rate of the cells and the number of cells used in the fermentation. For microbial cells, the required release rates for the nutrient main carbon source are e.g.
  • the required release rates for the N-source for microbial cells range from 0.333 mmol / (L * h) to 2333 mmol / (L * h) N-source to 1 N atom) and for eukaryotic cells in the range of 0.66 ⁇ 1 / ( ⁇ - * 1 ⁇ ) to 117 mmol / (L * h) N source (based on 1 N atom).
  • phosphate sources a range of 0.033 mmol / (L * h) to 1200 mmol / (L * h) phosphate source (based on 1 phosphate atom) is required for all cell types. Similar release rates as for the phosphate source also apply to potassium atoms. Sulfur atoms require a factor of 10-20 smaller release rates than for the phosphate source.
  • the data in L here refer to the reaction volume (e.g., fermentor working volume) and h to the reaction time (e.g., fermentation time).
  • a variant of the invention which is essential to the invention even without the features described above and can be applied to any desired processes, involves the temporary suspension or reduction of the enzyme activity for the polymers to be hydrolyzed (for nutrient, for base and / or acid).
  • these magnetic enzyme carriers can be concentrated within the cell suspension, e.g. be pulled into a corner of the fermenter, so that the mass transfer area of the enzyme-carrying polymers for cell suspension is greatly reduced and thus the hydrolysis rate is also reduced.
  • a further technical implementation of this variant may be the immobilization of the enzymes on a mechanically mobile element.
  • This mechanical element eg a wegaji rod
  • This mechanical element can then dip during fermentation temporarily in the cell suspension and thus specifically develop its hydrolytic activity for a certain time. If the hydrolytic effect to be stopped, the mechanical element is pulled back to the solution.
  • a further implementation of this variant can be realized by using dissolved or immobilized enzymes that change their conformation by an excited from outside the fermenter electromagnetic field or electromagnetic radiation, preferably UV-VIS light and thereby their enzymatic activity is reversibly affected. Due to the short-term irradiation of electromagnetic radiation on the enzyme, the activity is either increased, reduced or deactivated.
  • the enzyme Due to the reversibility of this reaction, the enzyme automatically recovers its original conformity and activity after a certain period of time, or the original molecule conformity and activity is recreated by renewed brief irradiation of electromagnetic radiation (possibly at a different wavelength) into the fermenter , Thus, the enzyme and thus the hydrolytic rate is switchable and einregelbar at will in the process.
  • electromagnetic radiation possibly at a different wavelength
  • the hydrolytic enzymes can also be immobilized on the reactor wall of the fermentation vessels.
  • the cell culture suspension of the fermentation is only in contact with the enzymes and thus with the hydrolytic enzyme activity, which is wetted by the cell culture suspension on the reactor wall.
  • the wetting of the reactor walls with cell culture suspension can be influenced by adjusting the speed of a stirrer, the shaking speed of a shaker, a time-varying working volume of the cell culture suspension or the inclination of the fermentation vessel. With an increase, for example, the shaking speed of a shaker, the slosh height of the liquid in a shaken fermentation tank, such as a shake flask, can be increased.
  • This embodiment can be used to adjust the nutrient limitation and pH control of the increasing cell concentration as the fermentation progresses. It is customary in professional circles to carry out the fedbatch fermentation with exponential or linearly increasing nutrient feed. This would also be possible with this embodiment of the invention.
  • a linearly increasing nutrient intake can also be achieved by the diffusive delivery of the hydrolyzing enzymes. This can be done by using "slow release" capsules.
  • the nutrient released from the nutrient polymer is simultaneously an inducer of gene and protein expression of the cells.
  • the inducer nutrient eg lactose from lactose polymers
  • gene and protein expression can be controlled via the hydrolysis rate. This allows, among other things, studies with a constant ratio of inductor to biomass with the progress of the fermentation. Again, adjustments in the release of inducer, nutrient and pH adjusters are needed.
  • the activity of the nutrient polymer hydrolyzing enzyme can be kept constant in its pH optimum even without high buffer concentrations.
  • a further variant of the combined enzymatic system of controlled nutrient and pH release agent release described in the invention is the targeted change of the pH at a certain point in time of the fermentation.
  • a base and an acid are released into the medium at a fixed ratio. If the nutrient release is terminated due to the depletion of the nutrient polymer, the pH may continue to run after the growth phase and greatly increase or decrease the pH, depending on which pH adjuster released and how much pH polymer still present in the solution.
  • the exact coordination of the amounts of template to polymers can be chosen so that specifically at the end of a fermentation, a certain pH is assumed.
  • the solubility of the target / product protein is lowest at its isoelectric point (pI). If the target protein is formed in a sufficiently high concentration and its pl is in the basic or acidic form, precipitation of the target protein can be effected in a targeted manner by adjusting the pH after completion of the growth phase.
  • the variation of hydrolytic enzyme activity during fermentation is also possible with a further embodiment of the invention. Hereby, by externally adding an enzyme concentrate or an enzyme inhibitor into the fermentation solution, the enzyme activity can be further increased or decreased. Care should be taken that the enzyme inhibitor does not inhibit cells, their growth and the biosynthesis of products. The inhibitor should act stoichiometrically on the enzymes and not cause general inhibition of the enzymes.
  • the inhibitor may also be released by enzymatic hydrolysis and reversibly inhibit the nutrient and pH adjuster-releasing enzymes, which inhibitor may not be toxic or inhibiting the cultured cells.
  • the activity of the nutrient and / or pH adjuster releasing enzymes is continuously reduced.
  • the hydrolytic enzymes can also be expressed or produced by the cells directly during the fermentation. Either the cell itself expresses all enzymes necessary for the pH-regulated fedbatch fermentation or else the enzyme not expressed by the cells is simply added to the fermentation medium as in the normal case.
  • the expression rate of the enzyme from the cell must be regulated so that the hydrolytic activity of the enzyme always releases the growth nutrient at a rate that is limiting for the cells.
  • the expression rate of the enzyme for the pH control must be adapted to the hydrolytic activity of the nutrient-releasing enzyme, so that the pH does not run away or the pH setpoint never more than + 1, 0 pH unit, preferably never again as + 0.5 pH unit, more preferably never more than + 0.1 pH unit or ideally never more than ⁇ 0.05 pH unit.
  • the nutrient and pH release rates required for pH-regulated fed-batch fermentation can be achieved either by selection of suitable cells in a screening, by co-fermentation of clones with different expression rates or enzyme activities, or by targeted genetic cloning of recombinant clones with different promoters to control gene and protein expression.
  • inducible, derepressible and / or constitutive promoters can be used, which results in an additional regulation level of the enzyme expression rates and thus of the pH-regulated fed-batch fermentation regime via corresponding ing inducers that enable premature nutrients or other process parameters (such as temperature).
  • Another embodiment of the invention is the use of enzymes with different pH and temperature optima. If different pH values are to be kept constant in a fermentation, then the activities of the enzymes (for the release of the nutrient and the pH adjuster) must be known at the corresponding pH values and be coordinated accordingly.
  • the pH-adjusting agent-releasing enzyme can also be used to establish a self-regulating system.
  • an enzyme having a pH optimum below the desired pH value for example an acid urease or an acid phytase
  • the desired pH value for example an acid urease or an acid phytase
  • FIG. 1 shows an exemplary embodiment of a bioreactor 1 with a rotating, thoroughly mixed reaction solution 4, in which the nutrient polymer 5 and the polymer for the pH-adjusting agent 6 are dissolved.
  • the hydrolytic enzyme for the nutrient polymer 7 and the hydrolytic enzyme for the pH polymer 3 are dissolved. It can be seen that the hydrolytic activity is already present and already nutrient 2 and pH-active substances 8 have been released from the dissolved polymers.
  • the cells or other reactants in the reaction solution 4 were not additionally shown for the sake of clarity. However, it is necessary that for the application of the invention, cells or other reactants are also dissolved or suspended in the reaction solution 4. This also applies to all other figures.
  • FIG. 2a shows a variant of the invention in which only a hydrolytic activity is present directly in the reaction solution 4.
  • the hydrolysis of the nutrient polymer to pure nutrient is supplemented in this case by the diffusive inflow of pH-active substances 11 such as ammonia through a channel connecting the bioreactor and a reservoir 9, which serves as a diffusion barrier 12.
  • a highly concentrated solution of the pH-active substance 9 is introduced in the reservoir 9, which may also be a gap between individual wells of a microtiter plate.
  • the concentration gradient between the reservoir with the highly concentrated solution of the pH-active substance 9 and the reaction solution in the bioreactor 4 results in a diffusive flow of the pH-active substance into the reaction solution 4 for pH control.
  • the diffusive flow of the pH-active substance must first be precisely tuned to the hydrolytic release of the nutrient and the nutrient-limited reaction in the bioreactor, eg. Limited cell growth. Only after accurate characterization and coordination of both rates (diffusive flow and nutrient release) can a satisfactory result in the sense of a pH-controlled fed-batch fermentation be achieved. Of course, the hydrolytic activity and the diffusive flow can also be exchanged so that a pH-active substance is released hydrolytically in the bioreactor and the nutrient enters the reaction solution in the bioreactor 4 via the diffusion barrier.
  • FIG. 2 b outlines a variant similar to that described in FIG. 2 a, except that here the nutrient 14 is released diffusively from a polymer carrier 13 which is suspended in the reaction solution 4.
  • the pH-active substance is released enzymatically from the dissolved pH polymer 6.
  • the release rates of the nutrient and the pH-active substance must be exactly matched to one another in order to realize a pH-regulated fedbatch fermentation.
  • the components are also interchangeable here.
  • Figure 2c shows a very similar variant of Figure 2b, in which only the nutrient 14-releasing polymer carrier is immobilized on the reactor inner surface 15 and from there Nutrient diffusively in the reaction solution 4 gives off. In turn, the pH-active substance is released enzymatically from the dissolved pH polymer 6. Again, the components are interchangeable.
  • FIGs 3a and 3b show the variants of the invention in which the hydrolytic activity of the enzymes in the reaction solution 4 from outside the bioreactor is beinflußbar.
  • a magnet 16 e.g. a permanent magnet or an electromagnet
  • the enzymes 17, 18 immobilized on magnetized carriers can be moved into and out of the reaction solution 4. This gives the user the opportunity to additionally influence the reaction from outside.
  • the real enzyme activity of each individual enzyme and thereby the corresponding release rates of the nutrient or the pH-active substance correspond to the immersion time of the enzymes in the reaction solution.
  • the immersion times of the two enzymes used are individually adjustable and thus the reaction can be adjusted to a specific pH value or a specific nutrient release rate can be achieved.
  • the magnetic enzyme carriers 17, 18 can be immersed only partially in the reaction solution 4. With increasing progress of the reaction, a larger area of the carrier 17, 18 can be driven into the reaction solution and thus the enzyme activity of the solution can be increased.
  • control variable (pH actual value) required for the pH control can be measured by a conventional pH electrode or a pH optode installed in the bioreactor. This pH measurement is continuously processed in the closed loop, which then controls the movement of the magnet in and out of the reaction solution 4 and thus the pH.
  • FIGS. 4a and 4b show a further variant of the invention in which the hydrolytic activity of the enzymes in the reaction solution 4 can be influenced by movable internals, for example a rod 22, 24.
  • the enzymes 23, 25 immobilized on the rod can be moved into and out of the reaction solution 4 by moving the rods.
  • the real enzyme activity of each enzyme and thereby the corresponding release rates of the nutrient or the pH-active substance correspond to the immersion time of the enzymes in the reaction solution.
  • the immersion times of the two applied enzymes are individually adjustable and thus the reaction can be adjusted to a specific pH value or a specific nutrient Release rate can be achieved. It is also possible for the movable rod 22, 24 to be immersed only partially in the reaction solution 4.
