WO2011103773A1

WO2011103773A1 - 聚乙二醇化环巴胺类似物及其制备方法和用途

Info

Publication number: WO2011103773A1
Application number: PCT/CN2011/000303
Authority: WO
Inventors: 宋淳; 张承智; 赵昕; 胡昭; 许绣玲; 张友忠; 王明毅; 孙志军
Original assignee: 北京科美森医药研发有限公司
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2011-02-25
Publication date: 2011-09-01
Also published as: US8877928B2; US20130324569A1; CN102167812A; CN102167812B

Description

聚乙二醇化环巴胺类似物及其制备方法和用途技术领域

本发明提供了作为 Hedgehog通道抑制剂的聚乙二醇化环巴胺 (cyclopamine)类似物，包含此类化合物的药物组合物，及其制备方法。还提供了它们用于治疗增殖性疾病的方法。背景技术

Hedgehog (Hh)信号通道是一种古老的且高度保守发展的通道，其参与大多数组织的胚胎形成和发育以及维持和修复成年体中的成熟组织。分泌的蛋白的 hedgehog家族的成员控制细胞增殖、分化和组织形成。在成年体中， Hh信号与胚胎和新生体中的相比显著降低。在若干种类的癌症中不恰当的 Hh通道被激活，该癌症例如基底细胞癌（Ervin H. Epstein (2008) Nat Rev Cancer. 8 : 743-54·)、成神经管细胞瘤 (Raffel, C. (1997) Cancer Research. 57: 842-845)、小细胞肺癌（Watkins, D.N. et al. (2003) Nature 422， 313-317)、胰腺癌 (Thayer, S.P. et al. (2003) Nature 425， 851-856)、前列腺肿瘤 (Karhadkar, S.S. et al. (2004). Nature 431， 707-712)、以及慢性淋巴细胞白血病 (Hegde GV. et al. (2008) Mol Cancer Res. 6(12): 1928-36)。因此，异常 Hh信号通道的抑制对于抗癌药物的设计而言是引人注目的靶标。

hedgehog基团首先在果蝇中被鉴定。 Hh的突变导致异常刺突，覆盖了幼虫的背部，用显影提示 hedgehog (Nusslein-Volhard, C. et al. 1980, Nature 287, 795-801)。此基因的三种同类物随后在哺乳动物中被报道：音速 hedgehog (Sonic hedgehog, Shh)、、印度 hedgehog (Indian hedgehog, Ihh)和沙漠 hedgehog (Desert hedgehog, Dhh) (Echelard, Y.et al; Cell 1993, 75， 1417-1430)。 Shh是哺乳动物中最普通的 hedgehog成员，并且还是 hedgehog家族中最好表征的配体。分泌之前， Shh历经分子内裂解和脂质修饰反应。脂质修饰的肽是全部信号激活的原因。两种跨膜蛋白参与 Hh通道的信号转导：十二-跨膜^卜丁受体 (twelve-transmembrane Patched receptor , PTCH) ，以及七 -跨膜平滑子蛋白（seven-transmembrane Smoothened protein (Smo))，其用作 Hh发信号的重要阳性介质。这三种 Hh蛋白用作启动 Hh发信号的配体。 Hh通道的该受体是 Ptch，一种十二-通过跨膜蛋白 (twelve-pass transmembrane protein)。在缺乏 Hh配体时， Ptch结合偶合受体样信号转导平滑子 (Smo)的 G-蛋白，并阻断其功能 (Eggenschwiler, J.T. (2007) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 23, 345-373)„ Hh配体的结合减轻了 Ptch-介导的 Smo的抑制作用。在与 Hh配体结合时， Ptch降低 Smo。接着， Smo 被活化，并启动信号级联，该信号级联导致刻印因子 (inscriptional factors) Glil-3的活化 ( Alexandre et al(1996) Genes Dev. 10: 2003-13), 其调节包括细胞周期蛋白 D、细胞周期蛋白 E (Duman-Scheel, M. et al. (2002) Nature 417， 299—304)、 c-myc (Ingham PW et al. Genes Dev 2001;15(23): 3059-87)、和 Bcl2(Regl， G. et al. (2004) Cancer Res. 64, 7724-7731)的 Hh靶基因。是通道是细胞周期以及发育期间分化的重要调节子。

在过去十年，越来越明显的是， Hh 通道成员的异常表达会促使癌症形成和维持。已经报道若干基因（例如 Shh、 PTCH1、 Smo 和 Gli)促使不同癌症的发展。 PTCH1 是第一个与癌症关联的 Hh 网络基因。患有遗传失活突变体 PTCH (其会导致构成性活化的 Hh 发信号）的患者具有基底细胞癌和成神经管细胞瘤的高发病率 (Johnson, R.L. et al. (1996) Science 272, 1668-1671, Epstein, E.H. (2008) Nat. Rev. Cancer 8， 743-754)。两种基因 PTCH和 SUFU的单倍不足与横紋肌肉瘤特别是胎儿横纹肌瘤和胚胎横纹肌肉瘤有关 (Tostar, U. et al. (2006)， J. Pathol. 208,17—25)。导致 Smo构成性活化的小脑神经细胞中的 Smo或 Ptchl的突变通常会引起成神经管细胞瘤 (Vorechovsky, I. et al. (1997) Oncogene 15， 361-366) _β已经发现，相比于健康细胞， Smo、 Glil和 Ptchl的转录水平在致瘤性多发性骨髓瘤细胞中显著地上调节。由于在癌症中普遍涉及 Hh通道，阻断此通道的方法是令人非常感兴趣的。已经显示， hedgehog 通道活性的小分子抑制会在许多不同种类的具有不受控制的 hedgehog通道活化的癌症中造成细胞死亡。

在 hedgehog通道抑制剂中，环巴胺 (一种植物藜芦碱)相当令人感兴趣。环巴胺直接结合 Smo, 并且作为 Hh通道的拮抗剂。动物试验证实，环巴胺在小细胞肺癌、成神经管细胞瘤前列腺癌和消化道癌的若干模型中具有抗肿瘤活性。尽管环巴胺具有吸引人的药理学性质，但其作为全身治疗的用途可能受下列限制： 1)致畸，包括：中线面部特征丧失、单眼、缺乏来自前脑的解剖学特征 2) 水溶性差 (5 g/mL)，以及 3)在低 pH下化学不稳定（Chen. J.K., al. (2002)， Proc. Natl. Acad. Sci. US.A, 99. 14071-14076) 。发明内容

发明概述

本发明目的是提供一种具有良好溶解度和 /或 pH稳定性增强等优良特征的环巴胺衍生物，有利于临床应用于治疗各种疾病。本发明令人意外地发现通过将聚乙二醇与环巴胺偶合得到的聚乙二醇化环巴胺类似物，得以顺利地实现本发明的上述目的。本发明基于上述发现而得以完成。为此，本发明第一方面提供一种聚乙二醇化环巴胺类似物，其是以下式 I表示的化合物，或者是包括至少一个各自相同或不同的以下式 I表示的基

或其单一对映体、对映体的混合物、或非对映体的混合物，或其药学可接受的盐、溶剂合物、或水合物，其中：

R是直线或分支的并具有 200至 200,000道尔顿的分子量的聚乙二醇，

L是下式 II表示的连接基

(Π)

其中，

R₂选自— C(0)R^e、 — C(0)OR^e、 - C(0)NR^fR^g、 -C(NR^e)NR^fR^g、 -OR^e、 -OC(0)R^e、 - OC(0)OR^e、 -OC(0)NR^fR、 -OC(=NR^e)NR^fR^g、 -OS(0)R^e、 - OS(0)₂R^e、 -OS(0)NR^fR^g、 - OS(0)₂NR^fR^g、 -NR^fR^g、 -NR^eC(0)R^h 、 -NR^eC(0)OR^f 、 -NR^eC(0)NR^fR 、 -NR^eC(=NR^h)NR^fR^g 、 -NR^eS(0)R^h 、 -NR^eS(0)₂R^h 、 -NR^eS(0)NR^fR , -NR^eS(0)₂NR^fR^g、 -SR^e、 -S(0)R^e、 - S(0)₂R^e、 -S(0)NR^fR^g和—S(0)₂NR^fR^g, 其中各个 R^e、 R^f、 R^g和 R^h独立地选自氢、 d_₆烷基、 C₂_₆烯基、或者 1^和1^与它们连接的 N原子一起形成含氮杂环基；

Y选自 0、 N、 S-S、亚曱基、亚乙基，其中有 /无包括下列的其它官能团：组织特异性靶功能基团和 /或各种细胞特异性靶功能基团例如维生素（vitamine ) 、叶酸衍生物、抗体；

m为 0至 6的整数；具体地， m为 0、 1、 2、 3、 4、 5、或 6。 X为环巴胺与 L之间的选自下列的连接基： -C(0)、-OC(0)、

-NC(O)、 —os(o)、 -os(o)₂、 — os(o)。

根据本发明第一方面任一项的聚乙二醇化环巴胺类似物，其中 R所示聚乙二醇的分子量为 300 至 180,000 道尔顿、 400 至 160,000道尔顿、 500至 150,000道尔顿、 600至 120,000道尔顿、 800至 100,000道尔顿、 1000至 80,000道尔顿、 1500至 60,000 道尔顿、 2000至 50,000道尔顿、 5000至 50,000道尔顿、 7500至 50,000道尔顿、或 10000至 50,000道尔顿。

根据本发明第一方面任一项的聚乙二醇化环巴胺类似物，其中 R所示聚乙二醇是下式 III所示的聚乙二醇：

R

n

(ΠΙ)

其中 ·.

