WO2011061114A1

WO2011061114A1 - Verfahren zur herstellung von trinukleotiden

Info

Publication number: WO2011061114A1
Application number: PCT/EP2010/067313
Authority: WO
Inventors: Sabine MÜLLER; Janczyk Matthäus
Original assignee: Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Priority date: 2009-11-23
Filing date: 2010-11-11
Publication date: 2011-05-26
Also published as: DE102009046981A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von geschützten Trinukleotidenunter Verwendung einer Kombination spezifischer Schutzgruppen.

Description

Verfahren zur Herstellung von Trinukleotiden

Im letzten Jahrzehnt hat das Interesse an effizienten Me^¬ thoden für die gezielte Mutagenese ( site-directed mutagene- sis) stark zugenommen. Studien zu Proteinfunktion, Optimierung und Design sowie die Forschung auf dem stetig wachsenden Feld der weißen Biotechnologie erfordern Verfahren, welche die Herstellung von Protein- und Peptidbibliotheken erlauben. Aus diesen Bibliotheken lassen sich mit geeigneten Verfahren Proteine oder Peptide selektieren, die eine spezifische Funktion erfüllen. Dabei stehen die Funktions^¬ optimierung von Proteinen und Peptiden sowie das Design neuer Enzyme mit Potential für eine Vielzahl von Anwendungen in der molekularen Biologie, der Medizin oder in der Industrie im Vordergrund.

Die gezielte Mutagenese ist die bevorzugte Methode zur Her^¬ stellung großer Protein- oder Peptidbibliotheken. Durch die Verwendung von synthetisch hergestellten Oligonucleotiden gemischter Zusammensetzung werden an ausgewählten Orten der Proteinsequenz Variationen der 20 Aminosäuren generiert. Üblicherweise werden gemischte Oligonukleotide durch sta^¬ tistische Kopplung einer Nukleotidmischung in jedem Zyklus der automatisierten Festphasensynthese erzeugt. Diese Vor^¬ gehensweise macht es jedoch unmöglich, die Einbringung unerwünschter Aminosäuren oder gar die Erzeugung von Stop- Codons zu vermeiden. Ebenso ist es nicht möglich, auf die^¬ sem Wege nur eine bestimmte Auswahl von Codons an einer de^¬ finierten Position zu generieren. Weiterhin ist die Häufigkeit der mit dieser Methode erzeugten Mutanten hin zu den Aminosäuren verzerrt, welche von redundanten Codons kodiert werden .

Alternative Verfahren wie das „Resin Splitting" oder enzy- matische Methoden zur Oligorandomisierung wie die fehleranfällige PCR, die in vitro-Rekombination oder die Verwendung von „spiked" Oligonukleotiden wurden zwar eingesetzt, ergaben aber auch kein umfassend befriedigendes Resultat.

Um die genannten Nachteile zu überwinden, wurden Trinukleo- tid-Synthons hergestellt, welche als besser geeignete Syn^¬ thesebausteine für die Generierung von kontrolliert ge^¬ mischten Oligonukleotiden angesehen wurden. Zu deren Erzeugung wurden verschiedene Ansätze verfolgt. Es konnte ge^¬ zeigt werden, dass die Verwendung dieser Kopplungseinheiten die Herstellung von Oligonukleotidmischungen erlaubt, welche alle möglichen Aminosäurevariationen über einen definierten Bereich eines Proteins zugänglich machen. Allerdings weisen alle in der Literatur bisher bekannten Verfahren verschiedene Nachteile auf.

Beispielsweise erfordert die bisher zur Synthese von Tri- nukleotid-Synthons hauptsächlich verwendete

Phosphotriester-Methode eine spezifische Phosphatschutz^¬ gruppe, die sich nicht mittels der in der Festphasensynthe^¬ se nach dem Phosphoramiditverfahren verwendeten Standardprozeduren entfernen lässt, sondern in einem Extraschritt mit einem spezifischen Reagenz abgespalten werden muss. Darüber hinaus war die Natur der Schutzgruppe zur transienten Blockierung der 3 ' -OH-Funktion bisher ein nicht befriedigend gelöstes Problem, das zu zahlreichen Nebenreaktionen und zur Verunreinigung der Trinukleotidsynthons mit isome- ren Di- und Trimeren und mit Degradationsprodukten gefüh hat .

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein Verfahren zur Herstellung von Trinukleotiden bereitzustellen, welches die oben genannten Nachteile überwindet.

Diese Aufgabe wird gelöst mit einem Verfahren gemäß An^¬ spruch 1. Weitere bevorzugte Ausführungsformen ergeben sie aus den Unteransprüchen.

In anderen Worten wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung von Trinukleotiden der allgemeinen Formel gelöst,

worin DMT eine Dimethoxytrityl-Schutzgruppe bedeutet, B ei^¬ ne Base aus der Gruppe der Purin- und Pyrimidin-Basen ist, wobei im Falle freier NH₂~Gruppen diese aeyliert vorliegen, und wobei alle Basen B gleich oder verschieden sind, PG eine Alkylschutzgruppe, welche unsubstituiert oder mit funk- tionellen Gruppen substituiert vorliegt, bedeutet und R ei^¬ ne tert-Butyldimethylsilyl-Gruppe (TBDMS) oder eine Disul- fid-Gruppe ist, wobei das Verfahren die Umsetzung eines ersten Nukleosid-3 ' -O-Phosphoramidits der allgemeinen For^¬ mel 2 ,

worin DMT, B und PG die oben genannte Bedeutung haben, mit einem ersten Nukleosid der allgemeinen Formel 3,

worin B und R die oben genannte Bedeutung haben, zu einem- Dinukleotid der allgemeinen Formel 4,

worin DMT, B, R und PG die oben genannte Bedeutung haben, und

a) anschließende Abspaltung der 5 ' -DMT-Gruppe und Umsetzung des Dinukleotids mit freier 5'-OH-Gruppe mit einem zweiten Nukleosid-3 ' -O-Phosphoramidit der allgemeinen Formel 2, wo^¬ bei die Base B gleich oder verschieden zu der des ersten Nukleosid -3 ' -O-Phosphoramidits ist

oder

b) anschließende Abspaltung der 3'-R-Gruppe, Erzeugung ei^¬ nes 3 ' -O-Phosphoramidits und Umsetzung des Dinukleotid-3 ' - O-phosphoramidits mit einem zweiten Nukleosid der allgemei^¬ nen Formel 3, wobei die Base B gleich oder verschieden zu der des ersten Nukleosids der allgemeinen Formel 3 ist, um- fasst .

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Trinukleo- tidphosphoramidite leicht zugänglich. Diese können mittels der Festphasen-Phosphoramdidit-Methode Kopplungsreaktionen eingehen. Weiterhin erlauben sie das Entschützen von Oligo- nukleotiden und die Abspaltung vom Trägermaterial in einem Schritt .

Kennzeichnend für dieses Verfahren ist die Verwendung or^¬ thogonaler Schutzgruppen für die 5'- und die 3' -Hydroxylgruppe, wobei insbesondere die 5 ' -Hydroxylgruppe durch eine DMT-Schutzgruppe geschützt ist. Die 3 ' -Hydroxylgruppe ist erfindungsgemäß entweder durch eine tert-Butyldimethyl- silyl-Gruppe (TBDMS) oder eine Disulfid-Gruppe geschützt. Für die Phosphatgruppen werden ebenfalls definierte Schutzgruppen PG eingesetzt. Diese werden ausgewählt aus Methyl^¬ gruppe oder substituierter oder unsubstituierter Ethylgrup- pe, wobei vorzugsweise eine ß-Cyanoethylgruppe (CE) genutzt wird. Für Methyl- und unsubstituierte Ethylgruppen ist eine Abspaltung mit einem weichen Nukleophil, vorzugsweise einem Thiolat erforderlich.

Der Begriff „Phosphat" bezeichnet hier generell einen Phos- phorsäure-di- oder -tri-ester. Mit „Phosphit" werden gene^¬ rell Phosphorigsäureester bezeichnet.

Auf diesem Weg können Nebenprodukte durch eine Konkurrenz zwischen der 5'- und der 3'-OH-Gruppe während der Synthese des Trinukleotids vermieden werden. Das Entschützen der mittels Kopplung der synthetisierten Trinukleotide mit ß- Cyanoethylgruppe als Phosphatschutzgruppe erzeugten Oligo- mere ist unter den Standardbedingungen der Oligonukleoti- dentblockung möglich, ohne die Notwendigkeit zusätzlicher Protokolle wie sie bei der Entfernung von ortho-Chloro- phenyl- oder Alkyl-Gruppen vom Phosphat sonst erforderlich sind, angewandt werden. Für unsubstituierte Methyl- oder Ethylgruppen ist zusätzlich die Abspaltung mit einem weichen Nukleophil wie oben beschrieben erforderlich.

