WO2011099670A1 - 셀룰로시마이크로비움 펀케이 에이치와이-１３ 균주로부터 생산되는 신규한 자일라나아제 - Google Patents

셀룰로시마이크로비움 펀케이 에이치와이-１３ 균주로부터 생산되는 신규한 자일라나아제 Download PDF

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WO2011099670A1
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xylanase
amino acid
seq
acid sequence
transformant
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PCT/KR2010/001693
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박호용
손광희
김도영
정태숙
김성욱
신동하
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한국생명공학연구원
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/248—Xylanases
    • C12N9/2482—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
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    • A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01008—Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)

Definitions

  • It relates to a microorganism producing the novel xylanase of the present invention.
  • the plant cell wall the largest reservoir of fixed carbon in nature, consists of three important compounds: cellulose [insoluble ⁇ -1,4-glucan cellulose] and hemicellulose [glucan]. non-cellulose polysaccharides including glucan, mannan and xylan] and lignin (a complex polyphenol structure). Hemicellulose binds the bundle of cellulose and serves as a binder to keep the biomass structurally firm, which is the biggest obstacle of hydrolysis for the utilization of biomass of lignocellulosic strains (Biomass recalcitrance).
  • xylanase enzymes It is generally known that three enzymes, endo- ⁇ -xylanase, exo- ⁇ -xylanase, and ⁇ -xylosidase, must work together to completely decompose and glycosylate xylan, the main component of hemicellulose. And these are collectively referred to as xylanase enzymes.
  • Xylan is composed of 30% sugar in herb hemicellulose and 20% sugar in legume forage hemicellulose. Since hemicellulose in legume feed consists of more complex sugar complexes than hemicellulose in grass, enzymes are required to dissolve fiber for the breakdown of hemicellulose in more complex structures in legume feed.
  • xylanase to grain feed can hydrolyze the hemicellulose layer surrounding the grains to increase the availability of nutrients in the grains, as well as improve the intestinal digest of livestock.
  • bioethanol which has recently been spotlighted as a green energy
  • technology is being transferred from the first generation bioethanol based on corn starch to the second generation bioethanol based on fiber, and the pretreatment of fibrin biomass is a specialized enzyme.
  • the application of xylanase has high value as an enzyme for feed addition and high value as an enzyme group for bioenergy production.
  • Trichoderma Trichoderma
  • Fungi in Trichoderma grow late and grow longer, and there is difficulty in genetic use and mutation.
  • microorganisms such as bacteria
  • the growth is fast and genetic variation is easy, and thus industrial use is high.
  • the selection of bacterial microorganisms capable of producing xylanase is urgent.
  • xylanase produced in Trichoderma sp. Shows maximum activity under acidic conditions around pH 5.0.
  • xylanase is required as an enzyme for feed addition as an enzyme having optimal enzyme activity that matches the intestinal pH conditions of livestock.
  • Invertebrates including insects, are among the most prolific biomes on the planet, showing a variety of food habits and high biodiversity. Recently, researches on utilizing the symbiotic microorganisms as useful biological resources in consideration of the life characteristics of invertebrates have been increasing, and researches on intestinal microorganisms which are closely related to the growth of invertebrates have been actively conducted. For example, research has shown that microorganisms related to the degradation of wood, termite's main food, are involved in the digestion and nutrition of termites, and isolates of highly efficient protease-producing strains from sugarless spiders that feed on animal food.
  • the present inventors have selected a highly efficient xylanase producing strain that produces novel xylanase XylK1 targeting the intestines of a number of invertebrates such as earthworms that feed on vegetable debris of the soil.
  • Xylanase isolated from lysates sugar substrates, including xylan, with high activity at neutral and basic pH, and X4 to X7 using xylotriose (X3) and xylotetraose (X4) as substrates. It was confirmed that the production of xyloligosaccharides (xylooligosaccharide).
  • the xylanase of the present invention includes a Fn3 domain (Fibronectin Type 3 Domain), and it was found that the Fn3 domain plays an important role in determining the activity of the enzyme and the binding ability to the substrate.
  • the present invention has been completed by confirming that it can be usefully used as a feed efficiency improving agent and a biomass degrading enzyme.
  • xylanases having the following characteristics (a) to (h):
  • GH10 glycoside hydrolase family 10
  • Fn3 domain Fibronectin Type 3 Domain
  • CBM2 carbohydrate-binding module2
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the xylanase.
  • the present invention also provides a recombinant expression vector operably linked to the polynucleotide.
  • the present invention also provides a transformant in which the recombinant expression vector is introduced into a host cell.
  • the present invention provides a xylanase comprising the xylanase, xylanase produced by the method or the transformant.
  • the present invention also provides a composition for processing xylan in a food comprising the xylanase, xylanase produced by the method or the transformant.
  • the present invention provides a composition for papermaking process comprising the xylanase, xylanase produced by the method or the transformant.
  • the present invention also provides a feed additive comprising the xylanase, the xylanase produced by the method or the transformant as an active ingredient.
  • the present invention provides a vegetable feed with increased xylan glycosylation, comprising the feed additive as an active ingredient.
  • the present invention also provides a feed manufacturing method comprising the step of adding the xylanase, the xylanase produced by the method or the transformant to the feed material of the animal.
  • the present invention provides a method for decomposing xylan comprising adding the xylanase, the xylanase produced by the method or the transformant to a fibrin-based biomass or xylan-containing solution.
  • the present invention provides a use of the xylanase, the xylanase produced by the method or the transformant for the production of a composition for processing xylan in food.
  • the present invention also provides a use of the xylanase, the xylanase produced by the method or the transformant in the manufacture of a papermaking process composition.
  • the present invention provides a use of the xylanase, the xylanase produced by the method or the transformant in the preparation of a feed additive.
  • the glycoside hydrolase family 10 (GH10) xylanase isolated from the Cellulosimicrobium funkei HY-13 strain of the present invention has a high activity at neutral and basic pH and contains a sugar substrate containing xylan. It was digested and xyloligosaccharides of X2 to X7 were generated using xylotriose (X3) and xylotetraose (X4) as substrates. Accordingly, the xylanase of the present invention can be usefully used as a feed efficiency improving agent and a biomass degrading enzyme.
  • xylanase 1 is a polypeptide sequence of a novel xylanase isolated from the present invention and a GH10 xylanase ( Cellulosimicrobium sp. Strain) HY-13 (Csp) xylanase (FJ859907) registered in NCBI; Cellulomonas fimi (Cfi) xylanase (AAA56792); Streptomyces coelicolor (Sco) A3 xylanase (CAB61191); Streptomyces ambofaciens (Sam) xylanase (CAJ88420); Acidothermus cellulolyticus 11B (Ace) xylanase (ABK51955); And thermobifida alba (Tal) xylanase (CAB02654), which shows the homology of the polypeptide sequences.
  • HY-13 Csp xylana
  • black boxes are the same amino acids and the gray boxes are the like amino acids respectively;
  • Glycoside hydrolase family 10 GH10
  • Fibronectin type 3 Fn3
  • CBM2 carbohydrate-binding module2 domains
  • the present invention provides a xylanase having the following characteristics (a) to (h):
  • GH10 glycoside hydrolase family 10
  • Fn3 domain Fibronectin Type 3 Domain
  • CBM2 carbohydrate-binding module2
  • the xylanase of the present invention is characterized by producing xylooligosaccharides using xylotriose and xylotetraose as substrates.
  • the Fn3 domain preferably has an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 11, but is not limited thereto, and any Fn3 domain known in the art is included in the scope of the present invention.
  • new xylanase was isolated using the conserved sequence from the strain.
  • a primer was prepared from a region previously conserved in the sequence and orientation of GH10 xylanase, which was previously reported, to clone a polynucleotide sequence encoding GH10 xylanase from the gDNA of the strain into a protein expression vector.
  • the recombinant xylanase enzyme rXylK1
  • the xylanase of the present invention was found to have a molecular weight of about 42.0 kDa.
  • XylK1 of the present invention in contrast to other GH10 xylanase, N-terminal enzyme activity GH10 It was found to be a single unit xylanase comprising a domain (SEQ ID NO: 10, Leu38 to Asp330), a Fn3 domain (SEQ ID NO: 11, Pro359 to Gly430) and a C-terminal CBM2 domain (SEQ ID NO: 12, Cys454 to Cys553) ( See FIG. 1).
  • unit xylanase (GenBank Accession Number ABQ06877) having an N-terminal Fn3 domain and a C-terminal GH10 domain has been reported through genome studies in Flavobacterium johnsoniae UW101, but the characteristics of the protein have been reported. This is not known, and nothing else has been reported for GH10 xylanase including Fn3.
  • the enzymatic GH10 domain of XylK1 was 67% sequence homologous (67%) to cellulomonas fimi xylanase (AAA 56792) among the GH10 enzymes available in the NCBI database.
  • the CBM 2 domain showed 64% sequence homology with Cellulomonas pimi GH6 cellulase (AAC36898).
  • the Fn3 domain of XylK1 exhibited the highest sequence homology (70%) with Acidothermus cellulolyticus 11B GH48 enzyme (ABK52390), which degrades cellulose.
  • it showed the highest enzyme activity at pH 6.0, the enzyme activity of more than 80% was maintained in the pH 5.0 to pH 9.0 range.
  • it showed the maximum activity at 50 °C ⁇ 60 °C, especially at 55 °C.
  • rXylK1 was reduced by 40% by Hg 2+ , 25% by Ca 2+ , Cu 2+ and Ba 2+, and was stable to Mn 2+ and Co 2+ , and was stabilized by Fe 2+ . Enzyme activity was increased. In addition, rXylK1 decreased enzymatic activity by EDTA, but was used in sulfhydryl reagents such as sodium azide, iodoacetamide and N-ethylmaleimide.
  • the xylanase of the present invention was completely inhibited by 5 mM N-bromosuccinimide, and the enzyme activity was significantly increased when Tween 80 or Triton X-100 was added.
  • the recombinant xylanase (rXylK1) and mutant xylanase (rXylK1 ⁇ Fn3) which lacks the Fn3 domain, the effect of the Fn3 domain on enzymatic activity was determined. There was no significant change in affinity.
  • the higher ability to degrade Birchwood xylan indicates that the xylanase having the Fn3 domain of the present invention will bind better to the substrate. In addition, it was confirmed that the substrate actually bound more efficiently than hydrolyzed.
  • the xylanase produced from the strain identified in the present invention is a novel xylanase different from the existing xylanase.
  • the xylanase of the present invention preferably includes any one of the following amino acid sequences, but is not limited thereto:
  • amino acid sequence of a protein functionally identical to a protein having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 5, wherein the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 5 consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added; ;
  • the stringent conditions of e) above are determined upon cleaning after hybridization.
  • One of the stringent conditions is 15 minutes with 6 ⁇ SSC, 0.5% SDS at room temperature, then 30 minutes with 2 ⁇ SSC, 0.5% SDS at 45 ° C, 30 minutes with 0.2 ⁇ SSC, 0.5% SDS at 50 ° C. Repeat the wash twice. More preferred stringent conditions are to use higher temperatures than above.
  • the other parts of the stringent conditions are carried out in the same manner, but the last two 30 minutes are washed with 0.2 ⁇ SSC, 0.5% SDS at 60 ° C.
  • Another stringent condition is to clean the last two times with 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS at 65 ° C. under the strict conditions. Those skilled in the art can clearly set these conditions in order to obtain the stringent conditions required.
  • the xylanase of the present invention preferably exhibits maximum activity at pH 5 to pH 9, preferably pH 6, and preferably maximum activity at 50 ° C to 60 ° C, preferably 55 ° C.
  • the xylanase of the present invention is preferably derived from Cellulosimicrobium funkei HY-13 strain deposited with accession number KCTC 11302BP, but is not limited thereto.