是封端子，其选自 H、 Me、烷基 (例如 d.₁₂烷基、烷基、 d.6烷基、或^^烷基)、组织特异性靶功能基团和 /或各种细胞特异性靶功能基团其为 vatamine、叶酸衍生物、抗体；

n 在每次、出现时各自独立地是 100-4500 的整数（例如为 100-4000的整数、或为 100-3500的整数、或为 100-3000的整数、或为 100-2500的整数、或为 100-2000的整数、或为 100-1500的整数、或为 100-1000的整数、或为 100-800的整数、或为 100-500 的整数。在一个实施方案中，n为 120-4500的整数、或为 150-4500 的整数、或为 200-4500 的整数、或为 250-4500 的整数、或为 300-4500的整数、或为 350-4500的整数、或为 500-4500的整数、或为 800-4500的整数、或为 1000-4500的整数、或为 1200-4500 的整数、或为 1500-4500的整数、或为 2000-4500的整数、或为 2500-4500的整数、或为； 3000-4500的整数。在一个实施方案中， n为 120-4200的整数、或为 150-4000的整数、或为 200-3500的整数、或为 250-3000的整数、或为 300-2500的整数、或为 350-2000 的整数、或为 500-2000的整数、或为 800-1500的整数)。

根据本发明第一方面任一项的聚乙二醇化环巴胺类似物，其特征在于以下 (1)-(3)的任一项或多项：

(1) R是直线或分支的并具有 200至 200,000道尔顿（例如 300至 180,000道尔顿、 400至 160,000道尔顿、 500至 150,000 道尔顿、 600至 120,000道尔顿、 800至 100,000道尔顿、 1000至 80,000道尔顿、 1500至 60,000道尔顿、 2000至 50,000道尔顿、 5000至 50,000道尔顿、 7500至 50,000道尔顿、或 10000至 50,000 道尔顿)的分子量的聚乙二醇，

(2) L是下式 II表示的连接基：

(II)

其中，

R₂选自 -C(0)R^e、 -C(0)OR^e、 -C(0)NR^fR^g、 -C(NR^e)NR^fR^g、 -OR^e、 - OC(0)R^e、 -OC(0)OR^e、 -OC(0)NR^fR 、 -OC(=NR^e)NR^fR^g、 -OS(0)R^e、 -OS(0)₂R^e、 -OS(0)NR^fR^g、 -OS(0)₂NR^fR^g、 -NR^fR^g、 - NR^eC(0)R^h 、 -NR^eC(0)OR^f 、 -NR^eC(0)NR^fR^g 、 -NR^eC(=NR^h)NR^fR^g 、 -NR^eS(0)R^h 、 -NR^eS(0)₂R^h 、 -NR^eS(0)NR^fR^g、 - NR^eS(0)₂NR^fR^g、 - SR^e、 - S(0)R^e、 - S(0)₂R^e、 -S(0)NR^fR^g和- S(0)₂NR^fR^g，其中各个 R^e、 R^f、 1^和 1^独立地选自氢、 d.₆烷基、 C₂_₆烯基、或者 R^f和 R^g与它们连接的 N原子一起形成含氮杂环基；

Y选自 0、 N、 S-S、亚曱基、亚乙基，其中有 /无包括下列的其它官能团：组织特异性靶功能基团和 /或各种细胞特异性靶功能基团例如维生素（vatamine ) 、叶酸^ f生物、抗体；

m为 0至 6的整数；；具体地， m为 0、 1、 2、 3、 4、 5、或

6.

(3) X 为环巴胺与 L 之间的选自下列的连接基： -C(0)、

- oc(o)、 -NC(O)、 -os(o)、 - os(o)₂、 - os(o)。

在本发明中，术语"维生素 "包括维生素 A、 B族维生素、维生素（：、维生素 D、维生素 E等。本发明第二方面提供制备本发明第一方面任一项所述聚乙二醇化环巴胺类似物的方法，其包括以下步骤：

i)提供聚乙二醇或其衍生物，或者它们的官能化物例如羧化物、酰胺化物及其衍生物或受保护的形式；

ii)使步骤 i)提供的物质与环巴胺或其单一对映体、对映体的混合物、或非对映体的混合物，或其药学可接受的盐、溶剂合物、或水合物反应，得到聚乙二醇化环巴胺类似物; 和任选地，

iii)使步驟 ii)所得的聚乙二醇化环巴胺类似物进行进一步的处理，例如进行分离、结晶、纯化、成盐、成溶剂合物等处理。

本发明第三方面提供了一种药物组合物，其包含治疗和 /或预防有效量的本发明第一方面任一项所述的聚乙二醇化环巴胺类似物，或其单一对映体、对映体的混合物、或非对映体的混合物，或其药学可接受的盐、溶剂合物、或水合物，以及任选的一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。

本发明第四方面提供了本发明第一方面任一项所述的聚乙二醇化环巴胺类似物或者本发明第三方面任一项所述药物组合物在制备用于治疗和 /或预防增殖性疾病、肿瘤性疾病或癌性疾病的药物中的用途。根据本发明第四方面的用途，其中所述的增殖性疾病、肿瘤性疾病或癌性疾病是可以用环巴胺或其类似物治疗和 / 或预防的疾病。具体地，所述肿瘤性疾病或癌性疾病为肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、或者乳腺癌。

本发明第五方面提供了一种在有需要的哺乳动物中治疗和 / 或预防增殖性疾病、肿瘤性疾病或癌性疾病的方法，该方法包括给有需要的哺乳动物施用治疗和 /或预防有效量的本发明第一方面任一项所述的聚乙二醇化环巴胺类似物或者本发明第三方面任一项所述药物组合物。根据本发明第五方面的方法，其中所述的增殖性疾病、肿瘤性疾病或癌性疾病是可以用环巴胺或其类似物治疗和 /或预防的疾病。具体地，所述肿瘤性疾病或癌性疾病为肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、或者乳腺癌。

本发明的第六方面提供了本发明第一方面任一项所述的聚乙二醇化环巴胺类似物或者本发明第三方面任一项所述药物组合物作为 Hedgehog通道抑制剂的用途。 ^明详述：

根据本发明第一方面提供的一种聚乙二醇化环巴胺类似物，其为聚乙二醇或其衍生物与环巴胺经环巴胺 F环上的环氮原子连接的偶合物，或其单一对映体、对映体的混合物、或非对映体的混合物，或其药学可接受的盐、溶剂合物、或水合物。环巴胺的化学结构及其 A-F六个稠合环的编号如下：

环巴胺

其中，环巴胺的 F环中的环氮原子上的氢被聚乙二醇或其衍生物通过任选的连接子取代，从而形成本发明第一方面任一项的聚乙二醇化环巴胺类似物。

根据本发明第一方面任一项的聚乙二醇化环巴胺类似物，其中所述聚乙二醇或其衍生物与环巴胺之间是通过包含酰胺基、磺酰胺基、或亚磺酰胺基的连接子连接的。在一个实施方案中，所述的连接子中包含选自下列的基团： - C(0)、 - OC(0)、 - NC(0)、 -OS(0)、 - OS(0)₂、 -OS(O). 在一个实施方案中，所述的连接子中包括下式 II表示的基团部分

(Π)

