WO2011106963A1 - 一种n-(4-氨基丁基)-n-乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金及其制备方法和应用 - Google Patents

一种n-(4-氨基丁基)-n-乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金及其制备方法和应用 Download PDF

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ethylisoluminol
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chloroauric acid
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田大勇
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    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence

Definitions

  • the present invention relates to an N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized nanogold and its preparation, properties and applications. It belongs to the field of materials science and biochemistry. Background technique
  • Gold nanomaterials have unique, dimensionally related optical, thermal, electrical, magnetic, and chemical properties such as surface plasmon resonance absorption (SPR), Raman scattering (RS), catalytic activity, and biocompatibility. These properties make gold nanomaterials important applications in catalysis, biosensors, and biomedical applications. Numerous studies have shown that the properties of gold nanomaterials are strongly influenced by their morphology, size and surface composition. Therefore, the synthesis methods and properties of gold nanomaterials are of great significance for the basic theoretical research and practical application of nanomaterials.
  • SPR surface plasmon resonance absorption
  • RS Raman scattering
  • the functionalization of gold nanomaterials mainly includes two aspects of direction and content: one is to obtain gold nanomaterials with controllable morphology and size to adjust its SPR absorption properties and catalytic activity; the second is to existing gold nanometers.
  • the surface modification of the material allows the gold nanomaterial to have rich properties of its surface ligands such as fluorescent properties, redox properties, biological activity and electrochemical activity.
  • the surface of common gold nanoparticles is often inorganic ions and Protected by molecular layers, these protective molecules retain their optical, electrochemical or redox activities while stabilizing the nano-gold particles, thus modifying various optically or electrochemically active organic molecules or biomolecules to the nano
  • the surface of the material or doped into the interior of the nanomaterial is another effective way to obtain functionalized nanomaterials. Since the internal structure of the metal nanomaterial is relatively dense, the metal nanomaterial is mostly functionalized by a surface chemical modification method.
  • the special optical properties of nanoparticles contain a wealth of information about the energy level structure and surface state of nanoparticles, and have always been one of the focuses of nanoscience research.
  • the research on the optical properties of nanomaterials mainly includes surface plasmon resonance absorption, surface enhanced Raman scattering and photoluminescence.
  • Chemiluminescence is a kind of light emission phenomenon accompanied by chemical reaction. Unlike the above optical phenomenon, chemiluminescence does not require external light source excitation, and has the advantages of high sensitivity, wide linear range, small background noise, simple instrument, and low price. In recent years, the application of metallic nanomaterials in chemiluminescence has also become an important research topic. Although chemiluminescence of semiconductor quantum dots and direct and indirect chemiluminescence of metal nanomaterials have attracted the attention of researchers, current research mainly focuses on the direct participation of unmodified nanomaterials or participation in chemiluminescence under other conditions. The research work of modified or functionalized gold nanomaterials in chemiluminescence theory and analytical applications is rarely reported. 2005, Roux et al.
  • Luminol is then grafted onto the surface of the nanogold by a condensation reaction of -NH 2 of luminol and -COOH of dihydrolipoic acid. This process requires multiple steps of reaction, precipitation washing, vacuum distillation, filtration, dispersion, etc. to complete, which is very cumbersome and time consuming.
  • N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol is a derivative of luminol isomeric isoluminol having the chemical formula C 14 H 20 N 4 O 2 . It is a white powder at room temperature and is a relatively stable synthetic organic compound with better chemiluminescence properties than luminol. Since the aliphatic amine group in the molecule is easily attached to the label and maintains high luminous efficiency, it is suitable as a probe for bioanalysis.
  • N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol is substituted for luminol to obtain stable N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol functionalized nano Gold sol. Therefore, it is of great significance to explore the synthesis method, chemiluminescence properties of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol-functionalized nanogold and its application in bioanalysis. Summary of the invention
  • the object of the present invention is to provide N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized gold nanoparticles, a preparation method thereof and application in biological analysis, and the contents thereof include the following aspects:
  • the first is to provide a functionalized nanogold.
  • the functionalized nano gold is formed by linking gold nanoparticles and N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol, the N-(4-aminobutyl)-N-ethyliso Mino is attached to the surface of the gold nanoparticles by a covalent bond Au-N.
  • the functionalized nanogold has chemiluminescent properties.
  • the functionalized nanogold reacts with an oxidant to produce chemiluminescence.
  • the oxidizing agent includes, but is not limited to, H 2 O 2 O 2 CIO—I 2 IO 4 — MnO 4 .
  • the second method provides a method for preparing the above functionalized nano gold, comprising the following steps:
  • the molar concentration of the aqueous solution of chloroauric acid A may be 1-10 mmol/L, 1-6 mmol/L, 6-10 mmol/L, 6-8 mmol/L or 8-10 mmol/L;
  • the molar concentration of the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol aqueous solution may be 0.5-8.0 mmol/L, 0.5-4.0 mmol/L, 0.5-6.0 mmol/L, 4.0-6.0. Mmmol/L, 4.0-8.0 mmol/L or 6.0-8.0 mmol/L;
  • the molar concentration of the aqueous chloroauric acid B may be 1-10 mmol/L, 1-6 mmol/L or 6-10 mmol/L.
  • the ratio of the aqueous solution of chloroauric acid A, the aqueous solution of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol and the aqueous solution of chloroauric acid B is any of the following h 1 -h 10 Kind:
  • the amount of the chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid A is N-(4-aminobutyl) B in the aqueous solution of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol
  • the amount of the chloroauric acid in the aqueous solution of the chloroauric acid B is 4 times the amount of the lyophilic acid, and the amount of the chloroauric acid in the aqueous solution of the chloroauric acid B is N-(4-aminobutyl)-N- described in the step (1). 1 time of the amount of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in the aqueous solution of ethylisoluminol;
  • the amount of the chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid A is N-(4-aminobutyl) B in the aqueous solution of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol
  • the amount of the substance of the chloroauric acid in the aqueous solution of the chloroauric acid B is twice the amount of the substance of the basal luminol
  • the amount of the substance of the chloroauric acid in the aqueous solution of the chloroauric acid is the N-(4-aminobutyl)ethylisoglutamine described in the step (1). 3 times the amount of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in the aqueous solution;
  • the amount of the chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid A is N-(4-aminobutyl) in the aqueous solution of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol.
  • the amount of the substance of N-ethylisoluminol is N-(4-aminobutyl)-N described in the step (1) - 1.8 times the amount of the substance of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in the aqueous solution of ethylisoluminol; h4, the substance of chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid A
  • the amount is 2.3 times the amount of the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in the aqueous solution of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol
  • the amount of the chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid B is the N-(4-amino group in the a
  • the amount of the substance of N-ethylisoluminol, and the amount of the substance of chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid B is N-(4-aminobutyl)-N described in the step (1) - 2.1 times the amount of the substance of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in the aqueous solution of ethylisoluminol; h6, the substance of chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid A
  • the amount is 2.7 times the amount of the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in the aqueous solution of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol
  • the amount of the chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid B is the N-(4-amino group in the
  • the amount of the chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid A is N-(4-aminobutyl) in the aqueous solution of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol. 27/11 times the amount of the substance of N-ethylisoluminol, and the amount of the substance of chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid B is N-(4-aminobutyl) described in the step (1) 18-81 times the amount of N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol in the aqueous solution of -N-ethylisoluminol;
  • the amount of hlO, the substance of chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid A is N-(4-aminobutyl) in the aqueous solution of N-(4-carbobutyl)-N-ethylisoluminol
  • the amount of the substance of the -N-ethylisoluminol is 2.25 times, and the amount of the substance of the chloroauric acid in the aqueous solution of the chloroauric acid B is the N-(4-aminobutyl) group in the step (1).
  • the amount of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in the aqueous solution of N-ethylisoluminol is 1.5 times.
  • the method further comprises purifying the gold sol by centrifugation. A step of.
  • the functionalized nanogold can be centrifuged under the following conditions: The initially synthesized nanogold sol is centrifuged at 17120*g for 45 minutes, and then the precipitate is dissolved with distilled water or secondary water or ultrapure water.
  • the reaction temperature may be 15-35 ° C, such as 15-25 ° C, 15-30 ° C, 25-35 ° C or 25-30 ° C.
  • the reaction time of the above step (1) may be 2 hours or more, and the reaction time of the above step (2) may be 1.5 hours or more; N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol is simultaneously used as a synthesis process. Reducing agents and stabilizers.
  • the water used for preparing the aqueous solution of chloroauric acid A, the aqueous solution of chloroauric acid B and the aqueous solution of N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol has a resistivity of 1.0 MQ*cm or more; the water is selected from the group consisting of Said at least one of three kinds of water: secondary distilled water, purified water and ultrapure water.
  • the functionalized nano-gold prepared by the above method can be in the form of monodisperse spherical or spherical nano-gold assembled chain or spherical nano-gold assembled mesh, and the particle size can also be controlled. Its particle size is 10-30 nm. When the morphology is a chain of spherical nano gold assembled, the chain length is 400-500 nm.
  • the third is to provide a bioanalytical probe which is a complex formed by the above-described functionalized nanogold-labeled biomolecule.
  • the biomolecule is a protein or nucleic acid molecule.
  • the bioanalytical probe is an immunoassay probe or a nucleic acid analysis probe.
  • the method for preparing the immunoassay probe is the following method of A or B:
  • the protein molecule is directly linked to the functionalized nanogold.
  • the protein in the immunoassay probe is an antigen or an antibody.
  • the method for preparing the nucleic acid analysis probe is as follows:
  • the nucleic acid molecule in the nucleic acid analysis probe is DNA, RNA or aptamer. Compared with the prior art, the present invention has the following advantages:
  • N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol was used to reduce the synthesis of gold nanoparticles by chloroauric acid.
  • N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoru was synthesized.
  • Mino acts as both a reducing agent and a stabilizer, without the need to add other reagents.
  • This synthesis method is different from the literature 4 (Cui, H.; Wang, W.; Duan, C. R; Dong, YP; Guo, JZ Chem. Eur. J. 2007, 13, 6975) A synthetic method for the reduction of chloroauric acid by luminol.
  • the morphology and particle size of the nanogold synthesized by the present invention can be regulated by the amount of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol and chloroauric acid: 1) The amount of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol is obtained to obtain nano-gold with different morphologies; the amount of chloroauric acid in step (2) can be adjusted to obtain nano-gold of different particle sizes .
  • the nano gold obtained by the method is a luminescent functionalized nano gold having a surface-bonded luminescent reagent N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol, the luminescent functionalized nanometer.
  • Gold has excellent chemiluminescence properties. Its luminous efficiency is better than that reported in the literature (Cui, H.; Wang, W.; Duan, C. R; Dong, YP; Guo, JZ Chem. Eur. J. 2007, 13, 6975) Luminol luminescence functionalization Nano gold.
  • Functionalized nanogold is used as a luminescent marker to label biomolecules to construct bioanalytical probes.
  • the method for preparing the bioanalytical probe is simple, quick, easy to operate, and has good binding effect, and overcomes the existing defects of the luminescent reagent and the enzyme labeling technique, such as troublesome operation, time consuming, and high analysis cost.
  • Figure 1 N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescence synthesized by different concentrations of chloroauric acid and N-(4- ⁇ butyl)-N-ethylisoluminol Nano gold:
  • Figure 2 Electron micrographs of different particle sizes of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized gold prepared with different amounts of chloroauric acid, of which:
  • Figure 3 N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescence with different morphologies prepared by different amounts of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol Electron micrograph of nano gold, where:
  • Figure 4 N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized gold nanoparticles synthesized at different temperatures: A: 9 mL 6 mmol/L chloroauric acid + 5.0 mL 4 mmol/L N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol + 6 mL 6 mmol/L chloroauric acid at 15 ° C N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized nanogold prepared under the preparation;
  • Figure 5 Effect of double distilled water, purified water and ultrapure water on the synthesis of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized gold
  • C Cls spectrum of the functionalized gold nanoparticle prepared for N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol
  • D Nls spectrum of the functionalized gold nanoparticle prepared for N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol
  • FIG. 7 Ultraviolet-visible absorption spectrum of the prepared N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized gold nanoparticles, wherein:
  • A ultraviolet-visible absorption spectrum of pure N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol aqueous solution
  • Figure 9 Luminescent functionalized nanogold synthesized by pH-13 conditions N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol and literature (Cui, H.; Wang, W.; Duan, CF; Dong, YP; Guo, JZ Chem. Eur. J.
