본 발명의 일 측면은 광독성이나 세포독성 등이 없고 자외선 흡수능이 뛰어나서 자외선 차단제의 주요 성분으로 이용될 수 있는 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이하, 본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법을 도 1을 통해 단계별로 설명한다. 다만, 도 1은 바람직한 일 실시예에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법의 공정을 나타낸 것으로서, 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정하거나 제한되지 않고 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있음은 물론이다.One aspect of the present invention relates to a method for preparing a non-toxic sunscreen extract that can be used as a main component of a sunscreen because there is no phototoxicity or cytotoxicity and excellent UV absorption ability. Hereinafter, a method for producing a non-toxic UV protection extract according to the present invention will be described step by step through FIG. However, Figure 1 shows a process of a method for producing a non-toxic UV protection extract according to a preferred embodiment, the technical idea of the present invention is not limited or limited to this can be variously modified by those skilled in the art Of course.
추출 원료를 준비하는 단계(S1)Preparing the extraction raw material (S1)
추출 원료로는 김(Porphyra) 또는 진두발(Chondrus)로부터 선택되는 1종 이상을 사용한다. 김 또는 진두발은 홍조류(Rhodophyta) 식물의 하나로서 본 발명자의 연구에 의하면 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)을 포함하는 자외선 차단용 추출물의 수율이 다른 녹조류, 갈조류 및 홍조류 식물로부터 추출할 때보다 상대적으로 현저하게 높은 장점을 가진다.As the raw material for extraction, at least one selected from laver (Porphyra) or chindrus (Chondrus) is used. Laver or Jindubal is one of the red algae (Rhodophyta) plants, and according to the research of the present inventors, green algae, brown algae and red algae plants having different yields of sunscreen extracts containing Mycosporine-like amino acids (MAA) It has a relatively significant advantage over extraction from.
김 또는 진두발은 바람직하게는 건조된 것을 사용하며, 보다 바람직하게는 조쇄(粗碎)된 것을 특징으로 한다. 조쇄된 김 또는 진두발은 표면적이 매우 커서 추출 용매에 의한 추출 속독 및 추출 수율을 향상시킨다. 김 또는 진두발은 유발(乳鉢, 막자사발), 또는 분쇄 장치 등을 통해 조쇄될 수 있다.The laver or jindubal preferably uses dried ones, and more preferably, pulverized. Crushed laver or soybean hair has a very large surface area to improve extraction speed reading and extraction yield by the extraction solvent. Steaming or head can be crushed through a mortar or mortar or the like.
추출 용매를 이용하여 유효성분을 추출하는 단계(S2)Extracting the active ingredient using the extraction solvent (S2)
조쇄된 김 또는 진두발과 같은 홍조류에 추출 용매를 첨가하고 소정의 온도로 유지하여 유효성분을 추출한다. 이때 추출 용매로는 물, 알코올, 또는 물과 알코올의 혼합 용매가 사용되는데 바람직하게는 알코올 대 물의 부피비가 1:9 내지 9:1인 혼합 용매이고 보다 바람직하게는 알코올 대 물의 부피비가 4:1인 것을 특징으로 한다. 알코올 대 물의 부피비가 1:9보다 낮은 경우 알코올의 함량이 너무 작아서 추출 속도 및 추출 수율이 떨어지고, 알코올 대 물의 부피비가 9:1보다 큰 경우 알코올 함량의 증가에 따른 추출 속도 및 추출 수율의 증가율이 크지 않아서 경제성이 떨어지며, 알코올 대 물의 부피비가 4:1인 경우 추출 속도, 추출 수율, 및 경제성이 최적이다.The extraction solvent is added to the red algae such as crushed laver or jindubal and maintained at a predetermined temperature to extract the active ingredient. At this time, as the extraction solvent, water, alcohol, or a mixed solvent of water and alcohol is used. Preferably, the volume ratio of alcohol to water is 1: 9 to 9: 1 mixed solvent, and more preferably, the volume ratio of alcohol to water is 4: 1. It is characterized by that. If the volume ratio of alcohol to water is lower than 1: 9, the content of alcohol is too small to reduce the extraction rate and extraction yield. If the volume ratio of alcohol to water is greater than 9: 1, the extraction rate and the increase rate of extraction rate are increased with the increase of alcohol content. It is not large, so it is inferior in economic efficiency, and the extraction rate, extraction yield, and economics are optimal when the volume ratio of alcohol to water is 4: 1.
알코올은 탄소수 1 내지 5인 것을 사용하는데, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 사용하고 보다 바람직하게는 메탄올은 사용한다. 메탄올을 사용하는 경우 추출 속도 및 추출 수율이 다른 알코올보다 높다.Alcohols are those having 1 to 5 carbon atoms, preferably methanol or ethanol, more preferably methanol. When using methanol the extraction rate and extraction yield are higher than other alcohols.
추출 온도는 그 범위가 크게 제한되지 않으나, 바람직하게는 약 30~60℃이다. 추출 온도가 30℃ 미만인 경우 추출 속도 및 추출 수율이 너무 낮고 추출 온도가 60℃를 초과하는 경우 알코올의 일부가 기화되어 추출에 이용되지 못한다.The extraction temperature is not particularly limited in the range, but is preferably about 30 ~ 60 ℃. If the extraction temperature is less than 30 ℃ extraction rate and extraction yield is too low and if the extraction temperature exceeds 60 ℃ some of the alcohol is vaporized and not available for extraction.
여과에 의해 상등액과 잔여 홍조류 고형물을 분리하는 단계(S3)Separating the supernatant from the remaining red algae solids by filtration (S3)
추출 용매에 의해 유효 성분의 추출이 완료되면, 유효성분 및 잔여 홍조류 고형물을 포함하는 혼합 용매를 여과하여 상등액과 잔여 홍조류 고형물로 분리한다. 여과에 사용되는 여과재로는 상등액과 잔여 홍조류 고형물을 분리할 효과적으로 분리할 수 있는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 구체적으로 여과지(Filter paper), 또는 여과포 등이 있으며 기공 크기는 약 0.1 ㎛ ~ 0.005 ㎜의 범위를 가진다.When the extraction of the active ingredient is completed by the extraction solvent, the mixed solvent including the active ingredient and the remaining red algae solid is filtered to separate the supernatant and the remaining red algae solids. The filter medium used for the filtration is not particularly limited as long as it can effectively separate the supernatant from the remaining red algae solids. Specifically, the filter medium or the filter cloth has a pore size of about 0.1 μm to 0.005. It has a range of mm.