Schema 1 gibt einen Überblick über das Verfahren. Die jeweiligen Reste/Schutzgruppen haben dabei die bereits genannte Bedeutung.

Schema 1

Ein N-Acyl-5 ' -dimethoxytrityl-geschütztes Nukleosid-3 ' -0- Phosphoramidit wird mit einem N-Acyl-3 ' -0-geschützten

Nukleosid verbunden, wobei Standardbedingungen der Phospho- ramidit-Chemie in Lösung eingesetzt werden. Das erhaltene Dinukleotid kann dann sowohl in 3'- als auch in 5' -Richtung verlängert werden. Im Rahmen dieser Erfindung wurde entschieden, die DMT-Schutzgruppe der 5 ' -Hydroxylgruppe zu entfernen. Anschließend wurde das in Position 5' entschützte Dinukleotid mit einem N-Acyl-5 ' -0-DMT geschützten Nukle^¬ osid-3 ' -O-phosphoramidit umgesetzt, woraus das vollständig geschützte Trinukleotid erhalten wurde. Da die DMT-Gruppe für die 5 ' -Hydroxylgruppe sich als die beste Schutzgruppe erwiesen hatte, war die Suche nach einer passenden Schutzgruppe für die 3' -OH-Gruppe ein Schlüssel^¬ schritt. Zum Schutz einer 3 ' -Hydroxylgruppe kann Phenoxya- cetyl eingesetzt werden (PAC) . Allerdings erfolgte die Ab^¬ spaltung dieser Gruppe mit methanolischem Ammoniak, was wiederum Schwierigkeiten bei der ebenfalls notwendigen Schutzgruppe am Phosphat hervorrief. Eine ß-Cyanoethyl- gruppe, welche für die spätere Oligonucleotidsynthese vor^¬ teilhaft ist, wird unter diesen Bedingungen abgespalten und musste daher durch eine stabilere Methylgruppe ersetzt wer^¬ den. Allerdings erfordert eine Methylgruppe eine spätere Abspaltung in einem zusätzlichen Schritt mit Thiophenol o- der einem anderen Thiolreagenz . Darüber hinaus sind

Phosphorsäuretriester leicht nucleophil spaltbar, so dass bei der ammoniakalischen Behandlung die deutliche Gefahr einer Spaltung der Internukleotid-Bindungen besteht.

In der Literatur wurde oftmals die Synthese von Trinukleo- tiden mittels Phosphotriester-Chemie beschrieben, wobei or- tho-Chlorphenyl als Schutzgruppe des Phosphats verwendet wurde. Für den Schutz der 3 ' -OH-Gruppe wurden dabei die Le- vulinyl-Gruppe oder die Azidomethylbenzoyl-Gruppe verwen^¬ det, oder sie wurde völlig ungeschütz belassen. Das Nicht- schützen der 3 ' -OH-Gruppe wurde mit der höheren Reaktivität und der damit verbundenen Selektivität von primären Alkoho^¬ len in Reaktionen mit Elektrophilen begründet. Dennoch, nicht überraschend wurde von Nebenprodukten wie isomeren Di- und Trinukleotiden bei Verwendung 3 ' -ungeschützter Nukleoside berichtet. Wurden die so hergestellten Synthons zur Synthese von Oligonukleotidbibliotheken verwendet, wa- ren Leserasterverschiebungen und unerwartete Mutationen auf Proteinebene die Folge.

Um diese Nachteile zu vermeiden, wurde ein Ansatz gewählt, welcher auf DMT als 5 ' -Schutzgruppe und einer tert- Butyldimethylsilyl-Gruppe (TBDMS) oder einer Disulfid- Gruppe als 3 ' -Schutzgruppe beruht. Dies wurde kombiniert mit einer Schutzgruppe PG am Phosphat, welche entweder eine Methylgruppe oder eine substituierte oder unsubstituierte Ethylgruppe ist. Als besonders geeignet erwies sich eine ß- Cyanoethylgruppe (CE) , welche im Gegensatz zur unsubstitu- ierten Methyl- oder Ethylgruppe ohne weitere Abspaltungs^¬ schritte unter den Standardbedingugen der Oligonucleoti- dentblockung entfernt wurde.

Eine TBDMS-Gruppe kann durch Behandlung mit Fluoridionen leicht abgespalten werden. Diese Reaktion ergab allerdings eine unerwünschte Spaltung der Phosphotriester-Bindungen. Aus der Literatur ist alternativ die Verwendung von 6N Salzsäure bekannt, um die TBDMS-Gruppe zu entfernen. Dies sind allerdings sehr extreme Bedingungen, welche zu einem partiellen Verlust der Purin-Basen führen können (Depurina- tion) . Außerdem erwies es sich, dass dabei die 5'-DMT- Gruppe simultan abgespalten wird, so dass anschließend die freien 5'- und 3 ' -OH-Gruppen bei der Bindungsreaktion miteinander konkurrieren. Entsprechend werden nur geringe Ausbeuten des angestrebten Trinukleotids erzielt, das darüber hinaus verunreinigt mit isomeren Di- und Trinukleotiden ist .

Erfindungsgemäß erfolgt die Freisetzung der 3'-OH-Gruppe durch Abspaltung der 3 ' -TBDMS-Gruppe mit einem fluoridhal^¬ tigen Reagenz in einem organischen polaren aprotischen Lö- sungsmittel, und anschließende Zugabe einer wässrigen Lö^¬ sung einer wasserlöslichen Base. Das organische polare aprotische Lösungsmittel umfasst reine Lösungsmittel sowie deren Mischungen. Vorzugsweise werden DMSO oder DMF eingesetzt .

Die Entfernung der TBDMS-Gruppe wurde anhand von Di- und Trinukleotiden weiter untersucht, wobei unterschiedliche Fluoridionen genutzt wurden. Traditionell wurde oftmals tert-Butylammoniumfluorid (TBAF) verwendet. Dies führt zum Erfolg, allerdings wird eine Mischung von Produkten erhal^¬ ten, was wahrscheinlich auf einer teilweisen Spaltung der Phosphotriester-Bindungen beruht .

Alternativ wurde gefunden, dass eine Entfernung der TBDMS- Gruppe mittels TEA/3HF zum gewünschten Ergebnis führt. Die^¬ ses Agens wird in der modernen RNA-Chemie zum Entschützen von 2 ' -O-TBDMS-Gruppen verwendet. Im Vergleich zu TBAF ist TEA/3HF ein weicheres Agens, welches eine spezifische Ab^¬ trennung der TBDMS-Gruppe ohne einen Angriff auf die

Phosphotriester-Bindung erlaubt. Bei Einsatz von TEA/3HF wird nur ein Hauptprodukt erhalten. Mittels Massenspektro- metrie wurde nachgewiesen, dass dieses Hauptprodukt das in^¬ takte Trinukleotid ist (vgl. Fig. 1) .

Erfindungsgemäß ist das fluoridhaltige Reagenz entsprechend ausgewählt aus tert-Butylammoniumfluorid (TBAF) und TEA/3HF, wobei TEA/3HF bevorzugt ist.

Ebenfalls entscheidend war die Wahl der richtigen Schutzgruppe am Phosphat. Angestrebt war insbesondere der Einsatz einer CE-Gruppe, um weitere Schritte bei der Aufarbeitung zu vermeiden. Neben der CE-Gruppe sollten auch unsubstitu- ierte Methyl- oder Ethylgruppen einsetzbar sein.

Die meisten in der Literatur bekannten Protokolle zur

Phosphotriesterchemie nutzen ortho-Chlorphenyl als Phos- phat-Schutzgruppe . Phosphittriester-Chemie wurde mit Me^¬ thyl- oder Ethylgruppen als Phosphatschutzgruppen kombiniert. In all diesen Fällen sind spezielle Protokolle für das Entschützen erforderlich.

Im Hinblick auf die CE-Gruppe, deren Verwendung hier vorrangig angestrebt war, sollte diese bei allen Synthese^¬ schritten erhalten bleiben. Als Hauptproblem erwies sich die hohe Anfälligkeit der CE-Gruppe bei basischen Bedingun^¬ gen. Aufgrund der eher hohen CH-Azidität wird eine CE- Gruppe leicht durch ß-Eliminierung abgespalten. Allerdings liegt nur dann eine ausreichend hohe Azidität vor, wenn der benachbarte Phosphor in seiner höchsten Oxidationsstufe vorliegt (P^v) . Solange der Phosphor die Oxidationsstufe III aufweist (P¹¹¹) , erwies sich die CE-Gruppe als stabil. Diese Stabilität blieb selbst in Gegenwart starker Basen wie Triethylamin (TEA) oder Diisopropylamin (DIPEA) erhalten. Daher konnte die erste Kopplungsreaktion des N-Acyl-5 ' -DMT- geschützten Nukleosid-3 ' -O-Phosphoramidits in Lösung unter Standardbedingungen durchgeführt werden, ohne dass die CE- Gruppe verloren ging. Ähnlich gute Ergebnisse ließen sich bei Einsatz einer unsubstituierten Methyl- oder einer un- substituierten Ethylgruppe erzielen, ohne dass weitere Schritte erforderlich waren.