  • a schematic diagram of the luminescence of a synthetic luminol directly bonded luminescent functionalized nanogold wherein: A: 500 N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol-synthesized luminescent functionalized gold nanoparticles after centrifugation were re-injected into a chemiluminescence signal of a concentration of 0.1 mol/L H 2 2 2 solution. ;
  • Figure 10 Luminescence properties of immunological and nucleic acid analysis probes prepared based on N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized gold nanoparticles. detailed description
  • N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized nanogold obtained by the present invention, the preparation method of the luminescent functionalized nano gold, and the bioanalytical probe based on the luminescent functionalized nano gold.
  • the functionalized nanogold is formed by the attachment of gold nanoparticles and N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol, and the N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol is passed A covalent bond Au-N is attached to the surface of the gold nanoparticle.
  • the functionalized nanogold has chemiluminescent properties.
  • the functionalized nanogold reacts with the oxidant to produce chemiluminescence.
  • the oxidizing agents include, but are not limited to, H 2 O 2 , O 2 , CIO —, I 2 , IO 4 — MnO 4 ,
  • the present invention is exemplified by H 2 O 2 as an oxidizing agent.
  • reaction conditions a 0.1 mol / LH 2 0 2 solution was injected into the functionalized nano-gold sol by centrifuging; wherein, 3 ⁇ 40 2 solution of 400 ⁇ L, functionalized nanogold sol is 500 L.
  • the method for preparing the functionalized nano gold of the present invention comprises the following steps:
  • the amount of the chloroauric acid in the aqueous solution of the chloroauric acid B is the N-(4-aminobutyl) described in the step (1).
  • the amount of the substance of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in the aqueous solution of ethylisoluminol is 1-3 times.
  • the molar concentration of the aqueous solution of chloroauric acid A may be 1-10 mmol/L, 1-6 mmol/L, 6-10 mmol/L, 6-8 mmol/L or 8-10 mmol/L;
  • the molar concentration of the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol aqueous solution may be 0.5-8.0 mmol/L, 0.5-4.0 mmol/L, 0.5-6.0 mmol/L, 4.0-6.0. Mmmol/L, 4.0-8.0 mmol/L or 6.0-8.0 mmol/L;
  • the molar concentration of the aqueous chloroauric acid B may be 1-10 mmol/L, 1-6 mmol/L or 6-10 mmol/L.
  • the ratio of the aqueous solution of chloroauric acid A, the aqueous solution of N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol and the aqueous solution of chloroauric acid B is any one of the following hl-hl0:
  • the amount of the chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid A is N-(4-aminobutyl) in the aqueous solution of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol.
  • the amount of the substance of chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid A is the N-(4-aminobutyl)-N-B 2.7 times the amount of the substance of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in the aqueous solution of iso- luminol
  • the substance of chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid B Is the amount of the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in the aqueous solution of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol described in the step (1) 1.8 times; h4, the amount of the chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid A is N-(4-amino group in the aque
  • Base - 1.4 times the amount of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in the aqueous solution of -N-ethylisoluminol; h5, chlorine in aqueous solution A of chloroauric acid
  • the amount of the substance of the gold acid is the substance of the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in the aqueous solution of the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol.
  • the amount of the chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid B is N-(4-aminobutyl) in the aqueous solution of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol described in the step (1).
  • the amount of the substance of the -N-ethylisoluminol is 2.1 times; h6, the amount of the substance of the chloroauric acid in the aqueous solution of the chloroauric acid A is the N-(4-aminobutyl)-N - 2.7 times the amount of the substance of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in the aqueous solution of ethylisoluminol, and the amount of the substance of chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid B Is the amount of the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in the aqueous solution of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol described in the step (1) 2.4 times; h7, the amount of the chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid A
  • the amount of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in the aqueous solution of -N-ethylisoluminol is 2.7 times; h8, the aqueous solution of chloroauric acid
  • the amount of the substance of chloroauric acid in A is the substance of N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol in the aqueous solution of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol 3 times the amount of the chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid
  • B is the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol aqueous solution in the step (1) 2 times the amount of the substance of (4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol; h9, the amount of the substance of chloroauric acid in
  • the amount of the chloroauric acid in the aqueous solution of chloroauric acid A is N-(4-aminobutyl) in the aqueous solution of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol
  • the amount of the substance of the -N-ethylisoluminol is 2.25 times
  • the amount of the substance of the chloroauric acid in the aqueous solution of the chloroauric acid B is the N-(4-aminobutyl) group in the step (1).
  • the amount of the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in the aqueous solution of N-ethylisoluminol is 1.5 times.
  • the method for preparing the functionalized nano gold is characterized in that , using the following specific steps:
  • the method further comprises the step of purifying the gold sol by centrifugation, as follows: The initially synthesized nanogold sol was centrifuged at 17120 * g for 45 minutes, and then the precipitate was dissolved in double distilled water or purified water or ultrapure water.
  • the preparation method of the functionalized nano gold may have a reaction temperature of 15-35 ° C; the reaction time of the above step (1) or 1) is 2 hours or more, and the reaction time of the above step (2) or 2) is 1.5. More than an hour; N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol is used as both a reducing agent and a stabilizer in the synthesis process.
  • the water used for preparing the aqueous solution of chloroauric acid A, aqueous solution of chloroauric acid B and N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol is greater than or equal to 1.0 MQ*cm; It is selected from at least one of the following three types of water: secondary distilled water, purified water, and ultrapure water.
  • the functionalized nano gold may have a monodisperse spherical shape, a spherical nano gold assembled chain or a spherical nano gold assembled mesh, and the particle size is also controllable. Its particle size is 10-30 nm. When the morphology is in the form of a spherical nano-gold assembled chain, the chain length is 400-500 nm.
  • the particle size of the obtained luminescent functionalized gold is gradually increased; increasing the amount of N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol can respectively obtain monodisperse spherical or spherical nano-gold assembly.
  • the chain-like or globular nanogold assembly of the reticular luminescent functionalized nanogold is gradually increased.
  • the functionalized nano gold is characterized by the fact that the amount of the luminescent reagent, the amount of the chloroauric acid, and the luminescent experimental conditions are equivalent to those of the literature (Cui, H.; Wang, W.; Duan, C. R; Dong). , YP; Guo, JZ Chem. Eur. J. 2007, 13, 6975 ) Synthetic luminol directly bonded luminescent functionalized nano-gold light with high efficiency.
  • the biomolecule is a protein or nucleic acid molecule.
  • the bioanalytical probe is an immunoassay probe or a nucleic acid analysis probe.
  • the method for preparing the immunoassay probe is the following method of A or B:
  • the protein molecule is directly linked to the functionalized nanogold.
  • the protein in the immunoassay probe is an antigen or an antibody.
  • the preparation method A of the immunoassay probe comprises the following steps:
  • the preparation method B of the immunoassay probe comprises the following steps:
  • the method for preparing the nucleic acid analysis probe is the following method a or b:
  • the preparation method of the nucleic acid analysis probe a includes the following steps:
  • N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol obtained by the present invention is directly reduced to the nanogold sol of chloroauric acid by adding streptavidin to a final concentration of 25 g. /mL. After mixing well, it was incubated at room temperature for 30 minutes, and then 5% (w/w) of bovine serum albumin was added to the solution and stirred for 5 minutes to give a final concentration of 1%.
  • the preparation method b of the nucleic acid analysis probe comprises the following steps:
  • 0.05 mol/L pH 8.0 Tris-HCl buffer at 0.3 mol/L sodium chloride. That is, a functionalized nanogold nucleic acid analysis probe is obtained.
  • the nucleic acid molecule in the nucleic acid analysis probe is DNA, RNA or aptamer.
  • the contents of the present invention will be further described below with reference to Embodiments 1 to 9.
  • Example 1 Synthesis of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized gold nanoparticles of chloroauric acid and N-(4-aminobutyl)-N-ethylisolumina Effect of Concentration of Concentration 10 mL of 1.0 mmol/L aqueous solution of chloroauric acid (aqueous solution of chloroauric acid A) and 30 mL of ultrapure water (resistivity 18.2 MQ*cm) were stirred at 25 ° C, and 5 mL of 0.5 mmol/ was added.
  • the purification conditions were as follows: After 1 ml of the gold sol was centrifuged at 17120 * g for 45 minutes, the precipitate was dissolved with ultrapure water to obtain purified functionalized gold.
  • the results of electron microscopy analysis of the purified functionalized gold nanoparticles showed that the synthesized N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized gold nanoparticles showed a monodisperse spherical shape, as shown in the attached drawing. 1 A is shown.
  • the particle size of the monodisperse sphere is mainly 16 nm.
  • Stabilized N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized nanogold sol stored at 4 °C protected from light.
  • the gold sol was characterized by centrifugal microscopy for electron microscopy.
  • the purification conditions were as follows: After centrifuging 1 ml of the gold sol at 17120 * g for 45 minutes, the precipitate was dissolved with ultrapure water to obtain purified functionalized gold.
  • the results of electrophoresis analysis of the purified functionalized gold nanoparticles showed that the synthesized N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized gold was characterized by a spherical nano-gold assembled chain.
  • the particle size of the monodisperse sphere is mainly 18 nm.
  • 10 mL of 8 mmol/L aqueous solution of chloroauric acid (aqueous solution of chloroauric acid A) and 30 mL of ultrapure water (resistivity 18.2 MQ*cm) were stirred at 25 °C, and 8 mL of 5 mmol/L of N- was added.
  • (4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol aqueous solution was stirred for 2 hours, then 12 mL of 10 mmol/L aqueous solution of chloroauric acid (aqueous solution of chloroauric acid B) was added and stirring was continued for 1.5 hours.
  • the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol is a functionalized nanogold sol that is protected from light and stored at 4 °C.
  • the gold sol was characterized by centrifugal microscopy for electron microscopy.
  • the purification conditions were as follows: 1 ml of the gold sol was centrifuged at 17120 * g for 45 minutes, and then the precipitate was dissolved with ultrapure water to obtain purified functionalized gold. Electron microscopic analysis of the purified functionalized gold nanoparticles showed that the synthesized N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized gold was in the form of spherical nano-gold assembled mesh. 1 C is shown.
  • the particle size of the monodisperse sphere is mainly 10 nm.
  • the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol is a functionalized nanogold sol that is protected from light and stored at 4 °C.
  • the gold sol was characterized by centrifugal microscopy for electron microscopy.
  • the purification conditions were as follows: 1 ml of the gold sol was centrifuged at 17120 * g for 45 minutes, and then the precipitate was dissolved with ultrapure water to obtain purified functionalized gold. Electron microscopic analysis of the functionalized nanogold after purification showed that the synthesized N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol was synthesized.
  • the morphology of the photofunctionalized nanogold is in the form of a spherical nanogold assembled mesh, as shown in Figure 1D.
  • the particle size of the monodisperse sphere is mainly 9 nm.
  • aqueous solution of chloroauric acid A, aqueous chloroauric acid B and N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in this example were all obtained from ultrapure water (resistivity 18.2 MQ*cm) Formulated.
  • Example 2 Synthesis of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized gold. The effect of the amount of chloroauric acid on the particle size is 9 mL 6 mmol/L chlorogold.
  • aqueous acid solution aqueous solution of chloroauric acid A
  • 30 mL of ultrapure water resistivity 18.2 MQ*cm
  • 5 mL of 4 mmol/L N-(4-aminobutyl)-N- was added.
  • 6 mL of 6 mmol/L aqueous solution of chloroauric acid was further added and stirring was continued for 1.5 hours to obtain a stable N-(4-aminobutyl group.
  • -N-ethylisoluminol luminescent functionalized nanogold sol stored at 4 °C protected from light.
  • the gold sol was characterized by centrifugal microscopy for electron microscopy.
  • the purification conditions were as follows: 1 ml of the gold sol was centrifuged at 17120 * g for 45 minutes, and then the precipitate was dissolved with ultrapure water to obtain purified functionalized gold.
  • the results of electron microscopic analysis of the purified functionalized gold nanoparticles showed that the size of the synthesized N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized gold was mainly 18 nm, as shown in Fig. 2A. Show.
  • the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol is a functionalized nanogold sol that is protected from light and stored at 4 °C.
  • the gold sol was characterized by centrifugal microscopy for electron microscopy.
  • the purification conditions were as follows: 1 ml of the gold sol was centrifuged at 17120 * g for 45 minutes, and then the precipitate was dissolved with ultrapure water to obtain purified functionalized gold.
  • the results of electron microscopy analysis of the purified functionalized gold nanoparticles showed that the size of the synthesized N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized gold was mainly 30 nm, as shown in Figure 2D. Show.
