WO2011069487A2 - Dna-aptamere, die den löslichen interleukin-6-rezeptor spezifisch binden - Google Patents

Dna-aptamere, die den löslichen interleukin-6-rezeptor spezifisch binden Download PDF

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aptamer
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Universitaet Hamburg
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Definitions

  • the invention relates to aptamers which specifically bind a target molecule.
  • cytokine interleukin-6 IL-6
  • IL-6 interleukin-6
  • the biological effect of cytokines on the target cells is mediated by specific, usually membrane-bound receptors.
  • the cytokine interleukin-6 (IL-6) acts on a variety of different cells and plays a central role, especially in inflammatory processes.
  • Cytokine IL-6 is known to be involved in a variety of diseases, e.g. inflammatory autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis.
  • soluble forms also exist which consist of the extracellular domains of the membrane-like forms and also possess the ability to bind ligand, albeit at a reduced affinity to the membrane-like form. Soluble receptors can neutralize ligands, for example, by their comparatively high concentration and act in this way
  • soluble interleukin-6 receptor sIL-6R
  • the complex of IL-6 and sIL-6R causes dimerization of the membrane gpl30 (Taga, T. et al. (1989) Cell, 58, 573-581 Mackiewicz, A. et al., (1992) J. Immunol., 149, 2021-2027; Scheller and Rose-John, Med. Microbiol Immunol. (2006), 195, 173-183; Rose-John et al. , (2006), JJ Leukocyte Biol. 80, 227-235; Jones et al.
  • gpl30 is present in almost all organs, e.g. Heart, kidneys, spleen, liver, lung, placenta, and brain (Saito, M. et al., 1992, J. Immunol., 148, 4066-4071) .
  • interleukin-6 may therefore also act on cells which do not express the membrane-bound interleukin-6 receptor but the glycoprotein gp 130 (Hirota, H. et al., (1995) Proc Natl Acad., USA, 92, 4862-4866).
  • tocilizumab (Actemra®) is a monoclonal antibody currently used to treat rheumatoid arthritis. Tocilizumab (Actemra®) exerts its action via the blockade of the human IL-6 receptor, resulting in the binding of IL-6 to the receptor and a consequent
  • Other side effects include gastrointestinal perforation, hypersensitivity reactions including anaphylaxis, headache and
  • Aptamers are artificial DNA or RNA molecules that contain another molecule, e.g. a protein, specifically bind. With high specificity and affinity as well as chemical
  • aptamers have a low immunogenicity compared to antibodies.
  • aptamers may be selected by a method termed SELEX (Evolutionary Evolutionary Ligations by Exponential Enrichment) (Ellington and Szostak (1990), Nature 346, 818-822, Gopinath (2007), Anal. Bioanal Chem 387, 171-182, WO 91/19813).
  • the invention provides a DNA aptamer which specifically binds the human soluble interleukin-6 receptor and comprises the sequence GGGNGGGHGGGWGGG (SEQ ID NO: 1). However, DNA aptamers containing the sequence are excluded
  • GGGTGGGTGGGTGGGT (abbreviated (G 3 T) 4 , see SEQ ID NO: 6).
  • N is A, T, TT or TTT.
  • the soluble human interleukin-6 receptor has a molecular weight of about 50 kDa at 339 amino acids (AA).
  • the amino acid sequence of sIL-6R is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the amino acid sequence of the sIL-6R is identical to that of the extracellular domain of the membrane-bound interleukin-6 receptor (IL-6R), so that the aptamer according to the invention naturally also specifically binds the IL-6R. Any reference to the sIL-6R should therefore also include the IL-6R, unless expressly stated otherwise.
  • the DNA aptamer according to the invention is affine and specific for the human sIL-6 receptor and is unlikely or not immunogenic. It provides a promising means to treat or prevent diseases involving the soluble IL-6 receptor. It is also simple and inexpensive to produce, durable and storable.
  • the DNA aptamer according to the invention can be used in a variety of ways to diagnose or influence conditions or diseases of humans in which IL-6 and / or the soluble and / or the membrane-bound interleukin-6 receptor are directly or indirectly involved , It can be used, for example, to prepare a drug or diagnostic agent that can be used to diagnose, prevent and / or treat inflammatory conditions or diseases, cancers or infections.
  • diseases in which the inventive DNA aptamer Applications include rheumatoid arthritis, sepsis, asthma, Crohn's disease, multiple sclerosis, depression, breast cancer, multiple myeloma, and HIV infection.
  • the DNA aptamer according to the invention can also be used to introduce other molecules, for example peptides, proteins, oligonucleotides, dyes, diagnostic agents etc., into a cell.
  • these molecules are coupled to the DNA aptamer using techniques that are familiar to those skilled in the art.
  • the molecule coupled to the DNA aptamer according to the invention can then be introduced into the cell by means of the sIL-6R or the IL-6R and re-released intracellularly.
  • the molecules can also be biologically or medically active substances, so that the DNA aptamer can also have a function as part of a prodrug.
  • DNA aptamer an isolated single-stranded DNA (ssDNA) containing a target molecule, e.g. a protein that specifically binds.
  • a target molecule e.g. a protein that specifically binds.
  • DNA aptamer ssDNA oligonucleotides having at most 150, preferably at most 130, at most 110, at most 100, at most 90, at most 80, at most 70, at most 60, at most 50, at most 40, at most 30, at most 20 , at most 15 or at most 10 nucleotides understood.
  • nucleotide are here in particular the basic building blocks of nucleic acids, i. organic molecules derived from a sugar residue, usually a pentose, e.g.
  • Deoxyribose or ribose an organic base (nucleobase) and phosphoric acid.
  • the phosphoric acid is regularly linked to the sugar via an ester bond, the sugar to the nucleobase via an N-glycosidic bond.
  • the nucleobases adenine (A), cytosine (C), guanine (G) and thymine (T) regularly occur, while in ribonucleic acid (RNA) the base uracil (U) is substituted for thymine.
  • the phosphoric acid is usually present in RNA and DNA as monophosphate.
  • a "target molecule” is understood here preferably to be non-RNA and non-DNA molecules, for example proteins, peptides and glycoproteins.
  • binding is meant a bond that does not rely on the Watson-Crick pairing between nucleotides. It is preferably a non-covalent bond.
  • a DNA aptamer or a fragment thereof which binds specifically to the human sIL-6 receptor is here understood as meaning a DNA aptamer or DN A-aptamer fragment which has a related function
  • a DNA aptamer or DNA aptamer fragment which specifically binds the human sIL-6 receptor is understood as meaning a DNA aptamer or DNA aptamer fragment which has a dissociation constant of at most 1000 nM (nmol / l preferably at most 500 nM, more preferably at most 250 nM and particularly preferably at most 150 nM If reference is made here to dissociation constants, this preferably refers to average values of a one-site binding described in more detail below. Size as determined by filter binding studies As already indicated above, the term includes an hsEL-6 receptor specific binding also to the hIL-6 receptor, ie the membrane-bound human IL-6 receptor.
  • a diagnostic agent is meant herein a product that can be used in a diagnostic procedure.
  • the term also includes products, such as reagents or kits of reagents, used to determine outside the human or animal body a particular condition and / or deviation from a normal condition, e.g. a deviating sIL-6R concentration can be detected.
  • the DNA aptamer according to the invention is distinguished by the presence of four G triplets which are also characterized by an adenine, thymine or cytosine nucleotide, if appropriate, in particular in the case of the first and second G triplet viewed from the S 'direction are linked together by two or three TTiymin nucleotides.
  • the DNA aptamer according to the invention comprises the nucleotide sequence GGGNGGGHGGGWGGGW (SEQ ID NO: 2).
  • the DNA aptamer according to the invention comprises the nucleotide sequence VGGGNGGGHGGGWGGG (SEQ ID NO: 3), VGGGNGGGHGGGWGGGW (SEQ ID NO: 4) or GGGTGGGCGGGTGGGT (SEQ ID NO: 5).
  • V A, G or C.
  • GGGTGGGTGGGTGGGTGGGT SEQ ID NO: 6
  • N, H and W are preferably not simultaneously A.
  • N, H and W are not all A at the same time.
  • N, H and W are not all A at the same time.
  • the DNA aptamer according to the invention comprises one of the sequences given in SEQ ID NO: 8-12 or SEQ ID NO: 13-17 or a fragment thereof which specifically binds the human soluble meleleukin-6 receptor.
  • One or more, possibly also all bases of the nucleotides of the DNA aptamer or of the DNA aptamer fragment can be modified. This can be beneficial to
  • the DNA aptamer of the invention may also be combined with other compounds, e.g. Cholesterol or polyethylene glycol (PEG), coupled or multimerized, for example, to increase bioavailability, reduce degradation or excretion.
  • other compounds e.g. Cholesterol or polyethylene glycol (PEG), coupled or multimerized, for example, to increase bioavailability, reduce degradation or excretion.