  • FIG. 5a to c show a variant of the invention, in which the hydrolytic activity of the enzymes in the reaction solution 4 can be influenced by the centrifugal force. In this case, the contact of the reaction solution with the enzymes is only achieved at a certain speed of a shaker (or stirrer) and thereby occurring sloshing height of the reaction solution 4 in the bioreactor.
  • FIG. 5a it is shown that at the applied shaking speed (col), the reaction solution does not yet wet the enzymes 30, 33 immobilized on the upper reactor wall, and thus the hydrolytic activity of the reaction solution is still unavailable.
  • the reaction only takes place in batch mode. If you then want to start the hydrolysis of the nutrient and pH polymer, the user only has to increase the speed of the shaker, so that the slosh height of the reaction solution 35 reaches the immobilized enzymes and wets them (Figure 5b). To further increase the real enzyme activity in the reaction solution can be further increase the shaking speed and the slosh height, so that also increases the wetted surface of immobilized enzyme and more active enzyme of the solution is available. With this variant, it is possible to realize typical progressive or exponential nutrient and / or pH-active substance release profiles which are customary in the field of fermentation.
  • FIG. 6 shows another variant of the invention, in which the enzyme activity can be influenced from outside the bioreactor.
  • electromagnetic radiation 38, 40 is coupled from the outside into the bioreactor.
  • the electromagnetic radiation for example light at a certain wavelength
  • a conformational change of the enzyme is caused, which changes the specific activity of the enzyme.
  • the change in activity may be reversible and regenerate by itself after a certain time or by re-radiation induction (eg, at a different wavelength than the first one).
  • the nutrient-polymer-hydrolyzing enzyme 37 may have another Wavelength can be manipulated as the pH polymer hydrolyzing enzyme 39, so that both enzyme activities are individually adjustable.
  • Figure 7 shows a selection of reactors in which the method according to the invention can be used. Due to the ease of use of the invention, the method can be applied across scales in different reactor types and volumes, thus greatly facilitating scale-up.
  • Figure 8 shows the biomass development (via scattered light intensities, engl. Scattered light) at different urease to amylogucosidase ratios (U / A activity ratio according to standard activities of the manufacturer).
  • the diagram additionally shows exemplary biomass concentrations achieved in calibrated OD 6 oo units.
  • Figure 9 shows the pH curves to the biomass developments in Figure 8.
  • FIG. 10 shows the biomass development of increasing amounts of enzyme at constant urease to amyloglucosidase ratio (U / A activity ratio according to standard activities of the manufacturer), in the diagram are also exemplified achieved biomass concentrations in calibrated OD 6 o 0 units.
  • Figure 11 shows pH curves to the biomass developments in Figure 10.
  • All media components including at least one polymer for the release of nutrient or pH adjusters are dissolved or having a solids content of ⁇ 20% (w / w), ⁇ 10% (w / w), ⁇ 5% (w / w) or preferably ⁇ 1% (w / w) in the cell culture medium of at least one enzyme having hydrolytic activity is used in the cell culture medium at least one nutrient or pH adjusting agent is diffusively from a solid or gel phase polymer carrier without hydrolysis or but released by a further enzymatic hydrolysis from a dissolved polymer, the hydrolytic enzyme activity can be temporarily reversible reduced, strengthened or deactivated a pH-controlled or regulated Fedbatch process is made possible without the use of containers for nutrient and pH adjuster (One-pot fermentation) in the fermentation tank no sensors (eg pH, p0 2 or nutrient) must be present for the assumption of regulatory tasks - the N nutrient limitation and pH control are pre
  • High throughput-capable the user or the manufacturer can simply apply the cell culture medium by weighing, mixing, dissolving and sterilization (by autoclaving and / or microfiltration ⁇ 0.2 ⁇ ) of all media components as well as a batch medium - the handling is accurate the same.
  • low technical equipment of fermentation tanks / reactors necessary - a simple microtiter plate or stirred tank without additional sensors is sufficient the level of training the user can be very low, since no deeper knowledge of fermentation, bioreactors or process control is necessary - by presenting all media components At the beginning of a fermentation, no nutrients and pH-adjusting agents need to be added to the fermentation tank during fermentation be supplied.
  • the characteristics of the one-pot process can also be very relevant in the growing of safety-relevant cells or material of higher biological safety levels (S2, S3 and S4) in order to prevent potential leakage of the cells or material via feeds or to avoid multiple access the application of the one-pot process can lead to significant cost savings on the one hand in the bioprocess development through the use of fed-batch fermentations in high throughput and on the other hand directly in the production process, since no large technical equipment of the fermentation tank is necessary and also the cell culture medium can be based on inexpensive nutrient polymers (eg polysaccharides or celluloses) and pH polymers (eg urea).
  • inexpensive nutrient polymers eg polysaccharides or celluloses
  • pH polymers eg urea
  • Example 1 E. coli fedbatch fermentation with various urease to amyloglucosidase ratios.
  • Figures 8 and 9 show exemplary cultivations of E. coli BL21 (DE3) in the described cell culture medium with simultaneous enzymatic hydrolysis of glucose from dextrins by the enzyme amyloglucosidase and enzymatic release of a pH adjusting agent on the example of urea hydrolysis to ammonia by the enzyme urease.
  • additional comparison shows two cultivations in which no enzymatic release of a pH adjusting agent took place.
  • the cell culture medium described in the invention was prepared on the basis of an E. coli medium described in the literature (Wilms B, Hauck A, Reuss M, Syldatk C, Mattes R, Siemann M, Altenbuchner J: High-cell-density fermentation for production of LN-carbamoylase using an expression system based on the Escherichia coli rhaBAD promoter, Biotechnology and Bioengineering 2001, 73 (2): 95-103) and buffered with 50 mM Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4, the first Comparative medium without enzymatic release of a pH adjuster, however, was buffered with 200 mM MOPS, the second comparison medium again with 50 mM Na 2 HP0 4 / NaH 2 P0 4 buffered.
  • amyloglucosidase concentration was fixed and the urease concentration varied to achieve different ratios of urease to amyloglucosidase (U / A). Comparative cultivation without enzymatic pH release agent was also treated with the same amyloglucosidase concentration.
  • the seed cell density was OD 6 o 0 1.0 and cultivations were performed at 37 ° C.
  • the cell culture medium described in the invention here in an exemplary embodiment with dextrin as glucose polymer, amyloglucosidase as glucose-releasing enzyme, urea as pH-adjusting agent polymer and urease as pH-adjusting agent-releasing enzyme allows, inter alia, the elimination of high buffer concentrations and switching from the more expensive MOPS buffer to the cheaper Na 2 HPO 4 / NaH 2 PO 4 buffer.
  • Example 2 E. coli with increasing enzyme concentrations at a constant ratio of urease to amyloglucosidase
  • the pH curves during the fermentations show a very stable pH at around pH 7 in all three cases of about 3 h for about another 30 h (FIG. 12).
  • the stabilization of the pH during the fermentation thus depends on the ratio of the two enzymes to one another and not on the absolute concentration of the respective enzymes.
  • reaction solution e.g. Fermentation broth with cell suspension
  • diffusion barrier e.g. a hydrogel
  • Immobilized enzyme for release of nutrient from nutrient polymers inactive because not in contact with reaction solution
  • Optically transparent reactor bottom Reversible, deactivated enzyme for release of nutrient from nutrient polymers
  • Electromagnetic beam source for manipulating the enzyme activity of the enzyme to release nutrient from nutrient polymers (e.g., an optical fiber coupling light at a particular wavelength into the reactor)
  • Electromagnetic beam source for manipulating enzyme activity of the enzyme to release pH-active substances from polymers (e.g., an optical fiber coupling light at a particular wavelength into the reactor)

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Prozessführung einer Edukt-limitierten, biochemischen Reaktion mit gleichzeitiger pH-Steuerung oder Regelung, wobei mindestens die Freisetzungsrate des Edukts oder die Freisetzungsrate an pH-aktiver Substanz durch eine Enzym-Aktivität gesteuert oder geregelt wird.

Description

Verfahren zur Prozessführung einer Edukt-limitierten, biochemischen Reaktion
[01] Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Prozessführung einer Edukt-limitierten, biochemischen Reaktion, insbesondere zur vereinfachten Anzucht von Zellen in der Fermentation.
[02] Aufgrund der autokatalytischen Reaktion von Zellen sich selbst immer wieder zu teilen, so lange ausreichend Nährstoffe im Zellkultur-Medium vorhanden sind, wachsen Zellen expo- nentiell. Dies wird beispielsweise in einem Batch-Prozess solange fortgeführt bis die vorgelegten Nährstoffe erschöpft sind und die Zellen in die stationäre Phase eintreten. Parallel zum Wachstum der Zellen nimmt auch die Anzahl von pH-aktiven Stoffwechselneben- und Hauptprodukten, die von den Zellen während des Wachstums ausgeschieden werden, wie Protonen oder Basen, exponentiell zu. Wird der pH- Wert nicht durch starke und hochkonzentrierte Puffer im Zellkulturmedium stabilisiert, so kann der pH-Wert sehr schnell in Regionen abwandern, die für die Zellen und/oder Produkte nicht förderlich sind. Dies bedeutet auch, dass für die Realisierung von pH-geregelten Fermentationen bei unlimitiertem, exponentiellem Wachstum der Zellen das pH- Stellmittel ebenfalls exponentiell verfügbar bzw. zudosiert werden muss. [03] Keine der bekannten Lösungen lassen sich in gleicher Weise vom Mikro- und Kleinmaßstab (Volumina < 10 mL) bis in den Produktionsmaßstab (Volumina > 10 L, > 100 L, > 1000 L > 10.000 L > 100.000 L) mit dem gleichen Fermentationsverfahren und den gleichen Technologien betreiben. Mit dem Stand der Technik müssen für verschiedene Fermentationsmaßstäbe (nL bis m3) jeweils andere Technologien für die Durchführung von pH-geregelten Fedbatch- Fermentationen herangezogen werden. Dadurch erhöht sich der Aufwand für das Scale up, da jeweils die verwendeten Technologien miteinander verglichen und abgestimmt werden müssen.
[04] Die Erfindung hat die Aufgabe Zellen in einer Fermentation unter Nährstoff -Limitierung und gleichzeitiger pH-Steuerung oder Regelung, in einer sogenannten Fedbatch-Fermentation, zu vermehren und damit die Biosynthese von Produkten in der Produktivität zu steigern, wobei auch die Zellen das eigentliche Produkt sein können. In einer Variante der Erfindung kann die Nährstoff-Verfügbarkeit zur Nährstoff -Limitierung mit verschiedenen Raten realisiert werden oder
BESTÄTIGUNGSKOPIE ganz ausgesetzt werden. Die Nährstoff-Limitierungsraten sind auch in der zeitlichen Abfolge variierbar und die Aussetzung ist reversibel. Eine temporäre oder vollständige Aussetzung, pH- Steuerung oder Regelung ist ebenfalls umsetzbar.
[05] Zudem ist die pH-geregelte Fedbatch-Technologie in verschiedenen Fermentationsmaß- Stäben (nL bis m3) einsetzbar, ohne dass sich wesentliche Verfahrenscharakteristika, außer der Größenmaßstab und damit verbundene verfahrenstechnische Gegebenheiten, ändern. Durch die Erfindung wird eine Ein-Topf-(One-Pot-)Fermentation oder zellfreie Biosynthese-Reaktion in nur einem Bioreaktor ermöglicht. Es sind keine zusätzlichen, separaten Vorhaltebehälter für pH- Stellmittel und Nährstoffe und die damit verbundenen Pumpen nötig. Damit können wesentliche Investitionen in die Fermentationsanlage und der Betriebsaufwand reduziert werden.