  • the culture supernatant was used as a coenzyme solution to isolate the microorganisms producing xylanase by selecting strains with excellent degradation ability of xylan.
  • the isolated strain was an in vitro symbiotic group, was a Gram-positive bacterium, and showed homology with 16S rDNA sequencing to the homologous cellulose strain of fungi ATCC BAA-886 of 99.8%.
  • This strain was identified as Cellulosimacrobi funk and named Cellulosimachromium funk HY-13.
  • the cellulosic microbium funky HY-13 strain was deposited on March 12, 2008 to the Gene Bank of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Accession No .: KCTC 11302BP).
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the xylanase.
  • the polynucleotide encoding the xylanase preferably includes but is not limited to any one of the following base sequences:
  • amino acid sequence of a protein functionally identical to a protein having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 5, wherein the amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 5 consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added;
  • a base sequence encoding a
  • the base sequence of the protein which is a DNA base sequence hybridized under stringent conditions with the DNA comprising the base sequence of SEQ ID NO: 4, and functionally identical to the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the present invention also provides a recombinant expression vector operably linked to the polynucleotide.
  • the present invention has revealed the nucleotide sequence of a novel gene encoding xylanase isolated from the Celluloshima microbium funky HY-13 strain, so that a recombinant vector comprising the gene can be obtained using conventional methods known in the art. I can make it.
  • the recombinant vector of the present invention may use a commercially available vector, but is not limited thereto, and those skilled in the art may prepare and use a suitable recombinant vector.
  • the present invention also provides a transformant in which the recombinant expression vector is introduced into a host cell.
  • the host cell that can be used in the present invention is not limited, but is preferably selected from the group consisting of prokaryotic cells including E. coli, yeast, animal cells, and insect cells, and more preferably using E. coli. It is not limited.
  • step 2) removing the insoluble precipitate from the precipitate of step 1) and dialysis to obtain a crude enzyme solution;
  • step 3) may be formed by a method comprising the step of purifying the crude enzyme solution of step 2) by column chromatography, but is not limited thereto.
  • the medium is preferably selected from the cellulose microbium funk HY-13 strain of the present invention or a medium suitable for the transformant of the present invention from a commercial medium known to those skilled in the art.
  • the precipitant of step 1) may be any one selected from the group consisting of ammonium sulfate, acetone, isopropanol, methanol, ethanol, polyethylene glycol.
  • the precipitation may be performed by concentrating by replacing the ultrafiltration method using a membrane having various pore sizes.
  • the column chromatography of step 3 may be purified by performing column chromatography using a filler selected from the group consisting of silica gel, Sephadex, RP-18, polyamide, Toyopearl, and XAD resin. Column chromatography can be carried out several times by selecting the appropriate filler as required.
  • the present invention provides a xylanase comprising the xylanase, xylanase produced by the method or the transformant.
  • the xylan degrading agent of the present invention can be used as the xylan degrading agent as well as the xylanase produced by the strain or the transformant.
  • the present invention also provides a composition for processing xylan in a food comprising the xylanase, xylanase produced by the method or the transformant.
  • the present invention provides a composition for papermaking process comprising the xylanase, xylanase produced by the method or the transformant.
  • composition of the present invention may include the same or similar components in addition to the xylanase of the present invention, preferably containing 1 to 90% of the total composition of the xylanase of the present invention, but is not limited thereto.
  • the xylanase of the present invention exhibits high activity in neutral and basic conditions (pH 5-9), whereas the conventional fungal-derived xylanase exhibits weak hydrolytic activity in neutral and basic conditions with acid xylanase. And since it has a xylose substitution activity capable of producing a long xyloligosaccharide from X4 can be used for a wide range of pH and high activity xylanase.
  • the present invention also provides a feed additive comprising the xylanase, the xylanase produced by the method or the transformant as an active ingredient.
  • the xylanase of the present invention showed the highest activity at pH 6.0, but the activity was maintained at 80% or more even in the pH range of 5.0 to 9.0.
  • the fungal-derived xylanase has low activity at neutral pH as acid xylanase
  • the xylanase of the present invention has a high activity even at a neutral pH and an alkyly pH range, and thus as an enzyme for feed addition. Its utilization is likely to be high.
  • the enzyme had the highest cleavage activity against PNP cellobioside, which was higher than that for other xylanases known as the same substrate (Haga KM). et al. , 1991; Kim DY et al. , 2009. Proc. Biochem. 44: 1055-1059).
  • the xylanase of the present invention is used against Birchwood xylan, beech wood xylan, oat spelt xylan and PNP (p-nitrophenyl) -cellobioside.
  • the xylanase of the present invention has no cellulase activity and is a true endo- ⁇ -1,4-xyl It was confirmed that it was a lanase. In addition, it was confirmed that the xylanase of the present invention has xylose substitution activity capable of cleaving PNP-xylopyranoside.
  • the xylanase of the present invention had specificity and efficiently decomposed xylan, and it is considered that the xylanase is effective for animal feed considering the high content of xylan in the vegetable grain feed most used in animals. Looking at these results, it was found that the xylanase of the present invention is suitable as a feed additive for the purpose of enhancing the decomposition of xylan from vegetable feed.
  • xylanase produced by the method of the present invention can be usefully used as a feed additive for xylan glycosylation.
  • the feed additive of the present invention is added to the feed of non-ruminant, such as pigs and chickens, which has low efficiency of starch or protein utilization of grains contained in the cell wall because there is no enzyme capable of breaking down the plant cell wall.
  • non-ruminant such as pigs and chickens
  • the value of the feed can be improved.
  • Xylanase the active ingredient of the feed additive of the present invention, is preferably composed of 0.01 to 10 parts by weight, more preferably 0.05 to 5 parts by weight of xylanase, and 0.12 to xylanase. Most preferably, it is comprised by weight part.
  • the feed additive may additionally contain a carrier that is acceptable to the unit animal.
  • the feed additive may be added as it is, or a known carrier, stabilizer, or the like. If necessary, various nutrients such as vitamins, amino acids, minerals, antioxidants, and other additives may be added. Powders, granules, pellets, suspensions and the like may be in a suitable state.
  • the unit animal may be supplied alone or mixed with feed.
  • the present invention provides a vegetable feed with increased xylan glycosylation, comprising the feed additive as an active ingredient.
  • the applications currently occupying the xylanase enzyme market can be broadly categorized into food, feed and technology (Bedford and Morgana, World's Poultry Science Journal 52: 61-68, 1996).
  • food fruit and vegetable production, brewing and liquor production, bakery and confectionery
  • it is used for quality improvement through softening and refining efficiency of materials, viscosity reduction, and extraction and filtration efficiency.
  • feed market it is used to reduce non-starch carbohydrates, improve intestinal viscosity, and increase digestibility of protein and starch in feeds such as pigs, poultry and ruminants (Kuhad and Singh, Crit. Rev. Biotechnol. 13, 151-172 , 1993).
  • it is used in the papermaking process, biological whitening process, reduction of chlorine consumption, energy reduction through reduction of mechanical papermaking process, deinking effect, separation of starch and gluten, renewable fuel (bioethanol) and chemical raw material production. .
  • novel xylanase of the present invention can be usefully used for paper production and waste paper regeneration, feed addition and food quality improvement or decomposition of xylanase for industrial use, which is obvious to those skilled in the art.
  • the compositions can be formulated and formulated in a manner known to those skilled in the art.
  • the present invention also provides a feed manufacturing method comprising the step of adding the xylanase, the xylanase produced by the method or the transformant to the feed material of the animal.
  • the amount of the strain, the transformant or the xylanase produced by the strain or the transformant can be adjusted by those skilled in the art.
  • the present invention provides a method for decomposing xylan comprising adding the xylanase, the xylanase produced by the method or the transformant to a fibrin-based biomass or xylan-containing solution.
  • the xylan decomposition method of the present invention is preferably used in the production process of renewable fuels or chemical raw materials, but is not limited thereto.
  • the amount of the strain, the transformant or the xylanase produced by the strain or the transformant can be adjusted by those skilled in the art.
  • the present invention provides a use of the xylanase, the xylanase produced by the method or the transformant for the production of a composition for processing xylan in food.
  • the xylan decomposer of the present invention can be used directly as the xylan decomposer, as well as the xylanase produced by the strain or the transformant, it can be used in the preparation of xylan processing composition in food.
  • the present invention also provides a use of the xylanase, the xylanase produced by the method or the transformant in the manufacture of a papermaking process composition.
  • the present invention provides a use of the xylanase, the xylanase produced by the method or the transformant in the preparation of a feed additive.
  • composition of the present invention When used for the preparation of the composition for the papermaking process or the preparation of the feed additive, it may contain the same or similar components in addition to the xylanase of the present invention, the xylanase of the present invention 1 to 90 It is preferably contained in%, but is not limited thereto.
  • the xylanase of the present invention exhibits high activity in neutral and basic conditions (pH 5-9), whereas the existing fungal-derived xylanase shows weak hydrolytic activity in neutral and basic conditions with acid xylanase. And since it has a xylose substitution activity capable of producing a long xyloligosaccharide from X4 can be used for a wide range of pH and high activity xylanase.
  • the present inventors collected the invertebrate earthworm ( Eisenia fetida ) used to search for microorganisms having xylanase production activity near Daejeon, transported them to the laboratory in a live state, and used them.
  • the earthworm surface was washed once with 70% (w / w) ethanol and again three times with sterile distilled water for isolation of bacteria producing xylanase.
  • the washed samples were dissected to separate the intestines and then ground in PBS buffer (0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.144% Na 2 HPO 4 , 0.024% KH 2 PO 4 ) and ground.
  • the strains selected by the above method were restricted medium containing 0.5% Birchwood xylan (K 2 HPO 4 7 g / L, KH 2 PO 4 2 g / L, (NH 4 ) 2 SO 4 1 g / L, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 1.1 g / L, yeast extract 0.6 g / L) inoculated in 3 ml and incubated for 48 hours in a shaking incubator at 25 °C, the supernatant was recovered by centrifugation to measure the xylanase activity, Among the strains excellent in xylanase activity was finally selected.
  • Birchwood xylan K 2 HPO 4 7 g / L, KH 2 PO 4 2 g / L, (NH 4 ) 2 SO 4 1 g / L, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 1.1 g / L, yeast extract 0.6 g / L
  • the enzyme activity was used as the DNS (Dinitrosalicylic acid) assay (Miller GL, Anal . Chem ., 55: 952-959, 1959). Specifically, 350 ⁇ l of substrate solution (1% Birchwood xylan) and 50 ⁇ l 0.5 M phosphate buffer solution (pH 6.0) were added to 100 ⁇ l of enzyme solution diluted at a constant ratio and reacted at 55 ° C. for 10 minutes, followed by 750 ⁇ l. DNS (3,5-Dinitrosalicylic acid) solution was added and then left for 5 minutes at 100 °C was measured at absorbance 540 nm. One unit of enzyme was defined as the amount of enzyme that releases 1 ⁇ mol of reducing sugar in one minute.
  • DNS Dinitrosalicylic acid
  • Example 1 a strain selected from the intestine of the earthworm was identified.
  • the isolated strain was an in vitro symbiotic group present in the intestinal mucosa and was Gram-positive bacteria.
  • genomic DNA of the strain was isolated to determine the 16S rDNA nucleotide sequence of the microorganism, PCR reaction was carried out with the following composition. Specifically, 2 ⁇ l of 10-fold Tag DNA polymerase buffer (MgCl 2 added) to 1 ⁇ l of genomic DNA (50-100 ng / ⁇ l), 2 ⁇ l of 2.5 mM dNTPs, 10 pmol of forward primer (27F: 5 ′).
  • PCR reaction was denatured at 94 ° C for 5 minutes, denatured at 94 ° C for 30 seconds, annealed at 50 ° C for 30 seconds, and repeated 30 minutes at 72 ° C for 30 minutes, and finally at 72 ° C. Finished with extension for 7 minutes at and maintained at 4 ° C.