한편, 1회 추출 후 여과에 의해 분리된 잔여 홍조류 고형물에는 추출되지 않은 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)과 같은 유효 성분이 존재하는데, 최종 추출 수율을 높이기 위해 상기의 잔여 홍조류 고형물을 혼합 용매에 첨가하고 추출 후 여과에 의해 상등액과 잔여 홍조류 고형물을 분리하는 과정을 1회 내지 3회 더 반복할 수 있다.On the other hand, the remaining red algae solids separated by filtration after one extraction have an active ingredient such as Mycosporine-like amino acids (MAA), which is not extracted. The process of separating the supernatant and the remaining red algae solids by addition of the solids to the mixed solvent and by filtration after extraction may be repeated one to three times.
또한, 본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물을 제조하는 방법은 도 1에는 도시되지 않았으나, 분리된 상등액을 멤브레인 필터(Membrane filter)에 통과시켜 불순물을 제거하는 단계를 선택적으로 더 포함할 수 있다. 멤브레인 필터는 나노 사이즈의 기공 크기(약 100 ㎚ 미만)를 가지는 막으로서 여과된 상등액에 포함된 불순물이나 오염 물질 등을 상등액으로부터 제거하는 역할을 한다.In addition, the method for producing the extract for non-toxic UV protection according to the present invention, although not shown in Figure 1, may further comprise the step of removing impurities by passing the separated supernatant through a membrane filter (Membrane filter). . The membrane filter is a membrane having a nano-sized pore size (less than about 100 nm) and serves to remove impurities, contaminants, and the like contained in the filtered supernatant from the supernatant.
상등액으로부터 고형화된 조추출물을 수득하는 단계(S4)Obtaining the crude extract solidified from the supernatant (S4)
여과 분리 또는 멤브레인 필터 처리된 상등액을 농축 및 건조 과정에 의해 고형화함으로서 조추출물을 수득한다.The crude extract is obtained by solidifying the filtration separation or membrane filtered supernatant by concentration and drying.
상등액의 농축은 바람직하게는 감압 농축인 것을 특징으로 하고, 건조는 동결 건조인 것을 특징으로 한다. 감압 농축에 의할 경우 낮은 온도에서 추출 용매를 쉽게 증발시킬 수 있고, 동결 건조에 의할 때 낮은 온도에서 추출물이 고형화되므로 추출물의 유효 성분이 열에 의해 변성되는 것을 방지할 수 있다.The concentration of the supernatant is preferably characterized by concentration under reduced pressure, and drying is characterized by freeze drying. When concentrated under reduced pressure, the extraction solvent can be easily evaporated at low temperature, and the extract solidifies at low temperature by lyophilization, thereby preventing the active ingredient of the extract from being denatured by heat.
고형화된 조추출물 수용액을 제조하고 멤브레인 필터 처리하는 단계(S5)Preparing a solid solution of the crude extract and treating the membrane filter (S5)
고형화된 조추출물을 물에 용해시켜 조추출물 수용액을 제조한다. 한편, 조출출물 수용액의 조추출물이 제조 과정에서 멤브레인 필터 처리를 거치지 않은 경우 조추출물 수용액을 멤브레인 필터에 통과시켜 불순물 등을 제거한다. 불순물이 제거된 조추출물 수용액은 후술하는 분획 및 정제 단계를 거친다. 또한, 도 1에는 도시되지 않았으나, 여과에 의해 상등액과 잔여 홍조류 고형물을 분리하는 단계(S3)에서 여과 및 멤브레인 필터 처리를 거친 상등액을 후술하는 분획 및 정제 처리할 수도 있다.Crude crude extract is dissolved in water to prepare an aqueous crude extract. On the other hand, when the crude extract of the crude extract aqueous solution is not subjected to the membrane filter treatment in the manufacturing process, the crude extract aqueous solution is passed through the membrane filter to remove impurities and the like. The crude extract aqueous solution from which impurities are removed is subjected to the fractionation and purification steps described below. In addition, although not shown in FIG. 1, in the step S3 of separating the supernatant and the remaining red algae solids by filtration, the supernatant after filtration and membrane filter treatment may be fractionated and purified.
조추출물 수용액을 분획하는 단계(S6)Fractionation of crude extract aqueous solution (S6)
불순물이 제거된 조추출물 수용액 또는 여과에 의해 상등액과 잔여 홍조류 고형물을 분리하는 단계(S3)에서 여과 및 멤브레인 필터 처리를 거친 상등액을 물-알코올 농도 구배로 전개시키고, 전개된 조추출물 수용액 중 280~400 ㎚의 자외선 파장을 흡수하는 조추출 분획물을 수득한다. 이때 알코올로는 탄소수 1 내지 5인 알코올을 사용하며, 바람직하게는 메탄올을 사용한다. 물-알코올 농도 구배의 전개는 구체적인 예로 물, 50 부피 %의 알코올 수용액을 순차적으로 전개하는 방법이 있다. 한편, 전개된 조출추출 수용액 또는 상등액 중 80~400 ㎚의 자외선 파장을 흡수하는 분획 부분을 측정하기 위하여 UV 디텍터가 사용되며, 보충적으로 RI(refractive index)가 더 사용될 수 있다.In the step (S3) of separating the supernatant and the remaining red algae solids by removing the impurities from the crude extract aqueous solution or the filtration, the supernatant subjected to the filtration and membrane filter treatment was developed with a water-alcohol concentration gradient, and 280- in the developed crude extract aqueous solution. A crude extract fraction is obtained which absorbs an ultraviolet wavelength of 400 nm. In this case, an alcohol having 1 to 5 carbon atoms is used, and preferably methanol. A specific example of the development of the water-alcohol concentration gradient is a method of sequentially developing water, an aqueous 50% alcohol solution. On the other hand, a UV detector is used to measure the fraction of absorbing the ultraviolet wavelength of 80 ~ 400 nm in the developed extraction extract aqueous solution or supernatant, supplementary RI (refractive index) may be further used.