[06] Eine weitere Aufgabe "der Erfindung soll es sein, dass sie kostengünstig und mit geringem personellem und technischem Aufwand im Hochdurchsatz betrieben werden kann.
[07] Die Erfindung soll die Fermentationsdurchführung wesentlich vereinfachen. Der Anwender soll wie er es gewohnt ist bei dem sehr verbreiteten Batch- Verfahren (ohne Nährstoff- Limitierung und Zufütterung, ohne pH-Regelung) alle Medienkomponenten im Medium in gelöster Form vorlegen, nur dass in dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht ein Batch- Verfahren sondern ein pH-gesteuertes oder geregeltes Fedbatch- Verfahren realisiert wird, was viel näher an das industrielle Verfahren in der Produktion heran kommt.
[08] Der verwendete Begriff „Zellkultur-Medium" bezieht sich auf alle bekannten und abge- wandelten flüssigen Nährstoff-Zusammensetzungen, die im Bereich der Zellkultivierung und Fermentation angewendet werden oder sich darauf beziehen. Unter einer Nährstoff- Zusammensetzung versteht man den Bedarf einer biologischen Zelle an anorganischen Chemikalien, Mineralsalzen, Vitaminen, Stickstoff-Quellen, Kohlenstoff- und Energie-Quellen, um den Energiehaushalt, das Wachstum und die Produktbildung einer Zelle zu unterhalten und zu för- dem. Zudem können diese Nährstoff-Zusammensetzungen komplexe, teilweise nicht definierte Bestandteile wie Hefeextrakte, Hydrolysate, Peptone und industrielle Abfallstoffe, sowie weitere definierte Bestandteile wie Aminosäuren, Wachstumsfaktoren, Hormone, Induktoren, Puffersubstanzen, Antibiotika, Selektionsmarker, Cytokine, Nukleotide und Serum-Proteine beinhalten. Große Anbieter von Zellkultur-Medien sind Becton, Dickinson and Company (BD), Invitrogen und Lonza, deren Produkt-Kataloge eine Vielzahl von Medien beinhalten.
[09] Es wird ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die Anwendung dieser Erfindung nicht beschränkt ist auf die genannten Beispiele sondern auf jegliches flüssige Zellkultur-Medium, welches in dem Bereich der Erfindung zur Anwendung kommt. Zudem ist im übertragenen Sinne mit Zellkultur-Medium auch der gelöste Reaktionsansatz mit allen Edukten der zellfreien Biosynthese-Systeme gemeint.
[10] Als„Nährstoff wird eine Komponente des Zellkultur-Mediums bezeichnet, die für das Wachstum, den Energiehaushalt, ihre Funktion und/oder Produktbildung einer Zelle essentiell ist und die einzelnen Funktionen der Zelle fördert.
[1 1] Als„Polymere" werden chemische Verbindungen aus Ketten- oder verzweigten Molekülen (Makromolekülen) bezeichnet, die wiederum aus gleichen oder gleichartigen Einheiten (den sogenannten Monomeren) bestehen. Die Monomere können organischer und anorganischer Natur sein sowie in dem Polymer gemischt aus verschiedenen Monomeren vorliegen. Die Polymere dienen in dieser Erfindung als Speicher von Nährstoffen oder pH-aktiven Substanzen. Die Polymere können von den Zellen nicht direkt verstoff wechselt werden. Als Kohlenstoff-Nährstoff Lieferant können folgende Polymere dienen: z.B. Polysaccharide wie Stärke, behandelte Stärke, Stärkeextrakte, Stärkederivate, Glykogen, Carrageen, Amylosen, Amylopektine, Pullulane, Dextrane, Dextrine, Maltodextrine, Maltotriose und Maltose oder aber Cellulose, behandelte Cellulose, Celluloseextrakte, Cellulosederivate, Hemicellulose, Glukane, Cellobiose. Als Lieferant für pH-aktive Substanzen können folgende Polymere dienen: z.B. Harnstoff, Gluten, Polyacrylamid, Polyamide, (Poly-) Aminosäuren, (Poly-) Glutaminsäure, (Poly-) Glutamate,, (Poly-) Amine, Proteine, Gelatine und deren Derivate oder aber Poly- und Oligophosphate sowie zyklische Phosphate, Phytinsäure und Phytat sowie Polylactide und Mischungen dieser. Unter Poly- meren sind auch Oligo- und Dimere einzuordnen.
[12] „Enzyme" sind im Bereich der Biotechnologie weitverbreitet und katalysieren biochemische Reaktionen. In dieser Erfindung dienen die Enzyme insbesondere zur biokatalytischen Spaltung oder Hydrolyse von Polymeren in Oligo-, Di- oder Monomere, die im Reaktionsansatz als Nährstoff oder als pH-regulierende Substanz fungieren. Insbesondere erbringen Polysaccharide hydrolysierende Enzyme wie Amylasen oder Cellulasen die Funktion der Nährstoff-Freisetzung (z.B. Glukose aus Stärke). Des Weiteren können Amidasen, Peptidasen, Proteasen, Transgluta- minasen, Transferasen zur Freisetzung von pH-aktiven Substanzen, wie z.B. der Base Ammoniak (NH3) aus Harnstoff durch Urease, angewendet werden. Zur Freisetzung von Protonen aus Poly- phosphaten können beispielsweise Phosphatasen und Phytase eingesetzt werden.
[13] Mit„Zellen" sind gemeint: alle Prokaryoten und Eukaryoten, insbesondere Bakterien, Hefen, Pilze, Myzelbildner, tierische, pflanzliche und menschliche Zellen in suspendierter oder adhärenter Form sowie deren Gewebe (engl, tissue). [14] Mit„zellfreien Systemen" sind Reaktionsansätze zur Biosynthese von natürlichen oder synthetischen Enzymen und Proteinen gemeint, die keine lebenden Zellen beinhalten aber ansonsten alle nötigen Funktionsbausteine des Transkriptions- und Translationsapparates einer Zelle zur Synthese von Enzymen und Proteinen beinhalten. In der Regel werden hierbei Zell-Lysate, aufgereinigte oder artifizielle Lysate, Edukte wie Peptide und Aminosäuren sowie Cofaktoren (FAD, FMN, NADH, NADPH u.a.) eingesetzt.
[15] Unter einer„hohe Zelldichte" und einer„Hoch-Zelldichte-Fermentation" versteht man die Anzucht von Zellen in Suspension von > lxlO8 Zellen/mL bei prokaryotischen Zellen und > lxlO6 Zellen/mL bei eukaryoti sehen Zellen. Hohe Zelldichten werden in der Regel nur erreicht in einer pH-geregelten Fedbatch-Fermentation oder in einer pH-geregelten Fermentation mit Zell- rückhaltung oder Zellrückführung über geeignete Separationstechniken.
[16] Unter„Hochdurchsatz" versteht man die Prozessierung von Proben mit parallelen Reaktoren in einer Mindest-Anzahl von > 20, > 50, > 100, > 500, > 1000, > 10.000 > 100.000, > 1.000.000, alle pro Tag oder Woche.
[17] Unter den Begriffen„Reaktortypen" oder„Fermentertypen" versteht man beliebe Gefäße oder Behälter, die es ermöglichen Zellen anzuziehen bzw. zu vermehren. Dies können sein: Mikrotiterplatten, Eppendorf-Hütchen, Vials, Küvetten, Zentrifugenröhrchen, Falcon-Röhrchen, Erlenmeyerkolben, T-Flaschen, Spinner, Rührkessel, Blasensäulen, Wave (Plastiktüten)- Bioreaktoren und ähnliche bekannte Reaktoren oder Fermenter.
[18] Unter einem„Batch"-Prozess versteht man den einfachen Ansatz aller Reaktionskomponenten einer Reaktion, wie z.B. in der Fermentation mit dem Zellkultur-Medium und den Zellen, auf einmal ohne weitere Zugabe von zusätzlichen Komponenten zu dem Reaktionsansatz oder die Abnahme von Komponenten aus dem Ansatz während der gesamten Reaktionszeit. Während der Reaktionszeit können natürlich kleinere Probenmengen für Versuchszwecke aus dem Ansatz gezogen werden, ohne die Reaktion und die Definition zu beeinflussen.
[19] Unter einem„Fedbatch"-Prozess versteht man den Zustrom (Zufütterung) von Edukten zu einem Reaktionsansatz. Durch die Rate des Zustroms wird die Reaktion gesteuert. Im Bereich der Fermentation wird in der Regel der Hauptnährstoff der Zellen (z. B. Glucose oder Glyzerin) langsam zu dem Fermentationsansatz über Flüssigkeitspumpen zugefüttert. Durch die langsame Zufütterung werden die Zellen durch den zugefütterten Nährstoff limitierend geführt. Zur Beschreibung dieser Erfindung wird der Begriff„fedbatch" auch für die in-situ Freisetzung von zu verstoffwechselnden Nährstoffen (z.B. aus Stärke hydrolysierte Glucose) im Reaktionsansatz verwendet.
[20] Ein„pH-geregelter Fedbatch"-Prozess ist die Erweiterung des Fedbatch-Prozesses um eine pH-Steuerung oder Regelung. Neben der Nährstoff-Zufütterung wird also ein pH-Stellmittel zu dem Reaktionsansatz hinzugeführt. Die Zugabe von Säure oder Lauge wird normalerweise über einen geschlossenen Regelkreis mit einem Prozessor und einem pH-Sensor geregelt und mit Flüssigkeitspumpen ausgeführt. In dieser Erfindung wird der Begriff „pH-geregelter Fedbatch"- Prozess ebenfalls für die parallele in-situ Freisetzung von pH-aktiven Substanzen (z.B. Ammonium) und von zu verstoffwechselnden Nährstoffen im Reaktionsansatz verwendet.
[21] Unter einer„Regelung" versteht man das Grundprinzip, den Wert der Regelgröße zu messen (Ist-Wert, z.B. den pH-Wert) und abhängig von seiner Abweichung zum Soll-Wert mittels der in der Regel bereits vorhandenen Möglichkeit seiner Beeinflussung („Steuerung") automatisch (mit dem Stellglied) korrigierend einzugreifen. Durch die Rückkopplung der Regelgröße über Messglied und Regler zur Steuergröße entsteht ein geschlossener Wirkungskreis (Regelkreis). Der geschlossene Kreis ist das eindeutige Unterscheidungsmerkmal einer Regelung von einer Steuerung. Übertragen auf diese Erfindung handelt es sich bei der pH-Steuerung um eine voreingestellte Freisetzungsrate von pH-aktiver Substanz und bei der Regelung um die gezielte Veränderung der enzymatischen Aktivität des pH-aktive Substanz-freisetzenden Enzyms aus dem pH-Polymer durch den geschlossenen Regelkreis, der wiederum durch die im Bioreaktor mit einem Sensor gemessenen Regelgröße (pH-Wert) geleitet wird.