  • a 3'-3'-dT cap deoxythymidine
  • dT deoxythymidine
  • a fragment of a DNA aptamer according to the invention preferably comprises at least 15, 16, 17, 18, 19 or 20, more preferably at least 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 or 60 consecutive nucleotides of any of the sequences shown in SEQ NO: 8-12 or the sequences given in SEQ ID NO: 13-17.
  • the fragment may also be at least 70, 80, 90, 100 or 101 consecutive nucleotides.
  • a fragment comprises at least one of the sequences according to SEQ ID NO: 1-5.
  • the DNA aptamer according to the invention preferably has a sequence as given in any one of SEQ ID Nos. 18-32, i.
  • the DNA aptamer according to the invention consists of a nucleic acid having one of the sequences shown in SEQ ID NO: 18-32
  • the aptamer according to the invention binds non-competitively to the human soluble interleukin-6 receptor. This will cause the bond of
  • Interleukin 6 (IL-6) on the sDL-6R is not affected in principle.
  • the signal transduction can be modified or prevented. This can be effected, for example, by attaching the gpl30 or else the IL-6 sterically or otherwise by means of an antibody directed against the DNA aptamer or, for example, by a molecule coupled to the DNA aptamer, e.g. a peptide, nucleic acid or other compound is hindered.
  • a binding molecule e.g. an antibody directed against the aptamer. It can also be an indirect
  • a molecule coupled to the DNA aptamer e.g., biotin or an antigen
  • another molecule e.g., avidin or an antibody
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an aptamer according to the invention.
  • the pharmaceutical composition moreover preferably comprises suitable carrier material, excipients and the like.
  • the drug may also contain one or more other active ingredients.
  • the drugs may also be coupled to the DNA aptamer, i. covalently or non-covalently bound. Suitable formulations and dosage forms are known to those skilled in the art or may be routinely prepared according to the prior art.
  • aptamers according to the invention can also be bound to nanoparticles, for example, which are loaded with other active ingredients, whereby a targeted supply of the active ingredients is made possible.
  • the invention also relates to the use of a DNA aptamer according to the first aspect of the invention for the manufacture of a medicament, preferably a medicament for the treatment of a condition or disease associated with non-normal levels of the sIL-6R in body fluid, e.g. Blood, or associated with a non-normal occurrence of IL-6R, or a diagnostic agent, e.g. to diagnose a disease associated with the normal condition
  • the medicament is for treatment and the diagnostic agent is for diagnosing inflammatory conditions, cancer or infections, for example rheumatoid arthritis, sepsis, asthma, Crohn's disease, multiple sclerosis, depression, breast cancer, multiple myeloma or HIV infection.
  • the invention relates to the use of the sequence (G 3 T) 4 (SEQ ID NO: 6), the sequence of SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 16
  • Inflammatory conditions or cancer preferably for the treatment of rheumatoid arthritis, sepsis, asthma, Crohn's disease, multiple sclerosis, depression, breast cancer or multiple myeloma.
  • Figure 1 Binding of aptamers 13-5, 13-11, 13-15, 13-27 and 13-32 to the target molecule sIL-6R.
  • the proportion of bound DNA aptamer (in%) was determined at defined sIL-6R concentrations in filter binding studies and plotted as a function of the sIL-6R concentration (logarithmic plot).
  • the measurement points and error bars shown result from the averages and standard deviations of three independent of each other Studies.
  • the dissociation constants were calculated using a one-site binding model.
  • Fig. 2 The fusion protein Hyper-IL-6. Schematically shown is the hyper IL-6 fusion construct consisting of the N- and C-terminal truncated sIL-6R (AS 113-323) and IL 6, which are linked together via a flexible linker. Linker amino acids are given in single letter code.
  • Fig. 3 Filter binding studies to analyze the specificity of the interaction between the aptamers 13-15, 13-27 and 13-32 and the target molecule sIL-6R.
  • Aptamers 13-15, 13-27 and 13-32 were exposed to increasing concentrations of the sIL-6R (see Figure 3B above) and the control proteins CEACAM1 (A) and IL6 (A and B).
  • SELEX Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment
  • Ellington and Szostak (1990) Nature 346, 818-822, Gopinath (2007), Anal., Bioanal. Chem 387, 171-182, WO 91/19813
  • steps of iterative cycles (1) incubation of a nucleic acid library with the target molecule, (2) separation of binding from non-binding nucleic acids, and (3) amplification of binding species, i. a
  • sIL-6R the amino acid sequence of sIL-6R see SEQ ID NO: 7
  • IL-6R the soluble version of the membrane-bound mterleukin-6 receptor
  • To immobilize the sIL-6R was biotinylated and subsequently immobilized via a biotin-streptavidin interaction on the surface of streptavidin-coupled Dynabeads ®.
  • the protein-coupled particles were used for aptamer selection. After separation non- binding nucleic acids by magnetic separation and washing steps, binding DNA species were eluted by heating and amplified by means of a PCR reaction. After strand separation followed the next round of selection.
  • the dsDNA was denatured by NaOH addition and the aptamer strand was was coupled from the complementary template strand with the help of magnetic Dynabeads ® to which streptavidin separately.
  • the corresponding reverse primer was previously biotinylated.
  • the resulting ssDNA was neutralized by a defined amount of HCl. After 13 rounds, the
  • the ssDNA output library Dl had the following basic structure:
  • sequence of ssDNA library Dl was characterized by a randomized region of 60 nucleotides flanked by 21 and 20 nucleotide constant regions at both the 3 'and 5' ends. The constant regions were used for attachment of the PCR primer.
  • Selection buffer B (lx PBS (0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, 6.5 mM Na 2 HP0 4 , 15 mM KH 2 PO 4 ); 3 mM MgCl 2 ; pH 7.4) for 30 min at room temperature (RT ).
  • the DNA molecules binding to the target were separated from non-binding molecules by magnetic separation, the supernatant discarded, and the DNA-target complexes washed once with 100 ⁇ l of selection buffer B (see above).
  • the elution of binding nucleic acids was carried out after careful resuspension in 55 ⁇ aqua dest. under heat at 80 ° C for 3 min. This eluate was subjected directly to a PCR without further purification steps.
  • the success of the PCR was monitored by PAGE (10% native polyacrylamide (PAA) gel).
  • the number of washing steps after separation of the non-binding DNA molecules was increased up to 12 with increasing number of selection rounds. After thirteen rounds, the
  • the sequences given include both the 60 nucleotide randomized region and the flanking 5 'and 3' primer regions. The number before the hyphen indicates the selection round (13).
  • the aptamer. 13-27 includes the known sequence motif (G 3 T) 4 .
  • Dissociation constants were carried out by means of filter binding studies. For this purpose, a constant amount ( ⁇ 0.2 nM) of radiolabeled DNA (the labeling was carried out by incorporation of ⁇ - [ 32 ⁇ ] - ⁇ (0, 1 ⁇ / ⁇ , 100 nM) using the T4 polynucleotide kinase) with increasing concentrations (up to 1000 nM) of protein for 45 min at 37 ° C incubated. Unless otherwise stated, the lx selection buffer B (lx PBS (0.137 M NaCl, 2.7mM KCl, 6.5mM Na 2 HP0 4 , 15mM KH 2 PO 4 ); 3mM MgCl 2 ; pH 7.4).
  • a nitrocellulose membrane was pretreated for 15 minutes with KOH to reduce unspecific DNA binding, clamped in a 96-well-dot blot apparatus (Schleicher & Schull) and washed twice with 200 ⁇ l of selection buffer B under vacuum.
  • the reactions were filtered through the nitrocellulose membrane. DNA molecules binding to the protein were retained on the membrane. Non-binding DNA molecules were removed by washing four times with lx selection buffer B.
  • the nitrocellulose membrane was dried and the amounts of radioactively labeled substances remaining on the membrane were quantified using a phosphorimager (BioRad). The evaluation of the data obtained was carried out using the software Quantity One ® (BioRad). For the plot of binding curves the program GraphPad Prism® (GraphPad Software, Inc., USA) was used. The dissociation constant (K ⁇ j) was determined according to a one-site-binding model based on the following equation:
  • aptamers 13-15 SEQ ID NO: 15
  • 13-27 SEQ ID NO: 16
  • filter binding studies were carried out, again the binding to SIL-6R, but also the binding to Hyper-IL6 was investigated.
  • Hyper-IL-6 is a bioactive fusion protein of IL-6 and slL-6R, both of which
  • Interaction partners are connected to each other via a flexible polypeptide linker.
  • This linker is composed of the 16 N-terminal non-helical amino acids of IL-6 and thirteen other amino acids, predominantly glycine and serine.