  • the inventors of the present invention use the primers prepared based on the sequence of the regions (WDVVNE and ITELDI) conserved in the glycoside hydrolase family 10 (GH10) xylanase in the genomic DNA of the strain selected in Example 2
  • the polynucleotide sequence (SEQ ID NO: 4) encoding SEQ ID NO: 5) was amplified and cloned.
  • genomic DNA is isolated from the strain, and then the genomic DNA is used as a template, 10 ⁇ buffer (MgCl 2 ), 2.5 mM dNTPs, 5 ⁇ GC-rich buffer, FastStart Taq DNA polymerase (Roche), and sequence Using primer pairs of the sense primers described by number 6 (5'-TGG GAC GTC STC AAC GAG-3 ') and the antisense primers described by SEQ ID NO: 7 (5'-GAT GTC GAG CTC SGT GAT-3') PCR was performed for the xylanase gene.
  • PCR conditions were repeated 35 times under conditions of 5 minutes at 95 ° C., 30 seconds at 95 ° C., 30 seconds at 50 ° C., 30 seconds at 72 ° C., and 40 seconds at 72 ° C., followed by last extension at 72 ° C. for 7 minutes. It was performed under the conditions.
  • PCR product of 342 bp xylanase obtained through the PCR was subjected to genome walking and nested-PCR using the DNA Walking SpeedUp premix kit (Seegene, Korea) to complete xy1K1. PCR products for the genes were obtained.
  • the PCR product of the entire xy1K1 gene and pET-28a (+) vector were digested with Nde I and Hind III restriction enzymes and purified. About 100 ng of each of the purified vectors and PCR products was added, and 1 unit of ligase (TaKaRa) was added thereto, followed by reaction at 16 ° C. for 16 hours. After the ligation reaction, the cells were transformed into BL21 (Novagen), screened in kanamycin-containing plates, and then digested with appropriate restriction enzymes to obtain plasmids containing the desired DNA fragments. Finally, clones were finally cloned through DNA sequencing. Confirmed. The prepared expression vector was named 'pET-xy1K1'.
  • the “pET-XylK1 ⁇ Fn3” expression vector in which both the fibronectin type 3 domain and the carbohydrate-binding module 2 (CBM 2) domain were deleted in the entire xy1K1 gene was identified by the sense primer (5′-).
  • the sense primer (5′-).
  • CAT ATG GCC ACC GAG CCG CTC G-3 ') and primer pairs of antisense primer (5'-AAG CTT TCA GGA CCT CGG CGA TCG C-3') as described in SEQ ID NO: 9 It was prepared by cloning by the method.
  • pET-xy1K1 or pET-XylK1 ⁇ Fn3 expression vectors were overexpressed in E. coli, and then recombinant Xy1K1 (rXylK1) or recombinant XylK1 ⁇ Fn3 (rXylK1 ⁇ Fn3) were isolated.
  • E. coli transformed with each expression vector was inoculated in liquid LB medium, and then cultured with shaking at 37 ° C. When the OD 600 value of each E. coli culture reached 0.4 to 0.5, 1.0 mM of IPTG was added, followed by incubation for 5 hours at 30 ° C.
  • rXylK1 was overexpressed in the inclusion bodies and rXylK1 ⁇ Fn3 in the inactivated inclusion bodies.
  • the present inventors solubilized the inclusion body after the E. coli overexpressing rXylK1. Solubilized rXylK1 cell lysate or rXylK1 ⁇ Fn3 cell lysate was refolded and purified using a HisTrap HP (GE Healthcare, Sweden) (5-ml) column, followed by a high performance liquid chromatography (LC) system according to the manufacturer's manual ( Amersham Pharmacia Biotech, Sweden).
  • HisTrap HP GE Healthcare, Sweden
  • LC high performance liquid chromatography
  • XylK1 of the present invention in contrast to other GH10 xylanase, has an N-terminal enzymatic GH10 domain (SEQ ID NO: 10, Leu38 to Asp330), a Fn3 domain (SEQ ID NO: 11, Pro359 to Gly430) and a C-terminal CBM2 domain (SEQ ID NO: 12, Cys454 to Cys553) was identified as being a single unit xylanase.
  • the enzymatic GH10 domain of XylK1 shows the highest sequence homology (67%) with Cellulomonas fimi xylanase (AAA 56792) among the GH10 enzymes available in the NCBI database. gave. However, the CBM 2 of the enzyme showed 64% homology with Cellulomonas pimi GH6 cellulase (AAC36898).
  • the Fn3 domain of XylK1 exhibited the highest sequence homology (70%) with Acidothermus cellulolyticus 11B GH48 enzyme (ABK52390), which degrades cellulose.
  • Two conserved residues of Glu161 (acid / base catalyst) and Glu266 (catalytic nucleophile) were predicted at the active site of the incomplete XylK1.
  • Example 3-2 SDS-PAGE was performed on the purely isolated xylanase in 12% gel to confirm that they were approximately 42 KDa and 34 KDa in size, respectively.
  • Ultraflex III MALDI at the Korea Basic Science Institute (Daejeon, Korea) Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analysis using a -TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, Germany) revealed that His-labeled purified rXylK1 was smaller than the complete rXylK1. It was measured with a molecular weight of 45,169 Da, a protein.
  • rXylK1 is expressed in Escherichia coli cells after cleavage of the protein at the C-terminal region by specific proteolytic enzymes derived from the host. Based on the measured molecular weight (45,169 Da) of the nodular rXylK1, it is assumed that the Val439-Thr440 site was processed to be a complete rXylK1 in the hinge region between the Fn3 domain of the incomplete XylK1 and the C-terminal CBM2 domain. It was.
  • reaction pH The effects of reaction pH, temperature, metal ions, reagents and surfactants were investigated to investigate the optimal reaction conditions of rXylK1.
  • the optimum pH of the enzyme activity was 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.5-5.5), 50 mM sodium phosphate buffer (pH 5.5-7.5), 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5). -9.0) and 50 mM glycine-NaOH buffer solution (pH 9.0-10.5), and the optimum temperature for enzyme activity was measured at intervals of 5 ° C in the range of 30-70 ° C.
  • the effect was measured at reaction conditions containing 1 mM Hg 2+ , Ca 2+ , Cu 2+ , Ba 2+ , Mn 2+ , Co 2+ or Fe 2+ , respectively. Measured under reaction conditions including mM EDTA, sodium azide, iodoacetamide and N-ethylmaleimide, the effect on surfactant was 0.5% Tween 80 Or at reaction conditions including Triton X-100.
  • rXylK1 showed the highest activity at pH 6.0, and showed more than 80% activity even at pH 5.0 ⁇ 9.0 range. Considering that the fungal-derived xylanase has low activity at neutral pH as acid xylanase, rXylK1 has high activity even at neutral pH, and thus it is considered to be highly useful as an enzyme for feed addition.
  • rXylK1 showed maximum activity at 55 ° C.
  • rXylK1 was reduced by 40% by Hg 2+ and by 25% by Ca 2+ , Cu 2+ and Ba 2+ .
  • Streptomyces sp. Strain S9 Korean amino acid sequence (Kulkarni NA et al. , 1999. FEMS Microbiol. Rev. 23: 411-456)
  • Aeromonas caviae ME-1 Liu Xylanase from C. JT et al. , 2003. J. Biosci. Bioeng . 95: 95-101
  • had a negative effect on Mn 2+ and Co 2+ but the xylanase of the present invention It was stable against ions.
  • Trp118, Trp306 and Trp314 of incomplete XylK1 are expected to play an important role in the catalysis and substrate binding of the enzyme.
  • the enzyme activity of His-labeled rXylK1 was added at 0.5% concentration of Tween 80 or Triton X-100. Approximately 1.8-fold significantly.
  • the stimulation of His-labeled rXylK1 activity was not significant when the enzymatic reaction was added with a surfactant without preincubation for 10 minutes with the same composition.
  • the binding capacity of rXylK1 or rXylK1 ⁇ Fn3 to the carbohydrate polymer was measured.
  • the binding capacity of the axel or insoluble oat spell xylan was measured by a known method (Cazemier AE et al. , 1999. Appl. Environ.Microbiol. 65 : 4099-4107).
  • the binding capacity of rXylK1 or rXylK1 ⁇ Fn3 to Birchwood xylan was measured and used as a control.
  • the resolution of the Birchwood xylan of rXylK1 or rXylK1 ⁇ Fn3 was confirmed by the method of Example 1.
  • the resolution of the various xylan and sugar substrates of Table 2 of the rXylK1 of the present invention was confirmed by the method of Example 1.
  • Birchwood xylan (1.0%) or PNP (p-nitrophenyl) sugar derivatives (5 mM) containing an enzyme solution (0.05 ml) diluted in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) Standard assay mixtures (0.5 ml) were compared by performing an enzyme reaction at 55 ° C. for 10 minutes.
  • One unit of xylanase activity for xylan or PNP-sugar derivatives was defined as the amount of enzyme required to produce 1 ⁇ mol of reducing sugar or PNP per minute under standard assay conditions.
  • Birchwood xylan (10 mg) (Sigma Co.), xylooligosaccharide (xylooligosaccharide) (1 mg each) (Megazyme International Ireland, Ireland) and cellooligosaccharide (1 mg each) (Seikagaku Biobusiness Co , Japan) was reacted with purified rXylK1 (2 ⁇ g) in 0.1 ml of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) for 3-6 hours while maintaining the stability of the enzyme at 37 ° C. It was carried out by.
  • oat spell xylan was most effectively hydrolyzed by rXylK1.
  • rXylK1 was not observed for other GH such as soluble starch, Avicel and Carboxyl Methylcellulose, and the enzymatic activity of rXylK1 to PNP-cellobioside was Approximately 1.7 times higher than the activity for oat spell xylan (193 IU / mg), it was found that the xylanase of the present invention had no degradation capacity for glucose-based carbohydrates.
  • the cleavage activity of pX-cellobioside of rXylK1 of the present invention is approximately 48 IU / mg, which is higher than that of other xylanases known as the same substrate (10 IU / mg) (Haga KM et. al. , 1991; Kim DY et al. , 2009. Proc. Biochem. 44: 1055-1059).
  • the results indicate that rXylK1 is a true endo- ⁇ -1,4-xylanase without cellulase activity.
  • rXylK1 has approximately 7.5% of the maximum hydrolytic activity of the enzyme for xylose substitution activity (oat spell xylan) that can cleave PNP-xylopyranoside.
  • Example 4-4 The reaction mixture of Example 4-4 was heated at 100 ° C. for 5 minutes to stop the enzyme reaction, and then the hydrolyzate was eluted with a known method.
  • Elution solution A 0.05% formic acid / sterile water
  • xylose substitution reaction was observed when xylotriose (X3) and xylotetraose (X4) were used as substrates for the hydrolysis reaction on the rXylK1 enzyme.
  • X3 and X3 were found to be the main products, xyloligosaccharides of X4 to X7 were produced upon enzymatic hydrolysis of X3 at 37 ° C for 3 hours.
  • hydrolysis of X4 by rXylK1 resulted in a mixture comprising long xylooligosaccharides (42.3%) of X5 to X8.
  • xyloligomer is produced by the rXylK1-catalyzed xylose substitution reaction.
  • X1 was not detected as a hydrolysis product of X2, X3 or X4.
  • the ability of rXylK1 to catalyze the synthesis of long xylooligosaccharides from X3 or X4 is that microbial xylanases generally produce short xylooligosaccharides such as X2 and / or X3 from the same substrate. It is very unique (Brennan Y et al. , 2004. 70: 3609-3617; Oh HW et al. , 2008).
  • rXylK1 decomposed Birchwood xylan into X2 (65.1%), X3 (29.5%) and X4 (5.4%) in an enzyme reaction at 37 ° C for 6 hours.