[22] Unter„Skalierbarkeit" (scale up) versteht man die Übertragung von Reaktionsergebnissen über Größen-Maßstäbe der Reaktoren hinweg, d.h. z.B. Ergebnisse aus pH-geregelten Fedbatch- Fermentationen aus geschüttelten Mikrotiterplatten lassen sich reproduzieren in IL, 10L und größeren Rührkesseln. Die„Skalierbarkeit" ist insbesondere dann erleichtert, wenn die gleiche Technik (z.B. pH-geregelter Fedbatch-Prozess) in beiden Maßstäben angewendet werden kann und man den relevanten verfahrenstechnischen Parameter wie z.B. den spezifischen Stoffübergangskoeffizienten (kLa-Wert), die Sauerstofftransferrate (OTR), den spezifischen Leistungseintrag oder die Mischzeit über die Maßstäbe hinweg gleich hält. [23] Die erfindungsgemäße Lösung für diese Aufgabe beinhaltet, dass alle Medienkomponenten, welche aus den nötigen Nährstoffen für das Wachstum und die Biosynthese von Targetprodukten der eingesetzten Zellen bestehen, in dem Zellkultur-Medium gelöst sind, insbesondere auch das von den Zellen zunächst nicht verstoffwechselbare, längerkettige Nährstoff-Polymer und das Polymer für die pH-Steuerung oder Regelung. Erst durch die Zugabe eines Enzyms, wel- ches das Nährstoff-Polymer zu einem monomeren oder niederkettigen und damit verstoffwech- selbaren Nährstoff hydrolysiert, und eines weiteren Enzyms, welches das Polymer für die pH- Regelung (z.B. für die Freisetzung einer Base) hydrolysiert und damit den pH reguliert, wird die pH-regulierte Fedbatch-Fermentation gestartet und danach fortgeführt. Wird eine pH-Steuerung oder Regelung in beide pH-Richtungen (basisch und sauer) im Prozess benötigt, dann ist es ebenso möglich ein drittes gelöstes Polymer (z.B. für die Freisetzung einer Säure) in dem Zellkultur-Medium vorzulegen und ein drittes dieses Polymer hydrolysierendes Enzym der Lösung zu zusetzen.
[24] Nur in der Kombination einer konstanten und aufeinander abgestimmten enzymatischen Aktivität der Hydrolyse zur Freisetzung von Nährstoff und der Hydrolyse zur Freisetzung von pH-aktiver Substanz ist die erfindungsgemäße pH-gesteuerte Fedbatch-Fermentation erst realisierbar, da nur so das Säure-Base-Gleichwicht konstant gehalten werden kann. Die durch das lineare Nährstoff-limitierte Wachstum der Zellen ausgeschiedenen pH-aktiven Stoffwechselnebenprodukte wie Protonen oder Basen werden direkt durch die freigesetzten Basen oder respekti- ve Säuren der Hydrolyse des Polymers für pH-aktive Substanzen neutralisiert und der pH- Wert wird somit konstant gehalten. Das Wachstum der Zellen und die pH-Regelung kann während der Fermentation auch gesteigert werden, indem eine zusätzliche Enzymmenge beider zuvor genannter Enzyme im abgestimmten Verhältnis der Zellkultur-Suspension zugegeben wird. Es lassen sich so unterschiedliche Bereiche linearen Wachstums mit gleichzeitiger pH-Regelung realisie- ren.
[25] Das Nährstoff-Polymer, das Polymer für die pH-Regelung und alle oder einzelne Enzyme für die pH-geregelte Fedbatch-Fermentation können entweder zu Beginn der Fermentation oder aber auch beliebig während der Fermentation entweder in einem flüssigen Konzentrat oder als pulverförmiger, gemahlener Feststoff dem Fermentationsmedium zugegeben werden.
[26] Werden dem Fermentationsmedium Feststoffe zugegeben, so sollen sich diese innerhalb von wenigen (1-5) Stunden im Fermentationsmedium lösen, vorzugsweise jedoch innerhalb von 1 Stunde, besonders vorzugsweise innerhalb von 20 - 30 Minuten oder wenigen Minuten. Ein nicht-gelöster Restfeststoffanteil in dem Fermentationsmedium von 0.1 bis 20% (w/w), vorzugsweise von < 10% (w/w), speziell vorzugsweise < 5% (w/w), besonders vorzugsweise < 1 % (w/w) und idealerweise < 0,1% (w/w) ist für das erfindungsgemäße Verfahren akzeptabel.
[27] Alle zugeführten Polymere und Enzyme müssen nicht in höchster Reinheit zugeführt werden. Verunreinigungen aus der Herstellung der Polymere oder Enzyme können ebenfalls dem Fermentationsmedium zugeführt werden, jedoch sollten die Verunreinigungen keine wesentlichen negative oder inhibierende Wirkungen auf die Enzymaktivitäten und die Zellen ausüben. [28] Werden Nährstoff- oder pH-Polymere verwendet, die sich nicht gut in wässrigen Lösungen lösen, so kann deren Lösung durch Löslichkeitsvermittler wie z.B. Polyethylenglykole, Ten- side oder Ionische Flüssigkeiten verbessert werden. Zudem kann es sein, dass die Polymere sich in einer zweiten flüssigen Phase (z.B. dem Löslichkeitsvermittler) lösen und sich mit der Fer- mentationsbrühe in Emulsion befinden. Die Polymere und/oder die Nährstoffe/pH-Stellmittel werden sich dann erst langsam aus der zweiten flüssigen Phase herauslösen, um sich in dem Zellkultur-Medium zu lösen.
[29] Die Erfindung erfordert die genaue Abstimmung der Freisetzungsraten des Nährstoffes aus dem Nährstoff-Polymer und der Freisetzungsrate der pH-aktiven Substanz aus dem Polymer für die pH-Regelung. Die Feinabstimmung dieser Freisetzungsraten ist sehr aufwendig und kann nur mit entsprechenden parallelen Fermentationssystemen, wie z.B. dem Mikrofermentationssys- tem BioLector, effektiv ermittelt werden.
[30] Die Abstimmung der Freisetzungsraten für den Nährstoff und das pH-Stellmittel sollte sich an der Stöchiometrie der ablaufenden Reaktion, z.B. Zell-Wachstum, orientieren. Für Bakterien- und Hefe-Biomasse werden elementare Stoffzusammensetzungen N/C (N= Stickstoffatom, C= Kohlenstoffatom) von 0,1 bis 0,35 berichtet. Für höhere eukaryotische Zellen (wie z.B. Chinese Hamster Ovary) kann von einer elementaren Stoffzusammensetzung N/C von 0,02 bis 0,35 ausgegangen werden. Dies würde bedeuten, dass die Freisetzung von Nährstoff wie z.B. Glucose als Haupt-Kohlenstoffquelle und dem pH-Stellmittel, welches z.B. Ammoniak als Haupt- Stickstoff (N)-Quelle sein kann, für mikrobielle Zellen im Verhältnis von 0,1 bis 0,35 N/C und für eukaryotische Zellen im Verhältnis von 0,02 bis 0,35 N/C stehen sollte. Im Falle der eukaryo- tischen Zellen können anstelle von Ammoniak auch Glutamin oder andere Aminosäuren oder Peptide oder Mischungen aus diesen als N-Quelle fungieren. [31] Die absoluten Freisetzungsraten orientieren sich an der Wachstumsgeschwindigkeit der Zellen und der eingesetzten Zellzahl in der Fermentation. Für mikrobielle Zellen liegen die erforderlichen Freisetzungsraten für den Nährstoff Haupt-Kohlenstoffquelle z.B. von Glucose im Bereich von 3,33 mmol/(L*h) bis 6.666 mmol/(L*h) Kohlenstoffquelle (bezogen auf 1 C-Atom), wobei sie bei eukaryoti sehen Zellen aufgrund des langsameren Wachstums und der niedrigeren Zellkonzentrationen im Bereich von 0,033 mmol/(L*h) bis 333 mmol/(L*h) Kohlenstoffquelle (bezogen auf 1 C-Atom) liegen.
[32] Entsprechend ergeben sich die erforderlichen Freisetzungsraten für die N-Quelle für mikrobielle Zellen im Bereich von 0,333 mmol/(L*h) bis 2.333 mmol/(L*h) N-Quelle (bezogen auf 1 N-Atom) und für eukaryotische Zellen im Bereich von 0,66 μιηο1/(Ι--*1ι) bis 117 mmol/(L*h) N-Quelle (bezogen auf 1 N-Atom).
[33] Für Phosphat-Quellen ist für alle Zelltypen ein Bereich von 0,033 mmol/(L*h) bis 1200 mmol/(L*h) Phosphat-Quelle (bezogen auf 1 Phosphat-Atom) erforderlich. Ähnliche Freiset- zungsraten wie für die Phosphat-Quelle gelten auch für Kalium-Atome. Für Schwefel-Atome sind um den Faktor 10-20 kleinere Freisetzungsraten wie für die Phosphat-Quelle notwendig. Die Angaben in L beziehen sich hier auf das Reaktionsvolumen (z.B. Fermenterarbeitsvolumen) und h auf die Reaktionszeit (z.B. Fermentationszeit).
[34] Die Feinabstimmung der Freisetzungsraten soll nicht durch den potentiellen Anwender erfolgen, sondern von dem Hersteller der Medien. Die Medien werden in fertigen Kits zusammen gestellt, sodass der Anwender nachher nur noch die vorsterilisierten Medien in sterile Fermentationsbehälter füllen muss und direkt mit den Versuchen loslegen kann. Die Raten der Nährstoff-Freisetzung können durch einfache Variation des Zusatzes der Enzym-Menge bzw. - Aktivität zu dem flüssigen Kulturmedium beeinflußt werden. [35] Eine Variante der Erfindung, die auch ohne die zuvor beschriebenen Merkmale erfindungswesentlich ist und auf beliebige Prozesse anwendbar ist, beinhaltet die temporäre Aussetzung oder Reduktion der Enzym-Aktivität für die zu hydrolysierenden Polymere (für Nährstoff, für Base und/oder Säure). Dies kann erreicht werden, indem die Enzyme zu bestimmten Zeitpunkten während der Fermentation keinen Kontakt zur Zell-Suspension haben, die Stoffaus- tauschfläche reduziert wird oder die Enzyme beliebig reversibel deaktiviert werden. Dies kann einerseits realisiert werden, indem die Enzyme auf Polymerträgern, z.B. Magnetkugeln, immobilisiert sind und über ein magnetisches Feld aus der Zell-Suspension herausgezogen werden. Anderseits können diese magnetischen Enzym-Träger innerhalb der Zell-Suspension derart eingeengt werden, z.B. in eine Ecke des Fermenters gezogen werden, so dass die Stoffaustauschfläche der Enzym-tragenden Polymere zur Zell-Suspension stark reduziert wird und damit die Hydrolyse-Rate ebenfalls reduziert wird.
[36] Eine weitere technische Umsetzung dieser Variante kann die Immobilisierung der Enzyme auf einem mechanisch beweglichen Element sein. Dieses mechanische Element, z.B. ein be- weglicher Stab, kann dann während der Fermentation temporär in die Zell-Suspension eintauchen und somit gezielt für eine bestimmte Zeit seine hydrolytische Wirkung entfalten. Soll die hydrolytische Wirkung gestoppt werden, wird das mechanische Element wieder der Lösung gezogen. [37] Eine weitere Umsetzung dieser Variante kann realisiert werden, indem man gelöste oder immobilisierte Enzyme einsetzt, die durch ein von außerhalb des Fermenters angeregtes elektromagnetisches Feld oder elektro-magnetische Strahlung, vorzugsweise UV- VIS Licht, ihre Konformation verändern und dadurch ihre enzymatische Aktivität reversibel beeinflußt wird. Durch die kurzzeitige Einstrahlung von elektro-magnetischer Strahlung auf das Enzym wird die Aktivi- tät entweder gesteigert, reduziert oder deaktiviert. Aufgrund der Reversibilität dieser Reaktion nimmt das Enzym nach einer bestimmten Zeit seine ursprüngliche Konformität und Aktivität automatisch wieder ein oder aber durch erneute kurzzeitige Einstrahlung von elektromagnetischer Strahlung (evtl. bei einer anderen Wellenlänge) in den Fermenter wird die ursprüngliche Molekül-Konformität und Aktivität wieder erstellt. Somit ist das Enzym und damit die hydrolytische Rate schaltbar und nach Belieben im Prozess einregelbar. Diese Varianten können auf beliebige enzymatische Umsetzungen angewendet werden.