조추출 분획물을 소수성 상호 칼럼으로 1차 정제하는 단계(S7)Primary purification of the crude extract fractions with a hydrophobic cross column (S7)
수집된 조추출 분획물을 소수성 상호 칼럼에 통과시켜 1차 정제 추출물을 수득한다. 이때 사용되는 소수성 상호 칼럼으로는 그 종류가 제한되지 않으며, 구체적으로 아가로오스(agarose) 겔, 실리카 겔, 또는 유기 중합체 수지로 이루어진 베이스 입자 표면에 소수성 알킬기, 소수성 아릴기, 소수성 시아노기, 및 소수성 아민기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 소수성 관능기가 결합된 것으로 구성된다. 소수성 알킬기로는 부틸기, 옥틸기, 옥타데실(Octadecyl)기 등이 있으며, 소수성 아릴기로는 페닐에틸기가 있으며, 소수성 시아노기로는 시아노프로필기가 있으며, 소수성 아민기로는 아미노프로필기가 있다. 또한, 본 발명에 사용되는 소수성 상호 칼럼은 바람직하게는 실리카 겔 표면에 소수성 알킬기, 소수성 아릴기, 소수성 시아노기, 및 소수성 아민기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 소수성 관능기가 결합된 것을 특징으로 하며, 이러한 소수성 상호 칼럼으로는 상업적으로 일본 시세이도사의 CAPCELL PAK C8, CAPCEll PAk C18 등이 있다. 이중 CAPCELL PAK C18은 캘슐 타입의 실리카 겔 표면에 실리콘(Silicone) 고분자를 증착하여 단층을 형성하고 단층 표면에 옥타데실기를 결합시킨 것이다. 특히 본 발명에서 소수성 상호 칼럼으로 CAPCELL PAK C18 UG120을 사용하는 경우 이동상으로는 아세트산 수용액을 사용한다.The collected crude extract fractions are passed through a hydrophobic mutual column to obtain a primary purified extract. The type of hydrophobic cross-column used here is not limited, and specifically, a hydrophobic alkyl group, a hydrophobic aryl group, a hydrophobic cyano group, and a hydrophobic alkyl group on the surface of a base particle made of agarose gel, silica gel, or organic polymer resin, and One hydrophobic functional group selected from the group consisting of hydrophobic amine groups is combined. Hydrophobic alkyl groups include butyl, octyl, and octadecyl groups. Hydrophobic aryl groups include phenylethyl groups, hydrophobic cyano groups include cyanopropyl groups, and hydrophobic amine groups include aminopropyl groups. In addition, the hydrophobic cross column used in the present invention is preferably characterized in that one hydrophobic functional group selected from the group consisting of a hydrophobic alkyl group, a hydrophobic aryl group, a hydrophobic cyano group, and a hydrophobic amine group is bonded to a silica gel surface. Such hydrophobic interaction columns include CAPCELL PAK C8, CAPCEll PAk C18, etc. manufactured by Shiseido, Japan. The CAPCELL PAK C18 is a single layer formed by depositing a silicon (Silicone) polymer on the surface of the gel-type silica gel to combine the octadecyl group on the single layer surface. In particular, when using CAPCELL PAK C18 UG120 as a hydrophobic cross column in the present invention, an aqueous acetic acid solution is used.
1차 정제 추출물을 크기 배제 칼럼으로 2차 정제하는 단계(S8)Secondary purification of the first purified extract with a size exclusion column (S8)
1차 정제 추출물을 크기 배제 칼럼(Size Exclusion Column)에 통과시켜 2차 정제 추출물을 수득한다. 이때 사용되는 크기 배제 칼럼은 수용성 시스템에 사용되는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 구체적으로 시세이도사의 실리카 베이스 수용계 크기 배제 칼럼(KW-800 시리즈, KW-400 시리즈), 폴리하이드록시메타크릴레이트 베이스의 크기 배제 칼럼(OHpak 시리즈) 등이 있다.The primary purified extract is passed through a size exclusion column to obtain a secondary purified extract. In this case, the size exclusion column to be used in the water-soluble system is not limited in kind, specifically, Shiseido's silica base water-based size exclusion column (KW-800 series, KW-400 series), polyhydroxy methacrylate Base size exclusion columns (OHpak series) and the like.
2차 정제 추출물로부터 고형화된 정제 추출물을 수득하는 단계(S9)Obtaining a solidified tablet extract from the secondary tablet extract (S9)
2차 정제 추출물을 농축하고 건조시켜 고형화된 정제 추출물을 수득한다. 2차 정제 추출물의 농축은 바람직하게는 감압 농축인 것을 특징으로 하고, 건조는 동결 건조인 것을 특징으로 한다. 감압 농축에 의할 경우 낮은 온도에서 물 등의 용매를 쉽게 증발시킬 수 있고, 동결 건조에 의할 때 낮은 온도에서 정제 추출물이 고형화되므로 정제 추출물의 유효 성분이 열에 의해 변성되는 것을 방지할 수 있다.The secondary purified extract is concentrated and dried to give a solidified purified extract. Concentration of the secondary purified extract is preferably characterized by concentration under reduced pressure, and drying is characterized by freeze drying. When concentrated under reduced pressure, solvents such as water can be easily evaporated at a low temperature, and when the freeze-dried solidifies the purified extract at a low temperature, the active ingredient of the purified extract can be prevented from being denatured by heat.
본 발명의 다른 측면은 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 비독성 자외선 차단용 추출물을 이용한 비독성 자외선 차단제에 관한 것이다.Another aspect of the present invention relates to a non-toxic sunscreen using a non-toxic sunscreen extract prepared by the production method according to the present invention.
본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물은 유효성분으로 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)을 함유하고, 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)으로 팔리틴(Palythine), 아스테리나-330(Asterina-330), 및 시노린(Shinorine)을 포함하며, 포르피라-334(Porphyra-334)를 선택적으로 더 포함 있어서 UV-A 흡수능이 뛰어나다. 또한, 본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물(특히 2차 정제 추출물)은 광독성이나 세포독성이 매우 낮아 비독성 자외선 차단제의 주요 성분으로 이용될 수 있다.The non-toxic sunscreen extract according to the present invention contains Mycosporine-like amino acids (MAA) as an active ingredient, and palytin (Mycosporine-like amino acids (MAA)). Palythine), Asterina-330 (Asterina-330), and Shinorine (Shinorine), and further includes Porphyra-334 (Porphyra-334), and excellent UV-A absorption capacity. In addition, the non-toxic sunscreen extract (particularly the secondary tablet extract) according to the present invention can be used as a main component of the non-toxic sunscreen is very low phototoxicity or cytotoxicity.