  • the N-terminal immunoglobulin-like domain Dl and the C-terminus of the sIL-6R have been omitted, since both are not suitable for the
  • the aptamers 13-15, 13-27 and 13-32 filter binding studies with two control proteins, IL6 and
  • CEACAMl a cell adhesion molecule that carries a C-terminal His tag analogously to sIL-6R. No binding of the aptamer to IL-6 or CEACAM1 could be detected (see Fig. 3). In contrast, a markedly concentration-dependent binding of the aptamers to the sIL-6R was observed (see Fig. 3 B, top).
  • CTTCAACGTACTCCCGGGGGTTTGGGTGGGTGGGTATCGGGAGTAGGCCGCAACTG CCTG 13-15_SeqB 35 nucleotides, see SEQ DD NO: 18
  • GGGTTGGGTGGGTGGGT The sequence of fragment 13-27_SeqD corresponds to the known DNA aptamer (G 3 T) 4 .
  • Target protein was Hyper-IL6.
  • variants 13-27_SeqD-T4A, 13-27_SeqD-T8A, 13-27_SeqD-T12A, 13-27_SeqD-T16A and 13-27_SeqD-A thymine bases have been replaced by adenine bases, with variants 13-27_SeqD-T4A, 13 -27_SeqD-T8A, 13-27_SeqD-T12A and 13-27_SeqD-T16A each a single TA exchange at different locations, ie at positions 4, 8, 12 and 16, respectively, whereas in variant 13-27_SeqD-A all thymidine nucleotides were exchanged for adenine nucleotides.
  • IQ dissociation constants
  • BMAX proportion of maximal bound DNA
  • the fragment 13-27_SeqD-A which was provided at the positions 4, 8, 12 and 16 respectively adenine instead of thyrnine nucleotides, showed a comparatively bad tie up.
  • the fragment 13-27_SeqD + TlT16 also tied badly.
  • the separation of the aptamer-protein mixtures was carried out via a 5% native polyacrylamide ⁇ AA) gel by means of polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Due to their size, aptamer-protein complexes formed under native conditions have a delayed migration behavior in the gel. The complexes therefore migrate more slowly than the corresponding free DNA molecules and are therefore detectable as so-called "shift" in the gel.
  • PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • Equal amounts of [ 32 P] radiolabelled DNA were incubated with increasing amounts of protein (0-1000 nM Hyper-IL6) in lx selection buffer B (see above) for 45 min at 37 ° C.
  • Samples were spiked with 6x DNA sample buffer (50% (w / v) sucrose, 1% (w / v) SDS, 0.1% (w / v) orange G) and native PAGE using a 5% PAA gels (lx TBE (89mM Tris-HCl, 89mM boric acid, 2mM EDTA); Acrylamide: bisacrylamide 37.5: 1 5% (w / v); TEMED (, N, NN , -tetamethyl-e-lecl amine ) 0.1% (v / v); APS (ammonium persulfate) 0.1% (w / v)).
  • the electrophoretic separation was carried out at 80 V and 4 ° C in lx TBE. After completion of the electrophoresis
  • Fragment of DNA aptamer fragment of the DNA aptamer
  • Variant of a fragment of DNA aptamer 13-27 variant of a fragment of DNA aptamer 13-27
  • DNA aptamer DNA aptamer
  • randomized region plus 5 'and 3' primer regions randomized region plus 5 'and 3' primer regions

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Zielmolekül spezifisch bindende Aptamere. Aufgabe der Erfindung ist es, diagnostische und/oder therapeutische Mittel zur Anwendung bei der Erkennung und/oder Prävention bzw. Behandlung von Entzündungsprozessen, Krebserkrankungen und Infektionen bereitzustellen. Zur Lösung dieser Aufgabe stellt die Erfindung ein DNA-Aptamer bereit, das den menschlichen löslichen Interleukin-6-Rezeptor (sIL-6R) spezifisch bindet und die Sequenz GGGNGGGHGGGWGGG, ausgenommen jedoch die Sequenz GGGTGGGTGGGTGGGT, umfasst, wobei N = A, T, TT oder TTT ist, H = A, C oder T ist und W = A oder T ist.

Description

DNA-APTAMERE, DIE DEN LÖSLICHEN INTERLEUKIN-6-REZEPTOR SPEZIFISCH BINDEN
Die Erfindung betrifft Aptamere, die ein Zielmolekül spezifisch binden.
Es ist bekannt, dass Zytokine, beispielsweise Interleukine wie Interleukin-6 (IL-6), eine bedeutende Rolle bei der Informationsvermittlung zwischen verschiedenen Zellen eines Organismus spielen. Die biologische Wirkung von Zytokinen auf die Zielzellen wird dabei durch spezifische, meist membrangebundene Rezeptoren vermittelt. Das Zytokin Interleukin-6 (IL-6) beispielsweise wirkt auf eine Vielzahl unterschiedlicher Zellen und spielt insbesondere bei Entzündungsprozessen eine zentrale Rolle. Von Zytokin IL-6 ist bekannt, dass es an einer Reihe von Erkrankungen, z.B. entzündlichen Autoimmunkrankheiten wie rheumatoider Arthritis, beteiligt ist. Von vielen membrangebundenen Zytokin-Rezeptoren existieren auch lösliche Formen, die aus den extrazellulären Domänen der membranständigen Formen bestehen und ebenfalls die Fähigkeit zur Ligandenbindung, wenn auch bei verminderter Affinität gegenüber der membranständigen Form, besitzen. Lösliche Rezeptoren können Liganden beispielsweise durch ihre vergleichsweise hohe Konzentration neutralisieren und wirken auf diese Weise
antagonistisch. Für die löslichen Rezeptoren einiger Zytokine wird aber auch eine agonistische Wirkung beschrieben. Im Falle des löslichen Interleukin-6-Rezeptors (sIL-6R) bewirkt beispielsweise der Komplex aus IL-6 und sIL-6R eine Dimerisation des membranständigen gpl30 (Taga, T. et al. (1989), Cell, 58, 573-581; Mackiewicz, A. et al. (1992) J. Immunol., 149, 2021-2027; Scheller und Rose- John, Med. Microbiol. Immunol. (2006), 195, 173-183; Rose- John et al., (2006), J. J. Leukocyte Biol. 80, 227-235; Jones et al. (2001), The FASEB Journal 15, 43-57), wodurch die Signaltransduktion initiiert wird. Anders als der membrangebundene IL-6-Rezeptor wird gpl30 in fast allen Organen, z.B. Herz, Nieren, Milz, Leber, Lunge, Plazenta und Gehirn, exprimiert (Saito, M. et al. (1992 J. Immunol., 148, 4066-4071). In Gegenwart von sIL6-R kann das Interleukin-6 daher auch auf Zellen wirken, die nicht den membranständigen Interleukin-6-Rezeptor, j edoch das Glykoprotein gp 130 exprimieren (Hirota, H. et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A, 92, 4862-4866).
BESTÄTIGUNGSKOPIE Aufgrund der oben skizzierten Bedeutung von Zytokinen sind im Stand der Technik bereits Ansätze verfolgt worden, durch gezielte Hemmung von Zytokinrezeptoren auf
Krankheitsverläufe Einfluss zu nehmen. Ein Ansatz besteht beispielsweise in der Verwendung von Antikörpern gegen Zytokinrezeptoren. Tocilizumab (Actemra®) ist beispielsweise ein monoklonaler Antikörper, der derzeit zur Behandlung von rheumatoider Arthritis eingesetzt wird. Tocilizumab (Actemra®) entfaltet seine Wirkung über die Blockade des humanen IL-6- Rezeptors, wobei die Bindung von IL-6 an den Rezeptor und eine daraus resultierende
Entzündungsreaktion verhindert wird. Die Verwendung von Antikörpern ist aber häufig mit unerwünschten Nebenwirkungen verbunden. Die häufigsten unerwünschten Nebenwirkungen bei Behandlung mit Antikörpern sind Infektionen, überwiegend Infektionen des oberen Respirationstraktes. Außerdem wurde bei deren Anwendung häufig ein leichter Anstieg der Leberfunktionswerte und des
Lipidstoffwechsels beobachtet. Weitere Nebenwirkungen sind Magen-Darm-Perforationen, Überempfindlichkeitsreaktionen einschließlich Anaphylaxie, Kopfschmerzen und
Bluthochdruck.
Seit einiger Zeit wird auch versucht, so genannte Aptamere als therapeutische und
diagnostische Mittel einzusetzen (s. z.B. Osborne et al. (1997), Curr. Opin. Chem. Biol. 1, 5-9). Aptamere sind künstliche DNA- oder RNA-Moleküle, die ein anderes Molekül, z.B. ein Protein, spezifisch binden können. Bei hoher Spezifität und Affinität sowie chemischer
Stabilität weisen Aptamere im Vergleich zu Antikörpern eine niedrige Immunogenität auf. Aptamere können zum Beispiel mit Hilfe eines Verfahrens selektiert werden, das als SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) bezeichnet wird (Ellington und Szostak (1990), Nature 346, 818-822; Gopinath (2007), Anal. Bioanal. Chem. 387, 171-182; WO 91/19813).