其中 R₂、 Y和 m如本发明所述。

根据本发明第一方面提供的一种聚乙二醇化环巴胺类似物，其是以下式 I表示的化合物，或者是包括至少一个各自相同或不同的以下式 I表示的基团部分的化合物：

(I)

或其单一对映体、对映体的混合物、或非对映体的混合物，或其药学可接受的盐、溶剂合物、或水合物；其中：

R是水溶性官能化的不同结构的聚乙二醇，该聚乙二醇是直线或分支的并具有 200至 200,000道尔顿的分子量。本文提供的 R具有下式 III：

(III)

R1是封端子，其包括 H、 Me、烷基、组织特异性靶功能基团和 /或各种细胞特异性靶功能基团其为维生素（vatamine ) 、叶酸衍生物、抗体； n 是乙二醇单元数，其每次出现时各自独立是地 110-4500的整数，其表示分子量 200至 200,000道尔顿的水溶性 PEG,

L是共价键，优选在 R和 X之间具有不同分子长度的生物可降解连接基，本文提供的 L为下式 II：

R₂ 丫)

(π)

R2是- C(0)R^e、 - C(0)OR^e、 - C(0)NR^fR^g、 - C(NR^e)NR^fR^g、 -OR^e、 -OC(0)R^e、 -OC(0)OR^e、 -OC(0)NR^fR^g、 -OC(=NR^e)NR^fR^g、 - OS(0)R^e、 - OS(0)₂R^e、 -OS(0)NR^fR > -OS(0)₂NR^fR -NR^fR^g、 -NR^eC(0)R^h 、 -NR^eC(0)OR^f 、 -NR^eC(0)NR^fR^g

h -NR^eC(=NR^h)NR^fR 、 -NR^eS(0)R^h 、 -NR^eS(0)₂R^f -NR^ES(0)NR^FR^G> -NR^ES(0)₂NR^FR , -SR^E、 -S(0)R^E、 - S(0)₂R^E、 -S(0)NR^FR^G和 -S(0)₂NR^FR^G; 其中各个 R^E、 R^F、 R^G和 R^H独立地是 (i)氢；（ii) d_₆烷基、 C₂_₆烯基；或者 ( ）1^和1^与它们连接的 N原子一起形成含氮杂环基；

Y是 0、 N、 S-S、亚曱基、亚乙基，其中有 /无包括下列的其它官能团：组织特异性靶功能基团和 /或各种细胞特异性靶功能基团其为维生素、叶酸衍生物、或者抗体，

m为亚烷基连接基的数目，其为 0至 6;

X优选为环巴胺与 L之间的生物可降解连接基；（i) - C(0)、

-oc(o)、 -NC(O)、 -os(o)、 - os(o)₂、 - os(o)。

根据本发明第一方面任一项的聚乙二醇化环巴胺类似物，其中所述聚乙二醇或其衍生物是直线或分支的聚乙二醇或其衍生物。

根据本发明第一方面任一项的聚乙二醇化环巴胺类似物，其中所述聚乙二醇或其衍生物是乙二醇单元数 n为 100-4500的整数 (例如为 100-4000的整数、或为 100-3500的整数、或为 100-3000 的整数、或为 100-2500 的整数、或为 100-2000 的整数、或为 100-1500的整数、或为 100-1000的整数、或为 100-800的整数、或为 100-500的整数。在一个实施方案中， n为 120-4500的整数、或为 150-4500的整数、或为 200-4500的整数、或为 250-4500的整数、或为 300-4500的整数、或为 350-4500的整数、或为 500-4500 的整数、或为 800-4500 的整数、或为 1000-4500 的整数、或为 1200-4500的整数、或为 1500-4500的整数、或为 2000-4500的整数、或为 2500-4500的整数、或为 3000-4500的整数。在一个实施方案中， n为 120-4200的整数、或为 150-4000的整数、或为 200-3500的整数、或为 250-3000的整数、或为 300-2500的整数、或为 350-2000的整数、或为 500-2000的整数、或为 800-1500的整数。 1-100的整数)。

根据本发明第一方面任一项的聚乙二醇化环巴胺类似物，其中所述聚乙二醇或其衍生物具有 200-200,000道尔顿 (例如是 300 至 180,000道尔顿、 400至 160,000道尔顿、 500至 150,000道尔顿、 600至 120,000道尔顿、 800至 100,000道尔顿、 1000至 80,000 道尔顿、 1500至 60,000道尔顿、 2000至 50,000道尔顿、 5000至 50,000道尔顿、 7500至 50,000道尔顿、或 10000至 50,000道尔顿)的分子量。

在一个实施方案中，本文提供的聚乙二醇化环巴胺类似物选自：



及其药学可接受的盐、溶剂合物和水合物。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解！^，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

本发明中所采用的术语 "烷基"、 "链烯基"和"炔基"具有本领域公知的一般含义，它们是直链或支链的烃基基团，并且这些基团中的碳数目通常为 1-22，例如 1-20、 1-15、 1-12、 1-10、 1-8、 1-6、或 1-4个碳原子，当然，对于"链烯基 "和"炔基"，其中的碳原子数至少为 2个。这些基团的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、烯丙基、丙烯基、丙炔基等，并且所述的 "烷基"、 "链烯基"和"炔基"可以统称为"烃基" 或"链烃基"。

如本文使用的，短语" d-C₆烷基"是指具有指定数目碳原子的取代或未取代的烷基基团，例如 d- 烷基、 d- 烷基、 d-Cz 烷基，其实例包括但不限于：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、新戊基。

如本文使用的，短语"环烷基"可以是指包含 3-10个、 3-8个、 3-6个、或 3-5个碳原子的环状烷基，其中可任选含有 1-3个选自氮、氧、硫的环杂原子，并且此时可称为杂环烷基或杂环基；此外环烷基中还任选含有双键。 "环烷基"的实例包括但不限于 "C₃-C₈环烷基"，其是指具有指定数目碳原子的取代或未取代的环状烷基，例如 c₃-c₆环烷基、 c₃-c₅环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。

本发明还涉及如本发明第一方面所述的聚乙二醇化环巴胺类似物的合适的可药用的盐、溶剂合物或水合物，其中可药用的盐包括但是并不局限于第一方面所述的聚乙二醇化环巴胺类似物与无机酸如盐酸、硫酸、磷酸、亚磷酸、氢溴酸和硝酸所成的盐以及与各种有机酸，如马来酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、酒石酸、拧檬酸、乙酸、乳酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、棕榈酸等所成的盐。本发明中的一些化合物可能用水或各种有机溶剂结晶或重结晶，在这种情况下，可能形成各种溶剂合物。本发明包括那些化学计量的溶剂合物，包括水合物，也包括在用低压升华千燥法制备时形成的包含可变量水的化合物。

本发明还涉及第一方面所述的聚乙二醇化环巴胺类似物的各种异构体。本发明中部分化合物可能以光学异构体或互变异构体的形式存在，本发明包括其所有存在形式，特别是纯异构体的形式。不同的异构体形式可以以各种常规的手段与其它形式的异构体分离或拆分开，或者某种异构体可以各种常规的合成方法或立体专一或不对称合成的方法得到。既然第一方面所述的聚乙二醇化环巴胺类似物是以药用为目的的，可以理解它们最好以纯的形式提供，例如至少 60%的纯度，更合适的 75%，更好的 85% , 最好至少 98%的纯度 (在此处，％是指重量百分比；在本说明书中，本领域技术人员理解，该。 /o在其出现的语境中有其公知的含义，例如在说明一液体时，通常为重量 /体积百分数)。不纯化合物的制备方法可用来用于药用组合物中更纯的形式。这些不够纯的产物中至少含有 1% , 更适合的 5% , 更好的至少 10%的如第一方面所述的聚乙二醇化环巴胺类似物或其可药用的衍生物。

根据本发明的详细教导以及已有的合成化常知识，本领域技术人员可以容易地合成本发明的第一方面所述的聚乙二醇化环巴胺类似物。

进一步地，本发明的第一方面所述的聚乙二醇化环巴胺类似物或其可药用的盐可以单独使用，或与可药用的载体或赋形剂一起以药物组合物的形式使用，当以药物组合物的形式使用时，通常将有效剂量的本发明第一方面所述的聚乙二醇化环巴胺类似物或其可药用盐或水合物以及一种或多种可药用载体或稀释剂结合制成适当的施用形式或剂量形式，这一程序包括通过合适的方式将组分混合、粒化、压缩或溶解。因此，本发明提供了药物组合物，它包含第一方面所述的聚乙二醇化环巴胺类似物、其所有可能的异构体、前药、可药用盐、溶剂合物或水合物以及至少一种可药用的载体。