  • aqueous solution of chloroauric acid A, aqueous chloroauric acid B and N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in this example were all obtained from ultrapure water (resistivity 18.2 MQ*cm) Formulated.
  • Example 3 Synthesis of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized gold in N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol Effect of the amount on the morphology 9 mL 6 mmol / L aqueous solution of chloroauric acid (aqueous solution of chloroauric acid A ) and 30 mL of ultrapure water (resistivity 18.2 MQ * cm ) were stirred at 25 ° C, added 4.5 mL 4 After stirring for 2 hours with mmol/L of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol solution, add 6 mL of 6 mmol/L aqueous solution of chloroauric acid (aqueous solution of chloroauric acid B).
  • the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol is a functionalized nanogold sol that is protected from light and stored at 4 °C.
  • the gold sol was characterized by centrifugal microscopy for electron microscopy.
  • the purification conditions were as follows: 1 ml of the gold sol was centrifuged at 17120 * g for 45 minutes, and then the precipitate was dissolved with ultrapure water to obtain purified functionalized gold.
  • Electron microscopic analysis of the purified functionalized gold nanoparticles showed that the synthesized N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized gold was characterized by spherical nano-gold assembled chains, spherical nano-gold particles.
  • the diameter is mainly 18 nm, and the chain length is 400-500 nm, as shown in Fig. 3B.
  • Electron microscopic analysis of the purified functionalized gold nanoparticles showed that the morphology of the synthesized N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized gold was a quasi-mesh composed of spherical nano-gold.
  • the gold nanospheres have a particle size of 11 nm, as shown in Fig. 3C. 9 mL of 6 mmol/L aqueous solution of chloroauric acid (aqueous solution of chloroauric acid A) and 30 mL of ultrapure water (resistivity 18.2 MQ*cm) were stirred at 25 °C, and 6 mL of 4 mmol/L of N- was added.
  • the purification conditions were as follows: 1 ml of the gold sol was centrifuged at 17120 * g for 45 minutes, and then the precipitate was dissolved with ultrapure water to obtain purified functionalized gold. Electron microscopic analysis of the functionalized gold nanoparticles after purification showed that the morphology of the synthesized N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized gold was a network of spherical nanogold assembled with gold nanospheres. The particle size is dominated by 12 nm, as shown in Figure 3D.
  • aqueous solution of chloroauric acid A, aqueous chloroauric acid B and N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in this example were all obtained from ultrapure water (resistivity 18.2 MQ*cm) Formulated.
  • Example 4 Effect of temperature on N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized gold synthesis 9 mL 6 mmol/L aqueous solution of chloroauric acid (aqueous solution A of chloroauric acid) and 30 mL Ultrapure water (resistivity 18.2 MQ*cm) was stirred at 15 ° C, and 5 mL of 4 mmol/L N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol aqueous solution was added and stirring was continued.
  • chloroauric acid aqueous solution A of chloroauric acid
  • Ultrapure water resistivity 18.2 MQ*cm
  • Electron microscopic analysis of the purified functionalized gold nanoparticles showed that the particle size of the synthesized N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized gold was mainly 13 nm, as shown in Fig. 4A. . 9 mL of 6 mmol/L aqueous solution of chloroauric acid (aqueous solution of chloroauric acid A) and 30 mL of ultrapure water (resistivity 18.2 MQ*cm) were stirred at 25 °C, and 5 mL of 4 mmol/L of N- was added.
  • the purification conditions were as follows: 1 ml of the gold sol was centrifuged at 17120 * g for 45 minutes, and then the precipitate was dissolved with ultrapure water to obtain purified functionalized gold. Electron microscopic analysis of the purified functionalized gold nanoparticles showed that the size of the synthesized N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized gold was mainly 18 nm, as shown in Fig. 4B. .
  • aqueous solution of chloroauric acid A, aqueous chloroauric acid B and N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in this example were all obtained from ultrapure water (resistivity 18.2 MQ*cm) Formulated.
  • Example 5 Effect of double distilled water, purified water and ultrapure water on the synthesis of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized gold nanoparticles 9 mL 6 mmol/L chlorogold
  • the aqueous acid solution aqueous solution of chloroauric acid A
  • 30 mL of double distilled water resistivity 1.0 MQ*cm
  • the purification conditions were as follows: 1 ml of the gold sol was centrifuged at 17120 * g for 45 minutes, and then the precipitate was dissolved with ultrapure water to obtain purified functionalized gold. Electron microscopic analysis of the purified functionalized gold nanoparticles showed that the particle size of the synthesized N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized gold was mainly 8 nm, as shown in Fig. 5. A is shown.
  • Aqueous solution of chloroauric acid A, aqueous solution of chloroauric acid B and N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol were prepared in double distilled water (resistivity 1.0 MQ*cm).
  • the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol is a functionalized nanogold sol that is protected from light and stored at 4 °C.
  • the gold sol was characterized by centrifugal microscopy for electron microscopy.
  • the purification conditions were as follows: 1 ml of the gold sol was centrifuged at 17120 * g for 45 minutes, and then the precipitate was dissolved with ultrapure water to obtain purified functionalized gold. Electron microscopic analysis of the purified functionalized gold showed that the particle size of the synthesized N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized gold was mainly 20 nm, as shown in Fig. 5B. .
  • Aqueous solution of chloroauric acid A, aqueous solution of chloroauric acid B and N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol were prepared in purified water (resistivity: 6.1 MQ*cm). 9 mL of 6 mmol/L aqueous solution of chloroauric acid (aqueous solution of chloroauric acid A) and 30 mL of ultrapure water (resistivity 18.2 MQ*cm) were stirred at 25 °C, and 5 mL of 4 mmol/L of N- was added.
  • the purification conditions were as follows: After centrifuging 1 ml of the gold sol at 17120 * g for 45 minutes, the precipitate was dissolved with ultrapure water to obtain purified functionalized gold. Electron microscopic analysis of the purified functionalized gold nanoparticles showed that the particle size of the synthesized N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized gold was mainly 18 nm, as shown in Fig. 5C. .
  • Aqueous solution of chloroauric acid A, aqueous solution of chloroauric acid B and N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol are all made of ultrapure water (resistance The rate was 18.2 MQ*cm).
  • Example 6 Characterization of luminescent functionalized gold obtained by direct reduction of chloroauric acid with N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol
  • Figure 6-7 shows N obtained under the following experimental conditions Characterization results of -(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized gold.
  • the gold sol of Fig. 1 b obtained in Example 1 was subjected to dialysis, salting out, two centrifugation-washing and dry purification.
  • the purification conditions are as follows: The dialysis process is to dialysis the synthesized gold sol at room temperature for 2 days, and the ultrapure water dialysate is changed every 8 hours, and the free N-(4-aminobutyl) can be sufficiently removed by dialysis operation.
  • the salting out process is a precipitate formed by adding NaCl to the gold sol to a final concentration of 0.5 mol/L of NaCl;
  • the second centrifugation-washing process is After the gold sol is centrifuged at 17120*g for 45 minutes after salting out, the precipitate is dissolved by ultrapure water; the drying process is performed by dialysis, salting out and centrifugation-washing of the nanogold sol. After being placed in an oven for 12 hours, the temperature was 40 °C.
  • Figure 6 is a pure sample of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol (N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol pure sample in TCI Tokyo Chemical Industry The company purchased, CAS No. 66612-29-1) and the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized nanogold sol of Figure 1b obtained in Example 1 was dialyzed. X-ray photoelectron spectroscopy of Au4f, C 1 s and N 1 s of gold nanoparticles after salting-out, two-centrifugation-washing and drying.
  • Figure 6 E shows the spin-orbit split of Au4f bimodal ( Au4f 7/2 and Au4f 5/2 ) divided into 3.7 ev, and literature (Ganesan, PG; Singh, AP; Ramanath, G. Appl. Phys. Lett , 2004, 85, 579. ) The reported zero-valent gold nanoparticles are consistent.
  • the Cls spectrum in a pure sample of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol comprises three components at 284.9, 286.0 and 287.3 ev, respectively.
  • the component of 284.9 ev is derived from a carbon atom on the aromatic ring of the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol molecule.
  • the 286.0 ev component is related to the carbon atoms on the aromatic ring and the fatty chain.
  • the component of ev is caused by a carbon atom (-CO-NH-) in the amide group.
  • Figure 6 C shows the Cls spectrum of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol-reduced gold nanoparticles.
  • Nls N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol pure sample contains 399.5 ev and 400.8 ev components, while N-(4-aminobutyl) B
  • Nls spectrum of the basic luminol luminescent functionalized gold nanoparticles also includes
  • N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol and its oxidation products both contain an amino nitrogen atom and the amide nitrogen atom is N-(4-aminobutyl)-N-ethylisolumina.
  • this result further supports the presence of gold nano-surfaces in N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol.
  • the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized nanogold of Fig. 1b obtained in Example 1 was characterized by ultraviolet-visible absorption light.
  • the small molecule solute is separated from the gold nanoparticles by multiple dialysis methods, and the ultraviolet-visible absorption light before and after dialysis is detected as shown in Fig. 7. Show.
  • the dialysis conditions are as follows: During the dialysis process, the gold sol is dialyzed at room temperature for 2 days, and the ultrapure water dialysate is changed every 8 hours.
  • the maximum absorption wavelength of the sol (530 nm) remains unchanged. This indicates that the dialysis process does not change the dispersion state and particle size of the gold nanoparticles. These results indicate centrifugation by dialysis, etc.
  • the method can effectively remove N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol from the sol and maintain the dispersibility and stability of the gold nanoparticles.
  • Example 3c and graphs synthesized in Example 3 3 d of 1 mL of different morphology of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized gold sol 17120 * g after centrifugation for 45 minutes with 500 ⁇ L of pH 13
  • the NaOH solution was dispersed and placed in a test cell, and then a 400-concentration solution of 0.1 mol/L 3 ⁇ 40 2 was injected, and the chemiluminescence kinetic curve was measured as shown in FIG.
  • the experimental results show that the luminescence intensity with the luminescent functionalized gold nanoparticles is monodisperse spherical, spherical nano-gold assembled chain, spherical nano-gold assembled quasi-mesh and spherical nano-gold assembled mesh (Fig. 8 AD )
  • the increase indicates that the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized nanogold synthesized by the present invention has good chemiluminescence properties.
  • Figure 9 is a graph showing the N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized gold nanoparticles of the present invention in the same amount as the luminescent reagent, the amount of chloroauric acid, and the luminescence experimental conditions (Cui, H.; Wang, W.; Duan, C. R; Dong, YP; Guo, JZ Chem. Eur. J. 2007, 13, 6975 ) Synthetic luminol directly bonded luminescent functionalized nano-gold light efficiency Comparison.
  • the experimental conditions were as follows: 500 g of the gold sol of FIG.
  • Example 1b and the luminol directly bonded luminescent functionalized nanoparticles obtained in Example 1 of the present invention after centrifugation with 0.1 mol/L of sodium hydroxide were placed.
  • the N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized gold nanoparticles of the present invention and the luminol directly bonded luminescent functionalized nanoparticles have a nanoparticle content of 0.3 mmol. /L
  • Chemiluminescence was detected by injecting a 400 ⁇ concentration of 0.1 mol/L H 2 O 2 solution.
  • Example 8 Preparation of N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol-based Functionalized Nanogold Immunoassay Probes
  • the preparation of the immunoassay probes may be as follows: two:
  • step B) adding streptavidin to the N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized nanogold sol obtained in step A) to a final concentration of 25 g/ mL. After mixing well, it was incubated at room temperature for 30 minutes, and then a 5 % (w/w) solution of bovine serum albumin was added thereto, and stirring was continued for 5 minutes to give a final concentration of bovine serum albumin of 1%.
  • step C) adding a terminal biotinylated antibody to the streptavidin-linked N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized nanogold obtained in step B) (Biotin-modified goat anti-human IgG) solution, incubated at 37 ° C for 30 minutes, centrifuged at 17120 * g for 30 minutes to remove unreacted reagents and weakly bound N-(4-aminobutyl group on the surface of gold nanoparticles -N-ethylisoluminol molecule, the resulting precipitate was dispersed in 250 0.1 mol/L pH 7.4 phosphate buffer containing 1% (w/w) of bovine serum albumin. That is, N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized nano Gold immunoassay probe.
  • Option 2 includes the following steps:
  • step b) 0.5 mL of 1.0 mg/mL antibody (goat anti-human IgG) was added to the N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol obtained in step a) with 0.1 mol/L sodium hydroxide The pH of the functionalized gold gel solution was adjusted to 8.0. After incubation for 30 minutes at room temperature, a 5% (w/w) solution of bovine serum albumin was added thereto, and stirring was continued for 5 minutes to obtain a final concentration of bovine serum albumin. 1 % ( w/w ).