Trotz der bisherigen intensiven Bemühungen besteht allerdings nach wie vor ein hoher Bedarf an diagnostischen und/oder therapeutischen Mitteln zur Anwendung bei der Erkennung und oder Prävention bzw. Behandlung von Entzündungsprozessen, Krebserkrankungen und Infektionen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, solche Mittel bereitzustellen. Gelöst wird die Aufgabe durch die Gegenstände des Anspruchs 1 und der weiteren nebengeordneten Ansprüche. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den
Unteransprüchen angegeben. In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein DNA-Aptamer bereit, das den menschlichen löslichen Interleukin-6-Rezeptor spezifisch bindet und die Sequenz GGGNGGGHGGGWGGG (SEQ DD NO: 1) umfasst. Ausgenommen sind jedoch DNA-Aptamere, die die Sequenz
GGGTGGGTGGGTGGGT (abgekürzt (G3T)4, s. SEQ ID NO: 6), umfassen. Die Buchstaben geben die Basen der Nukleotide in der üblichen Kodierung an: A = Adenin; C = Cytosin; G = Guanin; T = Thymin; H = A, C oder T; W = A oder T. N bedeutet A, T, TT oder TTT.
Der lösliche Human-Interleukin-6-Rezeptor (sIL-6R) weist bei 339 Aminosäuren (AS) ein Molekulargewicht von ca. 50 kDa auf. Die Aminosäuresequenz des sIL-6R ist in der SEQ ED NO: 7 wiedergegeben. Die Aminosäuresequenz des sIL-6R stimmt mit derjenigen der extrazellulären Domäne des membranständigen Interleukin-6-Rezeptors (IL-6R) überein, so dass das erfindungsgemäße Aptamer selbstverständlich auch den IL-6R spezifisch bindet. Jede Bezugnahme auf den sIL-6R soll daher auch den IL-6R mit erfassen, sofern dies nicht ausdrücklich anders angegeben ist. Das erfindungsgemäße DNA-Aptamer ist affin und spezifisch für den humanen sIL-6-Rezeptor und dabei voraussichtlich nicht oder wenig immunogen. Es stellt ein viel versprechendes Mittel bereit, um Erkrankungen, an denen der lösliche IL-6-Rezeptor beteiligt ist, zu behandeln oder zu verhindern. Es ist darüber hinaus einfach und kostengünstig herzustellen, gut haltbar und lagerungsfähig.
Das erfindungsgemäße DNA-Aptamer kann auf vielfältige Weise eingesetzt werden, um Zustände oder Erkrankungen des Menschen, an denen IL-6 und/oder der lösliche und/oder der membranständige Interleukin-6-Rezeptor direkt oder indirekt beteiligt sind, zu diagnostizieren oder zu beeinflussen. Es kann beispielsweise dazu verwendet werden, ein Arzneimittel oder ein Diagnosemittel herzustellen, mit dessen Hilfe inflammatorische Zustände oder Erkrankungen, Krebserkrankungen oder Infektionen diagnostiziert, verhindert und/oder behandelt werden können. Beispiele für Erkrankungen, bei denen das erfindungsgemäße DNA-Aptamer Anwendung finden kann, umfassen rheumatoide Arthritis, Sepsis, Asthma, Morbus Crohn, Multiple Sklerose, Depression, Brustkrebs, Multiples Myelom und HIV-Infektion.
Das erfindungsgemäße DNA-Aptamer kann auch verwendet werden, um andere Moleküle, beispielsweise Peptide, Proteine, Oligonukleotide, Farbstoffe, Diagnosemittel etc., in eine Zelle eirizuführen. Hierzu werden diese Moleküle mit Hilfe von Techniken, die dem Fachmann geläufig sind, an das DNA-Aptamer gekoppelt. Das an das erfindungsgemäße DNA-Aptamer gekoppelte Molekül kann dann mittels des sIL-6R oder des IL-6R in die Zelle geschleust und intrazellulär wieder freigesetzt werden. Bei den Molekülen kann es sich auch um biologisch bzw. medizinisch wirksame Substanzen handeln, so dass das DNA-Aptamer auch eine Funktion als Bestandteil eines Propharmakon haben kann.
Unter einem "DNA-Aptamer" wird hier eine isolierte Einzelstrang-DNA (ssDNA) verstanden, die ein Zielmolekül, z.B. ein Protein, spezifisch bindet. Insbesondere werden unter dem Begriff "DNA-Aptamer" ssDNA-Oligonukleotide mit höchstens 150, vorzugsweise höchstens 130, höchstens 110, höchstens 100, höchstens 90, höchstens 80, höchstens 70, höchstens 60, höchstens 50, höchstens 40, höchstens 30, höchstens 20, höchstens 15 oder höchstens 10 Nukleotiden verstanden. Unter einem "Nukleotid" werden hier insbesondere die Grundbausteine von Nukleinsäuren, d.h. organische Moleküle verstanden, die aus einem Zuckerrest, in der Regel einer Pentose, z.B. Desoxyribose oder Ribose, einer organischen Base (Nukleobase) und Phosphorsäure bestehen. Die Phosphorsäure ist mit dem Zucker regelmäßig über eine Esterbindung, der Zucker mit der Nukleobase über eine N-glykosidische Bindung verbunden. In Desoxyriboukleinsäure (DNA) kommen regelmäßig die Nukleobasen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) vor, während in Ribonukleinsäure (RNA) anstelle des Thymins die Base Uracil (U) vertreten ist. Die Phosphorsäure liegt in RNA und DNA in der Regel als Monophosphat vor. Die
Verknüpfung von Nukleotiden untereinander erfolgt meistens über eine Phosphordiester- bindung zwischen dem 5 '-C- Atom einer Pentose und dem 3'-C-Atom einer benachbarten Pentose. Unter einem "Zielmolekül" werden hier vorzugsweise Nicht-RNA- und Nicht-DNA-Moleküle, beispielsweise Proteine, Peptide und Glykoproteine, verstanden. Unter "Bindung" wird hier eine Bindung verstanden, die nicht auf der Watson-Crick-Paarung zwischen Nukleotiden beruht. Es handelt sich bevorzugt um eine nicht-kovalente Bindung. Unter einem den humanen sIL-6-Rezeptor spezifisch bindenden DNA-Aptamer oder einem Fragment davon wird hier ein DNA- Aptamer oder DN A-Aptamer-Fragment verstanden, das eine diesbezügliche
Dissoziationskonstante (K<j) von maximal 7· KT6 M (mol/1), bevorzugt maximal 5· KT6 M, bevorzugt maximal 3· KT6 M, bevorzugt maximal 2· KT6 M, bevorzugt maximal KT6 M, maximal 8·10-7 M, maximal 5·10-7 M, maximal 3·10-7 M, maximal 10-7 M, maximal Z'ICT* M, maximal 5· 1 (Γ8 M oder maximal 3 · 1 (Γ8 M aufweist. Insbesondere wird unter einem den humanen sIL-6-Rezeptor spezifisch bindenden DNA-Aptamer oder DNA-Aptamer-Fragment ein DNA-Aptamer oder DNA-Aptamer-Fragment verstanden, das eine Dissoziationskonstante von maximal 1000 nM (nmol/1), vorzugsweise maximal 500 nM, weiter bevorzugt maximal 250 nM und besonders bevorzugt maximal 150 nM aufweist. Wenn hier auf Dissoziations- konstanten Bezug genommen wird, bezieht sich dies vorzugsweise auf Mittelwerte einer mit Hilfe des unten näher beschriebenen "One-Site-Binding"-Modells unter Verwendung von Filterbindungsstudien ermittelten Größe. Wie oben bereits angegeben, umfasst der Begriff einer hsEL-6-Rezeptor-spezifischen Bindung auch die spezifische Bindung an den hIL-6-Rezeptor, d.h. den membranständigen menschlichen IL-6-Rezeptor.
Unter einem "Diagnosemittel" wird hier ein Erzeugnis verstanden, das in einem diagnostischen Verfahren verwendet werden kann. Der Begriff umfasst auch Erzeugnisse, beispielsweise Reagenzien oder Reagenzienkits, mit deren Hilfe außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers ein bestimmter Zustand und/oder die Abweichung von einem Normalzustand, z.B. eine abweichende sIL-6R-Konzentration, detektiert werden kann.