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Abstract

본 발명은 신규 자일라나아제 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 무척추동물로부터 분리한 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13(Cellulosimicrobium funkei HY-13) 균주에서 분리한 자일라나아제, 상기 자일라나아제의 Fn3 도메인(Fibronectin Type 3 Domain) 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 자일라나아제는 기질특이성을 가지고 중성 및 염기성 pH에서 고효율로 자일란을 분해하며, 상기 기질특이성에 Fn3 도메인이 중요한 역할을 하는 것을 확인하였으므로 본 발명의 자일라나아제는 다양한 식물성 사료 원료에 첨가하거나 섬유소계 바이오매스의 분해능을 향상시키는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

셀룰로시마이크로비움 펀케이 에이치와이-１３ 균주로부터 생산되는 신규한 자일라나아제
본 발명의 신규한 자일라나아제를 생산하는 미생물에 관한 것이다.
자연계에 존재하는 고정 탄소의 최대 저장고인 식물 세포벽은 다음의 3가지 중요한 합성물인 셀룰로오스[불용성 베타-1,4-글루칸 섬유소(insoluble β-1,4-glucan cellulose)], 헤미셀룰로오스(hemicellulose)[글루칸(glucan), 만난(mannan) 및 자일란(xylan)을 포함하는 비셀룰로오스(non-cellulose) 다당류] 및 리그닌(lignin; 복합 폴리페놀 구조)으로 구성되어 있다. 헤미셀룰로오스는 섬유소 다발을 묶어주어 바이오매스(biomass)를 구조적으로 단단히 유지하는 결합제의 역할을 담당하고 있어서 리그노 셀룰로오스 계통의 바이오매스의 활용을 위한 가수분해의 최대 장애가 되고 있다(Biomass recalcitrance). 이러한 헤미셀룰로오스의 주성분인 자일란을 완전하게 분해하여 당화하기 위해서는 일반적으로 세 가지 효소, 즉 엔도-β-자일라나아제, 엑소-β-자일라나아제 및 β-자일로시다아제가 함께 작용해야 하는 것으로 알려져 있으며 이들을 자일라나아제계 효소로 통칭한다. 자일란은 목초 헤미셀룰로오스에서는 30%의 당으로 구성되며 콩과류 마초 헤미셀룰로오스에서는 20%의 당으로 구성되어 있다. 콩과류 사료의 헤미셀룰로오스가 목초의 헤미셀룰로오스보다 더욱 복잡한 당복합체로 구성되어 있기 때문에, 콩류 사료의 좀 더 복잡한 구조의 헤미셀룰로오스의 분해를 위하여 섬유질을 용해하는 효소가 요구된다. 자일라나아제를 곡물 사료에 첨가하면 알곡을 감싸고 있는 헤미셀룰로오스 층을 가수분해하여 알곡 내에 있는 영양분의 이용성을 높일 뿐만 아니라 가축의 장내 소화물의 상태가 개선될 수 있다. 특히 최근 녹색 에너지로 각광 받는 바이오에탄올의 경우, 옥수수 전분을 원료로 하는 제 1세대 바이오 에탄올에서 섬유질을 원료로 하는 제 2세대 바이오 에탄올로 기술의 이행이 이뤄지고 있어서 섬유소계 바이오매스의 전처리는 전문 효소군의 사용에 의해 개선 될 수 있다. 따라서 자일라나아제의 적용은 사료 첨가용 효소로 그 가치가 높고 또한 바이오에너지 생산용 효소군으로서 활용 가치가 높다.
지금까지 보고된 사료용 자일라나아제의 생산에 사용되는 미생물의 대부분은 곰팡이를 들 수 있으며, 이 중에서도 트리코더마(Trichoderma) 속 균주들이 주로 이용되고 있다. 트리코더마 속 곰팡이는 생장이 늦어 배양시간이 길어지며 유전적 이용 및 변이의 어려움이 있다. 이에 반해 세균 등의 미생물을 이용할 경우 증식이 빠르고 유전적 변이가 용이하여 산업적인 이용이 높다. 산업적 이용을 위해서는 자일라나아제를 생산할 수 있는 세균류 미생물의 선발이 시급하다. 또한, 트리코더마 속 균주에서 생산하는 자일라나아제는 pH 5.0 부근의 산성 조건에서 최대 활성을 나타낸다. 그러나 돼지나 닭의 소화기관의 생리적 조건은 부위별로 다르지만 자일라나아제가 작용하여야 할 소장 이후의 pH 조건은 6.5 부근이므로 곰팡이 유래의 자일라나아제는 실험적 효소활성이 높아도, 필드 적용 시 활성 발휘에 제한이 있다. 따라서 최적 효소활성이 가축의 장내 pH 조건과 부합하는 특성을 지닌 효소로서 자일라나아제가 사료 첨가용 효소로 요구되고 있다.
곤충을 포함한 무척추동물은 지구상에서 가장 번성한 생물군으로서 다양한 먹이습성과 높은 생물학적 다양성을 나타내고 있다. 최근 들어 이러한 무척추동물의 생활특성을 고려하여 이의 공생 미생물을 유용생물자원으로 활용하고자 하는 연구가 증가하고 있으며, 특히 무척추동물의 생육과 밀접한 관련이 있는 장내미생물에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 그 예로서 흰개미의 장내에는 흰개미의 주요 먹이인 목재의 분해에 관련된 미생물들이 군집을 이루어 흰개미의 소화 및 영양에 관여하고 있다는 연구와 동물성 먹이를 포식하는 무당거미로부터 고효율의 단백질 분해효소 생산 균주를 분리하여 산업적으로 응용하고 있는 사례, 및 나비목, 딱정벌레목을 포함하는 여러 가지 무척추동물에서 분자생물학적 기법을 활용한 장내 미생물의 생태적 연구들이 발표되고 있다. 또한, 효소의 활성 증강을 위해서 미생물학적, 분자생물학적인 여러 가지 기술이 동원되고 있는데 특히 단백질의 구조는 효소의 활성에 가장 중요한 원천기술을 제공하므로 다양한 유전자의 조작과 단백질 구조의 변형을 통해서 고효율 효소를 개발하고자 하는 노력이 지속되고 있다.
이에, 본 발명자들은 토양의 식물성 잔해물 등을 먹이로 하는 지렁이 등의 다수의 무척추동물의 장을 대상으로 하여 신규한 자일라나아제 XylK1을 생산하는 고효율의 자일라나아제 생산 균주를 선별하였으며, 상기 생산 균주로부터 분리된 자일라나아제가 중성 및 염기성 pH에서 높은 활성으로 자일란을 포함한 당 기질을 분해하며, 자일로트리오스(xylotriose; X3) 및 자일로테트라오스(xylotetraose; X4)를 기질로 사용하여 X4 내지 X7의 자일로올리고사카라이드(xylooligosaccharide)를 생성하는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 자일라나아제는 Fn3 도메인(Fibronectin Type 3 Domain)을 포함하며, 상기 Fn3 도메인이 효소의 활성 및 기질에 대한 결합능을 결정하는데 중요한 역할을 하는 것을 밝혀, 본 발명의 자일라나아제가 사료효율 개선제 및 바이오매스 분해 효소로서 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규한 자일라나아제 및 상기 자일라나아제를 이용한 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
하기 (a) 내지 (h)의 특징을 가지는 자일라나아제(xylanase)를 제공한다:
(a) SDS-PAGE 상에서 분자량은 약 42 kDa;
(b) pI 값은 4.49;
*(c) pH 5 내지 pH 9에서 최대 활성;
(d) 55℃에서 최대 활성;
(e) 중온성 효소;
(f) 엔도-β-1,4-자일라나아제(endo-β-1,4-xylanase); 및,
(g) GH10(glycoside hydrolase family 10) 도메인, Fn3 도메인(Fibronectin Type 3 Domain) 및 CBM2(carbohydrate-binding module2) 도메인을 포함.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계; 및,
2) 상기 단계 1)에서 수득된 조효소액에서 자일라나아제를 정제하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 포함하는 자일란 분해제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 포함하는 식품내 자일란 가공용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 포함하는 제지공정용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 사료첨가제를 유효성분으로 포함하는 자일란 당화도가 증가된 식물성 사료를 제공한다.
또한, 본 발명은 동물의 사료 재료에 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 사료 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 섬유소계 바이오매스 또는 자일란 함유액에 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 식품내 자일란 가공용 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 제지공정용 조성물의 제조에 이용하는 용도를을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 사료첨가제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 셀룰로시마이크로비움 펀케이 에이치와이-13(Cellulosimicrobium funkei HY-13) 균주에서 분리된 GH10(glycoside hydrolase family 10) 자일라나아제는 중성 및 염기성 pH에서 높은 활성으로 자일란을 포함한 당 기질을 분해하고, 자일로트리오스(xylotriose; X3) 및 자일로테트라오스(xylotetraose; X4)를 기질로 사용하여 X2 내지 X7의 자일로올리고사카라이드(xylooligosaccharide)를 생성하였다. 이에, 본 발명의 자일라나아제는 사료효율 개선제 및 바이오매스 분해 효소로서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 분리한 신규 자일라나아제의 폴리펩티드 서열 및 NCBI에서 등록된 GH10 자일라나아제[셀룰로시마이크로비움 속(Cellulosimicrobium sp. strain) HY-13 (Csp) 자일라나아제 (FJ859907); 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) (Cfi) 자일라나아제 (AAA56792); 스트렙토마이세스 코엘리콜라(Streptomyces coelicolor) (Sco) A3 자일라나아제 (CAB61191); 스트렙토마이세스 암보파시엔스(Streptomyces ambofaciens) (Sam) 자일라나아제 (CAJ88420); 에시도써무스 셀룰로리티쿠스(Acidothermus cellulolyticus) 11B (Ace) 자일라나아제 (ABK51955); 및, 써모비피다 알바(Thermobifida alba) (Tal) 자일라나아제 (CAB02654)]의 폴리펩티드 서열의 상동성을 조사한 결과를 나타낸 도이다:
이때, 검은 박스는 같은 아미노산이고 회색 박스는 유사 아미노산을 각각 표시한 것이고;
추측된 신호 펩티드는 검은 막대로 표시하였으며;
효소반응에서 중요한 역할을 하는 고도로 보존된 아미노산 잔기는 별표(*)로 표시하였고; 및,
GH10(glycoside hydrolase family 10), Fn3(Fibronectin type 3) 및 CBM2(carbohydrate-binding module2) 도메인은 각각 실선, 긴 점선 및 점선으로 각각 외곽선을 표시하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은, 하기 (a) 내지 (h)의 특징을 가지는 자일라나아제(xylanase)를 제공한다:
(a) SDS-PAGE 상에서 분자량은 약 42 kDa;
(b) pI 값은 4.49;
(c) pH 5 내지 pH 9에서 최대 활성;
(d) 55℃에서 최대 활성;
(e) 중온성 효소;
(f) 엔도-β-1,4-자일라나아제(endo-β-1,4-xylanase); 및,
(g) GH10(glycoside hydrolase family 10) 도메인, Fn3 도메인(Fibronectin Type 3 Domain) 및 CBM2(carbohydrate-binding module2) 도메인을 포함.
본 발명의 자일라나아제는 상기 특성에 추가로 자일로트리오스(xylotriose) 및 자일로테트라오스(xylotetraose)를 기질로 사용하여 자일로올리고사카라이드(xylooligosaccharide) 생산하는 특징을 가진다.