  • Example 9 Preparation of nucleic acid analysis probe based on N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized gold nanoparticles
  • the preparation of the nucleic acid analysis probe can be as follows: Option II:
  • step (B) adding streptavidin to the N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized nanogold sol obtained in the step (A) to a final concentration of 25 g/ mL. After mixing uniformly, incubate at room temperature for 30 minutes, and then add 5% (w/w) of bovine serum albumin solution thereto, stirring constantly 5 Minutes, the final concentration of bovine serum albumin was 1% (w/w) and finally centrifuged at 17120 * g for 20 minutes to remove the unbound reagent and the weakly bound N-(4-aminobutyl)-N on the surface of the nano gold.
  • step (C) adding a terminal biotin-modified DNA solution to the streptavidin-linked N-(4-aminobutyl)ethylisoluminol luminescent functionalized nanogold obtained in the step (B) (The base sequence is GGGTTTATGAAAAACACTTT-biotin), incubated at 37 °C for 1 hour, and centrifuged at 17120 * g for 10 minutes to remove the unreacted reagent and the weakly bound N-(4-aminobutyl) surface of the nano gold surface.
  • aqueous solution of chloroauric acid A, aqueous chloroauric acid B and N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol in this example were all obtained from ultrapure water (resistivity 18.2 MQ*cm) Formulated.
  • Example 10 Luminescence characteristics of immunological and nucleic acid analysis probes based on N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized gold nanoparticles 1 mL of N prepared by the first embodiment of Example 8 -(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol luminescent functionalized nanogold sol-labeled immunoassay probe and N-(4-aminobutyl)-N-B prepared in Example 9

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Description

一种 N-(4-氨基丁基 N-乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金
及其制备方法和应用 本申请要求于 2010年 3月 3日提交中国专利局、申请号为 201010117687.9、 发明名称为 "一种 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金及其制 备方法和应用"的中国专利申请的优先权， 其全部内容通过引用结合在本申请 中。 技术械
本发明涉及一种 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金及其 制备、 性质和应用。 属于材料科学和生物化学领域。 背景技术
金纳米材料具有独特的、 与尺寸相关的光学、 热学、 电学、 磁学以及化学 等方面的性质， 如表面等离子体共振吸收（SPR )、 拉曼散射（RS )、 催化活性 和生物相容性， 这些特性使得金纳米材料在催化、 生物传感器、 生物医学等方 面具有重要的应用。 大量研究表明， 金纳米材料的性质受其形貌、 尺寸和表面 组成的强烈影响，因此金纳米材料的合成方法和性质研究对纳米材料的基础理 论研究及其实际应用都具有重要意义。
金纳米材料的功能化主要包括两个方面的方向和内容：其一是获得形貌和 大小可控的金纳米材料， 以调节其 SPR吸收性质和催化活性； 其二是对已有 的金纳米材料进行表面修饰，使得金纳米材料具有其表面配体的丰富性质， 如 荧光性质、 氧化还原性、 生物活性和电化学活性。
在各种形貌的金纳米颗粒的制备研究中，起步最早的是对球形金纳米粒子 的制备研究。现已能成功制备尺寸在几纳米至数百纳米范围内各种尺寸、分散 性好的球形金颗粒。 虽然金纳米颗粒的 SPR吸收会随着颗粒尺寸的变化有所 迁移， 但是迁移范围不大。 相比而言， 改变纳米颗粒的形貌是调节其 SPR特 性更有效的手段，以棒状或线状金纳米为典型代表的各向异性金纳米材料如纳 米片、 纳米花等独特可调的 SPR吸收性能是近年来该领域的研究热点。
在金纳米材料的表面修饰上，常见的金纳米粒子表面往往为无机离子和有 机分子层所保护，这些保护分子在稳定纳米金粒子的同时还能保持其自身的光 学、 电化学或氧化还原活性， 因此将各种具有光学、 电化学活性的有机分子或 生物分子修饰到纳米材料表面或掺杂到纳米材料内部也是获得功能化纳米材 料的另一种有效方式。 由于金属纳米材料内部结构较为致密， 因此对于金属纳 米材料多采用表面化学修饰的方法进行功能化。如利用金和硫之间的强相互作 用， 以硫醇分子作为金纳米粒子表面的配体以稳定纳米金粒子， 是近十年来制 备稳定的金纳米最有效的方法 （Brust, M.; Wallker, M.; Bethell, D. J. Chem. Soc.Chem. Commun., 1994, 801 )。
纳米粒子特殊的光学性质包含着有关纳米粒子能级结构和表面状态等的 丰富信息， 一直以来都是纳米科学研究的重点之一。 目前对于纳米材料光学性 质的研究主要包括表面等离子体共振吸收、表面增强拉曼散射和光致发光等光 学行为。
化学发光是伴随化学反应的一种光发射现象， 与以上光学现象不同，化学 发光不需要外界光源激发， 具有灵敏度高、 线性范围宽、 背景噪声小、 仪器简 单、 价格便宜等优点。 而近几年， 金属纳米材料在化学发光中的应用也已成为 一个重要的研究课题。尽管半导体量子点的化学发光、金属纳米材料直接和间 接参与的化学发光已经逐渐受到研究者的关注，但目前的研究主要集中于未修 饰的纳米材料直接参与、 或在其他条件诱导下参与化学发光， 改性或功能化金 纳米材料在化学发光理论及分析应用中的研究工作则鲜见报道。 2005年， Roux 等人 ( oux, S.; Garcia, Β·; Bridot, J. L.; Salom, Marquette, C. Langmuir. 2005, 21, 2526 ) 用二氢硫辛酸作为保护试剂， 硼氢化钠 （NaBH4 )还原氯金酸（氯金 酸.3H20 )合成了二氢疏辛酸保护的纳米金。 利用 1-乙基 -3- ( 3-二曱基氨丙基） -碳化二亚胺（EDC )和 N-羟基琥珀酰亚胺 （NHS ) 活化纳米金表面的二氢石克 辛酸的羧基， 然后通过鲁米诺的 -NH2和二氢硫辛酸的 -COOH进行缩合反应将 鲁米诺嫁接到纳米金的表面。 这个过程需要多步反应、 沉淀洗涤、 减压蒸馏、 过滤、 分散等多个步骤才能完成， 非常麻烦、 耗时。 研究结果表明通过二氢硫 辛酸键合到纳米金表面的鲁米诺仍具有较好电致化学发光活性。 2007 年， 本 课题组直接利用鲁米诺还原氯金酸一步合成得到了鲁米诺直接键合的纳米金 ( Cui, Η·; Wang, W.; Duan, C. R; Dong, Y. P.; Guo, J. Z. Chem. Eur. J. 2007, 13, 6975 ), 表征的结果显示鲁米诺以弱的 Au-N键直接连接到纳米金的表面。 通 过半胱氨酸桥联分子的静电相互作用，将该鲁米诺直接键合的纳米金组装到金 电极的表面， 发现该修饰电极在碱性溶液中具有电致化学发光活性且强度随 H2O2浓度的增加而增强， 就此发展了一个 H2O2电致化学发光传感器。
N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺是一种鲁米诺的异构体异鲁米诺的衍生 物， 化学式为 C14H20N4O2。 常温下是一种白色粉末， 是一种比较稳定的人工合 成的有机化合物， 其化学发光特性优于鲁米诺。 因为其分子中的脂肪胺基团容 易与被标记物相连接， 且保持高的发光效率， 所以适合直接作为生物分析的探 针。 因此， 直接利用 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺代替鲁米诺还原氯金酸 合成的纳米金有可能获得比鲁米诺直接键合的纳米金化学发光效率更高的发 光功能化的纳米金。 可是， 实验发现在鲁米诺还原氯金酸合成鲁米诺直接键合 的纳米金的条件下 （即将 100 mL 0.01 % ( w/w ) 的 HAuCl4水溶液加热至沸， 在冷凝回流并充分搅拌的条件下， 加入 1.5 - 2.0 mL含有 0.01 mol/L鲁米诺和 0.01 mol/L氢氧化钠的溶液， 保持沸腾并继续搅拌回流反应 30 min, 然后除去 加热源继续搅拌 15 min以上得到纳米金溶液。 ), 用 N-(4-氨基丁基) 乙基异 鲁米诺代替鲁米诺不能得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺功能化的 纳米金溶胶。 因此， 探索 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺功能化的纳米金的 合成方法、 化学发光特性及其在生物分析的应用具有重要的意义。 发明内容
本发明的目的是提供 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米 金及其制备方法和在生物分析中的应用， 其内容包括以下几个方面：
第一是提供一种功能化纳米金。 该功能化纳米金由金纳米粒子和 N-(4-氨 基丁基) -N-乙基异鲁米诺连接而成， 所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺通过 共价键 Au-N连接在所述金纳米粒子的表面。
所述功能化纳米金具有化学发光特性。所述功能化纳米金与氧化剂反应产 生化学发光。 所述氧化剂包括但不限于 H2O2 O2 CIO— I2 IO4— MnO4 第二是提供一种上述功能化纳米金的制备方法 , 包括如下步骤：
( 1 )将氯金酸水溶液 A与 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液在搅拌 状态下混合得到混合液；所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4- 氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质 的量的 2-4倍； .