Das erfindungsgemäße DNA-Aptamer zeichnet sich durch das Vorhandensein von vier G- Tripletts aus, die durch ein Adenin-, Thymin- oder Cytosin-Nukleotid, gegebenenfalls, insbesondere im Falle des aus S'-Richtung gesehen ersten und zweiten G-Tripletts, auch durch zwei oder drei TTiymin-Nukleotide miteinander verbunden sind. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform umfasst das erfindungsgemäße DNA-Aptamer die Nukleotidsequenz GGGNGGGHGGGWGGGW (SEQ ID NO: 2). In weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfasst das erfindungsgemäße DNA-Aptamer die Nukleotidsequenz VGGGNGGGHGGGWGGG (SEQ ID NO: 3), VGGGNGGGHGGGWGGGW (SEQ ID NO: 4) oder GGGTGGGCGGGTGGGT (SEQ ID NO: 5). Die Bedeutung der Buchstaben C, G, T, N, H und W ist wie oben angegeben. V = A, G oder C. Ausgenommen ist jeweils ein DNA- Aptamer, dass die Sequenz GGGTGGGTGGGTGGGT (SEQ ID NO:6) aufweist oder umfasst. Vorzugsweise sind im Falle der DNA- Aptamere mit den Sequenzen gemäß SEQ DD NO: 2 und SEQ DD NO: 4 N, H und W nicht gleichzeitig A. Auch im Falle der Sequenzen gemäß SEQ DD NO: 1 und 3 ist es bevorzugt, dass N, H und W nicht alle gleichzeitig A sind. Im Falle der
Aptamere mit den Sequenzen gemäß SEQ DD NO: 3 und SEQ DD NO: 4 ist es weiter bevorzugt, dass am 5'-Ende, d.h. an Position 1 der obigen Sequenzen, G oder C, d.h. S statt V, steht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße DNA-Aptamer eine der in den SEQ DD NO: 8-12 oder SEQ DD NO: 13-17 angegebenen Sequenzen oder ein Fragment davon, welches den menschlichen löslichen mterleukin-6-Rezeptor spezifisch bindet. Eine oder mehrere, gegebenenfalls auch alle Basen der Nukleotide des DNA-Aptamers oder des DNA-Aptamer-Fragments können modifiziert sein. Dies kann vorteilhaft sein, um
beispielsweise die Empfindlichkeit gegenüber Nukleasen in vivo zu verringern, die Aufnahme in die Zelle zu verbessern oder eine schnelle renale Resorption zu verhindern. Die Vornahme entsprechender Modifikationen liegt im Bereich des Fachkönnens des Durchschnittsfachmanns.
Das erfindungsgemäße DNA-Aptamer kann auch mit anderen Verbindungen, z.B. Cholesterol oder Polyethylenglykol (PEG), gekoppelt oder auch multimerisiert werden, um beispielsweise die Bioverfügbarkeit zu erhöhen, den Abbau oder die Ausscheidung zu vermindern. Zum Schutz vor dem Angriff von Exonukleasen kann beispielsweise am 3'-Ende eine 3'-3'-dT- Kappe (dT = Desoxythymidin) vorgesehen sein.
Ein Fragment eines erfindungsgemäßen DNA-Aptamers umfasst bevorzugt mindestens 15, 16, 17, 18, 19 oder 20, weiter bevorzugt mindestens 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 oder 60 aufeinander folgende Nukleotide von einer der in den SEQ DD NO: 8-12 oder der in den SEQ DD NO: 13-17 angegebenen Sequenzen. Im Falle der SEQ ID NO: 13-17 kann das Fragment auch mindestens 70, 80, 90, 100 oder 101 aufeinander folgende Nukleotide umfassen. Besonders bevorzugt umfasst ein Fragment mindestens eine der Sequenzen gemäß den SEQ ED NO: 1-5.
Das erfindungsgemäße DNA-Aptamer besitzt bevorzugt eine Sequenz, wie sie in einer der SEQ ID NO: 18-32 angegeben ist, d.h. das erfindungsgemäße DNA-Aptamer besteht bei diesen Ausfuhrungsformen aus einer Nukleinsäure mit einer der in den SEQ DD NO: 18-32
angegebenen Nukleotidsequenzen.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform bindet das erfindungsgemäße Aptamer nicht-kompetitiv an den menschlichen löslichen Interleukin-6-Rezeptor. Dadurch wird die Bindung von
Interleukin 6 (IL-6) an den sDL-6R grundsätzlich nicht beeinträchtigt. Gegebenenfalls kann jedoch die Signaltransduktion modifiziert oder verhindert werden. Dies kann beispielsweise bewirkt werden, indem die Anlagerung des gpl30 oder auch des IL-6 sterisch oder anderweitig mittels eines gegen das DNA-Aptamer gerichteten Antikörpers oder beispielsweise durch ein an das DNA-Aptamer gekoppeltes Molekül, z.B. ein Peptid, eine Nukleinsäure oder eine andere Verbindung, behindert wird. Eine andere Möglichkeit besteht beispielsweise darin, dass das an den Rezeptor gebundene Aptamer seinerseits von einem Bindungsmolekül, z.B. einem gegen das Aptamer gerichteten Antikörper, gebunden wird. Dabei kann auch ein indirekter
Mechanismus eingesetzt werden, so dass beispielsweise ein an das DNA-Aptamer gekoppeltes Molekül (z.B. Biotin oder ein Antigen) wiederum von einem anderen Molekül (z.B. Avidin oder ein Antikörper) gebunden wird. Auch bei diagnostischen Verfahren kann es vorteilhaft sein, wenn das DNA-Aptamer nicht-kompetitiv an den sIL-6R bindet.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel bereit, das ein erfindungsgemäßes Aptamer umfasst. Das Arzneimittel umfasst darüber hinaus bevorzugt geeignetes Trägermaterial, Exzipientien und dergleichen. Gegebenenfalls kann das Arzneimittel auch einen oder mehrere weitere Wirkstoffe enthalten. Die Wirkstoffe können dabei auch an das DNA-Aptamer gekoppelt, d.h. kovalent oder nicht-kovalent gebunden sein. Geeignete Formulierungen und Darreichungsformen sind dem Fachmann bekannt oder können auf routinemäßige Weise gemäß dem Stand der Technik hergestellt werden. Die
erfindungsgemäßen Aptamere können beispielsweise auch an Nanopartikel gebunden werden, die mit anderen Wirkstoffen beladen sind, wodurch eine gezielte Zufuhr der Wirkstoffe ermöglicht wird.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines DNA-Aptamers gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung zur Herstellung eines Arzneimittels, vorzugsweise eines Arzneimittels zur Behandlung eines Zustandes oder einer Erkrankung, die mit vom Normalzustand abweichenden Konzentrationen des sIL-6R in Körperflüssigkeit, z.B. Blut, oder mit einem vom Normalzustand abweichenden Vorkommen des IL-6R einhergeht, oder eines Diagnosemittels, z.B. zur Diagnose einer Erkrankung, die mit vom Normalzustand
abweichenden Konzentrationen des sIL-6R in Körperflüssigkeit, z.B. Blut, oder mit einem vom Normalzustand abweichenden Vorkommen des IL-6R verbunden sind. Vorzugsweise ist das Arzneimittel zur Behandlung und das Diagnosemittel zur Diagnose von Entzündungszuständen, Krebs oder Infektionen, beispielsweise Rheumatoider Arthritis, Sepsis, Asthma, Morbus Crohn, Multipler Sklerose, Depression, Brustkrebs, Multiplem Myelom oder einer HIV-Infektion vorgesehen.
In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines die Sequenz (G3T)4 (SEQ ID NO: 6), die Sequenz der SEQ ID NO: 11 oder der SEQ ED NO: 16
umfassenden DNA-Aptamers zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von
Entzündungszuständen oder Krebs, bevorzugt zur Behandlung von Rheumatoider Arthritis, Sepsis, Asthma, Morbus Crohn, Multipler Sklerose, Depression, Brustkrebs oder Multiplem Myelom.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen und den beigefügten Figuren zu Veranschaulichungszwecken näher erläutert.
Fig. 1 Bindung der Aptamere 13-5, 13-11, 13-15, 13-27 und 13-32 an das Zielmolekül sIL-6R. Der Anteil gebundenen DNA-Aptamers (in %) wurde bei definierten sIL-6R-Konzentrationen in Filterbindungsstudien ermittelt und in Abhängigkeit von der sIL-6R-Konzentration graphisch dargestellt (logarithmische Auftragung). Die gezeigten Messpunkte und Fehlerbalken ergeben sich aus den Mittelwerten und Standardabweichungen dreier voneinander unabhängiger Studien. Die Berechnung der Dissoziationskonstanten erfolgte unter Verwendung eines "One- Site-Binding"-Modells.
Fig. 2 Das Fusionsprotein Hyper-IL-6. Schematisch gezeigt ist das Hyper-IL-6- Fusionskonstrukt bestehend aus dem N-und C-terminal verkürzten sIL-6R (AS 113-323) und IL 6, welche über einen flexiblen Linker miteinander verbunden sind. Linker- Aminosäuren sind im Einbuchstaben-Code angegeben.