[38] In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die hydrolytischen Enzyme auch an der Reaktorwand der Fermentationsbehälter immobilisiert werden. Die Zellkultur- Suspension der Fermentation steht nur im Kontakt mit den Enzymen und damit mit der hydroly- tischen Enzym-Aktivität, die von der Zellkultur-Suspension auf der Reaktorwand benetzt wird. Die Benetzung der Reaktorwände mit Zellkultur-Suspension kann durch Einstellung der Drehzahl eines Rührers, die Schütteldrehzahl eines Schüttlers, ein zeitlich variierendes Arbeitsvolumen der Zellkultur-Suspension oder aber die Neigung des Fermentationsbehälters beeinflußt werden. Mit einer Erhöhung, z.B. der Schütteldrehzahl eines Schüttlers, kann die Schwapphöhe der Flüssigkeit in einem geschüttelten Fermentationsbehälter, z.B. einem Schüttelkolben, erhöht werden. Dadurch wird auch die Benetzungsfläche der Zellkultur-Suspension mit der Reaktorwand erhöht und damit die zur Verfügung stehende hydrolytische Enzym-Aktivität erhöht. Somit hat der Anwender die Möglichkeit die hydrolytische Aktivität des Reaktionsansatzes und damit die Nährstoff-Frei setzung und pH-Regelung selbst während der Fermentation zu beeinflussen. [39] Diese Ausführungsform kann dazu genutzt werden, die Nährstoff-Limitierung und die pH-Regelung der mit Fortlauf der Fermentation zunehmenden Zellkonzentration anzupassen. In Fachkreisen ist es üblich die Fedbatch-Fermentation mit exponentiellem oder linear steigendem Nährstoffzulauf durchzuführen. Dies wäre mit dieser Ausführungsform der Erfindung ebenfalls möglich. Ein linear steigender Nährstoff zulauf kann ebenfalls durch die diffusive Abgabe der hydrolysierenden Enzyme erfolgen. Dies kann durch den Einsatz von„Retard"-Kapseln geschehen.
[40] Alle Varianten mit Anwendung von immobilisierten Enzymen, sei es auf der Reaktorinnenwand, den Magnetkugeln, auf beweglichen Einbauten und ähnlichem haben zudem den Vor- teil, dass die Enzyme nach Beendigung der Reaktion bzw. Fermentation nicht zusätzlich aus der Reaktionslösung (Fermentationsbrühe) entfernt bzw. abgereinigt werden müssen. Dies ist ein wesentlicher Vorteil für die Produkt-Aufreinigung und erspart Kosten.
[41] In einer besonderen Ausführungsform ist der aus dem Nährstoff-Polymer freigesetzte Nährstoff gleichzeitig ein Induktor für die Gen- und Proteinexpression der Zellen. Durch die Hydrolyse des Induktor-Nährstoffes (z.B. Lactose aus Lactose-Polymeren) kann somit die Gen- und Proteinexpression über die Hydrolyserate gesteuert werden. Dies ermöglicht u.a. Untersuchungen mit konstantem Verhältnis von Induktor zu Biomasse mit Fortschreiten der Fermentation. Auch hier sind wieder Abstimmungen in der Freisetzung von Induktor, Nährstoff und pH- Stellmitteln nötig. [42] Mit Hilfe der enzymatischen pH-Steuerung oder -Regulierung kann die Aktivität des Nährstoff-Polymer hydrolisierenden Enzyms in ihrem pH-Optimum konstant gehalten werden auch ohne hohe Pufferkonzentrationen. Tritt keine Aktivitätsänderung des Nährstoff-Polymer hydrolisierenden Enzyms, z.B. Glucosidase, während der Fermentation auf, so herrscht stets eine konstante Nährstoff-Zufütterungsrate. Damit ist auch der 02-Bedarf in einer aeroben Kultivie- rung konstant. Bei geeigneter Abstimmung der kultivierten Zellen mit der (konstanten) Nährstoff-Freisetzungsrate kann knapp unterhalb der maximalen OTR (OTR= Oxygen Transfer Rate = maximal Sauers tofftransfer-Rate) eines Reaktorsystems operiert werden, ohne dass eine 02- Limiterung der Kultur auftritt. Dies ist besonders interessant für die Expression von nichtkommerziellen Proteinen im Labormaßstab oder zur Expression eines neu klonierten Gens im Labormaßstab mit einfach handhabbaren Reaktorsystemen wie z.B. Schüttelkolben oder Glasreaktoren mit Rühreinsatz.
[43] Eine weitere Variante des in der Erfindung beschriebenen kombinierten enzymatischen Systems aus kontrollierter Nährstoff- und pH-Stellmittelfreisetzung ist die gezielte Änderung des pH-Wertes zu einem bestimmten Zeitpunkt der Fermentation. Um den pH-Wert während der Fermentation konstant zu halten, werden in einem festgelegten Verhältnis eine Base und eine Säure ins Medium abgegeben. Ist die Nährstoff-Frei Setzung bedingt durch die Erschöpfung des Nährstoff-Polymers beendet, kann der pH-Wert im Anschluss an die Wachstumsphase weiter fortlaufen und den pH- Wert stark erhöhen oder erniedrigen, je nachdem welches pH-Stellmittel freigesetzt und wieviel pH-Polymer noch in der Lösung vorhanden ist. Die genaue Abstimmung der Vorlagemengen an Polymeren kann so gewählt werden, dass gezielt am Ende einer Fermentation ein bestimmter pH-Wert angenommen wird. Dies kann entweder für die Stabilität der Zellen, der hergestellten Produkte sowie der Weiterverarbeitung oder einfach der Untersuchung der optimalen Reaktionsbedingungen dienen. [44] Als weiteres Beispiel sei die Löslichkeit des Ziel-/Produktproteins genannt. Bekanntermaßen ist die Löslichkeit eines Proteins an seinem isoelektrischen Punkt (pl) am niedrigsten. Wird das Zielprotein in genügend hoher Konzentration gebildet und liegt sein pl im basischen oder sauren, kann eine Ausfällung des Zielproteins nach Beendigung der Wachstumsphase gezielt durch Einstellung des pH-Wertes bewirkt werden. [45] Die Variation der hydrolytischen Enzym-Aktivität während der Fermentation ist auch mit einer weiteren Ausführungsform der Erfindung möglich. Hierbei kann durch äußere Zugabe eines Enzym-Konzentrats oder eines Enzym-Inhibitors in die Fermentationslösung die Enzym- Aktivität weiter erhöht werden oder erniedrigt werden. Dabei ist darauf zu achten, dass der Enzym-Inhibitor sich nicht auch inhibierend auf die Zellen, deren Wachstum und die Biosynthese von Produkten auswirkt. Der Inhibitor soll stöchiometrisch auf die Enzyme wirken und keine generelle Inhibierung der Enzyme hervorrufen.
[46] Mit Erhöhung der Enzymmenge bzw. deren Aktivität im Reaktionsansatz durch Zugabe von Enzym-Konzentrat können die Hydrolyse-Raten an die Fermentation angepaßt werden. So lassen sich exponentielle oder linear steigende Nährstoff-Fütterungsraten und die entsprechende Anpassung der pH-Regelung realisieren.
[47] In eine weiteren Ausführungsform kann auch der Inhibitor durch enzymatische Hydrolyse freigesetzt werden und die Nährstoff- und pH-Stellmittel freisetzenden Enzyme reversibel hem- men, wobei der Inhibitor nicht toxisch oder inhibierend auf den kultivierten Zellen wirken darf. So wird durch die Zunahme des Inhibitors die Aktivität der Nährstoff- und/oder pH-Stellmittel freisetzenden Enzyme kontinuierlich reduziert.
[48] In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die hydrolytischen Enzyme auch von den Zellen direkt während der Fermentation exprimiert bzw. hergestellt werden. Ent- weder exprimiert die Zelle alle für die pH-regulierte Fedbatch-Fermentation nötigen Enzyme selbst oder aber das von den Zellen nicht-exprimierte Enzym wird wie in dem normalen Fall einfach dem Fermentationsmedium zugesetzt.
[49] Die Expressionsrate des Enzyms von der Zelle muss dabei so reguliert sein, dass die hydrolytische Aktivität des Enzyms den Wachstumsnährstoff immer in einer Rate freisetzt, die für die Zellen limitierend ist. Die Expressionsrate des Enzyms für die pH-Regelung muss dabei an die hydrolytische Aktivität des Nährstoff freisetzenden Enzyms angepasst werden, so dass der pH- Wert nicht wegläuft bzw. vom pH-Sollwert nie mehr als + 1 ,0 pH-Einheit, vorzugsweise nie mehr als + 0,5 pH-Einheit, besonders vorzugweise nie mehr als + 0,1 pH-Einheit oder idealer- weise nie mehr als ± 0,05 pH-Einheit abweicht. [50] Die für die pH-regulierte Fedbatch-Fermentation nötigen Nährstoff- und pH-Substanz- Freisetzungsraten können entweder durch die Selektion von geeigneten Zellen in einem Screening, durch Co-Fermentation von Klonen mit verschiedenen Expressionsraten oder Enzym- Aktivitäten oder aber durch gezielte genetische Klonierung von rekombinanten Klonen mit verschiedenen Promotoren zur Kontrolle der Gen- und Proteinexpression erfolgen. Bei Anwendung von gentechnisch erzeugten Klonen können induzierbare, dereprimierbare und/oder konstitutive Promotoren zum Einsatz kommen, was eine zusätzliche Regulationsebene der Enzym- Expressionsraten und damit der pH-geregelten Fedbatch-Fermentationsführung über entspre- chende Induktoren, derepremierende Nährstoffe oder andere Prozessparameter (wie z. B. Temperatur) ermöglicht.
[51] Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Anwendung von Enzymen mit verschiedenen pH- und Temperatur-Optima. Sollen verschiedene pH- Werte in einer Fermentation konstant gehalten werden, so müssen jeweils die Aktivitäten der Enzyme (für die Nährstoff- und die pH-Stellmittel-Freisetzung) bei den entsprechenden pH-Werten bekannt sein und entsprechend aufeinander abgestimmt werden.
[52] Das pH-Stellmittel freisetzende Enzym kann man auch dazu einsetzen, um ein selbstregulierendes System zu etablieren. Dabei wählt man gezielt ein Enzym mit einem pH-Optimum unterhalb des pH-Sollwerts (z.B. eine saure Urease oder eine saure Phytase). Läuft der pH-Wert aus dem Sollwert-Bereich in Richtung des pH-Optimums des Enzyms, so wird die Hydrolyse des pH-Stellmittels erhöht und dies wiederum korrigiert den pH-Wert in Richtung Sollwert. Eine aktive pH-Regelung läßt sich damit etablieren.
[53] Bei der hydrolytischen Nährstoff-Freisetzung kann die Verlagerung des pH-Wertes in das Optimum des Nährstoff-frei setzenden Enzyms dazu führen, dass die Freisetzungsraten des Nährstoffs beschleunigt werden und man dadurch von einer linearen Freisetzung abweichende, z.B. exponentielle Freisetzungsraten, erzielen kann. Bei einem Herausfahren des Bioprozesse aus dem pH-Optimum des Enzyms kann genau das Gegenteil entstehen, die Nährstoff -Freisetzungsraten nehmen degressiv ab. Des Weiteren können andere Prozessparameter wie z.B. die Temperatur dazu genutzt werden, um die Enzym-Aktivitäten gezielt zur Beeinflussung der Freisetzungsraten zu beeinflussen. Auch in diesem Falle (Temperatur) besitzen die Enzyme einen Bereich mit optimaler Aktivität.