자외선 차단제의 구체적인 조성을 살펴보면, 활성 성분으로 본 발명에 따른 비독성 자외선 차단용 추출물 약 0.05~10 중량%, 유상 매질 약 5~40 중량%, 유화제 약 1~10 중량%, 미량의 보조제 및 잔량으로 물과 같은 수상 매질을 포함한다.Looking at the specific composition of the sunscreen, as an active ingredient non-toxic sunscreen extract according to the present invention about 0.05 to 10% by weight, oil medium medium about 5 to 40% by weight, emulsifier about 1 to 10% by weight, trace amounts of auxiliary and residual amount Water phase media such as water.
유상 매질로는 파라핀이나 미네랄 오일과 같은 탄화수소 오일, 파라핀 왁스, 천연 오일, 실리콘 오일, 이소프로필 팔미테이트와 같은 지방산 에스터, 스테아릴 알코올과 같은 지방산 알코올 등이 있으며, 유상 매질은 유중수적(water in oil) 또는 수중유적(oil in water) 상태의 유상 성분을 구성한다.Oily media include hydrocarbon oils such as paraffin and mineral oils, paraffin waxes, natural oils, silicone oils, fatty acid esters such as isopropyl palmitate, fatty acid alcohols such as stearyl alcohol, and oily media are water in water. It constitutes an oily component in oil or oil in water.
유화제(Emulsifier)로는 솔비탄 에스터(Sorbitan eser, 상표명 SPAN), 에톡실화 솔비탄 에스터(Ethoxylated 으로 Sorbitan eser, 상표명 Tween), 실리콘 폴리올, 포타지움 스테아레이트, 에톡실화 지방산 에스터 등이 있다. Emulsifiers include sorbitan esters (trade name SPAN), ethoxylated sorbitan esters (Sorbitan eser, trade name Tween), silicone polyols, potassium stearate, ethoxylated fatty acid esters, and the like.
보조제로는 자외선 차단제에 통상적으로 포함되는 에몰리언트(emolient), 보습제, 항산화제, 유화 안정제, 증점제, 방부제, 방향제, 착색제 등이 있다.Adjuvants include emollients, humectants, antioxidants, emulsion stabilizers, thickeners, preservatives, fragrances, colorants, and the like, which are commonly included in sunscreens.
이하, 본 발명을 구체적인 실시예를 통하여 보다 명확하게 설명한다. 다만, 하기 실시예에 의하여 본 발명의 보호범위가 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described more clearly through specific examples. However, the protection scope of the present invention is not limited by the following examples.
1. 추출 원료의 선별1. Screening of Extracted Raw Materials
국내 해수에 존재하는 녹조류(Green algae, CHLOROPHYTA), 갈조류(Brown algae, PHAEOPHYTA), 홍조류(Red algae, RHODOPHYTA) 샘플을 취하고, 여지로 수분을 제거한 후 유발에서 조쇄하여 각 샘플 당 100g의 추출 원료를 준비하였다, 추출 원료 100g에 80 부피%의 메탄올 농도를 가진 수용액(메탄올 부피 80 및 물 부피 20으로 구성된 혼합 용매)을 10 ㎖ 첨가하고 약 45℃에서 믹서로 5분간 교반하면서 유효 성분을 추출한 후 여과지로 여과하고 약 280~400㎚의 파장을 가진 자외선으로 스캐닝하여 추출액의 자외선 흡수능을 검색하였다.Take samples of green algae (CHLOROPHYTA), brown algae (PHAEOPHYTA), red algae (Red algae, RHODOPHYTA) present in domestic seawater, remove water, and then crush them in jujube to extract 100g of each raw material. 10 ml of an aqueous solution (mixed solvent consisting of methanol volume 80 and water volume 20) having a methanol concentration of 80% by volume was added to 100 g of the extraction raw material, and the active ingredient was extracted while stirring for 5 minutes with a mixer at about 45 ° C, followed by filter paper Filtration and scanning with ultraviolet light having a wavelength of about 280 ~ 400nm to detect the ultraviolet absorption capacity of the extract.
표 1은 녹조류 샘플에서 추출한 추출액의 자외선 흡수능 결과를 나타낸 것이고, 표 2는 갈조류 샘플에서 추출한 추출액의 자외선 흡수능 결과를 나타낸 것이며, 표 3은 홍조류 샘플에서 추출한 추출액의 자외선 흡수능 결과를 나타낸 것이다.Table 1 shows the results of ultraviolet absorption of the extract extracted from the green algae sample, Table 2 shows the results of ultraviolet absorption of the extract extracted from the brown algae sample, Table 3 shows the results of ultraviolet absorption of the extract extracted from the red algae sample.