Fig. 3 Filterbindungsstudien zur Analyse der Spezifität der Interaktion zwischen den Aptameren 13-15, 13-27 sowie 13-32 und dem Zielmolekül sIL-6R. Die Aptamere 13-15, 13-27 und 13-32 wurden steigenden Konzentrationen des sIL-6R (s. Fig. 3B oben) sowie der Kontrollproteine CEACAM1 (A) und IL6 (A und B) ausgesetzt.
Beispiele
1. In-vitro-Selektion von DNA- Aptameren mittels magnetischer Beads
Zur Selektion von DNA- Aptameren wurde ein als SELEX (Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) bezeichneter In-vitro-Selektionsprozess (Ellington und Szostak (1990), Nature 346, 818-822; Gopinath (2007), Anal. Bioanal. Chem. 387, 171- 182; WO 91/19813) eingesetzt. Bei diesem Prozess erfolgt in iterativen Zyklen der Schritte (1) Inkubation einer Nukleinsäure-Bibliothek mit dem Zielmolekül, (2) Trennung bindender von nicht-bindenden Nukleinsäuren und (3) Vervielfältigung bindender Spezies, d.h. eine
Anreicherung von bindenden Nukleinsäuren.
Zu Beginn der ersten Selektionsrunde erfolgte die Inkubation einer DNA-Bibliothek hoher Diversität (bis zu 1015 verschiedene Moleküle) mit dem an magnetischen Partikeln
(Dynabeads®) immobilisierten sIL-6R (zur Aminosäuresequenz des sIL-6R siehe SEQ ID NO: 7), der löslichen Variante des membranständigen mterleukin-6-Rezeptors (IL-6R). Zur Immobilisierung wurde der sIL-6R biotinyliert und anschließend über eine Biotin-Streptavidin- Interaktion auf der Oberfläche Streptavidin-gekoppelter Dynabeads® immobilisiert. Die proteingekoppelten Partikel wurden für die Aptamerselektion eingesetzt. Nach Trennung nicht- bindender Nukleinsäuren mittels magnetischer Separation und Waschschritten wurden bindende DNA-Spezies durch Erhitzen eluiert und mit Hilfe einer PCR-Reaktion amplifiziert. Nach Strangtrennung folgte die nächste Selektionsrunde. Zur Strangtrennung wurde die dsDNA mittels NaOH-Zugabe denaturiert und der Aptamerstrang wurde von dem komplementären Matrizenstrang magnetisch mit Hilfe von Dynabeads®, an die Streptavidin gekoppelt war, getrennt. Der entsprechende Revers-Primer wurde vorher biotinyliert. Die so erhaltene ssDNA wurde durch eine definierte Menge an HCl neutralisiert. Nach 13 Runden wurde die
angereicherte Bibliothek kloniert und sequenziert. Die ssDNA- Ausgangsbibliothek Dl wies folgende Grundstruktur auf:
5'-G ;CTGT GTGAGCCTCCTAAC-N60-CATGCTTATTCTTGTCTCCC-3'
Die Sequenz der ssDNA-Bibliothek Dl war charakterisiert durch einen randomisierten Bereich von 60 Nukleotiden, welcher sowohl am 3'- als auch am 5'-Ende von konstanten Regionen mit 21 bzw. 20 Nukleotiden Länge flankiert war. Die konstanten Regionen dienten zur Anlagerung der PCR-Primer.
In der ersten Selektionsrunde wurde eine definierte Menge der DNA- Ausgangsbibliothek Dl (500 pmol) direkt mit dem an Dynabeads® immobilisierten sIL-6R (480 nmol) in lx
Selektionspuffer B (lx PBS (0,137 M NaCI, 2,7 mM KCl, 6,5 mM Na2HP04, 15 mM KH2P04); 3 mM MgCl2; pH 7,4) für 30 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Die an das Target bindenden DNA-Moleküle wurden mittels magnetischer Separation von nicht bindenden Molekülen getrennt, der Überstand verworfen und die DNA-Target-Komplexe einmal mit 100 μΐ lx Selektionspuffer B (s.o.) gewaschen. Die Elution bindender Nukleinsäuren erfolgte nach vorsichtigem Resuspendieren in 55 μΐ aqua dest. unter Hitzeeinwirkung bei 80 °C für 3 min. Dieses Eluat wurde direkt ohne weitere Reinigungsschritte einer PCR unterzogen. Der Erfolg der PCR wurde mittels PAGE (10%iges, natives Polyacrylamid(PAA)-Gel) kontrolliert. Die Anzahl der Waschschritte nach Trennung der nicht-bindenden DNA-Moleküle wurde mit steigender Selektionsrundezahl auf bis zu 12 erhöht. Nach dreizehn Runden wurde die
Selektion beendet. Die nach der finalen Runde 13 erhaltene dsDNA-Bibliothek wurde in den Vektor pUC19 (New England BioLabs, Beverly, MA, USA) kloniert und positive Klone wurden anschließend sequenziert. Die Sequenzierung ergab die folgenden fünf Aptamersequenzen: Aptamer SEQ ID NO:
13-5 13
13-11 14
13-15 15
13-27 16
13-32 17
Die angegebenen Sequenzen umfassen sowohl den 60 Nukleotide langen randomisierten Bereich als auch die flankierenden 5'- und 3 '-Primerbereiche. Die Ziffer vor dem Bindestrich weist auf die Selektionsrunde (13) hin. Das Aptamer. 13-27 umfasst dabei das bekannte Sequenzmotiv (G3T)4.
2. Charakterisierung und Analyse der Aptamer-sIL-6R- Wechselwirkung
Zur Untersuchung der Wechselwirkung der angereicherten DNA-Bibliothek mit dem
Zielmolekül sIL-6R und zur Ermittlung von Dissoziationskonstanten (Kj- Werten) wurden Filterbindungsstudien unter radioaktiven Bedingungen durchgeführt. Darüber hinaus wurden Gel-Shift-Untersuchungen mittels Polyacrylarnid-Gelelektrophorese (PAGE) sowie
Kompetitionsstudien unter Einsatz der Filterbindungstechnik durchgeführt. 2.1 Analytische Filterbindungsstudien
Die Untersuchung von Aptamer-Protein-Interaktionen und die Bestimmung von
Dissoziationskonstanten (Kd- Werte) erfolgten mittels Filterbindungsstudien. Dazu wurde eine konstante Menge (< 0,2 nM) an radioaktiv markierter DNA (die Markierung erfolgte durch Einbau von γ-[32Ρ]-ΑΤΡ (0, 1 μθϊ/μΐ; 100 nM) mittels der T4 Polynukleotid-Kinase) mit steigenden Konzentrationen (bis 1000 nM) an Protein für 45 min bei 37°C inkubiert. Als Puffer diente dabei, soweit nicht anders erwähnt, der lx Selektionspuffer B (lx PBS (0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl, 6,5 mM Na2HP04, 15 mM KH2P04); 3 mM MgCl2; pH 7,4). Eine Nitrozellulosemembran wurde zur Reduktion unspezifischer DNA-Bindung 15 min mit KOH vorbehandelt, in eine 96-Napf-Dot-Blot- Apparatur (Schleicher&Schüll) eingespannt und unter Vakuum zweimal mit 200 μΐ lx Selektionspuffer B gewaschen.
Die Reaktionsansätze wurden über die Nitrozellulosemembran filtriert. An das Protein bindende DNA-Moleküle wurden auf der Membran zurück gehalten. Nicht-bindende DNA- Moleküle wurden durch viermaliges Waschen mit lx Selektionspuffer B entfernt. Die
Nitrozellulosemembran wurde getrocknet und die auf der Membran verbliebenen Mengen an radioaktiv markierten Substanzen mit Hilfe eines Phosphorimagers (BioRad) quantifiziert. Die Auswertung der erhaltenen Daten erfolgte unter Verwendung der Software Quantity One® (BioRad). Zur graphischen Darstellung von Bindungskurven wurde das Programm GraphPad Prism® (GraphPad Software, Inc., USA) genutzt. Die Bestimmung der Dissoziationskonstanten (K<j) erfolgte nach einem "One-Site-Binding"-Modell auf Grundlage der folgenden Gleichung:
B
DNA max * C Protein
gebunden
Kd + c Protein wobei Bmax den maximal möglichen Anteil gebundener DNA darstellt. Für die fünf Aptamere 13-5, 13-11, 13-15, 13-27 und 13-32 (SEQ ID NO: 13-17) wurde die Bindung an den sIL-6R analysiert (s. Fig. 1). Die auf der Nitrozellulosemembran verbleibende Menge an radioaktiv markierten Nukleinsäuren wurde wie oben beschrieben quantifiziert und zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten herangezogen. Anhand der Filterbindungsstudien konnte gezeigt werden, dass alle untersuchten DNA- Aptamere ihr Zielmolekül in Lösung binden konnten und ähnliche Bindungseigenschaften aufwiesen. Die ermittelten zugehörigen Dissoziationskonstanten lagen in etwa im Bereich einer Größenordnung (s. Tabelle 1). Tabelle 1: Bindungseigenschaflen der Aptamere 13-5, 13-11, 13-15, 13-27 und 13-32.