상기 Fn3 도메인은 서열번호 11로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업계에 알려져 있는 Fn3 도메인이라면 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 무척추동물의 장 추출물로부터 자일란의 분해능이 우수한 균주를 동정한 후, 상기 균주로부터 보존된 서열을 이용하여 신규한 자일라나아제를 분리하였다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 종래 보고된 GH10 자일라나아제의 서열 및 방향성이 보존된 영역으로부터 프라이머를 제작하여 상기 균주의 gDNA로부터 GH10 자일라나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 단백질 발현 벡터에 클로닝하여, 대장균에서 발현시킨 다음 재조합 자일라나아제 효소(rXylK1)를 정제한 후 그 특성을 조사하였다. 그 결과, 본 발명의 자일라나아제는 약 42.0 kDa의 분자량을 지닌 것으로 나타났다. 또한, NCBI 데이터베이스에서 얻은 다른 GH10 자일라나아제의 단백질 서열 및 본 발명의 XylK1 폴리뉴클레오티드로부터 유추한 단백질 서열을 비교한 결과, 본 발명의 XylK1은 다른 GH10 자일라나아제와 대조적으로 N-말단 효소활성 GH10 도메인(서열번호 10, Leu38 내지 Asp330), Fn3 도메인(서열번호 11, Pro359 내지 Gly430) 및 C-말단 CBM2 도메인(서열번호 12, Cys454 내지 Cys553)를 포함하는 단일 단위 자일라나아제인 것으로 확인되었다(도 1 참조). 종래, 플라보박테리움 존스니에(Flavobacterium johnsoniae) UW101에서 게놈 연구를 통해 N-말단 Fn3 도메인 및 C-말단 GH10 도메인을 가진 단위 자일라나아제(GenBank 접근 번호 ABQ06877)가 보고된 바가 있지만 단백질의 특성이 밝혀지진 않았으며, 그 외에는 Fn3을 포함하는 GH10 자일라나아제에 대하여 보고된 바가 없다. 또한, XylK1의 효소적 GH10 도메인은 NCBI 데이터베이스에서 사용가능한 GH10 효소들 중 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) 자일라나아제(AAA 56792)와 67%의 서열 상동성(67%)을, C-말단의 CBM 2 도메인은 셀룰로모나스 피미 GH6 셀룰라아제(AAC36898)와 64% 서열 상동성을 나타내었다. XylK1의 Fn3 도메인은 셀룰로오스를 분해하는 에시도터무스 셀룰로리티쿠스(Acidothermus cellulolyticus) 11B GH48 효소(ABK52390)와 가장 높은 서열 상동성(70%)을 나타내었다. 또한, pH 6.0에서 가장 높은 효소활성을 보였으며, pH 5.0 내지 pH 9.0 범위에서 80%이상의 효소활성이 유지되었다. 또한, 50℃ ~ 60℃에서 최대 활성을 나타내었으며, 특히 55℃에서 최대 활성을 보였다. 또한, rXylK1은 Hg2+에 의해 40%, Ca2+, Cu2+ 및 Ba2+,에 의해 25% 활성이 감소되었고, Mn2+ 및 Co2+에 대하여 안정적이었으며, Fe2+에 의해 효소활성이 증가되었다. 또한,rXylK1은 EDTA에 의해 효소활성이 감소하였으나, 나트륨 아자이드(sodium azide), 아이도아세트아마이드(iodoacetamide) 및 N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide)와 같은 설프하이드릴 제제(sulfhydryl reagent)에 의해 상대적으로 영향을 덜 받았다. 또한, 본 발명의 자일라나아제는 5 mM N-브로모숙시니미드(N-bromosuccinimide)에 의해 완전히 억제되었고, Tween 80 또는 Triton X-100이 첨가되었을 때 효소활성이 유의하게 증가하였다. 또한, 재조합 자일라나아제(rXylK1) 및 Fn3 도메인이 결절된 돌연변이 자일라나아제(rXylK1ΔFn3)를 이용하여 효소활성에서 Fn3 도메인이 미치는 영향을 확인한 결과, rXylK1의 Fn3 도메인 결절은 귀리스펠트 자일란에 대한 결합 친화력에는 유의한 변화를 유도하지 않았다. 그러나 rXylK1ΔFn3의 경우 귀리스펠트 자일란에는 결합하지만, 아비셀(Avicel)에는 결합하지 않는 것을 확인하여 Fn3 도메인이 효소-기질 결합에서 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다(표 1 참조). 곡물 및 목재 등에 포함된 셀룰로오스는 자일란에 둘러싸여 있는데, 이 자일란을 분해하여야 셀룰로오스를 분리할 수 있다. 상기 결과로부터, Fn3 도메인을 포함하는 자일라나아제는 기질과의 접근성이 향상되어 곡물 및 바이오매스의 처리 공정에서 자일란의 분해를 효과적으로 촉매할 수 있다. 또한, 본 발명의 자일라나아제가 Fn3 도메인이 있을 때, 버치우드 자일란을 분해하는 능력이 더 높은 것으로부터(표 2 참조), 본 발명의 Fn3 도메인을 가지는 자일라나아제가 기질에 더 잘 결합할 뿐만 아니라, 실제로 결합한 기질을 보다 더 효율적으로 가수분해 시키는 것을 확인하였다.
따라서 서열분석 및 활성분석 결과 본 발명에서 동정한 균주로부터 생산되는 자일라나아제는 기존의 자일라나아제와 다른 신규한 자일라나아제임을 확인하였다.
또한,
본 발명의 자일라나아제는 하기의 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다:
a) 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열;
b) 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열;
c) 서열번호 4에 기재된 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열;
d) 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열; 및,
e) 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열이며, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열.
상기 e)의 엄격한 조건은 혼성화 후 세정 시에 결정된다. 엄격한 조건 중의 하나는 상온에서 6±SSC, 0.5% SDS로 15분 세정한 뒤 45℃에서 2±SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정하고, 50℃에서 0.2±SSC, 0.5% SDS로 30분간의 세정을 두 번 반복한다. 더 바람직한 엄격한 조건은 상기보다 더 높은 온도를 이용하는 것이다. 상기 엄격한 조건의 다른 부분은 동일하게 수행하되 마지막의 두 번의 30분은 60℃에서 0.2±SSC, 0.5% SDS로 세정한다. 또 다른 엄격한 조건은 상기 엄격한 조건에서 마지막 두 번을 65℃에서 0.1±SSC, 0.1% SDS로 세정하는 것이다. 당업자라면 필요한 엄격한 조건을 얻기 위하여 이러한 조건을 명백히 설정할 수 있다.
본 발명의 자일라나아제는 pH 5 내지 pH 9, 바람직하게는 pH 6에서 최대 활성을 나타내고, 50℃ 내지 60℃, 바람직하게는 55℃에서 최대 활성을 나타내는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 자일라나아제는 수탁번호 KCTC 11302BP로 기탁된 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13(Cellulosimicrobium funkei HY-13) 균주로부터 유래된 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 무척추동물의 장 추출물을 0.5% 버치우드 자일란(birchwood xylan)이 함유된 세균 분리용 배지에 도말하여 형성된 세균 콜로니를 0.5% 버치우드 자일란을 포함하는 배양액에서 25℃에서 2일간 배양한 후 배양상등액을 조효소액으로 사용하여 자일란의 분해능이 우수한 균주들을 선별하여 자일라나아제를 생산하는 미생물을 분리하였다. 상기 분리된 균주는 체외공생군이며, 그람 양성 세균이었고, 16S rDNA 염기서열을 대상으로 상동성 조사를 한 결과, 셀룰로시마이크로비움 펀케이 ATCC BAA-886균주와 99.8% 이상의 높은 상동성을 나타내어, 본 균주를 셀룰로시마이크로비움 펀케이로 동정하였으며 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13으로 명명하였다. 상기 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 균주는 2008년 3월 12일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 내 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 11302BP)
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 자일라나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하기의 염기 서열 중 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
a) 서열번호 4에 기재된 염기 서열;
b) 서열번호 4에 기재된 염기 서열과 95% 상동성을 가지는 염기 서열;
c) 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열;
d) 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열;
e) 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA 염기 서열이며, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 염기 서열.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 균주로부터 분리한 자일라나아제를 코딩하는 신규한 유전자의 염기서열을 밝혔으므로 당업계 공지된 통상의 방법을 이용하면 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작할 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 상용화된 벡터를 이용할 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자가 적합한 재조합 벡터를 제조하여 이용하는 것도 무방하다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 숙주세포는 한정된 것은 아니나, 대장균을 포함한 원핵세포, 효모, 동물세포, 곤충세포를 포함하는 진핵세포로 이루어진 군으로부터 선택하여 이용하는 것이 바람직하며, 대장균을 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은
1) 상기 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계; 및,
2) 상기 단계 1)에서 수득된 조효소액에서 자일라나아제를 정제하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법을 제공한다.
상기 단계 2)는
1) 상기 형질전환체의 배양액을 원심분리하여 수득한 상층액에 침전제를 가하여 수용성 단백질 침전을 유도하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 침전물에서 불용성 침전물을 제거한 후 투석하여 조효소액을 수득하는 단계; 및,
3) 상기 단계 2)의 조효소액을 컬럼 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 방법으로 이루어질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 배지는 본 발명의 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 균주 또는 본 발명의 형질전환체에 적합한 배지를 당업자에게 공지된 상용 배지 중에서 선별하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기 방법에서, 단계 1)의 침전제로는 황산암모늄, 아세톤, 아이소프로판올, 메탄올, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다. 상기 침전은 다양한 구멍의 크기(pore size)를 가지는 막을 이용한 한외여과법으로 대체하여 농축하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 방법에서, 단계 3)의 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄 및 XAD 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 충진제를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 정제할 수 있다. 컬럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 포함하는 자일란 분해제를 제공한다.
본 발명의 자일란 분해제는 상기 균주 또는 상기 형질전환체에서 생산하는 자일라나아제뿐만 아니라 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 직접 자일란 분해제로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 포함하는 식품내 자일란 가공용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 포함하는 제지공정용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 자일라나아제 외에 동일하거나 유사한 성분을 포함할 수 있으며, 본 발명의 자일라나아제를 전체 조성물 중 1 내지 90%로 함유하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 자일라나아제는 기존의 곰팡이 유래 자일라나아제가 산성 자일라나아제로 중성 및 염기성 조건에서 약한 가수분해활성을 보이는 것과 달리 중성 및 염기성 조건(pH 5-9)에서 높은 활성을 나타내고, X3 및 X4로부터 긴 자일로올리고사카라이드를 생산할 수 있는 자일로오스 치환 활성을 가지므로 광범위 pH 및 고활성 자일라나아제의 용도로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 자일라나아제는 pH 6.0에서 가장 높은 활성을 보였으나, pH 5.0 ~ 9.0 범위에서도 80%이상 그 활성이 유지되었다. 곰팡이 유래 자일라나아제는 산성 자일라나아제로서 중성 pH에서 그 활성이 낮다는 점을 고려할 때, 본 발명의 자일라나아제는 중성 pH 및 알킬리 pH 범위에서도 그 활성이 높으므로, 사료첨가용 효소제로서 그 활용도가 높을 것으로 사료된다.
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서 상기 효소는 PNP-셀로바이오사이드(PNP cellobioside)에 대하여 가장 높은 절단 활성을 가지고 있었으며, 이는 같은 기질로서 알려진 다른 자일라나아제에 대한 활성보다 더욱 높은 것이었다(Haga KM et al., 1991; Kim DY et al., 2009. Proc. Biochem. 44:1055-1059). 또한, 본 발명의 자일라나아제는 버치우드 자일란(birch wood xylan), 비치우드 자일란(beech wood xylan), 귀리 스펠트 자일란(oat spelt xylan) 및 PNP(p-nitrophenyl)-셀로비오사이드에 대하여 높은 분해능을 가지고 있으나, 가용성 녹말, 아비셀(Avicel) 및 카복시 메틸셀룰로오스(Carboxyl Methylcellulose)는 분해하지 못하는 것을 확인하여, 본 발명의 자일라나아제가 셀룰라아제 활성이 없는 진정한 엔도-β-1,4-자일라나아제인 것을 확인하였다. 아울러, 본 발명의 자일라나아제가 PNP-자일로피라노사이드(PNP-xylopyranoside)를 절단할 수 있는 자일로오스 치환 활성을 가지고 있는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터 본 발명의 자일라나제는 특이성을 갖고 효율적으로 자일란을 분해하는 것을 확인할 수 있었으며, 동물에 가장 많이 사용하는 식물성 곡물 사료에 자일란 함유가 높은 것을 고려할 경우 동물성 사료에 효율적이라고 사료된다. 이와 같은 결과를 살펴볼 때 본 발명의 자일라나제는 식물성 사료의 자일란 분해 증진을 목적으로 하는 사료 첨가제로 적합한 것을 알 수 있었다.