( 2 )在搅拌状态下， 再将氯金酸水溶液 B加入步骤（ 1 )得到的混合液中， 继续搅拌至形成金溶胶，得到的金溶胶即为功能化纳米金； 所述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺水溶 液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 1-3倍。
所述氯金酸水溶液 A的摩尔浓度可为 1-10 mmol/L、 1-6 mmol/L、 6-10 mmol/L、 6-8 mmol/L或 8-10 mmol/L;
所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液的摩尔浓度可为 0.5-8.0 mmol/L, 0.5-4.0 mmol/L, 0.5-6.0 mmol/L、 4.0-6.0 mmol/L、 4.0-8.0 mmol/L或 6.0 -8.0 mmol/L;
所述氯金酸水溶液 B的摩尔浓度可为 1-10 mmol/L, 1-6 mmol/L或 6-10 mmol/L。
所述氯金酸水溶液 A、 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液和所述氯金 酸水溶液 B的配比为下述 h 1 -h 10中的任一种：
hi、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺的物廣的量的 4倍， 所述 氯金酸水溶液 B中氯金酸的物廢的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙基 异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 1倍；
h2、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺的物质的量的 2倍， 所述 氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) 乙基 异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 3倍；
h3、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.7倍， 所 述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（1 ) 中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 1.8倍； h4、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.3倍， 所 述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（1 ) 中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 1.4倍； h5、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.7倍， 所 述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（1 ) 中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.1倍； h6、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.7倍， 所 述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（1 ) 中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.4倍； h7、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.7倍， 所 述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（1 ) 中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-tt丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.7倍； h8、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺的物质的量的 3倍， 所述 氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) 乙基 异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2倍；
h9、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 27/11倍， 所述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺的物质的量的 18八 1 倍；
hlO、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氣基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.25倍， 所述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 1.5倍. 所述方法还包括将所述金溶胶通过离心进行纯化的步骤。
所述功能化纳米金可在如下条件下离心： 将初始合成的纳米金溶胶在 17120 * g下离心 45分钟， 然后将沉淀用蒸馏水或二次水或超纯水溶解。
所述功能化纳米金的制备方法中，其反应温度可以为 15-35°C，如 15-25°C、 15-30°C、 25-35 °C或 25-30°C。 上述步骤（1 ) 的反应时间可为 2小时以上， 上述步骤（2 ) 的反应时间可 为 1.5小时以上； N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺同时作为合成过程中的还原 剂和稳定剂。
配制所述氯金酸水溶液 A、 氯金酸水溶液 B和 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁 米诺水溶液所用的水的电阻率大于等于 1.0 MQ*cm; 所述水选自下述三种水中 的至少一种： 二次蒸馏水、 纯净水和超纯水。
上述方法制备的功能化纳米金， 其形貌可呈单分散球状、球状纳米金组装 的链状或球状纳米金组装的网状， 并且粒径大小也可控。 其粒径大小为 10-30 纳米。 其形貌呈球状纳米金组装的链状时， 链长为 400-500纳米。
第三是提供一种生物分析探针，是由上述的功能化纳米金标记生物分子形 成的复合物。
所述生物分子为蛋白质或核酸分子。
所述的生物分析探针为免疫分析探针或核酸分析探针。
所述免疫分析探针制备的方法为下述 A或 B的方法：
A、 将所述蛋白质分子端基修饰生物素， 然后与连接有链霉亲和素的功能 化纳米金相连接；
B、 将所述蛋白质分子直接与所述的功能化纳米金相连接。
所述免疫分析探针中所述蛋白质为抗原或抗体。
所述核酸分析探针制备的方法下述 a或 b的方法：
a、 将所述核酸分子端基修饰生物素， 然后与连接有链霉亲和素的功能化 纳米金相连接；
b、将所述核酸分子端基修饰巯基， 然后与所述的功能化的纳米金相连接。 所述的核酸分析探针中所述核酸分子为 DNA、 RNA或适配体。 与现有技术相比， 本发明具有如下的优点：
1.提供了一种新的纳米金的合成方法， 该法具有简单、 快速、 无需特殊条 件等优点。
2.首次采用 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺还原氯金酸合成纳米金，在合 成过程中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺同时作为还原剂和稳定剂，无需在加 入其他反应试剂。 此合成方法不同于文献 4艮道（ Cui, H.; Wang, W.; Duan, C. R; Dong, Y. P.; Guo, J. Z. Chem. Eur. J. 2007, 13, 6975 )的鲁米诺还原氯金酸的合成 方法。
3.本发明所合成的纳米金的形貌和粒径，可由 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁 米诺和氯金酸的用量来进行调控： 可以通过调节步骤（ 1 )中 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺的量得到不同形貌的纳米金； 可调节步骤（2 ) 中氯金酸的量得 到不同粒径的纳米金。
4.由该方法所得到的纳米金为发光功能化的纳米金，其表面键合有发光试 剂 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺，该发光功能化的纳米金具有优良的化学发 光特性。其发光效率优于文献报道的（ Cui, H.; Wang, W.; Duan, C. R; Dong, Y. P.; Guo, J. Z. Chem. Eur. J. 2007, 13, 6975 ) 鲁米诺发光功能化的纳米金。
5.将功能化的纳米金作为发光标记物标记生物分子， 可构建生物分析探 针。 制备该生物分析探针的方法简单、 快捷、 操作简便、 结合效杲好， 克服了 现有的以发光试剂和酶为标记物的标记技术操作麻烦、 费时、 分析成本高等重 要缺陷。 附图说明
图 1： 不同浓度的氯金酸和 N-(4- ^丁基) -N-乙基异鲁米诺合成的 N-(4-氨 基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金：
A: 1.0 mmol/L氯金酸 + 0.5 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺 + 1.0 mmol/L氯金酸， 得到呈单分散球状的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发光 功能化纳米金；
B: 6 mmol/L氯金酸 + 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺 + 6 mmol/L氯金酸， 得到呈球状纳米金组装的链状的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁 米诺发光功能化纳米金；
C: 8 mmol/L氯金酸 + 5 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺 + 10 mmol/L氯金酸， 得到呈球状纳米金組装的网状的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁 米诺发光功能化纳米金；
D: 10 mmol/L氯金酸 + 8 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺 + 6 mmol/L氯金酸， 得到呈球状纳米金组装的网状的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁 米诺发光功能化纳米金； 图 2: 不同氯金酸的用量制备的不同粒径的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米 诺发光功能化纳米金的电镜照片， 其中：
A: 9 mL 6 mmol/L氯金酸+ 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁 米诺十 6 mL 6 mmol/L氯金酸制备的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能 化纳米金， 其粒径为 18 nm;
B: 9 mL 6 mmol/L氯金酸十 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米 诺 + 7 mL 6 mmol/L氯金酸制备的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化 纳米金， 其粒径为 22 nm;
C: 9 mL 6 mmol/L氯金酸+ 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米 诺 十 8 mL 6 mmol/L氯金酸制备的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化 纳米金， 其粒径为 25 nm;
D: 9 mL 6 mmol/L氯金酸 + 5 mL 4 mmol/L的 N-(4- ^丁基) -N-乙基异鲁 米诺十 9 mL 6 mmol/L氯金酸制备的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能 化纳米金， 其粒径为 30 nm;
图 3： 不同 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的用量制备的不同形貌的 N-(4- 氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金的电镜照片， 其中：
A: 9 mL 6 mmol/L氯金酸 + 4.5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁 米诺 + 6 mL 6 mmol/L氯金酸制备的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能 化纳米金呈单分散球状；
B: 9 mL 6 mmol/L氯金酸十 5.0 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁 米诺十 6 mL 6 mmol/L氯金酸制备的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能 化纳米金呈球状纳米金组装的链状；
C: 9 mL 6 mmol/L氯金酸 + 5.5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁 米诺十 6 mL 6 mmol/L氯金酸制备的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能 化纳米金呈球状纳米金组装的准网状；
D: 9 mL 6 mmol/L氯金酸十 6 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁 米诺 + 6 mL 6 mmol/L氯金酸制备的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能 化纳米金呈球状纳米金组装的网状；
图 4: 不同温度下合成的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米 金： A: 9 mL 6 mmol/L氯金酸 + 5.0 mL 4 mmol/L N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米 诺 + 6 mL 6 mmol/L氯金酸在 15°C下制备的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发 光功能化纳米金；
B: 9 mL 6 mmol/L氯金酸 + 5.0 mL 4 mmol/LN-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米 诺 + 6 mL 6 mmol/L氯金酸在 25°C下制备的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发 光功能化纳米金；
C: 9 mL 6 mmol/L氯金酸 + 5.0 mL 4 mmol/L N-(4-tt丁基) -N-乙基异鲁米 诺 + 6 mL 6 mmol/L氯金酸在 30°C下制备的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发 光功能化纳米金；
D: 9 mL 6 mmol/L氯金酸 + 5.0 mL 4 mmol/L N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米 诺 + 6 mL 6 mmol/L氯金酸在 35°C下制备的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发 光功能化纳米金；
图 5: 二次蒸馏水、 纯净水和超纯水对合成的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁 米诺发光功能化纳米金的影响：
A: 9 mL 6 mmol/L氯金酸 + 5.0 mL 4 mmol/L N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米 诺 + 6 mL 6 mmol/L氯金酸 + 30.0 mL的二次蒸馏水在 25°C下制备的 N-(4-氨基 丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金；
B: 9 mL 6 mmol/L氯金酸 + 5.0 mL 4 mmol/L N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米 诺 + 6 mL 6 mmol/L氯金酸 + 30.0 mL的纯净水在 25°C下制备的 N-(4-氨基丁 基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金；
C: 9 mL 6 mmol/L氯金酸 + 5.0 mL 4 mmol/L N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米 诺 + 6 mL 6 mmol/L氯金酸 + 30.0 mL的超纯水在 25°C下制备的 N-(4-氨基丁 基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金；
图 6: 制备的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发光功能化纳米金粒子的 X 射线电子能谱图与 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺纯样的 X射线电子能谱图， 其中：
A: 为 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺纯样中的 Cls能谱；
B: 为 N-(4-tt丁基) -N-乙基异鲁米诺纯样中的 Nls能谱；
C: 为制备的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金的 Cls能 谱； D: 为制备的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金的 Nls能 谱；
E: 为制备的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金的 Au4f能 谱；
图 7: 制备的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发光功能化纳米金粒子的紫 外 -可见吸收光谱图， 其中：
A: 纯 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液的紫外-可见吸收光谱；
B:初始 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米的紫夕卜可见吸收 光谱；
C:透析后的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发光功能化纳米溶液的紫夕卜 可见吸收光谱；
D:透析 -离心 -干燥后水分散-盐析-沉淀再溶解后的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基 异鲁米诺发光功能化纳米溶液紫外-可见吸收光谱；
E: 透析-离心-干燥后水分散 -盐析 -上清液的紫外-可见吸收光谱； 图 8： 不同形貌 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金的化 学发光曲线（实验条件： 制备的发光功能化纳米金粒子离心后的沉淀用 pH=13 的 NaOH溶液进行分散放入检测池中， 再注入浓度为 0.1 mol/L H202溶液）， 其 中：
A: 9 mL 6 mmol/L氯金酸+ 4.5 mL 的 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基 异鲁米诺 + 6 mL 6 mmol/L氯金酸；
B: 9 mL 6 mmol/L氯金酸十 5.0 mL 的 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异 鲁米诺 + 6 mL 6 mmol/L氯金酸；
C: 9 mL 6 mmol/L氯金酸 + 5.5 mL 的 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异 鲁米诺 + 6 mL 6 mmol/L氯金酸；
D: 9 mL 6 mmol/L氯金酸+ 6.0 mL 的 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基 异鲁米诺十 6 mL 6 mmol/L氯金酸；
图 9: pH=13条件 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺合成的发光功能化纳米 金和文献 ( Cui, H.; Wang, W.; Duan, C. F.; Dong, Y. P.; Guo, J. Z. Chem. Eur. J. 2007, 13, 6975 )合成的鲁米诺直接键合的发光功能化纳米金的发光比较示意 图， 其中： A: 500 经离心分离后的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺合成的发光功 能化纳米金再注入 400 浓度为 0.1 mol/L H202溶液的化学发光信号；
B: 500 经离心分离后的鲁米诺合成的发光功能化纳米金再注入 400 μ 浓度为 0.1 mol/L H2O2溶液的化学发光信号；
图 10:基于 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发光功能化纳米金制备的免疫 和核酸分析探针的发光特性。 具体实施方式
下面对本发明得到的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发光功能化纳米金、 该发光功能化的纳米金的制备方法以及基于该发光功能化的纳米金的生物分 析探针的具体实施方式进行详细描述。
1. 本发明的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发光功能化纳米金。
该功能化纳米金由金纳米粒子和 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺连接而 成，所述 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺通过共价键 Au-N连接在所述金纳米 粒子的表面。
所述功能化纳米金具有化学发光特性。 所述功能化纳米金与氧化剂反应产 生化学发光。
根据文献 ( U. Isacsson, G. Wettermark, Anal. Chim. Acta. 1974. 68. 339. ),所 述氧化剂包括但不限于 H2O2、 O2、 CIO—、 I2、 IO4—、 MnO4 , 本发明以 H2O2 作为氧化剂为例。
所述功能化纳米金与 H2O2反应产生化学发光；其反应条件为：将 0.1 mol/L H202溶液注入到经离心分离后的功能化纳米金溶胶中；其中， ¾02溶液为 400 μL, 功能化纳米金溶胶为 500 L。
2. 本发明的功能化纳米金的制备方法， 包括如下步骤：
( 1 )将氯金酸水溶液 A与 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液在搅拌 状态下混合得到混合液； 所述氯金酸水溶液 A 中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的 物质的量的 2-4倍； .