[54] Figur 1 zeigt als Ausführungsbeispiel einen Bioreaktor 1 mit einer rotierenden, durchmischten Reaktionslösung 4, in der das Nährstoff-Polymer 5 und das Polymer für die pH- Stellmittel 6 gelöst sind. Zudem sind in der Reaktionslösung 4 das hydrolytische Enzym für das Nährstoff-Polymer 7 und das hydrolytische Enzym für das pH-Polymer 3 gelöst. Es ist zu erkennen, dass die hydrolytische Aktivität bereits vorhanden ist und bereits Nährstoff 2 und pH-aktive Substanzen 8 aus den gelösten Polymeren freigesetzt wurden. Die Zellen oder andere Reaktanden in der Reaktionslösung 4 wurden aus Gründen der Übersicht nicht zusätzlich dargestellt. Es ist jedoch notwendig, dass für die Anwendung der Erfindung Zellen oder andere Reaktanden ebenfalls in der Reaktionslösung 4 gelöst oder suspendiert sind. Dies gilt auch für alle weiteren Figuren. [55] Figur 2a zeigt eine Variante der Erfindung, bei der nur eine hydrolytische Aktivität direkt in der Reaktionslösung 4 vorhanden ist. Die Hydrolyse des Nährstoff-Polymers zu reinem Nährstoff wird in diesem Falle ergänzt durch den diffussiven Zufluss von pH-aktiven Substanzen 11 wie z.B. Ammoniak durch einen den Bioreaktor und ein Reservoir 9 verbindenden Kanal, der als Diffusionsbarriere 12 dient. In dem Reservoir 9, welches auch ein Zwischenraum zwischen ein- zelnen Wells einer Mikrotiterplatte sein kann, wird eine hoch-konzentrierte Lösung der pH- aktiven Substanz 9 vorgelegt. Durch den Konzentrationsgradienten zwischen dem Reservoir mit der hoch-konzentrierten Lösung der pH-aktiven Substanz 9 und der Reaktionslösung im Bioreaktor 4 entsteht ein diffusiver Fluss der pH-aktiven Substanz in die Reaktionslösung 4 zur pH- Wert-Steuerung. Der diffusive Fluss der pH-aktiven Substanz muss zuvor genau auf die hydroly- tische Freisetzung des Nährstoffs und der Nährstoff-limitierten Reaktion im Bioreaktor, z. B. limitiertes Zell-Wachstum, abgestimmt werden. Nur nach genauer Charakterisierung und Abstimmung beider Raten (diffusiver Fluss und Nährstoff-Freisetzung) kann ein zufriedenstellendes Ergebnis im Sinne einer pH-geregelten Fedbatch-Fermentation erzielt werden. Natürlich können die hydrolytische Aktivität und der diffusive Fluss auch ausgetauscht werden, so dass im Biore- aktor eine pH-aktive Substanz hydrolytisch freigesetzt wird und der Nährstoff über die Diffusi- onsbarriere in die Reaktionslösung im Bioreaktor 4 gelangt.
[56] Figur 2b skizziert eine ähnliche Variante wie in Figur 2a beschrieben, nur dass hier der Nährstoff 14 aus einem Polymerträger 13, der in der Reaktionslösung 4 suspendiert ist, diffusiv freigesetzt wird. Die pH-aktive Substanz wird enzymatisch aus dem gelösten pH-Polymer 6 frei- gesetzt. Auch hier sind die Freisetzungsraten des Nährstoffs und der pH-aktiven Substanz exakt aufeinander abzustimmen, um eine pH-geregelte Fedbatch-Fermentation zu realisieren. Natürlich sind die Komponenten auch hier austauschbar.
[57] Figur 2c zeigt eine sehr ähnliche Variante von Figur 2b, bei der lediglich der Nährstoff 14 freisetzende Polymerträger an der Reaktorinnenfläche immobilisiert ist 15 und von dort aus Nährstoff diffusiv in die Reaktionslösung 4 abgibt. Die pH-aktive Substanz wird wiederum en- zymatisch aus dem gelösten pH-Polymer 6 freigesetzt. Auch hier sind die Komponenten austauschbar.
[58] Die Figuren 3a und 3b zeigen die Varianten der Erfindung, bei der die hydrolytische Ak- tivität der Enzyme in der Reaktionslösung 4 von außerhalb des Bioreaktors beinflußbar ist. Mit Hilfe eines Magneten 16, z.B. einem Permanent-Magnet oder einem Elektromagnet, können die auf magnetisierte Träger immobilisierten Enzyme 17, 18 in und aus der Reaktionslösung 4 bewegt werden. Damit hat der Anwender die Möglichkeit, zusätzlich von außen Einfluss auf die Reaktion zunehmen. Die reale Enzym-Aktivität jedes einzelnen Enzyms und dadurch die ent- sprechenden Freisetzungsraten des Nährstoffs oder der pH-aktiven Substanz entsprechen der Eintauchzeit der Enzyme in die Reaktionslösung. Die Eintauchzeiten der beiden angewandten Enzyme sind individuell einstellbar und somit kann die Reaktion gezielt auf einen bestimmten pH-Wert eingeregelt werden oder eine bestimmte Nährstoff-Freisetzungsrate erzielt werden. Es ist auch möglich die magnetischen Enzym-Träger 17, 18 nur teilweise in die Reaktionslösung 4 eintauchen zu lassen. Mit zunehmendem Fortschritt der Reaktion kann eine größere Fläche des Trägers 17, 18 in die Reaktionslösung gefahren werden und somit die Enzym-Aktivität der Lösung erhöht werden.
[59] Die für die pH-Regelung nötige Regelgröße (pH-Istwert) kann durch eine im Bioreaktor eingebaute, übliche pH-Elektrode oder eine pH-Optode gemessen werden. Dieser pH-Messwert wird kontinuierlich in dem geschlossenen Regelkreis verarbeitet, welcher dann die Bewegung des Magneten in und aus der Reaktionslösung 4 und damit den pH-Wert regelt.
[60] Die Figuren 4a und 4b zeigen eine weitere Variante der Erfindung, bei der die hydrolytische Aktivität der Enzyme in der Reaktionslösung 4 durch bewegliche Einbauten, z.B. einen Stab 22, 24 beeinflussbar ist. Die auf dem Stab immobilisierten Enzyme 23, 25 können durch Verfah- ren der Stäbe in und aus der Reaktionslösung 4 bewegt werden. Die reale Enzym-Aktivität jedes einzelnen Enzyms und dadurch die entsprechenden Freisetzungsraten des Nährstoffs oder der pH-aktiven Substanz entsprechen der Eintauchzeit der Enzyme in die Reaktionslösung. Die Eintauchzeiten der beiden angewandten Enzyme sind individuell einstellbar und somit kann die Reaktion gezielt auf einen bestimmten pH-Wert eingeregelt werden oder eine bestimmte Nährstoff- Freisetzungsrate erzielt werden. Es ist auch möglich den beweglichen Stab 22, 24 nur teilweise in die Reaktionslösung 4 eintauchen zu lassen. Mit zunehmendem Fortschritt der Reaktion kann eine größere Fläche des Stabs 22, 24 in die Reaktionslösung gefahren werden und somit die Enzym-Aktivität der Lösung erhöht wird. [61] Die Figuren 5a bis c zeigen eine Variante der Erfindung, bei der die hydrolytische Aktivität der Enzyme in der Reaktionslösung 4 durch die Zentrifugalkraft beeinflussbar ist. Hierbei wird der Kontakt der Reaktionslösung mit den Enzymen erst bei einer bestimmten Drehzahl eines Schüttlers (oder Rührers) und dadurch auftretenden Schwapphöhe der Reaktionslösung 4 im Bioreaktor erreicht. [62] In Figur 5a ist dargestellt, dass bei der angewandten Schütteldrehzahl (col) die Reaktionslösung noch nicht die an der oberen Reaktorwand immobilisierten Enzyme 30, 33 benetzt und damit steht der Reaktionslösung noch keine hydrolytische Aktivität zur Verfügung. Die Reaktion erfolgt lediglich im Batch-Modus. Möchte man dann die Hydrolyse des Nährstoff- und pH- Polymers starten, so muss der Anwender lediglich die Drehzahl des Schüttlers erhöhen, so dass die Schwapphöhe der Reaktionslösung 35 an die immobilisierten Enzyme heranreicht und diese benetzt (Figur 5b). Zur weiteren Erhöhung der realen Enzym-Aktivität in der Reaktionslösung kann man die Schütteldrehzahl und die Schwapphöhe weiter erhöhen, so dass sich ebenfalls die benetzte Fläche an immobilisiertem Enzym erhöht und mehr aktives Enzym der Lösung zur Verfügung steht. Mit dieser Variante lassen sich gezielt typische progressive oder exponentielle Nährstoff- und/oder pH-aktive Substanz-Freisetzungsprofile realisieren, die im Bereich der Fermentation üblich sind.
[63] Figur 6 zeigt eine weitere Variante der Erfindung, bei der die Enzym-Aktivität von außerhalb des Bioreaktors beeinflussbar ist. Über einen optisch transparenten Boden 36 am Bioreaktor wird elektromagnetische Strahlung 38, 40 von außen in den Bioreaktor eingekoppelt. Durch die elektromagnetische Strahlung, z.B. Licht bei einer bestimmten Wellenlänge, wird eine Konformationsänderung des Enzyms hervorgerufen, was die spezifische Aktivität des Enzyms verändert. Die Aktivitätsveränderung kann reversibel sein und sich von selbst nach einer bestimmten Zeit oder durch erneute Strahlungs-Induktion (z. B. bei einer anderen Wellenlänge als die erste) regenerieren. Das Nährstoff-Polymer-hydrolysierende Enzym 37 kann über eine andere Wellenlänge manipuliert werden als das pH-Polymer-hydrolysierende Enzym 39, so dass beide Enzym- Aktivitäten individuell einstellbar sind.
[64] Figur 7 zeigt eine Auswahl von Reaktoren, in denen das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann. Aufgrund der einfachen Handhabung der Erfindung kann das Verfahren maßstabsübergreifend in verschiedenen Reaktortypen und Volumen angewendet werden und erleichtert somit das Scale-up wesentlich.
[65] Figur 8 zeigt die Biomasseentwicklung (über Streulicht Intensitäten, engl. Scattered light) bei unterschiedlichen Urease zu Amylogucosidase- Verhältnissen (U/A-Aktivitätsverhältnis nach Norm-Aktivitäten des Herstellers). Im Diagramm sind zusätzlich exemplarisch erreichte Biomasse-Konzentrationen in calibrierten OD6oo-Einheiten angegeben.
[66] Figur 9 stellt die pH-Verläufe zu den Biomasseentwicklungen in Figur 8 dar.
[67] Figur 10 zeigt die Biomasseentwicklung von steigenden Enzymmengen bei konstantem Urease zu Amyloglueosidase Verhältnis (U/A-Aktivitätsverhältnis nach Norm-Aktivitäten des Herstellers), im Diagramm sind zusätzlich exemplarisch erreichte Biomasse-Konzentrationen in calibrierten OD6o0-Einheiten angegeben.
[68] Figur 11 stellt pH-Verläufe zu den Biomasseentwicklungen in Figur 10 dar.