표 1 녹조류 종류 | 흡수 정점을 보이는 자외선 파장(㎚) |
Ulva lactuca L. | 검출 되지 않음 |
Ulva pertusa Kjellman | 검출 되지 않음 |
Ulva conglobata Kjellman | 검출 되지 않음 |
Table 1 Green algae | Ultraviolet wavelength (nm) showing absorption peak |
Ulva lactuca L. | Not detected |
Ulva pertusa Kjellman | Not detected |
Ulva conglobata Kjellman | Not detected |
표 2 갈조류 종류 | 흡수 정점을 보이는 자외선 파장(㎚) |
Agarum cribrosom Bory | 검출 되지 않음 |
Corda filum Lamouroux | 검출 되지 않음 |
Eklonia stolonifera | 검출 되지 않음 |
Kjellmaniela crassifolia Miyabe | 검출 되지 않음 |
Hizikia fusiforme | 검출 되지 않음 |
Laminaria japonica | 검출 되지 않음 |
Sargassum confusum Agardh | 335 |
Sargassum thunbergii O. Kuntze | 검출 되지 않음 |
Sargassum horneri C. Agardh | 검출 되지 않음 |
Sargassum fulvellum Agardh | 검출 되지 않음 |
Sargassum tortile C. Agardh | 검출 되지 않음 |
Spathoglossum pacificum Yendo | 322 |
Scytosiphon lomentaria J. Agardh | 검출 되지 않음 |
Pelvetia wrightii Yendo | 332 |
Pardina aborescens Holmes | 305 |
Undaria pinnatifida Suringar | 337 |
TABLE 2 Brown algae | Ultraviolet wavelength (nm) showing absorption peak |
Agarum cribrosom Bory | Not detected |
Corda filum lamouroux | Not detected |
Eklonia stolonifera | Not detected |
Kjellmaniela crassifolia Miyabe | Not detected |
Hizikia fusiforme | Not detected |
Laminaria japonica | Not detected |
Sargassum confusum Agardh | 335 |
Sargassum thunbergii O. Kuntze | Not detected |
Sargassum horneri C. Agardh | Not detected |
Sargassum fulvellum Agardh | Not detected |
Sargassum tortile C. Agardh | Not detected |
Spathoglossum pacificum Yendo | 322 |
Scytosiphon lomentaria J. Agardh | Not detected |
Pelvetia wrightii Yendo | 332 |
Pardina aborescens Holmes | 305 |
Undaria pinnatifida Suringar | 337 |
표 3 홍조류 종류 | 흡수 정점을 보이는 자외선 파장(㎚) |
Acrosorium polyneurum Okamura | 검출 되지 않음 |
Carpopeltis affinis Okamura | 328, 334 |
Chondria crassicaulis Harvey | 327, 329 |
Chondrus ocellatus Holmes | 326 |
Corallina officinalis Linne | 326 |
Carpopeltis affinis Okamura | 305 |
Gelidium amansii Lamouroux | 329, 333 |
Gracilaria textorii J.Agardh | 검출 되지 않음 |
Grateloupia filicina J. Agardh | 330 |
Grateloupia filicina C. Agardh | 330 |
Grateloupia turuturu Yamada | 330 |
Gymnogongrus flabelliformis Harvey | 334 |
Gigartina tenella Harvey | 326 |
Gloiopeltis complanata Yamada | 320 |
Gloiopeltis furcata J. Agardh | 329, 332 |
Grateloupia prolongata J. Agardh | 검출 되지 않음 |
Hypnea saidana Holmes | 332 |
Halymenia acuminata J. Agardh | 329 |
Hypnea charoides Lamouroux | 320 |
Lomentaria catenata Harvey | 330 |
Porphyra suborbiculata Kjellman | 334 |
Porphyra yezoensis | 337 |
Pachymeniopsis elliptica Yamada | 328, 330, 334 |
Phacelocarpus japonicus Okamura | 300 |
Pterocladia tenuis Okamura | 334 |
Plocamium telfairiae Harvey | 322(trace) |
Schizymenia dubyi J. Agardh | 334 |
TABLE 3 Red algae | Ultraviolet wavelength (nm) with absorption peak |
Acrosorium polyneurum Okamura | Not detected |
Carpopeltis affinis Okamura | 328, 334 |
Chondria crassicaulis Harvey | 327, 329 |
Chondrus ocellatus Holmes | 326 |
Corallina officinalis Linne | 326 |
Carpopeltis affinis Okamura | 305 |
Gelidium amansii Lamouroux | 329, 333 |
Gracilaria textorii J.Agardh | Not detected |
Grateloupia filicina J. Agardh | 330 |
Grateloupia filicina C. Agardh | 330 |
Grateloupia turuturu Yamada | 330 |
Gymnogongrus flabelliformis Harvey | 334 |
Gigartina tenella Harvey | 326 |
Gloiopeltis complanata Yamada | 320 |
Gloiopeltis furcata J. Agardh | 329, 332 |
Grateloupia prolongata J. Agardh | Not detected |
Hypnea saidana Holmes | 332 |
Halymenia acuminata J. Agardh | 329 |
Hypnea charoides Lamouroux | 320 |
Lomentaria catenata Harvey | 330 |
Porphyra suborbiculata Kjellman | 334 |
Porphyra yezoensis | 337 |
Pachymeniopsis elliptica Yamada | 328, 330, 334 |
Phacelocarpus japonicus Okamura | 300 |
Pterocladia tenuis Okamura | 334 |
Plocamium telfairiae Harvey | 322 (trace) |
Schizymenia dubyi J. Agardh | 334 |
표 1에 나타나는 바와 같이 녹조류에서는 280~400㎚의 파장을 가진 자외선의 흡수 정점이 발견되지 않았고, 표 2에 나타나는 바와 같이 갈조류에서는 16종 중 5종에서 280~400㎚의 파장을 가진 자외선의 흡수 정점이 발견되었으나, 홍조류에서 발견된 흡수 정점에 비해 그 높이가 낮아 상대적으로 낮은 유효 성분 함량을 보였다. 홍조류의 경우 표 3에서 나타나는 바와 같이 27종 중 24종에서 280~400㎚의 파장을 가진 자외선의 흡수 정점이 발견되었으며, 참곱슬이(Plocamium telfairiae)를 제외한 26종에서 흡수 정점의 높이가 갈조류에서 나타난 흡수 정점보다 커서 상대적으로 높은 유효 성분 함량을 보였다.As shown in Table 1, no absorption peak of ultraviolet light with wavelength of 280-400 nm was found in green algae, and as shown in Table 2, absorption of ultraviolet light with wavelength of 280-400 nm was observed in 5 of 16 species in brown algae. Although the peak was found, its height was lower than that of the absorption peak found in the red algae, showing a relatively low active ingredient content. In the case of red algae, the absorption peak of ultraviolet ray with wavelength of 280-400nm was found in 24 of 27 species, and the absorption peak height was increased in 26 species except Plocamium telfairiae. It was larger than the absorption peak shown, showing a relatively high active ingredient content.