本文所用的术语"组合物"意指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。根据本发明，所述的 "组合物"是指"药物组合物"。

包含本发明化合物的药物组合物，可以以下方面的任意方式施用：口服、喷雾吸入、直肠给药、鼻腔给药、阴道给药、局部给药、非肠道给药如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内或颅内注射或输入，或借助一种外植的储器用药，其中优选口服、肌注、腹膜内或静脉内用药方式。另外，为使本发明化合物或含有它的药物组合物有效治疗中枢神经系统疾病，可优选心室内途径用药可克服化合物可能低的血脑屏障透过率。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶嚢、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、埋植剂、贴剂、擦剂等。

本发明的药物组合物中还可以含有常用的载体，这里所述可药用载体包括但不局限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血清蛋白，緩沖物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解盾，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙浠吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛酯等。载体在药物组合物中的含量可以是 1重量％-98重量。 /。，通常大约占到 80重量％。为方便起见，局部麻醉剂，防腐剂，緩冲剂等可直接溶于载体中。

口服片剂和胶嚢可以含有赋形剂如粘合剂，如糖浆，阿拉伯胶，山梨醇，黄芪胶，或聚乙烯吡咯烷酮，填充剂，如乳糖，蔗糖，玉米淀粉，磷酸钙，山梨醇，氨基乙酸，润滑剂，如硬脂酸镁，滑石，聚乙二醇，硅土，崩解剂，如马铃薯淀粉，或可接受的增润剂，如月桂醇钠硫酸盐。片剂可以用制药学上公知的方法包衣。

口服液可以制成水和油的悬浮液，溶液，乳浊液，糖浆或酏剂，也可以制成干品，用前补充水或其它合适的媒质。这种液体制剂可以包含常规的添加剂，如悬浮剂，山梨醇，纤维素甲醚，葡萄糖糖浆，凝胶，羟乙基纤维素，羧曱基纤维素，硬脂酸铝凝胶，氢化的食用油脂，乳化剂，如卵磷脂，山梨聚醣单油酸盐，阿拉伯树胶；或非水载体 (可能包含可食用油），如杏仁油，油脂如甘油，乙二醇，或乙醇；防腐剂，如对羟基苯曱酸甲酯或丙酯，山梨酸。如需要可添加调味剂或着色剂。

栓剂可包含常规的栓剂基质，该赋形剂在室温下呈固体状态，而在体温下熔化释出药物，如可可脂，其它甘油酯或蜂蜡。

对胃外投药，液态剂型通常由化合物和一种消毒的载体制成。载体首选水。依照所选载体和药物浓度的不同，化合物既可溶于载体中也可制成悬浮溶液，在制成注射用溶液时先将化合物溶于水中，过滤消毒后装入封口瓶或安瓿中。

当皮肤局部施用时，本发明化合物可以制成适当的软膏，洗剂，或霜剂的形式，其中活性成分悬浮或溶解于一种或多种的载体中。其中软膏制剂可以使用的载体包括但不局限于：矿物油，液体凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧化乙烯，聚氧化丙烯，乳化蜡和水; 洗剂和霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，吐温 60，十六烷酯蜡，十六碳烯芳醇， 2-辛基十二烷醇，苄醇和水。

依据给药方式的不同，组分中可以含有重量比 0.1%，或更合适的重量比 10-60%的活性组分。但组分中包含单位剂量时，每个单位最好包含 1-500毫克活性成分。

当用于本发明上述治疗和 /或预防或其他治疗和 /或预防时，治疗和 /或预防有效量的一种本发明化合物可以以纯形式应用，或者以药学可接受的酯或前药形式 (在存在这些形式的情况下)应用。或者，所述化合物可以以含有该目的化合物与一种或多种药物可接受赋形剂的药物组合物给药。词语"治疗和 /或预防有效量 "的本发明化合物指以适用于任何医学治疗和 /或预防的合理效果 /风险比治疗障碍的足够量的化合物。但应认识到，本发明化合物和组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明第一方面所述的聚乙二醇化环巴胺类似物用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于 0.0001 ~ 1000 mg/kg体重 /天，例如介于 0.001 ~ 100 mg/kg体重 /天，例如介于 0.01 ~ 100 mg/k 体重 /天，例如介于 0.01 ~ 10 mg/kg体重 /天; 或者，本发明第一方面所述的聚乙二醇化环巴胺类似物用于哺乳动物特别是人的剂量可以按其中的环巴胺的量计算，介于 0.0001 ~ 1000 微摩尔环巴胺 /kg体重 /天，例如介于 0.001 ~ 100微摩尔环巴胺 /kg体重 /天，例如介于 0.01 ~ 100微摩尔环巴胺 /kg体重 /天，例如介于 0.01 ~ 10 微摩尔环巴胺 /kg体重 /天；或者，本发明第一方面所述的聚乙二醇化环巴胺类似物用于哺乳动物特别是人的剂量可以参考环巴胺通常使用时的剂量进行确定，例如本发明第一方面所述的聚乙二醇化环巴胺类似物是环巴胺通常使用剂量的 0.1-10 倍，例如是 0.1-8倍、 0.1-7倍、 0.2-6倍、 0.2-5倍、或 0.2-2倍。

必须认识到，第一方面所述的聚乙二醇化环巴胺类似物的最佳给药剂量和间隔是由化合物性质和诸如给药的形式、路径和部位等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须识到，最佳的疗程，即第一方面所述的聚乙二醇化环巴胺类似物在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。附图说明

Fig.l: 在不同 pH ( 6.1、 7.3和 8.1 ) 下，化合物 2随不同时间（0、 2、 4、 6、 20、 24、 36、 48、 72和 144 h ) 的剩余量（以百分率表示）的曲线图。

Fig.2: 在不同 pH ( 6.1、 7.3和 8.1 ) 下，化合物 6随不同时间（0、 2、 4、 6、 20、 24、 36、 48、 72和 144 h ) 的剩余量（以百分率表示）的曲线图。

Fig.3: 在不同 pH ( 6.1、 7.3和 8.1 )下，化合物 12随不同时间（0、 2、 4、 6、 20、 24、 36、 48、 72和 144 h ) 的剩余量（以百分率表示）的曲线图。

Fig.4: 化合物 2、 4、 12、 15、以及环巴胺对肿瘤体积影响的曲线图。具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进^ f亍各种变化和修饰。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和 /或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

对于以下全部实施例，可以使用本领域技术人员已知的标准操作和纯化方法。除非另有说明，所有温度以。 C (摄氏度)表示。所有反应均中室温下进行，除非另有说明。所描述的合成方法将通过使用具体实施例示例性地说明可适用的有机化学法，并且并不表示限制本发明范围。此外，在以下实施例中，尽管在反应流程中标示了聚乙二醇或其衍生物的乙二醇单体聚合数 n , 但所使用的聚乙二醇或其衍生物是分子量来标示其规格，例如在实施例中使用的 "mPEG-NHS-20K，，表示聚乙二醇的分子量为 20000道尔顿级别的产品。另外，实施例中所使用到的聚乙二醇或其衍生物购自商业途径，其它原料或试剂自制或者购自商业途径。