( 2 )在搅拌状态下， 再将氯金酸水溶液 B 加入步骤（ 1 )得到的混合液 中， 继续搅拌至形成金溶胶， 得到的金溶胶即为功能化纳米金； 所述氯金酸水 溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米 诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 1-3倍。
所述氯金酸水溶液 A的摩尔浓度可为 1-10 mmol/L、 1-6 mmol/L、 6-10 mmol/L、 6-8 mmol/L或 8-10 mmol/L;
所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液的摩尔浓度可为 0.5-8.0 mmol/L, 0.5-4.0 mmol/L, 0.5-6.0 mmol/L、 4.0-6.0mmol/L、 4.0-8.0 mmol/L或 6.0-8.0 mmol/L;
所述氯金酸水溶液 B的摩尔浓度可为 1-10 mmol/L, 1-6 mmol/L或 6-10 mmol/L。
所述氯金酸水溶液 A、 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺水溶液和所述氯金 酸水溶液 B的配比为下述 hl-hl0中的任一种：
hi、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 4倍， 所述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 1倍； h2、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺的物质的量的 2倍， 所述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 3倍； h3、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.7倍， 所述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 1.8倍； h4、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.3倍， 所述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 1.4倍； h5、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.7倍， 所述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.1倍； h6、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.7倍， 所述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.4倍； h7、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.7倍， 所述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.7倍； h8、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺的物质的量的 3倍， 所述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2倍； h9、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 27/11 倍， 所述氯金酸水溶液 B 中氯金酸的物廢的量是步骤（1 ) 中所述 N-(4-tt 丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量 的 18/11倍；
hi 0、所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.25倍， 所述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 1.5倍. 所述的功能化纳米金的制备方法， 其特征在于， 釆用了如下具体步骤：
1 )将 9 mL 6.0 mmol/L氯金酸水溶液 A与 30 mL水在搅拌状态下混合， 然后加入 4.5-6 mL浓度为 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺水溶 液后持续搅拌；
2 )在搅拌状态下， 再将 6-9 mL 6.0 mmol/L氯金酸水溶液 B加入 1 )得到 的溶液中， 继续搅拌至形成金溶胶。
所述方法还包括将所述金溶胶通过离心进行纯化的步骤，具体如下： 将初 始合成的纳米金溶胶在 17120 * g下离心 45分钟，然后将沉淀用二次蒸馏水或 纯净水或超纯水溶解。
所述功能化纳米金的制备方法，其反应温度可以为 15-35°C ;上述步骤（ 1 ) 或 1 ) 的反应时间为 2小时以上， 上述步骤（2 )或 2 ) 的反应时间为 1.5小时 以上； N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺同时作为合成过程中的还原剂和稳定 剂。
配制所述氯金酸水溶液 A、 氯金酸水溶液 B和 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异 鲁米诺水溶液所用的水的电阻率大于等于 1.0 MQ*cm;所述水选自下述三种水 中的至少一种： 二次蒸镏水、 純净水和超纯水。
所述的功能化纳米金， 其形貌可呈单分散球状、 球状纳米金组装的链状或 球状纳米金组装的网状， 并且粒径大小也可控。 其粒径大小为 10-30纳米。 其 形貌呈球状纳米金组装的链状时， 链长为 400-500纳米。
增加氯金酸的量，所得到的发光功能化纳米金的粒径逐渐增加；增加 N-(4- 氨基丁基) 乙基异鲁米诺的量可以分别得到单分散球状、 球状纳米金组装的 链状或球状纳米金组装的网状的发光功能化的纳米金。
所述的功能化纳米金， 其特征在于， 在发光试剂用量、 氯金酸用量和发光 实验条件等同的情况下要比文献（ Cui, H.; Wang, W.; Duan, C. R; Dong, Y. P.; Guo, J. Z. Chem. Eur. J. 2007, 13, 6975 )合成的鲁米诺直接键合的发光功能化纳 米金发光效率高。
3. 基于功能化纳米金的一种生物分析探针，是由上述的功能化纳米金标记 生物分子形成的。
所述生物分子为蛋白质或核酸分子。
所述的生物分析探针为免疫分析探针或核酸分析探针。
所述免疫分析探针制备的方法为下述 A或 B的方法：
A、 将所述蛋白质分子端基修饰生物素， 然后与连接有链霉亲和素的功能 化纳米金相连接；
B、 将所述蛋白质分子直接与所述的功能化纳米金相连接。
所述免疫分析探针中所述蛋白质为抗原或抗体。
所述免疫分析探针的制备方法 A， 包括如下步骤：
A )将本发明所得到的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺直接还原氯金酸的 纳米金溶胶中加入链霉亲和素， 使其终浓度为 25 g/mL。 混合均匀后在室温下 培育 30分钟， 再把 5 % ( w/w ) 的牛血清白蛋白加到溶液中不断搅拌 5分钟， 使 其最终浓度为 1 %。 最后在 17120 * g下离心 20分钟， 以除去未反应试剂和纳米 金表面弱结合的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺分子， 然后将沉淀用含有 1 % ( w/w )的牛血清白蛋白的 0.1 mol/L pH=7.4磷酸盐緩冲液溶解， 得到连接链霉 亲和素的功能化纳米金；
B )在步骤 A ) 中所得的连接链霉亲和素的功能化的纳米金中加入端基经 生物素修饰的抗体或抗原溶液， 在 37 °C下孵育 30分钟， 在 17120 * g下离心 30分钟， 以除去未反应试剂和纳米金表面弱结合的 N-(4-氨基丁基) 乙基异 鲁米诺分子， 将所得沉淀分散于 250 含有 1 % ( w/w ) 的牛血清白蛋白的 0.1 mol/L pH=7.4磷酸盐緩冲液溶解。 即得到功能化纳米金免疫分析探针。
所述免疫分析探针的制备方法 B, 包括如下步骤：
将 0.5 mL的 1.0 mg/mL抗体或抗原分子加到用 0.1 mol/L的氢氧化钠将 pH 调至 8.0的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺直接还原氯金酸所得到的金胶溶液 中去， 在室温培育 30分钟后， 再把 5 % ( w/w )的牛血清白蛋白加到溶液中不 断搅拌 5分钟，使其最终浓度为 1 % ( w/w )。最后在 17120 * g下离心 30分钟， 以除去未反应试剂和纳米金表面弱结合的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺分 子， 然后将沉淀用含有 1 % ( w/w ) 的牛血清白蛋白的 0.1 mol/L pH=7.4磷酸 盐緩冲液溶解， 即得到功能化的纳米金免疫分析探针。
所述核酸分析探针制备的方法为下述 a或 b的方法：
a、 将所述核酸分子端基修饰生物素， 然后与连接有链霉亲和素的功能化 纳米金相连接；
b、将所述核酸分子端基修饰巯基， 然后与所述的功能化的纳米金相连接。 所述核酸分析探针的制备方法 a， 包括如下步骤：
ql ) 将本发明所得到的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺直接还原氯金酸 的纳米金溶胶中加入链霉亲和素， 使其终浓度为 25 g/mL。 混合均匀后在室 温下培育 30分钟， 再把 5 % ( w/w ) 的牛血清白蛋白加到溶液中不断搅拌 5 分钟， 使其最终浓度为 1 %。 最后在 17120 * g下离心 20分钟， 以除去未反应 试剂和纳米金表面弱结合的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺分子， 然后将沉 淀用含有 0.3 mol/L的氯化钠的 0.05 mol/L pH=8.0 Tris-HCl緩冲液分散， 得到 连接链霉亲和素的功能化的纳米金；
q2 ) 在步骤 ql ) 中所得的连接链霉亲和素的功能化的纳米金中加入端基 经生物素修饰的核酸溶液， 在 37 °C下孵育 1小时， 在 17120 * g下离心 10分 钟， 以除去未反应试剂和纳米金表面弱结合的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米 诺分子， 将所得沉淀分散于 250 μ 含有 0.3 mol/L 的氯化钠的 0.05 mol/L pH=8.0 Tris-HCl緩冲液。 即得到功能化的纳米金核酸分析探针。
所述核酸分析探针的制备方法 b , 包括如下步骤：
将功能化的纳米金中加入端基经巯基修饰的核酸溶液， 再慢慢加入含有 1 mol/L氯化钠的 0.1 mol/L pH=7.4磷酸盐緩冲液继续反应 40小时。然后在室温 下孵育 24小时， 在 17120 * g下离心 20分钟， 以除去未反应试剂和纳米金表 面弱结合的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺分子， 将所得沉淀分散于 0.3 mol/L的氯化钠的 0.05 mol/L pH=8.0 Tris-HCl緩冲液。 即得到功能化的纳米金 核酸分析探针。
所述的核酸分析探针中所述核酸分子为 DNA、 RNA或适配体。 下面以实施例 1至实施例 9进一步说明本发明专利的内容。 实施例 1 :合成 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金中氯金酸和 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺浓度的影响 将 10 mL 1.0 mmol/L氯金酸水溶液（氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水 (电阻率为 18.2 MQ*cm )在 25°C下搅拌， 加入 5 mL 0.5 mmol/L的 N-(4-#^ 丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后， 再加入 2.5 mL 1.0 mmol/L 氯金酸水溶液（氯金酸水溶液 B ) 继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨 基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所 述金溶胶通过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml 所述金溶胶在 17120 * g下离心 45分钟后,再用超纯水将沉淀物溶解，得到纯化的功能化纳米 金。 纯化后的功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺发光功能化的纳米金的形貌呈单分散球型， 如附图 1 A所示。 单分 散球的粒径大小以 16纳米为主。 将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液 (氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 25 °C下搅拌，加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后，再加入 6 mL 6 mmol/L氯金酸水溶 液（氯金酸水溶液 B )继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金溶胶通 过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离 心 45 分钟后， 再用超纯水将沉淀物溶解， 得到纯化的功能化纳米金。 纯化后 的功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺 发光功能化的纳米金的形貌呈球状纳米金组装的链状， 如附图 1 B所示。 单分 散球的粒径大小以 18纳米为主。 将 10 mL 8 mmol/L氯金酸水溶液 (氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 25 °C下搅拌，加入 8 mL 5 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后， 再加入 12 mLlO mmol/L氯金酸水 溶液（氯金酸水溶液 B )继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金溶胶通 过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离 心 45分钟后,再用超纯水将沉淀物溶解， 得到纯化的功能化纳米金。 纯化后的 功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发 光功能化的纳米金的形貌呈球状纳米金组装的网状， 如附图 1 C所示。 单分散 球的粒径大小以 10纳米为主。
将 15 mLlO mmol/L氯金酸水溶液（氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 25 °C下搅拌，加入 8 mL 8 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后， 再加入 15 mL 6 mmol/L氯金酸水 溶液（氯金酸水溶液 B )继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金溶胶通 过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离 心 45分钟后,再用超纯水将沉淀物溶解， 得到纯化的功能化纳米金。 纯化后的 功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发 光功能化的纳米金的形貌呈球状纳米金组装的网状， 如附图 1 D所示。 单分散 球的粒径大小以 9纳米为主。
该实施例中的氯金酸水溶液 A、 氯金酸水溶液 B和 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液均由超純水（电阻率为 18.2 MQ*cm ) 配制。 实施例 2: N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金的合成方法中氯 金酸的用量对粒径的影响 将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液 (氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 25 V下搅拌，加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后，再加入 6 mL 6 mmol/L氯金酸水溶 液（氯金酸水溶液 B )继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金溶胶通 过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离 心 45分钟后,再用超纯水将沉淀物溶解， 得到纯化的功能化纳米金。 纯化后的 功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发 光功能化纳米金的粒径大小以 18纳米为主， 如附图 2 A所示。 将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液 (氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 25 °C下搅拌，加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后，再加入 7 mL 6 mmol/L氯金酸水溶 液（氯金酸水溶液 B ) 继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金溶胶通 过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离 心 45分钟后,再用超纯水将沉淀物溶解， 得到纯化的功能化纳米金。 纯化后的 功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发 光功能化纳米金的粒径大小以 22纳米为主， 如附图 2 B所示。 将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液 (氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 25 V下搅拌，加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后，再加入 8 mL 6 mmol/L氯金酸水溶 液（氯金酸水溶液 B )继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金溶胶通 过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离 心 45分钟后,再用超纯水将沉淀物溶解， 得到纯化的功能化纳米金。 纯化后的 功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发 光功能化纳米金的粒径大小以 25纳米为主， 如附图 2 C所示。 将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液 (氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 25 V下搅拌，加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后，再加入 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶 液（氯金酸水溶液 B )继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金溶胶通 过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离 心 45分钟后,再用超纯水将沉淀物溶解， 得到纯化的功能化纳米金。 纯化后的 功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发 光功能化纳米金的粒径大小以 30纳米为主， 如附图 2 D所示。
该实施例中的氯金酸水溶液 A、 氯金酸水溶液 B和 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液均由超純水（电阻率为 18.2 MQ*cm ) 配制。 实施例 3 : N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金的合成方法中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的量对形貌的影响 将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液 (氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 25 °C下搅拌， 加入 4.5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁 基) -N-乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后， 再加入 6 mL 6 mmol/L氯金 酸水溶液（氯金酸水溶液 B ) 继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁 基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金 溶胶通过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离心 45分钟后,再用超纯水将沉淀物溶解， 得到纯化的功能化纳米金。 純 化后的功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁 米诺发光功能化纳米金的形貌呈单分散球型， 粒径大小以 11纳米为主， 如附 图 3 A所示。