이에, 본 발명의 방법으로 생산된 자일라나아제는 자일란 당화를 위한 사료첨가제로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 사료첨가제는 식물 세포벽을 분해할 수 있는 효소가 없어서 세포벽 내에 들어있는 곡물의 전분이나 단백질 이용 효율이 매우 떨어지는, 돼지나 닭 같은 단위동물(non-ruminant)의 사료에 첨가되어 세포벽의 주요 성분인 자일란을 당화함으로써 사료의 가치를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 사료첨가제의 유효성분인 자일라나아제가 첨가될 사료에 대해 0.01 내지 10 중량부로 구성되는 것이 바람직하며, 자일라나아제가 0.05 내지 5 중량부로 구성되는 것이 더욱 바람직하며, 자일라나아제가 0.12 중량부로 구성되는 것이 가장 바람직하다.
또한 상기 사료첨가제는 추가적으로 단위동물에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기 사료첨가제를 그대로 또는 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 단위동물에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 사료첨가제를 유효성분으로 포함하는 자일란 당화도가 증가된 식물성 사료를 제공한다.
현재 자일라나아제 효소시장을 점유하고 있는 용도는 크게 식품, 사료 및 기술로 분류할 수 있다(Bedford and Morgana, World's Poultry Science Journal 52:61-68, 1996). 식품(과일 및 야채생산, 양조 및 주류생산, 제빵 및 제과)시장에서는 재료의 연화 및 정제효율 개선, 점도감소, 추출 및 여과 효율증대 등을 통한 품질향상에 활용되고 있다. 사료시장에서는 돼지, 가금류, 반추동물 등의 사료의 비전분 탄수화물의 감소, 장내 점도개선, 단백질 및 전분의 소화흡수율 증대 등에 이용되고 있다(Kuhad and Singh, Crit. Rev. Biotechnol. 13, 151-172, 1993). 아울러 기술적으로는 제지공정에서 생물학적 백화공정, 염소소비의 감소, 기계적인 제지공정 단축을 통한 에너지 감소, 탈묵효과, 전분과 글루텐의 분리, 재생가능 연료(바이오에탄올) 및 화학원료생산 등에 활용되고 있다.
그러므로 본 발명의 신규 자일라나아제는 용지 생산 및 폐지 재생, 사료 첨가 및 식품의 품질 향상 또는 산업상 사용하는 자일라나아제의 분해에 유용하게 이용될 수 있으며 이는 당업자에게 자명하다. 상기 조성물들은 당업자에게 공지된 방법으로 제형화 되고 제제화될 수 있다.
또한, 본 발명은 동물의 사료 재료에 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 사료 제조 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 상기 형질전환체가 생산하는 자일라나아제의 첨가량은 당업자에 의해 조정될 수 있다.
또한, 본 발명은 섬유소계 바이오매스 또는 자일란 함유액에 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법을 제공한다.
본 발명의 자일란 분해 방법은 재생 가능 연료 또는 화학 원료의 생산 공정에 이용되는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다. 상기 방법에 있어서, 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 상기 형질전환체가 생산하는 자일라나아제의 첨가량은 당업자에 의해 조정될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 식품내 자일란 가공용 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 자일란 분해제는 상기 균주 또는 상기 형질전환체에서 생산하는 자일라나아제뿐만 아니라 상기 균주 또는 상기 형질전환체를 직접 자일란 분해제로 사용할 수 있으므로, 식품내 자일란 가공용 조성물의 제조에 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 제지공정용 조성물의 제조에 이용하는 용도를을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 자일라나아제, 상기 방법으로 생산된 자일라나아제 또는 상기 형질전환체를 사료첨가제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 조성물이용하여 제지공정용 조성물의 제조 또는 사료 첨가제의 제조할 경우, 본 발명의 자일라나아제 외에 동일하거나 유사한 성분을 포함할 수 있으며, 본 발명의 자일라나아제를 전체 조성물 중 1 내지 90%로 함유하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 자일라나아제는 기존의 곰팡이 유래 자일라나아제가 산성 자일라나아제로 중성 및 염기성 조건에서 약한 가수분해활성을 보이는 것과 달리 중성 및 염기성 조건(pH 5-9)에서 높은 활성을 나타내고, X3 및 X4로부터 긴 자일로올리고사카라이드를 생산할 수 있는 자일로오스 치환 활성을 가지므로 광범위 pH 및 고활성 자일라나아제의 용도로 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 무척추동물로부터 자일라나아제 생산 균주 분리 및 선별
본 발명자들은 자일라나아제(xylanase) 생산 활성을 가지는 미생물의 탐색에 이용된 무척추동물인 지렁이(Eisenia fetida)를 대전 인근에서 채집하여 살아있는 상태로 연구실로 운반하여 분류한 후 사용하였다. 자일라나아제를 생산하는 세균의 분리를 위해 상기 지렁이 표면을 70%(w/w) 에탄올로 한번 세척하고 다시 멸균된 증류수로 3번 세척하였다. 세척한 시료를 해부하여 내장을 분리한 다음 PBS 완충액(0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.144% Na2HPO4, 0.024% KH2PO4)에 넣고 분쇄하였으며, 상기 추출물을 단계적으로 희석하여 0.5% 버치우드 자일란(birchwood xylan)을 첨가한 고체배지에 도말한 다음 25℃에서 3일간 배양한 후, Congo-red 염색법(Theater RM & Wood PJ, Appl. Environ. Microbiol. 43:777-780, 1982)을 통해 미생물이 자라난 콜로니 주변에 투명환을 형성하는 균주를 1차적으로 선별하였다. 상기의 방법으로 선별된 균주들을 0.5% 버치우드 자일란이 함유된 제한 배지(K2HPO4 7 g/L, KH2PO4 2 g/L, (NH4)2SO4 1 g/L, MgSO4ㆍ7H2O 1.1 g/L, 효모 추출물 0.6 g/L) 3 ㎖에 접종하여 25℃의 진탕 배양기에서 48시간 배양한 후, 원심분리로 상등액을 회수하여 자일라나아제 활성을 측정하였고, 그 중 자일라나아제 활성이 우수한 균주를 최종적으로 선별하였다. 이때, 상기 효소활성은 DNS(Dinitrosalicylic acid) 정량법(Miller GL, Anal.Chem., 55:952-959, 1959)을 사용하였다. 구체적으로, 일정비율로 희석한 100 ㎕의 효소용액에 350 ㎕의 기질용액(1% 버치우드자일란) 및 50 ㎕ 0.5 M 인산완충용액 (pH 6.0)을 넣고 55℃에서 10분간 반응시킨 후 750 ㎕의 DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid) 용액을 첨가한 다음 100℃에서 5분간 방치한 후 흡광도 540 ㎚에서 측정하였다. 효소의 1 유닛(unit)은 1분 동안에 1 μ㏖의 환원당을 방출시키는 효소양으로 정하였다.
실시예 2. 분리된 균주의 동정
상기 실시예 1에서 지렁이의 장으로부터 분리하여 선발된 균주를 동정하였다.
분리된 균주는 장 점막에 존재하는 체외공생군이며, 그람 양성 세균이었다.
또한, 미생물의 16S rDNA 염기서열 결정을 위하여 균주의 게놈 DNA를 분리하였으며, 다음과 같은 조성으로 PCR 반응을 하였다. 구체적으로, 1 ㎕의 게놈 DNA(50-100 ng/㎕)에 10배의 Tag DNA 중합효소 완충액(MgCl2 첨가) 2 ㎕, 2.5 mM dNTPs 2 ㎕, 10 p㏖의 정방향 프라이머(27F: 5'-agagtttgatcmtggctcag-3', 서열번호 1)와 역방향 프라이머(1492R: 5'-ggttaccttgttacgactt-3', 서열번호 2)를 각각 1 ㎕, 1~2 단위의 Tag DNA 중합효소(Promega, USA)를 첨가하여 최종 50 ㎕ 반응액이 되도록 증류수를 첨가하였다. 이때, 프라이머쌍은 진핵세균의 16S rDNA 부위에 해당하는 1373 bp의 뉴클레오티드 증폭하도록 제작하였다. PCR 반응은 94℃에서 5분간 변성(denaturation)한 후 94℃에서 30초 변성, 50℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 3분 연장(extension)을 30회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 7분간 연장으로 마무리하였고 4℃에서 유지되었다.
상기 16S rDNA 염기서열을 결정한 후(서열번호 3), 상동성 조사를 한 결과, 셀룰로시마이크로비움 펀케이(Cellulosimicrobium funkei) ATCC BAA-886균주와 99.8% 이상의 높은 상동성을 나타내어, 본 균주를 셀룰로시마이크로비움 펀케이로 동정하였으며 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13으로 명명하였다. 상기 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 균주는 2008년 3월 12일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 내 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 11302BP).
실시예 3. 자일라나아제의 클로닝 및 정제
<3-1> 자일라나아제의 클로닝
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 선별한 균주의 게놈 DNA에서 GH10(glycoside hydrolase family 10) 자일라나아제에서 보존된 영역(WDVVNE 및 ITELDI)의 서열을 기반으로 제작한 프라이머를 이용하여 자일라나아제 단백질(서열번호 5)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 4)을 증폭하여 클로닝하였다. 구체적으로, 상기 균주로부터 게놈 DNA를 분리한 다음, 상기 게놈 DNA를 주형으로 하여 10× 완충액(MgCl2), 2.5mM dNTPs, 5× GC-rich 완충액, FastStart Taq DNA 중합효소(Roche) 및, 서열번호 6로 기재되는 센스 프라이머(5'-TGG GAC GTC STC AAC GAG-3') 및 서열번호 7로 기재되는 안티센스 프라이머(5'-GAT GTC GAG CTC SGT GAT-3')의 프라이머 쌍을 이용하여 자일라나아제 유전자에 대한 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건은 95℃에서 5분, 95℃에서 30초간 변성, 50℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 40초간 신장의 조건으로 35회 반복한 다음, 72℃에서 7분 동안 최후신장을 수행하는 조건으로 수행하였다. 상기 PCR을 통해 수득한 342 bp의 자일라나아제의 PCR 산물을 DNA Walking SpeedUp premix kit(Seegene, 한국)을 이용하여 게놈 워킹(Genome walking) 및 네스티드-PCR(nested-PCR)을 수행하여 전체 xy1K1 유전자에 대한 PCR 산물을 수득하였다. 상기 전체 xy1K1 유전자의 PCR 산물 및 pET-28a(+) 벡터(Novagen, 미국)를 NdeI 및 HindⅢ 제한효소로 각각 절단한 후 정제하였다. 상기 정제한 벡터 및 PCR 산물을 약 100 ng씩 사용하여, TaKaRa 사의 리가아제(ligase) 1 unit을 첨가하여 16℃에서 16시간 반응시켰다. 라이게이션(ligation) 반응 후 BL21(Novagen)에 형질전환하여 카나마이신이 함유된 플레이트에서 선별한 후 적절한 제한효소로 절단하여 원하는 DNA 절편이 든 플라스미드를 확보하였으며 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 최종적으로 클론을 확인하였다. 상기 제조된 발현벡터를 'pET-xy1K1'로 명명하였다.