조사된 대부분의 홍조류 추출물에서 자외선 흡수 물질의 존재 가능성이 파악됨에 따라 홍조류 추출물을 대상으로 4가지 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA)인 팔리틴(Palythine), 아스테리나-330(Asterina-330), 시노린(Shinorine), 포르피라-334(Porphyra-334)를 표준물질로 사용하여 홍조류 추출물 내의 미코스포린-유사 아미노산 성분의 함량을 분석하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다. 분석은 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 수행되었다.As most of the red algae extracts were examined for the presence of UV-absorbing substances, four mycosporine-like amino acids (MAA), parlythine and asterina-330, were identified for red algae extracts. (Asterina-330), Shinorine, Porphyra-334 (Porphyra-334) were used as a standard to analyze the content of mycosporin-like amino acid components in red algae extracts, the results are shown in Table 4. . Analysis was performed by high performance liquid chromatography.
표 4 홍조류 종류 | 미코스포린-유사 아미노산 추출 수율(%, 추출 원료 건조 중량 기준) |
팔리틴 | 아스테리나-330 | 시노린 | 포르피라-334 | 4가지 미코스포린-유사 아미노산 전체 |
Porphyra yezoensis | 0.225540 | 0.131668 | 0.228878 | 1.099902 | 1.685989 |
Chondrus ocellatus | 1.058505 | 0.448038 | 0.173267 | - | 1.276576 |
Grateloupia filicina | 0.43331 | 0.000412 | 0.315449 | - | 0.749172 |
Gloiopeltis furcata | 0.342213 | 0.009644 | 0.030747 | 0.261463 | 0.644067 |
Pachymeniopsis elliptica | 0.411870 | 0.006765 | 0.159964 | - | 0.578598 |
Carpopeltis affinis | 0.29995 | 0.005995 | 0.090416 | - | 0.396367 |
Grateloupia turuturu | 0.190443 | 0.002925 | 0.115745 | - | 0.309112 |
Gymnogongrus flabelliformis | 0.000482 | 0.000161 | 0.297636 | 0.000097 | 0.298375 |
Gelidium amansii | 0.024122 | 0.120514 | 0.123046 | - | 0.267681 |
Table 4 Red algae | Mycosporin-like amino acid extraction yield (% of extract raw material dry weight) |
Pallitin | Asterina-330 | Sinorin | Porfira-334 | All four mycosporin-like amino acids |
Porphyra yezoensis | 0.225540 | 0.131668 | 0.228878 | 1.099902 | 1.685989 |
Chondrus ocellatus | 1.058505 | 0.448038 | 0.173267 | - | 1.276576 |
Grateloupia filicina | 0.43331 | 0.000412 | 0.315449 | - | 0.749172 |
Gloiopeltis furcata | 0.342213 | 0.009644 | 0.030747 | 0.261463 | 0.644067 |
Pachymeniopsis elliptica | 0.411870 | 0.006765 | 0.159964 | - | 0.578598 |
Carpopeltis affinis | 0.29995 | 0.005995 | 0.090416 | - | 0.396367 |
Grateloupia turuturu | 0.190443 | 0.002925 | 0.115745 | - | 0.309112 |
Gymnogongrus flabelliformis | 0.000482 | 0.000161 | 0.297636 | 0.000097 | 0.298375 |
Gelidium amansii | 0.024122 | 0.120514 | 0.123046 | - | 0.267681 |
표 4에서 나타나는 바와 같이 4가지 미코스포린-유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids, MAA) 표준물질 전체 함량을 기준으로 한 수율은 김(Porphyra) 추출물에서 약 1.7%, 진두발(Chondrus) 추출물에서 약 1.3%로 다른 홍조류 추출물(약 0.3~0.7%)보다 상대적으로 높게 나타났다. 또한, 김 추출물은 4가지 표준 물질을 모두 포함하였으며, 포르피린-334의 함량이 매우 높은 것으로 나타났다. 또한, 진두발 추출물은 포르피린-334를 제외한 3가지 표준 물질을 포함하였으며, 팔리틴의 함량이 매우 높은 것으로 나타났다. 상기에서 검토한 결과를 바탕으로 자외선 차단용 추출물의 원료 후보로서 김과 진두발을 선택하였다.As shown in Table 4, the yield based on the total content of the four Mycosporine-like amino acids (MAA) standards is about 1.7% in the Porphyra extract and about in the Chondrus extract. It was 1.3% higher than other red algae extracts (about 0.3 ~ 0.7%). In addition, the seaweed extract contained all four standard substances, and showed a very high content of porphyrin-334. In addition, the extract of Jindubal included three standard substances except porphyrin-334, and the content of palatin was found to be very high. Based on the results examined above, seaweed and jindubal were selected as candidates for the sunscreen extract.
2. 김으로부터 자외선 차단용 추출물의 제조2. Preparation of UV Protection Extract from Seaweed
(1) 조추출물(PE)의 제조(1) Preparation of crude extract (PE)
건조 김(Porphyra yezoensis) 100g을 바이얼(vial)에 담고 여기에 80 부피%의 메탄올 수용액(메탄올 부피 80 및 물 부피 20으로 구성된 혼합 용매) 20㎖를 첨가한 후 45℃로 유지된 항온 수조에서 3시간동안 유지시켜 유효 성분을 추출하였다. 이후 바이얼 내의 내용물을 여과지(whatman No.2)로 여과하여 상등액과 잔여 홍조류 고형물을 분리시켰다. 분리된 잔여 홍조류 고형물로부터 상기의 추출 및 여과에 의해 2회 더 추출하였다. 분리된 상등액을 모두 모은 후 이를 진공 건조시켜 농축하고를 반복하여 2회 추출하였다.을 과 같은 방식으로 포함 유지하였다. 이후 용액을 여과하고(whatman No.2), 잔여고형물은 같은 방식으로 두 차례 추출을 시도하였다. 이렇게 해서 얻은 추출액을 모두 모아서 진공 증발기로 농축하고 건조시켜서 고형화된 조추출물(Pophyra extract, PE)를 수득하였다.100 g of dried seaweed ( Porphyra yezoensis ) was added to a vial, and 20 ml of 80% by volume aqueous methanol solution (mixed solvent consisting of 80 volumes of methanol and 20 volumes of water) was added thereto. Maintained for 3 hours to extract the active ingredient. The contents in the vial were then filtered through filter paper (whatman No. 2) to separate the supernatant from the remaining red algae solids. Extraction was carried out two more times by extraction and filtration from the remaining red algae solids. The separated supernatants were collected, concentrated in vacuo, concentrated, and extracted twice. The solution was then filtered (whatman No. 2) and the remaining solids were extracted twice in the same way. The extracts thus obtained were collected, concentrated in a vacuum evaporator and dried to give a solidified crude extract (Pophyra extract, PE).