[69] Gegenüber dem Stand der Technik unterscheidet sich die Erfindung im Wesentlichen in den folgenden Aspekten:
Prozessführung einer pH-gesteuerten oder geregelten Fedbatch-Fermentation mit gezielter Einstellung von linearen oder beliebigen Profilen von Nährstoff- und pH-Stellmittel-
Freisetzungsraten ohne Verwendung von aktorischen Antriebsmitteln wie Flüssigkeitspumpen - Alle Medienkomponenten inklusive mindestens eines Polymers für die Freisetzung von Nährstoff- oder pH-Stellmittel liegen gelöst oder mit einem Feststoffgehalt von < 20% (w/w), < 10% (w/w), < 5% (w/w) oder vorzugsweise < 1 % (w/w) im Zellkultur-Medium vor mindestens ein Enzym mit hydrolytischer Aktivität wird in dem Zell-Kulturmedium ange- wendet mindestens ein Nährstoff oder pH-Stellmittel wird diffusiv aus einem festen oder gel- phasigen Polymerträger ohne Hydrolyse oder aber durch eine weitere enzymatische Hydrolyse aus einem gelösten Polymer freigesetzt die hydrolytische Enzym-Aktivität kann temporär reversible reduziert, verstärkt oder deakti- viert werden ein pH-gesteuertes oder geregeltes Fedbatch-Verfahren wird ermöglicht ohne Verwendung von Vorlage-Behältnissen für Nährstoff und pH-Stellmittel (Ein-Topf-Fermentation) in dem Fermentationsbehälter müssen keine Sensoren (z.B. pH, p02 oder Nährstoff) für die Übernahme von Regelungsaufgaben vorhanden sein - die Nährstoff-Limitierung und pH-Regelung sind durch die Stöchiometrie der biochemischen Reaktion vorbestimmt und jeweils auf einen speziellen Zelltyp abgestimmt das Verfahren ist maßstabsunabhängig und kann in wenigen nL bis in den m3 Maßstab ohne grundsätzliche Änderungen angewendet werden mit diesem Verfahren können Standard-Fermentationsbehälter (Mikrotiterplatten, Zentrifu- genröhrchen, Falcon-Röhrchen, Erlenmeyerkolben, T-Flaschen, Spinner, Rührkessel, Blasensäulen, Wave (Plastiktüten)-Bioreaktoren und ähnliche bekannte Reaktoren) verwendet werden das Verfahren ist für Hochdurchsatz-Anwendungen sehr gut geeignet, da nur flüssige Medien pipettiert werden müssen und es dafür automatische Pipettierroboter gibt
[70] Gegenüber dem offengelegten Stand der Technik bietet die vorgestellte Erfindung die folgenden Vorteile: - einfaches Ein-Topf -Verfahren
Realisierung einer pH-gesteuerten oder geregelten Fedbatch-Fermentation ohne erforderliche äußere Beeinflussung des Verfahrens
Erreichung hoher Zelldichten ohne Überfluss-Metabolismus und Wachstums-Inhibierungen durch driftenden pH-Wert - Maßstabs-unabhängiges Verfahren
Hochdurchsatz-fähig der Anwender oder der Hersteller kann das Zellkultur-Medium einfach durch Einwaage, Durchmischen, Lösen und Sterilisation (durch Autoklavieren und/oder Mikrofiltration < 0,2 μπι) aller Medienkomponenten genauso wie bei einem Batch-Medium anwenden - die Handhabung ist exakt die gleiche. geringe technische Ausstattung der Fermentationsbehälter/-Reaktoren notwendig - eine einfache Mikrotiterplatte oder Rührkessel ohne zusätzliche Sensorik ist ausreichend der Ausbildungsgrad der Anwender kann sehr niedrig sein, da kein tiefer gehendes Wissen über Fermentation, Bioreaktoren oder Prozess-Regelung notwendig ist - durch die Vorlage aller Medienkomponenten direkt zu Beginn einer Fermentation müssen keine Nährstoffe und pH-Stellmittel während der Fermentation dem Fermentationsbehälter zugeführt werden. Dies reduziert wesentlich die Kontaminationsgefahr für das Verfahren durch die Zuläufe und stellt den mono-septischen Betrieb der Fermentation sicher insbesondere bei anaeroben Fermentationsverfahren ist die einmalige Vorlage aller Medienkomponenten und die Vermeidung weiterer Zugriffe oder Zuläufe in den Prozess ein wesent- licher Vorteil, um den Eintritt von Umgebungsluft, insbesondere Sauerstoff in den Fermentationsbehälter zu vermeiden. Dies fördert wesentlich die Prozess-Sicherheit die Charakteristika des Ein-Topf- Verfahrens können auch bei der Anzucht von sicherheitsrelevanten Zellen oder Material höherer biologischer Sicherheitsstufen (S2, S3 und S4) sehr relevant sein, um einen potentiellen Austritt der Zellen oder des Materials über Zuläufe oder bei mehrmaligen Zugriffen zu vermeiden die Anwendung des Ein-Topf-Verfahrens kann zu wesentlichen Kosteneinsparungen einerseits in der Bioprozessentwicklung durch die Anwendung der Fedbatch-Fermentationen im Hochdurchsatz führen und andererseits direkt in dem Produktionsprozess, da keine große technische Ausstattung der Fermentationsbehälter notwendig ist und auch das Zellkultur- Medium auf kostengünstigen Nährstoff-Polymeren (z.B. Polysacchariden oder Cellulosen) und pH-Polymeren (z.B. Harnstoff) basieren kann.
[71] Im Folgenden sind einige Ausführungsbeispiele der Erfindung in weiterer Detaillierung aufgeführt. Die Ausführungsbeispiele sind nur exemplarisch zu sehen und beschränken in keiner Hinsicht die Anwendungsmöglichkeiten der Erfindung in anderer Kombination als hier erwähnt. Beispiel 1 : E. coli Fedbatch-Fermentation mit verschiedenen Urease zu Amyloglucosidase Verhältnissen.
[72] Die Figuren 8 und 9 zeigen beispielhafte Kultivierungen von E. coli BL21 (DE3) im beschriebenen Zellkulturmedium mit gleichzeitiger enzymatischer Hydrolyse von Glucose aus Dextrinen durch das Enzym Amyloglucosidase und enzymatischer Freisetzung eines pH- Stellmittels am Beispiel der Harnstoff-Hydrolyse zu Ammoniak durch das Enzym Urease. Als zusätzlicher Vergleich sind zwei Kultivierungen gezeigt, bei denen keine enzymatische Freisetzung eines pH-Stellmittels erfolgte.
[73] Das in der Erfindung beschriebene Zellkulturmedium wurde auf Basis eines in der Literatur beschriebenen E.coli-Mediums angesetzt (Wilms B, Hauck A, Reuss M, Syldatk C, Mattes R, Siemann M, Altenbuchner J: High-cell-density fermentation for production of L-N- carbamoylase using an expression System based on the Escherichia coli rhaBAD promoter. Bio- technology and Bioengineering 2001 , 73(2): 95-103) und mit 50 mM Na2HP04/NaH2P04 gepuffert, das erste Vergleichsmedium ohne enzymatische Freisetzung eines pH-Stellmittels wurde dagegen mit 200 mM MOPS, das zweite Vergleichsmedium wiederum mit 50 mM Na2HP04/NaH2P04 gepuffert.
[74] In dem Anwendungsbeispiel wurde die Amyloglucosidase-Konzentration festgesetzt und die Urease-Konzentration variiert, um verschiedene Verhältnisse von Urease zu Amyloglucosidase (U/A) zu erzielen. Die Vergleichkultivierung ohne enzymatische pH- Stellmittelfreisetzung wurde ebenfalls mit der gleichen Amyloglucosidase-Konzentration versetzt.
[75] Die Animpf-Zelldichte betrug OD6o0 1,0, die Kultivierungen wurden bei 37 °C ausgeführt.
[76] Bei den Kultivierungen in den Wells B07/B08 betrug das U/A- Verhältnis 0,02 (jeweils in Unit U / Unit A; 1 Unit = 1 U [1 μmol min]). In diesem Beispiel reicht die Kombination des 50 mM Na2HP04/NaH2P04-Puffers zusammen mit der enzymatischen NH3-Freisetzung nicht aus, um den pH-Wert der Fermentation im Bereich um pH 7 zu halten. Die Kultur war durch den zu niedrigen pH-Wert von ca. 5 ab 10 h in der Fermentationsbrühe im Wachstum limitiert.
[77] Bei den Kultivierungen in den Wells D07/D08 betrug das U/A- Verhältnis 0,1. In diesem Beispiel ist die NH3-Freisetzung zu hoch, so dass der pH-Wert in der Fermentationsbrühe wiederum außerhalb des Optimums für das Wachstum von E. coli liegt. Zusätzlich wird die Kultur durch zu schnell ansteigende NH3-Konzentration inhibiert. [78] Bei den Kultivierungen in den Wells C07/C08 betrug das U/A-Verhältnis 0,05. Der pH- Wert bleibt ab ca. 3 h für eine Dauer von ca. 30 h konstant bei ca. pH 7.
[79] Der Vergleich mit den Kultivierungen ohne enzymatische Freisetzung eines pH- Stellmittels in den Wells E08 (50 mM Na2HP04/NaH2PQ4) und F08 (200 mM MOPS) zeigt deutlich die Überlegenheit des in der Erfindung beschriebenen Zellkulturmediums. Die enzymatische Aktivität der Urease sorgt dafür, dass die Fermentationsbrühe mit 50 mM Na2HPC>4/NaH2P04 ausreichend gepuffert wird. Um einen ähnlich konstanten pH-Verlauf über die Fermentationsdauer zu erhalten, wenn keine enzymatische Freisetzung eines pH-Stellmittels verwendet wird, ist eine hohe Pufferkonzentration von 200 mM MOPS nötig. Bedingt durch die höhrere Ionenstärke und Osmolarität eines solchen Mediums im Vergleich mit dem in der Erfindung beschriebenen Zellkulturmedium wird die Amyloglucosidase in ihrer Aktivität gehemmt, was sich in einer niedrigeren Glucosefreisetzungsrate und damit Biomasseproduktionsrate zeigt.
[80] Das in der Erfindung beschriebene Zellkulturmedium, hier in einer beispielhaften Ausführung mit Dextrin als Glucosepolymer, Amyloglucosidase als Glucose-freisetzendes Enzym, Harnstoff als pH-Stellmittel-Polymer und Urease als pH-Stellmittel-freisetzendes Enzym ermöglicht u. a. den Verzicht auf hohe Pufferkonzentrationen und den Wechsel vom teureren MOPS -Puffer zum billigeren Na2HP04/NaH2P04-Puffer.
Beispiel 2: E. coli mit steigenden Enzymkonzentrationen bei konstantem Verhältnis von Urease zu Amyloglucosidase
[81 ] In diesem Anwendungsbeispiel mit Dextrin als gelöstes Nährstoff-Polymer, Amyloglucosidase (AMG) als Glucose-freisetzendes Enzym, Harnstoff als pH-Stellmittel-Polymer und Urease (U) als pH-Stellmittel-freisetzendes Enzym wurde das Mengenverhältnis von Urease [U/L] zu Amyloglucosidase [U/L] (U/A) auf 0,05 festgesetzt. Die Randbedingungen entsprechen denen in Beispiel 1. In parallel laufenden Fermentationen (jeweils als Doppelansatz) wurden die Enzymmengen jeweils um den Faktor 2 erhöht (AMG 500 U/L, Urease 25 U/L und AMG 1000 U/L, Urease 50 U/L und AMG 2000 U/L, Urease 100 U/L, Aktivitätsangaben jeweils in Norm-U nach Angaben des Herstellers der Enzyme (Sigma-Aldrich)). [82] In Figur 11 steigt die (konstante) Biomassebildungsrate in der FedBatch-Phase proportional mit der eingesetzten Amyloglucosidase-Konzentration und damit Glucosezufütterungsrate. In dem Maße wie die Glucosezufütterungsrate erhöht wurde durch Erhöhung der Amyloglucosidase-Konzentration wurde auch die Ureasekonzentration und damit die pH-Stellmittel- Freisetzungsrate erhöht.
[83] Die pH-Verläufe während den Fermentationen zeigen einen sehr stabilen pH- Verlauf um ca. pH 7 in allen drei Fällen von ca. 3 h für ca. weitere 30 h (Figur 12). Die Stabilisierung des pH-Wertes während der Fermentation hängt damit von dem Verhältnis der beiden Enzyme zueinander ab und nicht von der absoluten Konzentration der jeweiligen Enzyme.