Bei der Oxidation des Phosphors erwies es sich als sehr wichtig, die Kontamination mit starken Basen zu vermeiden, da unter diesen Bedingungen eine leichte Abspaltung der CE- Gruppe vom Phosphat mit Phosphor in der Oxidationsstufe V durch ß-Eliminierung erfolgte.

Wie oben beschrieben wird zur Abspaltung der TBDMS-Gruppe vorzugsweise TEA/3HF verwendet, da dieses Reagenz neutral ist. In bekannten Protokollen zur Abspaltung einer 2'-0- Schutzgruppe bei RNA wird die Reaktion normalerweise durch reine Zugabe von Wasser beendet. Dies war im vorliegenden Fall nicht möglich, da die Hydrolyse des Reagenz zu einer stark sauren Lösung führte, welche die DMT-Gruppe abspal^¬ tet .

Daher wurde für die Beendigung der Reaktion eine wässrige Lösung einer wasserlöslichen Base verwendet, wobei strikt neutrale Bedingungen eingehalten wurden (pH-Wert zwischen 6,5 und 7,5). Unter diesen Vorraussetzungen blieben sowohl die DMT- als auch die Schutzgruppe am Phosphat intakt. Be^¬ vorzugt wurde als wasserlösliche Base Natriumhydrogencarbo- nat verwendet.

Alternativ zur TBDMS-Gruppe erwies sich für die 3'-OH- Gruppe eine Disulfid-Gruppe -CH₂-S-S-R' als geeignete

Schutzgruppe. Der Rest R' ist dabei vorzugsweise ausgewählt aus primären, sekundären oder tertiären Alkylgruppen . Besonders bevorzugt ist R' ausgewählt aus n-Propyl-, iso- Propyl- und tert . -Butyl-Gruppe .

Die Freisetzung der 3'-OH-Gruppe durch Abspaltung der 3'- Disulfid-Gruppe erfolgt vorzugsweise mit Dithiothreitol (DTT) in einem Gemisch aus Wasser und einem organischen polaren aprotischen Lösungsmittel, welches bevorzugt DMF ist. Auch hier umfasst der Begriff organisches polares aproti- sches Lösungsmittel reine Lösungsmittel sowie deren Mi^¬ schungen .

Bei primären und sekundären Alkylgruppen als Rest R' ist auf diesem Weg eine schnelle Abspaltung der Disulfid-Gruppe unter milden Bedingungen, z.B. bei Raumtemperatur, möglich. Beispielsweise ist bei primären Alkylgruppen das freie Thi- ol bereits nach 30 Minuten detektierbar, nach neun Stunden ist die 3 ' -O-Thioalklygruppe vollständig abgespalten, so dass eine freie 3'-OH-Gruppe vorliegt. Analoge Ergebnisse wurden für sekundäre Alkylgruppen erhalten, d.h. nach 9 Stunden lag auch dort die freie 3'-OH-Gruppe vor. Die er^¬ haltenen Trinukleotide weisen einen hohen Reinheitsgrad auf .

Die Spaltung eines Disulfids mit tertiärem Alkylrest erfor^¬ derte höhere Temperaturen und längere Reaktionszeiten, beispielsweise 45°C und 24 Stunden Reaktionszeit. Auch die auf diesem Weg erhaltenen Trinukleotide weisen einen hohen Reinheitsgrad auf.

Entsprechende Massenspektren, welche die vollständige Ab^¬ spaltung der Disulfid-Gruppe unter Erhalt aller anderen Schutzgruppen belegen, sind in Fig. 2 dargestellt.

Auf beiden Wegen, d.h. sowohl auf Basis der TBDMS- als auch basierend auf einer Disulfid-Schutzgruppe, wurde ein an^¬ sonsten vollständig geschütztes Trinukleotid mit freier 3'- OH-Gruppe erhalten.

Ein weiterer wichtiger Schritt war dann die Darstellung der Trinukleotidphosphoramidite der allgemeinen Formel 5

Untersucht wurden hierfür zwei Methoden. Bei der ersten kam 2-Cyanoethyl-N, -diisopropyl-chlorphosphoramidit zum Ein^¬ satz, bei der zweiten wurde 2-Cyanoethyl-N, , Ν' , N' -tetraisopropylphosphoramidit verwendet. Der Einsatz von 2- Cyanoethyl-N, -diisopropyl-chlorphosphoramidit erfordert die Gegenwart von Diisopropylethylamin (DIPEA) als Hilfsbase. Diese Reaktion ergab bei ß-Cyanoethyl als Schutzgruppe PG allerdings deren Abspaltung. Der Versuch, DIPEA durch schwächere Basen wie Pyridin, Lutidin oder Collidin zu ersetzen, scheiterte. In diesen Fällen kam es zu keiner Bildung des gewünschten Phosphoramidits .

Das alternativ eingesetzte Reagenz 2-Cyanoethyl-N, N, Ν' , N' - tetraisopropylphosphoramidit erforderte eine Aktivierung durch Tetrazol-Derivate, wobei die Reaktion nicht von der Gegenwart starker Basen abhängig ist. Zur Aktivierung wurde Diisopropylammoniumtetrazolid eingesetzt. Dies führte al^¬ lerdings wieder zu einem merklichen Verlust der ß-Cyano- ethylgruppe. Die Umsetzung eines Äquivalents des Tetrazo- lids mit einem Äquivalent des Nukleotids lieferte zwei Ä- quivalente Diisopropylamin . Letzteres ist basisch genug, die ß-Eliminierung der Cyanoethylgruppe zu initiieren. Um dieses Problem zu lösen wurde das Tetrazolid durch Benzyl- mercaptotetrazol ersetzt. Dieser Ansatz ergab nur die Frei^¬ setzung eines Äquivalents Diisopropylamin, welches von dem nach der Reaktion freigesetzten Benzylmercaptotetrazol neutralisiert wurde. Da Benzylmercaptotetrazol stärker sau^¬ er als normales Tetrazol oder Ethylmercaptotetrazol ist, agiert es als hervorragender Fänger für das Diisopropyla^¬ min, welches in das protonierte Kation überführt wird. Die^¬ se Reaktionsbedingungen ermöglichten die nahezu vollständige Umsetzung zum Phosphoramidit , wobei nur geringe Spuren an Nebenprodukt beobachtet wurden.

Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist entsprechend eine Phosphitylierung der freien 3'-OH- Gruppe durch Umsetzung mit 2-Cyanoethyl-N, N, Ν' , N' -Tetraiso- propylphosphoramidit unter Beigabe von Benzylmercaptotetra^¬ zol (BMT) zum Trinukleotid-5' -O-DMT-3' -O-Phosphoramidit der allgemeinen Formel 5.

Basierend auf diesem Protokoll wurden Trinukleotidphospho- ramidit-Synthons hergestellt, welche Codons für alle 20 A- minosäuren darstellen. Diese Synthons wurden anschließend in einem automatischen Synthesizer gekoppelt und die resultierenden Oligonukleotide wurden nach Standardprotokollen der DNA-Synthese entschützt, ohne dass zusätzliche Schritte erforderlich waren. Beschreibung der Figuren

Fig.l MALDI-MS-Analyse eines voll geschützten Trinukle- otids CAC vor (linke Seite, berechnet: 1654, ge^¬ funden: 1654) und nach Entfernung der 3'-0-TBDMS- Gruppe (rechte Seite, berechnet: 1540, gefunden: 1540)

Fig. 2 Dargestellt ist eine Übersicht von 3 ' -O-disulfid- geschützten Trinukleotiden . Die Trinukleotide unterscheiden sich im Alkylierungsgrad der Disul- fidgruppe. 13a:1580 g/mol; 14a: 1669 g/mol; 15a: 1481 g/mol. Das Derivat nach Spaltung der Disul- fidbrücke ist als 13-15b gekennzeichnet, das De^¬ rivat nach Abspaltung der 3 ' -O-Thiomethylgruppe als 13-15c. Die entsprechenden Massenspektren zeigen die vollständige Abspaltung der Disulfid- Gruppe unter Erhalt aller anderen Schutzgruppen.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert .

Beispiele

Beispiel 1 : Synthese eines 3 " -O-TBDMS-5 " -O-DMT geschützten Dinukleotids iV-Acylierung von 2 ' -Desoxyadenosin / 2 ' -Desoxycytidin / 2 ' - Desoxyguanosin

Ansatz :

1. 500 ml Pyridin

2. 50 mmol 2 ' -Desoxynukleosid (13.45 g dA-Hydrat; 13.35 g dG; 13.15 g dCHydrochlorid)

3. 5 Äq. Trimethylchlorsilan (32.5 ml)

4. 5 Äq. Acylierungsmittel (42.5 ml Isobuttersäureanhydrid bzw. 30 ml Benzoylchlorid)

In einem 1000 ml Einhalskolben wurden 50 mmol 2'- Desoxyadenosin / 2 ' -Desoxycytidin / 2 ' -Desoxyguanosin zwei Mal mit je 100 ml trockenem Pyridin coevaporiert und schließlich in 500 ml trockenem Pyridin suspendiert. Unter Kühlung wurden 5 Äquivalente Trimethylchlorsilan (32,5 ml) innerhalb 10 Minuten zur Lösung hinzugetropft, die Lösung daraufhin 15 Minuten lang weitergerührt. 5 Äquivalente Iso^¬ buttersäureanhydrid (Desoxyadenosin, Desoxyguanosin; 42,5 ml) bzw. Benzoylchlorid (Desoxycytidin; 30 ml) innerhalb von 10 Minuten zur weiterhin gekühlten Lösung getropft, das Eisbad daraufhin entfernt. Nach 20 Minuten wurde die Lösung wiederum in einem Eisbad gekühlt und die Reaktion durch die Zugabe von 200 ml kaltem Wasser beendet, nach weiteren 15 Minuten wurden 100 ml einer 30% Ammoniaklösung hinzugegeben. Nach 30 Minuten Rühren wurden alle Lösungsmittel entfernt, der Rückstand in möglichst wenig Wasser (ca. 50 ml) vollständig gelöst. Die wässrige Phase wurde daraufhin mit 100 ml Diethylether gewaschen und in einen Erlenmeyerkolben überführt. Die Kristallisation begann z.T. bereits nach einigen Sekunden und konnte ggf. durch Kühlung bzw. durch Entfernen eines Teils des Wassers beschleunigt bzw. ermög^¬ licht werden. Der Erlenmeyerkolben wurde über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt, das auskristallisierte Produkt am nächsten Tag abgesaugt, mit Wasser gewaschen und in einem Exsikkator bei vermindertem Druck über Nacht getrocknet. Als Produkt wurden färb- und geruchlose Kristalle von wat^¬ teartiger Konsistenz erhalten. Die Mutterlauge wurde für eine etwaige Nachfällung aufbewahrt, die Kristallisation unter o.g. Bedingungen wiederholt. Bei nicht erfolgter Kristallisation wurde das Produkt bis zur Trockene einge^¬ engt und mittels Säulenchromatographie (CH₂CI₂ : Methanol 80:20) von den organischen Salzen getrennt. Nach Entfernen des Dichlormethan/Methanol-Gemisches wurde ein farbloser Feststoff erhalten.

Rf-Wert (CH₂Cl₂:MeOH 8:2): 0,5

Ausbeuten :

- dA (N-acyl) : 94 %

- dC (N-acyl) : 90 %

- dG (N-acyl) : 96 % 5 ^' -O-Tritylierung

Ansatz :

1. 100 ml Pyridin (trocken)

2. 7 mmol W-Acyl-Nukleosid 1

3. 2 ml Triethylamin (trocken)

4. 0.05 Äq. DMAP (0.043 g)

5. 1.3 Äq. DMTC1 (3.1 g)

7 mmol des W-acylierten Desoxynukleosids 1 bzw. Thymidins wurden in einem 250 ml Einhalskolben jeweils zwei Mal mit je 30 ml trockenem Pyridin coevaporiert und schließlich in 100 ml trockenem Pyridin und 1.5 ml trockenem Triethylamin suspendiert. 0.05 Äquivalente DMAP (43 mg) und daraufhin 1.3 Äquivalente Dimethoxytritylchlorid (3.1 g) wurden zur Suspension hinzugegeben. Die Bildung des tritylierten Produkts wurde mittels Dünnschichtchromatographie überprüft. Bei nicht vollständiger Umsetzung wurde weiteres DMTC1 zu^¬ gegeben. Die Reaktion wurde nach Zugabe von 100 ml Wasser beendet. Das Produkt wurde so oft mit jeweils 100 ml

Diethylether extrahiert bis kein Produkt mehr in der wäss- rigen Phase vorhanden war (ca. 10 x) . Nachdem die Lösungs^¬ mittel unter vermindertem Druck vollständig am Rotations^¬ verdampfer entfernt wurden, konnte das Produkt säulenchro- matographisch gereinigt werden (CH₂Cl₂:MeOH = 99:1_^95:5).

Rf-Wert (CH₂Cl₂:MeOH 9:1): 0.5 Ausbeuten :

- 5 ^' -O-Trityl-dA (N-acyl) : 92 %

- 5 ' -O-Trityl-dA (N-acyl): 91 %

- 5 ^'-O-Trityl-dA (N-acyl): 86 %

- 5 ^' -O-Trityl-T : 97 %

Die tritylierten Nukleoside wurden mittels MALDI-MS als Natriumsignale nachgewiesen.

- 5 ' -O-Trityl-dA (N-acyl): 646.3 m/z (Natriumpeak)

- 5 ' -O-Trityl-dA (N-acyl): 656.1 m/z (Natriumpeak)

- 5 ' -O-Trityl-dA (N-acyl): 663.0 m/z (Natriumpeak)

- 5 ' -O-Trityl-T : 566 m/z (Natriumpeak)

3 ^' -O-Silylierung

Ansatz :

1. 30 ml Tetrahydrofuran (trocken)

2. 5 mmol N-Acyl-5 ^' -O-Trityl-Nukleosid 2

3. 5 ml Pyridin (trocken)

4. 1.3 Äq. Silbernitrat (0.043 g)

5. 1.2 Äq. DMTC1 (3.1 g)

5 mmol des 5 ' -O-Tritylierten Nukleosids 2 wurden in 30 ml trockenem Tetrahydrofuran und 5 ml trockenem Pyridin gelöst. Es wurden daraufhin 1.3 Äquivalente Silbernitrat und 1.2 Äquivalente TBDMS-Cl zugegeben, die Lösung danach über Nacht gerührt. Nach vollständiger Umsetzung, die mittels Dünnschichtchromatographie kontrolliert wurde, wurde das Gemisch durch einen Faltenfilter in einen mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gefüllten Scheidetrichter gegossen, die organische Phase gewaschen und daraufhin mit Natriumsulfat getrocknet. Nachdem die organischen Lösungs^¬ mittel destillativ entfernt wurden, fand keine weitere Rei^¬ nigung des Produkts statt.

Rf-Wert (CH₂Cl₂:MeOH 95:5): 0.8

Ausbeute: vollständige Umsetzung

5 ^' -O-Trityl-3 ^' -O-Silyl-dA (N-acyl) : 760.4 m/z

(Natriumpeak)

5 ^' -O-Trityl-3 ^' -O-Silyl-dC (N-acyl): 776.9 m/z (Na^¬ triumpeak)

5 ^' -O-Trityl-3 ^' -O-Silyl-dG (N-acyl): 770.5 m/z (Na^¬ triumpeak)

5 ^' -O-Trityl-3 ^' -O-Silyl-T: 681.7 m/z (Natriumpeak)

Abspaltung der 5^'-0-DMT Gruppe

Ansatz :

1. 100 ml Dichlormethan

2. 5 g Trichloressigsäure (TCA)

3. 4 mmol 5 ^' -O-Trityl-3 ^' -O-Silyl-Desoxynukleosid

(N-acyl) 3

5 g Trichloressigsäure (TCA) wurden in 100 ml Dichlormethan gelöst und zu 4 mmol Nukleosids 3 zugegeben. Nachdem mit^¬ tels Dünnschichtchromatographie auf Vollständigkeit der Ab^¬ spaltung geprüft wurde (ggf. TCA zugeben), wurde die orga^¬ nische Phase vorsichtig mit gesättigter Natriumhydrogencar- bonatlösung gewaschen . Die organische Phase wurde mit Natri^¬ umsulfat getrocknet, das Trocknungsmittel filtriert, das Lösungsmittel schließlich destillativ entfernt. Das Produkt wurde mittels Kieselgelchromatographie gereinigt.