또한, 전체 xy1K1 유전자에서 피브로넥틴 타입 3 도메인(Fibronectin Type 3 Domain) 및 CBM 2(carbohydrate-binding module2) 도메인이 모두 결실된 “pET-XylK1ΔFn3” 발현벡터를 서열번호 8로 기재되는 센스 프라이머(5'-CAT ATG GCC ACC GAG CCG CTC G-3') 및 서열번호 9로 기재되는 안티센스 프라이머(5'-AAG CTT TCA GGA CCT CGG CGA TCG C-3')의 프라이머 쌍을 사용한 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 클로닝을 수행하여 제조하였다.
<3-2> 자일라나아제의 정제
pET-xy1K1 또는 pET-XylK1ΔFn3 발현벡터를 대장균에서 과발현시킨 후 재조합 Xy1K1(rXylK1) 또는 재조합 XylK1ΔFn3(rXylK1ΔFn3)를 분리하였다. 구체적으로, 각 발현벡터를 형질전환시킨 대장균을 액체 LB 배지에 접종한 뒤, 37℃에서 흔들면서 배양하였다. 각각의 대장균 배양액의 OD600 값이 0.4 내지 0.5에 이르렀을 때 1.0 mM의 IPTG를 첨가한 뒤 30℃에서 5시간 더 흔들면서 배양시켜주었다. 상기 배양액을 원심분리하여 음파분쇄기로 세포를 분쇄한 뒤 관찰한 결과 rXylK1은 활성화 포함체(inclusion bodies)에서, rXylK1ΔFn3는 불활성화 포함체에서 과발현되는 것을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 rXylK1를 과발현하는 대장균은 세포를 분쇄한 뒤 포함체를 가용화시켜 주었다. 가용화된 rXylK1 세포 분쇄물 또는 rXylK1ΔFn3 세포 분쇄물을 HisTrap HP(GE Healthcare, 스웨덴)(5-ml) 컬럼을 이용하여 재접힘 및 정제한 후, 제조사의 매뉴얼에 따라 고성능 액체 크로마토그래피(LC) system(Amersham Pharmacia Biotech, 스웨덴)를 수행하였다. 공지의 방법인 HiLoad 26/60 Superdex 200 prep-grade(Amersham Biosciences, 스웨덴) 컬럼을 이용한 겔 투과 크로마토그래피를 수행하여 정제된 rXylK1 또는 rXylK1ΔFn3 단백질의 전기영동 동질성을 확인하였다. 상기에서 정제한 rXylK1 또는 rXylK1ΔFn3 단백질을 브래드포드 시약(Bio-Rad, 미국)을 이용하여 단백질을 정량한 후, 동결건조하여 -20℃에 보관하였다.
실시예 4. 자일라나아제의 특성
<4-1> 서열분석
본 발명자들은 NCBI 데이터베이스에서 얻은 다른 GH10 자일라나아제의 단백질 서열 및 본 발명의 XylK1 폴리뉴클레오티드로부터 유추한 단백질 서열을 비교하였다. 본 발명의 XylK1은 다른 GH10 자일라나아제와 대조적으로 N-말단 효소활성 GH10 도메인(서열번호 10, Leu38 내지 Asp330), Fn3 도메인(서열번호 11, Pro359 내지 Gly430) 및 C-말단 CBM2 도메인(서열번호 12, Cys454 내지 Cys553)을 포함하는 단일 단위 자일라나아제인 것으로 확인되었다. 플라보박테리움 존스니에(Flavobacterium johnsoniae) UW101에서 게놈 연구를 통해 N-말단 Fn3 도메인 및 C-말단 GH10 도메인을 가진 특정되지 않은 단위 자일라나아제(GenBank accession no. ABQ06877)가 보고된 바가 있지만, 그 외에는 Fn3를 포함하는 GH10 자일라나아제에 대하여 보고된 바가 없다.
도 1에서 나타낸 바와 같이, XylK1의 효소적 GH10 도메인은 NCBI 데이터베이스에서 사용가능한 GH10 효소들 중 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) 자일라나아제(AAA 56792)와 가장 높은 서열 상동성(67%)을 보여주었다. 그러나 상기 효소의 CBM 2는 셀룰로모나스 피미 GH6 셀룰라아제(AAC36898)와 64% 상동성을 나타내었다. XylK1의 Fn3 도메인은 셀룰로오스를 분해하는 에시도터무스 셀룰로리티쿠스(Acidothermus cellulolyticus) 11B GH48 효소(ABK52390)와 가장 높은 서열 상동성(70%)을 나타내었다. Glu161(산/염기 촉매) 및 Glu266(촉매 친핵체)의 두 보존된 잔기는 미완성형 XylK1의 활성형 부위에서 예측되었다.
<4-2> 분자량 분석
상기 실시예 3-2에서 순수 분리된 자일라나아제를 12% 겔에서 SDS-PAGE를 수행하여 각각 대략 42 KDa 및 대략 34 KDa 크기임을 확인하였으며, 한국기초과학연구소(대전, 한국)에서 Ultraflex III MALDI-TOF mass spectrometer(Bruker Daltonics, 독일)를 이용하여 MALDI-TOF MS(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry) 분석을 수행한 결과, His-표지된 정제된 rXylK1가 완전한 rXylK1보다 작은 단백질인 45,169 Da의 분자량으로 측정되었다. 상기 결과는 His 표지 컬럼에 단단히 부착되는 성질과 작아진 단백질의 분자량으로부터 유추해 볼 때 rXylK1이 대장균 세포 내에서 발현된 후 숙주 유래의 특정 단백질 가수분해 효소에 의해 C 말단 영역에서 단백질의 절단이 일어났기 때문인 것으로 판단되며, 결절형 rXylK1의 측정된 분자량(45,169 Da)에 기초하여 미완성형 XylK1의 Fn3 도메인 및 C-말단의 CBM2 도메인 사이의 경첩 영역에서 Val439-Thr440 사이트가 프로세싱되어 완전한 rXylK1이 된 것으로 가정하였다. 상기 C 말단에 Val439 잔기를 가진 rXylK1의 추론된 분자량(45,179 Da)은 MALDI-TOF MS 분석에 의해 측정된 상기 표소의 분자량(45,169 Da)과 매우 근접하였다.
<4-3> 생화학적 특성
rXylK1의 최적 반응조건을 조사하기 위하여 반응 pH, 온도, 금속이온, 시약 및 계면활성제의 영향을 알아보았다. 구체적으로, 효소활성 최적 pH는 50 mM 나트륨 시트레이트 완충용액(Sodium citrate buffer)(pH 3.5-5.5), 50 mM 나트륨 인산염 완충용액(pH 5.5-7.5), 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5-9.0) 및 50 mM glycine-NaOH 완충용액 (pH 9.0-10.5)을 사용하여 측정하였고, 효소활성 최적 온도는 30~70℃범위에서 5℃ 간격으로 효소활성을 측정하였으며, 금속이온의 효소활성에 대한 영향은 각각 1 mM의 Hg2+, Ca2+, Cu2+, Ba2+, Mn2+, Co2+ 또는 Fe2+를 포함하는 반응 조건에서 측정하였고, 시약에 의한 영향은 각각 5 mM의 EDTA, 나트륨 아자이드(sodium azide), 아이도아세트아마이드(iodoacetamide) 및 N-에틸말레이미드(N-ethylmaleimide)를 포함하는 반응 조건에서 측정하였으며, 계면활성제에 대한 영향은 0.5%의 Tween 80 또는 Triton X-100를 포함하는 반응 조건에서 측정하였다.
그 결과, rXylK1은 pH 6.0에서 가장 높은 활성을 보였으며, pH 5.0~9.0 범위에서도 80%이상의 활성을 보였다. 곰팡이 유래 자일라나아제는 산성 자일라나아제로서 중성 pH에서 그 활성이 낮다는 점을 고려할 때, rXylK1은 중성 pH에서도 그 활성이 높으므로, 사료첨가용 효소제로서 그 활용도가 높을 것으로 사료된다.
또한, rXylK1은 55℃에서 최대 활성을 보였다.
또한, rXylK1은 Hg2+에 의해 40%, Ca2+, Cu2+ 및 Ba2+,에 의해 25% 활성이 감소하였다. 스트렙토마이세스 속 S9 균주(Streptomyces sp. strain S9) (Kulkarni NA et al., 1999. FEMS Microbiol. Rev. 23:411-456), 에어로모나스 카비에 ME-1(Aeromonas caviae ME-1)(Liu C. JT et al., 2003. J. Biosci. Bioeng. 95:95-101)로부터 유래한 자일라나아제는 Mn2+ 및 Co2+에 대하여 부정적 영향을 받았으나, 본 발명의 자일라나아제는 상기 이온에 대하여 안정적이었다. 이전에 Fe2+에 의해 효소활성이 억제된다는 보고가 있었는데(Haga KM et al., 1991. Agric. Biol. Chem. 55:19591967; Oh HW et al., 2008. Antonie van Leeuwenhoek 93:437442), rXylK1은 Fe2+에 의해 대략 1.4배 효소활성이 증가되었다. 또한, rXylK1은 5 mM EDTA를 10 분간 전배양해주었을 때 상기 효소의 원래활성이 68%를 잃었던 것에 반해, 나트륨 아자이드, 아이도아세트아마이드 및 N-에틸말레이미드와 같은 설프하이드릴 제제(sulfhydryl reagent)에 의해 상대적으로 영향을 덜 받았다. 5 mM N-브로모숙시니미드(N-bromosuccinimide)에 의한 rXylK1의 완전한 억제는 스트렙토마이세스 리비디안스(Streptomyces lividans)(Roberge MF et al., 1999. Protein Eng. 12:251257) 및 지오바실러스 스테로써모필러스 T-6(Geobacillus stearothermophilus T-6)(Zolotnitsky GU et al., 2004. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:11275-11280) GH10 자일라나아제에서 보여준 바와 같이, GH10 효소의 고도로 보존된 영역의 Trp 잔기가 효소-기질 상호작용에서 중요하게 포함되는 것을 잘 설명해준다. 미완성형 XylK1의 Trp118, Trp306 및 Trp314의 세 잔기는 효소의 촉매 및 기질 결합에 중요한 역할을 하는 것으로 예상되는데, His-표지된 rXylK1의 효소활성이 Tween 80 또는 Triton X-100이 0.5% 농도로 첨가되었을 때 대략 1.8배 유의하게 증가하였다. 게다가, His-표지된 rXylK1 활성의 자극은 상기 효소 반응이 같은 조성물과 10분간 선배양하지 않고 계면활성제를 넣어준 경우에서는 유의하지 않았다. 이는 비이온성-계면활성제-유도성 His-표지된 rXylK1의 활성화가 상기 재조합 효소와 Tween 80 또는 Triton X-100 분자의 직접적인 상호작용 동안에 일어나며, 이것이 효소-기질 상호작용의 변이를 야기하는 것을 시사한다.