环巴胺提取和分离：环巴胺是使用 Keeler和合作者的方案从加州落芦 (Verairum californicum)^ ^'J的。

收采的根部样品。将该样品风干，研磨成细粉，在室温下将其混悬于含有 NH₄OH (5%)的 CH2C12 的混合物（〜 6L/k 干燥颗粒）中达 16 小时。倾出溶剂，浓缩成糊状，将其置于 THF/己烷 (1 : 3)的混合物中。放置 2-3天之后，倾出溶剂，再浓缩至粘稠的油状物。将该粗制的油加载到硅胶柱 (1-2重量)上，再用 EtOAc/CH₂Cl₂/MeOH/Et3N (8: 1 : 1 : 0.1)洗脱。将富集有环巴胺的级分浓缩至四分之一体积，再将沉淀的环巴胺过滤。可通过用丙酮进一步沉淀来获得更多的环巴胺。可以在热 MeOH (30-40 体积）中将合并的环巴胺重结晶纯化。此方案通常得到每 kg 干生物质 1 g 的环巴胺。在此方法中获得的环巴胺的典型 RP-HPLC纯度超过 95 a/a%@215nm。（化合物 1) ¹HNMR (400 MHz, CD2C12) 5.40 (m, 1 H，)， 3.50 (tt, J = 11.2, 4.0 Hz, 1 H), 3.18 (ddd, = 10.8, 9.7, 3.9 Hz, 1 H)， 3.03 (ddd, = 12.4， 4.2, 1.1 Hz, 1 H)， 2.62 (t, J = 8.8 Hz, 1 H)， 2.41 (p， J = 7.6 Hz, 1 H); 2.37 (ddd, / = 10.8, 4.8, 2.2 Hz, 1 H), 2.27 (m, 3 H)， 2.23 (m, 1 H)， 2.18 (m, 1 H), 2.11 (m, 1 H)， 1.89 (m, 1 H), 1.83 (m, 1 H), 1.81 (m， 1 H), 1.78 (m, 1 H), 1.76(m, 1 H)， 1.72 (m, 1 H), 1.64 (s， 3 H)， 1.58 (m, 1 H)， 1.55 (m, 1 H), 1.51 (m， 1 H)， 1.44 (m， 1 H), 1.31 (m， 1 H)， 1.25 (m, 1 H), 1.23(m, 1 H), 1.13 (m, 1 H)， 1.00 (s, 3 H), 0.94 (d, 7 = 5.2 Hz, 3 H)， 0.92(d, = 5.6 Hz, 3H); ¹³CNHR (100 MHz, CD2C12) δ 142.2 (C-12), 141.9 (C-5), 127.0 (C-13), 121.7 (C-6), 85.0 (C-17), 75.6 (C-23), 71.7 (C-3), 66.5 (C-22), 54.9 (C-26), 52.1 (C-9), 49.1 (C-14), 41.9 (2 C, C-4和 C-8), 39.9 (C-20), 39.2 (C-24), 38.2 (C-1),

36.5 (C-10), 31.9 (C-16), 31.7 (C-25), 31.5 (C-2), 31.1 (C-7), 28.8 (C-ll), 24.7 (C-15), 18.7 (C-27), 18.4 (C-19), 12.8 (C-18), 10.4 (C-21); HRMS (m/z)： [M+H】+下式计算值： C₂₇H₄₂N0₂： 412.32101 , 实测值： 412.32058.

通用的最终化合物纯化：

将全部合成的聚乙二醇化化合物透析，其中使用相当规格的透析袋 (MWCO XXXXX)和水 (2 L)，达 24小时 (换水 2.0 L x 3次）。然后将此溶液冷冻干燥，得到固体产物。通过首先溶解于二氯曱烷中然后使用乙醚沉淀将该固体化合物重结晶，再在真空和 35°C 下干燥，得到最终化合物。

将 mPEG-NHS-20K (1.0 g, 0.05 mmol)和环巴胺（22.6 mg, 0,055 mmol, 1.1当量化合物 1)在 10.0 mL无水二氯曱烷中的混合物在室温下搅拌 24小时。在减压下将该混合物蒸发至约 1.5 mL，然后加入 5.0 mL水以及透析袋 (MWCO 20000) ,再将该溶液对水 (2 L) 透析 24小时 (换水 2.0 L x 3次）。然后将该溶液冷冻干燥成固体化合物。通过首先溶解于二氯甲烷中然后使用乙醚沉淀将该固体化合物重结晶，再在真空和 35°C下干燥，得到最终化合物为 0.98 g (化合物 2)。

¹³CNHR (100 MHz, CD2C12) δ 172.31 (PEG), 142.2 (C-12), 141.9 (C-5), 127.0 (C-13), 121.7 (C-6), 85.0 (C-17), 75.6 (C-23), 71.7 (C-3), 71.15 (PEG), 69.60 (PEG), 66.30 (C-22), 61.54 (C-26), 52.1 (C-9), 49.1 (C-14), 41.9 (2 C, C-4和 C-8)， 39.9 (C-20), 39.2 (C-24), 38.2 (C-1), 36.5 (C-10), 31.9 (C-16), 31.7 (C-25), 31.5 (C-2) 31.1 (C-7), 28.8 (C-11), 24.7 (C-15), 18.7 (C-27), 18.4 (C-19), 12.8 (C-18), 10.4 (C-21);

s/u/ O iiosld ε/-/-εοϊποίAV

中加入 K₂C0₃ (13.8mg, 0.1 mmol)和在另外 20 mL DCM中的固体 CDI (19.45 mg, 0.12 mmol), 在室温下搅拌过夜 (约 12小时）。将该溶液浓缩至 5.0 mL, 再通过透析袋 (MWCO 5000)对水 (2.0 L) 透析。换水 2.0 L X 3次。然后将该溶液冷冻干燥成固体化合物。通过首先溶解于二氯甲烷中然后使用乙醚沉淀将该固体化合物重结晶，以除去已分解的 PEG, 再在真空和 35。C下干燥，得到最终化合物为 4.97 g (化合物 5)。

^ MR (400 MHz, CDC13): 8.12 (s)， 7.40 (s)， 4.22 (m), 3.65-3.53 (宽峰)。

将 CDI-mPEG (1.0 g, 约 0.2 mmol)和环巴胺（90.4 mg, 0.22 mmol, 1.1当量化合物 1)在 7.5 mL 无水二氯甲烷中的混合物在室温下搅拌 24小时。在减压下将该混合物蒸发至约 3.0 mL, 然后加入 5.0 mL水以及透析袋 (MWCO 5000), 再将该溶液对水（2 L) 透析 24小时 (换水 2.0 L x 3次）。然后将该溶液冷冻干燥成固体化合物。通过首先溶解于二氯曱烷中然后使用乙醚沉淀将该固体化合物重结晶，再在真空和 35°C下干燥，得到最终化合物为 0.83 _g (化合物 6)。

¹³CNHR (100 MHz, CD2C12) δ 157.32 (PEG), 141.8 (C-12), 141.9 (C-5), 127.2 (C-13), 121.7 (C-6), 85.0 (C-17), 75.6 (C-23), 71.7 (C-3), 71.2 (PEG), 69.32 (PEG), 66.33 (C-22), 61.21 (C-26),

52.1 (C-9), 49.1 (C-14), 41.9 (C-4和 C-8)， 39.9 (C-20), 39.0 (C-24),

38.2 (C-l), 36.4 (C-10), 31.9 (C-16), 31.7 (C-25), 31.5 (C-2), 31.1 (C-7), 28.7 (C-ll), 24.7 (C-15), 18.7 (C-27), 18.5 (C-19), 12.3 (C-18), 10.3 (C-21);

向 4-臂化 -PEG 10K (5.0 g, 0.5 mmol) 在 20.0 mL DCM中的混合物中加入 K₂C0₃ (276 mg, 2.0mmol) 和在另外 20 mL DCM 中的固体 CDI (392 mg, 2.40 mmol), 在室温下搅拌过夜 (约 12小时）。将该溶液浓缩至 5.0 mL，再通过透析袋 (MWCO 10000)对水 (2.0 L)透析。换水 2.0 L x 3次。然后将该溶液冷冻干燥成固体化合物。通过首先溶解于二氯甲烷中然后使用乙醚沉淀将该固体化合物重结晶，以除去已分解的 PEG, 再在真空和 35。C下干燥，得到最终化合物为 5.02 g (化合物 7)。

^NMR (400 MHz, CDC13): 8.15 (m), 7.38 (m), 4.21 (m), 3.66-3.47 (宽峰)。实施例 7:

将 a-臂化 -CDI-mPEG-10K (1.0 g, 约 0.1 mmol)和环巴胺 (181 mg, 0.44 mmol, 1.1当量化合物 1)在 7.5 mL 无水二氯甲烷中的混合物在室温下搅拌 24小时。在减压下将该混合物蒸发至约 3.0 mL, 然后加入 5.0 mL水以及透析袋 (MWCO 10000)，再将该溶液对水（2 L) 透析 24小时 (换水 2.0 L x 3次）。然后将该溶液冷冻干燥成固体化合物。通过首先溶解于二氯甲烷中然后使用乙醚沉淀将该固体化合物重结晶，再在真空和 35°C下干燥，得到最终化合物为 0.95 g (化合物 8)。

¹³CNHR (100 MHz, CD2C12) δ 157.32 (PEG), 142.3 (C-12), 141.9 (C-5), 127.2 (C-13), 121.7 (C-6), 85.0 (C-17), 75.6 (C-23), 71.7 (C-3), 70.9 (PEG), 69.25 (PEG), 66.33 (C-22), 61.21 (C-26),