Rf-Wert (CH₂Cl₂:MeOH 9:1): 0.5

Ausbeuten :

- 3 ^' -O-Silyl-dA (N-acyl) : 89 %

- 3^'-0-Silyl-dC (N-acyl) : 90 %

- 3^'-0-Silyl-dG (N-acyl) : 84 %

- 3^'-0-Silyl-T: 89 % Nukleosid-3 ^' -O-Phosphoramid.it

Ansatz :

1. 30 ml Dichlormethan

2. 5 ml DIPEA (trocken)

3. 3 mmol 5 ^' -O-Trityl-dA (N-acyl) 2

4. 1.2 Äq. 2-Cyanoethyl- , - diisopropylchlorphosphoramidit (0.85 ml]

3 mmol des 5'-0-DMT geschützten Nukleosids 2 wurden zwei Mal mit jeweils einer Mischung aus 10 ml trockenem Dichlormethan und 1 ml trockenem Pyridin coevaporiert und

schliesslich in 30 ml trockenem Dichlormethan gelöst. Es wurden 5 ml trockenes Diisopropylethylamin zugegeben. 1.2 Äquivalente (0.85 ml) 2-Cyanoethyl-N,.N-diisopropyl- chlorphosphoramidit wurden langsam zur Lösung gegeben, es wurde daraufhin mittels Dünnschichtchromatographie auf vollständige Umsetzung geprüft (Dichormethan : Essigester : Triethylamin : 45% : 45% : 10%) , ggf. wurde weiteres Phospity- lierungsreagenz zugegeben bis kein Ausgangsmaterial mehr zu sehen war. Nach vollständiger Umsetzung wurde die Reaktion durch die Zugabe von 2 ml trockenem Methanol beendet. Es wurden 15 ml Essigester und 5 ml Triethyamin zugegeben, die Lösung mit jeweils zwei Mal mit gesättigter Natriumhydro- gencarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Nachdem die organische Phase mit Natriumsulfat ge^¬ trocknet und das Trocknungsmittel filtriert wurde, wurden die Lösungsmittel destillativ entfernt. Das Phosphoramidit 55 wurde mittels Kieselgelchromatographie gereinigt, wobei folgendes Lösungsmittelsystem verwendet wurde:

1. 100 ml Essigester:Triethylamin 90 %:10 %

2. 100 ml Dichormethan : Essigester : riethylamin

50 %:40 %:10 %

Der Dichlormethananteil wurde in 5 "6 Schritten (jeweils 100 ml) erhöht, bis das gewünschte Phosphoramidit von der Säule eluierte. Nachdem die Lösungsmittel destillativ entfernt wurden, fand eine mindestens fünfmalige Coevaporation des Produktes mit jeweils 5 ml trockenem Dichlormethan statt, um Triethylaminreste zu entfernen (Geruchsprobe) . Das

Phosphoramidit wurde am Olpumpenvakuum über Nacht getrocknet und für die nachfolgende Kopplungsreaktion verwendet.

Rf-Wert (Dichormethan : Essigester : riethylamin 45% : 45% : 10%) : 0.9 (Desoxyguanosin : 0.4)

Ausbeuten :

- 5 ' -O-Trityl-dA (N-acyl ) -3 ' -O-Phosphoramidit : 95 %

- 5 ' -O-Trityl-dC (N-acyl)- 3 ' -O-Phosphoramidit : : 93 %

- 5 ' -O-Trityl-dG (N-acyl)- 3 ' -O-Phosphoramidit : : 86 %

- 5 ' -O-Trityl-T-3 ' -O-Phosphoramidit : : 91 % Dinukleotid

Ansatz :

1. 100 ml Acetonitril (trocken)

2. 1.5 mmol Nukleosid 4

3. 2 mmol Phosphoramidit 5

4. 10 mmol Benzylmercaptotetrazol (1.92 g)

2 mmol des Nukleosid-3 ' -O-Phosphoramidits 5 und 1.5 mmol des 3'-0-TBDMS geschützten Nukleosids 4 wurden in einem 100 ml Einhalskolben in 40 ml trockenem Acetonitril gelöst, es wurden 10 mmol (1.92 g) Benzylmercaptotetrazol (BMT) zuge^¬ geben und die Lösung so lange geschwenkt bis sich das ge^¬ samte BMT gelöst hat. Nach 5 Minuten wurde eine 0,2 M Iod- lösung ( Pyridin : HF : Wasser 2:2:1) zur Lösung hinzugegossen bis sich die Lösung nicht mehr entfärbte. Zur organischen Phase wurden nacheinander 10 ml Θ1ΠΘΓ 5 "6 Natriumbisulfit- lösung, danach 20 ml gesättigte Natriumhydrogencarbonatlö- sung und schließlich 50 ml Dichlormethan zugegeben. Die organische Phase wurde vorsichtig gewaschen und anschliessend mit Natriumsulfat getrocknet. Das Trocknungsmittel wurde filtriert, die Lösungsmittel destillativ entfernt. Die Iso^¬ lierung des Produktes fand mittels Kieselgelsäulenchroma- tographie statt. Rf-Wert (CH₂Cl₂:MeOH 9:1): = 0.6

¹H-NMR (5'-O-DMT-dGdG-3'-O-TBDMS) : (CHCl₃-dl, 300 MHz): δ = 0.111 [6 H, s, 2x -CH₃, Si-CH₃], 0.922-0.931 [9 H, s, TBDMS tert-Butyl], 1.253-1.353 [12 H, m, 4 x CH₃, Isobuturyl) , -2.2 [2 H, m, Isobuturyl], -2.75 [2 H, CH₂; CE-Gruppe] , -3.8 [6 H, s, DMT 2x -0-CH₃], -4.25 [2 H, m, CE-Gruppe], 6.805-7.3 [13 H, m, DMT Phenyl], 10.278-12.510 [2 H,q, 2x Guanin-Amid]

³¹P-NMR: δ = -2.874 [1 x Phosphotriester]

¹H-NMR (5'-O-DMT-dGT-3'-O-TBDMS) : (CHCl₃-dl, 300 MHz): δ = 0.895 [9 H, s, TBDMS tert-Butyl], 1.228-1.274 [6 H, m, 2 x CH₃, Isobuturyl), 1.962-1.980 [3 H, d, Thymin-Methyl ] , -2.2 [1 H, m, Isobuturyl], -2.6 [2 H, CH₂; CE-Gruppe], -3.8 [6 H, s, DMT 2x -OCH₃] , -4.303-4.394 [2 H, m, CE-Gruppe], 6.8- 7.3 [13 H, m, DMT-Phenyl], 7.5-8.3 [5 H, m, Cytosin-Phenyl ] , 10.125-12.197 [2 H, q, lx Guanin-Amid, lx Cytosin-Amid]

³¹P-NMR: δ = -2.406, -2.320 [1 x Phosphotriester]

¹H-NMR (5'-O-DMT-dGdC-3'-O-TBDMS) : (CHCl₃-dl, 300 MHz): δ = 0.082-0.092 [9 H,s, TBDMS tert-Butyl], 0.852-0.890 [6 H, d, 2x CH₃, TBDMS], 1.204-1.312 [6 H, m, 2 x CH₃ , I sobuturyl ) , -2.35 [1 H, m, Isobuturyl], -2.8 [2 H, CH₂; CE-Gruppe], -3.8 [6 H, s, DMT 2x -0-CH₃], -4.35 [2 H, m, CE-Gruppe], 6.8-7.3 [13 H, m, DMT-Phenyl], 10.105-12.354 [2 H, q, lx Guanin-Amid, lx Thymin-Lactam] ³¹P-NMR: δ = -2.559, -2.458 [1 x Phosphotriester] Alle 20 Dinukleotide wurden mittels MALDI-MS als Natrium^¬ signale nachgewiesen. Ergebnisse der MALDI-Massenspektren der vollständig geschützten Dinukleotide sind in Tabelle 1 abgebildet .

Beispiel 2 : Synthese eines Trinukleotids Abspaltung der 5'-0-DMT Gruppe

Ansatz :

1. 100 ml Dichlormethan

2. 5 g Trichloressigsäure (TCA)

3. 1 mmol Dinukleotid 6

1 g Trichloressigsäure (TCA) wurde in 20 ml Dichlormethan gelöst und zu 1 mmol des 5'-ODMT- 3 ' -O-TBDMS- -Acyl ge^¬ schützten Dinukleotids 6 zugegeben. Nachdem mittels Dünnschichtchromatographie auf Vollständigkeit der Abspaltung geprüft wurde (ggf. TCA zugeben), wurde die Lösung in einen mit 50 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gefüllten Scheidetrichter gegossen. Die organische Phase wurde mit der basischen Lösung gewaschen, der geöffnete Scheidetrichter zunächst nur geschwenkt bis keine CO₂- Entwicklung mehr erkennbar war. Die organische Phase wurde mit Natrium^¬ sulfat getrocknet, das Trocknungsmittel abfiltriert, das Lösungsmittel schließlich destillativ entfernt. Das Produkt wurde säulenchromatographisch gereinigt.