Wiedergegeben sind die Dissoziationskonstanten (K<i) und der Anteil an maximal gebundener DNA, ermittelt in jeweils drei unabhängigen Filterbindungsstudien. Aptamer SEQ ID NO: Anteil maximaler Bindung [%] K<j [nM] Anzahl Studien
13-5 13 73,5 1163 3
13-11 14 88,5 507 3 -
13-15 15 100 434 3
13-27 16 69,5 284 3
13-32 17 100 472 3
Die Aptamere 13-15 (SEQ TD NO: 15) und 13-27 (SEQ ID NO: 16) wurden im Folgenden einer noch genaueren Untersuchung unterzogen. Hierzu wurden Filterbindungsstudien durchgerührt, wobei erneut die Bindung an SIL-6R, aber auch die Bindung an Hyper-IL6 untersucht wurde. Hyper-IL-6 ist ein bioaktives Fusionsprotein aus IL-6 und slL-6R, wobei beide
Interaktionspartner über einen flexiblen Polypeptidlinker miteinander verbunden sind. Dieser Linker setzt sich aus den 16 N-terrninalen nicht-helikalen Aminosäuren des IL-6 und dreizehn weiteren Aminosäuren, vorwiegend Glycin und Serin, zusammen. Um die Größe dieses Fusionsproteins so gering wie möglich zu halten, wurde auf die N-terminale Immunglobulin- ähnliche Domäne Dl und den C-Terminus des sIL-6R verzichtet, da beide nicht für die
Bioaktivität des IL 6/sIL-6R-Komplexes benötigt werden (Fischer, M., et al., I. A bioactive designer cytokine for human hematopoietic progenitor cell expansion. Nat Biotechnol, 1997. 15(2): S. 142-5), so dass nur die Aminosäuren 113-323 des sIL-6 in dem Fusionsprotein verwendet wurden. Es resultiert ein 408 Aminosäuren großes Fusionsprotein mit einem
Molekulargewicht von etwa 57 kDa (s. Fig. 2).
Sieben unabhängige Filterbindungsstudien zur Bindung von Aptamer 13-15 an sIL-6R ergaben einen durchschnittlichen Anteil maximaler Bindung (BMAX) von 76,4 % und eine
durchschnittliche Dissoziationskonstante K<j von 381 nM. Bei sechs unabhängigen
Filterbindungsstudien zur Bindung von Aptamer 13-15 an Hyper-IL6 ergab sich ein
durchschnittlicher Anteil maximaler Bindung (BMAX) von 35,8 % und eine durchschnittliche Dissoziationskonstante K<i von 167 nM. Im Falle des Aptamers 13-27 ergaben sich für die Bindung an sIL-6R Werte für BMAX von 100 % und für K<i von 331 nM (7 Parallelen), für die Bindung an Hyper-IL6 Werte für BMAX von 22,6 % und für Kd von 388 nM (3 Parallelen)
Zur Untersuchung der Spezifität der Aptamer-Protem- Wechselwirkung wurden die Aptamere 13-15, 13-27 und 13-32 Filterbindungsstudien mit zwei Kontrollproteinen, IL6 und
CEACAMl, einem Zelladhäsionsmolekül, das analog zum sIL-6R einen C-tenmnalen His-Tag trägt, unterzogen. Es konnte keine Bindung des Aptamers an IL-6 oder CEACAMl detektiert werden (s. Fig. 3). Im Gegensatz dazu war eine deutlich konzentrationsabhängige Bindung der Aptamere an den sIL-6R festzustellen (s. Fig. 3 B, oben).
Weitere Filterbindungsstudien wurden an Fragmenten der isolierten DNA- Aptamere durchgeführt. Hierzu wurden exemplarisch die Aptamere 13-15 (SEQ ID NO: 15) und 13-27 (SEQ ID NO: 16) herangezogen. Folgende Fragmente wurden auf ihre Bindungseigenschaften untersucht:
13-15_SeqA (60 Nukleotide, s. SEQ ED NO: 10)
CTTCAACGTACTCCCGGGGGTTTGGGTGGGTGGGTATCGGGAGTAGGCCGCAACTG CCTG 13-15_SeqB (35 Nukleotide, s. SEQ DD NO: 18)
ACTCCCGGGGGTTTGGGTGGGTGGGTATCGGGAGT
13-15_SeqC (71 Nukleotide, s. SEQ ID NO: 19)
GT GTGAGCCTCCTAACCTTCAACGTACTCCCGGGGGTTTGGGTGGGTGGGTATCG GGAGTAGGCCGCAAC
13-15_SeqD (19 Nukleotide, s. SEQ ID NO: 20)
GGGGGTTTGGGTGGGTGGG 13-15_SeqDl (18 Nukleotide, s. SEQ DD NO: 21)
GGGTTTGGGTGGGTGGGT
13-27_SeqA (60 Nukleotide, s. SEQ ID NO: 11) GAAGGACACGGTTTAGGGGTGGGTGGGTGGGTAGCTACCGGTGCCTTGGTTGGGG GTGGG
13-27_SeqB (60 Nukleotide, s. SEQ ID NO: 22)
CCTAACGAAGGACACGGTTTAGGGGTGGGTGGGTGGGTAGCTACCGGTGCCTTGGT TGGG
13-27_SeqC (34 Nukleotide, s. SEQ ID NO: 23)
ACGGTTTAGGGGTGGGTGGGTGGGTAGCTACCGG
13-27_SeqD (16 Nukleotide, s. SEQ DD NO: 6)
GGGTGGGTGGGTGGGT
13-5/32_SeqD (16 Nukleotide, s. SEQ DD NO: 5)
GGGTGGGCGGGTGGGT
13-1 l_SeqD (17 nt, s. SEQ ID NO: 24)
GGGTTGGGTGGGTGGGT Die Sequenz des Fragments 13-27_SeqD entspricht dem bekannten DNA-Aptamer (G3T)4.
Die Ergebnisse der Filterbindungsstudien sind in Tabelle 2 wiedergegeben:
Tabelle 2 Bindungseigenschaften von Fragmenten der Aptamere 13-15 und 13-27.
Wiedergegeben sind die Dissoziationskonstanten (K<j) und der Anteil an maximal gebundener DNA (BMAX), ermittelt in der angegebenen Anzahl unabhängiger Filterbindungsstudien. Zielprotein war Hyper-IL6.
Aptamerfragment SEQ TD NO: BMAX [%] Kd tnM] Anzahl Studien
13-15_SeqA 10 35,5 343 4
13-15_SeqB 18 61 1310 4
13-15_SeqC 19 26,7 252 4
13-15_SeqD 20 55,3 1639 3 13-15_SeqDl 21 93,7 418 8
13-27_SeqA 11 30,4 848 3
13-27_SeqB 22 97,8 1100 3
13-27_SeqC 23 100 5553 3
13-27_SeqD 6 31,9 221 5
13-5/32_SeqD 5 27,4 204 4
13-l l_SeqD 24 32,9 458 4
Noch weitere Filterbindungsstudien wurden mit modifizierten DNA-Aptamer-Fragmenten durchgeführt. Hierzu wurden die folgenden Fragment- Varianten des DNA-Aptamers 13-27 eingesetzt:
13-27_SeqD+Tl (16 Nukleotide, s. SEQ TD NO: 25)
TGGGTGGGTGGGTGGG
13-27_SeqD+TlT16 (17 Nukleotide, s. SEQ TD NO: 26)
TGGGTGGGTGGGTGGGT
13-27_SeqD-T (15 Nukleotide, s. SEQ TD NO: 27)
GGGTGGGTGGGTGGG
13-27_SeqD-T4A (16 Nukleotide, s. SEQ ID NO: 28)
GGGAGGGTGGGTGGGT 13-27_SeqD-T8A (16 Nukleotide, s. SEQ TD NO: 29)
GGGTGGGAGGGTGGGT
13-27_SeqD-T12A (16 Nukleotide, s. SEQ TD NO: 30)
GGGTGGGTGGGAGGGT
13-27_SeqD-T16A (16 Nukleotide, s. SEQ ID NO: 31)
GGGTGGGTGGGTGGGA 13-27_SeqD-A (16 Nukleotide, s. SEQ ID NO: 32)
GGGAGGGAGGGAGGGA Bei den Varianten 13-27_SeqD-T4A, 13-27_SeqD-T8A, 13-27_SeqD-T12A, 13-27_SeqD- T16A und 13-27_SeqD-A wurden Thyminbasen durch Adeninbasen ersetzt, wobei bei den Varianten 13-27_SeqD-T4A, 13-27_SeqD-T8A, 13-27_SeqD-T12A und 13-27_SeqD-T16A jeweils ein einzelner T-A-Austausch an verschiedenen Stellen, d.h. an den Positionen 4, 8, 12 bzw. 16, vorgenommen wurde, während bei der Variante 13-27_SeqD-A alle Thymidin- Nukleotide gegen Adenin-Nukleotide ausgetauscht wurden.