将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液 (氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 25 V下搅拌，加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后，再加入 6 mL 6 mmol/L氯金酸水溶 液（氯金酸水溶液 B )继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金溶胶通 过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离 心 45分钟后,再用超纯水将沉淀物溶解， 得到纯化的功能化纳米金。 纯化后的 功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发 光功能化纳米金的形貌呈球状纳米金组装的链状， 球状纳米金粒径以 18纳米 为主， 其链长为 400-500纳米， 如附图 3 B所示。 将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液 (氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 25 °C下搅拌， 加入 5.5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁 基) -N-乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后， 再加入 6 mL 6 mmol/L氯金 酸水溶液（氯金酸水溶液 B ) 继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁 基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金 溶胶通过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离心 45分钟后,再用超纯水将沉淀物溶解， 得到纯化的功能化纳米金。 纯 化后的功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁 米诺发光功能化纳米金的形貌为由球状纳米金组装的准网状，金纳米球粒径以 11纳米为主， 如附图 3 C所示。 将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液（氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 25 °C下搅拌，加入 6 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2 小时后 ,再加入 6 mL 6 mmol/L氯金酸水溶 液（氯金酸水溶液 B )继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金溶胶通 过离心純化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离 心 45分钟后,再用超纯水将沉淀物溶解， 得到纯化的功能化纳米金。 纯化后的 功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发 光功能化纳米金的形貌为由球状纳米金组装的网状， 金纳米球粒径以 12纳米 为主， 如附图 3 D所示。
该实施例中的氯金酸水溶液 A、 氯金酸水溶液 B和 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液均由超纯水（电阻率为 18.2 MQ*cm ) 配制。 实施例 4:温度对 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发光功能化纳米金合成的影 响 将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液 (氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 15°C下搅拌，加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后，再加入 6 mL 6 mmol/L氯金酸水溶 液（氯金酸水溶液 B )继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金溶胶通 过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离 心 45分钟后,再用超纯水将沉淀物溶解， 得到纯化的功能化纳米金。 纯化后的 功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发 光功能化纳米金的粒径以 13纳米为主， 如附图 4 A所示。 将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液（氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 25 °C下搅拌，加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后，再加入 6 mL 6 mmol/L氯金酸水溶 液（氯金酸水溶液 B ) 继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金溶胶通 过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离 心 45分钟后,再用超纯水将沉淀物溶解， 得到纯化的功能化纳米金。 纯化后的 功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发 光功能化纳米金的粒径以 18纳米为主， 如附图 4 B所示。 将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液 (氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 30°C下搅拌，加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后，再加入 6 mL 6 mmol/L氯金酸水溶 液（氯金酸水溶液 B )继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金溶胶通 过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离 心 45分钟后,再用超纯水将沉淀物溶解， 得到纯化的功能化纳米金。 纯化后的 功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发 光功能化纳米金的粒径以 8纳米为主， 如附图 4 C所示。 将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液 (氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 35 °C下搅拌，加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后，再加入 6 mL 6 mmol/L氯金酸水溶 液（氯金酸水溶液 B )继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金溶胶通 过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离 心 45分钟后,再用超纯水将沉淀物溶解， 得到纯化的功能化纳米金。 纯化后的 功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发 光功能化纳米金的粒径以 10纳米为主， 如附图 4 D所示。
该实施例中的氯金酸水溶液 A、 氯金酸水溶液 B和 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液均由超純水（电阻率为 18.2 MQ*cm ) 配制。 实施例 5: 二次蒸馏水、 纯净水和超純水对 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发 光功能化纳米金合成的影响 将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液（氯金酸水溶液 A )和 30 mL二次蒸馏水 (电阻率为 1.0 MQ*cm )在 25°C下搅拌， 加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁 基) -N-乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后， 再加入 6 mL 6 mmol/L氯金 酸水溶液（氯金酸水溶液 B ) 继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁 基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金 溶胶通过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离心 45分钟后,再用超純水将沉淀物溶解， 得到純化的功能化纳米金。 純 化后的功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁 米诺发光功能化纳米金的粒径以 8纳米为主， 如附图 5 A所示。 氯金酸水溶液 A、氯金酸水溶液 B和 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液均用二次蒸馏水 (电阻率为 1.0 MQ*cm ) 配制。 将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液 (氯金酸水溶液 A )和 30 mL纯净水（电 阻率为 6.1 MQ*cm )在 25°C下搅拌，加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后，再加入 6 mL 6 mmol/L氯金酸水溶 液（氯金酸水溶液 B ) 继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金溶胶通 过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离 心 45分钟后,再用超纯水将沉淀物溶解， 得到纯化的功能化纳米金。 纯化后的 功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发 光功能化纳米金的粒径以 20纳米为主， 如附图 5 B所示。 氯金酸水溶液 A、 氯金酸水溶液 B和 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液均用纯净水（电阻 率为 6.1 MQ*cm ) 配制。 将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液（氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 25 °C下搅拌，加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后，再加入 6 mL 6 mmol/L氯金酸水溶 液（氯金酸水溶液 B )继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶， 避光保存在 4 °C下。 将所述金溶胶通 过离心纯化进行电镜表征。 纯化条件为： 将 1 ml所述金溶胶在 17120 * g下离 心 45 分钟后， 再用超纯水将沉淀物溶解， 得到純化的功能化纳米金。 纯化后 的功能化纳米金经电镜分析结果表明合成的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺 发光功能化纳米金的粒径以 18纳米为主， 如附图 5 C所示。 氯金酸水溶液 A、 氯金酸水溶液 B和 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺水溶液均由超纯水（电阻 率为 18.2 MQ*cm )配制。
实施例 6: N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺直接还原氯金酸得到的发光功能化 纳米金的表征 附图 6-7是下述实验条件下得到的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光 功能化纳米金的表征结果。 将实施例 1中得到的图 l b的金溶胶通过经透析、 盐析、 两次离心 -洗涤并千燥纯化进行征。 純化条件为： 渗析过程是将合成的 所述金溶胶在常温下渗析 2天，每 8小时换一次超纯水渗析液，通过渗析操作 可以充分去除游离的的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺及其氧化产物； 盐析 过程是将 NaCl加入所述金溶胶中使 NaCl的最终浓度为 0.5 mol/L , 形成的沉 淀物；二次离心 -洗涤的过程是将所述金溶胶在盐析的作用后经 17120 * g下离 心 45分钟后,再用超純水将沉淀物溶解；干燥过程是将所述纳米金溶胶经渗析、 盐析和离心 -洗涤作用后放入烘箱作用 12个小时， 温度为 40°C。
附图 6是 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺纯样品（ N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺纯样在 TCI东京化成工业株式会社购买， CAS号为 66612-29-1 ) 和实施例 1中得到的图 1 b的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米 金溶胶经透析、 盐析、 两次离心-洗涤并千燥后的金纳米粒子的 Au4f、 C 1 s和 N 1 s的 X射线光电子能谱。 附图 6 E显示 Au4f双峰（ Au4f7/2和 Au4f5/2 )的自 旋 -轨道裂分为 3.7 ev,与文献 ( Ganesan, P. G.； Singh , A. P.; Ramanath , G. Appl. Phys. Lett, 2004, 85, 579. )报道的零价金纳米粒子相一致。 如附图 6A所示， N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺纯样品中的 Cls 能谱包括三个分别位于 284.9、 286.0和 287.3 ev的组分。 284.9 ev的组分来自于 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺分子中芳香环上的碳原子。 286.0 ev的组分则与芳香环上和脂肪链 上的碳原子相关。 287.3 ev的组分是由酰胺基团中的碳原子（ -CO-NH- )所致。 附图 6 C则显示了 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺还原的金纳米粒子的 Cls 能谱。 与 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺纯样的 Cls能谱相比， 发现了一个 位于 288.1 ev的新组分， 其他组分的位置基本与 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁 米诺各组分的位置相同。 因此， Cls能语数据表明在金纳米粒子表面有 N-(4- 氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的各种碳组分， 而 288.1 ev的新组分对应于 N-(4- 氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的氧化产物中的羧基碳组分。 这一结果表明 N-(4- 氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺存在于纳米粒子表面上。
对于 Nls能谙实验结果分析与上述讨论也较为一致。 如附图 6 B所示， N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺纯样品包含的 399.5 ev和 400.8 ev的组分，而 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发光功能化金纳米粒子的 Nls 能谱也包含了
399.2 ev和 400.3 ev两个类似的组分， 均分别对应氨基氮原子（ -NH2 )和酰胺 氮原子（-CO-NH - )。 考虑到 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺及其氧化产物中 均含有氨基氮原子而酰胺氮原子则为 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺所独有， 这个结果进一步支持 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺存在金纳米表面。 有报 道指出对于脂肪胺保护的金纳米粒子而言（ Kumar, A.; Mandal, S.; Selvakannan, PR. Langmuir, 2003, 19, 6277. ), 除了 Au-N弱共价作用之外， 还可能存在质子 化氨基与带负电的金纳米粒子之间的静电吸引力。在本工作中则未观察到位于
402.3 eV 处的质子化氨基氮原子（-NH3 +)组分 （ Seitz O, Chehimi MM, Cabet-Deliry E, et al., Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2003, 218, 225. ), 从而排除了 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺以质子 化氨基与带负电的金纳米粒子通过静电相互作用连接的可能性。 因此， Au-N 弱共价相互作用是连接 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺在金纳米粒子表面的 唯一作用力。
进一步， 用紫外-可见吸收光语表征了实施例 1中得到的图 1 b的 N-(4-氨 基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金。 为了避免溶胶中游离反应物和产 物对表面鉴定的千扰，首先利用多次透析的方法将小分子溶质与金纳米粒子相 分离， 并检测透析前后的紫外-可见吸收光镨如附图 7所示。 渗析条件为： 渗 析过程是将金溶胶在常温下渗析 2天，每 8小时换一次超纯水渗析液。与纯的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液（附图 7 A所示 )和刚合成好的金溶胶 (附图 7 B所示）比较，透析后的金溶胶（附图 7 C所示）在 291 nm和 319 nm 处的吸收峰显著减弱。 该处的吸收峰为 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的特 征吸收， 这表明溶胶中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺含量在透析后显著降 低。 更为重要的是， 溶胶的最大吸收波长（ 530 nm )保持不变。 这表明透析过 程不会改变金纳米粒子的分散状态和粒径大小。这些结果表明通过透析离心等 方法可以有效的将 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺从溶胶中分离除去， 并且 保持金纳米粒子的分散性和稳定性。
随后对透析过的金溶胶中加入足量电解质盐使得金纳米粒子团聚并最终 沉淀下来。 离心后的沉淀物用 0.1 mol/L Na2CO3重新溶解， 并进行紫外-可见吸 收光谱表征（附图 7 D所示）， 同样得到了 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺的 特征峰。 与此同时， 还在离心后的上清液（附图 7 E 所示） 中再次观察到了 N-(4-tt丁基) -N-乙基异鲁米诺的紫外吸收特征峰。 这些结杲表明， 金纳米粒 子表面的保护剂在盐析过程中部分解离下来并在离心之后存在于上清液中，所 以能够在上清夜中再次观察到 N-(4-tt丁基) -N-乙基异鲁米诺的吸收峰。 因 此， 这些结果也表明 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺存在于金纳米粒子表面。 实施例 7: N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金的发光特性 将实施例 3中合成的图 3 a、 图 3 b、 图 3 c和图 3 d的 1 mL不同形貌的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金溶胶 17120 * g下离心 45分 钟后的沉淀用 500 μL pH=13的 NaOH溶液进行分散放入检测池中，再注入 400 浓度为 0.1 mol/L ¾02溶液， 测定其化学发光动力学曲线如附图 8所示。 实验结果表明发光强度随着发光功能化纳米金粒子形貌呈单分散球型、球状纳 米金组装链、球状纳米金组装的准网状和球状纳米金组装的网状（附图 8 A-D ) 不断增加， 表明本发明合成的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化的 纳米金具有良好的化学发光特性。