<4-4> 기질 특이성
탄수화물 중합체에 대한 본 발명의 자일라나아제의 효소활성이 Fn3 도메인의 유무에 따라 어떻게 변하는지 확인하기 위하여, rXylK1 또는 rXylK1ΔFn3의 탄수화물 중합체에 대한 결합능을 측정하였다. 우선, rXylK1 또는 rXylK1ΔFn3의 불용성 당기질에 대한 결합능을 알아보기 위하여, 아비셀 또는 불용성 귀리 스펠트 자일란에 대한 결합능을 공지의 방법으로 측정하였다(Cazemier AE et al., 1999. Appl. Environ. Microbiol. 65:4099-4107). 이때, 버치우드 자일란에 대한 rXylK1 또는 rXylK1ΔFn3의 결합능을 측정하여 대조군으로 사용하였다. 또한, 상기 Fn3의 유무가 기질특이적 결합 뿐만 아니라 실제로 결합한 자일란의 가수분해에도 영향을 미치는지 확인하기 위하여, rXylK1 또는 rXylK1ΔFn3의 버치우드 자일란에 대한 분해능을 상기 실시예 1의 방법으로 확인하였다. 아울러, 본 발명의 rXylK1의 표 2의 다양한 자일란 및 당 기질에 대한 분해능을 실시예 1의 방법으로 확인하였다. 이때 대조군으로서 버치우드 자일란(birch wood xylan)(1.0%) 또는 PNP(p-nitrophenyl)당 유도체(5 mM)를 50 mM 인산나트륨완충액(pH 6.0)에 희석한 효소 용액(0.05 ml)를 포함하는 표준 분석 혼합물(0.5 ml)을 55℃에서 10분 동안 효소 반응을 수행하여 비교하였다. 자일란 또는 PNP-당 유도체에 대한 자일라나아제 활성의 1 유니트(unit)는 표준 분석 조건하에서 1분당 1 μmol의 환원당 또는 PNP를 생산하는데 필요한 효소의 양으로 정의되었다. 버치우드 자일란(10 mg)(Sigma Co.), 자일로올리고사카라이드(xylooligosaccharide)(각각 1 mg)(Megazyme International Ireland, 아일랜드) 및 셀로올리고사카라이드(cellooligosaccharide)(1 mg each)(Seikagaku Biobusiness Co., 일본)의 효소적 가수분해는 정제된 rXylK1(2 μg)를 이용하여 0.1 ml의 50 mM 인산나트륨완충액(pH 6.0), 37℃ 조건에서 상기 효소의 안정성이 유지되는 3 내지 6시간 동안 반응시킴으로써 수행하였다.
그 결과, 표 1에서 나타난 바와 같이 rXylK1ΔFn3 및 rXylK1의 탄수화물 중합체에 대한 결합 친화력에는 유의한 차이가 없는 것을 확인하여, rXylK1의 C-말단 결절은 상기 효소의 탄수화물 중합체에 대한 결합 친화력에는 유의한 변이를 유도하지 않음을 알 수 있었다. 또한, rXylK1ΔFn3는 rXylK1과 같이 불용성 귀리 스펠트 자일란(oat spelt xylan)에 결합한 후 자일란 중합체의 가수분해를 촉진할 수 있지만, rXylK1과 다르게 아비셀(Avicel)에는 결합하지 않는 것을 확인하였다. 이는 Fn3 도메인이 효소-기질 결합에서 중요한 역할을 하는 것을 시사한다.
표 1
기질 결합 후 단위 자일라나아제 활성(총 IU)a
rXylK1 rXylK1ΔFn3
대조군 0.50 0.50
아비셀 ≤0.01 0.49±0.02
불용성 귀리 스펠트 자일란 0.05±0.01 ≤0.01
a: 버치우드 자일란을 이용하여 분석한 단위 자일라나아제 활성
또한, 표 2에서 나타난 바와 같이 rXylK1ΔFn3와 비교하였을 때 rXylK1의 활성이 5.3배 더 높았다. 이로부터 Fn3 도메인을 가지는 자일라나아제가 기질 특이적으로 결합할 뿐만 아니라 실제로 결합한 자일란 중합체를 가수분해 시키는 것을 확인하였다.
표 2
기질 자일라나제의 비(比)활성, IU/mg
rXylK1(A) rXylK1ΔFn3(B) A 및 B의 비율
버치우드 자일란 (Birchwood xylan) 143.0 27.0 5.3:1
또한, 표 3에서 나타난 바와 같이 평가된 자일란 물질 중 귀리 스펠트 자일란이 rXylK1에 의해 가장 효과적으로 가수분해되었다. 또한, rXylK1은 가용성 녹말, 아비셀 및 카복시 메틸셀룰로오스(Carboxyl Methylcellulose)와 같은 다른 GH에 대한 활성이 관찰되지 않았고, 상기 PNP-셀로비오사이드(PNP-cellobioside)에 대한 rXylK1의 효소활성이 상기 효소의 귀리 스펠트 자일란에 대한 활성(193 IU/mg)보다 대략 1.7배 높은 것으로부터 본 발명의 자일라나아제가 글루코오스-기반 탄수화물에 대한 분해 능력은 없음 알 수 있었다. 또한, 본 발명의 rXylK1의 PNP-셀로바이오사이드에 대한 절단 활성은 대략 48 IU/mg로, 이는 같은 기질로서 알려진 다른 자일라나아제에 대한 활성(10 IU/mg)보다 더욱 높은 것이다(Haga KM et al., 1991; Kim DY et al., 2009. Proc. Biochem. 44:1055-1059). 상기 결과는 rXylK1이 셀룰라아제 활성이 없는 진정한 엔도-β-1,4-자일라나아제(endo-β-1,4-xylanase)인 것을 가리킨다. 아울러, rXylK1이 PNP-자일로피라노사이드(PNP-xylopyranoside)를 절단할 수 있는 자일로오스 치환 활성(귀리 스펠트 자일란에 대한 상기 효소의 최대 가수활성의 대략 7.5%를 가지고 있는 것을 확인하였다.
표 3
기질 상대적 활성(%)a
버치우드 자일란 74.1±2.8
비치우드 자일란 85.8±3.5
귀리 스펠트 자일란 100.0
가용성 녹말 탐지되지 않음
아비셀 탐지되지 않음
카르복시 메틸셀룰로오스 탐지되지 않음
PNP-셀룰로비오사이드 171.7±4.9
PNP-글루코피라노사이드 ≤0.5
PNP-자일로피라노사이드 7.5±0.6
a: 세 번 반복실험을 통해 얻은 상대적 활성
<4-5> 자일란 분해산물의 특성
상기 실시예 4-4의 반응 혼합물을 100℃에서 5분간 가열하여 효소 반응을 정지시킨 다음, 가수분해 산물을 공지의 방법으로 용출용액 A(0.05% 포말산/멸균수) 용출용액 B(0.05% 포말산/멸균수: 아세토니트릴/메탄올 = 6:4)의 이동상을 이용하여 LC-MS를 수행하여 측정하였다(Kim DY et al., 2009).
그 결과, 표 4에서 나타난 바와 같이 자일로트리오스(xylotriose; X3) 및 자일로테트라오스(xylotetraose; X4)를 rXylK1 효소에 대한 가수분해반응의 기질로 넣어주었을 경우 자일로오스 치환 반응이 관찰되었다. X2 및 X3이 주된 산물로서 밝혀졌지만, X3을 37℃에서 3시간 효소적 가수분해시킨 경우 X4 내지 X7의 자일로올리고사카라이드들이 생성되었다. 이와 유사하게, rXylK1에 의한 X4의 가수분해는 X5 내지 X8의 긴 자일로올리고사카라이드(42.3%)를 포함하는 혼합물을 생성하였다. 이는 상기 자일로올리고머가 rXylK1-촉매 자일로오스 치환 반응에 의해 생성된다는 것을 의미한다. 그러나 X2, X3 또는 X4의 가수분해 산물로서 X1은 탐지되지 않았다. 상기 X3 또는 X4로부터 긴 자일로올리고사카라이드의 합성을 촉매할 수 있는 rXylK1의 능력은 미생물 자일라나아제가 같은 기질로부터 일반적으로 X2 및/또는 X3과 같은 짧은 자일로올리고사카라이드를 생산한다는 점에서 매우 특이한 점이다(Brennan Y et al., 2004. 70:3609-3617; Oh HW et al., 2008). 또한, rXylK1은 37℃, 6시간의 효소 반응에서 버치우드 자일란을 X2(65.1%), X3(29.5%) 및 X4(5.4%)로 분해하였다.
표 4
기질 가수분해 반응에 의해 형성된 산물의 조성(%)a
X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8
X2 100.0
X3 27.8 45.4 16.8 5.6 3.9 0.5
X4 12.8 26.3 18.6 18.1 14.5 8.4 1.3
버치우드 자일란 65.1 29.5 5.4
a: LC 영역 백분율

Claims (18)

  1. 하기 (a) 내지 (h)의 특징을 가지는 자일라나아제:
    (a) SDS-PAGE 상에서 분자량은 약 42 kDa;
    (b) pI 값은 4.49;
    (c) pH 5 내지 pH 9에서 최대 활성;
    (d) 55℃에서 최대 활성;
    (e) 중온성 효소;
    (f) 엔도-β-1,4-자일라나아제(endo-β-1,4-xylanase); 및,
    (g) GH10(glycoside hydrolase family 10) 도메인, Fn3 도메인 및 CBM2(carbohydrate-binding module2) 도메인을 포함.
  2. 제 1항에 있어서, 추가로 자일로트리오스(xylotriose) 및 자일로테트라오스(xylotetraose)를 기질로 사용하여 자일로올리고사카라이드(xylooligosaccharide) 생산하는 특징을 가지는 자일라나아제.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 자일라나아제는 하기의 서열 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 자일라나아제:
    a) 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열;
    b) 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열과 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산 서열;
    c) 서열번호 4에 기재된 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열;
    d) 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열; 및,
    e) 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열이며, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 자일라나아제는 수탁번호 KCTC 11302BP로 기탁된 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13(Cellulosimicrobium funkei HY-13) 균주로부터 유래한 것을 특징으로 하는 자일라나아제.
  5. 제 1항의 자일라나아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 하기의 염기 서열 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 유전자:
    a) 서열번호 4에 기재된 염기 서열;
    b) 서열번호 4에 기재된 염기 서열과 95% 상동성을 가지는 염기 서열;
    c) 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열;
    d) 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 첨가된 아미노산 서열로 구성되며, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열;
    e) 서열번호 4에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건하에서 혼성화되는 DNA 염기 서열이며, 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질과 기능적으로 동일한 단백질의 염기 서열.
  7. 제 5항의 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현벡터.
  8. 제 7항의 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균을 포함한 원핵세포 또는, 효모, 동물세포 및 곤충세포를 포함하는 진핵세포인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  10. 1) 제 8항의 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계; 및,
    2) 상기 단계 1)에서 수득된 조효소액에서 자일라나아제를 정제하는 단계를 포함하는 자일라나아제 생산 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 단계 2)는
    1) 제 11항의 형질전환체의 배양액을 원심분리하여 수득한 상층액에 침전제를 가하여 수용성 단백질 침전을 유도하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 침전물에서 불용성 침전물을 제거한 후 투석하여 조효소액을 수득하는 단계; 및,
    3) 상기 단계 2)의 조효소액을 컬럼 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 자일라나아제 생산방법.
  12. 제 1항의 자일라나아제, 제 8항의 형질전환체 또는 제 10항의 방법으로 생산된 자일라나아제를 포함하는 식품내 자일란 가공용 조성물.
  13. 제 1항의 자일라나아제, 제 8항의 형질전환체 또는 제 10항의 방법으로 생산된 자일라나아제를 포함하는 제지공정용 조성물.
  14. 제 1항의 자일라나아제, 제 8항의 형질전환체 또는 제 10항의 방법으로 생산된 자일라나아제를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제.
  15. 동물의 사료 재료에 제 1항의 자일라나아제, 제 8항의 형질전환체 또는 제 10항의 방법으로 생산된 자일라나아제를 가하는 단계를 포함하는 사료 제조 방법.
  16. 제 1항의 자일라나아제, 제 8항의 형질전환체 또는 제 10항의 방법으로 생산된 자일라나아제를 식품내 자일란 가공용 조성물의 제조에 이용하는 용도.
  17. 제 1항의 자일라나아제, 제 8항의 형질전환체 또는 제 10항의 방법으로 생산된 자일라나아제를 제지공정용 조성물의 제조에 이용하는 용도.
  18. 제 1항의 자일라나아제, 제 8항의 형질전환체 또는 제 10항의 방법으로 생산된 자일라나아제를 사료첨가제의 제조에 이용하는 용도.
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