52.1 (C-9), 49.1 (C-14), 41.9 (C-4和 C-8), 39.9 (C-20), 39.0 (C-24),

38.2 (C-l), 36.4 (C-10), 31.9 (C-16), 31.7 (G-25), 31.5 (C-2), 31.1 (C-7), 28.7 (C-ll), 24.7 (C-15), 18.7 (C-27), 18.5 (C-19), 12.3 (C-18), 10.4 (C-21)。实施例 8:

将环巴胺 (1) (1.027 g, 2.5 mmol)和 N-琥珀酰亚胺 3-(2-吡啶基二硫）丙酸酯 (SPDP) (1.17ο g, 1.5 eq, 3.75 mmol)在无水二氯甲烷 (DCM) 15 mL中的混合物在室温下搅拌，在室温下搅拌 10小时，用碳酸氢钠和盐水洗涤，在真空下浓缩，用制备型 -HPLC 纯化，得到白色固体为 1.25克 (82% , 纯度 >98%) (化合物 9)。

'HNMR (400 MHz, CD2C12) 8.78 (d, 1H)， 7.86 (dd, 2H)， 7.28 (d, 1H)， 5.42 (m， 1 H，)， 3.50 (m, 1 H)， 3.18 (dd, 1 H)， 3.03 (dd, 1 H), 2.96 (d, 2H)， 2.64-2.62(b, 3 H)， 2.41 (m, 1 H); 2.37 (dd, 1 H), 2.27 (m, 3 H), 2.23 (m, 1 H)， 2.18 (m, 1 H)， 2.11 (m, 1 H)， 1.89 (m, 1 H), 1.82 (m, 2 H), 1.78 (m, 2 H)， 1.71 (m, 1 H)， 1.65 (s, 3 H)， 1.57 (m， 2 H)， 1.51 (m, 1 H)， 1.44 (m, 1 H)， 1.30 (m, 1 H)， 1.25 (m, 1 H)， 1.23(m, 1 H), 1.15 (m, 1 H), 1.01 (s, 3 H)， 0.94 (dd, 3 H), 0.92 (d, 3H);

LC-MS (m/z) : C35H48 2O3S2的 [M+H】+: 609.42

在 0 °C下，向化合物 (9) (1.0 g， 1.6 mmol)在 5.0 mL 无水二氯甲烷中的溶液中加入在 2.0 mL 无水二氯甲烷中的 2-氨基乙硫醇 (0.25 g, 2.0 eq, 3.2 mmol) , 在室温下搅袢 6小时，用碳酸氢钠和盐水洗涤，在真空下浓缩，用制备型 -HPLC 纯化，在真空和 35 °C 下干燥，得到最终化合物为 0.616克 (67% , 纯度 >98%) (化合物 10)。

^NMR (400 MHz, CD2C12) 5.61-5.38 (b, around 3Η，)，3·67 (m, 2H), 3.50 (m, 1 H)， 3.18 (dd, 1 H), 3.05-2.97 (m, 5H)， 2.64-2.62(b, 3 H)， 2.41 (m， 1 H); 2.37 (dd, 1 H)， 2.27 (m， 3 H)， 2.23 (m, 1 H)， 2.18 (m, 1 H)， 2.11 (m, 1 H), 1.89 (m, 1 H), 1.83 (m, 1 H), 1.81 (m, 1 H)， 1.78 (m, 1 H), 1.76(m, 1 H)， 1.72 (m, 1 H), 1.64 (s, 3 H)， 1.58 (m, 1 H)， 1.55 (m， 1 H)， 1.51 (m, 1 H)， 1.44 (m, 1 H)， 1.31 (m, 1 H)， 1.25 (m, 1 H), 1.23(m, 1 H), 1.13 (m， 1 H), 1.00 (s, 3 H), 0.93 (dd, 6 H);

¹³CNHR (100 MHz, CD2C12) δ 142.2 (C-12), 141.9 (C-5), 127.0 (C-13), 121.7 (C-6), 85.0 (C-17), 75.6 (C-23), 71.7 (C-3), 66.5 (C-22), 54.9 (C-26), 52.1 (C-9), 49:1 (C-14), 41.9 (2 C, C-4和 C-8), 39.9 (C-20), 39.2 (C-24), 38.2 (C-1), 36.5 (C-10), 31.9 (C-16), 31.7 (G-25), 31.5 (C-2), 31.1 (C-7), 28.8 (C-11), 24.7 (C-15), 18.7 (C-27) 18.4 (C-19), 12.8 (C-18), 10.4 (C-21);

LC-MS (m/z) : C32H50N3O3S2的 [M+H】+: 575.51 实施例 10:

将 mPEG-NHS-20K (1.0 g, 0.05 mmol)和化合物 10 (31.6 mg, 0,055 mmol, 1.1当量)在 10.0 mL无水二氯甲烷中的混合物在室温下搅拌 24小时。在减压下将该混合物蒸发至约 1.5 mL, 然后加入 5.0 mL水以及透析袋 (MWCO 20000),再将该溶液对水 (2 L) 透析 24小时 (换水 2.0 L X 3次)。然后将该溶液冷冻干燥成固体化合物。通过首先溶解于二氯曱烷中然后使用乙醚沉淀将该固体化合物重结晶，再在真空和 35°C下干燥，得到最终化合物为 0.863g (化合物 11)。

¹³CNHR (100 MHz, CD2C12) δ 175.2， 174.82， 172.31 (PEG), 142.2 (C-12), 141.9 (C-5), 127.0 (C-13), 121.7 (C-6), 85.0 (C-17),

75.6 (C-23), 71.7 (C-3), 71.26 (PEG), 69.63 (PEG), 67.3 (C-O, PEG), 66.30 (C-22), 61.54 (C-26), 55.7 (C-N), 52.1 (C-9), 49.1 (C-14), 41.9 (C-4和 C-8), 40.5 (S-C), 39.9 (C-20), 39.0 (C-24), 38.2 (C-l)， 36.7 (C-10), 33.6 (连接基 C)， 32.1 (C-16), 31.8 (C-25), 31.3 (C-2), 31.1 (C-7), 28.8 (C-11), 24.7 (C-15), 18.7 (C-27), 18.3 (C-19),

12.7 (C-18), 10.3 (C-21); 实施例 11:

将 Y-型 -mPEG-NHS-40K，（4.0 g, 0.05 mmol)和化合物 10 (31.6 mg, 0,055 mmol, 1.1当量化合物 1)在 20.0 mL的无水二氯甲烷和无水 THF (3: 2)中的混合物在室温下搅袢 24小时。在减压下将该混合物蒸发至约 5.0 mL, 然后加入 5.0 mL水以及透析袋 (MWCO 35000), 再将该溶液对水（2 L) 透析 24小时 (换水 2.0 L X 3次)。然后将该溶液冷冻干燥成固体化合物。通过首先溶解于二氯甲烷中然后使用乙醚沉淀将该固体化合物重结晶，再在真空和 35'C下干燥，得到最终化合物为 3.85 g (化合物 12)。

¹³CNHR (100 MHz, CD2C12) δ 175.1, 174.76, 172.42 (PEG), 142.2 (C-12), 141.9 (C-5), 127.0 (C-13), 121.7 (C-6), 85.0 (C-17), 75.6 (C-23), 71.7 (C-3), 71.26 (PEG), 69.63 (PEG), 66.94 (C-O, PEG), 66.30 (C-22), 61.54 (C-26), 55.7 (C-N), 52.1 (C-9), 49.1 (C-14), 42.1 (C-4和 C-8), 40.6 (S-C), 39.9 (C-20), 39.2 (C-24), 38.2 (C-1), 36.7 (C-10), 33.5 (连接基 C)， 32.1 (C-16), 31.6 (C-25), 31.4 (C-2), 31.01 (C-7), 28.7 (C-11), 24.4 (C-15), 19.0 (C-27), 18.4 (C-19), 12.6 (C-18), 10.3 (C-21);

将 4-臂化 -mPEG-COOH-10K (1.0 g, 0.05 mmol)、 l.Oeq EDCI、 0.2 eq DMAP和化合物 10 (126.3 mg， 0,22 mmol, 1.1当量在 7.5 mL的无水 DMF和 THF (2: 1)中的混合物在室温下搅拌 24小时。在减压下将该混合物蒸发至约 5.0 mL,然后加入 5.0 mL 水以及透析袋 (MWCO 10000)，再将该溶液对水（2 L) 透析 24小时 (换水 2.0 L x 3次）。然后将该溶液冷冻干燥成固体化合物。通过首先溶解于二氯甲烷中然后使用乙醚沉淀将该固体化合物重结晶，再在真空和 35Ό下干燥，得到最终化合物为 1.02 g (化合物 13)。