Rf-Wert (CH₂C1₂: Methanol = 9:1) = 0.4 Ausbeuten: 80-90 %

¹H- MR (5'-OH-dGdC-3'-0-TBDMS) : (CHCl₃-dl, 300 MHz): δ = 0.920[9 H, s, TBDMS tert-Butyl], 1.196-1.302 [6 H, m, 2 x CH₃, Isibuturyl), 2.317-2.384 [1 H, m, Isobuturyl], 2.536- 2.637 [2 H, CH₂; CE-Gruppe] , 10.488-10.775 [1 H, d, Guanin- Amid] , 12.150-12.185 [1 H, d, H, Cytosin-Amid]

³¹P- MR: δ = -2.458, -2.420 [1 x Phosphotriester ]

Alle 20 Dinukleotide wurden mittels MALDI-MS als Natrium^¬ signale nachgewiesen. Die Ergebnisse der MALDI-Massen- spektren der 5 ' -O-entschützten Dinukleotide sind in Tabelle 2 dargestellt.

Kopplung zum vollständig geschützten Trinukleotid

Ansatz :

1. 100 ml Acetonitril (trocken)

2. 0.5 mmol Dinukleotid 7

3. 1 mmol Phosphoramidit 5

4. 5 mmol Benzylmercaptotetrazol (1 g)

In einem 50 ml Einhalskolben wurden 1 mmol des Nukleosid- 3 ' -O-Phosphoramidits 5 und 0,5 mmol des 3'-0-TBDMS ge^¬ schützten Dinukleotids 7 in 20 ml trockenem Acetonitril gelöst, es wurden 5 mmol (1 g) Benzylmercaptotetrazol (BMT) zugegeben und die Lösung so lange geschwenkt bis sich das gesamte BMT gelöst hat. Nach 5 Minuten wurde eine 0,2 M I- odlösung ( Pyridin : HF : Wasser 2:2:1) zugegeben bis sich die Lösung nicht mehr entfärbte. Die Lösung wurde in einen Scheidetrichter überführt, es wurden 5 ml einer 5 % Natriumbisulfitlösung, danach 20 ml gesättigte Natriumhydrogen- carbonatlösung und 30 ml Dichlormethan zugegeben. Das Pro- dukt wurde durch zunächst vorsichtiges Schwenken, danach durch Ausschütteln in die organische Phase extrahiert. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet, das Trocknungsmittel filtriert, die Lösungsmittel destillativ entfernt. Restliches Pyridin wurde durch zweimalige Coeva- portion mit einigen Millilitern Toluol entfernt. Das Pro^¬ dukt konnte mittels Kieselgelsäulenchromatographie gerei^¬ nigt werden.

Rf-Wert (CH₂Cl₂:MeOH 95:5): 0.7

Alle 20 Trinukleotide wurden mittels MALDI-MS als Natrium^¬ signale nachgewiesen. Die Ergebnisse der MALDI- Massenspektren der vollständig geschützten Trinukleotide sind in Tabelle 3 dargestellt.

Selektive Abspaltung der 3 ^' -O-Silylgruppe

Ansatz :

1. 10 ml Dimethylformamid (trocken)

2. 1 mmol Trinukleotid 8

3. 0.5 ml TEA/3xHF

In einem 25 ml Einhalskolben wurde 1 mmol des silylierten Trinukleotids 8 in 10 ml trockenem DMF gelöst, es wurden 0,5 ml TEA/3xHF zugegeben. Die Lösung wurde solange bei Raumtemperatur gerührt bis die TBDMS-Gruppe vollständig entfernt wurde (Kontrolle mittels DC) . Nach vollständiger Umsetzung wurde die Reaktion durch vorsichtige Zugabe von gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung beendet bis keine Gasentwicklung mehr zu beobachten war, das Produkt danach mit Dichlormethan im Scheidetrichter extrahiert. Nachdem das Lösungsmittel destillativ entfernt wurde, wurde das Produkt säulenchromatographisch gereinigt. Analytik (exemplarisch für DMTTGGOH und DMTGATOH) : DMTTGGOH :

Rf-Wert (CH₂C1₂: Methanol = 9:1) = 0.6

¹H- MR: (DMSO-d<5, 300 MHz): δ = 1.07-1.135 [12 H, 2x Dii- sopropyl, Quartett], 1.755 [3 H, Thymin CH₃) , 3.688-3.726 [ 6 H, 2x O-CH₃ (DMT) ]

MALDI⁺-MS: gesucht: 1449,31 g/mol, gefunden: 1472,47 g/mol (Natriumpeak)

DMTGATOH :

Rf-Wert (CH₂C1₂: Methanol = 9:1) = 0.6

¹H- MR: (DMSO-d<5, 300 MHz): δ = 1.1-1.149 [12 H, q, 4x -

CH₃, 12 H, Diisopropyl] , 1.755-1.78 [3 H, C-CH₂, 3 H, Thy^¬ min], 2.926-2.967 [4 H, m, 2 x CH₃, CE-Gruppe) , 3.09-3.243 [2 H, m, Diisopropyl], 3.683-3.726 [6 H, 2x 0-CH₃ DMT], 6.751-7.482 [13 H, m, DMT-Phenyl], 11.299-11.317 [1 H, d, NH, Amid] , 11.573-11.583 [1 H, d, H, Amid] , 12.062 [1 H, s, NH, Thymin, Lactam]

³¹P- MR: δ = -3.142, -2.848 [2 x Phosphotriester]

MALDI⁺-MS: gesucht: 1433,31 g/mol, gefunden: 1456,41g/mol (Natriumpeak) Trinukleotid-Phosphoramidit

Ansatz :

1. 5 ml Dichlormethan (trocken)

2. 0.5 mmol Trinukleotid 9

3. 0.55 mmol 2-Cyanoethyl- , , ',Ν' - tetraisopropylphosphoramidit

4. 0.6 mmol BMT (0.12 g)

In einem 10 ml Einhalskolben wurden 0.5 mmol des gereinigten Trinukleotids 9 in 5 ml trockenem Dichlormethan gelöst, es wurden 0.55 mmol 2-Cyanoethyl-N_/.N_/.N ',N' - tetraisopropyl^¬ phosphoramidit und 0,6 mmol BMT zugegeben. Die Reaktionslö^¬ sung wurde ca. zwei Stunden gerührt bis das Edukt vollstän^¬ dig verschwunden war. Nach vollständiger Reaktion wurde das Lösungsmittel entfernt, das Phosphoramidit zwei Mal mit trockenem Dichlormathan coevaporiert und über Nacht am Öl- pumpenvakuum getrocknet. Eine wässrige Aufarbeitung und Reinigung fand nicht statt. Das Phosphoramidit wurde sofort für die Festphasensynthese verwendet.

Rf-Wert (CH₂Cl₂:MeOH 9:1): 0.7

Ausbeute: 50-70 %

Die 20 Phosphoramidite wurden anhand einer Testkopplung a- nalysiert, bei der jeweils ein 6-mer synthetisiert wurde. Die 6-mere wurden massenspektrometrisch nachgewiesen.

Beispiel 3 : Synthese eines 3 " -O-Disulfid geschützten Tri- nukleotids

3'-0-MTM funktionalisiertes Nukleosid

Ansatz :

1. 50 ml DMSO

2. 50 ml Acetanhydrid

3. 40 ml Essigsäure

4. 10 mmol Nukleosid 2

In einem mit 10 mmol eines 5 ' -O-DMT-geschützten Desoxy- nukleosids 2 gefüllten 250 ml Einhalskolben wurden nacheinander 50 ml DMSO, 50 ml Acetanhydrid und 40 ml Essigsäure zugegeben. Die Lösung wurde solange gerührt bis sich das Edukt vollständig umgesetzt hat (5-24h) . Nach vollständiger Umsetzung wurde die Lösung in 200 ml gesättigte Natrium- hydrogencarbonatlösung gegossen, das Produkt durch Zugabe von weiteren 200 ml Dichlormethan extrahiert. Sofern noch Produkt in der wässrigen Phase vorhanden war, wurde die Extraktion mit weiteren 100 ml Dichlormethan wiederholt.

Die Lösungsmittel wurden bei vermindertem Druck destillativ entfernt, das Produkt danach säulenchromatographisch gereinigt .