Bezugszeichenliste:
1 Bioreaktor
2 Freigesetzter Nährstoff
3 Enzym für Freisetzung von pH-aktiven Substanzen aus Polymeren
4 Reaktionslösung, z.B. Fermentationsbrühe mit Zell-Suspension
5 Gelöstes Nährstoff-Polymer
6 Gelöstes Polymer für pH-Stellmittel
7 Enzym für Freisetzung von Nährstoff aus Nährstoff-Polymeren
8 Freigesetzte pH-aktive Substanz
9 Reservoir mit konzentrierter pH-aktiven Substanz (oder Nährstoff)
10 Boden des Bioreaktor mit Verbindung zu einem Reservoir
1 1 Diffundierende pH-aktive Substanz (oder Nährstoff)
12 Diffusionsbarriere, z.B. ein Hydrogel
13
Polymerträger mit eingeschlossenem Nährstoff (oder pH-aktiver Substanz)
14 Freigesetzter Nährstoff aus Polymerträger(oder pH-aktive Substanz)
15 Immobilisierter Polymerträger an Reaktorinnenfläche mit eingeschlossenem Nährstoff
(oder pH-aktiver Substanz)
16 Beweglicher Magnet (oder Elektromagnet), obere Position
17 Magnetische Träger mit immobilisiertem Enzym für Freisetzung von Nährstoff aus Nährstoff-Polymeren, inaktiv, da nicht in Kontakt mit Reaktionslösung
18 Magnetische Träger mit immobilisiertem Enzym für Freisetzung von pH-aktiven Substanzen aus Polymeren, inaktiv, da nicht in Kontakt mit Reaktionslösung
19 Magnetische Träger mit immobilisiertem Enzym für Freisetzung von Nährstoff aus Nährstoff -Polymeren, aktiv, da in Kontakt mit Reaktionslösung
20 Beweglicher Magnet (oder Elektromagnet), untere Position mit Kontakt zur Reaktionslösung
21 Magnetische Träger mit immobilisiertem Enzym für Freisetzung von pH-aktiven Substanzen aus Polymeren, aktiv, da in Kontakt mit Reaktionslösung Beweglicher Stab mit immobilisiertem Enzym für Freisetzung von Nährstoff aus Nährstoff-Polymeren
Immobilisiertes Enzym für Freisetzung von Nährstoff aus Nährstoff-Polymeren, inaktiv, da nicht in Kontakt mit Reaktionslösung
Beweglicher Stab mit immobilisiertem Enzym für Freisetzung von pH-aktiven Substanzen aus Polymeren
Immobilisiertes Enzym für Freisetzung von pH-aktiven Substanzen aus Polymeren, inaktiv, da nicht in Kontakt mit Reaktionslösung
Beweglicher Stab mit immobilisiertem Enzym für Freisetzung von Nährstoff aus Nährstoff-Polymeren, in Kontakt mit Lösung
Immobilisiertes Enzym für Freisetzung von Nährstoff aus Nährstoff-Polymeren, aktiv, da in Kontakt mit Reaktionslösung
Beweglicher Stäb mit immobilisiertem Enzym für Freisetzung von pH-aktiven Substanzen aus Polymeren, in Kontakt mit Lösung
Immobilisiertes Enzym für Freisetzung von pH-aktiven Substanzen aus Polymeren, aktiv, da in Kontakt mit Reaktionslösung
Auf Reaktorinnenfläche-immobilisiertes Enzym für Freisetzung von Nährstoff aus Nährstoff-Polymeren, inaktiv, da nicht in Kontakt mit Reaktionslösung Entgegengesetzte Schwapphöhe der Flüssigkeitsoberfläche bei Flüssigkeitsrotation im Reaktor
Schwapphöhe der Flüssigkeitsoberfläche Auf Reaktorinnenfläche-immobilisiertes Enzym für Freisetzung von pH-aktiven Substanzen aus Polymeren, inaktiv, da nicht in Kontakt mit Reaktionslösung Entgegengesetzte Schwapphöhe der Flüssigkeitsoberfläche durch Erhöhung der Rotationsfrequenz, mit Kontakt der immobilisierten Enzyme zur Reaktionslösung
Angestiegende Schwapphöhe der Flüssigkeitsoberfläche durch Erhöhung der Rotationsfrequenz, mit Kontakt der immobilisierten Enzyme zur Reaktionslösung
Optisch transparenter Reaktorboden Reversible, deaktiviertes Enzym für Freisetzung von Nährstoff aus Nährstoff- Polymeren
Elektromagnetische Strahlquelle zur Manipulation der Enzym- Aktivität des Enzyms für Freisetzung von Nährstoff aus Nährstoff-Polymeren (z.B. ein Lichtwellenleiter, der Licht bei einer bestimmten Wellenlänge in den Reaktor eingekoppelt)
Reversible, deaktiviertes Enzym für Freisetzung von pH-aktiven Substanzen aus Polymeren
Elektromagnetische Strahlquelle zur Manipulation der Enzym-Aktivität des Enzyms für Freisetzung von pH-aktiven Substanzen aus Polymeren (z.B. ein Lichtwellenleiter, der Licht bei einer bestimmten Wellenlänge in den Reaktor eingekoppelt)

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Prozessführung einer Edukt-limitierten, biochemischen Reaktion mit gleichzeitiger pH-Steuerung oder Regelung, wobei mindestens die Freisetzungsrate des Edukts oder die Freisetzungsrate an pH-aktiver Substanz durch eine Enzym-Aktivität gesteuert oder geregelt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die pH-steuernde oder regulierende pH-aktive Substanz aus einem in der Reaktionslösung gelösten Polymer enzyma- tisch freigesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das reaktions- limitierende Edukt aus einem in der Reaktionslösung gelösten Polymer enzymatisch freigesetzt wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass entweder das Edukt oder die pH-aktive Substanz aus einem festen oder gel-artigen Polymerträger oder über einen an den Bioreaktor angrenzenden Diffusionskanal in die Reaktionslösung gelangt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens zwei Enzyme einen pH-gesteuerten oder geregelten Fedbatch-Prozess ausführen, und das eine Enzym durch seine Aktivität das reaktions-limitierende Edukt aus einem Polymer freisetzt und das andere Enzym durch seine Aktivität eine pH-aktive Substanz aus einem anderen Polymer freisetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Edukt-freisetzende Polymer ein Polysaccharid, vorzugsweise Stärke, behandelte Stärke, Stärke Extrakt, Stärke Derivate, Stärke-Hydrolysate, Glykogen, Carrageen, Amylose, Amylopektin, Peptidogyl- kan, Pullulan, Dextran, Dextrin, Maltodextrin, Maltotriose und Maltose, oder Cellulose, behandelte Cellulose, Cellulose Extrakt, Cellulose Derivat, Hemicellulose, Glukan, Cel- lobiose und Polylactose aufweist.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer für die pH- Steuerung oder Regelung Harnstoff, Gluten, Polyacrylamid, Polyamid (Poly-) Aminosäure, (Poly-) Glutaminsäure, (Poly-) Glutamat, (Poly-) Amine, Protein, Gelatine, deren Derivate, Poly-, Oligophosphate, zyklische Phosphate, Phytinsäure, Phytat oder Polylactide aufweist.
8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivitäten der Enzyme derart abgestimmt sind, dass die biochemische Reaktion einerseits durch das freigesetzte Edukt reaktions-limitiert ist und andererseits der pH-Wert in einem Bereich von + 1 ,0 pH-Einheiten, vorzugsweise + 0,5 pH-Einheiten, bevorzugt + 0,1 pH-Einheiten, besonders bevorzugt + 0,05 pH-Einheiten von einem pH-Sollwert gesteuert oder geregelt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das reaktions-limitierende Edukt Glucose ist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das reaktions-limitierende Edukt durch die hydrolytische Aktivität einer Amylase freigesetzt wird.
1 1. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das reaktions-limitierende Edukt durch die hydrolytische Aktivität einer Glucoamylase freigesetzt wird.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das pH-steuernde oder regelnde Enzym eine Peptidase, Amidase oder Protease ist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das pH-steuernde oder regelnde Enzym eine Urease ist.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das pH-steuernde oder regelnde Enzym eine Phosphatase ist.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das pH-steuernde oder regelnde Enzym eine Phytase ist.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine Enzym-Aktivität während der biochemischen Reaktion variiert wird.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Enzym auf Magnet-Kugeln immobilisiert ist, die Magnet-Kugeln durch ein von außen aufgeprägtes Magnetfeld zeitweise in und zeitweise aus der Reaktionslösung bewegt werden und somit die Enzym-Aktivität, die der Reaktionslösung zur Hydrolyse zur Verfügung steht, einstellbar ist.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Enzym auf einem beweglichen Element immobilisiert ist, welches mechanisch angetrieben zeitweise in und zeitweise aus der Reaktionslösung bewegt wird, und somit die Enzym-Aktivität, die der Reaktionslösung zur Verfügung steht, einstellbar ist.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Enzym durch elektromagnetische Strahlung, vorzugsweise durch UV- VIS Licht, in seiner Konformation verändert wird und dadurch reversibel aktivierbar und deaktivierbar ist und somit die Enzymaktivität, die der Reaktionslösung zur Verfügung steht, einstellbar ist.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Enzym an der Bioreaktorwand immobilisiert ist und dass die der Reaktionslösung zur Verfügung stehende Enzymaktivität durch den Benetzungsgrad des immobilisierten Enzym mit der Reaktionslösung an der Reaktorwand bestimmt wird, welcher durch die Rührerdrehzahl, die Schütteldrehzahl, den Neigungsgrad des Bioreaktors oder das Füllvolumen einstellbar ist.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwei Enzym- Aktivitäten während der biochemischen Reaktion variiert werden.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Freisetzungsraten für das reaktions-limitierende Edukt und die pH-aktive Substanz bezogen auf die elementaren Stoffzusammensetzungen im Verhältnis N/C von 0,02 bis 0,35 stehen.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die absolute Freisetzungsrate für das reaktions-limitierende Edukt, in Form einer Kohlenstoffquelle, im Bereich von 0,033 mmol/(L*h) bis 6.666 mmol/(L*h) Kohlenstoffquelle (bezogen auf 1 C-Atom) / Arbeitsvolumen / Reaktionszeit liegt.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die absolute Freisetzungsrate für das reaktions-limitierende Edukt oder die pH-aktive Substanz, in Form einer N-Quelle, im Bereich von 0,66 mmol/(L*h) bis 2333 mmol/(L*h) N- Quelle (bezogen auf 1 N-Atom) / Arbeitsvolumen / Reaktionszeit liegt.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die absolute Freisetzungsrate für das reaktions-limitierende Edukt oder die pH-aktive Substanz, in Form einer Phosphat-Quelle, im Bereich von 0,033 mmol/(L*h) bis 1200 mmol/(L*h) Phosphat-Quelle (bezogen auf 1 Phosphat-Atom) / Arbeitsvolumen / Reaktionszeit liegt.
26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, dass die absolute Freisetzungsrate für das reaktions-limitierende Edukt oder die pH-aktive Substanz, in Form einer Kalium-Quelle, im Bereich von 0,033 mmol/(L*h) bis 1200 mmol/(L*h) Kalium-Quelle (bezogen auf 1 Kalium-Atom) / Arbeitsvolumen / Reaktionszeit liegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der biochemischen Reaktion um eine Fedbatch-Fermentation mit Zellen handelt und das reaktions-limitierende Edukt ein wachstums-limitierender Nährstoff ist.
28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der biochemischen Reaktion um ein zell-freies Biosynthese-System handelt.
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