(2) 조추출 분획물의 제조(2) Preparation of Crude Extract Fractions
고형화된 조추출물 10㎖를 증류수 90㎖에 첨가하고 용해시켜 조추출물 수용액을 제조한 후 이를 기공 크기가 0.45㎚인 멤브레인 필터(Gelman, USA)에 여과시켜 불순물을 제거하였다. 불순물이 제거된 조추출물 수용액을 Prep LC system[dual pump(Koto, Japan), auto injector, UV/RI detector, fraction collector로 구성됨 상에서 물-메탄올 농도 구배(처음엔 물, 다음엔 50 부피%의 메탄올 수용액)로 전개(전개속도는 5㎖/min)시킨 후 UV 디텍터 및 RI 디텍터를 사용하여 280~400 ㎚의 자외선 파장을 흡수하는 조추출 분획물을 수득하였다.10 mL of the solidified crude extract was added to 90 mL of distilled water to dissolve to prepare an aqueous crude extract solution, which was then filtered through a membrane filter (Gelman, USA) having a pore size of 0.45 nm to remove impurities. The crude extract aqueous solution from which impurities are removed is composed of Prep LC system (dual pump (Koto, Japan), auto injector, UV / RI detector, and fraction collector) in water-methanol concentration gradient (first water, then 50% by volume methanol solution). The crude extract fraction absorbing the ultraviolet wavelength of 280-400 nm was obtained using UV detector and RI detector after development ().
(3) 정제 추출물(P7)의 제조(3) Preparation of the purified extract (P7)
수득한 조추출 분획물을 UG120 guard column(Shiseido, Japan)으로 보호된 소수성 상호 칼럼(Capcellpak C18 UG120 semi-prepatative column; Shiseido, Japan)에 0.2 부피%의 아세트산 수용액과 함께 10㎖/min의 속도로 전개하여 1차 정제하였다. 1차 정제 추출물을 크기 배제 칼럼(Ohpak 2002; Shiseido, Japan)에 물과 함께 2.5㎖/min의 속도로 정개하여 2차 정제 하였다. 2차 정제 추출물은 밝은 노란빛을 가진 액체이었고, 이를 진공 증발기로 농축하고 동결 건조시켜서 고형화된 정제 추출물(P7)을 수득하였다.The obtained crude extract fractions were developed at a rate of 10 ml / min with a 0.2% by volume aqueous acetic acid solution in a hydrophobic cross column (Capcellpak C18 UG120 semi-prepatative column; Shiseido, Japan) protected by a UG120 guard column (Shiseido, Japan). It was purified first. The first purified extract was purified on a size exclusion column (Ohpak 2002; Shiseido, Japan) with water at a rate of 2.5 ml / min for second purification. The secondary tablet extract was a bright yellow liquid, which was concentrated on a vacuum evaporator and lyophilized to give a solidified tablet extract (P7).
3. 김으로부터 추출된 자외선 차단용 추출물의 독성 실험3. Toxicity test of sunscreen extract extracted from seaweed
(1) 광독성(phototoxicity)(1) phototoxicity
김으로부터 제조된 추출물인 PE와 P7에 대해 인체 광독성 결과와 양호한 일치를 보인다고 알려진 OECD의 화학물질의 평가법인 3T3 NRU 광독성 시험법(The 3T3 neutral red uptake photoxicity test,3T3 NRU PT)과 산소의존적 세포막 손상을 효과적으로 검색하는 방법으로 알려진 광용혈 시험법(Photohemolysis Test)을 적용하여 광독성을 평가하였다. 3T3 NRU 광독성 시험법에는 마우스 유래의 섬유아세모(NIH/3T3)가 사용되었고, 광용혈 시험법에는 인간 적혈구(Human Erythrocyte)가 사용되었다.The 3T3 neutral red uptake photoxicity test (3T3 NRU PT) and oxygen-dependent cell membrane damage, an assessment of OECD chemicals known to show good agreement with human phototoxicity results for PE and P7 extracts from seaweed. The photohemolysis test (Photohemolysis Test), which is known as an effective method of screening, was applied to evaluate phototoxicity. Fibrosismolecule derived from mouse (NIH / 3T3) was used for the 3T3 NRU phototoxicity test, and human erythrocytes (Human Erythrocyte) were used for the photohemolysis test.
3T3 NRU 광독성 시험법(The 3T3 neutral red uptake photoxicity test,3T3 NRU PT)은 화장품의 광독성 평가에 대한 대체시험법으로 2004년 4월 OECD 독성시험 기준으로 채택되었으녀, 마우스 유래의 섬유아세포인 3T3 cell을 이용하여 광조사한 것과 광조사하지 않은 세포와의 세포독성을 NRU 시험을 이용하여 그 정도를 비교하여 그 차이(PIF, photoirritation factor)가 5배 이상이 되면 광독성 물질로 분류하는 평가방법이다.The 3T3 neutral red uptake photoxicity test (3T3 NRU PT) was adopted as an alternative to the evaluation of cosmetic phototoxicity in April 2004 as an OECD Toxicity Test standard. It is an evaluation method to classify the cytotoxicity between light irradiated and non-irradiated cells by using the NRU test to classify the phototoxic substance when the difference (PIF, photoirritation factor) becomes 5 times or more.
표 5는 3T3 NRU 광독성 시험법에 의한 김으로부터 제조된 추출물인 PE와 P7의 광독성 결과를 나타낸 것이다.Table 5 shows the phototoxicity results of PE and P7 extracts prepared from laver by the 3T3 NRU phototoxicity assay.