¹³CNHR (100 MHz, CD2C12) δ 174 54 (PEG), 174.27(PEG)， 141.9 (C-12), 141.7 (C-5), 127.0 (C-13), 121.7 (C-6), 85.0 (C-17), 75.6 (G-23), 71.7 (C-3), 71.33 (PEG), 71.25 (PEG), 69.71 (PEG), 69.53 (PEG), 67.10 (C O, PEG), 66.30 (C-22), 61.54 (C-26), 55.7 (C-N), 52.1 (C-9), 49.1 (C-14), 42.1 (C-4和 C-8)， 40.81 (S-C), 40.5 (S-C), 39.9 (C-20), 39.2 (C-24), 38.2 (C-l), 36.7 (C-10), 33.8-33.6 (连接基 C)， 32.1 (C-16), 31.6 (C-25), 31.4 (C-2), 31.01 (C-7), 28.7 (C-ll), 24.4 (C-15), 19.0 (C-27), 18.4 (C-19), 12.6 (C-18), 10.2 (C-21);

将 CDI-mPEG (1.0 g, 约 0.2 mmol, 化合物 5)和化合物 10 (126.3 mg, 0.22 mmol , 1.1 当量化合物 1)在 7.5 mL 的无水 THF/MeOH (12: 1)中的混合物在 35°C下搅拌 12小时。在减压下将该混合物蒸发至约 3.0 mL, 然后加入 5.0 mL 水以及透析袋 (MWCO 5000),再将该溶液对水（2 L) 透析 24小时 (换水 2.0 L x 3次)。然后将该溶液冷冻干燥成固体化合物。通过首先溶解于二氯曱烷中然后使用乙醚沉淀将该固体化合物重结晶，再在真空和

将 a-臂化 -CDI-mPEG-10K (1.0 g，约 0.1 mmol，化合物 7)和化合物 10 (252.6 mg, 0.44 mmol, 1.1 当量)在 7.5 mL 的无水 THF/MeOH (2: 1)中的混合物在 50°C下搅拌 16小时。在减压下将该混合物蒸发至约 3.0 mL, 然后加入 5.0 mL 水以及透析袋 (MWCO 10000), 再将该溶液对水（2 L) 透析 24小时 (换水 2.0 L x 3次)。然后将该溶液冷冻干燥成固体化合物。通过首先溶解于二氯曱烷中然后使用乙醚沉淀将该固体化合物重结晶，再在真空和 35°C下干燥，得到最终化合物为 1.12 g (化合物 15)。

¹³CNHR (100 MHz, CD2C12) δ 174.7, 174.5, 173.9, 157.56 和 157.32 (PEG), 142.5 (C-12), 141.8 (C-5), 127.1 (C-13), 121.8 (C-6), 85.2 (C-17), 75.6 (C-23), 71.8 (C-3), 71.2 (PEG), 69.3(PEG), 66.7 (PEG), 66.33 (C-22), 61.21 (C-26), 52.1 (G-9), 49.1 (C-14), 41.8 (C-4和 C-8), 40.84和 40.52 (S-C), 40.1(C-20), 39.0 (C-24), 38.2 (C-1), 36.4 (C-10), 31.9 (C-16), 31.7 (C-25), 31.5 (C-2), 31.1 (C-7), 28.7 (C-11), 24.7 (C-15), 18.7 (C-27), 18.5 (C-19), 12.3 (C-18), 10.4 (C-21)。生物活性试验：

血浆稳定性研究

将相应的 PEG-环巴胺（25.0 mg)与血浆 (Biomeda, CA) 150 在 37。C下孵育 0、 2、 4、 6、 20、 24、 36、 48、 72和 144 h的不同时间。将该混合物 1: 1的 CH₃CN/MeOH混合物 (800 μΐ)猝灭，涡旋 lmin, 然后通过 0.2 μιη滤膜过滤；通过 HPLC分析 30 μΐ的滤液，测定该结合物的消失。结果如下面的表 1所示。

表 1: 本发明化合物的血浆稳定性研究结果

从表 1可见，本发明的化合物具有良好的血浆稳定性。 DH稳定性研究

将相应的 PEG-环巴胺（化合物 2、 6、 12 ) (10mg/ml)分别稀释于不同 pH ( pH分别为 6.1、 7.4、 8.1 )的磷酸盐緩冲盐水中， pH为 6.1、 7.3和 8.1 , 在 37。C下孵育。在不同的时间点取出等份，加入等体积的 DMSO, 再通过 HPLC分析以测定结合物的消失。通过对剩余起始物质百分数与时间过程进行绘图，生成稳定性特征图。根据在 0、 2、 4、 6、 20、 24、 36、 48、 72和 144 h的样品峰面积对起始峰面积的比率计算该百分数。每个稳定性特征图代表用相同取样时间表的两个独立操作的平均值。每个点的标准偏差一般为 2%或更低。结果如图 1 - 3所示。结果显示，本发明的化合物在 pH6.1 - 8.1之间具有良好的稳定性。体外细胞毒性：

全部细胞系均得自美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection), 并且在以下培养基中生长： COLO 205 和 OVCAR 3 (RPMI 1640，含有 4.5 g/L葡萄糖、10mM HEPES、lmM 丙酮酸钠、 10% FBS); HT-29 (McCoy's 5a, 含有 1.5mM L-谷氨酰胺、 10% FBS); A549 (Ham's F12K, 含有 10% FBS)。全部细胞系均维持在含有 5% C02的 37。C孵育器中。相应的 PEG-坏巴胺与 CT-11 的体外细胞毒性是使用细胞增殖四氮唑染料分析法 (MTS 分析法）进行测定的。简言之，试验开始前一天将 10,000-20,000/孔的细胞辅板于 96-孔板中。用溶解于 DMSO中的相应 PEG-环巴胺、 CPT-11或环巴胺的系列稀释液处理细胞，再在 37。C孵育器中孵育 3-4天。孵育期间结束时，加入 MTS染料，再在 490 nm处使用 Spectramax 340PC读取器 (Molecular Devices CA)测定形成的有色产物甲！ ¾。（IC50: μΜ ) A 区间小于 0.100 μΜ; Β 区间大于 0.100 μΜ 但小于 0.500μΜ; C 区间大于 0.500 μΜ但小于 2.000μΜ; D 区间大于 2.000 μΜ

表 2: 体外细胞毒性试验结果

体内效能研究：人乳房癌 (MX-1)肿瘤碎片得自 DTP, DCTD肿瘤保藏中心， NCI,

Bethesda, MD。皮下 (s.c.)肿瘤异种移植物模型是通过注射人癌细胞或肿瘤碎片在雌性棵鼠的右侧腋下 (axillary flank)区来建立的（4-5 周）。 MX-1肿瘤是通过将从供者小鼠采集的 MX-1肿瘤的 4-至 5-mm³ 组织碎片植入到受者棵鼠的腋下来建立的。动物体内测试采用化合物 2， 4， 12，及 15对照环巴胺进行，给药量均为 5mg/kg，给药每天一次，每组动物三支；结果如图 4所示。结果显示，本发明的化合物能够使肿瘤体积显著缩小在以上的生物活性试验中，本发明聚乙二醇化环巴胺类似物例如实施例提供的聚乙二醇化环巴胺类似物具有优良的、令人满意的结果。

* * * * *

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

Claims

权利要求

1. 聚乙二醇化环巴胺类似物，其是以下式 I表示的化合物，或者是包括至少一个各自相同或不同的以下式 I表示的基团部的化合物：

L是下式 II表示的连接

(Π)

其中，

R₂选自— C(0)R^e、 — C(0)OR、 — C(0)NR^fR^g、 -C(NR^e)NR^fR^g、 -OR^e、 -OC(0)R^e、 -OC(0)OR^e、 - OC(0)NR^fR^g、 -OC(=NR^e)NR^fR^g、 - OS(0)R^e、 - OS(0)₂R^e、 -OS(0)NR^fR^g、 - OS(0)₂NR^fR^g、 -NR^fR^g、 -NR^eC(0)R^h 、 -NR^eC(0)OR^f 、 -NR^eC(0)NR^fR^g 、 -NR^eC(=NR^h)NR^fR^g 、 -NR^eS(0)R^h 、 -NR^eS(0)₂R^h 、 - NR^eS(0)NR^fR^g、 - NR^eS(0)₂NR^fR^g、 -SR^e、 - S(0)R^e、 -S(0)₂R^e、一 S(0)NR^fR^g和 -S(0)₂NR^fR^g，其中各个 R^e、 R^f、 R^g和 R^h独立地选自氢、烷基、 C₂.₆烯基、或者 R^f和 R^g与它们连接的 N原子一起形成含氮杂环基；