R_f-Wert (CH₂Cl₂:MeOH 95:5): 0.7

Ausbeuten :

• 3^'-0-MTM-dA (N-acyl) : 71 %

• 3^'-0-MTM-dC (N-acyl): 80 %

• 3^'-0-MTM-dG (N-acyl): 66 %

• 3'-0-MTM-T: 75 %

Folgende Nukleoside wurden mittels MALDI-MS nachgewiesen: dA: errechnet: 684 g/mol; gemessen: 685 m/z (kein Natrium- peak)

dC : errechnet: 694 g/mol; gemessen: 717 m/z

dG: errechnet: 700 g/mol; gemessen: 701 m/z (kein Natrium- peak)

T: errechnet: 604 g/mol; gemessen: 627 m/z

3 ^' -O-Disulfidgeschütztes Desoxynukleosid

Ansatz :

1. 100 ml Dichlormethan (trocken)

2. 10 mmol Desoxynukleosid 11

3. 1.4 ml Triethylamin (1 Äquivalent; 101,19 g/mol; 0,73 g/ml)

4. 0.81 ml Sulfurylchlorid (1 Äquivalent; 135 g/mol;

1, 6674 g/ml)

5. 4.5 g (2 Äquivalente; 225 g/mol) Kaliumthiotosylat 6. 5. Äq. 1-Propanthiol, 2-Propanthiol bzw. Tertbutylmer- captan

Oben dargestellte Nukleoside wurden alle nach dem gleichen Verfahren hergestellt.

10 mmol des 3'-0-MTM geschützten Desoxynukleosids 11 wurden in einem 250 ml Kolben in 100 ml trockenem Dichlormethan gelöst, es wurden zusätzlich etwas Molekularsieb und 1.4 ml Triethylamin (1 Äquivalent; 101,19 g/mol; 0,73 g/ml) zuge^¬ geben. Der Kolben wurde mit einem Septum, welches über eine Kanüle mit einem Trockenrohr verbunden war, verschlossen und in einem Eisbad 10 Minuten lang gerührt. 0.81 ml Sulfu- rylchlorid (1 Äquivalent; 135 g/mol; 1,6674 g/ml) wurden mit 10 ml trockenem Dichlormethan verdünnt und mit Hilfe einer Spritze und Kanüle über einen Zeitraum von ca. 10 Minuten zur Lösung hinzugetropft. Die Lösung färbte sich zum Ende der Zugabe leicht rot. Nach erfolgter Zugabe wurde das Eisbad entfernt, die Lösung weitere 15 Minuten lang weiter^¬ gerührt. 4.5 g (2 Äquivalente; 225 g/mol) Kaliumthiotosylat wurden in 50 ml trockenem DMF gelöst und zur Lösung zugegeben, die sich daraufhin entfärbte. Nach 10 Minuten Rühren wurden schließlich entweder 1-Propanthiol, 2-Propanthiol oder Tertbutylmercaptan zur Lösung gegeben. Die Lösung wurde 10 Minuten gerührt und mit gesättigter Natruimhydrogen- carbonatlösung gewaschen. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet, das Trocknungsmittel abfiltriert und die Lösungsmittel destillativ entfernt. Das Produkt wurde mittels Kieselgelchromatographie gereinigt.

R_f-Wert (CH₂Cl₂:MeOH 95:5): 0.7

Ausbeuten :

• DMTdCSS Schutzgruppe (primär) : 56 %

• DMTdCSS Schutzgruppe (sekundär) : 62 %

• DMTdCSS Schutzgruppe (tertiär) : 66 %

Folgende Nukleoside wurden mittels MALDI-MS als Natriumsig^¬ nale nachgewiesen:

DMTdCSS Schutzgruppe (primär): errechnet: 753 g/mol; ge- messsen: 776.1 m/z (Natriumpeak)

DMTdCSS Schutzgruppe (sekundär): errechnet: 753 g/mol; ge- messsen: 776.4 m/z (Natriumpeak)

DMTdCSS Schutzgruppe (tertiär): errechnet: 768 g/mol; ge- messsen: 790.3 m/z (Natriumpeak) Abspaltung der 5'-0-DMT Gruppe

5 g Trichloressigsäure (TCA) wurden in 100 ml Dichlormethan gelöst und zu 4 mmol des 5 ' -O-DMT-3 ' -O-Disulfid-N-Acyl ge^¬ schützten Nukleosids 12 gegeben. Nachdem mittels Dünnschichtchromatographie auf Vollständigkeit der Abspaltung geprüft wurde (ggf. TCA zugeben), wurde die Lösung in einen mit 200 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gefüllten Scheidetrichter gegossen. Die organische Phase wurde mit der basischen Lösung gewaschen, der geöffnete Scheidetrichter dabei zunächst nur geschwenkt bis keine CO₂- Entwicklung mehr erkennbar war. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet, das Trocknungsmittel filt^¬ riert, das Lösungsmittel schließlich destillativ entfernt. Das Produkt wurde mittels Kieselgelchromatographie gerei^¬ nigt .

Rf-Wert (CH₂Cl₂:MeOH 95:5): 0.4

Ausbeuten :

• dCSS Schutzgruppe (primär) : 78 %

• dCSS Schutzgruppe (sekundär) : 83 %

• dCSS Schutzgruppe (tertiär) : 74 % Kopplung zum Dinukleotid

2 mmol des Nukleosid-3 ' -O-Phosphoramidits und 1,5 mmol des 3 ' -O-Disulfid geschützten Nukleosids wurden in einem 100 ml Einhalskolben in 40 ml trockenem Acetonitril gelöst, es wurden 10 mmol (1,92 g) Benzylmercaptotetrazol (BMT) zuge^¬ geben und die Lösung so lange geschwenkt bis sich das ge^¬ samte BMT gelöst hat. Nach 5 Minuten wurde eine 0,2 M Iod- lösung ( Pyridin : HF : Wasser 2:2:1) bis sich die Lösung nicht mehr entfärbte. Die Lösung wurde in einen Scheidetrichter überführt, es wurden 10 ml Θ1ΠΘΓ 5 "6 Natriumbisulfitlösung, danach 20 ml gesättigte Natriumhydrogencarbonatlösung und 50 ml Dichlormethan zugegeben, das Produkt durch zunächst vorsichtiges Schwenken, danach durch Ausschütteln in die organische Phase extrahiert. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet, das Trocknungsmittel filtriert, die Lösungsmittel destillativ entfernt. Restliches Pyridin wurde durch zweimalige Coevaportion mit wenig Toluol ent^¬ fernt. Die jeweiligen Produkte wurden mittels Kieselgelsäu- lenchromatographie gereinigt

Rf-Wert (CH₂Cl₂:MeOH 95:5): 0.6 Ausbeuten :

• DMTTdCBzSS Schutzgruppe (primär) : 67 %

• DMTdABzdCBzSS Schutzgruppe (sekundär) : 61 %

• DMTTdCBzSS Schutzgruppe (tertiär) : 66 %

DMTTdCBzSS Schutzgruppe primär: errechnet: 1110.3 g/mol; gemessen: 1133.2 m/z (Natriumpeak)

DMTdABzdCBzSS Schutzgruppe sekundär: errechnet: 1209.3 g/mol; gemessen: 1232.1 m/z (Natriumpeak)

DMTdCdTSS Schutzgruppe tertiär: errechnet: 1124.3 g/mol; gemessen: 1147.1 m/z (Natriumpeak)

Abspaltung der 5'-0-DMT Gruppe an den 3 ' -O-Disulfid geschützten Dinukleotiden

1 g Trichloressigsäure (TCA) wurde in 20 ml Dichlormethan gelöst und zu 1 mmol des 5 ' -O-DMT-3 ' -O-Disulfid-N-Acyl ge^¬ schützten Dinukleotids zugegeben. Nachdem mittels Dünnschichtchromatographie auf Vollständigkeit der Abspaltung geprüft wurde (ggf. TCA zugeben), wurde die Lösung in einen mit 50 ml gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gefüllten Scheidetrichter gegossen. Die organische Phase wurde mit der basischen Lösung gewaschen, der geöffnete Scheidetrichter zunächst nur geschwenkt bis keine C0₂~Entwicklung mehr erkennbar war. Die organische Phase wurde mit Natrium^¬ sulfat getrocknet, das Trocknungsmittel filtriert, das Lö^¬ sungsmittel schließlich destillativ entfernt. Die Produkte wurden mittels Kieselgelchromatographie gereinigt.