표 5에서 나타나는 바와 같이 정제 추출물인 P7은 평균 반수 치사량(IC50, 일반적으로 독성이 예상되는 물질 일정량을 동물에 투여해 실험에 사용된 동물의 수가 반수 이상 죽는 량을 말한다.) 농도가 자외선 조사 여부와 관계없이 1000 ㎎/㎖를 초과하고, PIF 값이 1을 나타내어 비광독성 물질(non-phototoxic substance)로 판정되었다. 또한, 조추출물인 PE의 경우 평균 반수 치사량의 농도가 P7보다 낮게 나타나 상대적으로 독성 정도가 높았으나, PIF 값이 5 미만으로 나타나 비광독성 물질로 판정되었다.As shown in Table 5, P7, a purified extract, has an average half lethal dose (IC 50 , which is the amount by which a certain amount of a substance that is expected to be toxic to animals is used in the experiment. It was determined as a non-phototoxic substance with a PIF value of 1 exceeding 1000 mg / ml regardless of whether or not. In addition, in the case of the crude extract PE, the mean half lethal concentration was lower than that of P7, and the degree of toxicity was relatively high.
표 5 추출물 종류 | 3T3 NRU 광독성 시험 결과 |
평균 IC50 농도(UV-, ㎎/㎖) | 평균 IC50 농도(UV+, ㎎/㎖) | PIF[IC50(UV-)/IC50(UV+)] |
PE | 932.5 | 215.0 | 4.34 |
P7 | > 1000 | > 1000 | 1 |
Table 5 Extract Type | 3T3 NRU Phototoxicity Test Results |
Average IC 50 Concentration (UV-, mg / ml) | Average IC 50 Concentration (UV +, mg / ml) | PIF [IC 50 (UV-) / IC 50 (UV +)] |
PE | 932.5 | 215.0 | 4.34 |
P7 | > 1000 | > 1000 | One |
도 2는 인간 적혈구 세포을 이용한 광용혈 시험법에 따른 김으로부터 추출된 비독성 자외선 차단용 조추출물(PE)과 2차 정제 추출물(P7)의 광독성 결과를 나타낸 그래프이다. 또한, 도 3은 김으로부터 추출된 비독성 자외선 차단용 조추출물(PE)의 농도가 500㎍/㎖ 일 때의 인간 적혈구 세포을 이용한 광용혈 시험법에 따른 광독성 결과를 나타낸 사진이고, 도 4는 김으로부터 추출된 비독성 자외선 차단용 2차 정제 추출물(P7)의 농도가 250㎍/㎖ 일 때의 인간 적혈구 세포을 이용한 광용혈 시험법에 따른 광독성 결과를 나타낸 사진이다. 도 2 내지 도 4에서 UV-는 자외선을 조사하지 않은 상태를 나타내고, UV+는 자외선을 조사한 상태를 나타낸다. 도 2 내지 도 4에 나타난 광용혈 시험에서 사용된 자외선 조사량은 UVA 15J/㎠ 이었다.Figure 2 is a graph showing the phototoxicity results of the non-toxic UV protection crude extract (PE) and secondary purified extract (P7) extracted from seaweed according to the photohemolysis test using human red blood cells. In addition, Figure 3 is a photograph showing the phototoxicity results according to the photohemolysis test using human erythrocytes when the concentration of non-toxic UV protection crude extract (PE) extracted from seaweed is 500㎍ / ㎖, Figure 4 It is a photograph showing the phototoxicity results according to the photohemolysis test using human erythrocytes when the concentration of the non-toxic UV blocking secondary tablet extract (P7) extracted from the 250 ㎍ / ㎖. In Figures 2 to 4, UV- represents a state not irradiated with ultraviolet rays, and UV + represents a state irradiated with ultraviolet rays. The ultraviolet dose used in the photohemolysis test shown in FIGS. 2 to 4 was UVA 15J / cm 2.
인간 적혈구를 이용한 광용혈 시험법에 의한 광독성 결과는 3T3 NRU 광독성 시험법에 의한 광독성 시험 결과와 거의 동일하였다.The phototoxicity result by the photohemolysis test using human erythrocytes was almost the same as the phototoxicity test result by the 3T3 NRU phototoxicity test.
(2) 세포독성(Cytotoxicity)(2) Cytotoxicity
김으로부터 제조된 추출물인 PE와 P7에 대해 사람의 각질세포(keratinocyte)인 HaCaT에 대한 세포독성 시험(cytotoxicity test)을 수행하였다. 세포독성의 평가는 Neutral red assay를 이용하였다.Cytotoxicity test was performed on HaCaT, a human keratinocyte, against PE and P7 extracts prepared from seaweed. The cytotoxicity was evaluated using the Neutral red assay.
표 6는 3김으로부터 제조된 추출물인 PE와 P7의 사람의 각질세포(keratinocyte)인 HaCaT에 대한 세포독성 시험 결과를 나타낸 것이다.Table 6 shows the results of cytotoxicity test on HaCaT, human keratinocytes of PE and P7, which are extracts prepared from 3 ginseng.
표 6에서 나타나는 바와 같이 PE와 P7의 HaCaT에 대한 반수 치사량 농도가 모두 5㎎/㎖ 이상으로 나타나 비세포독성 물질(non-cytotoxic substance)로 사료된다.As shown in Table 6, both the half lethal concentrations of HaCaT of PE and P7 were more than 5 mg / ml, which is considered to be a non-cytotoxic substance.
표 6 추출물 종류 | IC50 농도(㎎/㎖) |
PE | > 5 |
P7 | > 5 |
Table 6 Extract Type | IC 50 concentration (mg / ml) |
PE | > 5 |
P7 | > 5 |
상기에서 검토한 바와 같이 김으로부터 제조된 조추출물과 정제 추출물은 모두 비독성 자외선 차단용 추출물로 판명되었으며, 상기 추출물은 자외선 차단제와 같은 화장료 조성물의 주요 성분으로 사용될 수 있다. 이때 화장료 조성물은 크림, 로션, 겔, 토닉 또는 미스트 등의 유형으로 제조될 수 있고, 자외선 차단용 주출물의 함량은 피부에 독성을 일으키지 않는 범위에서 적절하게 선택될 수 있다.As discussed above, both the crude extract and the purified extract prepared from laver were found to be non-toxic sunscreen extracts, and the extract may be used as a main component of a cosmetic composition such as a sunscreen. At this time, the cosmetic composition may be prepared in the form of cream, lotion, gel, tonic or mist, the content of the sunscreen injection may be appropriately selected in the range that does not cause toxicity to the skin.