Y选自 0、 N、 S-S、亚甲基、亚乙基，其中有 /充包括下列的其它官能团：组织特异性靶功能基团和 /或各种细胞特异性靶功能基团例如 vitamine、叶酸衍生物、抗体；

m为 0至 6的整数；

X为环巴胺与 L之间的选自下列的连接基： - C(0)、 -OC(0)、 -NC(0)、 - OS(0)、 - OS(0)₂、 -OS(0

2. 根据权利要求 1的聚乙二醇化环巴胺类似物，其中 R所示聚乙二醇的分子量为 300至 180,000道尔顿、 400至 160,000道尔顿、 500至 150,000道尔顿、 600至 120,000道尔顿、 800至 100,000 道尔顿、 1000至 80,000道尔顿、 1500至 60,000道尔顿、 2000至 50,000道尔顿、 5000至 50,000道尔顿、 7500至 50,000道尔顿、或 10000至 50,000道尔顿。

3. 根据权利要求 1的聚乙二醇化环巴胺类似物，其中 R所示聚乙二醇是下式 ΙΠ所示的聚乙二醇：

R 门

(III)

其中：

是封端子，其选自 H、 Me、烷基 (例如 d.₁₂烷基、 d.₈烷基、烷基、或 d_₄烷基)、组织特异性靶功能基团和 /或各种细胞特异性靶功能基团其为 vatamine、叶酸衍生物、抗体；

n在每次出现时各自独立地是 100-4500的整数。

4. 根据权利要求 1的聚乙二醇化环巴胺类似物，其特征在于以下（1)-(³)的任一项或多项：

(1) R是直线或分支的并具有 200至 200,000道尔顿 (例如

300至 180,000道尔顿、 400至 160,000道尔顿、 500至 150,000道尔顿、 600至 120,000道尔顿、 800至 100,000道尔顿、 1000至 80,000 道尔顿、 1500至 60,000道尔顿、 2000至 50,000道尔顿、 5000 50,000道尔顿、 7500至 50,000道尔顿、或 10000至 50,000道尔顿) 的分子量的聚乙二醇，

(2) L是下式 II表示的连接基：

R₂^Y^m

(Π)

其中，

R₂选自— C(0)R^e、 -C(0)OR^e、 — C(0)NR^fR^g、 - C(NR^e)NR^fR^g、 - OR^e、 - OC(0)R^e、 - OC(0)OR^e、 - OC(0)NR^fR^g、 -OC(=NR^e)NR^fR^g、 -OS(0)R^e、 - OS(0)₂R^e、 - OS(0)NR^fR^g、 - OS(0)₂NR^fR^g、 -NR^fR^g、 -NR^eC(0)R^h 、 -NR^eC(0)OR^f 、 -NR^eC(0)NR^fR^g 、 -NR^eC(=NR^h)NR^fR^g、 -NR^eS(0)R^h、 -NR^eS(0)₂R^h、 -NR^eS(0)NR^fR^g、 -NR^eS(0)₂NR^fR 、 -SR^e、 - S(0)R^e、 -S(0)₂R^e、 -S(0)NR^fR 和 -S(0)₂NR^fR , 其中各个 R^e、 R^f、 1^和1^独立地选自氢、 d_₆烷基、 C₂.₆烯基、或者 R^f和 R^g与它们连接的 N原子一起形成含氮杂环基；

Y选自 0、 N、 S-S、亚曱基、亚乙基，其中有 /无包括下列的其它官能团：组织特异性靶功能基团和 /或各种细胞特异性靶功能基团例如维生素、叶酸衍生物、抗体；

m为 0至 6的整数；

(3) X 为环巴胺与 L 之间的选自下列的连接基： -C(0)、 -OC(0)、 -NC(0)、 - OS(0)、 -OS(0)₂、 -OS(0)₀

5. 聚乙二醇化环巴胺类似物，其为聚乙二醇或其衍生物与环巴胺经环巴胺 F环上的环氮原子连接的偶合物，或其单一对映体、对映体的混合物、或非对映体的混合物，或其药学可接受的盐、溶剂合物、或水合物。

6. 根据权利要求 5的聚乙二醇化环巴胺类似物，其中所述聚乙二醇或其衍生物与环巴胺之间是通过包含酰胺基、磺酰胺基、或亚磺酰胺基的连接子连接的。

7. 根据权利要求 6的聚乙二醇化环巴胺类似物，所述的连接子中包含选自下列的基团： -c(o)、 — oc(o)、一 NC(O)、 -os(o)、

- OS(0)₂、 -OS(0) o

8. 根据权利要求 6或 7的聚乙二醇化环巴胺类似物，所述的连接子中包括下式 II表示的基团部分：

(II)

其中:

R₂ 选自 - C(0)R^E、 - C(0)OR^E、 - C(0)NR^FR^G、 - C(NR^E)NR^FR^G、 -OR^E、 -OC(0)R^E、 -OC(0)OR^E、 - OC(0)NR^FR^G、 -OC(=NR^E)NR^FR^G、 - OS(0)R^E、 -OS(0)₂R^E、 -OS(0)NR^FR^G、 -OS(0)₂NR^FR^G、 - NR^FR^G、 -NR^EC(0)R^H 、 -NR^EC(0)OR^F 、 -NR^EC(0)NR^FR^G 、 -NR^EC(=NR^H)NR^FR^G 、 -NR^ES(0)R^H 、 -NR^ES(0)₂R^H 、 -NR^ES(0)NR^FR^G、 -NR^ES(0)₂NR^FR^G、 - SR^E、 - S(0)R^E、 -S(0)₂R^E、一 S(0)NR^FR^G和— S(0)₂NR^FR^G，其中各个 R^E、 R^F、 R^G和 R^H独立地选自氢、 d.₆烷基、 C₂.₆烯基、或者 ^和！^与它们连接的 N原子一起形成含氮杂环基；

m 为 0至 6的整数。

9. 根据权利要求 1-8任一项的聚乙二醇化环巴胺类似物，其选自：

46

及其药学可接受的盐、溶剂合物和水合物。

10. 制备权利要求 1-9任一项所述聚乙二醇化环巴胺类似物的方法，其包括以下步骤：

ii)使步骤 i)提供的物质与环巴胺或其单一对映体、对映体的混合物、或非对映体的混合物，或其药学可接受的盐、溶剂合物、或水合物反应，得到聚乙二醇化环巴胺类似物；和任选地， iii)使步骤 ii)所得的聚乙二醇化环巴胺类似物进行进一步的处理，例如进行分离、结晶、纯化、成盐、成溶剂合物等处理。

11. 一种药物组合物，其包含治疗和 /或预防有效量的权利要求 1-9任一项所述聚乙二醇化环巴胺类似物，或其单一对映体、对映体的混合物、或非对映体的混合物，或其药学可接受的盐、溶剂合物、或水合物，以及任选的一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。

12. 权利要求 1-9任一项所述聚乙二醇化环巴胺类似物或者权利要求 11所述药物组合物在制备用于治疗和 /或预防增殖性疾病、肿瘤性疾病或癌性疾病的药物中的用途。

13. 根据权利要求 12的用途，其中所述的增殖性疾病、肿瘤性疾病或癌性疾病是可以用环巴胺或其类似物治疗和 /或预防的疾病；具体地，所述肿瘤性疾病或癌性疾病为肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、或者乳腺癌。

14. 在有需要的哺乳动物中治疗和 /或预防增殖性疾病、肿瘤性疾病或癌性疾病的方法，该方法包括给有需要的哺乳动物施用治疗和 /或预防有效量的权利要求 1-9任一项所述聚乙二醇化环巴胺类似物或者权利要求 11所述药物组合物。

15. 根据权利要求 14的方法，其中所述的增殖性疾病、肿瘤性疾病或癌性疾病是可以用环巴胺或其类似物治疗和 /或预防的疾病。

16. 权利要求 1-9任一项所述聚乙二醇化环巴胺类似物或者权利要求 11所述药物组合物作为 Hedgehog通道抑制剂的用途。