Rf-Wert (CH₂Cl₂:MeOH 95:5): 0.3

Ausbeuten :

• TdCBzSS Schutzgruppe (primär) : 78 %

• dABzdCBzSS Schutzgruppe (sekundär) : 81 %

• TdCBzSS Schutzgruppe (tertiär) : 87 %

TdCBzSS Schutzgruppe primär: errechnet: 809 g/mol; gemes^¬ sen: 809 m/z

dABzdCBzSS Schutzgruppe sekundär: errechnet: 922 g/mol; ge^¬ messen: 944 m/z (Natriumpeak)

TCBzSS Schutzgruppe sekundär: errechnet: 822.2 g/mol; ge^¬ messen: 844.9 m/z (Natriumpeak)

3 ^' -O-Disulfid geschützte Trinukleotide

In einem 50 ml Einhalskolben wurden 1 mmol des Nukleosid- 3 ' -O-Phosphoramidits und 0,5 mmol des 3 ' -O-Disulfid ge^¬ schützten Dinukleotids in 20 ml trockenem Acetonitril gelöst, es wurden 5 mmol (1 g) Benzylmercaptotetrazol (BMT) zugegeben und die Lösung so lange geschwenkt bis sich das gesamte BMT gelöst hat. Nach 5 Minuten wurde eine 0,2 M I- odlösung ( Pyridin : HF : Wasser 2:2:1) zugegeben bis sich die Lösung nicht mehr entfärbte. Die Lösung wurde in einen Scheidetrichter überführt, es wurden 5 ml einer 5 % Natriumbisulfitlösung, danach 20 ml gesättigte Natriumhydrogen- carbonatlösung und 30 ml

Dichlormethan zugegeben, das Produkt durch zunächst vorsichtiges Schwenken, danach durch Ausschütteln in die organische Phase extrahiert. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet, das Trocknungsmittel filtriert, die Lösungsmittel destillativ entfernt. Restliches Pyridin wurde durch zweimalige Coevaportion mit einigen Millilitern Toluol entfernt. Die jeweiligen Produkte wurden mittels Kieselgelsäulenchromatographie gereinigt .

Rf-Wert (CH₂Cl₂:MeOH 95:5): 0.5

Ausbeuten :

• DMTdABzTdCBzSS Schutzgruppe (primär) : 64 %

• DMTdCBzdABzdCBzSS Schutzgruppe (sekundär) : 78 %

• DMTTTdCBzSS Schutzgruppe (tertiär) : 80 %

DMTdABzTdCBzSS Schutzgruppe (primär): errechnet: 1581.6 g/mol; gemessen: 1604.3 m/z (Natriumpeak)

DMTdCBzdABzdCBzSS Schutzgruppe (sekundär): errechnet: 1669 g/mol; gemessen: 1692.6 m/z (Natriumpeak)

DMTTTdCBzSS Schutzgruppe tertiär: errechnet: 1482.5 g/mol; gemessen: 1505.2 m/z (Natriumpeak)

Selektive Abspaltung der Disulfidschutzgruppen

0,1 mmol (0,1 g) des 3 ' -O-Disulfid geschützten Trinukleo- tids 13a-15a wurden in einem 10 ml Einhalskolben in 4 ml trockenem DMF gelöst, es wurden 0,5 mmol (0,077 g) DTT zugegeben. Die Lösung wurde bei 45°C in einem Wasserbad ge^¬ rührt. Die Umsetzung wurde in Zeitabständen von ca. 1 Stunde mittels DC und MALDI-MS kontrolliert. Es war neben der Spaltung der Disulfidbrücke auch auf die Entfernung der verbliebenen Thiomethylgruppe zu achten. Nach Ende der Reaktion wurde das Lösungsmittel entfernt, das Produkt säu- lenchromatographisch gereinigt. Eine wässrige Aufarbeitung fand nicht statt. Alternativ könnte eine wässrige Aufarbei^¬ tung mit destilliertem Wasser durchgeführt werden, eine basische Aufsrbeitung mit z.B. Natriumhydrogencarbonat ist auf Grund der Bildung von Thiolaten unter allen Umständen zu vermeiden.

Rf-Wert (CH₂Cl₂:MeOH 95:5): 0.3

Folgende Nukleoside wurden mittels MALDI-MS als Natriumsig nale nachgewiesen:

DMTdABzTdCBzOH: errechnet: 1460.4 g/mol; gemessen: 1483. m/z (Natriumpeak)

DMTdCBzdABzdCBzOH: errechnet: 1549.5 g/mol; gemessen 1572.6 m/z (Natriumpeak)

DMTTTdCBzOH : errechnet: 1347.4 g/mol; gemessen: 1370.6 m/ (Natriumpeak)

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Trinukleotiden der allgemeinen Formel 1

worin DMT eine Dimethoxytrityl-Schutzgruppe bedeutet, B eine Base aus der Gruppe der Purin- und Pyrimidin-Basen ist, wobei im Falle freier NH₂~Gruppen diese acyliert vorliegen, und wobei alle Basen B gleich oder verschieden sind, PG eine Alklyschutzgruppe, welche unsubstitu- iert oder mit funktionellen Gruppen substituiert vorliegt, bedeutet und R eine tert-Butyldimethylsilyl- Gruppe (TBDMS) oder eine Disulfid-Gruppe ist,

umfassend die Umsetzung eines ersten Nukleosid-5 ' -0- Dimethoxytrityl-3 ' -O-Phosphoramidits der allgemeinen Formel 2,

worin DMT, B und PG die oben genannte Bedeutung haben, mit einem ersten Nukleosid der allgemeinen Formel 3

worin B und R die oben genannte Bedeutung haben, zu einem Dinukleotid der allgemeinen Formel 4

worin DMT, B, R und PG die oben genannte Bedeutung haben

und

a) anschließende Abspaltung der 5 ' -DMT-Gruppe und Um- Setzung des Dinukleotids mit freier 5'-OH-Gruppe mit einem zweiten Nukleosid-3 ' -O-Phosphoramidit der allge^¬ meinen Formel 2, wobei die Base B gleich oder verschie^¬ den zu der des ersten Nukleosid-3 ' -O-Phosphoramidits ist

oder

b) anschließende Abspaltung der 3'-R-Gruppe, Erzeugung eines 3 ' -O-Phosphoramidits und Umsetzung des Dinukleo- tid-3 ' -O-phosphoramidits mit einem zweiten Nukleosid der allgemeinen Formel 3, wobei die Base B gleich oder verschieden zu der des ersten Nukleosids der allgemei^¬ nen Formel 3 ist.

2. Verfahren zur Herstellung von Trinukleotiden nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Schutzgruppe PG ausgewählt ist aus Methlygruppe oder substituierter oder unsubstituierter Ethylgruppe, vorzugsweise eine ß- Cyanoethylgruppe (CE) .

3. Verfahren zur Herstellung von Trinukleotiden nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Freisetzung der 3'-OH-Gruppe durch Abspaltung der 3'- TBDMS-Gruppe mit einem fluoridhaltigen Reagenz in einem organischen polaren aprotischen Lösungsmittel, und anschließende Zugabe einer wässrigen Lösung einer wasserlöslichen Base, erfolgt.

4. Verfahren zur Herstellung von Trinukleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ei^¬ ne Freisetzung der 3'-OH-Gruppe durch Abspaltung der

3' -Disulfid-Gruppe, vorzugsweise mit Dithiothreitol (DTT) in einem Gemisch aus Wasser und einem organischen polaren aprotischen Lösungsmittel, erfolgt.

5. Verfahren zur Herstellung von Trinukleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das fluoridhaltige Reagenz ausgewählt ist aus tert- Butylammoniumfluorid (TBAF) und TEA/3HF, vorzugsweise TEA/3HF.

6. Verfahren zur Herstellung von Trinukleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das organische polare aprotische Lösungsmittel ausgewählt ist aus DMSO oder DMF .

7. Verfahren zur Herstellung von Trinukleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserlösliche Base Natriumhydrogencarbonat ist.

8. Verfahren zur Herstellung von Trinukleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass ei^¬ ne Phosphitylierung der freien 3'-OH-Gruppe durch Umsetzung mit 2-Cyanoethyl-N, N, Ν' , N' -Tetraisopropyl- phosphoramidit unter Beigabe von Benzylmercaptotetrazol (BMT) zum Trinukleotid-5' -O-DMT-3' -O-Phosphoramidit der allgemeinen Formel 5 erfolgt:

9. Verfahren zur Herstellung von Trinukleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest R eine Disulfid-Gruppe -CH₂-S-S-R' ist, wobei der Rest R' ausgewählt ist aus primären, sekundären oder tertiären Aklylgruppen.

10. Verfahren zur Herstellung von Trinukleotiden nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest R eine Disulfid-Gruppe -CH₂-S-S-R' ist, wobei der Rest R' ausgewählt ist aus n-Propyl-, iso-Propyl- und tert . -Butyl-Gruppe .