Die Ergebnisse der Filterbindungsstudien sind in Tabelle 3 wiedergegeben:
Tabelle 3 Bindungseigenschaften von modifizierten Fragmenten des Aptamers 13-27.
Wiedergegeben sind die Dissoziationskonstanten (IQ) und der Anteil an maximal gebundener DNA (BMAX), ermittelt in der angegebenen Anzahl unabhängiger Filterbindungsstudien. Zielprotein war Hyper-IL6.
Aptamerfragment SEQ ID NO: BMAX [%] Kd [nM] Anzahl Studien 13-27_SeqD+Tl 25 42,6 1969 4
13-27_SeqD+TlT16 26 - - 5
13-27_SeqD-T 27 48,7 146 3
13-27_SeqD-T4A 28 17 504 3
13-27_SeqD-T8A 29 55,4 285 3
13-27_SeqD-T12A 30 36,1 191 3
13-27_SeqD-T16A 31 33,6 914 3
13-27_SeqD-A 32 76,7 2604 3
Die Ergebnisse zeigen, dass die Fragmente bzw. Fragmentvarianten den sIL-6R ebenfalls spezifisch binden. Das Fragment 13-27_SeqD-A, bei dem an den Positionen 4, 8, 12 und 16 jeweils Adenin- statt Thyrnin-Nukleotide vorgesehen waren, wies eine vergleichsweise schlechte Bindung auf. Das Fragment 13-27_SeqD+TlT16 band ebenfalls schlecht.
Verlässliche Werte für BMAX und K<j ließen sich nicht ermitteln.
2.2 Analyse von Aptamer-Protein-Interaktionen mittels Gel-Shift
Zur weiteren Analyse der spezifischen Aptamer-sIL-6R-Interaktion wurden Gel-Shift- Experimente exemplarisch mit dem Aptamer 13-15 (SEQ ID NO: 15) sowie dem Fragment 13- 15_SeqDl (SEQ ID NO: 21) durchgeführt. Dazu wurde das radioaktiv markierte Aptamer 13- 15 bzw. 13-15_SeqDl mit steigenden Mengen Hyper-IL6 in lx Selektionspuffer B (lx PBS (0,137 M NaCl, 2,7 mM KCl, 6,5 mM Na2HP04, 15 mM KH2P04); 3 mM MgCl2; pH 7,4) inkubiert. Die Trennung der Aptamer-Protein-Gemische erfolgte über ein 5%iges natives Polyacrylamid^ AA)-Gel mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE). Unter nativen Bedingungen gebildete Aptamer-Protein-Komplexe weisen aufgrund ihrer Größe ein verzögertes Migrationsverhalten im Gel auf. Die Komplexe wandern daher langsamer als die entsprechenden freien DNA-Moleküle und werden dadurch als so genannter„Shift" im Gel detektierbar.
Gleiche Mengen [32P]-radiomarkierter DNA wurden mit steigenden Proteinmengen (0-1000 nM Hyper-IL6) in lx Selektionspuffer B (s.o.) für 45 min bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden mit 6x DNA-Probenpuffer (50% (w/v) Saccharose; 1 % (w/v) SDS; 0, 1 % (w/v) Orange G) versetzt und mittels nativer PAGE unter Verwendung eines 5%igen PAA-Gels (lx TBE (89 mM Tris-HCl, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA); Acrylamid:Bisacrylamid 37,5:1 5% (w/v); TEMED ( ,N,N N,-TetΓamemyl-e lencüamin) 0,1% (v/v); APS (Ammoniumpersulfat) 0,1% (w/v)) analysiert. Die elektrophoretische Trennung erfolgte bei 80 V und 4 °C in lx TBE. Nach beendeter Elektrophorese wurde das Gel unter Anlegen von Vakuum getrocknet. Die radioaktiven Banden wurden mittels Autoradiographie detektiert.
Die spezifische Bindung der DNA an das Targetmolekül (Hyper-IL6) verlangsamte das Laufverhalten im Vergleich zum Aptamer allein durch Formation der Aptamer-Protein- Komplexe. Diese Komplexe wurden im Gel als so genannter„Shift" deutlich. Mittels
Autoradiographie konnten die resultierenden Banden visualisiert werden. Das Aptamer 13-15 und das Aptamerfragment 13-15_SeqDl zeigten dabei deutlich eine Interaktion mit Hyper-IL6, wobei ein konzentrationsabhängiges Signal zu beobachten war (nicht dargestellt).
2.3 Kompetitionsstudien
In In-vitro-Kompetitionsstudien wurde die Wechselwirkung zwischen ausgewählten D A- Aptameren und dem sIL-6R in Anwesenheit seiner natürlichen Liganden IL-6 und gpl30 sowie von Hyper-IL-6 untersucht. Verwendet wurden hierzu die radiomarkierten "Volllängen"-DNA- Aptamere 13-15 (SEQ ID NO: 15) und 13-27 (SEQ ID NO: 16) sowie die Fragmente
13-15_SeqDl (SEQ ID NO: 21) und 13-27_SeqD (SEQ ID NO: 6). Es zeigte sich, dass keines der getesteten Aptamere mit IL-6 um die Bindung an den Rezeptor kompetiert.
Sequenzprotokoll - freier Text und Übersetzung englischer Ausdrücke
Artificial Sequence = Künstliche Sequenz
consensus sequence = Konsensussequenz
misc feature = sonstiges Merkmal
Common sequence motif of DNA äptamers 13-5 and 13-32 = Gemeinsames Sequenzmotiv der DNA-Aptamere 13-5 und 13-32
Fragment of DNA aptamer = Fragment des DNA- Äptamers
Variant of a fragment of DNA aptamer 13-27 = Variante eines Fragments des DNA- Äptamers 13-27
h is a, c or t = h ist a, c oder t
n is a, t, tt or ttt = n ist a, t, tt oder ttt
v is a, g or c = v ist a, g oder c
w is a or t = w ist a oder t
DNA aptamer = DNA- Aptamer
randomised region = randomisierter Bereich
3' primer region = 3 '-Primer-Bereich
5' primer region = 5 '-Primer-Bereich
randomised region plus 5' and 3' primer regions = randomisierter Bereich plus 5'- und 3'- Primerbereiche

Claims

Patentansprüche
DNA-Aptamer, das den menschlichen löslichen Interleukin-6- ezeptor spezifisch bindet und eine Sequenz gemäß SEQ ED NO: 1, ausgenommen jedoch eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 6, umfasst.
DNA-Aptamer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Aptamer eine der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 2-5 umfasst.
DNA-Aptamer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Aptamer eine der in den SEQ ID NO: 8-12 oder SEQ ID NO: 13-17
angegebenen Sequenzen oder ein Fragment davon, das den menschlichen löslichen Interleukin-6-Rezeptor spezifisch bindet, umfasst.
DNA-Aptamer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment mindestens 15, vorzugsweise mindestens 16, 17, 18, 19 oder 20, weiter bevorzugt mindestens 25, 30, 35, 40, 45, 50 oder 55 und besonders bevorzugt mindestens 60 aufeinander folgende Nukleotide der in den SEQ ID NO: 8-12 oder der in den SEQ ID NO: 13-17 angegebenen Sequenzen umfasst.
DNA-Aptamer nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Fragment mindestens eine der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1-5 umfasst.
DNA-Aptamer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Aptamer die Sequenz gemäß einer der SEQ ID NO: 18-32 besitzt.
7. DNA-Aptamer nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das DNA-Aptamer nicht-kompetitiv an den menschlichen löslichen Interleukin-6- Rezeptor bindet.
8. Arzneimittel, umfassend ein DNA-Aptamer nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
9. Verwendung eines DNA-Aptamers nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Arzneimittels oder eines Diagnosemittels.
10. Verwendung eines DNA-Aptamers nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Entzündungszuständen, Krebs oder Infektionen.
11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel zur Behandlung von Rheumatoider Arthritis, Sepsis, Asthma, Morbus Crohn, Multipler Sklerose, Depression, Brustkrebs, Multiplem Myelom oder einer HIV-Infektion vorgesehen ist.
12. Verwendung eines die Sequenz der SEQ ED NO: 6, SEQ DD NO: 11 oder der SEQ DD NO: 16 umfassenden DNA-Aptamers zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Entzündungszuständen oder Krebs.
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