附图 9是本发明的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发光功能化金纳米粒 子在发光试剂用量、氯金酸用量和发光实验条件等同的情况下与文献（ Cui, H.; Wang, W.; Duan, C. R; Dong, Y. P.; Guo, J. Z. Chem. Eur. J. 2007, 13, 6975 )合成 的鲁米诺直接键合的发光功能化纳米金发光效率的比较。 其实验条件为： 将 500 用 0.1 mol/L的氢氧化钠分散离心分离后的本发明的实施例 1中得到的 图 l b的金溶胶和鲁米诺直接键合的发光功能化纳米粒子放入检测池中（其中 本发明的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发光功能化金纳米粒子和鲁米诺直 接键合的发光功能化纳米粒子中纳米粒子含量都为 0.3 mmol/L ) 注入 400 μ 浓度为 0.1 mol/L H2O2溶液检测化学发光。 实验结果发现本发明的 N-(4-氨基 丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化金纳米粒子 （附图 9 A )在发光试剂用量、 氯金酸用量和发光实验条件等同的情况下比文献（ Cui, H.; Wang, W.; Duan, C. R; Dong, Y. P.; Guo, J. Z. Chem. Eur. J. 2007, 13, 6975 )合成的鲁米诺直接键合 的发光功能化纳米金（附图 9 B )发光效率高，表明本发明的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化纳米金具有很高的发光效率。 实施例 8:基于 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金免疫分析探 针的制备 所述免疫分析探针的制备可采用下述方案一或方案二：
方案一， 包括如下步骤：
A )将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液（氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水 (电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 25°C下搅拌， 加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后，再加入 6 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液 (氯金酸水溶液 B ) 继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基 异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶。
B )将步骤 A ) 中所得到的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳 米金溶胶中加入链霉亲和素， 使其终浓度为 25 g/mL。 混合均匀后在室温下培 育 30分钟， 再向其中加入 5 % ( w/w ) 的牛血清白蛋白溶液， 不断搅拌 5分钟， 使牛血清白蛋白最终浓度为 1 %。 最后在 17120 * g下离心 20分钟， 以除去未反 应试剂和纳米金表面弱结合的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺分子，然后将沉 淀用 500 含有 1 % ( w/w )的牛血清白蛋白的 0.1 mol/L pH=7.4磷酸盐緩冲液 溶解，得到连接链霉亲和素的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化的纳 米金；
C )在步骤 B ) 中所得的连接链霉亲和素的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁 米诺发光功能化的纳米金中加入端基经生物素修饰的抗体（生物素修饰的羊抗 人 IgG )溶液， 在 37 °C下孵育 30分钟， 在 17120 * g下离心 30分钟， 以除去 未反应试剂和纳米金表面弱结合的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺分子， 将 所得沉淀分散于 250 含有 1 % ( w/w ) 的牛血清白蛋白的 0.1 mol/L pH=7.4 磷酸盐緩冲液溶解。 即得到 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米 金免疫分析探针。 方案二， 包括如下步骤：
a )将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液（氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水（电 阻率为 18.2 MQ*cm )在 25°C下搅拌， 加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后 ,再加入 6 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液 (氯金酸水溶液 B ) 继续搅拌 1.5 小时后， 得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基 异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶。
b )将 0.5 mL 1.0 mg/mL抗体（羊抗人 IgG )加到用 0.1 mol/L的氢氧化钠 将步骤 a )中所得的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发光功能化的金胶溶液的 pH调至 8.0, 在室温培育 30分钟后， 再向其中加入 5 % ( w/w )的牛血清白蛋 白溶液， 不断搅拌 5分钟， 使牛血清白蛋白最终浓度为 1 % ( w/w )。 最后在 17120 * g下离心 30分钟， 以除去未反应试剂和纳米金表面弱结合的 N-(4-氨 基丁基) -N-乙基异鲁米诺分子， 然后将沉淀用 250 L含有 1 % ( w/w ) 的牛血 清白蛋白的 0.1 mol/L pH=7.4磷酸盐緩冲液溶解， 即得到 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金免疫分析探针。 实施例 9:基于 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金的核酸分析 探针的制备 所述核酸分析探针的制备可采用下述方案一或方案二：
方案一， 包括如下步骤：
( A )将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液（氯金酸水溶液 A ) 和 30 mL超纯水 (电阻率为 18.2 MQ*cm )在 25°C下搅拌， 加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁 基) -N-乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后， 再加入 6 mL 6 mmol/L氯金酸 水溶液（氯金酸水溶液 B )继续搅拌 1.5 小时后，得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶。
( B ) 将步骤（A ) 中所得到的 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发光功能 化的纳米金溶胶中加入链霉亲和素， 使其终浓度为 25 g/mL。 混合均匀后在室 温下培育 30分钟， 再向其中加入 5 % ( w/w )的牛血清白蛋白溶液， 不断搅拌 5 分钟， 使牛血清白蛋白最终浓度为 1 % ( w/w )最后在 17120 * g下离心 20分钟， 以除去未反应试剂和纳米金表面弱结合的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺分 子， 然后将沉淀用 500 含有 0.3 mol/L的氯化钠的 0.05 mol/L pH=8.0 Tris-HCl 緩冲液分散，得到连接链霉亲和素的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能 化的纳米金；
( C )在步骤（B ) 中所得的连接链霉亲和素的 N-(4-氨基丁基) 乙基异 鲁米诺发光功能化的纳米金中加入端基经生物素修饰的 DNA溶液（碱基序列 为 GGGTTTATGAAAAACACTTT-biotin ), 在 37 °C下孵育 1小时， 在 17120 * g下离心 10分钟，以除去未反应试剂和纳米金表面弱结合的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺分子，将所得沉淀分散于 250 μ∑含有 0.3 mol/L的氯化钠的 0.05 mol/L pH=8.0 Tris-HCl緩冲液。即得到 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功 能化的纳米金 DNA分析探针。 方案二， 包括如下步骤：
( a )将 9 mL 6 mmol/L氯金酸水溶液（氯金酸水溶液 A )和 30 mL超纯水 (电阻率为 18.2 MQ*cm )在 25。C下搅拌， 加入 5 mL 4 mmol/L的 N-(4-氨基丁 基) -N-乙基异鲁米诺水溶液后持续搅拌 2小时后， 再加入 6 mL 6 mmol/L氯金酸 水溶液（氯金酸水溶液 B )继续搅拌 1.5 小时后，得到稳定的 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金溶胶。
( b )根据文献 ( Demers, L., Μ·; Mrikin, C" A. Anal. Chem. 2000, 72, 5535-5541 )将步骤（a ) 中所得到的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能 化的纳米金中加入端基经巯基修饰的 DNA溶液（碱基序列为 GAT CAG ATT CGC-(CH2)6-SH ), 在室温下反应 24小时， 再慢慢加入含有 1 mol/L氯化钠的 0.1 mol/L pH=7.4碑酸盐緩冲液继续反应 40小时。 最后在 17120 * g下离心 20 分钟， 将所得沉淀分散于 500 μ∑ 0.3 mol/L 的氯化钠的 0.05 mol/L pH=8.0 Tris-HCl緩冲液。即得到 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺发光功能化的纳米金 DNA分析探针。
该实施例中的氯金酸水溶液 A、 氯金酸水溶液 B和 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液均由超纯水（电阻率为 18.2 MQ*cm ) 配制。 实施例 10: 基于 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金的免疫和 核酸分析探针的发光特性 将 1 mL由实施例 8方案一制备的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功 能化纳米金溶胶标记的免疫分析探针和实施例 9 方案一制备的 N-(4-氨基丁 基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金溶胶标记的核酸分析探针经离心分离 后的沉淀分别用 0.1 mol/L pH=7.4磷酸盐緩沖液和含有 0.3 mol/L氯化钠的 0.05 mol/L pH=8.0 Tris-HCl緩冲液进行分 丈入检测池中， 再注入含有 0.1 mol/L 过氧化氢的 0.02 mol/L pH=9.95的碳酸盐底液， 测定其化学发光动力学曲线如 附图 10所示。 表明用本发明的 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺发光功能化的 纳米金制备的免疫分析探针和核酸分析探针具有良好的化学发光特性。

Claims

1、 一种功能化纳米金， 由金纳米粒子和 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺 连接而成， 所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺连接在所述金纳米粒子的表 面。
2、 根据权利要求 1所述的功能化纳米金， 其特征在于： 所述 N-(4-氨基丁 基) -N-乙基异鲁米诺通过共价键 Au-N连接在所述金纳米粒子的表面。
权
3、 根据权利要求 1或 2所述的功能化纳米金， 其特征在于： 所述功能化纳 米金具有化学发光特性。 利
3
4、 根据权利要求 1或 2或 3所述的功 1能要化纳米金， 其特征在于： 所述功能化 纳米金与氧化剂反应产生化学发光。 求
5、根据权利要求 4所述的功能化纳米金，其特征在于：所述氧化剂为 ¾02、 O2、 CIO 、 I2、 IO4 或 Mn04 。
6、 根据权利要求 1-5中任一所述的功能化纳米金， 其特征在于： 所述功能 化纳米金按照下述权利要求 7- 13中任一所述的方法制备。
7、权利要求 1至 6中任一所述的功能化纳米金的制备方法， 包括如下步骤： ( 1 )将氯金酸水溶液 A与 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液在搅拌 状态下混合得到混合液；所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4- 氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质 的量的 2-4倍； .
( 2 )在搅拌状态下， 再将氯金酸水溶液 B加入步骤（ 1 )得到的混合液中， 继续搅拌至形成金溶胶，得到的金溶胶即为功能化纳米金； 所述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶 液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 1-3倍。
8、 根据权利要求 7所述的方法， 其特征在于： 所述氯金酸水溶液 A的摩尔 浓度为 1-10 mmol/L、 l-6 mmol/L、 6-10 mmol/L、 6-8 mmol/L或 8-10 mmol/L; 所述 N-(4-氨基丁基） -N-乙基异鲁米诺水溶液的摩尔浓度为 0.5-8.0 mmol/L, 0.5-4.0 mmol/L, 0.5-5.0 mmol/L、 4.0-8.0 mmol/L、 5.0-8.0 mmol/L或 4.0-5.0 mmol/L;
所述氯金酸水溶液 B的摩尔浓度为 1-10 mmol/L , 1-6 mmol/L 或 6-10 mmol/L。
9、 根据权利要求 7或 8所述的方法， 其特征在于： 所述氯金酸水溶液 A、 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液和所述氯金酸水溶液 B的配比为下述 M-hlO中的任一种：
hi、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺的物质的量的 4倍， 所述 氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙基 异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 1倍；
h2、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺的物质的量的 2倍， 所述 氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) 乙基 异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 3倍；
h3、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.7倍， 所 述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（1 ) 中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 1.8倍； h4、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.3倍， 所 述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（1 ) 中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 1.4倍； h5、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氣基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.7倍， 所 述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（1 ) 中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.1倍； h6、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.7倍， 所 述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（1 ) 中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.4倍； h7、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.7倍， 所 述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（1 ) 中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.7倍； h8、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺的物质的量的 3倍， 所述 氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) 乙基 异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2倍；
h9、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N-乙 基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 27/11倍， 所述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) 乙基异鲁米诺的物质的量的 18八 1 倍；
hl0、 所述氯金酸水溶液 A中氯金酸的物质的量是所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 2.25倍， 所述氯金酸水溶液 B中氯金酸的物质的量是步骤（ 1 )中所述 N-(4-氨基丁基) -N- 乙基异鲁米诺水溶液中 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺的物质的量的 1.5倍.
10、 根据权利要求 7或 8或 9所述的方法， 其特征在于： 所述方法还包括将 所述金溶胶通过离心进行純化的步骤。
11、 根据权利要求 10所述的功能化纳米金， 其特征在于： 离心的条件为： 将所述金溶胶在 17120 * g下离心 45分钟。
12、 根据权利要求 7-11中任一所述的方法， 其特征在于， 步骤（1 )和步 骤（2 )的反应温度均为 15-35 °C、 15-25°C、 15-30°C、 25-35°C或 25-30°C。
13、 根据权利要求 7-12中任一所述的方法， 其特征在于， 步骤（1 )的反 应时间为 2小时以上， 步骤（2 )的反应时间 1.5小时以上。
14、 根据权利要求 7-13中任一所述的方法， 其特征在于， 配制所述氯金酸 水溶液 A、 氯金酸水溶液 B和 N-(4-氨基丁基) -N-乙基异鲁米诺水溶液所使用的 水的电阻率大于等于 1.0 MQ*cm; 所述水选自下述三种水中的至少一种： 二次 蒸馏水、 纯净水和超纯水。
15、 权利要求 7至 14中任一所述方法制备的功能化纳米金。
16、权利要求 1至 6和 15中任一所述的功能化纳米金， 其特征在于， 所述功 能化纳米金的形貌呈单分散球状、球状纳米金组装的链状或球状纳米金组装的 网状。
17、 根据权利要求 16所述的功能化纳米金， 其特征在于， 所述功能化纳米 金的形貌呈单分散球状， 单分散球的粒径大小为 10-30纳米； 或， 组装成链状 或网状的球状纳米金的粒径大小为 10-30纳米。
18、 根据权利要求 16所述的功能化纳米金， 其特征在于， 所述功能化纳米 金的形貌呈球状纳米金组装的链状， 链长为 400-500纳米。
19、 一种生物分析探针， 是由功能化纳米金标记生物分子形成的复合物； 所述功能化纳米金为权利要求 1至 6中任一所述功能化纳米金或权利要求 15所 述功能化纳米金。
20、 根据权利要求 19中所述的生物分析探针， 其特征在于， 所述生物分子 为蛋白质或核酸分子。
21、 根据权利要求 20所述的生物分析探针， 其特征在于， 所述生物分子为 蛋白质的生物分析探针的制备方法为下述 A或 B的方法：
A. 将所述蛋白质分子的端基修饰生物素， 然后与连接有链霉亲和素的所 述功能化纳米金相连接；
B. 将所述蛋白质分子直接与所述功能化纳米金相连接。
22、 根据权利要求 20或 21所述的生物分析探针， 其特征在于， 所述蛋白质 为抗原或抗体。
23、 根据权利要求 20所述的生物分析探针， 其特征在于， 所述生物分子为 核酸的分析探针的制备方法为下述 a或 b的方法：
a、 将所述核酸分子端基修饰生物素， 然后与连接有链霉亲和素的所述功 能化纳米金相连接；
b、 将所述核酸分子端基修饰巯基， 然后与所述功能化的纳米金相连接。
24、 根据权利要求 20或 23中所述的生物分析探针， 其特征在于， 所述核酸 分子为 DNA、 RNA或适配体。
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